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JP2024540099A - Ｒｏｒ１結合タンパク質を発現する細胞を培養する方法 - Google Patents

Ｒｏｒ１結合タンパク質を発現する細胞を培養する方法 Download PDF

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JP2024540099A
JP2024540099A JP2024525393A JP2024525393A JP2024540099A JP 2024540099 A JP2024540099 A JP 2024540099A JP 2024525393 A JP2024525393 A JP 2024525393A JP 2024525393 A JP2024525393 A JP 2024525393A JP 2024540099 A JP2024540099 A JP 2024540099A
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fold
jun
immune cells
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クマール ボドナラ，スマン
クリシナムーアスィー，ヴィーナ
パーク，スペンサー
ボン，クイニー
セイザー，ブライス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
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Lyell Immunopharma Inc
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Abstract

本明細書で開示されているのは、少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養する方法であり、該培地は免疫細胞の幹細胞性を高めることができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養される免疫細胞は、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されている。いくつかの態様では、免疫細胞は投与を必要とする対象に投与される。

Description

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年１０月２８日に出願された米国仮出願第６３／２６３，２３０号、２０２２年２月１１日に出願された同第６３／３０９，４００号、及び２０２２年５月６日に出願された同第６３／３３９，３４７号の優先権の利益を主張し；そのそれぞれが参照によって全体として本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願にて提出された、電子的に提出された配列表（名称：４３８５＿０８２ＰＣ０３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ、サイズ：１２３，６９９バイト、作成日：２０２２年１０月２６日）の内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、例えば、改変されていない対応する細胞と比べてｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む細胞、例えば、多能性細胞、多分化能細胞、及び／または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法に関する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、そのエフェクター活性を保持しながら、培養にて低分化細胞及び／または未分化細胞の濃縮を促進する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている培養方法は、細胞にて目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現を高めるのにも役立つことができる。本明細書に開示されている方法を使用して培養される細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、ネオ抗原に向けたＴ細胞療法を含むＴＣＲ Ｔ細胞療法、及びＴＩＬ療法を含むが、これらに限定されない種々の細胞療法に使用することができる。
がん免疫療法は、Ｔ細胞（感染した細胞及び病んだ細胞の免疫系の主な殺傷細胞）を利用して、腫瘍細胞を攻撃し、殺傷することに頼っている。しかしながら、腫瘍細胞を標的とし、殺傷する免疫細胞の能力は、腫瘍微小環境内に存在する免疫応答の種々の阻害剤の存在によって抑えられる。したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞は、特定のがんの治療にて種々の成功を収めてきた（例えば、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクロイセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＹＥＳＣＡＲ ＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロロイセル、Ｋｉｔｅ／Ｇｉｌｅａｄ）がＦＤＡに認可されている）一方で、課題も残されている。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法の成功は、レシピエントの体内でのＣＡＲ Ｔ増殖の程度によって制限されることが多く、通常、大量の細胞注入が必要とされる。さらに、移入されたＣＡＲ Ｔ細胞の疲弊及び存続性の喪失が観察され、臨床効果の低下及び再発の可能性につながっている。
Ｔ細胞疲弊を克服する１つの手段は、低分化状態を有するＴ細胞を選択的に投与することである。例えば、Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）は、さらに分化したＴセントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞またはＴエフェクターメモリー（ＴＥＭ）細胞よりも、投与後の患者にてさらに長期間存続し、ＴＳＣＭはさらに分化した細胞よりも腫瘍サイズに対してさらに顕著で長期的な効果を発揮する。しかしながら、多くの養子細胞療法（ＡＣＴ）の細胞調製物は、分化の種々の段階で免疫細胞の不定形な混合物を含み、これは固形腫瘍を根絶するには効果がない。治癒力を高めるには、自己複製能を強化した幹細胞／エフェクター特性を持つＴ細胞製剤が必要である。このように、当該技術分野では、単離したＴ細胞の混合集団から低分化Ｔ細胞及び／またはナイーブＴ細胞を効率的に濃縮する方法が依然として必要である。
本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、生体外培養または試験管内培養にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の幹細胞性を高める方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、生体外培養または試験管内培養にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の収率を高める方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、免疫療法のために免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の集団を調製する方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、免疫療法のために生体外培養または試験管内培養にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の収率を高めながら免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の幹細胞性を高める方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含む、生体外または試験管内にて幹細胞様免疫細胞の集団を増殖させる方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。
本明細書で提供されているのはまた、抗原刺激に応答した免疫細胞によるサイトカインの産生を高める方法であり、その際、該方法は５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、該免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。
いくつかの態様では、サイトカインはＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、培養後、参照免疫細胞と比べて、抗原刺激に応答したサイトカインの産生は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。
本開示はさらに、持続的抗原刺激に応答した免疫細胞のエフェクター機能を高める方法を提供し、該方法は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、該免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。
いくつかの態様では、免疫細胞は、参照免疫細胞と比べて、抗原刺激アッセイの少なくとも１回の、少なくとも２回の、または少なくとも３回の追加の回の間、エフェクター機能を保持する。いくつかの態様では、エフェクター機能は（ｉ）腫瘍細胞を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激の際にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方の能力を含む。いくつかの態様では、サイトカインはＩＦＮ－γを含む。
いくつかの態様では、培養後、持続的抗原刺激に応答した免疫細胞のエフェクター機能は参照免疫細胞と比べて少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上高められる。
本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含む、免疫細胞上の１以上のマーカーの表現型発現を変化させる方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。
いくつかの態様では、１以上のマーカーはＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、参照免疫細胞と比べて、１以上のマーカーの発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少する。いくつかの態様では、参照免疫細胞と比べて、１以上のマーカーの発現は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍減少する。
上記の方法のいずれにおいても、いくつかの態様では、参照免疫細胞は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地で培養された対応する免疫細胞、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されておらず、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養された対応する免疫細胞、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されておらず、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地で培養された対応する免疫細胞、または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）までの任意の組み合わせの対応する免疫細胞を含む。
上記の方法のいずれにおいても、いくつかの態様では、免疫細胞はキメラポリペプチド、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、またはその双方をコードする外来性ポリヌクレオチドで改変されているので、改変後、免疫細胞は改変されていない対応する免疫細胞と比べて、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇している。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは免疫細胞にとって内在性であり、免疫細胞は内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を高めることができる転写活性化因子で改変されている。いくつかの態様では、転写活性化因子は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される。
本明細書で提供されているのはまた、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドと（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドとをコードする外来性ポリヌクレオチドで免疫細胞を改変することを含む、免疫療法のために生体外または試験管内で免疫細胞を調製する方法である。本開示はさらに、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、（ｉ）内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を高めることができる転写活性化因子と、（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドとによって免疫細胞を改変することを含む、免疫療法のために生体外または試験管内で免疫細胞を調製する方法を提供する。いくつかの態様では、転写活性化因子は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは免疫細胞の疲弊を防止または軽減することができる。
本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、生体外培養及び試験管内培養中にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の幹細胞性を高める方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、生体外培養または試験管内培養にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の収率を高める方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、免疫療法のために免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の集団を調製する方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）を培養することを含む、免疫療法のために生体外培養または試験管内培養での増殖中に免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の収率を高めながら、免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の幹細胞性を高める方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている。本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含む、生体外または試験管内にて幹細胞様免疫細胞の集団を増殖させる方法であり、その際、免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている。
上記の方法のいずれにおいても、いくつかの態様では、免疫細胞はさらに、キメラポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドで改変される。
本明細書で提供されているのは、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドで免疫細胞を改変することを含む、免疫療法のために生体外または試験管内で免疫細胞を調製する方法である。
いくつかの態様では、上記で提供されている方法のいずれかのキメラポリペプチドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
いくつかの態様では、上記で提供されている方法のいずれかの免疫細胞はさらに、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はキメラポリペプチド、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、またはその双方をコードする外来性ポリヌクレオチドで改変されているので、改変後、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇している。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは免疫細胞にとって内在性であり、免疫細胞は内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を高めることができる転写活性化因子で改変されている。いくつかの態様では、転写活性化因子は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは免疫細胞の疲弊を防止または軽減することができる。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む外来性ポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチドは配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１に示される核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるヌクレオシド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号４に示される核酸配列に対して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号５に示される核酸配列に対して少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号６に示される核酸配列に対して少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号７に示される核酸配列に対して少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号８に示される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号９に示される核酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号１０に示される核酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びキメラポリペプチドは同じ配列（すなわち、ベクター）上にある。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びキメラポリペプチドは異なる配列（すなわち、ベクター）上にある。
いくつかの態様では、上記で提供されている方法のいずれかのＲＯＲ１結合タンパク質はＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質はＲ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質はＲ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。いくつかの態様では、ＶＨ ＣＤＲ１は配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＶＬ ＣＤＲ１は配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質のＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含み、ＲＯＲ１結合タンパク質のＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は配列番号８３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
上記方法のいずれかにて、いくつかの態様では、キメラポリペプチドはさらに、膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。いくつかの態様では、ＴＭドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。いくつかの態様では、ＴＭドメインはＣＤ２８に由来する。いくつかの態様では、ＴＭドメインは配列番号７５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドはさらに、ＲＯＲ１結合タンパク質とＴＭドメインとの間にスペーサーを含む。いくつかの態様では、スペーサーは免疫グロブリンヒンジ領域またはＣＤ８に由来する。いくつかの態様では、スペーサーは配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、スペーサーはさらに、リンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーはＧＧＧＳＧ（配列番号４０）を含む。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドはさらに、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＣＤ３δ活性化ドメイン、ＣＤ３ε活性化ドメイン、ＣＤ３η活性化ドメイン、ＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＦＣＥＲ１Ｇ活性化ドメイン、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８活性化ドメイン、ＺＡＰ７０活性化ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号８４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドはさらに、細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内共刺激ドメインは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様では、細胞内共刺激ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの態様では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号７６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－ＪｕｎポリペプチドとＲＯＲ１結合タンパク質はリンカーによって連結される。いくつかの態様では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、切断可能なリンカーはＰ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、フーリン切断部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、キメラポリヌクレオチドはさらに、切り詰めたＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔはリンカーによってｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び／またはＲＯＲ１結合タンパク質に連結されている。いくつかの態様では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、フーリン切断部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
上記の方法のいずれかにて、いくつかの態様では、キメラポリペプチドはさらに、シグナルペプチドを含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドはｈＩｇＫに由来する。いくつかの態様では、ｈＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号８６に示されるヌクレオチド酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む外来性ポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの態様では、上記で提供されている方法のいずれかの外来性ポリヌクレオチドはベクターを含む。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドはさらに、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ユビキチンプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号９２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
上記の方法のいずれかにて、いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約１０ｍＭより高い、約１５ｍＭより高い、約２０ｍＭより高い、約２５ｍＭより高い、約３０ｍＭより高い、約３５ｍＭより高い、約４０ｍＭより高い、約４５ｍＭより高い、約５０ｍＭより高い、約５５ｍＭより高い、約６０ｍＭより高い、約６５ｍＭより高い、約７０ｍＭより高い、約７５ｍＭより高い、約８０ｍＭより高い、約８５ｍＭより高い、または約９０ｍＭより高い。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、及び約８０ｍＭから成る群から選択される。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約３０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約５０ｍＭ～８０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約７０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約７０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約７０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約６０ｍＭの間、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、または約７０ｍＭである。
いくつかの態様では、培地はさらに、ナトリウムイオンを含む。いくつかの態様では、培地はさらにＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、培地は、約１４０ｍＭ未満、約１３０ｍＭ未満、約１２０ｍＭ未満、約１１０ｍＭ未満、約１００ｍＭ未満、約９０ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、または約４０ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。
いくつかの態様では、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、培地は低張性であり、カリウムイオン濃度とナトリウムイオン濃度の合計の２倍が２８０ｍＭ未満である。いくつかの態様では、培地は低張性であり、カリウムイオン濃度とナトリウムイオン濃度の合計の２倍が２４０ｍＭより高く且つ２８０ｍＭ未満である。いくつかの態様では、培地は等張性であり、カリウムイオン濃度とナトリウムイオン濃度の合計の２倍が２８０ｍＭ以上且つ３００ｍＭ未満である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約８０ｍＭ未満、約７５ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６５ｍＭ未満、または約６０ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約８５ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７５ｍＭ未満、または約７０ｍＭ未満、または約６５ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約９０ｍＭ未満、約８５ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、または約７５ｍＭ未満、または約７０ｍＭ未満である。
いくつかの態様では、上記で提供されている方法の免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、免疫細胞は試験管内または生体外で操作されている。
いくつかの態様では、培地はさらに、１以上のサイトカインを含む。いくつかの態様では、１以上のサイトカインはインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、１以上のサイトカインはＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様では、培地は約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－２の濃度は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬである。いくつかの態様では、ＩＬ－２の濃度は約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの間である。いくつかの態様では、ＩＬ－２の濃度は約２００ＩＵ／ｍＬである。
いくつかの態様では、培地は約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－２１の濃度は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬである。いくつかの態様では、ＩＬ－２１の濃度は約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの間である。いくつかの態様では、ＩＬ－２１の濃度は約２００ＩＵ／ｍＬである。
いくつかの態様では、培地は約５００ＩＵ／ｍＬ～約１，５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－７の濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ、約５５０ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約６５０ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約７５０ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約８５０ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約９５０ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，０５０ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，１５０ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，２５０ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，３５０ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，４５０ＩＵ／ｍＬ、または約１，５００ＩＵ／ｍＬである。いくつかの態様では、ＩＬ－７の濃度は約１，０００ＩＵ／ｍＬ～約１，４００ＩＵ／ｍＬである。いくつかの態様では、ＩＬ－７の濃度は約１，２００ＩＵ／ｍＬである。
いくつかの態様では、培地は約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬである。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの間である。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は約２００ＩＵ／ｍＬである。
いくつかの態様では、培地はさらに細胞増殖剤を含む。いくつかの態様では、細胞増殖剤はＧＳＫ３Ｂ阻害剤、ＡＣＬＹ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害は、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クエン酸ヒドロキシル、ＬＹ２９４００２、ピクチリシブ、ＣＡＬ１０１、ＩＣ８７１１４、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＡＫＴ阻害剤は、ＭＫ２２０６、Ａ４４３６５４、ＡＫＴｉ－ｖｉｉｉ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの態様では、出発免疫細胞と比べて、高い濃度のカリウムイオンがない培地で培養された免疫細胞と比べて、及び／またはｃ－Ｊｕｎポリペプチドがない免疫細胞と比べて最終細胞製剤にて、上記で提供されている方法の培地は、ａ）低分化及び／または未分化の細胞の数及び／または割合を増やすことができ；ｂ）形質導入効率を高めることができ；ｃ）幹細胞様免疫細胞を増やすことができ；ｄ）生体内生存能を高めることができ；ｅ）細胞能力を高めることができ；ｆ）細胞疲弊を防止することができ；またはｇ）それらの任意の組み合わせを行うことができる。
いくつかの態様では、培地はさらにカルシウムイオン、グルコースまたはその双方を含む。
いくつかの態様では、培地はさらにグルコースを含み、その際、グルコースの濃度は約１０ｍＭを超える。いくつかの態様では、グルコースの濃度は、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約１９ｍＭ、約１５ｍＭ～約１８ｍＭ、約１５ｍＭ～約１７ｍＭ、約１５ｍＭ～約１６ｍＭ、約１６ｍＭ～約２０ｍＭ、約１６ｍＭ～約１９ｍＭ、約１６ｍＭ～約１８ｍＭ、約１６ｍＭ～約１７ｍＭ、約１７ｍＭ～約２０ｍＭ、約１７ｍＭ～約１９ｍＭ、または約１７ｍＭ～約１８ｍＭである。いくつかの態様では、グルコースの濃度は、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、または約２５ｍＭである。いくつかの態様では、グルコースの濃度は、約１５．４ｍＭ、約１５．９ｍＭ、約１６．３ｍＭ、約１６．８ｍＭ、約１７．２ｍＭ、または約１７．７ｍＭである。
いくつかの態様では、培地はさらにカルシウムイオンを含み、その際、カルシウムイオンの濃度は約０．４ｍＭを超える。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は、約０．４ｍＭ～約２．８ｍＭ、約０．４ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．１ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．２ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．３ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．４ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．６ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．６ｍＭ～約２．８ｍＭ、約１．７ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．８ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．２～約１．３ｍＭ、約１．２～約１．４ｍＭ、約１．２～約１．５ｍＭ、約１．２～約１．６ｍＭ、約１．２～約１．７ｍＭ、約１．２～約１．８ｍＭ、約１．３～約１．４ｍＭ、約１．３～約１．５ｍＭ、約１．３～約１．６ｍＭ、約１．３～約１．７ｍＭ、約１．３～約１．８ｍＭ、約１．４～約１．５ｍＭ、約１．４～約１．６ｍＭ、約１．４～約１．７ｍＭ、約１．４～約１．８ｍＭ、約１．５～約１．６ｍＭ、約１．５～約１．７ｍＭ、約１．５～約１．８ｍＭ、約１．６～約１．７ｍＭ、約１．６～約１．８ｍＭ、または約１．７～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．１ｍＭ、約２．２ｍＭ、約２．３ｍＭ、約２．４ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約２．９ｍＭ、または約３．０ｍＭである。
いくつかの態様では、免疫細胞は、培養後にＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、またはＴＣＦ７＋、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、免疫細胞は医薬組成物及び薬学的に許容される担体にて製剤化される。
本明細書で提供されているのは、本明細書に記載されている方法のいずれかによって調製される免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の集団である。
本明細書で提供されているのは、生体内で長期間の存続が可能である免疫細胞の集団であり、その際、免疫細胞は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養されており、且つ（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように改変され、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている。いくつかの態様では、それを必要とする対象に投与されると、本明細書に記載されている免疫細胞の集団は少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約３ヵ月間、少なくとも約４ヵ月間、少なくとも約５ヵ月間、または少なくとも約６ヵ月間対象にて存続することが可能である。
本明細書で提供されているのはまた、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の集団と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
本開示はさらに、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）の集団または医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む、それを必要とする対象にて腫瘍を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、腫瘍は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、腎癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（胃）癌、消化器癌、卵巣癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する。いくつかの態様では、腫瘍は固形腫瘍である。
いくつかの態様では、投与後、腫瘍のサイズ（腫瘍サイズ）は参照腫瘍サイズと比べて減少する。いくつかの態様では、参照腫瘍サイズは（ｉ）投与前の腫瘍サイズ、（ｉｉ）投与を受けなかった（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地で形質導入され、培養された対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象における腫瘍サイズ、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方を含む。いくつかの態様では、参照腫瘍サイズと比べて、腫瘍サイズは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少する。
いくつかの態様では、投与後、対象の生存期間は、参照生存期間と比べて延長される。いくつかの態様では、参照生存期間は、投与を受けなかった（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地にて形質導入され、培養された対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象の生存期間を含む。いくつかの態様では、参照生存期間と比べて、生存期間は、少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約１ヵ月、少なくとも約２ヵ月、少なくとも約３ヵ月、少なくとも約４ヵ月、少なくとも約５ヵ月、少なくとも約６ヵ月、少なくとも約７ヵ月、少なくとも約８ヵ月、少なくとも約９ヵ月、少なくとも約１０ヵ月、少なくとも約１１ヵ月、または少なくとも約１年増加する。
いくつかの態様では、本明細書に提供されている腫瘍を治療する方法はさらに、少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫に基づく治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で提供されているのはまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を含む組成物であり、これらの細胞は（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、その際、（ｉ）改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性であり；（ｉｉ）改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性であり、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方である。
本明細書で提供されているのはまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を含む組成物であり、これらの細胞は（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、その際、改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性である。本明細書で提供されているのはまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を含む組成物であり、これらの細胞は（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、その際、改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性である。
本明細書で提供されているのはまた、（ａ）操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている免疫細胞の集団を含む組成物であり、その際、細胞の少なくとも約４％は前駆疲弊Ｔ細胞である。本開示のいくつかの態様は（ａ）操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている免疫細胞の集団を含む組成物に関するものであり、その際、細胞の約４％～約６％の間は前駆疲弊Ｔ細胞である。本明細書で提供されているのはまた、（ａ）操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている免疫細胞の集団を含む組成物であり、その際、細胞の少なくとも約４％は前駆疲弊Ｔ細胞であり、細胞の少なくとも約４％は幹細胞様Ｔ細胞である。
（Ａ）ＴＣＭ（すなわち、対照培地）及びＭＲＭにて培養（または増殖）したＴ細胞における抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲの形質導入効率の比較を示す。Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を含む）はドナー＃１に由来した。（Ｂ）ＴＣＭ（すなわち、対照培地）及びＭＲＭにて培養（または増殖）したＴ細胞における抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲの形質導入効率の比較を示す。Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を含む）はドナー＃２に由来した。（Ｃ）ＴＣＭ（すなわち、対照培地）及びＭＲＭにて培養（または増殖）したＴ細胞における抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲの形質導入効率の比較を示す。Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を含む）はドナー＃３に由来した。異なる形質導入条件（または試験群）は以下のとおりである：（１）ＴＣＭにて培養した非形質導入Ｔ細胞；（２）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（４）ＭＲＭにて培養した非形質導入Ｔ細胞；（５）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞；及び（６）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞。 （Ａ）さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞総集団内に存在するＣＤ４＋（黒色の棒）及びＣＤ８＋（白色の棒）Ｔ細胞の割合を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。形質導入したＴ細胞はドナー＃１に由来した。（Ｂ）さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞総集団内に存在するＣＤ４＋（黒色の棒）及びＣＤ８＋（白色の棒）Ｔ細胞の割合を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。形質導入したＴ細胞はドナー＃２に由来した。（Ｃ）さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞総集団内に存在するＣＤ４＋（黒色の棒）及びＣＤ８＋（白色の棒）Ｔ細胞の割合を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。形質導入したＴ細胞はドナー＃３に由来した。 （Ａ）さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質発現レベル（中央値蛍光強度（ＭＦＩ）として示す）に対するＭＲＭの効果を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。形質導入したＴ細胞はドナー＃１に由来した。（Ｂ）さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質発現レベル（中央値蛍光強度（ＭＦＩ）として示す）に対するＭＲＭの効果を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。形質導入したＴ細胞はドナー＃２に由来した。（Ｃ）さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質発現レベル（中央値蛍光強度（ＭＦＩ）として示す）に対するＭＲＭの効果を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。形質導入したＴ細胞はドナー＃３に由来した。 さまざまな試験群由来の幹細胞様形質導入ＣＤ４＋Ｔ細胞（３名の異なるドナー（Ａ、Ｂ、Ｃ）の割合の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。 さまざまな試験群由来の幹細胞様形質導入ＣＤ４＋Ｔ細胞（３名の異なるドナー（Ａ、Ｂ、Ｃ）の割合の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。 さまざまな試験群由来の幹細胞様形質導入ＣＤ４＋Ｔ細胞（３名の異なるドナー（Ａ、Ｂ、Ｃ）の割合の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。 さまざまな試験群由来の幹細胞様形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ，Ｅ，Ｆ（３名の異なるドナー））の割合の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。実施例２で説明されるように、幹細胞様細胞をＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋として同定した。 さまざまな試験群由来の幹細胞様形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ，Ｅ，Ｆ（３名の異なるドナー））の割合の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。実施例２で説明されるように、幹細胞様細胞をＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋として同定した。 さまざまな試験群由来の幹細胞様形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ，Ｅ，Ｆ（３名の異なるドナー））の割合の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。実施例２で説明されるように、幹細胞様細胞をＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋として同定した。 ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｇ、Ｈ、Ｉ）について同じ３名のドナーからのナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞の割合を示す。実施例２に記載されているように、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。 ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｇ、Ｈ、Ｉ）について同じ３名のドナーからのナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞の割合を示す。実施例２に記載されているように、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。 ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｇ、Ｈ、Ｉ）について同じ３名のドナーからのナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞の割合を示す。実施例２に記載されているように、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。 ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｊ、Ｋ、Ｌ）について同じ３名のドナーからのナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞の割合を示す。実施例２に記載されているように、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。 ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｊ、Ｋ、Ｌ）について同じ３名のドナーからのナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞の割合を示す。実施例２に記載されているように、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。 ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｊ、Ｋ、Ｌ）について同じ３名のドナーからのナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞の割合を示す。実施例２に記載されているように、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋として同定した。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＣＤ３９を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＬＡＧ３を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＰＤ１を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＧＩＴを発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＭ３を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＣＤ３９を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＬＡＧ３を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＰＤ１を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＧＩＴを発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃１に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＭ３を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＣＤ３９を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＬＡＧ３を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＰＤ１を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＧＩＴを発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＭ３を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＣＤ３９を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＬＡＧ３を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＰＤ１を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＧＩＴを発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃２に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＭ３を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＣＤ３９を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＬＡＧ３を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＰＤ１を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＧＩＴを発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＭ３を発現した抗ＲＯＲ１（Ｒ１２）ＣＡＲ導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＣＤ３９を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＬＡＧ３を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＰＤ１を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＧＩＴを発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 さまざまな試験群由来の形質導入したＴ細胞（ドナー＃３に由来する）上の種々の表面マーカーの発現の比較を示す。さまざまな試験群は図１Ａ～１Ｃに記載されたものと同じである。ＴＩＭ３を発現した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 （Ａ）一次抗原刺激後にＭＲＭまたはＴＣＭにて形質導入し、培養したＴ細胞によるＩＬ－２産生の比較を示す。形質導入したＴ細胞はドナー＃１に由来した。（Ｂ）一次抗原刺激後にＭＲＭまたはＴＣＭにて形質導入し、培養したＴ細胞によるＩＬ－２産生の比較を示す。形質導入したＴ細胞はドナー＃２に由来した。（Ｃ）一次抗原刺激後にＭＲＭまたはＴＣＭにて形質導入し、培養したＴ細胞によるＩＬ－２産生の比較を示す。形質導入したＴ細胞はドナー＃３に由来した。さまざまな試験群は、以下のとおりである：（１）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞（黒丸）；（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞（黒四角）；（３）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（白丸）；及び（４）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（白四角）。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 （Ａ）複数回の抗原刺激後に形質導入し、ＭＲＭまたはＴＣＭにて培養したＴ細胞によるＩＦＮ－γ産生の比較を示す。さらに実施例３に提供されるように、連続刺激アッセイは、後続回の再播種に必要な形質導入Ｔ細胞数が達成されなかった時点で終了した：（ｉ）ドナー＃１について４回の抗原刺激。（Ｂ）複数回の抗原刺激後に形質導入し、ＭＲＭまたはＴＣＭにて培養したＴ細胞によるＩＦＮ－γ産生の比較を示す。さらに実施例３に提供されるように、連続刺激アッセイは、後続回の再播種に必要な形質導入Ｔ細胞数が達成されなかった時点で終了した：（ｉｉ）ドナー＃２について３回の抗原刺激。（Ｃ）複数回の抗原刺激後に形質導入し、ＭＲＭまたはＴＣＭにて培養したＴ細胞によるＩＦＮ－γ産生の比較を示す。さらに実施例３に提供されるように、連続刺激アッセイは、後続回の再播種に必要な形質導入Ｔ細胞数が達成されなかった時点で終了した：（ｉｉｉ）ドナー＃３について２回の抗原刺激。さまざまな試験群は、以下のとおりである：（１）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞（黒丸）；（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞（黒四角）；（３）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（白丸）；及び（４）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（白四角）。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示す。形質導入されたＴ細胞は、３名の異なるドナー：ドナー＃１（図１０Ｂ及び１０Ｅ）、ドナー＃２（図１０Ａ及び１０Ｄ）、及びドナー＃３（図１０Ｃ及び１０Ｆ）に由来した。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）（白色棒）のいずれかで形質導入し、対照培地（すなわち、ＴＣＭ）にて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。図１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（白色棒）のいずれかで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示す。形質導入されたＴ細胞は、３名の異なるドナー：ドナー＃１（図１０Ｂ及び１０Ｅ）、ドナー＃２（図１０Ａ及び１０Ｄ）、及びドナー＃３（図１０Ｃ及び１０Ｆ）に由来した。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）（白色棒）のいずれかで形質導入し、対照培地（すなわち、ＴＣＭ）にて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。図１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（白色棒）のいずれかで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示す。形質導入されたＴ細胞は、３名の異なるドナー：ドナー＃１（図１０Ｂ及び１０Ｅ）、ドナー＃２（図１０Ａ及び１０Ｄ）、及びドナー＃３（図１０Ｃ及び１０Ｆ）に由来した。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）（白色棒）のいずれかで形質導入し、対照培地（すなわち、ＴＣＭ）にて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。図１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（白色棒）のいずれかで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示す。形質導入されたＴ細胞は、３名の異なるドナー：ドナー＃１（図１０Ｂ及び１０Ｅ）、ドナー＃２（図１０Ａ及び１０Ｄ）、及びドナー＃３（図１０Ｃ及び１０Ｆ）に由来した。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）（白色棒）のいずれかで形質導入し、対照培地（すなわち、ＴＣＭ）にて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。図１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（白色棒）のいずれかで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示す。形質導入されたＴ細胞は、３名の異なるドナー：ドナー＃１（図１０Ｂ及び１０Ｅ）、ドナー＃２（図１０Ａ及び１０Ｄ）、及びドナー＃３（図１０Ｃ及び１０Ｆ）に由来した。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）（白色棒）のいずれかで形質導入し、対照培地（すなわち、ＴＣＭ）にて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。図１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（白色棒）のいずれかで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示す。形質導入されたＴ細胞は、３名の異なるドナー：ドナー＃１（図１０Ｂ及び１０Ｅ）、ドナー＃２（図１０Ａ及び１０Ｄ）、及びドナー＃３（図１０Ｃ及び１０Ｆ）に由来した。図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）（白色棒）のいずれかで形質導入し、対照培地（すなわち、ＴＣＭ）にて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。図１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（黒色棒）またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（白色棒）のいずれかで形質導入し、ＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞についての結果を提供する。ｘ軸は、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（すなわち、形質導入されたＴ細胞の標的腫瘍細胞に対する比）を提供する。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞の投与後の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植したマウスを以下の１つで静脈内にて処理した：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけの（未形質導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞（図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｅ）または（ｂ）２．５×１０６細胞（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｆ）の２つの用量の１つでマウスに投与した。Ｔ細胞を投与した後、投与後の種々の時点で動物の腫瘍サイズ（図１１Ａ及び１１Ｂ）、体重（図１１Ｃ及び１１Ｄ）、及び生存率（図１１Ｅ及び１１Ｆ）を評価した。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞の投与後の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植したマウスを以下の１つで静脈内にて処理した：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけの（未形質導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞（図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｅ）または（ｂ）２．５×１０６細胞（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｆ）の２つの用量の１つでマウスに投与した。Ｔ細胞を投与した後、投与後の種々の時点で動物の腫瘍サイズ（図１１Ａ及び１１Ｂ）、体重（図１１Ｃ及び１１Ｄ）、及び生存率（図１１Ｅ及び１１Ｆ）を評価した。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞の投与後の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植したマウスを以下の１つで静脈内にて処理した：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけの（未形質導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞（図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｅ）または（ｂ）２．５×１０６細胞（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｆ）の２つの用量の１つでマウスに投与した。Ｔ細胞を投与した後、投与後の種々の時点で動物の腫瘍サイズ（図１１Ａ及び１１Ｂ）、体重（図１１Ｃ及び１１Ｄ）、及び生存率（図１１Ｅ及び１１Ｆ）を評価した。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞の投与後の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植したマウスを以下の１つで静脈内にて処理した：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけの（未形質導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞（図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｅ）または（ｂ）２．５×１０６細胞（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｆ）の２つの用量の１つでマウスに投与した。Ｔ細胞を投与した後、投与後の種々の時点で動物の腫瘍サイズ（図１１Ａ及び１１Ｂ）、体重（図１１Ｃ及び１１Ｄ）、及び生存率（図１１Ｅ及び１１Ｆ）を評価した。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞の投与後の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植したマウスを以下の１つで静脈内にて処理した：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけの（未形質導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞（図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｅ）または（ｂ）２．５×１０６細胞（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｆ）の２つの用量の１つでマウスに投与した。Ｔ細胞を投与した後、投与後の種々の時点で動物の腫瘍サイズ（図１１Ａ及び１１Ｂ）、体重（図１１Ｃ及び１１Ｄ）、及び生存率（図１１Ｅ及び１１Ｆ）を評価した。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞の投与後の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植したマウスを以下の１つで静脈内にて処理した：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけの（未形質導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞（図１１Ａ、１１Ｃ、及び１１Ｅ）または（ｂ）２．５×１０６細胞（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｆ）の２つの用量の１つでマウスに投与した。Ｔ細胞を投与した後、投与後の種々の時点で動物の腫瘍サイズ（図１１Ａ及び１１Ｂ）、体重（図１１Ｃ及び１１Ｄ）、及び生存率（図１１Ｅ及び１１Ｆ）を評価した。 本明細書に記載されているように形質導入し、ＭＲＭにて培養し、且つＭＨＣクラスＩ及びＩＩをノックアウトしたＨ１７９５担癌ＮＳＧマウスに投与したＴ細胞の存続性を示す。示すように、動物には、以下：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけ（未導入）Ｔ細胞（「見せかけ－ＭＲＭ」、円）、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－ＪｕｎなしのＲ１２ ＣＡＲ）を形質導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（「対照Ｒ１２ ＣＡＲ－ＭＲＭ」、四角）；（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）を形質導入し、ＭＲＭで培養したＴ細胞（「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２－ＣＡＲ－ＭＲＭ」、三角）の１つを単回静脈内投与した。（Ａ）Ｔ細胞は（ａ）５×１０６細胞の用量をマウスに投与した。（Ｂ）Ｔ細胞は（ｂ）２．５×１０６細胞の用量をマウスに投与した。次に、投与後の種々の時点で末梢血を採取し、フローサイトメトリーを使用して血液１ｍＬあたりのＣＡＲ＋Ｔ細胞（対照群及びｃ－Ｊｕｎ Ｒ１２群）の数を定量した。 連続抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のトランスクリプトームのプロファイルを示す。実施例６でさらに説明されているように、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の一部をｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変し、及び／またはＭＲＭにて培養した。示されているさまざまな試験群は次のとおりである：（１）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）を導入し、対照培地で培養したＴ細胞（灰色の棒）、及び（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）を導入し、ＭＲＭにて培養したＴ細胞（黒色の棒）。（Ａ）連続抗原刺激アッセイの７日目と１０日目に幹細胞様遺伝子が濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。（Ｂ）終末疲弊Ｔ細胞遺伝子が濃縮されているＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 腫瘍を担うマウスへの養子導入後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ過剰発現の有無にかかわらず）のトランスクリプトームのプロファイルを示す。実施例７でさらに説明されているように、腫瘍を担うマウスを、ＭＲＭにて培養したｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）またはＭＲＭにて培養した対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）のいずれかで処理した。その後、養子導入した形質導入Ｔ細胞を腫瘍から単離し、単個細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。双方の処理群のすべての試料からのＣＤ８＋Ｔ細胞のＵＭＡＰを示す。 腫瘍を担うマウスへの養子導入後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ過剰発現の有無にかかわらず）のトランスクリプトームのプロファイルを示す。実施例７でさらに説明されているように、腫瘍を担うマウスを、ＭＲＭにて培養したｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）またはＭＲＭにて培養した対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）のいずれかで処理した。その後、養子導入した形質導入Ｔ細胞を腫瘍から単離し、単個細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。終末疲弊Ｔ細胞遺伝子が濃縮されているＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 腫瘍を担うマウスへの養子導入後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ過剰発現の有無にかかわらず）のトランスクリプトームのプロファイルを示す。実施例７でさらに説明されているように、腫瘍を担うマウスを、ＭＲＭにて培養したｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）またはＭＲＭにて培養した対照ＲＯＲ１ＣＡＲ Ｔ細胞（対照Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）のいずれかで処理した。その後、養子導入した形質導入Ｔ細胞を腫瘍から単離し、単個細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。前駆疲弊Ｔ細胞遺伝子が濃縮されているＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 腫瘍を担うマウスへの養子導入後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ過剰発現の有無にかかわらず）のトランスクリプトームのプロファイルを示す。実施例７でさらに説明されているように、腫瘍を担うマウスを、ＭＲＭにて培養したｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）またはＭＲＭにて培養した対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）のいずれかで処理した。その後、養子導入した形質導入Ｔ細胞を腫瘍から単離し、単個細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。幹細胞様遺伝子が濃縮されているＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 腫瘍を担うマウスへの養子導入後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ過剰発現の有無にかかわらず）のトランスクリプトームのプロファイルを示す。実施例７でさらに説明されているように、腫瘍を担うマウスを、ＭＲＭにて培養したｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－ＪｕｎＲ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）またはＭＲＭにて培養した対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（対照Ｒ１２ ＣＡＲ ＭＲＭ）のいずれかで処理した。その後、養子導入した形質導入Ｔ細胞を腫瘍から単離し、単個細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。Ｔ細胞活性化関連遺伝子が濃縮されているＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。 ＲＯＲ１ ＣＡＲを形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎ発現を示す棒グラフである。実施例８でさらに説明されているように、調べたさまざまなＭＲＭのカリウムイオン濃度は４０～８０ｍＭ（すなわち、低濃度から高濃度）の範囲であった。さまざまな形質導入条件（または試験群）は以下のとおりである：（１）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（３）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、さまざまなカリウム濃度のＭＲＭにて培養したＴ細胞；（４）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、さまざまなカリウム濃度のＭＲＭにて培養したＴ細胞。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製のｃ－Ｊｕｎ発現を示す。 ＲＯＲ１ ＣＡＲを形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎ発現を示す棒グラフである。実施例８でさらに説明されているように、調べたさまざまなＭＲＭのカリウムイオン濃度は４０～８０ｍＭ（すなわち、低濃度から高濃度）の範囲であった。さまざまな形質導入条件（または試験群）は以下のとおりである：（１）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（３）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、さまざまなカリウム濃度のＭＲＭにて培養したＴ細胞；（４）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、さまざまなカリウム濃度のＭＲＭにて培養したＴ細胞。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製のｃ－Ｊｕｎ発現を示す。 ＲＯＲ１ ＣＡＲを形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎ発現を示す棒グラフである。実施例８でさらに説明されているように、調べたさまざまなＭＲＭのカリウムイオン濃度は４０～８０ｍＭ（すなわち、低濃度から高濃度）の範囲であった。さまざまな形質導入条件（または試験群）は以下のとおりである：（１）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有しないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを有するＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭにて培養したＴ細胞；（３）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、さまざまなカリウム濃度のＭＲＭにて培養したＴ細胞；（４）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入し、さまざまなカリウム濃度のＭＲＭにて培養したＴ細胞。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製のｃ－Ｊｕｎ発現を示す。 、形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養した幹細胞様ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率の比較を示す。さまざまな試験群は図１５Ａ～１５Ｃに記載されたものと同じである。幹細胞様細胞は細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋によって同定した。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製の結果を示す。 、形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養した幹細胞様ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率の比較を示す。さまざまな試験群は図１５Ａ～１５Ｃに記載されたものと同じである。幹細胞様細胞は細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋によって同定した。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製の結果を示す。 、形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養した幹細胞様ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率の比較を示す。さまざまな試験群は図１５Ａ～１５Ｃに記載されたものと同じである。幹細胞様細胞は細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋によって同定した。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製の結果を示す。 、形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて、形質導入し、培養した幹細胞様ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率の比較を示す。さまざまな試験群は図１５Ａ～１５Ｃに記載されたものと同じである。幹細胞様細胞は細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋によって同定した。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製の結果を示す。 、形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて形質導入し、培養した幹細胞様ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率の比較を示す。さまざまな試験群は図１５Ａ～１５Ｃに記載されたものと同じである。幹細胞様細胞は細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋によって同定した。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製の結果を示す。 、形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて形質導入し、培養した幹細胞様ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率の比較を示す。さまざまな試験群は図１５Ａ～１５Ｃに記載されたものと同じである。幹細胞様細胞は細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋によって同定した。図のそれぞれは、３名の独立したドナーから単離したＴ細胞の生物学的複製の結果を示す。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＮＦ－αの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＮＦ－αの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＮＦ－αの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２の産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＮＦ－αの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＮＦ－αの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１での一次抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＮＦ－αの産生を示す。実施例８でさらに説明されているように、Ｔ細胞（３名の独立したドナーから単離）を形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭのいずれかにて培養した。Ｔ細胞には（１）Ｔ細胞対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）（黒丸）または（２）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）（黒四角）を形質導入した。 抗ＲＯＲ１ ＣＡＲＣＤ８＋Ｔ細胞（形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭで及び培養した）が複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷する能力を示す。実施例８でさらに説明されているように、形質導入したＴ細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比が１：１での抗原によって刺激した。対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の結果を示す。腫瘍生存率は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して算出した（バーが低いほど、細胞傷害性が高くなる）。図のそれぞれでは、腫瘍のみの細胞及び非形質導入（「見せかけ」）Ｔ細胞を対照として使用した。 抗ＲＯＲ１ ＣＡＲＣＤ８＋Ｔ細胞（形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭで及び培養した）が複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷する能力を示す。実施例８でさらに説明されているように、形質導入したＴ細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比が１：１での抗原によって刺激した。ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭで培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の結果を示す。腫瘍生存率は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して算出した（バーが低いほど、細胞傷害性が高くなる）。図のそれぞれでは、腫瘍のみの細胞及び非形質導入（「見せかけ」）Ｔ細胞を対照として使用した。 抗ＲＯＲ１ ＣＡＲＣＤ８＋Ｔ細胞（形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭで及び培養した）が複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷する能力を示す。実施例８でさらに説明されているように、形質導入したＴ細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比が１：４での抗原によって刺激した。対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭにて培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の結果を示す。腫瘍生存率は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して算出した（バーが低いほど、細胞傷害性が高くなる）。図のそれぞれでは、腫瘍のみの細胞及び非形質導入（「見せかけ」）Ｔ細胞を対照として使用した。 抗ＲＯＲ１ ＣＡＲＣＤ８＋Ｔ細胞（形質導入し、ＴＣＭまたはさまざまな濃度でカリウムイオンを含むＭＲＭで及び培養した）が複数回の抗原刺激後に標的腫瘍細胞を殺傷する能力を示す。実施例８でさらに説明されているように、形質導入したＴ細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比が１：４での抗原によって刺激した。ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入し、ＴＣＭまたは４０～８０ｍＭの濃度（すなわち、低濃度から高濃度）のカリウムイオンを含むＭＲＭで培養したＣＤ８＋Ｔ細胞の結果を示す。腫瘍生存率は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して算出した（バーが低いほど、細胞傷害性が高くなる）。図のそれぞれでは、腫瘍のみの細胞及び非形質導入（「見せかけ」）Ｔ細胞を対照として使用した。
細胞免疫療法の有効性は、患者に注入される細胞製剤の存続性、多分化能、及び非対称細胞分裂を含む、いくつかの因子に左右される。細胞療法に使用される細胞の培養及び／または操作に使用される培地は、これらの細胞の代謝的特質、エピジェネティック特質、表現型特質に大きな影響を与える可能性があり、それによって治療可能性に影響を与える。
本開示は、細胞を培養する方法、その方法によって調製された細胞、及び／または細胞培養方法のための組成物またはキットを対象とする。いくつかの態様では、本開示は、養子細胞療法（ＡＣＴ）のための免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎのレベルが上昇するように改変された）の集団を生成する方法を提供し、その際、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は低分化状態を有し、増殖する能力を保持する。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は低分化状態を有し、腫瘍細胞を標的として殺傷する能力を維持する。いくつかの態様では、免疫細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は低分化状態を有し、増殖能力を保持し、腫瘍細胞を標的として殺傷する能力を維持する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従って培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、従来の方法に従って、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞と比べて、ＡＣＴにて高い有効性を有する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、従来の方法に従って、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞と比べて、ＡＣＴにて対象に投与された際、高い存続性を有する。そのような高い存続性は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の腫瘍微小環境に浸潤し、機能する能力、疲弊の発症に耐え、それを遅延させる能力、ならびに連続した増殖及び応答の耐久性を確保する幹細胞性の持続を指す。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従って培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された細胞）は幹細胞様細胞である。そのような細胞は、自己複製、増殖及び分化が可能である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された細胞）は、エフェクター様マーカーも発現する幹細胞様細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、腫瘍細胞を標的とし、殺傷する能力も維持する幹細胞様細胞である。
本開示の細胞培養方法は、培養細胞の多能性及び／または万能性を高めることができ、または細胞がベクターで形質導入されている場合の形質導入効率を高めることができる。いくつかの態様では、培養方法は、細胞が培養される場合、及び／または細胞が生体内での療法に使用される場合に細胞疲弊を減らす及び／または防止することができる。いくつかの態様では、培養方法はまた、生体内生存能、生体内存続性、生体内エフェクター機能、またはそれらの任意の組み合わせを高めることができる。いくつかの態様では、本明細書で開示されている培養方法は、オリゴクローナルまたはポリクローナル腫瘍反応性幹細胞様Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬを濃縮することができる。いくつかの態様では、本明細書で開示されている培養方法は、がん患者に由来するＴＩＬのクローン多様性を保持することができる。
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも約５ｍＭ（例えば、５ｍＭよりも高い）濃度でカリウムを含む代謝再プログラム化培地に細胞を置くことを含む、細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を培養する方法を対象とし、その際、培地は高張性ではなく、例えば、低張性または等張性である。本開示のいくつかの態様は、４０ｍＭよりも高い、例えば、約４０～８０ｍＭ、例えば、５０ｍＭ～８０ｍＭの濃度でカリウムを含む培地に細胞を置くことを含む、細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を培養する方法を対象とする。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本開示のいくつかの態様は、５ｍＭよりも高い（例えば、４０ｍＭ～８０ｍＭの間）濃度でカリウムイオン及び３０ｍＭ～１００ｍＭの間の濃度でＮａＣｌを含む代謝再プログラム化培地にて細胞を培養することを含む、免疫細胞の幹細胞性を高めながら、生体外または試験管内の培養中に免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の収率を高める方法を対象とし、その際、カリウムイオンとＮａＣｌの総濃度は１１０～１４０ｍＭの間である。本開示のいくつかの態様は、５ｍＭより高い（例えば、４０ｍＭ～８０ｍＭの間）濃度のカリウムイオン及び３０ｍＭ～１００ｍＭの間の濃度でＮａＣｌを含む代謝再プログラム化培地にて細胞を培養することを含む、免疫療法のために免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の集団を調製する方法を対象とし、その際、カリウムイオンとＮａＣｌの総濃度は１１０～１４０ｍＭの間である。本開示のいくつかの態様は、５ｍＭより高い（例えば、４０ｍＭ～８０ｍＭの間）濃度でカリウムイオン及び３０ｍＭ～１００ｍＭの間の濃度でＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）を培養することを含む、生体外または試験管内の培養中に免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の幹細胞性を高める方法を対象とし、その際、カリウムイオンとＮａＣｌの総濃度は１１０～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、免疫細胞はＴ細胞である。
いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は等張性である。特定の態様では、培地はさらにインターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、培地はＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、培地はＩＬ－２及びＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、培地はさらに、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように（例えば、ｃ－Ｊｕｎをコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を増やすことができる転写活性化因子によって）免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を改変することは、参照方法と比べて免疫細胞の１以上の特性をさらに改善することができ、その際、参照方法では（ｉ）免疫細胞は改変される（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように）が、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムを含む培地では培養されない；（ｉｉ）免疫細胞は改変されないが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムを含む培地で培養される、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の双方である。そのような方法のさらなる態様は本開示全体を通して提供されている。
Ｉ．用語
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用されるとき、本明細書で明示的に提供されない限り、以下の用語のそれぞれは、以下に示される意味を有することとする。追加の定義は本出願全体を通して示される。
本開示の全体を通して、用語「ａ」または「ａｎ」実体は、その実体のうち１以上を指し、例えば、「ａキメラポリペプチド」は１以上のキメラポリペプチドを表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書では相互交換可能に使用することができる。加えて、「または」は、リスト内の構成成分のオープンリストを意味するのに使用される。例えば、「ＸはＡまたはＢを含む」は、ＸがＡを含む、ＸがＢを含む、ＸがＡ及びＢを含む、またはＸがＡもしくはＢ及び任意の他の構成要素を含むことを意味する。
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用されるとき、他方の有無にかかわらず、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。したがって、「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含するように意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびに「Ｃ」（単独）。
態様が、「含むこと」という言語とともに本明細書に記載されている場合は常に、「から成る」及び／または「から本質的になる」の観点から記載される他の同様の態様もまた提供されることが理解される。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くに関する一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号はそれらの国際単位系（ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲は、明白に述べられない限り範囲を定義する数を含む。
本明細書で使用される略語は本開示全体を通して定義される。本開示の種々の態様は以下の小節にてさらに詳しく記載される。
「約」または「本質的に含む」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値または組成の許容誤差範囲内にある値または組成を指し、これは値または組成がどのように測定または決定されるのか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。たとえば、「約」または「本質的に含む」は、当該技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内または１標準偏差以上を意味することができる。あるいは、「約」または「本質的に含む」は、最大１０％の範囲（たとえば、別途記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された参照値のいずれかの方向（さらに大きいかまたはさらに小さいか）に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内の範囲に収まる値の範囲）を意味することができる。例えば、本明細書で使用されるとき「約５５ｍＭ」には、４９．５ｍＭ～６０．５ｍＭが含まれる。さらに、特に生物系またはプロセスに関して、その用語は最大１桁または最大５倍の値を意味することができる。特定の値または組成物が本出願及び特許請求の範囲で提供される場合、別段の記載がない限り、「約」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成物の許容誤差範囲内にあると想定されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「およそ」という用語は目的の１以上の値に適用される場合、規定の参照値と類似している値を指す。いくつかの態様では、「約」という用語のような「およそ」という用語は、別途明記のない限り、または別途文脈から明らかでない限り（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載の参照値のいずれかの（さらに大きいまたはさらに小さい）方向に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内に入る値の範囲を指す。
本明細書に記載されているように、任意の濃度範囲、比率範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を含み、適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）を含むと理解されるべきである。
「対照培地」、「従来の培養培地」または「参照培養培地」という用語は、本明細書で使用されるとき、本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地（「ＭＲＭ」）と比較した任意の培地を指す。対照培地は、特定のイオン濃度、例えば、カリウムイオンを除き、代謝再プログラム化培地と同じ成分を含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地は、本明細書に記載されているように、１以上のイオン濃度、例えば、カリウムイオン濃度を調整することによって対照培地から調製される。いくつかの態様では、対照培地は、基本培地、例えば、ＣＴＳ（商標）ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）を含む。いくつかの態様では、したがって、対照培地は、代謝再プログラム化培地にも加えられるアミノ酸、グルコース、グルタミン、Ｔ細胞刺激因子、抗体、置換物などを含むが、これらに限定されない１以上の追加の成分を含むが、対照培地は代謝再プログラム化培地とは異なる特定のイオン濃度を有する。別途示されない限り、「培地（ｍｅｄｉａ）」及び「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は相互交換可能に使用することができる。
本明細書で使用されるとき「培養」という用語は生体外及び／または試験管内での細胞の制御された増殖を指す。本明細書で使用されるとき、「培養」は、細胞増殖中、または細胞操作（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、もしくはＴＣＲｍを発現させるための構築物による形質導入）中の本明細書で開示されている細胞、例えば、免疫細胞、例えば、１以上の操作された免疫細胞の増殖を含む。いくつかの態様では、培養細胞は、対象、例えば、ヒト対象／患者から得られる。いくつかの態様では、培養細胞はヒト対象／患者から得られる免疫細胞を含む。いくつかの態様では、培養細胞は本明細書に開示されている１以上の操作された免疫細胞を含む。いくつかの態様では、培養細胞はヒト対象／患者から得られるＴ細胞またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は培養前に精製される。いくつかの態様では、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は腫瘍に浸潤しているＴ細胞及び／またはＮＫ細胞である。いくつかの態様では、培養細胞は本明細書に開示されている１以上の操作された免疫細胞を含む。
「増殖させる」または「増殖」という用語は、免疫細胞培養に関して本明細書で使用されるとき、細胞を刺激し、または活性化し、細胞を培養するプロセスを指す。増殖プロセスは、細胞が刺激され、または活性化され、培養された後、培養細胞の集団にて、所望の細胞の比率または総数の増加、例えば、低分化免疫細胞の比率または総数の増加をもたらすことができる。増殖は、培養細胞の集団におけるすべての細胞型の数が増加することを必要としない。むしろ、いくつかの態様では、培養細胞の集団における細胞のサブセットのみが、増殖中に数が増加するのに対し、他の細胞タイプの数は変化しない場合があり、または減少する場合がある。
本明細書で使用されるとき、「収率」という用語は、培養方法またはその一部の後の細胞の総数を指す。いくつかの態様では、「収率」という用語はＴ細胞の集団における特定の細胞、例えば、幹細胞様Ｔ細胞の集団を指す。収率は、代表的な試料に基づいて収率を推定することを含むが、これに限定されない任意の方法を使用して決定することができる。
「代謝再プログラム化培地（ｍｅｄｉａ）」、「代謝再プログラム化培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、または「ＭＲＭ」という用語は本明細書で使用されるとき、本開示の培地を指し、その際、培地は高カリウム濃度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は４０ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｍＭ，少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約８５ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約９５ｍＭ、または少なくとも約１００ｍＭのカリウムイオンの濃度を含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約４０ｍＭの濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約５０ｍＭの濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約６０ｍＭの濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約７０ｍＭの濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約８０ｍＭの濃度でカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約４０ｍＭ～約８０ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭのＫＣｌ、約０．５ｍＭ～約２．８ｍＭのカルシウム、及び約１０ｍＭ～約２４ｍＭのグルコースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約４０ｍＭ～約８０ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭのカリウムイオン、約０．５ｍＭ～約２．８ｍＭのカルシウム、及び約１０ｍＭ～約２４ｍＭのグルコースを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは、約５５ｍＭ～約９０ｍＭのＮａＣｌ及び約４０ｍＭ～約８０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はさらに、約２５０～約３００ｍＯｓｍｏｌの浸透圧を含む。
本明細書で使用されるとき、「よりも高い」という用語はそれを超えるが、等しくはないことを意味する。例えば、「５ｍＭより高い」は５ｍＭを超える任意の量を意味するが、５ｍＭを含まない。
本明細書で使用されるとき「張度」という用語は、細胞膜を横切る計算された有効浸透圧勾配を指し、カリウムイオンの濃度と塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度の合計に２を掛けた値で表される。張度は、溶液、例えば、培地の浸透圧濃度（ｍＯｓｍ／ｋｇ）または浸透圧モル濃度（ｍＯｓｍ／Ｌ）によって表すことができる。浸透圧濃度と浸透圧モル濃度は、質量あたり（浸透圧濃度）及び体積あたり（浸透圧モル濃度）の溶媒の溶質浸透圧濃度の測定値である。本明細書で使用されるとき、等張培地は約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ（例えば、（［Ｋ＋］＋［ＮａＣｌ］）×２＝２８０）の張度を有する。
本明細書で使用されるとき、低張溶液は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満（例えば、（［Ｋ＋］＋［ＮａＣｌ］）×２＜２８０）の張度を有する。いくつかの態様では、低張培地は少なくとも約２１０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、低張培地は少なくとも約２２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、低張培地は少なくとも約２３０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、低張培地は少なくとも約２４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている低張培地は約２５０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。
本明細書で使用されるとき、高張溶液は、３００ｍＯｓｍ／Ｌを超える（例えば、（［Ｋ＋］＋［ＮａＣｌ］）×２＞３００）張度を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている高張培地は、約３２０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、溶液、例えば、培地の張度はカリウムイオン及びＮａＣｌの濃度を増加または減少させることによって調整される。いくつかの態様では、培地の張度は、ある溶質の増加を第２の溶質の減少で相殺することによって維持することができる。例えば、ナトリウムイオンの濃度を変えることなく培地におけるカリウムイオンの濃度を増加させると、培地の張度が増加し得る。しかしながら、カリウムイオンの濃度が増加し、ナトリウムイオンの濃度が減少する場合、元の培地の張度は維持され得る。
本明細書で使用されるとき、「カリウム」、「カリウムイオン」、「カリウムカチオン」、及び「Ｋ＋」という用語は相互交換可能に使用され、元素カリウムを指す。元素カリウムは溶液中に陽イオンとして存在する。しかしながら、カリウムイオンを含む溶液を調製する標準的な手段は、カリウム含有塩（例えば、ＫＣｌ）を溶液中に希釈することを含むことが、当業者には容易に明らかとなる。したがって、あるモル（Ｍ）濃度でカリウムイオンを含む溶液、例えば、培地は、等モル（Ｍ）濃度のカリウムを含む塩を含むと記載され得る。
本明細書で使用されるとき、「ナトリウムイオン」及び「ナトリウムカチオン」という用語は、元素ナトリウムを指すために交換可能に使用される。元素ナトリウムは、一価カチオンとして溶液中に存在する。しかしながら、ナトリウムイオンを含む溶液を調製する標準的な手段が、ナトリウム含有塩（例えば、ＮａＣｌ）を溶液に希釈することを含むことは当業者に容易に明らかであろう。したがって、あるモル（Ｍ）濃度のナトリウムイオンを含む溶液、例えば、培地は、等モル（Ｍ）濃度のナトリウムを含む塩を含むと記載され得る。
本明細書で使用されるとき、「カルシウムイオン」及び「カルシウムカチオン」という用語は、元素カルシウムを指すために交換可能に使用される。元素カルシウムは、二価カチオンとして溶液中に存在する。しかしながら、カルシウムイオンを含む溶液を調製する標準的な手段が、カルシウム含有塩（例えば、ＣａＣｌ２）を溶液に希釈することを含むことは当業者に容易に明らかであろう。したがって、あるモル（Ｍ）濃度のカルシウムイオンを含む溶液、例えば、培地は、等モル（Ｍ）濃度のカルシウムを含む塩を含むと記載され得る。
本明細書で使用されるとき、「免疫細胞」という用語は免疫系の細胞を指す。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球から選択される。本明細書で使用されるとき、細胞の「集団」は２以上の細胞、例えば、複数の細胞の集合を指す。いくつかの態様では、細胞の集団は、２以上の免疫細胞、例えば、複数の免疫細胞を含む。いくつかの態様では、細胞の集団は、複数のタイプの細胞を含む細胞の異種混合物、例えば、免疫細胞及び非免疫細胞の異種混合物を含む。いくつかの態様では、細胞の集団は複数のＴ細胞を含む。
本明細書で使用されるとき「参照免疫細胞」（または「参照細胞」）という用語は、本明細書に提供されている方法を使用して改変されていない及び／または培養されていない細胞を指す。例えば、いくつかの態様では、参照細胞は、本明細書に記載されているように（例えば、本明細書に提供されているｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列及び／または転写活性化因子のいずれかで）改変されていない細胞（例えば、対応する免疫細胞）を含む。いくつかの態様では、参照細胞は、本開示の培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）で培養された（本明細書に記載されているように改変されていない）そのような細胞を含む。いくつかの態様では、参照細胞は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地（すなわち、参照培地）で培養された（本明細書に記載されているように改変されていない）そのような細胞を含む。いくつかの態様では、参照細胞は、本明細書に記載されているように（例えば、本明細書に提供されているｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列及び／または転写活性化因子のいずれかで）改変されているが、参照培地で培養された細胞を含む。したがって、特に指示されない限り、参照細胞は、以下：（１）本明細書に記載されているように改変されていない細胞（例えば、対応する免疫細胞）；（２）本明細書に記載されているように改変されておらず、本開示の培地で培養もされていない細胞（例えば、対応する免疫細胞）；（３）本明細書に記載されているように改変されていないが、本開示の培地で培養された細胞（例えば、対応する免疫細胞）；（４）本明細書に記載されているように改変されているが、参照培地で培養された細胞（例えば、対応する免疫細胞）、または（５）（１）～（４）の任意の組み合わせのいずれかを含むことができる。少なくとも本開示に基づいて、本明細書で使用される場合「参照細胞」という用語の範囲は、当業者には明らかであろう。
本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は相互交換可能であり、胸腺によって産生または処理されるあらゆるリンパ球を指す。Ｔ細胞の非限定的なクラスには、エフェクターＴ細胞及びＴｈ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＴｈ１細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＴｈ２細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＴｃ１７細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＴｈ１７細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＴｒｅｇ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）である。
本明細書で使用されるとき、「メモリー」Ｔ細胞という用語は、これまでに（例えば、生体内、試験管内、もしくは生体外で）それらの同族抗原に遭遇し、応答したＴ細胞、または例えば、（例えば、試験管内もしくは生体外にて）抗ＣＤ３抗体で刺激されたＴ細胞を指す。二次曝露の際に「メモリー様」表現型を有する免疫細胞、そのようなメモリーＴ細胞は増殖して、一次曝露中よりも速く且つ強い免疫応答を起こすことができる。いくつかの態様では、メモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、組織常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ細胞）、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で使用されるとき、「幹細胞様メモリーＴ細胞」、「Ｔメモリー幹細胞」、または「ＴＳＣＭ細胞」という用語は、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現するメモリーＴ細胞を指し、自己複製する幹細胞様能力ならびにメモリー及びエフェクターＴ細胞サブセットの範囲全体を再構成する多能性を付与されている。
本明細書で使用されるとき、「セントラルメモリーＴ細胞」または「ＴＣＭ細胞」という用語は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現するメモリーＴ細胞を指す。セントラルメモリーＴ細胞は一般にリンパ節内及び末梢循環で見られる。
本明細書で使用されるとき、「エフェクターメモリーＴ細胞」または「ＴＥＭ細胞」という用語は、ＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌの発現を欠いているメモリーＴ細胞を指す。エフェクターメモリーＴ細胞は、リンパ節ホーミング受容体（例えば、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌ）を欠いているので、これらの細胞は通常、末梢循環及び非リンパ組織で見られる。
本明細書で使用されるとき、「組織常在性メモリーＴ細胞」または「ＴＲＭ細胞」という用語は、循環せず、皮膚、肺、及び消化管のような末梢組織に常在しているメモリーＴ細胞を指す。いくつかの態様では、組織常在性メモリーＴ細胞はまた、エフェクターメモリーＴ細胞でもある。
本明細書で使用されるとき、「ナイーブＴ細胞」または「ＴＮ細胞」という用語は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＤ９５を発現しないＴ細胞を指す。ＴＮ細胞はＴ細胞系列にて最も未分化な細胞である。ＴＮ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の相互作用によって、活性化ＴＥＦＦ細胞へのＴＮ細胞の分化及び免疫応答が誘導される。
本明細書で使用されるとき、「幹細胞性」、「幹細胞様」、「幹細胞様」、または「低分化」という用語は、さらにナイーブな表現型と一致するマーカーを発現する細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＴＩＬ）を指す。例えば、低分化Ｔ細胞はＴＮ細胞またはＴＳＣＭ細胞に特徴的な１以上のマーカーを発現することができる。いくつかの態様では、「低分化」または「幹細胞様」のＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現する。いくつかの態様では、「低分化」または「幹細胞様」のＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、及びＴＣＦ７を発現する。いくつかの態様では、「低分化」または「幹細胞様」のＴ細胞はＣＤ４５ＲＡを発現せず、またはＣＤ４５ＲＯ低である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、低分化表現型を有する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を推奨する。特定のメカニズムに束縛されることなく、いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法は、低分化免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）の分化を阻止、阻害、または制限し、その結果、培養中の幹細胞様細胞の数が増加する。例えば、腫瘍を効果的に制御するには、幹細胞様メモリー表現型またはセントラルメモリー表現型を持つ低分化免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の養子移入が好ましいと一般的に考えられている。Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１６１６－１６２６（２００５），Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５（７）：８０８－８１４（２００９），Ｌｙｎｎ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７６（７７８６）：２９３－３００（２０１９）；Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．１２：６７１－６８４（２０１２），Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１－６７０（２０１２）及びＧａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１７（１０）：１２９０－１２９７（２０１１）を参照のこと。
幹細胞性は自己複製能力、多能性、及び増殖能の持続性を特徴とする。いくつかの態様では、幹細胞性は特定の特徴的な遺伝子発現、例えば、多数の遺伝子にわたる発現の組み合わせパターンを特徴とする。いくつかの態様では、幹細胞様細胞は、例えば、本明細書に開示されている幹細胞性の特徴的な遺伝子発現を使用して、トランスクリプトーム分析によって同定され得る（例えば、実施例６及び７を参照のこと）。いくつかの態様では、特徴的な遺伝子発現は、ＡＣＴＮ１、ＤＳＣ１、ＴＳＨＺ２、ＭＹＢ、ＬＥＦ１、ＴＩＭＤ４、ＭＡＬ、ＫＲＴ７３、ＳＥＳＮ３、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＬＯＣ２８３１７４、ＴＣＦ７、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＬＡＳＳ６、ＵＢＥ２Ｅ２、ＩＬ７Ｒ、ＧＣＮＴ４、ＴＡＦ４Ｂ、ＳＵＬＴ１Ｂ１、ＳＥＬＰ、ＫＲＴ７２、ＳＴＸＢＰ１、ＴＣＥＡ３、ＦＣＧＢＰ、ＣＸＣＲ５、ＧＰＡ３３、ＮＥＬＬ２、ＡＰＢＡ２、ＳＥＬＬ、ＶＩＰＲ１、ＦＡＭ１５３Ｂ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＧＪＢ６、ＯＣＭ２、ＧＣＥＴ２、ＬＲＲＮ１、ＩＬ６ＳＴ、ＬＲＲＣ１６Ａ、ＩＧＳＦ９Ｂ、ＥＦＨＡ２、ＬＯＣ１２９２９３、ＡＰＰ、ＰＫＩＡ、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＣＨＭＰ７、ＫＩＡＡ０７４８、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＦＬＪ１３１９７、ＮＲＣＡＭ、Ｃ５ｏｒｆ１３、ＧＩＰＣ３、ＷＮＴ７Ａ、ＦＡＭ１１７Ｂ、ＢＥＮＤ５、ＬＧＭＮ、ＦＡＭ６３Ａ、ＦＡＭ１５３Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ１１、ＲＢＭ１１、ＲＩＣ３、ＬＤＬＲＡＰ１、ＰＥＬＩ１、ＰＴＫ２、ＫＣＴＤ１２、ＬＭＯ７、ＣＥＰ６８、ＳＤＫ２、ＭＣＯＬＮ３、ＺＮＦ２３８、ＥＤＡＲ、ＦＡＭ１５３Ｃ、ＦＡＡＨ２、ＢＣＬ９、Ｃ１７ｏｒｆ４８、ＭＡＰ１Ｄ、ＺＳＷＩＭ１、ＳＯＲＢＳ３、ＩＬ４Ｒ、ＳＥＲＰＩＮＦ１、Ｃ１６ｏｒｆ４５、ＳＰＴＢＮ１、ＫＣＮＱ１、ＬＤＨＢ、ＢＺＷ２、ＮＢＥＡ、ＧＡＬ３ＳＴ４、ＣＲＴＣ３、ＭＡＰ３Ｋ１、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＲＡＢ４３、ＳＧＴＢ、ＣＮＮ３、ＣＷＨ４３、ＫＬＨＬ３、ＰＩＭ２、ＲＧＭＢ、Ｃ１６ｏｒｆ７４、ＡＥＢＰ１、ＳＮＯＲＤ１１５－１１、ＳＮＯＲＤ１１５－１１、ＧＲＡＰ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む（例えば、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７（１０）：１２９０－９７（２０１１）を参照のこと）。いくつかの態様では、特徴的な遺伝子発現は、ＮＯＧ、ＴＩＭＤ４、ＭＹＢ、ＵＢＥ２Ｅ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＨＡＶＣＲ１、ＦＣＧＢＰ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＴＰＳＴ１、ＡＣＴＮ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＲＴ７２、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＧＪＢ６、ＬＲＲＮ１、ＰＲＡＧＭＩＮ、ＧＩＰＣ３、ＦＬＮＢ、ＡＲＲＢ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＮＵＣＢ２、ＬＲＲＣ７、ＭＹＯ１５Ｂ、ＭＡＬ、ＡＥＢＰ１、ＳＤＫ２、ＢＺＷ２、ＧＡＬ３ＳＴ４、ＰＩＴＰＮＭ２、ＺＮＦ４９６、ＦＡＭ１１７Ｂ、Ｃ１６ｏｒｆ７４、ＴＤＲＤ６、ＴＳＰＡＮ３２、Ｃ１８ｏｒｆ２２、Ｃ３ｏｒｆ４４、ＬＯＣ１２９２９３、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＭＬＸＩＰ、Ｃ７ｏｒｆ１０、ＳＴＸＢＰ１、ＫＣＮＱ１、ＦＬＪ１３１９７、ＬＤＬＲＡＰ１、ＲＡＢ４３、ＲＩＮ３、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＡＧＢＬ３、ＴＣＥＡ３、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＦＡＭ１５３Ｂ、ＦＡＭ１５３Ｃ、ＶＩＰＲ１、ＭＭＰ１９、ＨＢＳ１Ｌ、ＥＥＦ２Ｋ、ＳＮＯＲＡ５Ｃ、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＦＬＪ４３３９０、ＲＰ６－２１３Ｈ１９．１、ＩＮＰＰ５Ａ、ＰＩＭ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＮＲＫ、ＬＯＣ１００１２８２８８、ＰＩＧＶ、ＬＯＣ１００１２９８５８、ＳＰＴＢＮ１、ＰＲＯＳ１、ＭＭＰ２８、ＨＥＳ１、ＣＡＣＨＤ１、ＮＳＵＮ５Ｃ、ＬＥＦ１、ＴＴＴＹ１４、ＳＮＯＲＡ５４、ＨＳＦ２、Ｃ１６ｏｒｆ６７、ＮＳＵＮ５Ｂ、ＫＩＡＡ１２５７、ＮＲＧ２、ＣＡＤ、ＴＡＲＢＰ１、ＳＴＲＡＤＢ、ＭＴ１Ｆ、ＴＭＥＭ４１Ｂ、ＰＤＨＸ、ＫＤＭ６Ｂ、ＬＯＣ１００２８８３２２、ＵＸＳ１、ＬＧＭＮ、ＮＡＮＯＳ２、ＰＹＧＢ、ＲＡＳＧＲＰ２、Ｃ１４ｏｒｆ８０、ＸＰＯ６、ＳＬＣ２４Ａ６、ＦＡＭ１１３Ａ、ＭＲＭ１、ＦＢＸＷ８、ＮＤＵＦＳ２、ＫＣＴＤ１２、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む（例えば、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，１７（１０）：１２９０－１２９７（２０１１）を参照のこと）。いくつかの態様では、特徴的な遺伝子発現は、ＳＥＬＬ、ＣＣＲ７、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ３、ＴＣＦ７、ＧＰＲ１８３、ＳＣ５Ｄ、ＦＡＡＨ２、ＬＴＢ、ＳＥＳＮ３、ＭＡＬ、ＴＳＨＺ２、ＬＥＦ１、ＡＰ３Ｍ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＩＣＡＭ２、ＰＬＡＣ８、ＳＣＭＬ１、ＩＬ７Ｒ、ＡＢＬＩＭ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＴＲＡＢＤ２Ａ、ＳＡＴＢ１、ＡＬＧ１３、ＡＲＩＤ５Ａ、ＢＡＣＨ２、ＰＡＢＰＣ１、ＧＰＣＰＤ１、ＮＥＬＬ２、ＴＡＦ４Ｂ、ＦＣＭＲ、ＡＲＲＤＣ２、Ｃ１ｏｒｆ１６２、ＦＡＭ１７７Ａ１、ＡＮＫＲＤ１２、ＴＸＫ、ＳＯＲＬ１、ＡＱＰ３、ＡＤＴＲＰ、ＦＸＹＤ７、ＣＤ２８、Ｐ２ＲＹ８、ＣＲＹＢＧ１、ＴＮＦＳＦ８、ＢＥＸ２、ＰＧＡＰ１、ＰＴＧＥＲ４、ＭＡＭＬ２、ＢＥＸ３、ＰＣＳＫ１Ｎ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＡＣ１１９３９６．１、ＣＸＣＲ５、ＬＩＮＣ００４０２、ＣＣＲ４、ＩＬ６Ｒ、ＺＢＴＢ１０、ＩＴＧＡ６、ＡＲＭＨ１、ＲＩＬＰＬ２、ＦＯＸＰ１、ＴＥＳＰＡ１、ＹＰＥＬ５、ＬＰＡＲ６、ＣＭＳＳ１、ＲＩＰＯＲ２、ＺＮＦ３３１、ＥＭＰ３、ＧＩＭＡＰ７、ＷＤＲ７４、ＲＩＣ３、ＣＹＳＬＴＲ１、ＩＴＧＢ１、ＣＤ５、ＳＡＭＨＤ１、ＳＥＲＩＮＣ５、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む（例えば、Ｃａｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１２６－１３２（２０２１）を参照のこと）。
本明細書で使用されるとき、「エフェクター様」または「エフェクター細胞様」という用語は、腫瘍細胞殺傷能力及びサイトカイン多機能性、例えば、炎症性サイトカイン及び／または細胞傷害性分子を産生する細胞の能力を指す。いくつかの態様では、エフェクター様細胞は細胞によって発現される特定のマーカーを特徴とする。いくつかの態様では、それらのエフェクター様マーカーはｐＳＴＡＴ５＋、ＳＴＡＴ５＋、ｐＳＴＡＴ３＋、及びＳＴＡＴ３＋のうちの１以上を含む。いくつかの態様では、エフェクター様マーカーはＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＩＳＨ、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＨ１、ＣＴＦ１、ＥＰ３００、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＧＨ１、ＧＨ２、ＧＨＲ、ＧＲＢ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＬＲ１、ＩＦＮＷ１、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１９、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＩＬ２６、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＲＦ９、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＬＥＰ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＩＭ１、ＰＲＬ、ＰＲＬＲ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ６、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ７、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＳＰＲＥＤ１、ＳＰＲＥＤ２、ＳＰＲＹ１、ＳＰＲＹ２、ＳＰＲＹ３、ＳＰＲＹ４、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＴＰＯ、ＴＳＬＰ、ＴＹＫ２、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるＳＴＡＴ標的を含む。いくつかの態様では、エフェクター様細胞はトランスクリプトーム分析によって特徴づけられる。いくつかの態様では、エフェクター様マーカーは、Ｋａｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１１：８３７－５１（２００２）；Ｔｒｉｐａｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８５：２１１６－２４（２０１０）；及び／またはＪｏｈｎｎｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：ｅａｂｅ３７０２（Ｊａｎ．１５，２０２１）に開示されているマーカーを含み、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、エフェクター様細胞は、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７（１０）：１２９０－９７（２０１１）に記載されているエフェクター関連遺伝子セットを使用して特徴づけられる。いくつかの態様では、エフェクター様細胞の特徴的な遺伝子発現は、ＭＴＣＨ２、ＲＡＢ６Ｃ、ＫＩＡＡ０１９５、ＳＥＴＤ２、Ｃ２ｏｒｆ２４、ＮＲＤ１、ＧＮＡ１３、ＣＯＰＡ、ＳＥＬＴ、ＴＮＩＰ１、ＣＢＦＡ２Ｔ２、ＬＲＰ１０、ＰＲＫＣＩ、ＢＲＥ、ＡＮＫＳ１Ａ、ＰＮＰＬＡ６、ＡＲＬ６ＩＰ１、ＷＤＦＹ１、ＭＡＰＫ１、ＧＰＲ１５３、ＳＨＫＢＰ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＨＣＮ３、ＧＴＰＢＰ１、ＴＬＮ１、Ｃ４ｏｒｆ３４、ＫＩＦ３Ｂ、ＴＣＩＲＧ１、ＰＰＰ３ＣＡ、ＡＴＧ４Ｄ、ＴＹＭＰ、ＴＲＡＦ６、Ｃ１７ｏｒｆ７６、ＷＩＰＦ１、ＦＡＭ１０８Ａ１、ＭＹＬ６、ＮＲＭ、ＳＰＣＳ２、ＧＧＴ３Ｐ、ＧＡＬＫ１、ＣＬＩＰ４、ＡＲＬ４Ｃ、ＹＷＨＡＱ、ＬＰＣＡＴ４、ＡＴＧ２Ａ、ＩＤＳ、ＴＢＣ１Ｄ５、ＤＭＰＫ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ６、ＲＥＥＰ５、ＡＢＨＤ６、ＫＩＡＡ０２４７、ＥＭＢ、ＴＳＥＮ５４、ＳＰＩＲＥ２、ＰＩＷＩＬ４、ＺＳＣＡＮ２２、ＩＣＡＭ１、ＣＨＤ９、ＬＰＩＮ２、ＳＥＴＤ８、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＵＬＢＰ３、ＩＬ１５ＲＡ、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＬＣＰ１、ＣＨＰ、ＲＵＮＸ３、ＴＭＥＭ４３、ＲＥＥＰ４、ＭＥＦ２Ｄ、ＡＢＬ１、ＴＭＥＭ３９Ａ、ＰＣＢＰ４、ＰＬＣＤ１、ＣＨＳＴ１２、ＲＡＳＧＲＰ１、Ｃ１ｏｒｆ５８、Ｃ１１ｏｒｆ６３、Ｃ６ｏｒｆ１２９、ＦＨＯＤ１、ＤＫＦＺｐ４３４Ｆ１４２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＩＴＰＲ３、ＢＴＧ３、Ｃ４ｏｒｆ５０、ＣＮＮＭ３、ＩＦＩ１６、ＡＫ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＲＥＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＶＤ、ＴＴＣ３９Ｃ、ＰＬＥＫＨＡ２、ＦＫＢＰ１１、ＥＭＬ４、ＦＡＮＣＡ、ＣＤＣＡ４、ＦＵＣＡ２、ＭＦＳＤ１０、ＴＢＣＤ、ＣＡＰＮ２、ＩＱＧＡＰ１、ＣＨＳＴ１１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＭＹＯ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＤＬＧ３、ＭＸＤ４、ＲＡＬＧＤＳ、Ｓ１ＰＲ５、ＷＳＢ２、ＣＣＲ３、ＴＩＰＡＲＰ、ＳＰ１４０、ＣＤ１５１、ＳＯＸ１３、ＫＲＴＡＰ５－２、ＮＦ１、ＰＥＡ１５、ＰＡＲＰ８、ＲＮＦ１６６、ＵＥＶＬＤ、ＬＩＭＫ１、ＣＡＣＮＢ１、ＴＭＸ４、ＳＬＣ６Ａ６、ＬＢＡ１、ＳＶ２Ａ、ＬＬＧＬ２、ＩＲＦ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＣＤ９９、ＲＡＰＧＥＦ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＯＳＢＰＬ７、ＦＯＸＰ４、ＳＬＡ２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＳＴ７、ＪＡＺＦ１、ＧＧＡ２、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＣＤ６８、ＬＰＧＡＴ１、ＳＴＸ１１、ＺＡＫ、ＦＡＭ１６０Ｂ１、ＲＯＲＡ、Ｃ８ｏｒｆ８０、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＴＧＦＢＩ、ＤＮＡＪＣ１、ＧＰＲ１１４、ＬＲＰ８、ＣＤ６９、ＣＭＩ、ＮＡＴ１３、ＴＧＦＢ１、ＦＬＪ０００４９、ＡＮＴＸＲ２、ＮＲ４Ａ３、ＩＬ１２ＲＢ１、ＮＴＮＧ２、ＲＤＸ、ＭＬＬＴ４、ＧＰＲＩＮ３、ＡＤＣＹ９、ＣＤ３００Ａ、ＳＣＤ５、ＡＢＩ３、ＰＴＰＮ２２、ＬＧＡＬＳ１、ＳＹＴＬ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＴＢＫ１、ＰＭＡＩＰ１、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＧＣＮＴ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＳＴＯＭ、ＣＡＬＨＭ２、ＡＢＣＡ２、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＳＹＮＥ２、ＰＡＭ、Ｃ１２ｏｒｆ７５、ＣＬＣＦ１、ＭＸＲＡ７、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＣＬＳＴＮ３、ＡＣＯＴ９、ＨＩＰ１、ＬＡＧ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＣＢＬＤ１、ＫＬＦ６、ＣＡＣＮＢ３、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＡＢ２７Ａ、ＦＡＤＳ３、ＤＬＧ５、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＡＣＴＮ４、ＴＢＫＢＰ１、ＡＴＸＮ１、ＡＲＡＰ２、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＦＡＭ５３Ｂ、ＭＡＮ１Ａ１、ＦＡＭ３８Ａ、ＰＬＸＮＣ１、ＧＲＬＦ１、ＳＲＧＮ、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＷＩＰＩ１、ＰＴＰＲＪ、ＳＬＦＮ１１、ＤＵＳＰ２、ＡＮＸＡ５、ＡＨＮＡＫ、ＮＥＯ１、ＣＬＩＣ１、ＥＩＦ２Ｃ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＩＬ２ＲＢ、ＰＬＥＫＨＧ１、ＭＹＯ６、ＧＴＤＣ１、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＧＡＬＭ、ＴＡＲＰ、ＡＤＡＭ８、ＭＳＣ、ＨＮＲＰＬＬ、ＳＹＴ１１、ＡＴＰ２Ｂ４、ＮＨＳＬ２、ＭＡＴＫ、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＰＩＫ３Ｒ３、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＭＢＯＡＴ１、ＧＹＧ１、ＫＡＴＮＡＬ１、ＦＡＭ４６Ｃ、ＺＣ３ＨＡＶ１Ｌ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＣＴＮＮＡ１、ＮＰＣ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＲＩＭ１、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＲＮ１、ＹＰＥＬ１、ＴＢＸ２１、ＳＬＣ１Ａ４、ＦＡＳＬＧ、ＰＨＡＣＴＲ２、ＧＡＬＮＴ３、ＡＤＲＢ２、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＴＬＲ３、ＰＬＥＫＨＡ５、ＤＵＳＰ１０、ＧＮＡＯ１、ＰＴＧＤＲ、ＦＲＭＤ４Ｂ、ＡＮＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、ＣＡＤＭ１、ＭＡＦ、ＴＰＲＧ１、ＮＢＥＡＬ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＰＥＬＯ、ＳＬＣ４Ａ４、ＫＬＲＦ１、ＦＯＳＬ２、ＲＧＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＰＲＦ１、ＭＹＯ１Ｆ、ＧＡＢ３、Ｃ１７ｏｒｆ６６、ＭＩＣＡＬ２、ＣＹＴＨ３、ＴＯＸ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＳＹＮＥ１、ＷＥＥ１、ＰＹＨＩＮ１、Ｆ２Ｒ、ＰＬＤ１、ＴＨＢＳ１、ＣＤ５８、ＦＡＳ、ＮＥＴＯ２、ＣＸＣＲ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ２、ＤＵＳＰ４、ＡＵＴＳ２、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＫＬＲＧ１、ＴＮＩＰ３、ＧＺＭＡ、ＰＲＲ５Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＳＴ８ＳＩＡ６、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＰＲＭ、ＧＦＰＴ２、ＭＹＢＬ１、ＳＬＡＭＦ７、ＦＬＪ１６６８６、ＧＮＬＹ、ＺＥＢ２、ＣＳＴ７、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＣＣＬ５、ＫＬＲＤ１、ＫＬＲＢ１、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む（例えば、以下を参照：Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１７（１０）：１２９０－９７（２０１１））。
本明細書でさらに説明されているように（例えば、実施例７を参照）、いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）の特性は、Ｔ細胞活性化（本明細書では「ＴＡＣＴ遺伝子」とも呼ばれる）、Ｔ細胞前駆疲弊（本明細書では「ＴＰＥ遺伝子」とも呼ばれる）、Ｔ細胞の終末疲弊（本明細書では「ＴＴＥ遺伝子」とも呼ばれる）に関連するさまざまな遺伝子セットの上方調節及び／または下方調節を比較することによって、トランスクリプトーム解析を使用して評価することができる。
いくつかの態様では、終末期に疲弊したＴ細胞は、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１１９－１２５（２０２１）に記載されているＴＴＥ関連遺伝子セットを使用して特徴付けられる。いくつかの態様では、ＴＴＥ細胞の特徴的な遺伝子発現は、ＫＲＴ８６、ＲＤＨ１０、ＡＣＰ５、ＣＸＣＲ６、ＨＭＯＸ１、ＬＡＹＮ、ＣＬＩＣ３、ＨＡＶＣＲ２、ＡＣ２４３８２９．４、ＰＲＦ１、ＳＬＣ２Ａ８、ＣＨＳＴ１２、ＧＡＬＮＴ２、ＥＮＴＰＤ１、ＬＡＧ３、ＧＺＭＢ、ＰＤＣＤ１、ＣＡＲＤ１６、ＣＴＬＡ４、ＳＬＡ２、ＣＤ２７、ＲＡＬＡ、ＶＣＡＭ１、ＳＹＮＧＲ２、ＮＫＧ７、ＬＳＰ１、ＣＣＬ５、ＲＡＲＲＥＳ３、ＣＤ７、ＣＴＳＷ、ＭＴＳＳ１、ＰＴＭＳ、ＢＡＴＦ、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＡＫＡＰ５、ＣＤ３８、ＲＡＢ２７Ａ、ＧＺＭＨ、ＩＧＦＬＲ１、ＡＴＰ８Ｂ４、ＣＤ６３、ＨＯＰＸ、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＤＧＲＧ１、ＰＬＰＰ１、ＣＳＦ１、ＴＮＦＳＦ１０、ＳＮＡＰ４７、ＬＩＮＣ０１８７１、ＭＹＯ１Ｅ、ＺＢＥＤ２、ＡＨＩ１、ＡＢＩ３、ＦＡＳＬＧ、ＴＹＭＰ、ＺＢＴＢ３８、ＣＴＳＢ、ＰＬＳＣＲ１、ＡＦＡＰ１Ｌ２、ＩＴＧＡＥ、ＴＮＳ３、ＤＵＳＰ１６、ＣＡＳＰ１、ＣＡＲＳ、ＤＵＳＰ５、ＩＦＩＴ１、ＳＬＣ１Ａ４、ＧＯＬＩＭ４、ＲＳＡＤ２、ＤＮＰＨ１、ＮＢＬ１、ＡＣＯＴ９、ＡＢＨＤ６、ＯＡＳ１、ＳＬＣ２７Ａ２、ＺＢＰ１、ＣＤ２００Ｒ１、ＯＡＳ３、ＣＭＰＫ２、ＴＮＦＳＦ４、ＰＯＬＲ１Ｅ、ＣＡＤＭ１、ＨＥＬＺ２、ＳＹＴＬ２、ＡＧＰＡＴ２、ＵＢＥ２Ｆ、ＧＩＭＡＰ６、ＺＢＴＢ３２、ＲＩＮ３、ＰＬＥＫＨＦ１、ＣＨＰＦ、ＰＡＣＳＩＮ２、ＡＢＣＢ１、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＵＳＰ１８、ＴＭＥＭ９、ＫＬＲＣ１、ＭＰＳＴから選択される１以上の遺伝子またはすべての遺伝子を含む。いくつかの態様では、前駆疲弊Ｔ細胞は、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１１９－１２５（２０２１）に記載されているＴＰＥ関連遺伝子セットを使用して特徴付けられる。いくつかの態様では、ＴＰＥ細胞の特徴的な遺伝子発現は、ＦＸＹＤ６、ＣＡＶ１、ＧＮＧ４、ＸＣＬ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＸＣＬ１３、ＧＥＭ、ＸＣＬ２、ＦＸＹＤ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＬＡＮＣＬ２、ＲＡＳＳＦ４、ＢＡＧ３、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＳＰＢ１、ＦＡＢＰ５、ＭＳ４Ａ６Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＲＧＳ２、ＤＲＡＩＣ、ＣＤ７４、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＥ１、ＣＤ８２、ＴＯＸ、ＣＤ２００、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＮＲ４Ａ２、ＶＣＡＭ１、ＢＥＸ３、ＡＩＦ１、ＤＮＡＪＡ１、ＨＳＰＨ１、ＤＮＡＪＢ１、ＨＩＰＫ２、ＬＨＦＰＬ６、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＧＫ、ＴＳＨＺ２、ＬＰＬ、Ｃ１６ｏｒｆ４５、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＣＤ８０、ＥＴＶ１、ＮＭＢ、ＤＥＤＤ２、ＣＭＣ１、ＰＯＮ２、ＳＥＭＡ４Ａ、ＥＮＣ１、ＧＲＡＭＤ１Ａ、ＭＹＬ６Ｂ、ＢＣＡＴ１、ＡＲＭＨ１、ＴＩＡＭ１、ＰＩＫＦＹＶＥ、ＭＲＰＬ１８、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＬＭＣＤ１、ＳＥＳＮ３、ＣＣＤＣ６、ＫＩＡＡ１３２４、ＣＨＮ１、ＡＮＫＲＤ１０、ＣＤ７０、ＰＲＲＧ４、ＴＮＦＳＦ４、ＣＯＲＯ１Ｂ、ＤＮＡＪＢ４、ＭＡＧＥＨ１、ＩＣＡＭ１、ＧＧＴ１、ＮＩＮＪ２、ＢＬＶＲＡ、ＦＡＡＨ２、ＴＯＸ２、ＳＬＫ、ＣＣＤＣ１４１、ＡＴＦ３、ＩＮＰＰ１、ＦＡＭ３Ｃ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＡＰＰ、ＭＡＬ、ＳＩＴ１、ＤＲＡＭ１、ＣＬＥＣＬ１、ＭＤＦＩＣ、ＰＭＣＨ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＰＨＦ６、ＡＦＡＰ１Ｌ２、ＢＴＮ２Ａ２、ＣＣＬ４Ｌ２から選択される１以上の遺伝子またはすべての遺伝子を含む。いくつかの態様では、活性化Ｔ細胞（ＴＡＣＴ）は、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１１９－１２５（２０２１）に記載されているＴＡＣＴ関連遺伝子セットを使用して特徴付けられる。いくつかの態様では、活性化Ｔ細胞の特徴的な遺伝子発現は、ＥＧＲ１、ＨＳＰＡ６、ＦＯＳ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＮＲ４Ａ１、ＦＯＳＢ、ＡＴＦ３、ＤＮＡＪＢ１、ＤＵＳＰ１、ＪＵＮＢ、ＣＤ６９、ＮＲ４Ａ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＫＬＦ６、ＤＮＡＪＡ１、ＪＵＮ、ＳＲＳＦ７、ＳＬＣ２Ａ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＩＥＲ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＥＩＦ４Ａ２、ＩＤ１、ＩＦＲＤ１、ＣＣＮＬ１、ＲＳＲＰ１、ＳＥＲＴＡＤ１、ＤＥＤＤ２、ＫＬＦ１０、ＡＬ１１８５１６．１、ＫＬＦ２、ＺＦＡＮＤ２Ａ、ＣＬＫ１、ＲＳＲＣ２、ＩＥＲ３、ＢＴＧ２、ＭＹＬＩＰ、ＭＡＦＦ、ＣＳＲＮＰ１、ＩＤ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＢＡＧ３、ＳＮＨＧ１２、ＴＮＦ、ＤＤＩＴ４、ＳＧＫ１、ＳＮＨＧ１５、ＤＮＡＪＢ４、ＮＲ４Ａ３、ＮＦＫＢＩＤ、ＳＣＭＬ１、ＲＡＳＤ１、ＡＴＦ４、ＡＲＥＧ、ＲＡＳＧＥＦ１Ｂ、ＡＣ０２０９１６．１、ＤＤＩＴ３、ＳＮＨＧ８、ＣＩＴＥＤ２、ＴＸＮＩＰ、ＴＯＢ１、ＰＩＭ２、ＳＯＣＳ３、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１６、ＴＩＰＡＲＰ、ＮＦＫＢＩＺ、ＣＣＬ４、ＣＤ８３、ＰＰＰ１Ｒ１０、ＣＣＬ４Ｌ２、ＳＥＳＮ２、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＬＥＦ１、ＣＳＫＭＴ、ＨＥＸＩＭ１、ＨＳＰＡ２、ＭＲＰＬ１８、ＲＢＫＳ、ＣＤ５５、ＡＲＲＤＣ２、ＳＣ５Ｄ、ＦＡＭ５３Ｃ、ＡＴＰ２Ｂ１－ＡＳ１、ＩＦＮＧ、ＭＹＣ、ＴＳＣ２２Ｄ２、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＬＲＩＦ１、ＡＲＲＤＣ３、ＩＬＦ３－ＤＴ、ＩＮＴＳ６、ＺＮＦ１０、ＰＲＭＴ９、ＡＴＭ、ＳＥＬＬ、ＡＣ２４３９６０．１から選択される１以上またはすべての遺伝子を含む。
本明細書で使用されるとき、「基本」培地という用語は、本明細書に開示されている追加の要素、例えば、カリウム、ナトリウム、カルシウム、グルコース、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの任意の組み合わせのうち１以上で補完されている任意の出発培地を指す。基本培地は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を培養するための任意の培地であることができる。いくつかの態様では、基本培地は、平衡塩類溶液（例えば、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＥＢＳＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、クリック培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ＲＰＭＩ１６４０、グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）、アルファ最小必須培地（アルファＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍ１９９、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）Ｐｒｏ、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞増殖基本培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）完全、ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＩＭ Ｖ（商標）、ＴＥＸＭＡＣＳ（商標）培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）Ｔ細胞ＣＤＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ）、ＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）、ＴＩＬ増殖培地、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、基本培地は無血清である。いくつかの態様では、基本培地はＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）Ｔ細胞ＣＤＭを含む。いくつかの態様では、基本培地はＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）を含む。いくつかの態様では、基本培地はＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）Ｐｒｏを含む。いくつかの態様では、基本培地はさらに、免疫細胞血清置換（ＩＣＳＲ）を含む。例えば、いくつかの態様では、基本培地は、ＩＣＳＲで補完したＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）完全、ＩＣＳＲで補完したＡＩＭ Ｖ（商標）、ＩＣＳＲで補完ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）ＸＦ、ＩＣＳＲで補完ＲＰＭＩ、ＩＣＳＲで補完したＴＥＸＭＡＣＳ（商標）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、好適な基本培地には、クリック培地、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（商標）（ＣＴＳ（商標））培地、ＳＴＥＭＬＩＮＥ（登録商標）Ｔ細胞増殖培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡＩＭ Ｖ（商標）培地（ＣＴＳ（商標））、ＴＥＸＭＡＣＳ（商標）培地（ＭＩＬｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（登録商標）培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）Ｔ細胞増殖ＸＳＦＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、イスコフ培地、及び／またはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。いくつかの態様では、基本培地はＮａＣｌ非含有ＣＴＳ（商標）ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）を含む。いくつかの態様では、基本培地はＮａＣｌに加えて１以上のナトリウム塩を含む。
本明細書で使用されるとき、「サイトカイン」という用語は、細胞間の相互作用及び伝達に対して特定の効果を有する、細胞によって放出される小さな分泌タンパク質を指す。サイトカインの非限定的な例には、インターロイキン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１０、ＩＬ－２０、ＩＬ－１４、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１及びＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮ、例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、ならびに形質転換増殖因子（ＴＧＦ）ファミリーメンバーが挙げられる。本開示のいくつかの態様は、サイトカインを含む培地中にて本明細書で開示されている免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、または１以上の操作された免疫細胞を培養する及び／または増殖させる方法を対象とする。いくつかの態様では、サイトカインはインターロイキンである。いくつかの態様では、サイトカインはＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ＩＬ－２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ６０５６８）は、抗原刺激または分裂促進刺激に応答してＴ細胞によって産生される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞増殖と、免疫応答の制御に重要な他の活性とを刺激することが知られている。ＩＬ－７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１３２３２）はリンパ球前駆細胞の増殖を刺激することができる造血成長因子である。ＩＬ－７はＢ細胞成熟の特定の段階中に増殖にて役割を担うと考えられている。ＩＬ－１５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０９３３）はＩＬ－２と同様にＴリンパ球の増殖を刺激するサイトカインである。ＩＬ－２１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＨＢＥ４）は免疫調節活性を持つサイトカインである。ＩＬ－２１は、自然免疫と適応免疫との間の移行を促進し、Ｂ細胞にてＩｇＧ１及びＩｇＧ３の産生を誘導すると考えられている。ＩＬ－２１はまた、ＩＬ－１５との相乗作用でナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖及び成熟にて役割を担う場合があり、ＩＬ－２１は、活性化刺激に応答して成熟Ｂ細胞及びＴ細胞の増殖を調節する場合がある。ＩＬ－１５及びＩＬ－１８との相乗作用では、ＩＬ－１５はＴ細胞及びＮＫ細胞中にてインターフェロンガンマ産生も刺激し、ＩＬ－２１はＴ細胞が介在する免疫応答にて樹状細胞の活性化及び成熟を阻害する場合もある。
本明細書で使用されるとき、「投与すること」は、種々の方法及び送達システムのいずれかを使用して、治療剤または治療剤を含む組成物を対象に物理的に導入することを指す。本明細書に記載されている治療剤（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されているように培養された免疫細胞または免疫細胞の集団）のさまざまな投与経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入による投与が挙げられる。
「非経口投与」という語句は、本明細書で使用されるとき、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、これには限定しないで、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、腫瘍内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、気管内、経肺、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、心室内、硝子体内、硬膜外、及び胸骨内の注射及び注入、と同様に生体内エレクトロポレーションが挙げられる。
あるいは、本明細書に記載されている治療剤（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されているように培養された免疫細胞）は、非経口ではない経路、例えば、局所、表皮、または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸内、舌下、または局所を介して投与することができる。投与することはまた、例えば、１回、複数回、及び／または１以上の長期間にわたって実施され得る。
本明細書で使用されるとき、「細胞操作」または「細胞改変」（その誘導体を含む）は、本明細書に開示されている細胞、例えば、免疫細胞の的を絞った改変を指す。いくつかの態様では、細胞操作は、ウイルス遺伝子操作、非ウイルス遺伝子操作、Ｔ細胞機能を改善する１以上の内在性遺伝子の腫瘍特異的標的化（例えば、抗ＲＯＲ１結合タンパク質）導入を可能にする受容体の導入、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の機能を改善する１以上の合成遺伝子（例えば、改変されていない対応する細胞と比べて、免疫細胞がｃ－Ｊｕｎの発現の上昇を示すような、ｃ－Ｊｕｎをコードするポリヌクレオチド）の導入、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本開示の他の箇所でさらに説明されているように、いくつかの態様では、転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づく）によって細胞を操作する、または改変することができ、その際、転写活性化因子は、目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の内在性発現を誘導する及び／または増やすことが可能である。
本明細書で使用されるとき、「抗原」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはハプテンのような任意の天然または合成の免疫原性物質を指す。本明細書で使用されるとき、「同族抗原」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が認識することによって免疫細胞の活性化を誘導する（例えば、サイトカイン産生のようなエフェクター機能を誘導する、及び／または細胞増殖のための細胞内シグナルを始動させる）抗原を指す。いくつかの態様では、抗原は腫瘍抗原を含む。いくつかの態様では、抗原はネオ抗原を含む。
「がん」は、体内の異常細胞の無制御の増殖を特徴とする種々の疾患の広範な群を指す。無秩序な細胞の分裂及び増殖は、隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を通って身体の遠位部に転移することもできる悪性腫瘍の形成をもたらす。「がん」は、本明細書で使用されるとき、原発性がん、転移がん及び再発がんを含む。別途示されない限り、「がん」及び「腫瘍」という用語は相互交換可能に使用することができる。
「血液悪性腫瘍」または「血液癌」という用語は、造血組織及びリンパ組織の哺乳類のがん及び腫瘍を指す。血液悪性腫瘍の非限定的な例には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡｍＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＩＶＩＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を冒すものが挙げられる。血液悪性腫瘍はまた、「液性腫瘍」とも称される。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫に加えて、他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
「固形腫瘍」は、本明細書で使用されるとき、組織の異常な腫瘤を指す。固形腫瘍は、良性または悪性の場合がある。固形腫瘍の非限定的な例としては、肉腫、癌腫、及びリンパ腫、例えば、肺、乳房、前立腺、結腸、直腸、及び膀胱のがんなどが挙げられる。固形腫瘍の組織構造は、実質（がん細胞）及びがん細胞が分散し、関連する微小環境を提供する場合がある関連する間質細胞を含む相互依存性組織区画を含む。
いくつかの態様では、がんは、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭及び下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織の肉腫、基底細胞及び扁平上皮細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる続発性のがんから選択される。いくつかの態様では、がんは、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、粘液／円形細胞型脂肪肉腫、骨肉腫、アバメシー肉腫、脂肪肉腫、脂肪肉腫、肺胞軟部肉腫、エナメル上皮繊維肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血球肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、または毛細血管拡張性肉腫から選択される。いくつかの態様では、がんは、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫から選択される。いくつかの態様では、がんは、腺房癌、小葉癌、腺嚢胞癌、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌、類基底癌、基底扁平上皮癌、気管支肺胞癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、子宮体部癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱上皮癌、円柱細胞癌、管癌、硬性癌、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌腫、腺上皮癌、外方発育癌、潰瘍癌、線維癌、膠様癌、膠様癌、巨細胞癌、巨細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母組織癌、血様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、副腎様癌、乳児性胎児性癌、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌、クロムペッヘル癌、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌、レンズ状癌、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌、髄様癌、黒色癌、軟性癌、粘液性癌、粘液分泌癌、粘液細胞癌、粘表皮癌、粘液癌、粘液性癌、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、軟性癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、紐様癌、毛細血管拡張癌、毛細血管拡張癌、移行上皮癌、結節癌、結節癌、疣状癌、または絨毛癌から選択される。いくつかの態様では、がんは、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、前立腺癌、ミュラー管癌、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、または子宮体部漿液性腺癌から選択される。いくつかの態様では、がんは、転移性黒色腫、非小細胞肺癌、骨髄腫、食道癌、滑膜肉腫、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
本明細書で使用されるとき、「免疫応答」という用語は、外来性作用物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答は、これらの作用物質及びそれらに起因する疾患から生物を保護する。免疫応答には、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）及びこれらの細胞のいずれかまたは肝臓で産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用が介在し、この応答は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性細胞もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、正常なヒトの細胞もしくは組織の選択的標的化、それへの結合、損傷、破壊、及び／または脊椎動物の身体からの排除をもたらすものである。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞、例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化もしくは阻害、またはＴｒｅｇ細胞の阻害が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は相互交換可能であり、胸腺によって産生または処理されるあらゆるリンパ球を指す。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。
本明細書で使用されるとき、「抗腫瘍免疫応答」という用語は腫瘍抗原に対する免疫応答を指す。
「対象」には、あらゆるヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ならびにマウス、ラット、及びモルモットのような齧歯動物といった脊椎動物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、対象はヒトである。「対象」、「患者」、「個体」及び「宿主」という用語は本明細書では相互交換可能に使用される。本明細書で使用されるとき、「それを必要とする対象」という語句は、例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養された免疫細胞の投与から、本明細書に記載されているように腫瘍の増殖を制御するという恩恵を受けることになる、哺乳類対象のような対象を含む。
「治療有効量」または「治療上有効な投与量」という用語は、所望の生物学的結果、治療結果、及び／または予防結果をもたらす作用物質（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されているように培養された免疫細胞）の量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、または原因のうち１以上の減少、改善、緩和、軽減、遅延、及び／または軽減、または生物系の任意の他の所望の変化であることができる。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍を縮小させる、及び／または腫瘍の成長速度を減少させる（腫瘍成長を抑制するなど）、あるいは他の望ましくない細胞増殖を防止または遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの態様では、有効量は、腫瘍発達を遅延させるのに十分な量である。いくつかの態様では、有効量は、腫瘍再発を防止または遅延させるのに十分な量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。
有効量の組成物（例えば、本明細書に記載されているような免疫細胞、例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されているように培養された免疫細胞）は、例えば、（ｉ）がん細胞の数を減らすことができ；（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小することができ；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞の浸潤を抑制し、遅延させ、ある程度まで遅らせてそれを停止することができ；（ｉｖ）阻害することができ（すなわち、腫瘍転移をある程度まで遅らせてそれを停止することができ）、（ｖ）腫瘍増殖を阻害することができ；（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を防止もしくは遅延させることができ；及び／または（ｖｉｉ）がんと関連する症状のうち１以上をある程度まで緩和することができる。
いくつかの態様では、「治療有効量」は、本明細書に開示されている組成物（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されているように培養された免疫細胞）の量であり、これは進行性固形腫瘍のようながんの著しい減少またはがんの進行の緩徐化（退縮）をもたらすことが臨床的に証明されている。疾患退縮を促進する本開示の治療剤（例えば、本明細書に記載されているように改変し、且つ培養した免疫細胞）の能力は、当業者に既知の種々の方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象にて、ヒトでの効力を予測する動物モデル系にて、または試験管内アッセイで薬剤の活性をアッセイすることによって評価され得る。
治療に関する「有効な」及び「有効性」という用語は、薬理学的有効性及び生理学的安全性の双方を含む。薬理学的有効性は、本明細書に開示されている組成物（例えば、本明細書に記載されているように改変し、且つ培養した免疫細胞）が患者にてがん退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性は、本明細書に開示されている組成物（例えば、本明細書に記載されているように改変し、且つ培養した免疫細胞）の投与に起因する毒性、または細胞、臓器、及び／または生物のレベルでの他の有害生理作用（有害作用）のレベルを指す。
「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」という用語は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチドのセット、通常、最も単純な形態で２つのポリペプチドを指し、これは、免疫エフェクター細胞における場合、標的細胞、通常がん細胞に対する特異性、及び細胞内シグナル生成を細胞に提供する。いくつかの態様では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び下で定義される刺激分子及び／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットには、二量化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させ得、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させ得る二量化スイッチが含まれる。いくつかの態様では、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）である。いくつかの態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１以上の機能性シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、共刺激分子は、本明細書に記載されている共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ２８から選択される。
いくつかの態様では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質であって、抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ＣＡＲスペーサーによって連結されている、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲスペーサーを介して膜貫通ドメインに連結された抗原結合ドメインならびに共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲスペーサーを介して膜貫通ドメインに連結された抗原結合ドメインならびに１以上の共刺激分子（複数可）に由来する２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲスペーサーを介して膜貫通ドメインに連結された抗原結合ドメインならびに１以上の共刺激分子（複数可）に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲのアミノ末端（Ｎ末端）における任意のリーダー配列を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲはさらに、抗原結合ドメインのＮ末端でリーダー配列を含み、その際、リーダー配列は、細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意で切断される。
キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原、通常、悪性腫瘍の表面発現抗原を認識し、それと特異的に結合する。抗原特異的細胞外ドメインが抗原と特異的に結合するのは、例えば、そのドメインが、約０．１ｐＭ～約１０μＭ、例えば、約０．１ｐＭ～約１μＭまたは約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数または相互作用の親和性（ＫＤ）で抗原と結合する場合である。相互作用の親和性を決定する方法は、当該技術分野において既知である。本開示のＣＡＲでの使用に適した抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、多種多様のポリペプチドが当該技術分野において既知である。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体に基づく認識ドメイン、例えば、ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそのヒト化型、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化型、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）、ならびに「ラクダ化」抗体可変ドメインも、本開示のＣＡＲでの使用に好適である。いくつかの態様では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく認識ドメイン、例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、すなわち、ＶαＶβを含有する単鎖２ドメインＴＣＲ）も、本開示のＲＯＲ１結合タンパク質での使用に好適である。
本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、α鎖及びβ鎖の２本の異なる膜貫通ポリペプチド鎖で構成されるヘテロ二量体を指し、鎖のそれぞれが、鎖をＴ細胞表面膜内に固定する定常領域、及びＭＨＣによって提示される抗原を認識し、それに結合する可変領域から成る。ＴＣＲ複合体は、２つのヘテロ二量体のＣＤ３γε及びＣＤ３δε、ならびに１つのホモ二量体のＣＤ３ζを形成する６つのポリペプチドと会合し、これらが共にＣＤ３複合体を形成する。Ｔ細胞受容体操作Ｔ細胞療法は、これらの複合体を保持するＴ細胞の改変を利用して、特定の腫瘍細胞によって発現される抗原を特異的に標的とする。本明細書で使用されるとき、「ＴＣＲ」という用語は天然に存在するＴＣＲ及び操作されたＴＣＲを含む。
本明細書で使用されるとき、「操作されたＴＣＲ」または「操作されたＴ細胞受容体」は、選択され、クローニングされ、及び／またはその後に免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の集団に導入される、主要組織適合抗原複合体／ペプチド標的抗原（ＭＨＣ／ＲＯＲ１ペプチド）に所望の親和性で特異的に結合するように操作されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。
「ＴＣＲ模倣体」または「ＴＣＲｍ」は、ペプチド及びＭＨＣ－Ｉ分子の双方を含むエピトープを認識する抗原結合ドメイン（例えば、抗体に由来する）を含む操作されたキメラＴＣＲの型を指し、Ｔ細胞上のＴＣＲによるそのような複合体の認識と同様である。ＴＣＲ模倣体はさらに、少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子を動員できるＴ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を含む。例示的なＴＣＲ模倣体は、例えば、米国特許第１０，８２２，４１３号に記載されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド（複数可）配列」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互交換可能に使用することができ、一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかでのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはそれらの任意のリン酸エステル類似体、例えば、ホスホロチオエート及びチオエステルを指す。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡ螺旋が可能である。核酸分子及び特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に限定されない。よって、この用語には、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡ及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論述する際、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを付与する通常の規則に従って本明細書で記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが挙げられる。本開示の「核酸組成物」は本明細書に記載されている１以上の核酸を含む。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、単一のタンパク質をコードする単一のヌクレオチド配列（例えば、コドン最適化ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列）（「単シストロン性」）を含む場合がある。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリシストロン性である（すなわち、２以上のシストロンを含む）。いくつかの態様では、ポリシストロン性ポリヌクレオチドのシストロンのそれぞれは、本明細書で開示されているタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、ＲＯＲ１結合タンパク質、またはＥＧＦＲｔ）をコードすることができる。いくつかの態様では、シストロンのそれぞれが互いに独立して翻訳され得る。
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、別段の指示がない限り、ペプチド及びタンパク質の双方を包含する。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、上述のもののホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、変異体、ならびに類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一ポリペプチドであり得、または多分子複合体、例えば、二量体、三量体または四量体であり得る。それらはまた、一本鎖または複数鎖のポリペプチドを含み得る。最も一般的に、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語はまた、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用され得る。いくつかの態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であることができる。
本明細書で使用されるとき、ポリペプチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド）の「断片」という用語は、Ｎ及び／またはＣ末端で欠失した天然に存在する配列よりも短いポリペプチドのアミノ酸配列、または天然に存在するポリペプチドと比べて欠失したポリペプチドの任意の部分を指す。したがって、断片は必ずしもＮ末端及び／またはＣ末端のアミノ酸のみが欠失したものである必要はない。天然に存在する配列に関して内部アミノ酸が欠失したポリペプチドも断片とみなされる。
本明細書で使用されるとき、「機能的断片」という用語はポリペプチド機能を保持するポリペプチド断片を指す。したがって、いくつかの態様では、Ｉｇヒンジの機能的断片は、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が標的エピトープ（例えば、腫瘍抗原）と有効に相互作用できるように、標的エピトープ（例えば、腫瘍抗原）から少し離れてＲＯＲ１結合タンパク質における抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を配置する能力を保持する。同様に、いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎの機能的断片は免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）で発現された場合、例えば、対応する完全長ｃ－Ｊｕｎを発現する参照免疫細胞の活性の少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を有する免疫細胞をもたらす断片である。そのような活性の非限定的な例はさらに、本開示の他の箇所で説明されている。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して生成されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。操作された宿主細胞にて発現した組換えで生成されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離された、分画された、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えのポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されたとみなされる。本明細書に開示されているポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば、抗ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）は当該技術分野で知られている方法を使用して組換えで生成することができる。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば、抗ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）は、本明細書に記載されている少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードするベクターによる形質移入の後に、細胞、例えば、Ｔ細胞によって生成される。
本明細書で使用されるとき、「コード領域」、「コード配列」または「翻訳可能配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコドンから成るポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は通常はアミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなすことができる。ただし、すべてのフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンと、得られるポリペプチドのカルボキシ末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンとによって一般的に決定される。
「相補的」及び「相補性」という用語は、ワトソン・クリック型塩基対形成則により互いに関連する２以上のオリゴマー（すなわち、それぞれが核酸塩基配列を含む）、またはオリゴマーと標的遺伝子との間を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’から３’）」は、核酸塩基配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’から５’）」と相補性である。相補性は「部分的」であってよく、その場合、所与の核酸塩基配列の核酸塩基のすべてより少ないものが塩基対形成則に従って他の核酸塩基配列と一致している。例えば、いくつかの態様では、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間の相補性は約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であることができる。したがって、いくつかの態様では、「相補性」という用語は、標的核酸配列（例えば、ｃ－Ｊｕｎをコードする核酸配列）に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の一致または相補性を指す。または、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間に「完全な」あるいは「完璧な」（１００％の）相補性がある場合もある。いくつかの態様では、核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリッド形成の効率及び強度に顕著な影響を与える。
本明細書で使用されるとき、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを生成するプロセスを指す。発現には限定しないで、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現によって「遺伝子産物」が生成される。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドであることができる。本明細書に記載されている遺伝子産物にはさらに、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングのような転写後修飾を有する核酸、または、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解切断のような翻訳後修飾を有するポリペプチドが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。いかなる追加の修飾語もない「同一である」という用語、例えば、「ポリヌクレオチドＡはポリヌクレオチドＢと同一である」は、ポリヌクレオチド配列同士が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。例えば、「７０％同一である」と２つの配列を表現することは、例えば、「７０％配列同一性」を有するとそれらを表現することに等しい。
２つのポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって実施することができる（例えば、最適な配列比較のために第１及び第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一方または双方にギャップを導入することができ、同一でない配列は比較目的のために無視することができる）。いくつかの態様では、比較目的のために整列させた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。次いで、対応するアミノ酸位のアミノ酸、またはポリヌクレオチドの場合は塩基を比較する。
第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチドにより占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一率（％）は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一率（％）の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。
異なる配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）を整列させるために使用することができる好適なソフトウェアプログラムはさまざまな供給源から入手可能である。配列同一性パーセントを決定するための好適なプログラムの１つは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴパッケージプログラムの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮが核酸配列を比較するために使用されるのに対して、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の適当なプログラムとしては、例えば、バイオインフォマティクスプログラムパッケージＥＭＢＯＳＳの一部であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）よりｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにおいてやはり入手可能なＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒがある。
配列アラインメントは、当該技術分野において公知の方法、例えば、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどを使用して実施され得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自体の配列同一率（％）を有することができる。配列同一率（％）は、１０分の１の位に四捨五入される点に留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数である点に留意のこと。
いくつかの態様では、同一性比率（％ＩＤ）または第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する同一性比率（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列の配列比較（目視検査または特定の配列の配列比較プログラムによって整列させる）にて完全な一致と評価されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列を超える場合、第１の配列の第２の配列に対する同一性パーセントは、第２の配列の第１の配列に対する同一性パーセントより高くなる。
当業者であれば、配列同一率（％）を計算するための配列アラインメントの生成が、一次配列データによってのみ行われるバイナリー配列間比較に限定されない点は理解されよう。配列アライメントは、配列データを異種の供給源由来のデータ、例えば、構造データ（例えば、タンパク質結晶構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統学的データと統合することにより生成され得ることも理解されよう。異種データを統合してマルチプル配列アラインメントを生成する適当なプログラムは、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手できるか、あるいは例えばＥＢＩからも入手できるＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的な配列比較は、自動または手動のいずれかで精選され得ることも理解されるであろう。
本明細書で使用されるとき、「単離された」、「精製された」、「抽出された」という用語、及びそれらの文法的変形は相互交換可能に使用され、１以上の精製プロセスを受けた本開示の所望の組成物の調製状態を指す。いくつかの態様では、本明細書で使用されるとき単離または精製は、汚染物質を含有する試料から本開示の組成物（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変した）を部分的に取り出す（例えば、画分）ことを含む、取り出すプロセスである。
いくつかの態様では、単離された組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さない、または代わりに、望ましくない活性のレベルもしくは量が許容可能なレベルまたは量以下である。いくつかの態様では、単離された組成物は、本開示の所望の組成物の量及び／または濃度を許容可能な量及び／または濃度及び／または活性以上で有する。いくつかの態様では、単離された組成物は組成物が得られる出発物質と比べて濃縮されている。この濃縮は、出発物質と比べて少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。
いくつかの態様では、単離された調製物は、残留する生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離された調製物は、任意の混入している生物学的物質を１００％、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、または少なくとも約９０％含まない。残留する生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「連結された」という用語は、共有結合または非共有結合によりそれぞれ第２のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に結合された、第１のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列に直接的に結合もしくは並列され得るか、または代替的に介在配列が第１の配列から第２の配列までに共有結合により加わり得る。「連結された」という用語は、第１のポリヌクレオチド配列の第２のポリヌクレオチド配列への５’末端または３’末端での融合を意味するだけでなく、第２のポリヌクレオチド配列（または第１のポリヌクレオチド配列）における任意の２つのヌクレオチドへの第１のポリヌクレオチド配列（またはそれぞれ第２のポリヌクレオチド配列）全体の挿入も含む。第１のポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより第２のポリヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであることができる。
対象の「治療」または「療法」（その文法的な派生物を含む）は、症状、合併症、状態、または疾患に関連する生化学的兆候の発症、進行、発達、重症度または再発を元に戻す、軽減する、改善する、抑制する、緩徐化する、または予防する目的で、対象に対して行われる任意のタイプの介入もしくはプロセス、または対象に対する活性剤の投与を指す。いくつかの態様では、この用語は、対象にて抗原に対する免疫反応を誘導することを指す。
本明細書で使用されるとき、「予防する」、「予防すること」という用語、及びそれらの変形は、疾患、障害、及び／または状態の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または状態の１以上の症状、特徴、または臨床徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または状態の１以上の症状、特徴、または徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または状態の進行を部分的または完全に遅延させること；及び／または疾患、障害、及び／または状態に関連する病状を発生するリスクを減らすことを指す。いくつかの態様では、転帰の予防は予防的治療を介して達成される。
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般的に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、天然遺伝子にその全体が由来することができ、または自然界にみられるさまざまなプロモーターに由来するさまざまな要素で構成することができ、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含むことができる。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプにおいて、または発生の異なる段階において、または異なる環境的もしくは生理学的条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができる点は、当業者には理解されよう。ほとんどの細胞タイプでほとんどの時間に遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発生または細胞分化の特定の段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「誘導性プロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合で調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
本明細書で使用されるとき、「ｕｇ」及び「ｕＭ」という用語は、それぞれ「μｇ」及び「μＭ」と相互交換可能に使用される。
本開示の種々の態様が以下の小節にてさらに詳しく記載される。
ＩＩ．本開示の方法
ＩＩ．Ａ．代謝再プログラム化培地
本開示のいくつかの態様は、培養条件（例えば、培地）にて免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）を培養する方法を対象としており、その際、培養条件（例えば、特定のイオン濃度、培地の張度、サイトカイン、及び／またはそれらの任意の組み合わせ）は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の分化を低減する、制限する、または防止することができ、それによって細胞療法、例えば、養子細胞療法におけるそれらの使用に影響を与える、または改善することができる。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地（ＭＲＭ）にて培養される。いくつかの態様では、ＭＲＭにて培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、従来の方法を使用して、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞と比べてさらに高い比率の幹細胞様細胞を有する。いくつかの態様では、ＭＲＭにて培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、従来の方法を使用して、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞と比べてさらに高い比率のエフェクター様細胞を有する。いくつかの態様では、ＭＲＭにて培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、従来の方法を使用して、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞と比べてさらに高い比率の幹細胞様細胞及びエフェクター様細胞の双方を有する。いくつかの態様では、ＭＲＭにて培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、従来の方法を使用して、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞と比べてさらに高い増殖能を有する。
本開示のいくつかの態様は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地（例えば、本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地）にて細胞を培養することを含む、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の集団を調製する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地（例えば、本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地）にてＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）を培養することを含む、Ｔ細胞の集団を調製する方法を対象とする。いくつかの態様では、本開示は、５ｍＭよりも高い（例えば、４０ｍＭよりも高い、例えば、４０ｍＭ～８０ｍＭの間、例えば、５５ｍＭ～７０ｍＭの間）の濃度でカリウムイオンを含む培地にて細胞を培養することを含む、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）を調製する方法を提供し、培養細胞の幹細胞様表現型（例えば、最小の分化）を保持することができる。いくつかの態様では、本開示は、５ｍＭよりも高い（例えば、４０ｍＭよりも高い、例えば、４０ｍＭ～８０ｍＭの間、例えば、５５ｍＭ～７０ｍＭの間）の濃度でカリウムイオンを含む培地にてＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）を培養することを含む、Ｔ細胞を調製する方法を提供し、培養されたＴ細胞の幹細胞様表現型（例えば、最小の分化）を保持することができる。いくつかの態様では、培養細胞は、さらに低いカリウム濃度を有する培地にて増殖した細胞よりも多い幹細胞様表現型（例えば、低分化）を有する。いくつかの態様では、培地はさらに、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、培地はさらに、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）、カルシウムイオン、グルコース、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法を使用して培養された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の集団は、従来の方法を使用して、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養された細胞の集団と比べて幹細胞様細胞の数の増加を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法を使用して培養されたＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の集団は、従来の方法を使用して、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地にて培養されたＴ細胞の集団と比べて幹細胞様Ｔ細胞の数の増加を呈する。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、免疫細胞の出発集団（すなわち、培養前）と比べて幹細胞様細胞に特徴的なマーカーの発現増加を呈する。いくつかの態様では、Ｔ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）は、Ｔ細胞の出発集団（すなわち、培養前）と比べて幹細胞様細胞に特徴的なマーカーの発現増加を呈する。いくつかの態様では、免疫細胞の出発集団は、ヒト対象から得られる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を含む。いくつかの態様では、免疫細胞の出発集団はヒト対象から得られるＴ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫Ｔ細胞の出発集団は、ＴＮ細胞、ＴＳＣＭ細胞、ＴＣＭ細胞、ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、免疫細胞の出発集団は、本明細書に記載されているような改変（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／またはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドによる形質移入）前のＴ細胞を含む。
高い細胞多能性は、当該技術分野にて既知の任意の方法を使用して測定することができる。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性は抗体染色に続いてゲートをかけたフローサイトメトリーによって測定される。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性はオートファジーフラックスによって測定される。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性はグルコース取込みによって測定される。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性は脂肪酸取込みによって測定される。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性はミトコンドリア量によって測定される。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性は、ＲＮＡ定量／発現分析（例えば、マイクロアレイ、ｑＰＣＲ（ｔａｑｍａｎ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ、またはそれらの任意の組み合わせ）によって測定される。いくつかの態様では、細胞の幹細胞性は、代謝アッセイ（例えば、海馬代謝アッセイ、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の分析、酸素消費速度（ＯＣＲ）の分析、予備呼吸能の分析、及び／またはミトコンドリア膜電位の分析）に関連付けられる転写物によって測定される。いくつかの態様では、幹細胞性は、生体内または試験管内の機能アッセイ（例えば、細胞持続性、抗腫瘍能、抗腫瘍クリアランス、ウイルスクリアランス、多能性、サイトカイン放出、細胞殺傷、またはそれらの任意の組み合わせをアッセイすること）のうち１以上を使用して測定される。
いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の分化状態は、低分化細胞に特有のマーカーを発現する細胞の数の増加を特徴とする。いくつかの態様では、Ｔ細胞の分化状態は、低分化Ｔ細胞に特有のマーカーを発現する細胞の数の増加を特徴とする。いくつかの態様では、幹細胞様細胞の数の増加は、ＴＮ細胞及び／またはＴＳＣＭ細胞に特有のマーカーを発現するＴ細胞の数の増加を特徴とする。いくつかの態様では、幹細胞様Ｔ細胞の数の増加は、ＴＳＣＭ細胞に特有のマーカーを発現する細胞の数の増加を特徴とする。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＣＲ７を発現する細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ６２Ｌを発現する細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ２８を発現する細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ９５を発現する細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞はＣＤ４５ＲＯ低である。いくつかの態様では、細胞はＣＤ４５ＲＯを発現しない。いくつかの態様では、細胞集団はＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋である細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団はＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ６２Ｌ＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団はＣＤ９５＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ６２Ｌ＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団はＴＣＦ７を発現する細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＴＣＦ７＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ９５＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＴＣＦ７＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＴＣＦ７＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ３＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＴＣＦ７＋である細胞数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞はＣＤ２７を発現する。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ２７＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＴＣＦ７＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ２７＋、ＣＤ３＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＴＣＦ７＋である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＣＤ３９－及びＣＤ６９－である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団はＴＣＦ７＋及びＣＤ３９－である細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団はＴＳＣＭ細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団はＴＮ細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団はＴＳＣＭ細胞及びＴＮ細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、細胞集団は幹細胞様Ｔ細胞の数の増加を示す。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞であり、いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を含む。
いくつかの態様では、培養物中の幹細胞様細胞の数は、ＭＲＭでの培養前の幹細胞様細胞の数と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％増加する。いくつかの態様では、培養物中の幹細胞様細胞の数は、ＭＲＭでの培養前の幹細胞様細胞の数と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍増加する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％を構成する。いくつかの態様では、幹細胞様Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋）はＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約２０％を構成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の総数の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％を構成する。いくつかの態様では、幹細胞様Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋）はＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約２０％を構成する。
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本開示の方法は（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するようにＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を改変するのに使用することができる。したがって、いくつかの態様では、培養後、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＲＯＲ１結合タンパク質を発現し、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルを高め、改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約２０％は幹細胞様Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋）である。いくつかの態様では、培養後、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＲＯＲ１結合タンパク質を発現し、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルを高め、改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約２０％は幹細胞様Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋）である。
いくつかの態様では、いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％～少なくとも約７０％を構成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％を構成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％を構成する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％～少なくとも約４０％はＣＤ３９－／ＣＤ６９－Ｔ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％はＣＤ３９－／ＣＤ６９－Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０～少なくとも約７０％はＣＤ３９－／ＴＣＦ７＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％はＣＤ３９－／ＴＣＦ７＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、Ｔ細胞の総数の少なくとも約１０％～少なくとも約７０％はＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％はＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を含む。
いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従って培養された、本開示の免疫細胞、例えば、操作された免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されたＴ細胞及び／またはＮＫ細胞）は高い形質導入効率を示す。
いくつかの態様では、形質導入後、細胞の高い割合が、例えば、リガンド結合タンパク質をコードする標的導入遺伝子を発現し、その際、従来の方法を使用して（例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて）同様に形質導入して培養した細胞と比べて、細胞は本明細書に開示されている方法に従って培養されている。特定の態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養された細胞の高い割合が、従来の方法（例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて）を使用して培養された同様に形質導入した細胞と比べて、細胞のレンチウイルス形質導入後、リガンド結合タンパク質を発現する。いくつかの態様では、形質導入効率は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法を使用して培養した同様に形質導入した細胞と比べて、少なくとも約１．５倍上昇する。いくつかの態様では、形質導入効率は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法を使用して培養した同様に形質導入した細胞と比べて、少なくとも約２倍上昇する。本明細書で使用されるとき、「形質導入効率」という用語は（ｉ）規定の期間内に細胞内に物理的に導入され得る物質（例えば、外来性ポリヌクレオチド）の量；（ｉｉ）所与の量の物質を細胞内に物理的に導入するのに要する時間の量；（ｉｉｉ）標的物質、例えば、外来性ポリヌクレオチド、すなわち、導入遺伝子が細胞の集団によって取り込まれるレベル（例えば、導入遺伝子を発現する細胞の割合）；または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを指す。いくつかの態様では、形質導入効率を増加させることによって、本明細書で提供されている培養方法は、さらに多い量の外来性ヌクレオチド配列が細胞内に導入されることを可能とし、及び／または所与の量の外来性ヌクレオチド配列を導入するのに必要とされる時間の量を減少させ得る。どんな１つの理論によっても束縛されるものではなく、いくつかの態様では、そのような効果は、改変した免疫細胞におけるコードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド）の発現を増やすことができる。
いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、本明細書に開示されている方法に従って培養する前に形質導入される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、本明細書に開示されている方法に従って培養した後に形質導入される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、例えば、形質導入の前に、形質導入中に、及び形質導入の後で、少なくとも５ｍＭのカリウムイオン（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）を含む培地にて免疫細胞をＡＰＣ－ＭＳと接触させることによって本明細書に開示されている方法に従って培養される。
特定の態様では、免疫細胞はウイルスベクターを使用して形質導入される。いくつかの態様では、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルスベクターを含む。いくつかの態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスを含む。いくつかの態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスを含む。いくつかの態様では、ウイルスベクターはＡＡＶを含む。
いくつかの態様では、免疫細胞は非ウイルス的方法を使用して形質導入される。いくつかの態様では、非ウイルス的方法にはトランスポゾンの使用が挙げられる。いくつかの態様では、非ウイルス的送達方法の使用は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の再プログラム化、及び対象への細胞の直接的注入を可能にする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びゲノム編集代替手段、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼ（ＭＮ）を使用することによって標的細胞（例えば、Ｔ細胞）または宿主細胞（例えば、コードされるタンパク質の組換え発現のための細胞）のゲノムに挿入するこができる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した、リガンド結合タンパク質を任意で発現する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の養子移入の際に、移入された細胞は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法を使用して培養した細胞と比べて、細胞疲弊の低下を示す。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した、リガンド結合タンパク質を任意に発現するＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変された）の養子移入の際に、移入されたＴ細胞は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法を使用して培養したＴ細胞と比べて細胞疲弊の低下を示す。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞の養子移入の際に、移入された細胞は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地中にて従来の方法を使用して培養した細胞と比べて、生体内でさらに長い期間存続する。いくつかの態様では、移入された細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法を使用して培養した細胞と比べてさらに高い生体内有効性、例えば、腫瘍殺傷活性を有する。いくつかの態様では、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法を使用して培養した細胞と比べて、対象にて応答、例えば、腫瘍体積の低下を引き出すのに必要とされる、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞の用量は低い。
いくつかの態様では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）は、対象から単離後直ちに、本明細書に開示されている方法に従って、例えば、少なくとも５ｍＭのカリウムイオン（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）を含む培地にて培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞の増殖中に本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞の操作中に、例えば、導入遺伝子、例えば、リガンド結合タンパク質をコードする構築物での形質導入中に本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞の操作後に、例えば、導入遺伝子、例えば、リガンド結合タンパク質をコードする構築物での形質導入後に本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、増殖及び操作の全体を通して本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、ウイルス遺伝子操作の全体を通して本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、非ウイルス遺伝子操作の全体を通して本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、腫瘍特異的標的化（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣体）を可能とするための免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）へのリガンド結合タンパク質の導入中に本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞機能を改善する１以上の内在性遺伝子（ｃ－Ｊｕｎ）の導入全体を通して本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞機能を改善する１以上の合成遺伝子（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチド、またはＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲもしくはＴＣＲ模倣体をコードする外来性ポリヌクレオチド）の導入全体を通して本明細書に開示されている方法に従って培養される。
いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、生体外培養の全体にわたって、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞が対象から単離された時から、成長、増殖、操作を経て、養子細胞療法を必要とする対象への投与まで、例えば、少なくとも５ｍＭのカリウムイオン（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）を含む培地にて本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、生体外培養の全体にわたって、例えば、Ｔ細胞が対象から単離された時から、成長、増殖、操作を経て、養子細胞療法を必要とする対象への投与まで、例えば、少なくとも５ｍＭのカリウムイオン（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）を含む培地にて本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、増殖期間中、本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、生存免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の総数が少なくとも約１０４、少なくとも約５×１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約５×１０５、少なくとも約１０６、または少なくとも約５×１０６、少なくとも約１×１０７、少なくとも約５×１０７、少なくとも約１×１０８、少なくとも約５×１０８、少なくとも約１×１０９、少なくとも約５×１０９、少なくとも約１×１０１０、少なくとも約５×１０１０、少なくとも約１×１０１１、少なくとも約５×１０１１、少なくとも約１×１０１２、または少なくとも約５×１０１２の総細胞となるまで本明細書に開示されている方法に従って培養される。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、生存Ｔ細胞の総数が少なくとも約１０４、少なくとも約５×１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約５×１０５、少なくとも約１０６、または少なくとも約５×１０６、少なくとも約１×１０７、少なくとも約５×１０７、少なくとも約１×１０８、少なくとも約５×１０８、少なくとも約１×１０９、少なくとも約５×１０９、少なくとも約１×１０１０、少なくとも約５×１０１０、少なくとも約１×１０１１、少なくとも約５×１０１１、少なくとも約１×１０１２、または少なくとも約５×１０１２の総Ｔ細胞となるまで本明細書に開示されている方法に従って培養される。
いくつかの態様では、培地はさらに細胞増殖剤を含む。本明細書で使用されるとき、「細胞増殖剤」は、培養細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）の試験管内及び／または生体外の成長及び増殖を促進する薬剤、例えば、小分子、ポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを指す。いくつかの態様では、細胞増殖剤はＰＩ３Ｋ阻害剤を含む。いくつかの態様では、培地はＡＫＴ阻害剤をさらに含む。いくつかの態様では、培地はＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡＫＴ阻害剤をさらに含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２を含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＩＣ８７１１４を含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はイデラリシブを含む（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．２（３）：２１０－２３（２０１８）を参照のこと）。いくつかの態様では、培地はさらに、ＧＳＫ３Ｂ阻害剤を含む。いくつかの態様では、ＧＳＫ３Ｂ阻害剤はＴＷＳ１１９を含む。いくつかの態様では、培地はＡＣＬＹ阻害剤をさらに含む。いくつかの態様では、ＡＣＬＹ阻害剤はヒドロキシクエン酸カリウム三塩基性一水和物を含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クエン酸ヒドロキシルを含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はピクチリシブを含む。いくつかの態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＣＡＬ－１０１を含む。いくつかの態様では、ＡＫＴ阻害剤は、ＭＫ２２０６、Ａ４４３６５４、またはＡＫＴｉ－ｖｉｉｉ（Ｃａｓ６１２８４７－０９－３）を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はミトコンドリア燃料を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はＯ－アセチル－Ｌ－カルニチン塩酸塩を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１．０ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、または少なくとも約１０ｍＭのＯ－アセチル－Ｌ－カルニチン塩酸塩を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１．０ｍＭのＯ－アセチル－Ｌ－カルニチン塩酸塩を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はさらに、（ｉ）１以上の細胞増殖剤、（ｉｉ）ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）、（ｉｉｉ）１以上の糖類、（ｉｖ）カルシウムイオン、及び（ｖ）１以上のサイトカインのうちの１以上を含む。
ＩＩ．Ａ．１．カリウム
本開示のいくつかの態様は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を、対照培地と比べて、漸増濃度のカリウムイオン（例えば、約５ｍＭ超、約４０ｍＭ超、約４５ｍＭ超、約５０ｍＭ超、約５５ｍＭ超、約６０ｍＭ超、約６５ｍＭ超、または約７０ｍＭ超）を含む培地、すなわち、本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地にて培養する方法を対象とする。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約１００ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約９０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５ｍＭ～少なくとも約４０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約１０ｍＭ～少なくとも約４０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約２０ｍＭ～少なくとも約４０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約４０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４０ｍＭ～少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約４５ｍＭ～少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５０ｍＭ～少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５０ｍＭ～少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５０ｍＭ～少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５０ｍＭ～少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオン、少なくとも約５０ｍＭ～少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオン、または少なくとも約５０ｍＭ～少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオンを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、または少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオンを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは約４０ｍＭ～約８０ｍＭのカリウムイオン（例えば、４０～８０ｍＭ）を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は漸増濃度のカリウムイオン、例えば、少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンを含み、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でカリウムイオン及び約３０ｍＭ～約１００ｍＭの間の濃度でＮａＣｌを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は約１１０～約１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５ｍＭ～約１００ｍＭである。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５ｍＭ～約１００ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は、約５ｍＭ～約９０ｍＭ、約５ｍＭ～約８０ｍＭ、約５ｍＭ～約７０ｍＭ、約５ｍＭ～約６０ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は、約５ｍＭ～約９０ｍＭ、約５ｍＭ～約８０ｍＭ、約５ｍＭ～約７０ｍＭ、約５ｍＭ～約６０ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約２５ｍＭ～約１００ｍＭである。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約２５ｍＭ～約１００ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約２５ｍＭ～約９０ｍＭ、約２５ｍＭ～約８０ｍＭ、約２５ｍＭ～約７０ｍＭ、約２５ｍＭ～約６０ｍＭ、または約２５ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は、約２５ｍＭ～約９０ｍＭ、約２５ｍＭ～約８０ｍＭ、約２５ｍＭ～約７０ｍＭ、約２５ｍＭ～約６０ｍＭ、または約２５ｍＭ～約５０ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約４０ｍＭ～約１００ｍＭである。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は、約４０ｍＭ～約１００ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８５ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７５ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６５ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約５５ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８５ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７５ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６５ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約５５ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間であり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約９０ｍＭ、約５０ｍＭ～約８５ｍＭ、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約７０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６５ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約５５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約５０ｍＭ～約９０ｍＭ、約５０ｍＭ～約８５ｍＭ、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約７０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６５ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約５５ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び約９０ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約５０ｍＭ～約１１５ｍＭ、約５０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１０５ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約９５ｍＭ、約５０ｍＭ～約９０ｍＭ、約５０ｍＭ～約８５ｍＭ、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約７０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６５ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約５５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は少なくとも約５０ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約９０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約５５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約５５ｍＭ～約１１０ｍＭ、約５５ｍＭ～約１０５ｍＭ、約５５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５５ｍＭ～約９５ｍＭ、約５５ｍＭ～約９０ｍＭ、約５５ｍＭ～約８５ｍＭ、約５５ｍＭ～約８０ｍＭ、約５５ｍＭ～約７５ｍＭ、約５５ｍＭ～約７０ｍＭ、約５５ｍＭ～約６５ｍＭ、または約５５ｍＭ～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は少なくとも約５５ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約８５ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭである。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約６０ｍＭ～約１１５ｍＭ、約６０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約６０ｍＭ～約１０５ｍＭ、約６０ｍＭ～約１００ｍＭ、約６０ｍＭ～約９５ｍＭ、約６０ｍＭ～約９０ｍＭ、約６０ｍＭ～約８５ｍＭ、約６０ｍＭ～約８０ｍＭ、約６０ｍＭ～約７５ｍＭ、約６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６０ｍＭ～約６５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は少なくとも約６０ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約６５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約６５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約６５ｍＭ～約１１０ｍＭ、約６５ｍＭ～約１０５ｍＭ、約６５ｍＭ～約１００ｍＭ、約６５ｍＭ～約９５ｍＭ、約６５ｍＭ～約９０ｍＭ、約６５ｍＭ～約８５ｍＭ、約６５ｍＭ～約８０ｍＭ、約６５ｍＭ～約７５ｍＭ、または約６５ｍＭ～約７０ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６５ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約７５ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約７０ｍＭ～約１１５ｍＭ、約７０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１０５ｍＭ、約７０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７０ｍＭ～約９５ｍＭ、約７０ｍＭ～約９０ｍＭ、約７０ｍＭ～約８５ｍＭ、約７０ｍＭ～約８０ｍＭ、または約７０ｍＭ～約７５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７０ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約７０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約７５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約７５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約７５ｍＭ～約１１０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１０５ｍＭ、約７５ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約９５ｍＭ、約７５ｍＭ～約９０ｍＭ、約７５ｍＭ～約８５ｍＭ、または約７５ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７５ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約６５ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は、１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約８０ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約８０ｍＭ～約１１５ｍＭ、約８０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１０５ｍＭ、約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８０ｍＭ～約９５ｍＭ、約８０ｍＭ～約９０ｍＭ、または約８０ｍＭ～約８５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８０ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約６０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約８５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約８５ｍＭ～約１１０ｍＭ、約８５ｍＭ～約１０５ｍＭ、約８５ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、または約８５ｍＭ～約９０ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８５ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約６５ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約９０ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は、約９０ｍＭ～約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１０５ｍＭ、約９０ｍＭ～約１００ｍＭ、または約９０ｍＭ～約９５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９０ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約５０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約９５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約９５ｍＭ～約１１０ｍＭ、約９５ｍＭ～約１０５ｍＭ、または約９５ｍＭ～約１００ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９５ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約５５ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約１００ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１００ｍＭ～約１１５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１１０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約１０５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１００ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約５０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約１０５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１０５ｍＭ～約１１５ｍＭ、または約１０５ｍＭ～約１１０ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０５ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約３５ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約１１０ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１０ｍＭ～約１１５ｍＭである。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１１０ｍＭ～約１２０ｍＭのカリウムイオン及び約３０ｍＭ未満～約２０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約９０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約９０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約９０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８０ｍＭ～約９０ｍＭである。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約９０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約９０ｍＭ未満～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約８０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約９０ｍＭ未満～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約９０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約９０ｍＭ未満～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約８０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約８０ｍＭ未満～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約９０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約７０ｍＭ未満～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約８０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約７０ｍＭ未満～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８０ｍＭ～約９０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約６０ｍＭ未満～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるカリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約５５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約５５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約９０未満～約８５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５５ｍＭ～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５５ｍＭ～約６０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約８５未満～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約６５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約６５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約８０ｍＭ未満～約７５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６５ｍＭ～約７０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６５ｍＭ～約７０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約７５ｍＭ未満～約７０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約７５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７０ｍＭ～約７５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約７０ｍＭ未満～約６５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７５ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７５ｍＭ～約８０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約６５ｍＭ未満～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８０ｍＭ～約８５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８０ｍＭ～約８５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約６０ｍＭ未満～約５５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８５ｍＭ～約９０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８５ｍＭ～約９０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約５５ｍＭ未満～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９０ｍＭ～約９５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９０ｍＭ～約９５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約５０未満～約４５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９５ｍＭ～約１００ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９５ｍＭ～約１００ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約４５ｍＭ未満～約４０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１００ｍＭ～約１０５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１００ｍＭ～約１０５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約４０ｍＭ未満～約３５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１０５ｍＭ～約１１０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１０５ｍＭ～約１１０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約３５未満～約３０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１０ｍＭ～約１１５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１０ｍＭ～約１１５ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約３０ｍＭ未満～約２５ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１５ｍＭ～約１２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１５ｍＭ～約１２０ｍＭであり、ＮａＣｌの濃度は約２５ｍＭ未満～約２０ｍＭである。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭ～約９０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭ～約８０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭ～約７０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約９０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約８０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５０ｍＭ～約７０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５５ｍＭ～約９０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５５ｍＭ～約８０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５５ｍＭ～約７０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約９０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約８０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６０ｍＭ～約７０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６５ｍＭ～約９０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６５ｍＭ～約８０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６５ｍＭ～約７０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約５ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約６ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約７ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約８ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約９ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１０ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１１ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１２ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１２ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１３ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１３ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１４ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１４ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１５ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１５ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１６ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１６ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１７ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１７ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１８ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１８ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１９ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約１９ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２０ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２１ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２１ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２２ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２２ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２３ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２３ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２４ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２４ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２５ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２５ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２６ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２６ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２７ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２７ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２８ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２８ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２９ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約２９ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３０ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３１ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３１ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３２ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３２ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３３ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３３ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３４ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３４ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３５ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３５ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３６ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３６ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３７ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３７ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３８ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３８ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３９ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約３９ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４０ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４１ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４１ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４２ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４２ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４３ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４３ｍＭであり、培地は低張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４４ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４４ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４５ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４５ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４６ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４６ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４７ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４７ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４８ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４８ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４９ｍＭよりも高く、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度は約４９ｍＭであり、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、高濃度のカリウムイオンを含む代謝再プログラム化培地は、培地に十分な量のカリウム塩を加えることによって調製される。いくつかの態様では、カリウム塩の非限定的な例には、アミントリクロロ白金酸カリウム、アクアペンタクロロルテニウム酸カリウム、ビス（オキサラト）白金（ｉｉ）酸カリウム二水和物、硫酸水素カリウム、水素化ホウ素カリウム、臭化カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クロム酸カリウム、重クロム酸カリウム、ジシアノ銀酸カリウム、ジシアノ金酸カリウム、フッ化カリウム、フルオロ硫酸カリウム、ヘキサクロロイリジウム酸カリウム、ヘキサクロロオスミウム酸カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸カリウム、ヘキサクロロ白金酸カリウム、ヘキサクロロレニウム酸カリウム、ヘキサシアノクロム酸カリウム、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、ヘキサシアノルテニウム（ｉｉ）酸カリウム水和物、ヘキサフルオロアンチモン酸カリウム、ヘキサフルオロニッケル酸カリウム、ヘキサフルオロリン酸カリウム、ヘキサフルオロチタン酸カリウム、ヘキサフルオロジルコン酸カリウム、ヘキサヒドロキソアンチモン酸カリウム、ヘキサヨード白金酸カリウム、ヘキサヨードレニウム酸カリウム、水酸化カリウム、ヨウ素酸カリウム、ヨウ化カリウム、マンガン酸カリウム、メタバナジン酸カリウム、モリブデン酸カリウム、硝酸カリウム、ニトロソジスルホン酸カリウム、オスミウム（ｖｉ）酸カリウム二水和物、ペンタクロロニトロシルルテニウム酸カリウム、過塩素酸カリウム、過レニウム酸カリウム、過ルテニウム酸カリウム、過硫酸カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、ピロリン酸カリウム、セレノシアン酸カリウム、セレノシアン酸カリウム、スズ酸カリウム三水和物、硫酸カリウム、テルル酸カリウム水和物、亜テルル酸カリウム、四ホウ酸カリウム四水和物、テトラブロモ金酸カリウム、テトラブロモパラジウム酸カリウム、テトラクロロパラジウム酸カリウム、テトラクロロ白金酸カリウム、テトラシアノパラジウム酸カリウム、テトラシアノ白金酸カリウム、テトラフルオロホウ酸カリウム、テトラニトロ白金酸カリウム、テトラチオン酸カリウム、ｐ－トルエンチオスルホン酸カリウム、ヒドロキシクエン酸カリウム三塩基性一水和物、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。特定の態様では、カリウム塩は塩化カリウム（ＫＣｌ）を含む。特定の態様では、カリウム塩はグルコン酸カリウムを含む。特定の態様では、カリウム塩はクエン酸カリウムを含む。特定の態様では、カリウム塩はヒドロキシクエン酸カリウムを含む。
ＩＩ．Ａ．２．ナトリウム
本開示のいくつかの態様は（ｉ）少なくとも約５ｍＭ（例えば、５ｍＭより高く、例えば、約４０ｍＭと約８０ｍＭの間）の濃度でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約１１５ｍＭ未満の濃度でのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）とを含む培地にて免疫細胞を培養する方法を対象とする。いくつかの態様では、培地は低張性または等張性である。いくつかの態様では、ナトリウムの目標濃度は、さらに高濃度のナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む基本培地から出発し、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の目標濃度に到達するように溶液を希釈することによって達成される。いくつかの態様では、ナトリウムの目標濃度は、１以上のナトリウム塩（例えば、さらに多くのＮａＣｌ）を加えることによって達成される。ナトリウム塩の非限定的な例には（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム、酒石酸アルセニルナトリウム水和物、アジ化ナトリウム、ナトリウムベンジルオキシド、臭化ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クロム酸ナトリウム、シクロヘキサン酪酸ナトリウム、エタンチオール酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、フルオロリン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ヘキサクロロイリジウム（ｉｉｉ）酸ナトリウム水和物、ヘキサクロロイリジウム（ｉｖ）酸ナトリウム六水和物、ヘキサクロロ白金（ｉｖ）酸ナトリウム六水和物、ヘキサクロロロジウム（ｉｉｉ）酸ナトリウム、ヘキサフルオロアルミン酸ナトリウム、ヘキサフルオロアンチモン（Ｖ）酸ナトリウム、ヘキサフルオロヒ（Ｖ）酸ナトリウム、ヘキサフルオロ鉄（ｉｉｉ）酸ナトリウム、ヘキサフルオロリン酸ナトリウム、ヘキサフルオロケイ酸ナトリウム、ヘキサヒドロキシ白金（ｉｖ）酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、二フッ化水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ナトリウム水素シアナミド、水酸化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、メタホウ酸ナトリウム四水和物、メタケイ酸ナトリウム九水和物、メタバナジン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム一水和物、過炭酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、過ヨウ素酸ナトリウム、過マンガン酸ナトリウム、過レニウム酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、スズ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜テルル酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、テトラクロロアルミン酸ナトリウム、テトラクロロ金（ｉｉｉ）酸ナトリウム、テトラクロロパラジウム（ｉｉ）酸ナトリウム、テトラクロロ白金（ｉｉ）酸ナトリウム、チオリン酸ナトリウム三塩基性、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム五水和物、オキシフッ化イットリウムナトリウム、トリメタリン酸三ナトリウム、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、ナトリウム塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、ナトリウム塩はグルコン酸ナトリウムを含む。いくつかの態様では、ナトリウム塩は重炭酸ナトリウムを含む。いくつかの態様では、ナトリウム塩はヒドロキシクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの態様では、ナトリウム塩はリン酸ナトリウムを含む。
いくつかの態様では、本開示の代謝再プログラム化培地におけるナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は基本培地の濃度よりも低い。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度が増加するにつれて、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は低下する。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約２５ｍＭ～約１１５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウム（例えば、ＮａＣｌ）イオンの濃度は、約２５ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５０ｍＭ～約５５ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６５ｍＭ、約５０ｍＭ～約７０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５５ｍＭ～約６０ｍＭ、約５５ｍＭ～約６５ｍＭ、約５５ｍＭ～約７０ｍＭ、約５５ｍＭ～約７５ｍＭ、約５５ｍＭ～約８０ｍＭ、約６０ｍＭ～約６５ｍＭ、約６０ｍＭ～約７０ｍＭ、約６０ｍＭ～約７５ｍＭ、約６０ｍＭ～約８０ｍＭ、約７０ｍＭ～約７５ｍＭ、約７０ｍＭ～約８０ｍＭ，または約７５ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約４０ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５０ｍＭ～約８５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５５ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約３０ｍＭ～約３５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、約３５ｍＭ～約４０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約４０ｍＭ～約４５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、約４５ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５０ｍＭ～約５５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、約５５ｍＭ～約６０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約６０ｍＭ～約６５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約６５ｍＭ～約７０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約７０ｍＭ～約７５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約７５ｍＭ～約８０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約８０ｍＭ～約８５ｍＭである。
いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、または約９０ｍＭである。特定の態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約４０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約４５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５５．６ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約５９．３ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約６０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約６３．９ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約６５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約６７．６ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約７０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約７２．２ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約７５ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約７６ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約８０ｍＭである。いくつかの態様では、ナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は約８０．５ｍＭである。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約４０ｍＭ～約９０ｍＭのカリウムイオン及び約４０ｍＭ～約８０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約５０ｍＭ～約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約９０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約５５ｍＭ～約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約９０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６０ｍＭ～約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約９０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６５ｍＭ～約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６６ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６７ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６８ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６９ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム培地は約７１ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７２ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７３ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７４ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ～約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６５ｍＭのカリウムイオン及び約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６５ｍＭのカリウムイオン及び約９０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約９０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７５ｍＭのカリウムイオン及び約８５ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７５ｍＭのカリウムイオン及び約９０ｍＭのナトリウムイオン（例えば、ＮａＣｌ）を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約４０ｍＭ～約９０ｍＭのカリウムイオン及び約３０ｍＭ～約１０９ｍＭのＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度（ｍＭ）は（１３５－カリウムイオン濃度、つまり１３５からカリウムイオン濃度を引いた値）以下である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約４０ｍＭのカリウムイオン及び約９５ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約９５ｍＭ、約９４ｍＭ、約９３ｍＭ、約９２ｍＭ、約９１ｍＭ、約９０ｍＭ、約８５ｍＭ、約８０ｍＭ、約７５ｍＭ、約７０ｍＭ、約６５ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約４５ｍＭのカリウムイオン及び約９０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約９０ｍＭ、約８９ｍＭ、約８８ｍＭ、約８７ｍＭ、約８６ｍＭ、約８５ｍＭ、約８０ｍＭ、約７５ｍＭ、約７０ｍＭ、約６５ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約５０ｍＭのカリウムイオン及び約８５ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約８５ｍＭ、約８４ｍＭ、約８３ｍＭ、約８２ｍＭ、約８１ｍＭ、約８０ｍＭ、約７５ｍＭ、約７０ｍＭ、約６５ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約５５ｍＭのカリウムイオン及び約８０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約８０ｍＭ、約７９ｍＭ、約７８ｍＭ、約７７ｍＭ、約７６ｍＭ、約７５ｍＭ、約７０ｍＭ、約６５ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６０ｍＭのカリウムイオン及び約７５ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約７５ｍＭ、約７４ｍＭ、約７３ｍＭ、約７２ｍＭ、約７１ｍＭ、約７０ｍＭ、約６５ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約６５ｍＭのカリウムイオン及び約７０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約７０ｍＭ、約６９ｍＭ、約６８ｍＭ、約６７ｍＭ、約６６ｍＭ、約６５ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約７０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約６５ｍＭ、約６４ｍＭ、約６３ｍＭ、約６２ｍＭ、約６１ｍＭ、約６０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７５ｍＭのカリウムイオン及び約６０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約６０ｍＭ、約５９ｍＭ、約５８ｍＭ、約５７ｍＭ、約５６ｍＭ、約５５ｍＭ、約５０ｍＭ、約４５ｍＭ、または約４０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約８０ｍＭのカリウムイオン及び約５５ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５５ｍＭ、約５４ｍＭ、約５３ｍＭ、約５２ｍＭ、約５１ｍＭ、約５０ｍＭ、約４５ｍＭ、約４０ｍＭ、または約３５ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約８５ｍＭのカリウムイオン及び約５０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５０ｍＭ、約４９ｍＭ、約４８ｍＭ、約４７ｍＭ、約４６ｍＭ、約４５ｍＭ、約４０ｍＭ、約３５ｍＭ、または約３０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約９０ｍＭのカリウムイオン及び約４５ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約４５ｍＭ、約４４ｍＭ、約４３ｍＭ、約４２ｍＭ、約４１ｍＭ、約４０ｍＭ、約３５ｍＭ、約３０ｍＭ、または約２５ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約６０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約６１ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約７０ｍＭのカリウムイオン及び約６２ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの態様では、培地は約５０ｍＭのカリウムイオン及び約７５ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は等張性である。
本開示のいくつかの態様は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）約１３５ｍＭ未満の濃度のＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は（ｉ）４０ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１００ｍＭ未満の濃度でのＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は（ｉ）５０ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約９０ｍＭ未満の濃度でのＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は（ｉ）５５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７０ｍＭ未満の濃度でのＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は（ｉ）６０ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７０ｍＭ未満の濃度でのＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は（ｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は（ｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でカリウムイオン及び（ｉｉ）約５５ｍＭ～約９０ｍＭの間の濃度でＮａＣｌを含む培地にて免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）を培養する方法を対象とする。
ＩＩ．Ａ．３．張度
本開示のいくつかの態様では、代謝再プログラム化培地の張度（例えば、（カリウムイオンの濃度及びＮａＣｌの濃度）×２）は、カリウムイオン及び／またはＮａＣｌの濃度に基づいて調整される。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地の張度は基本培地の張度より低い。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地の張度は基本培地の張度より高い。いくつかの態様では、培地の張度は基本培地の張度と同じである。培地におけるカリウムイオン及び／またはＮａＣｌの濃度を改変することによって、代謝再プログラム化培地の張度に影響を及ぼすことができる。いくつかの態様では、カリウムイオン濃度の上昇はＮａＣｌの濃度の上昇または低下と対になる。いくつかの態様では、この対合は代謝再プログラム化培地の張度に影響を及ぼす。いくつかの態様では、カリウムイオンの濃度が上昇する一方で、ＮａＣｌの濃度は低下する。
いくつかの態様では、本発明の培地に有用な培地は、カリウムイオンと張度の関数に基づいて調製することができる。例えば、いくつかの態様では、本開示に有用な培地が低張性（例えば、２８０ｍＯｓｍ未満）であり、少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオンを含む場合、低張性として培地を維持するのに十分なＮａＣｌの濃度は、次の式：ＮａＣｌ濃度＝（所望の張度（２８０）／２）－カリウムイオン濃度（すなわち、ＮａＣｌの濃度（ｍＭ）は（１４０－カリウムイオン濃度）以下である）に基づいて決定することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されている低張培地は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間のカリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度を含む。したがって、低張培地については、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度が１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である限り、カリウムイオンの濃度は５０ｍＭ～９０ｍＭの間の濃度で設定することができ、ＮａＣｌの濃度は９０ｍＭ～５０ｍＭの間で設定することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されている低張培地は、１１５ｍＭ～１４０ｍＭの間でカリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されている低張培地は、１２０ｍＭ～１４０ｍＭの間でカリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は等張（２８０ｍＯｓｍ～３００ｍＯｓｍの間）であり、約５０ｍＭ～７０ｍＭの間のカリウムイオンの濃度を含む。ＮａＣｌの対応する濃度が、次の式：ＮａＣｌ濃度＝（所望の張度／２）－カリウムイオン濃度に基づいて再度算出され得る。例えば、カリウムの濃度が５０ｍＭであり、所望の張度が３００ｍＯｓｍである場合、ナトリウム濃度は１００ｍＭであることができる。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は等張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２８０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±１ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±２ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±３ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±４ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±６ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±７ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、ＭＲＭは２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±８ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±９ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ±１０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２９５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約３００ｍＯｓｍ／Ｌ、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約３０５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～約３１５ｍＯｓｍ／Ｌ、または約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ～３２０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２９０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２９５ｍＯｓｍ／Ｌ、約３００ｍＯｓｍ／Ｌ、約３０５ｍＯｓｍ／Ｌ、約３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、または約３１５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように２８０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２７５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２７５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２７０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２７０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２６５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２６５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２６０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２６０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２６５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２６５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２６０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２６０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は２５５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、２５５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２４５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように約２４５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２４０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、約２４０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２３５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、約２３５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２３０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、約２３０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２２５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２２５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の張度を有する。いくつかの態様では、張度は、カリウムイオン濃度及びＮａＣｌ濃度を加算し、２を乗じることによって測定されるように、約２２０ｍＯｓｍ／Ｌより高い。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２３０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２２０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２１５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２１０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２０５ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２００ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約１００ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約１２５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約１５０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約１７５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２００ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２１０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２２５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２３０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２３５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２４０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２４５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２６５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌ、または約２７５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２７０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６５ｍＯｓｍ／Ｌ、または約２５４ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６３ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５４ｍＯｓｍ／Ｌ～約２５５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ～約２５６ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５６ｍＯｓｍ／Ｌ～約２５７ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５７ｍＯｓｍ／Ｌ～約２５８ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５８ｍＯｓｍ／Ｌ～約２５９ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６１ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６１ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６２ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６２ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６３ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６３ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６４ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６４ｍＯｓｍ／Ｌ～約２６５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２２０ｍＯｓｍ／Ｌ～約２８０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約１００ｍＯｓｍ／Ｌ、約１２５ｍＯｓｍ／Ｌ、約１５０ｍＯｓｍ／Ｌ、約１７５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２００ｍＯｓｍ／Ｌ、約２１０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２２０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２２５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２３０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２３５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２４０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２４５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２５５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２６０ｍＯｓｍ／Ｌ、約２６５ｍＯｓｍ／Ｌ、約２７０ｍＯｓｍ／Ｌ、または約２７５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６２．２６ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５９．７ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５７．５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５７．２ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５５．２ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５４．７の張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２５５ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度を有する。いくつかの態様では、ＭＲＭは（ｉ）５ｍＭより高い濃度のカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭから約８０ｍＭの間の濃度のＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約２５０～２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度とを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは（ｉ）約４０ｍＭから約８０ｍＭの間の濃度のカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭから約８０ｍＭの間の濃度のＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約２５０～２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度とを含む。いくつかの態様では、ＭＲＭは（ｉ）約４０ｍＭから約８０ｍＭの間の濃度のカリウムイオンと、（ｉｉ）約５５ｍＭ～約９０ｍＭの間の濃度のＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約２５０～２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度とを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）約５０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約８０．５ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約２４ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約２．８ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約４０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約８８．９ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約２４ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約２．８ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約６０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約７２．２ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約２４ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約２．８ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約７０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約６３．９ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約２４ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約２．８ｍＭのカルシウムイオンをと含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約８０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約５５．６ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約２４ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約２．８ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約５０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約８０．５ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１７．７ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．９ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約５０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約８０．５ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１７．７ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．８ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約５５ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約７６ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１７．２ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．７ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約６０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約７２．２ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１６．８ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．６ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約６５ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約６７．６ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１６．３ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．５ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約７０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約６３．９ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１５．９ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．４ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約７５ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約５９．３ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１５．４ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．３ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、約８０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉ）約５５．６ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉ）約１５ｍＭのグルコース；及び（ｉｉｉ）約１．２ｍＭのカルシウムイオンとを含む。
代謝再プログラム化培地の張度は、任意の時点で、例えば、本明細書に開示されている等張または低張の状態に調整され得る。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地の張度は、細胞が代謝再プログラム化培地に加えられる前に、例えば、本明細書に開示されている等張または低張の状態に調整され得る。いくつかの態様では、細胞は、細胞操作前に、例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、またはＴＣＲ模倣体を発現する構築物による形質導入前に低張または等張の培地にて培養される。いくつかの態様では、細胞は、細胞操作中に、例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、またはＴＣＲ模倣体を発現する構築物による形質導入中に低張または等張の培地にて培養される。いくつかの態様では、細胞は、細胞操作後に、例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、またはＴＣＲ模倣体を発現する構築物による形質導入後に低張または等張の培地にて培養される。いくつかの態様では、細胞は、細胞増殖全体を通して低張または等張の培地にて培養される。
ＩＩ．Ａ．４．糖類
本開示のいくつかの態様は（ｉ）少なくとも約５ｍＭ（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）の濃度でのカリウムイオンと（ｉｉ）糖類とを含む培地にて免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を培養する方法を対象とする。いくつかの態様では、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、糖類の目標濃度は、さらに高濃度の糖類を含む基本培地から出発し、糖類の目標濃度に到達するように溶液を希釈することによって達成される。いくつかの態様では、糖類の目標濃度は、所望の濃度に到達するまで糖類を加えることにより、糖類の濃度を上昇させることによって達成される。いくつかの態様では、糖類は、単糖、二糖、または多糖である。いくつかの態様では、糖類は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の態様では、糖類はグルコースである。いくつかの態様では、培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）４０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含む。いくつかの態様では、培地は低張である。いくつかの態様では、培地は等張である。いくつかの態様では、培地は（ｉ）４０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、培地は（ｉ）５０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、培地は（ｉ）少なくとも約４０ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約１００ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）４０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約１００ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は等張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５０ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）グルコースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約４０ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭの濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）マンノースを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭの間である。
いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１０ｍＭ～約２４ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は、約４．２９ｇ／Ｌ未満である。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約２４ｍＭ未満である。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約５ｍＭを超える。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約５ｍＭ～約２０ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１０ｍＭ～約２０ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約１９ｍＭ、約１５ｍＭ～約１８ｍＭ、約１５ｍＭ～約１７ｍＭ、約１５ｍＭ～約１６ｍＭ、約１６ｍＭ～約２０ｍＭ、約１６ｍＭ～約１９ｍＭ、約１６ｍＭ～約１８ｍＭ、約１６ｍＭ～約１７ｍＭ、約１７ｍＭ～約２０ｍＭ、約１７ｍＭ～約１９ｍＭ、または約１７ｍＭ～約１８ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約５ｍＭ～約２０ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１０ｍＭ～約２０ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１０ｍＭ～約１５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１４ｍＭ～約１４．５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１４．５ｍＭ～約１５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１５ｍＭ～約１５．５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１５．５ｍＭ～約１６ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１６ｍＭ～約１６．５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１６．５ｍＭ～約１７ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１７ｍＭ～約１７．５ｍＭである。いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約１７．５ｍＭ～約１８ｍＭである。
いくつかの態様では、糖類、例えば、グルコースの濃度は約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１０．５ｍＭ、約１１ｍＭ、約１１．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．５ｍＭ、約１３ｍＭ、約１３．５ｍＭ、約１４ｍＭ、約１４．５ｍＭ、約１５ｍＭ、約１５．５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１６．５ｍＭ、約１７ｍＭ、約１７．５ｍＭ、約１８ｍＭ、約１８．５ｍＭ、約１９ｍＭ、約１９．５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２０．５ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、または約２５ｍＭである。
いくつかの態様では、本開示に有用な培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度（例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのＮａＣｌと、（ｉｉｉ）グルコースとを含む。いくつかの態様では、本開示に有用な培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度（例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間での濃度のＮａＣｌと、（ｉｉｉ）グルコースと、（ｉｖ）約２５０～２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度とを含む。いくつかの態様では、本開示に有用な培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度（例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ～約２４ｍＭの濃度でのグルコースと、（ｉｖ）約２５０～２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度とを含む。
ＩＩ．Ａ．５．カルシウム
本開示のいくつかの態様は（ｉ）少なくとも約５ｍＭ（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）の濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）カルシウムイオンを含む培地にて免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を培養する方法を対象とする。いくつかの態様では、培地は低張性または等張性である。
いくつかの態様では、カルシウムの目標濃度は、さらに高濃度のカルシウムイオンを含む基本培地から出発し、カルシウムイオンの目標濃度に到達するように溶液を希釈することによって達成される。いくつかの態様では、カルシウムの目標濃度は、１以上のカルシウム塩を加えることにより、カルシウムイオンの濃度を上昇させることによって達成される。カルシウム塩の非限定的な例としては、臭化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、カルシウムシアナミド、フッ化カルシウム、水素化カルシウム、水酸化カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、過塩素酸カルシウム四水和物、第一リン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、チオシアン酸カルシウム四水和物、ヒドロキシアパタイト、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、カルシウム塩は塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む。いくつかの態様では、カルシウム塩は、グルコン酸カルシウムを含む。
いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は、基本培地の濃度よりも低い。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は、基本培地の濃度よりも高い。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．４ｍＭ超である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約２．８ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約２．５ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約２．０ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．９ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．８ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．７ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．６ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．５ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．４ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．３ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．２ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．１ｍＭ未満である。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．０ｍＭ未満である。
いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．４ｍＭ～約２．８ｍＭ、約０．４ｍＭ～約２．７ｍＭ、約０．４ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．１ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．２ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．３ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．４ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．６ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．７ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．８ｍＭ～約２．０ｍＭ、約０．８～約０．９ｍＭ、約０．８～約１．０ｍＭ、約０．８～約１．１ｍＭ、約０．８～約１．２ｍＭ、約０．８～約１．３ｍＭ、約０．８～約１．４ｍＭ、約０．８～約１．５ｍＭ、約０．８～約１．６ｍＭ、約０．８～約１．７ｍＭ、約０．８～約１．８ｍＭ、約０．８～約１．９ｍＭ、約０．９～約１．０ｍＭ、約０．９～約１．１ｍＭ、約０．９～約１．２ｍＭ、約０．９～約１．３ｍＭ、約０．９～約１．４ｍＭ、約０．９～約１．５ｍＭ、約０．９～約１．６ｍＭ、約０．９～約１．７ｍＭ、約０．９～約１．８ｍＭ、約０．９～約１．９ｍＭ、約１．０～約１．１ｍＭ、約１．０～約１．２ｍＭ、約１．０～約１．３ｍＭ、約１．０～約１．４ｍＭ、約１．０～約１．５ｍＭ、約１．０～約１．６ｍＭ、約１．０～約１．７ｍＭ、約１．０～約１．８ｍＭ、約１．０～約１．９ｍＭ、約１．１～約１．２ｍＭ、約１．１～約１．３ｍＭ、約１．１～約１．４ｍＭ、約１．１～約１．５ｍＭ、約１．１～約１．６ｍＭ、約１．１～約１．７ｍＭ、約１．１～約１．８ｍＭ、約１．１～約１．９ｍＭ、約１．２～約１．３ｍＭ、約１．２～約１．４ｍＭ、約１．２～約１．５ｍＭ、約１．２～約１．６ｍＭ、約１．２～約１．７ｍＭ、約１．２～約１．８ｍＭ、約１．２～約１．９ｍＭ、約１．３～約１．４ｍＭ、約１．３～約１．５ｍＭ、約１．３～約１．６ｍＭ、約１．３～約１．７ｍＭ、約１．３～約１．８ｍＭ、約１．３～約１．９ｍＭ、約１．４～約１．５ｍＭ、約１．４～約１．６ｍＭ、約１．４～約１．７ｍＭ、約１．４～約１．８ｍＭ、約１．４～約１．９ｍＭ、約１．５～約１．６ｍＭ、約１．５～約１．７ｍＭ、約１．５～約１．８ｍＭ、約１．５～約１．９ｍＭ、約１．６～約１．７ｍＭ、約１．６～約１．８ｍＭ、約１．６～約１．９ｍＭ、約１．７～約１．８ｍＭ、約１．７～約１．９ｍＭ、または約１．８～約１．９ｍＭである。
いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．８ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．９ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．０ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．１ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．２ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．８ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．８ｍＭ～約０．９ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．９ｍＭ～約１．０ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．０ｍＭ～約１．１ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．１ｍＭ～約１．２ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．２ｍＭ～約１．３ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．３ｍＭ～約１．４ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．４ｍＭ～約１．５ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．５ｍＭ～約１．６ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．７ｍＭ～約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は、約１．８ｍＭ～約１．９ｍＭである。
いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、または約２．０ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．６ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．７ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約０．９ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．０ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．１ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．２ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．３ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．４ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．５ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．６ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．７ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．８ｍＭである。いくつかの態様では、カルシウムイオンの濃度は約１．９ｍＭである。
いくつかの態様では、本開示に有用な培地は（ｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのカリウムイオン、及び（ｉｉ）約０．５ｍＭ～約２．８ｍＭの間の濃度でのカルシウムを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約０．５ｍＭ～約２．８ｍＭの間の濃度でのカルシウムとを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ～約２４ｍＭの間の濃度でのグルコースと、（ｉｖ）約０．５ｍＭ～約２．８ｍＭの間の濃度でのカルシウムとを含む。いくつかの態様では、培地は（ｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのカリウムイオンと、（ｉｉ）約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間の濃度でのＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ～約２４ｍＭの間の濃度でのグルコースと、（ｉｖ）約０．５ｍＭ～約２．８ｍＭの間の濃度でのカルシウムと、（ｖ）約２５０～２６０ｍＯｓｍ／Ｌの張度とを含む。
ＩＩ．Ａ．６．サイトカイン
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はサイトカインを含む。いくつかの態様では、培地は低張性である。いくつかの態様では、培地は等張性である。いくつかの態様では、培地は高張性である。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はＩＬ－２を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はＩＬ－２及びＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はＩＬ２とＩＬ２１とＩＬ１５とを含む。
サイトカインは任意の時点で培地に加えることができる。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞が培地に加えられる前に、サイトカインが培地に加えられる。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞を操作する前に、例えば、リガンド結合タンパク質をコードする構築物で形質導入する前に（ｉ）本明細書に開示されている濃度（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムと（ｉｉ）サイトカインとを含む培地にて培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞を操作している最中に、例えば、リガンド結合タンパク質をコードする構築物で形質導入している最中に（ｉ）本明細書に開示されている濃度（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムと（ｉｉ）サイトカインとを含む培地にて培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞を操作した後で、例えば、リガンド結合タンパク質をコードする構築物で形質導入した後で（ｉ）本明細書に開示されている濃度（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムと（ｉｉ）サイトカインとを含む培地にて培養される。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、細胞増殖の全体を通して（ｉ）本明細書に開示されている濃度（例えば、５ｍＭより高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）でのカリウムと（ｉｉ）サイトカインとを含む培地にて培養される。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－７を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－７を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－７を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－１５を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－１５を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－１５を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－７及びＩＬ－１５を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－７及びＩＬ－１５を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオン及び（ｉｉ）ＩＬ－２を含み、代謝再プログラム化培地はＩＬ－７及びＩＬ－１５を含まない。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－２及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－２及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－２及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－７及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－７及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－７及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－１５及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）４０ｍＭを超えるカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－１５及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオンと（ｉｉ）ＩＬ－１５及びＩＬ－２１とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は低張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は等張性である。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はさらにＮａＣｌを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭである。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）は約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
したがって、いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度のカリウムイオン及び（ｉｉ）約９０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１２５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２２５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約３５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＩＬ－２を含む代謝再プログラム化培地はさらに、約１１５ｎＭ未満の濃度でＮａＣｌを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、または約２７５ｎｇ／ｍＬ～約３２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５９０ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約６００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７３．６ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）は、約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、培養培地は、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約９０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１２５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２２５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約３５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＩＬ－２１を含む代謝再プログラム化培地はさらに、約１１５ｎＭ未満の濃度でＮａＣｌを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）は、約５００ＩＵ／ｍＬ～約１，５００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬ、約５５０ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約６５０ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約７５０ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約８５０ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約９５０ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，０５０ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，１５０ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，２５０ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，３５０ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，４５０ＩＵ／ｍＬ、または約１，５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。
いくつかの態様では、本開示のために有用な代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約６５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約８００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約８５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約９００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約９５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，０５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，１５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，３５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，４５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１，５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＩＬ－７を含む代謝再プログラム化培地はさらに、約１１５ｎＭ未満の濃度でＮａＣｌを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）は約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、培養培地は約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
したがって、いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約７０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約９０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１２５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約１７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２２５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約２７５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約３５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約４５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でのカリウムイオン及び（ｉｉ）約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、カリウムイオン及びＩＬ－１５を含む代謝再プログラム化培地はさらに、約１１５ｎＭ未満の濃度でＮａＣｌを含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約２．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約３．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約４．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約５．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約６．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約７．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約８．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約９．０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地はさらにＮａＣｌを含み、カリウムイオン及びＮａＣｌの総濃度は１１０ｍＭ～１４０ｍＭである。
いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約３０ｍＭ～少なくとも約１００ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、４０ｍＭを超えるカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約４５ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約５０ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約５５ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約７５ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約８０ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約８５ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は、少なくとも約９０ｍＭのカリウムイオンと、約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。いくつかの態様では、代謝再プログラム化培地は（ｉ）少なくとも約７０ｍＭのカリウムイオンと、（ｉｉ）約６０ｍＭのＮａＣｌと、（ｉｉｉ）約１．４ｍＭのカルシウムと、（ｉｖ）約１６ｍＭのグルコースと、（ｖ）約３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と、（ｖｉ）約０．４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とを含む。
ＩＩ．Ａ．７．基本培地
いくつかの態様では、基本培地は、平衡塩類溶液（例えば、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＥＢＳＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ＲＰＭＩ１６４０、グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）、アルファ最小必須培地（アルファＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍ１９９、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞増殖基本培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）完全、ＩｍＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）ＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）、ＡＩＭ Ｖ、ＴＥＸＭＡＣＳ（商標）培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）Ｔ細胞ＣＤＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ）、ＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）ＴＩＬ増殖培地、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、基本培地はＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞ＣＤＭを含む。いくつかの態様では、基本培地はＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）を含む。いくつかの態様では、基本培地はＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）Ｐｒｏを含む。いくつかの態様では、基本培地は無血清である。いくつかの態様では、基本培地はさらに免疫細胞血清置換（ＩＣＳＲ）を含む。例えば、いくつかの態様では、基本培地は、ＩＣＳＲで補完したＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）完全、ＩＣＳＲで補完したＡＩＭ Ｖ、ＩＣＳＲで補完したＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）ＸＦ、ＩＣＳＲで補完したＲＰＭＩ、ＩＣＳＲで補完したＴＥＸＭＡＣＳ（商標）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様では、基本培地はＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）完全を含む。
いくつかの態様では、培地、例えば、ＭＲＭはさらに、約２．５％の血清補足剤（ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、２ｍＭのＬ－ｇｌｕｔａｍａｘ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ、２０μｇ／ｍＬのｆｕｎｇｉｎ（商標）、ピルビン酸ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、培地はさらに、Ｏ－アセチル－Ｌ－カルニチン塩酸塩を含む。いくつかの態様では、培地はさらに、キナーゼ阻害剤を含む。
いくつかの態様では、培地はさらに、ＣＤ３アゴニストを含む。いくつかの態様では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。いくつかの態様では、抗ＣＤ３抗体はＯＫＴ－３を含む。
いくつかの態様では、培地はさらに、ＣＤ２８アゴニストを含む。いくつかの態様では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。いくつかの態様では、培地はさらに、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）を含む。いくつかの態様では、培地はさらに、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）を含む。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で開示されている培地を含む細胞培養物、本明細書で開示されている培地を含む細胞バッグ、または本明細書で開示されている培地を含む生物反応器を含む。
ＩＩ．Ｂ．細胞の起源及び活性化
初代Ｔ細胞を含む本開示の免疫細胞（本明細書に記載されている方法を使用して改変及び培養することができる）は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び／または腫瘍組織を含む、多数の組織源から得ることができる。ＰＢＭＣを含む白血球は、周知の技術、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離及び白血球アフェレーシスによって他の血液細胞から単離することができる。白血球アフェレーシス産物は通常、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞を含む）、単球、顆粒球、及び他の有核白血球を含有する。Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介する遠心分離によってまたは対向流遠心溶出法によって他の白血球からさらに単離することができる。Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＧＩＴＲ＋、及び／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の特定の亜集団は、陽性選択または陰性選択の技術によって（例えば、蛍光に基づくまたは磁気に基づく細胞選別を使用して）さらに単離することができる。例えば、Ｔ細胞は、種々の市販の抗体結合ビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離製品（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のいずれかとともに、所望のＴ細胞の陽性選択または不要な細胞の除去のための陰性選択に十分な時間インキュベートすることによって単離することができる。
いくつかの例では、自己Ｔ細胞はがん治療後にがん患者から直接得られる。特定のがん治療の後、免疫系を損っている特定のものでは、治療の直後に採取されたＴ細胞の品質は、生体外で増殖する及び／または生体外で操作された後に移植するための改善された能力を有し得ることが観察された。
遺伝子組換え（例えば、本明細書に記載されている組換え法のいずれかを使用する）の前または後にかかわらず、Ｔ細胞は、一般に、例えば、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に明示的に組み込まれる米国特許５，８５８，３５８号；同第５，８８３，２２３号；同第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；同第６，６９２，９６４号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８０号；同第６，９０５，６８１号；同第６，９０５，８７４号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１４４，５７５号；同第７，１７２，８６９号；同第７，１７５，８４３号；同第７，２３２，５６６号；同第７，５７２，６３１号；及び同第１０，７８６，５３３号に記載されている方法を使用して活性化及び増殖され得る。一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを付着させた表面に接触させることによって試験管内または生体外で増殖させることができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に不動化された抗ＣＤ３抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用することができる。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）、または市販のナノ粒子、例えばＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはその他の既知の活性化剤を使用して活性化し、増殖させる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法は、本明細書に記載されているように、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地（例えば、代謝再プログラム化培地）にて、ヒト免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルを上昇させるように改変されたＴ細胞及び／またはＮＫ細胞）をプログラム可能な細胞シグナル伝達足場（ＰＣＳ）と接触させることを含む。プログラム可能な細胞シグナル伝達足場（ＰＣＳ）の非限定的な例は、ＷＯ２０１８／０１３７９７及びＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６（２）：１６０－１６９（２０１８）に記載されており、その内容は参照によって本明細書に全体として組み込まれる。いくつかの態様では、本開示のプログラム可能な細胞シグナル伝達足場は、高表面積のメソ孔のシリカマイクロロッド（ＭＳＲ）を含む第１の層と；第１層をコーティングする脂質を含む第２の層と；足場上に搭載された複数の機能性分子とを含む。いくつかの態様では、機能性分子には、Ｔ細胞を活性化する刺激分子（Ｔ細胞活性化分子）が含まれるが、これに限定されない。いくつかの態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体の構成成分を結合する及び／またはクラスター化することによってＴ細胞を活性化する。いくつかの態様では、刺激分子は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、機能性分子には１以上の共刺激抗原に特異的に結合する１以上の共刺激分子が含まれる。共刺激分子の代表的な例には、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、及び／またはＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）に特異的に結合する分子が挙げられるが、これらに限定されない。そのような足場は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に一般的に関連付けられている機能を模倣することができ、これによって、足場は標的細胞に対して種々の機能（例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能を引き出す）を引き出すことができる。本明細書で企図されているように、いくつかの態様では、足場は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）に存在する細胞表面分子と足場によって提示される種々の機能分子との間の直接的または間接的な相互作用を介してこれらの効果に介在する。いくつかの態様では、足場は、足場自体の物理的または化学的な特性を介して、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の生存、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖、及び／または標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の機能を調節する。
ＩＩ．Ｃ．細胞
本開示はまた、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現し、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する細胞）と比べてｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇している改変された細胞も提供する。いくつかの態様では、細胞は自然にｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現しないが、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されている。いくつかの態様では、細胞は自然にｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現することができるが、内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増やすように改変されている。特に指示されない限り、「ｃ－Ｊｕｎ過剰発現」（またはその派生語）はそのような改変された細胞の双方を含む。本明細書に記載されているように、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して本明細書に記載されている細胞を改変することができる。
いくつかの態様では、本開示に有用な細胞は、目的のタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように改変されているので、コードされたタンパク質は細胞にて発現される。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、改変後、コードされたタンパク質の発現は、参照細胞（例えば、外来性ヌクレオチド配列を含むように改変されていない対応する細胞）と比べて増加する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞は、目的のさまざまなタンパク質（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードする複数の外来性ヌクレオチド配列を含むように改変されている。複数の外来性ヌクレオチド配列が関与する場合、いくつかの態様では、複数の外来性ヌクレオチド配列は、単一のポリシストロン性ポリヌクレオチドの一部であることができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞は、細胞における目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の内在性発現を誘導する及び／または増やすことができる転写活性化因子で改変されている。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、改変後、タンパク質の内在性発現は参照細胞（例えば、転写活性化因子で改変されていない対応する細胞）と比べて増加する。本明細書で使用されるとき、「転写活性化因子」という用語は、遺伝子または遺伝子セットの転写を（例えば、核酸配列のエンハンサーまたはプロモーターの近位要素に結合し、それによってその転写を誘導することによって）増加させるタンパク質を指す。本開示で使用され得るかかる転写活性化因子の非限定的な例としては、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ベースの転写活性化因子、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ベースの転写活性化因子、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システムベースの転写活性化因子、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、参照によって全体として本明細書に組み込まれるＫａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，６９（２）：１８８－１９７（Ｓｅｐ．２０１４）を参照のこと。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムベースの転写活性化因子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）で改変されている。例えば、参照によって全体として本明細書に組み込まれるＮｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，５４：１－１３（Ｍａｙ，２０１４）を参照のこと。ＣＲＩＳＰＲａは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くが、そのガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡ核酸配列に結合する能力を保持する修飾されたＣａｓタンパク質の使用を含むＣＲＩＳＰＲツールの一種である。本開示で使用され得るかかる修飾されたＣａｓタンパク質の非限定的な例は、当該技術分野で既知である。例えば、参照によって全体として本明細書に組み込まれるＰａｎｄｅｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０（１）：１－１４（Ｊａｎ．２０２０）を参照のこと。いくつかの態様では、該修飾されたＣａｓタンパク質は、修飾されたＣａｓ９タンパク質（当該技術分野では「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、該修飾されたＣａｓタンパク質は、修飾されたＣａｓ１２ａタンパク質を含む。いくつかの態様では、本開示に有用な修飾されたＣａｓタンパク質は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、低分子ガイドＲＮＡ）に結合し（「修飾されたＣａｓガイド複合体」）、該ガイドポリヌクレオチドは、目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）をコードする核酸配列の領域に相補的である認識配列を含む。いくつかの態様では、該ガイドポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする内在性核酸配列のプロモーター領域に相補的な認識配列を含む。いくつかの態様では、１以上の転写活性化因子は、該修飾されたＣａｓガイド複合体（例えば、該修飾されたＣａｓタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端）に結合され、該修飾されたＣａｓガイド複合体が細胞に導入された場合に、１以上の転写活性化因子が、核酸配列の調節要素（例えば、プロモーター領域）に結合することができ、それによって、コードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現が誘導され、及び／または増加する。いくつかの態様では、該１以上の転写活性化因子は、内在性遺伝子の調節要素（例えば、プロモーター領域）に結合することができ、それによって、コードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現を誘導する及び／または増加させることができる。使用され得る一般的な活性化因子の非限定的な例としては、ＲＮＡＰのオメガサブユニット、ＶＰ１６、ＶＰ６４及びｐ６５が挙げられる。例えば、参照によって全体として本明細書に組み込まれるＫａｂａｄｉ ａｎｄ Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，６９：１８８－１９７（２０１４）を参照のこと。
いくつかの態様では、１以上の転写リプレッサー（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスドメイン（ＫＲＡＢ））は、修飾されたＣａｓガイド複合体（例えば、修飾されたＣａｓタンパク質のＮ及び／またはＣ末端）に結合される可能性があり、細胞に導入された場合に、１以上の転写リプレッサーが、遺伝子、例えば、ｃ－Ｊｕｎの発現を妨害し得る遺伝子（例えば、ＢＡＣＨ２）の転写を抑制または低減し得る。例えば、そのそれぞれが参照によって全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０００３０３７９Ａ１及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ，１９：４５９（２０２１）を参照のこと。いくつかの態様では、本開示に有用な修飾されたＣａｓタンパク質は、１以上の転写活性化因子及び１以上の転写リプレッサーの双方に結合し得る。
いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、そのような修飾されたＣａｓタンパク質の使用により、目的の遺伝子の条件付き転写及び発現が可能になり得る。例えば、いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、プロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ））及びｃ－Ｊｕｎのプロモーター領域を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に連結されたリガンド結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を含むように修飾される。いくつかの態様では、細胞は、転写活性化因子（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ転写活性化因子（ＶＰＲ））にリンカー（例えば、ＴＥＶ切断可能リンカー）を介して結合した修飾されたＣａｓタンパク質と複合体を形成するＴ細胞の活性化用リンカー（ＬＡＴ）をさらに含むように修飾される。リガンド結合タンパク質が活性化されると、修飾されたＣａｓタンパク質が核局在化のために放出され、ｃ－Ｊｕｎの発現を条件付きかつ可逆的に誘導する。参照によって全体として本明細書に組み込まれるＹａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ，９（Ｓｕｐｐｌ２）：Ａ１６４（２０２１）。
当業者には明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞は、複数のアプローチの組み合わせを使用して改変されている。例えば、いくつかの態様では、細胞は（ｉ）１以上のタンパク質（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質及びＥＧＦＲｔ）をコードする外来性ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）内在性タンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現を高める外来性転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）を含むように改変されている。いくつかの態様では、細胞は（ｉ）第１のタンパク質（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質）をコードする外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質）をコードする外来性ヌクレオチド配列とを含むように改変されている。いくつかの態様では、改変された細胞はさらに、第３のタンパク質（例えば、ＥＧＦＲｔ）をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むことができる。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、第１、第２及び第３のタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列は、単一のポリシストロン性ベクターの一部であることができる。
特に指示されない限り、１以上の外来性ヌクレオチド配列及び／または転写活性化因子は、当該技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して細胞に導入することができる。１以上の外来性ヌクレオチド配列を細胞に送達するのに好適な方法の非限定的な例には、形質移入（形質転換及び形質導入としても知られる）、エレクトロポレーション、非ウイルス送達、ウイルス形質導入、脂質ナノ粒子送達、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、本開示の免疫細胞（本明細書に記載されている方法を使用して改変及び培養することができる）は、例えば、試験管内または生体外で培養する前にヒト対象から単離される。いくつかの態様では、免疫細胞は他家細胞療法のためにヒト対象から単離される。いくつかの態様では、免疫細胞は自家細胞療法のためにヒト対象から単離される。いくつかの態様では、免疫細胞はＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）である。いくつかの態様では、免疫細胞はＮＫ細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞はＴｒｅｇである。
いくつかの態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は本明細書に開示されている方法に従って培養する前に操作される。いくつかの態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、本明細書に開示されている方法に従って培養した後に操作される。いくつかの態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は本明細書に開示されている方法に従って、例えば、細胞操作の前に、細胞操作中に、及び細胞操作の後に、少なくとも５ｍＭ（例えば、５ｍＭよりも高い、例えば、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間）のカリウムイオンを含む低張または等張の培地にて培養される。いくつかの態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される。いくつかの態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作される。特定の態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を、本明細書に開示されている条件下で、例えば、少なくとも約５ｍＭのカリウムイオンを含む低張または等張の培地にて培養すると、さらに高い形質導入効率がもたらされる。いくつかの態様では、形質導入効率は、４ｍＭ以下のカリウムイオンを含む培地にて培養した細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞と比べて、本明細書に開示されている方法に従って少なくとも約６０ｍＭのカリウムイオンを含む低張または等張の培地にて培養した細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞では少なくとも約２倍高い。いくつかの態様では、形質導入効率は、４ｍＭ以下のカリウムイオンを含む培地にて培養した細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞と比べて、本明細書に開示されている方法に従って少なくとも約６５ｍＭのカリウムイオンを含む低張または等張の培地にて培養した細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞では少なくとも約２．５倍高い。
本開示から明らかなように、いくつかの態様では、本開示に有用な免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して改変及び培養されたもの）は、当該技術分野で知られている任意の好適な免疫細胞を含む。さらに、本開示の他の箇所でさらに説明されているように、本開示の免疫細胞は改変されているので、自然界に自然に存在する対応する免疫細胞とは異なる。例えば、本明細書に記載されている免疫細胞は、免疫細胞の独特な特性を付与するのに役立つ１以上のタンパク質を発現するように改変されている。具体的には、いくつかの態様では、本明細書で提供されている改変された免疫細胞は、参照細胞（例えば、本明細書に記載されているように改変されていない対応する免疫細胞）と比べて、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルが上昇している。いくつかの態様では、本明細書に記載されている改変された免疫細胞は、免疫細胞では自然に発現されないキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）も発現する。本開示から明らかなように、いくつかの態様では、キメラ結合タンパク質（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質）は、キメラ結合タンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドで細胞を改変することによって細胞にて発現させることができる。外来性ポリヌクレオチドによってコードされ、免疫細胞で発現され得る追加のタンパク質については、本開示の他の箇所で説明されている。そのようなポリヌクレオチドに関する非限定的な開示は以下に提供されている。
ＩＩ．Ｃ．１．ＲＯＲ１結合タンパク質
本開示から明らかなように、本明細書に記載されている細胞（例えば、ＭＲＭにて培養された免疫細胞）はＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように改変される。したがって、いくつかの態様では、参照細胞（例えば、自然界に自然に存在する細胞のような改変されていない対応する細胞）と比べて、本明細書に記載されている細胞はＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように改変されている（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように細胞に形質導入することによって）。いくつかの態様では、参照細胞と比べてＲＯＲ１結合タンパク質の発現は、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
本明細書で使用されるとき「ＲＯＲ１結合タンパク質」という用語は、ＲＯＲ１タンパク質またはその断片（例えば、腫瘍細胞またはペプチド／ＭＨＣ複合体上に発現されるもの）に特異的に結合することができる任意のタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指す。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、抗体、ｓｃＦｖのような操作された抗体、ＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、ＴＣＲ模倣体（例えば、抗体－Ｔ細胞受容体（ａｂＴＣＲ）もしくはキメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ｃａＴＣＲ））、またはキメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質はＲＯＲ１の天然リガンドを含む。そのようなＲＯＲ１結合タンパク質に関する追加の開示は、以下でさらに提供されている。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、参照によって全体として本明細書に組み込まれる、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（１２）：３１５３－６４（２０１３）；Ｂａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，４：３４９－６１（２０１２）；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，６：ｅ２１０１８（２０１１）；ＵＳ９，３１６，６４６Ｂ２；及びＵＳ９，７５８，５８６Ｂ２に記載されている２Ａ２、Ｒ１１、及びＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨ及び／またはＶＬ配列を含む抗体またはその断片を含む。例えば、いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は抗ＲＯＲ１抗体、例えば、Ｒ１２、抗体と交差競合することができる。Ｒ１２抗体の配列は表１４に示されている。
いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、例えば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９２２５９９２Ａ１（例えば、ＡＢ４、Ａ２Ｆ２、Ａ２Ｆ３、ＢＡ６、ＣＣ９、Ｃ２Ｅ３、ＤＧ６、Ｄ２Ｂ１２、Ａ２Ｆ２ Ｍ１、及びＢＡ６ Ｍ１；例えば、配列番号４３－５８）；ＵＳ２０２１０３１７２０４Ａ１（例えば、配列番号４５－５９）；ＷＯ２０２２１２９６２２Ａ１（例えば、変異型を含めてＢ１、Ｂ１Ｇ４、１Ｅ２、１Ｅ５、１Ｂ１１、Ｃ３ＣＰ、２Ｇ５、１Ｇ１２、Ｇ５ＣＰ、２Ｆ４、１Ｇ９、１Ｈ８、Ｇ１１ＣＰ、Ｄ９ＣＰ、１Ｂ６、１Ｆ１０、Ｅ６ＣＰ、Ｆ２ＣＰ、Ｂ６ＣＰ、１Ｇ１、Ａ１０ＣＰ、Ｇ３ＣＰ、Ｇ３ＣＰ Ｇ４、Ｇ３ＣＰ Ｖ１５、１Ｈ８ Ｇ４、１Ｈ８ Ｖ１５、Ｃ３ＣＰ Ｇ４、Ｃ３ＣＰ Ｖ１５、Ｐ３Ａ１ Ｇ１；表１及び２または配列を参照のこと）；ＷＯ２０２２０２０３８８Ａ１（例えば、配列番号６４１－６４４及び６４１－７４４）；ＵＳ２０２００３３８２１０Ａ１（例えば、ｍ２Ａ２、ｈ２Ａ２、及びＹ３１；配列番号１、２、９、１０、３６、及び３７）；ＵＳ２０１９０１５３０９２Ａ１（例えば、２Ａ２、ｈｕ２Ａ２Ｂ、ｒｂＱ１１、ｒｂＤ４、ｒｂＱ１２、ｈｕＲ１２＿４、ｈｕＲ１２＿７、ｈｕＲ１２＿１１、及びｈｕＲ１２＿１６；配列番号７－１４、２１－２８、及び３５－４４）；ＷＯ２０２１０４８５６４Ａ２（例えば、１Ｄ４、３Ｆ６、４Ｅ２、５Ｄ２、８Ｂ２、８Ｂ３、及び９Ｇ１；配列番号７、８、１５、１６、２３、２４、３１、３２、３９、４０、４７、４８、５５、及び５６）；ＷＯ２０２２０２９４３１Ａ１（例えば、配列番号５）；ＷＯ２０１７１５６４７９Ａ１（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ２４－配列番号１４６；配列番号７、８、１５、１６、２３、２４、３１、３２、３９、４０、４７、４８、５５、５６、６３、６４、７１、７２、７９、８０、８７、８８、９５、９６、１０３、１０４、１１１、１１２、１１９、及び１２０）；ＵＳ２０１８０１４７２７１Ａ１（例えば、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、２１５、２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、２１６、２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、及び３６０）；ＵＳ１０７５２６８４Ｂ２（例えば、２Ａ２、４Ａ５、Ｄ１０、Ｇ６、Ｇ３、Ｈ１０、２Ａ４、及び１Ｃ１１；配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３２、３７、４１、４５、４９、５３、５８、６３、６７、７１、及び７５）；ＵＳ１０７５９８６８Ｂ２（例えば、Ｈ８、Ａ１、Ａ２、及びＡ３；配列番号１１－１８）；ＷＯ２０２１１９０６２９Ａ１（例えば、抗体＃１、１１、３２、１０１、１０３、１１５、１４０、及び１６２）；ＵＳ２０２００１５７１７４Ａ１（例えば、配列番号１０５、１１３、１２１、１２９、１３７、１４５、１５３、１０９、１１７、１２５、１３３、１４１、１４９、及び１５７）；ＵＳ２０２００２５５５２１Ａ１（例えば、配列番号２－９）；ＵＳ２０１７０３０６０１８Ａ１（例えば、ＭＡＢ１、ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、及びＭＡＢ４；配列番号：２、６、及び４２－４７）；ＷＯ２０２２０４２４８８Ａ１（例えば、ヒト化変異型を含めてｍＡｂ００４；配列番号８－２０）；ＷＯ２０２２０２６７５９Ａ１（例えば、配列番号：４５０、４５４、４５８、及び４６２）；ＵＳ２０２１０１５５６９２Ａ１（例えば、Ｉ２Ａ－３、Ｉ２Ａ－４、Ｉ２Ａ－６、Ｉ２－Ａ８、Ｉ２－Ａ１２、Ｉ２－Ａ２０、Ｉ２－Ａ２５、Ｉ２－Ａ２６、Ｉ２－Ａ２７、Ｉ２－Ａ３０、Ｉ２－Ａ３２、Ｉ２－Ａ３３、及びＩ２－Ａ３７；表６に提供された配列）；ＵＳ１１１５５６１５Ｂ２（例えば、６０１－１４７、６０１－１４９、６０１－２８、６０１－３７、６０１－４、６０１－５、６０１－５０、６０１－６５、６０１－６６、６０１－７０、６０１－８７、及び６０１－９；表６及び７に提供された配列）；ＵＳ１０９６８２７５Ｂ２（例えば、配列番号１２－１６）；ＵＳ２０２１０１４５８８２Ａ１（例えば、２Ａ２、Ｒ１２、Ｒ１１、Ｙ３１、ＵＣ－９６１、Ｄ１０、及びＨ１０；配列番号１－４５）；ＥＰ４０３９７０７Ａ１（例えば、ＰＲ０００３７４；配列番号８４及び８５）；ＷＯ２０２１１１５４９７Ａ２（例えば、１０１５Ｍ２－Ｈ４；配列番号６３及び７１）；ＷＯ２０２２０４８５８１Ａ１（例えば、配列番号９３－１３４及び１８６－１９７）；ＵＳ２０２２０１９５０４１Ａ１（例えば、配列番号１５６及び１６６）；ＷＯ２０２１０５７８２２Ａ１（例えば、Ｃ３、Ｇ３、及びＧ６；配列番号１、５、１５、１９、２９、及び３３）；ＷＯ２０２２１５０８３１Ａ１（例えば、配列番号３４－３６及び２５６－２７０）；ＵＳ２０２１０１７７９０２Ａ１（例えば、配列番号１５－７４）；ＵＳ１０８８９６５２Ｂ２（例えば、クローン８３Ｂ、８３、３０５、２９８、３５０、２０、１６、４８、４３、３６６、４０、４６１、６５、８１、及び７；表３Ｂに提供された配列）；ＵＳ２０２２０１６８３４４Ａ１（例えば、配列番号１５２－１５７）；ＵＳ１０６４７７６８Ｂ２（例えば、配列番号５１及び５２）；ＷＯ２０２２１５２１６８Ａ１（例えば、配列番号：２４、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、６８、６９、７２、７３、７６、７７、８０、８１、８４、８５、８８、８９、９２、及び９３）；ＷＯ２０２００２６９８７Ａ１（例えば、配列番号１７及び２２）；ＵＳ２０１９０１５３０９２Ａ１（例えば、配列番号９－４４）；ＵＳ２０２１０１３９５７９Ａ１（例えば、配列番号２０、２１、４、５、８、９、２２、２３、２、及び３）；ＵＳ１０７５８５５６Ｂ２（例えば、配列番号４及び５）；ＵＳ２０２１３７９１９４Ａ１（例えば、配列番号１、２、２０、及び２１）；ＵＳ１０６１８９５９Ｂ２（配列番号１３０－１４１）；ＷＯ２０２２０８４４４０Ａ２（例えば、配列番号：２１２－２１４及び２２１－２２３）；ＷＯ２０２２１６７４６０Ａ１（例えば、配列番号：７－１２及び２０－２９）；ＵＳ９２２８０２３Ｂ２（例えば、Ａ１－Ａ１４；配列番号１－１４、２９－４２、２６８、及び２７０）；ＷＯ２０２１２０２８６３Ａ１（例えば、配列番号３及び４）；ＵＳ２０２１２７７１０９Ａ１（例えば、２２６Ｅ１２、３２３Ｈ７、３２４Ｃ７、３２３Ｄ１０、３２４Ｅ２、３２４Ｃ６、３３８Ｈ４、及び３３０Ｆ１１；配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、及び１３２）；ＵＳ２０１９２７６５４０Ａ１（例えば、配列番号６５、６９、及び７９）；ＵＳ２０２００４０５７５９Ａ１（例えば、配列番号３－１４）；ＵＳ９９３８３５０Ｂ２（例えば、配列番号１及び２）；ＵＳ１１３１２７８７Ｂ２（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２７－３２）；ＵＳ２０１９０１１２３８０Ａ１（例えば、配列番号４５４、４５５、７５５、及び７５６）；ＥＰ３５４８０５５Ａ２（例えば、表６及び７または例示的な配列を参照のこと）；ＵＳ２０２１０１３７９７７Ａ１（例えば、配列番号９６９９、９６３７、９６３８、及び１１１４５－１１１９３）；ＷＯ２０２１１８８５９９Ａ１（例えば、配列番号１９０６５－１９１３３）；ＵＳ２０２１２５３７２９Ａ１（例えば、配列番号：２４－２６）；ＵＳ２０２２０１５２２１４Ａ１（例えば、Ａｂ１；配列番号３及び４）；ＵＳ２０２２０２２７８６６Ａ１（例えば、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ６、Ａｂ７；配列番号７２－７５、１００、及び１０３）；ＷＯ２０２１１５９０２９Ａ１；ＷＯ２０２２０１１０７５Ａ１；ＵＳ２０２２０１３３９０１Ａ１；に開示されている抗ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１抗体）のいずれかのＶＨ及び／またはＶＬ配列（またはＣＤＲ配列の１以上）を含む。
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）ファミリーのメンバーである。これは神経栄養性チロシナーゼキナーゼ受容体関連１（ＮＴＲＫＲ１）としても知られている。ヒトのアミノ酸及び核酸の配列は、公共データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔで見ることができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１及び２前駆体のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２及びＮＰ＿００１０７７０６１．１でそれぞれ見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００５０１２．３及びＮＭ＿００１０８３５９２．１でそれぞれ見ることができる。本明細書で使用されるとき、「ＲＯＲ１」には、完全長野生型ＲＯＲ１の突然変異、例えば、点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異型を含むタンパク質が含まれる。
ＲＯＲ１は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）や非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌を含む、種々のがんにて過剰発現していることが記載されている。Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：３０６１－３０７１（２０１７）．受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１陽性（ＲＯＲ１＋）固形腫瘍を、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で安全に標的とすることができる（Ｓｐｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（７９）（４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｐ２－０９－１３））；しかしながら、悪性固形腫瘍の患者では注入後にＣＡＲ Ｔ細胞が疲弊または機能不全を示すので、有効性はある程度限定されている。加えて、固形腫瘍は、ＣＡＲ Ｔ細胞のような免疫療法の抗腫瘍活性を限定する免疫抑制バリアを有する（Ｎｅｗｉｃｋ，２０１６，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，２０１８，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，２０１９）。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本開示に有用なＲＯＲ１結合タンパク質はＣＡＲを含む。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養することができる免疫細胞は、ＣＡＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されている。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＡＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＣＡＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の双方を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれはＣＡＲと高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、本明細書に開示されているＣＡＲ発現細胞はＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、モノＣＡＲ Ｔ細胞、ゲノム編集ＣＡＲ Ｔ細胞、二重ＣＡＲ Ｔ細胞、またはタンデムＣＡＲ Ｔ細胞である。そのようなＣＡＲ Ｔ細胞の例は国際出願番号第ＷＯ２０２００２８４００号に提供されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる
いくつかの態様では（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質と組み合わせて発現され得る）ＣＡＲは標準的ＣＡＲとして設計される。「標準的ＣＡＲ」では、さまざまな構成要素（例えば、細胞外標的化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達／活性化ドメイン）が直線的に単一の融合タンパク質として構築される。いくつかの態様では、ＣＡＲは第一世代のＣＡＲとして設計される。「第一世代」のＣＡＲは細胞外結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び１以上の細胞内シグナル伝達ドメインから構成される。第一世代のＣＡＲはすべて、細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ζ鎖ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、第二世代のＣＡＲとして設計される。「第二世代」のＣＡＲはさらに共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは第三世代のＣＡＲとして設計される。「第三世代」のＣＡＲは、複数の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８－４－１ＢＢまたはＣＤ２８－ＯＸ４０）を含むことを除いて第二世代のＣＡＲと同様である。いくつかの態様では、ＣＡＲは第四世代のＣＡＲとして設計される。「第四世代」のＣＡＲ（ＴＲＵＣＫまたは強化型ＣＡＲとしても知られている）は、機能をさらに向上させることができる追加の因子をさらに含有する。例えば、いくつかの態様では、第四世代のＣＡＲは、標的腫瘍組織にてＣＡＲシグナル伝達時に放出され得るサイトカインをさらに含有する。いくつかの態様では、第四世代のＣＡＲは、ＣＡＲの活性をさらに調節するのに役立つことができる、ホーミング遺伝子及び自殺遺伝子のような１以上の追加の要素を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲはスプリットＣＡＲとして設計される。「スプリットＣＡＲ」系では、ＣＡＲの１以上の構成要素（例えば、細胞外標的化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達／活性化ドメイン）は、完全な機能的受容体の構築を促進する複数の入力に依存するように、２以上の部分に分けられる。いくつかの態様では、ＣＡＲは切替可能なＣＡＲとして設計される。「切替可能なＣＡＲ」によって、ＣＡＲは、刺激の存在下にて（例えば、一時的に）オン（オンスイッチＣＡＲ）またはオフ（オフスイッチＣＡＲ）の切替ができる。本開示で使用することができるＣＡＲの追加の例は、例えば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０／０１７２８７９Ａ１及びＵＳ２０１９／０１８３９３２Ａ１に記載されている。
操作されたＴ細胞受容体
いくつかの態様では、本開示で使用することができるＲＯＲ１結合タンパク質は操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（当該技術分野では「トランスジェニック」ＴＣＲとも呼ばれる）を含む。本明細書で使用されるとき、「操作されたＴＣＲ」または「操作されたＴ細胞受容体」という用語は、単離されて、または所望の親和性で主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）／ペプチド標的抗原と特異的に結合するように操作されて、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の集団に導入されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。
したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養することができる免疫細胞は、トランスジェニックＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されている。例えば、いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、トランスジェニックＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、トランスジェニックＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の双方を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれはトランスジェニックＴＣＲを含み、高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。
ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に見られる分子であり、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原の断片を認識することに関与している。ＴＣＲは２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様では、ＴＣＲは（それぞれ、ＴＲＡ及びＴＲＢによってコードされる）アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖から成る。いくつかの態様では、ＴＣＲは（それぞれ、ＴＲＧ及びＴＲＤによってコードされる）ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖から成る。ＴＣＲがＭＨＣ分子（ペプチド／ＭＨＣ）によって提示される抗原ペプチドと結合すると、Ｔリンパ球はシグナル伝達を介して活性化される。特定の態様では、本明細書に記載されている操作されたＴＣＲは、一般にベータ鎖可変領域の少なくとも一部及びアルファ鎖可変領域の少なくとも一部から構成される抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインはＲＯＲ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的である、またはそれに特異的に結合する。
特定の実施形態では、操作されたＴＣＲはクラスＩのＭＨＣに拘束される。別の実施形態では、操作されたＴＣＲはクラスＩＩのＭＨＣに拘束される。特定の実施形態では、操作されたＴＣＲはＲＯＲ１ペプチド：ＭＨＣ複合体を認識する。特定の実施形態では、操作されたＴＣＲは、膜貫通ドメインと、少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子の動員を促進するＴＣＲドメインとを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲはさらに、１以上のＴＣＲ由来の定常ドメイン、例えば、ＣＨ１及びＣＬを含む。
Ｔ細胞受容体模倣体（ＴＣＲｍ）
いくつかの態様では、免疫細胞を改変するのに使用することができるＲＯＲ１結合タンパク質はＴ細胞受容体模倣体（ＴＣＲ模倣体）を含む。本明細書で使用されるとき「Ｔ細胞受容体模倣体」または「ＴＣＲ模倣体」という用語は、腫瘍抗原を認識するよう操作された抗体（またはその断片）を指し、該腫瘍抗原はＨＬＡ分子と関連して提示される。当業者には明白であるように、これらの抗体はＴＣＲの特異性を模倣することができる。ＴＣＲ模倣体の非限定的な例は、例えば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／０２２６４７４Ａ１；ＵＳ２０１９／００９２８７６Ａ１；及びＴｒａｎｅｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（１００１）：１－１２（２０１７）にて提供されている。いくつかの態様では、ＴＣＲ模倣体は（ｉ）目的のペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体部分と、（ｉｉ）少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子を動員することが可能なＴ細胞受容体モジュールとを含む。いくつかの態様では、ＴＣＲ模倣体は（ｉ）目的のペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体部分と、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ鎖ドメイン）、及び任意で１以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）とを含む。
したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養することができる免疫細胞は、ＴＣＲ模倣体及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されている（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及びＴＣＲ模倣体をコードする１以上の外来性ヌクレオチド配列で形質導入されている）。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ＴＣＲ模倣体及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、ＴＣＲ模倣体及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の双方を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれはＴＣＲ模倣体及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。
いくつかの態様では、ＴＣＲ模倣体はキメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ｃａＴＣＲ）を含む。本明細書で使用されるとき「キメラ抗体－Ｔ細胞受容体」または「ｃａＴＣＲ」は（ｉ）目的の抗原に特異的に結合する抗体部分と（ｉｉ）少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子を動員することができるＴ細胞受容体モジュールとを含む。いくつかの態様では、抗体部分とＴ細胞受容体モジュールは一緒に融合される。本開示に有用であるｃａＴＣＲに関する追加の開示は、例えば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ１０，８２２，４１３Ｂ２；及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，４：６２（２０１８）に提供されている。
したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養することができる免疫細胞は、ｃａＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されている（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及びｃａＴＣＲをコードする１以上の外来性ヌクレオチド配列で形質導入されている）。いくつかの態様では、ｃａＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変された免疫細胞はさらに、キメラ共刺激受容体を発現するように改変される。いくつかの態様では、本明細書で提供されている免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現し、ｃａＴＣＲと、ｉ）標的リガンドと結合または相互作用することができるリガンド結合モジュール、ｉｉ）膜貫通モジュール、及びｉｉｉ）免疫細胞に共刺激シグナルを提供することができる共刺激免疫細胞シグナル伝達モジュールを含むキメラ共刺激受容体とを含み、その際、リガンド結合モジュール及び共刺激免疫細胞シグナル伝達モジュールは同じ分子に由来するものではなく、キメラ共刺激受容体は機能的な一次免疫細胞シグナル伝達ドメインを欠いている。いくつかの態様では、キメラ共刺激受容体は腫瘍抗原に結合するリガンド結合モジュールを含む。例示的なキメラ共刺激受容体は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第１０，８２２，４１３号に記載されている。いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ｃａＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、ｃａＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の双方を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれはｃａＴＣＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。
キメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）
いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質はキメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）を含む。「キメラシグナル伝達受容体」または「ＣＳＲ」は、標的リガンドと特異的に結合するリガンド結合ドメインと、ＣＳＲを発現する免疫細胞に刺激シグナルを提供することができる共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。キメラシグナル伝達受容体は（１）細胞外結合ドメイン（例えば、天然／改変の受容体細胞外ドメイン、天然／改変のリガンド細胞外ドメイン、ｓｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、及びアフィボディ）と、（２）膜貫通ドメインと、（３）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、転写因子を活性化するドメイン、またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ、キナーゼ、ホスファターゼ、及びユビキチン；ＳＨ３；ＳＨ２；及びＰＤＺを動員及び／または活性化するドメインとを含むことができる。例えば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み込まれる、ＥＰ３４０７９３Ｂ１，ＵＳ２０２１／０２５３６６５Ａ１、ＵＳ１０，８２２，４１３Ｂ２、及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，４：６２（２０１８）を参照のこと。
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養することができる免疫細胞（例えば、高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されたもの）は、キメラシグナル伝達受容体を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ＣＳＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、ＣＳＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の双方を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれはＣＳＲ及び高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。
抗原結合ドメイン
本明細書に記載されているように、本開示に有用なＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む。膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインに関する追加の開示は、本開示の他の箇所で提供されている。
本開示の他の箇所でさらに記載されているように、ＲＯＲ－１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）の抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合できる任意のポリペプチド（その断片または変異型を含む）であることができる。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、イントラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、ユニボディ、ナノボディ、及び対象のタンパク質（例えば、ＲＯＲ１）、リガンド（天然リガンドを含む）、受容体、受容体断片、ペプチドアプタマー、もしくはそれらの組み合わせに特異的に結合することができる抗体に由来する抗原結合領域を含む、またはそれらに由来する。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
シグナル伝達（細胞内）、膜貫通、及び共刺激のドメイン
いくつかの態様では、本明細書に記載されているＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）は、細胞外ドメインへの抗原結合の際にエフェクター機能シグナルを伝達し、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）に特殊な機能を実行するように指図する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインの非限定例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２に由来する細胞内シグナル伝達ドメイン領域、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号９０に示されるような）を含む。
いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、本明細書で開示されているタンパク質の細胞内ドメイン全体を含む。いくつかの態様では、細胞内ドメインは切り詰められる。細胞内ドメインの切り詰め部分は、エフェクター機能シグナルを依然として伝達する限り完全な鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の切り詰め部分を含むことを意味する。
いくつかの態様では、本開示に有用なＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）はさらに、膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質の抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインによって細胞内ドメインに連結される。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質の抗原結合ドメインは、リンカーによって膜貫通ドメインに接続される。いくつかの態様では、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にリンカーを含めることは、抗原結合ドメインの柔軟性に影響を与え、それによって、ＲＯＲ１結合タンパク質の１以上の特性を向上させることができる。
当該技術分野にて既知の任意の膜貫通ドメインを、本明細書に記載されているキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）に使用することができる。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは人工的なもの（例えば、操作された膜貫通ドメイン）である。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは天然に存在するポリペプチドに由来する。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは天然に存在するポリペプチド由来の膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインの非限定的な例には、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（タクチル）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ８の膜貫通ドメイン領域またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号７５に示されるような）を含む。
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本開示に有用なＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）は、１以上の共刺激ドメイン（例えば、第二世代及び第三世代のＣＡＲ）を含む。どんな理論にも束縛されるものではないが、これらの共刺激ドメインはさらに、ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドとの組み合わせで）を発現するように操作された免疫細胞の増殖、活性化、記憶、存続、及び／またはエフェクター機能を改善することができる。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは共刺激ドメインに融合されており、任意で、共刺激ドメインは第２の共刺激ドメインに融合され、共刺激ドメインはＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合される。共刺激ドメインの非限定的な例には、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、共刺激ドメインは４－１ＢＢ／ＣＤ１３７の共刺激ドメイン（例えば、配列番号７６に示されるような）を含む。
ｃ－Ｊｕｎ
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、本明細書に提供されている方法を使用して改変及び培養されたもの）はｃ－Ｊｕｎタンパク質を含む、またはｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現することができる。免疫細胞がｃ－Ｊｕｎタンパク質を天然に発現できる場合、場合によっては、内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現が誘導され、それによって、タンパク質の増加または過剰発現を生じる。細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現（または過剰発現）を誘導する際に、いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質が外から加えられる。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質は細胞にて組み換え発現される。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列（本明細書では「ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列」とも呼ばれる）を含む外来性ポリヌクレオチドを含むように改変または操作（例えば、遺伝的に）されているので、改変された細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現は、参照細胞（例えば、外来性ポリヌクレオチドを含むように改変されていない対応する細胞）と比べて増加する。いくつかの態様では、細胞は、転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づく転写活性化因子、例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）によって改変されているので、内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現は、参照細胞（例えば、転写活性化因子で改変されていない対応する細胞）と比べて増加する。
いくつかの態様では、改変（例えば、外から導入されるｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列及び／または転写活性化因子の導入）に起因して、操作された細胞はｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現する、すなわち、そのような改変がない対応する細胞（「参照細胞」）よりも高いレベル（例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％多く、または１．５、２、３、４、５、または１０倍多く）のｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。「の高いレベル［もしくは量」を発現する」、「過剰発現する」、または「の高い発現を有する」という用語（及び本明細書で使用される語句の類似の形態）は相互交換可能に使用される。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている操作された（または改変された）細胞は、参照細胞よりも少なくとも約２～１００倍多く、約５～５０倍多く、約５～４０倍多く、約５～３０倍多く、約５～２０倍多く、約８～２０倍多く、または約１０～２０倍多くのｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている改変された細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現は参照細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現と比べて、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
さらに、本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本開示の培養培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）は、改変された細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質（または任意の他の目的のタンパク質）の発現をさらに増加させるのにも役立つことができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法を使用して培養された場合、改変された細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることができる転写活性化因子をコードする外来性ヌクレオチド配列の導入の結果生じる）はさらに、参照細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現と比べて、少なくとも０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、ＲＯＲ１結合タンパク質及びｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドで免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を改変することを含み、その際、改変後、免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現は参照細胞と比べて増加する。いくつかの態様では、免疫細胞は別の培地にて外来性ポリヌクレオチドで改変され、その後、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地に移され、培養され得る。
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、参照細胞は、以下：（ｉ）改変されておらず、培養培地で培養されていない対応する細胞（すなわち、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない、例えば、ＴＣＭ）、（ｉｉ）改変されているが、培養培地で培養されていない対応する細胞、（ｉｉｉ）改変されていないが、培養培地で培養された対応する細胞、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせのいずれかを含むことができる。
本開示から明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して培養された）は、増加した量のｃ－Ｊｕｎタンパク質と組み合わせて１以上の追加の導入遺伝子を発現するように改変されている。例えば、いくつかの態様では、本開示に有用な免疫細胞は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする第１の外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする第２の外来性ヌクレオチド配列とを含むように改変されている。いくつかの態様では、第１及び第２のヌクレオチド配列は、単一のポリヌクレオチド（本明細書では「ポリシストロン性ポリヌクレオチド」と呼ばれる）の一部である。このようなポリシストロン性ポリヌクレオチドの非限定的な例については、以下でさらに記載されている。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、免疫細胞のそのような改変（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現し、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させる）は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて発生する。いくつかの態様では、免疫細胞は、参照培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地）にて改変され、その後、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養される。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、改変前に５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養することができる。いくつかの態様では、改変されたＴ細胞はさらに、改変後に５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地中にて培養することができる。いくつかの態様では、免疫細胞は、改変前、改変中、及び改変後に５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養される。
ｃ－Ｊｕｎは活性化因子タンパク質－１（ＡＰ－１）ファミリーに属する発がん性転写因子である。これは、種々のタンパク質（例えば、ｃ－Ｆｏｓ）と相互作用して、細胞増殖及び腫瘍進行を含む多様な範囲の細胞シグナル伝達経路を調節する二量体複合体を形成する。したがって、ある特定のがんでｃ－Ｊｕｎ発現の増加が観察され、かかるがんを治療するためのｃ－Ｊｕｎアンタゴニストの開発に大きな関心が寄せられてきた。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，３９（１）：１８４（Ｓｅｐ．２０２０）を参照のこと。
ヒトでは、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、１番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００１．１１のヌクレオチド５８，７８０，７９１～５８，７８４，０４７、マイナス鎖方向）に位置するＪＵＮ遺伝子によってコードされる。ＪＵＮ遺伝子、及びそのコードされるタンパク質の同義語が知られており、これらとしては、「Ｊｕｎがん原遺伝子、ＡＰ－１転写因子サブユニット」、「ｖ－Ｊｕｎトリ肉腫ウイルス１７がん遺伝子ホモログ」、「転写因子ＡＰ－１」、「Ｊｕｎがん遺伝子」、「ＡＰ－１」、「Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質」、「ｐ３９」、及び「エンハンサー結合タンパク質ＡＰ１」が挙げられる。野生型ヒトｃ－Ｊｕｎタンパク質配列は、３３１アミノ酸長である。野生型ヒトｃ－Ｊｕｎのアミノ酸配列及び核酸配列をそれぞれ表１及び表２に示す。
野生型ヒトｃ－Ｊｕｎ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ０５４１２－１）タンパク質配列は３３１アミノ酸長（配列番号１３）である。アミノ酸配列及び核酸配列をそれぞれ表１及び表２に示す。
Figure 2024540099000001
Figure 2024540099000002
いくつかの態様では、本明細書に開示されている免疫細胞は、配列番号１２に示される野生型ヌクレオチド配列のような野生型ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように改変されている。あるいは、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞は、免疫細胞の疲弊を防止及び／または軽減する能力を保持する突然変異型ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように改変される。いくつかの態様では、本明細書で開示されている免疫細胞上で発現させることができる突然変異型ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、野生型ｃ－Ｊｕｎタンパク質のＣ末端のアミノ酸残基（例えば、Ｃ末端の５０、７５、１００、１５０、２００、もしくは２５０以上の残基）、Ｃ末端部分（例えば、４分の１、３分の１、もしくは半分）またはＣ末端ドメイン（例えば、イプシロン、ｂＺＩＰ、及びそのアミノ酸のＣ末端）と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含む。いくつかの態様では、野生型ｃ－Ｊｕｎ（すなわち、配列番号１３）のＮ末端のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端の５０、７５、１００、もしくは１５０以上）、Ｎ末端部分（例えば、４分の１、３分の１、もしくは半分）、またはＮ末端ドメイン（例えば、デルタ、トランス活性化ドメイン、及びそのアミノ酸のＮ末端）を欠失させる、変異させる、またはそうでなければ不活性化する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎは突然変異型ヒトｃ－Ｊｕｎであり、任意でそのトランス活性化ドメインまたはデルタドメインに不活性化変異を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎ突然変異型はＳ６３Ａ及びＳ７３Ａの突然変異を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎ突然変異型は野生型ｃ－Ｊｕｎ（配列番号１３）と比べて残基２と１０２の間に欠失を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎ突然変異型は野生型ｃ－Ｊｕｎ（配列番号１３）と比べて残基３０と５０の間に欠失を含む。いくつかの態様では、突然変異型ｃ－Ｊｕｎは、野生型ヒトｃ－Ｊｕｎ（配列番号１３）と比べて（ｉ）Ｓ６３Ａ及びＡ７３Ａの突然変異、または（ｉｉ）残基２と１０２の間、もしくは残基３０と５０の間に欠失を含む。本開示に有用な突然変異型ｃ－Ｊｕｎタンパク質の非限定的な例は、ＵＳ２０１９／０１８３９３２Ａ１及びＵＳ２０１７／００３７３７６Ａ１に提供されており、これらのそれぞれは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞はｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように改変されており、その際、外来性ヌクレオチド配列は、配列番号１～１１に示される核酸配列のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１～１１のいずれか１つに示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１に示される核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号１に示される核酸配列に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号１に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号２に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号３に示される核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、配列番号３に示される核酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号３に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号４に示される核酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号４に示される核酸配列に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号４に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号５に示される核酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号５に示される核酸配列に対して少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号５に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号６に示される核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号６に示される核酸配列に対して少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号６に示される核酸配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号７に示される核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号７に示される核酸配列に対して少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号８に示される核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号８に示される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号９に示される核酸配列に対して少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号９に示される核酸配列に対して少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドは配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１０に示される核酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは配列番号１０に示される核酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、外来性ヌクレオチドは配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む。
例示的なｃ－Ｊｕｎのヌクレオチド配列を（下記）表３に示す。
Figure 2024540099000003
Figure 2024540099000004
Figure 2024540099000005
Figure 2024540099000006
本明細書に開示されているｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してコドンを最適化することができる。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示されているｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列のコドンは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１１）と比べて以下のパラメーター：（ｉ）コドン適応指数（すなわち、コドン使用頻度バイアス）；（ｉｉ）グアニン・シトシン（ＧＣ）ヌクレオチド含量；（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ二次構造及び不安定なモチーフ；（ｉｖ）反復配列（例えば、直接反復、逆位反復、対反復）；（ｖ）制限酵素認識部位、または（ｖｉ）それらの組み合わせの１以上を改変する（例えば、増加もしくは低下させる）ように最適化されている。
いくつかの態様では、本明細書で提供されているｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドは、野生型ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列（例えば、配列番号１１）で形質移入された細胞における対応する発現と比べて、免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）に形質移入、形質導入または他の方法で導入された場合に、コードされるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることができる。いくつかの態様では、外来性ポリヌクレオチドを含むように改変した免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現は、野生型ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列で発現するように形質移入した、形質導入した、またはさもなければ遺伝子組換えした細胞における対応する発現と比べて、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
上記に提供されている特定の開示は一般的には、ｃ－Ｊｕｎタンパク質（野生型ｃ－Ｊｕｎまたはその変異型）をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むように免疫細胞を改変することに関する一方で、細胞にてｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現（野生型またはその変異型のいずれか）を誘導する及び／または増加させるのに他の好適な方法を使用できることは当業者には明らかである。例えば、本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現は転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）によって増やすことができる。特に指示されない限り、外来性ヌクレオチド配列を使用する上記で提供されている開示は、本明細書で提供されている細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質発現を誘導及び／または増加させる他のアプローチ（例えば、転写活性化因子、例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）にも同様に適用される。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加は、免疫細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のようなＴ細胞）の１以上の特性を向上及び／または増大させることができる。そのような特性の非限定的な例には、疲弊に対する耐性（例えば、ＰＤ－１、ＣＤ３９、ＴＩＭ－３、及び／またはＬＡＧ－３のような疲弊マーカーの発現の低下、存続／生存の延長、機能不全状態の発症の遅延及び／またはサイトカイン産生の増加によって示される）、増殖／増殖の増加、抗原感受性の増大、エフェクター機能の向上、特に反復抗原刺激に続くエフェクター機能の向上（例えば、抗原刺激時のサイトカイン産生、標的抗原を発現する細胞の溶解、もしくは双方）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
疲弊、細胞表現型、持続性、細胞傷害性及び／または殺傷、増殖、サイトカインの産生／放出、及び遺伝子発現プロファイルを測定するために有用なアッセイは、当該技術分野で既知であり、それらには、例えば、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）免疫細胞殺傷分析、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）または同様のアッセイ、持続抗原刺激アッセイ、バルク及び単個細胞ＲＮＡｓｅｑ（例えば、Ｆｒｏｎ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１１：２２０；２０１９，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３５：ｉ４３６－４４５；２０１９，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｄａｔａ Ｓｃｉ．２：１３９－１７３を参照のこと）、細胞傷害性／殺傷アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の標準的な分子生物学及び細胞生物学の方法、例えば、本明細書に記載されているもの、または、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９－２０２１）もしくはその他に記載のものが挙げられる。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加は、疲弊に対する免疫細胞の耐性を高める。いくつかの態様では、疲弊に対する耐性は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有するように改変されていない対応する細胞）と比べて少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加によって疲弊した細胞の疲弊を軽減することができる。いくつかの態様では、例えば、本明細書に記載されているような１以上のアッセイを使用して測定したとき、参照細胞（ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有するように改変されていない対応する疲弊細胞）と比べて、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現は、疲弊を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％減らすことができる。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加によって細胞にて疲弊の開始が遅延する。いくつかの態様では、例えば、本明細書に記載されているような１以上のアッセイを使用して測定したとき、参照細胞（ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有するように改変されていない対応する疲弊細胞）と比べて、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現は、疲弊の開始を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％遅延させる。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現は疲弊の開始を少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、または少なくとも約１４日以上遅延させる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞における１以上の疲弊マーカー（例えば、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及び／またはＬＡＧ－３）の発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現が上昇するように改変されていない対応する細胞）と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている細胞における１以上の疲弊マーカー（例えば、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及び／またはＬＡＧ－３）の発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されていない対応する細胞）と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。
いくつかの態様では、免疫細胞の集団（例えば、本明細書に提供されている方法を使用して改変及び培養されたもの）の疲弊状態は、免疫細胞集団内の所与の疲弊マーカー（例えば、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及び／またはＬＡＧ－３）を発現する細胞の量（例えば、数及び／または比率）を定量することによって判定することができる。例えば、免疫細胞集団がｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルが上昇するように改変されると（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質と組み合わせて）、本明細書に記載されているように改変されていない対応する免疫細胞集団の量と比べて、所与の疲弊マーカーを発現する細胞の量（例えば、数及び／または比率）は減少する。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載されている改変した免疫細胞の集団にて所与の疲弊マーカーを発現する細胞の量は、本明細書に記載されているように改変されなかった免疫細胞の対応する集団における量と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加は、例えば、生体内で対象に投与される場合、免疫細胞の存続性／生存期間を延長することができる。いくつかの態様では、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有するように改変されなかった対応する細胞）と比べて、細胞の存続性／生存期間は少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞の存続性／生存期間は、本明細書に記載されているように改変されなかった免疫細胞の対応する集団における量と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加する。
したがって、いくつかの態様では、本開示の免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎの発現を高めることができる転写活性化因子によって）改変され、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養されるので、改変及び培養の後、免疫細胞の存続性／生存期間は参照細胞と比べて増加する。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、参照細胞は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されていないが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養された、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されているが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養されていない、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方である対応する免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加は、例えば、抗原刺激の際に免疫細胞の増殖／増殖を増やすことができる。いくつかの態様では、細胞の増殖／増殖は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有するように改変されなかった対応する細胞）と比べて、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
いくつかの態様では、例えば、抗原刺激の際、免疫細胞の増殖／増殖は、本明細書に記載されているように改変されなかった免疫細胞の対応する集団における量と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加する。
したがって、いくつかの態様では、本開示の免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を発現し、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎの発現を高めることができる転写活性化因子によって）改変され、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養されるので、改変及び培養の後、免疫細胞の存続性／生存期間は参照細胞と比べて増加する。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、参照細胞は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されていないが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養された、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されているが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養されていない、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方である対応する免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加は、細胞のエフェクター機能、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及び／またはＩＬ－２）の産生、グランザイム放出、及び／または細胞傷害性を高めることができる。いくつかの態様では、エフェクター機能の増加は持続的抗原刺激に反応したものである。本明細書で使用されるとき「持続的抗原刺激」または「慢性抗原刺激」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）がその同族抗原に繰り返しさらされることを指すので、免疫細胞は刺激される、または活性化される。いくつかの態様では、持続的抗原刺激は、同族抗原に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約３ヵ月間、少なくとも約４ヵ月間、少なくとも約５ヵ月間、少なくとも約６ヵ月間、少なくとも約７ヵ月間、少なくとも約８ヵ月間、少なくとも約９ヵ月間、少なくとも約１０ヵ月間、少なくとも約１１ヵ月間、または少なくとも約１年間さらすことを含む。いくつかの態様では、持続的抗原刺激は継続的であることができる。いくつかの態様では、持続的抗原刺激は、複数回の抗原刺激を含むことができ、各回の抗原刺激の後に非抗原刺激期間が続く。いくつかの態様では、持続的抗原刺激は、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、または少なくとも約６回以上の抗原刺激回数を含む。本開示から明らかであり、当該技術分野で知られているように、免疫細胞に対するそのような持続的抗原刺激は、免疫細胞の疲弊につながることができる。
いくつかの態様では、細胞のエフェクター機能は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有するように改変されなかった対応する細胞）と比べて、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。
いくつかの態様では、参照細胞と比べて、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現は細胞のエフェクター機能を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％高めることができる。
したがって、いくつかの態様では、本開示の免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎの発現を高めることができる転写活性化因子によって）改変され、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養されるので、改変及び培養の後、例えば、持続的抗原刺激に反応した免疫細胞のエフェクター機能は参照細胞と比べて増大する。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、参照細胞は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されていないが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養された、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されているが、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地で培養されていない、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方である対応する免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎの発現レベルが上昇するように改変された細胞（例えば、本明細書に記載されているように）は、対照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現していない細胞）と比べて、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、またはそれ以上の追加の回数の連続、常在または逐次の刺激アッセイ（実施例３に記載されるもの、または例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２８（４）：４１５－４２８；Ｋｕｎｋｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（４）：３６８－３７９に記載されているもの。これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）について、エフェクター機能、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及び／またはＩＬ－２）産生、グランザイム放出、及び／または細胞傷害性（例えば、関連する標的細胞を殺傷する能力）の増大を保持する。
いくつかの態様では、参照培養培地にて培養された対応する免疫細胞と比べて、本開示の代謝再プログラム化培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）にて培養された免疫細胞は、少なくとも２回の抗原刺激後、少なくとも３回の抗原刺激後、少なくとも４回の抗原刺激後、少なくとも５回の抗原刺激後、少なくとも６回の抗原刺激後に、さらに多くの量のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ及び／またはＩＬ－２）を産生することができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、抗原刺激に応答した免疫細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法であり、この方法は、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含む。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの高いレベルを有するように改変されていない対応する免疫細胞）と比べて、免疫細胞は、ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を含むように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドの高いレベルを有するように改変されている。
いくつかの態様では、培養後、抗原刺激に応答した改変された免疫細胞によるサイトカインの産生は、参照細胞（例えば、本明細書に記載されている）と比べて、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。いくつかの態様では、培養後、抗原刺激に応答した改変された免疫細胞によるサイトカインの産生は、参照細胞と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加する。
Ｔ細胞におけるｃ－Ｊｕｎの高い発現は、例えば、Ｔ細胞機能不全（例えば、Ｔ細胞の疲弊）を緩和または防止することによって、細胞の活性状態を持続するのに役立つことができる。したがって、本明細書で提供されている細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質発現を高めるさまざまなアプローチ（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチド及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎの発現を高めることができる転写活性化因子で細胞を改変する）を使用して、Ｔ細胞のような免疫細胞を操作することができ、その後、これらの細胞は、所望の標的細胞（例えば、内在性ＴＣＲの標的または本明細書に記載されているようなＲＯＲ１結合タンパク質の標的）に対して持続的で強力な細胞傷害性を示す。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しないＴ細胞と比べて、本明細書に開示されている操作されたＴ細胞（ｃ－Ｊｕｎタンパク質の高い発現を有する）は、上記に記載されているようなＴ細胞の疲弊の徴候が少ない。
さらに、本開示から明らかなように、いくつかの態様では、本明細書で提供されている改変された免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇している）のいずれかを、本明細書で提供されている方法（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む代謝再プログラム化培地にて）を使用して培養すると、上記の特性のうちの１以上がさらに増強される。例えば、いくつかの態様では、参照細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するよう、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されているが、本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地で培養されていない、及び／または本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地で培養されているが、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されていない）と比べて、本開示の免疫細胞（ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、代謝再プログラム化培地（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む）で培養された）は、以下：（ｉ）疲弊に対する耐性の上昇（例えば、ＰＤ－１、ＣＤ３９、ＴＩＭ－３、及び／またはＬＡＧ－３のような疲弊マーカーの発現の減少；存続性／生存期間の延長；機能不全状態の開始の遅延；及び／またはサイトカイン産生の増加によって示されるような）、（ｉｉ）増大した増殖／増殖、（ｉｉｉ）増大した抗原感受性、（ｉｖ）増大したエフェクター機能（特に抗原刺激の繰り返し後）（例えば、抗原刺激時のサイトカイン産生、標的抗原を発現する細胞の溶解、またはその双方）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせの１以上を示すことができる。
ＩＩ．Ｃ．２．追加の翻訳可能な配列
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して改変及び培養される）は、１以上の追加の目的タンパク質を発現することができる。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載されている改変された免疫細胞はさらに、追加の目的のタンパク質をコードする１以上の外来性ヌクレオチド配列を含む。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示されている免疫細胞は、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列、及び追加の目的タンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードする１以上の追加の外来性ヌクレオチド配列を含む。そのような追加の翻訳可能な配列の非限定例は以下に記載されている。
切り詰め型ＥＧＦＲ
いくつかの態様では、本明細書に開示されている免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して改変され培養されたもの）はさらに、切り詰めた上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする外来性ヌクレオチド配列を含むので、ＥＧＦＲｔは完全長ＥＧＦＲタンパク質（例えば、配列番号１９）の部分配列のみを含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩ及びＩＶならびにＥＧＦＲの膜貫通ドメインを含むが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩ及びＩＩならびにＥＧＦＲの細胞内配列を欠いている。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示されている免疫細胞は（ｉ）－Ｊｕｎポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含むように改変されている。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）を使用してｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を内在性に高めることができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞は（ｉ）内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることができる転写活性化因子と、（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含むように改変されている。上記の態様のそれぞれでは、複数の外来性ヌクレオチド配列のうちの１以上は、単一のポリシストロン性ポリヌクレオチドの一部であることができる。
ＥＧＦＲは、大きな細胞外領域と、単一の膜貫通ドメインと、細胞内膜近傍領域と、チロシンキナーゼドメインと、Ｃ末端調節領域とを含む１８０ｋＤａの単量体糖タンパク質である。細胞外領域は４つのドメインを含み：ドメインＩ及びＩＩＩは相同性リガンド結合ドメインであり、ドメインＩＩ及びＩＶはシステインが豊富なドメインである（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００８），３７：３５３－３）。別に指示がある場合を除いて、ＥＧＦＲは本明細書で使用されるとき、ヒトＥＧＦＲを指す。選択的スプライシングのため、ヒトＥＧＦＲの少なくとも４つの既知のアイソフォームが存在する。さまざまなＥＧＦＲアイソフォームについての配列を（下記）表４に示す。
Figure 2024540099000007
Figure 2024540099000008
上記のＥＧＦＲについての標準配列（すなわち、アイソフォーム１）では、種々のＥＧＦＲドメインが以下のとおりに説明される。シグナルペプチドはアミノ酸１～２４に及ぶ。細胞外配列はアミノ酸２５～６４５に及び、ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ、及びドメインＩＶは、それぞれ、アミノ酸２５～１８８、１８９～３３３、３３４～５０４、及び５０５～６４５に及ぶ。膜貫通ドメインは、アミノ酸６４６～６６８に及ぶ。細胞内ドメインはアミノ酸６６９～１，２１０に及び、膜近傍ドメインはアミノ酸６６９～７０３に及び、チロシンキナーゼドメインはアミノ酸７０４～１，２１０に及ぶ。
いくつかの態様では、本開示に有用なＥＧＦＲｔは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示で使用することができるＥＧＦＲｔは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは配列番号２１（表６を参照のこと）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本開示で使用することができるＥＧＦＲｔは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは配列番号２４（表５を参照のこと）に示されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2024540099000009
いくつかの態様では、本明細書に記載されているＥＧＦＲｔはさらに、膜近傍ドメインを含む。本明細書で使用されるとき、「膜近傍ドメイン」という用語は、膜貫通ドメインのすぐＣ末端にある細胞表面タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ）の細胞内部分を指す。どんな理論にも束縛されるものではないが、いくつかの態様では、膜近傍ドメインの追加によって、本開示のポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を増やすことができる。
いくつかの態様では、膜近傍ドメインは約１～約２０（例えば、２～２０、３～２０、４～２０、５～２０、２～１８、３～１８、４～１８、または５～１８）のアミノ酸長であることができる。いくつかの態様では、膜近傍ドメインは２０アミノ酸よりも長くてもよい。いくつかの態様では、膜近傍ドメインの最初の１以上（例えば、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）のアミノ酸は、正味中性または正味正の電荷をもつ配列である（例えば、アルギニン及びリジン残基の数が、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基の数と同じまたはそれより多い）。いくつかの態様では、これらの最初のアミノ酸は約３０％を超える（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％を超える）親水性アミノ酸を含有する。本開示に有用な膜近傍ドメインの非限定例を（下記）表６に提供する。
Figure 2024540099000010
いくつかの態様では、本開示で使用することができる膜近傍ドメインは、天然の細胞表面タンパク質の膜近傍領域、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、またはホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸（ＰＩＰ２）と相互作用するヒト受容体型チロシンキナーゼの膜近傍領域（例えば、最初の２０の膜近傍アミノ酸の全配列または部分配列）由来であることができる（例えば、Ｈｅｄｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５），５：９１９８）を参照のこと）。受容体型チロシンキナーゼの非限定例は、ＥＲＢＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３）、ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ４）、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＳＲＲ、ＰＧＦＲＡ、ＰＧＦＲＢ、ＫＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＶＧＦＲ１、ＶＧＦＲ２、ＶＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＴＫ７、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＵＦＯ、ＴＹＲＯ３、ＭＥＲＴＫ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡＡ、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＲＥＴ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＯＳ１、ＬＭＴＫ１、ＬＭＴＫ２、ＬＭＴＫ３、ＬＴＫ、ＡＬＫ、及びＳＴＹＫ１である。いくつかの態様では、膜近傍ドメインは、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の意図されない任意のシグナル伝達能力を回避するためにリン酸化されるのがわかっている残基を除去する１以上の突然変異（例えば、置換または欠失）を含むことができる。
いくつかの態様では、膜近傍ドメインはＥＧＦＲの膜近傍領域に由来する。ＥＧＦＲ由来の膜近傍ドメインの非限定例は（下記）表７に提供されている配列のうちの１つを含む。いくつかの態様では、膜近傍ドメインはアミノ酸配列ＲＲＲを含む。いくつかの態様では、そのような膜近傍ドメインを含むＥＧＦＲｔは配列番号２４に示される配列を含む。
Figure 2024540099000011
本開示から明らかなように、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現し、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇している）を、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列をさらに含むように改変すると、特定の利点が得られる。例えば、いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは強制停止スイッチとして機能することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている操作された細胞が体内で必要とされなくなったとき、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、またはネシツムマブのような医薬品等級の抗ＥＧＦＲ抗体を、操作された細胞を受け入れた対象に投与し、それによって、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を介して、操作された細胞を除去することができる。
スペーサー
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して改変及び培養されるもの）はスペーサーをコードする外来性ヌクレオチド配列も含む。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルが上昇するように改変されており（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることができる転写活性化因子を使用して）、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、スペーサーをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルが上昇するように改変されており、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列と、スペーサーをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、１以上の外来性ヌクレオチド配列は、単一のポリシストロン性ポリヌクレオチドの一部である。本明細書で使用されるとき、「スペーサー」という用語は、間隔のあいた２つの部分（例えば、Ｐ２ＡリンカーとＲＯＲ１結合タンパク質）を一緒に共有結合することができるポリペプチド配列を指す。
いくつかの態様では、スペーサーは、免疫グロブリンに由来する（例えば、ヒンジ領域またはループ領域に由来する）。いくつかの態様では、スペーサーは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのヒンジ領域、それらの断片（単独で、または追加の配列、例えば、ＣＨ１もしくはＣＨ２領域の配列によってキャップされた）、あるいはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのヒンジ領域由来の断片の組み合わせ（本明細書では「ヒンジ領域由来のスペーサー」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、スペーサーは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの定常ドメインループ領域、それらの断片（単独で、または例えば、隣接するβ－鎖由来の、追加の配列によってキャップされた）、あるいはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのループ領域の断片の組み合わせ（本明細書では「ループ領域由来のスペーサー」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、スペーサーは、ヒンジ領域由来のスペーサー、ループ領域由来のスペーサー、または双方（例えば、２以上の連結されたヒンジ領域由来のスペーサー及びループ領域由来のスペーサー）を含む。
したがって、いくつかの態様では、本開示に記載されているポリヌクレオチドは（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質、（ｉｉ）第１のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）、（ｉｉｉ）シグナルペプチド（例えば、ｈＩｇκ）、（ｉｖ）抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、（ｖ）第２のリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ；配列番号４０）、（ｖｉ）スペーサー（例えば、ＩｇＧ２ヒンジ由来のスペーサー）、（ｖｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）、（ｉｘ）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、（ｘ）第３のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）、及び（ｘｉ）ＥＧＦＲｔを含むポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、本開示に有用なスペーサーは、ヒトＩｇＡ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６、ＩＧＨＡ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常アルファ１、配列番号４１）、ヒトＩｇＡ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７７、ＩＧＨＡ２＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常アルファ２、配列番号４２）、マウスＩｇＧ２Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１６６５、ＧＣＡＭ＿ＭＯＵＳＥ、免疫グロブリンガンマ２Ａ鎖Ｃ領域、配列番号４３）、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７、ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ガンマ１、配列番号４４）、ヒトＩｇＧ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９、ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ガンマ２、配列番号４５）、ヒトＩｇＧ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０、ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ガンマ３、配列番号４６）、ヒトＩｇＧ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６１、ＩＧＨＧ４、免疫グロブリン重定常ガンマ４、配列番号４７）、ヒトＩｇＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８８０、ＩＧＨＤ＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常デルタ、配列番号４８）、ヒトＩｇＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５４、ＩＧＨＥ＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常鎖イプシロン、配列番号４９）、またはＩｇＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７１、ＩＧＨＭ＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ミュー、配列番号５０）から成る群から選択される免疫グロブリン重鎖の部分配列を含み、部分配列は、ＣＨ１－ＣＨ２ヒンジ領域またはその一部を含む。いくつかの態様では、部分配列は、ＣＨ１及び／またはＣＨ２定常ドメインの隣接部分をさらに含む。
いくつかの態様では、スペーサーは、ヒトＩｇＡ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６、ＩＧＨＡ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常アルファ１、配列番号４１）、ヒトＩｇＡ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７７、ＩＧＨＡ２＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常アルファ２、配列番号４２）、マウスＩｇＧ２Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１６６５、ＧＣＡＭ＿ＭＯＵＳＥ、免疫グロブリンガンマ２Ａ鎖Ｃ領域、配列番号４３）、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７、ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ガンマ１、配列番号４４）、ヒトＩｇＧ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９、ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ガンマ２、配列番号４５）、ヒトＩｇＧ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０、ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ガンマ３、配列番号４６）、ヒトＩｇＧ４（ＵｎｉｐｒｏｔＰ０１８６１、ＩＧＨＧ４、免疫グロブリン重定常ガンマ４、配列番号４７）、ヒトＩｇＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８８０、ＩＧＨＤ＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常デルタ、配列番号４８）、ヒトＩｇＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５４、ＩＧＨＥ＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常鎖イプシロン、配列番号４９）、またはＩｇＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７１、ＩＧＨＭ＿ＨＵＭＡＮ、免疫グロブリン重定常ミュー、配列番号５０）から成る群から選択される免疫グロブリン重鎖の部分配列を含み、部分配列は、定常ドメインのループ領域またはその一部を含む。いくつかの態様では、部分配列は、β鎖の隣接部分をさらに含む。
いくつかの態様では、本開示に有用なスペーサーはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する。いくつかの態様では、スペーサーはＩｇＧ２ヒンジに由来する。いくつかの態様では、ＩｇＧ２ヒンジ由来のスペーサーは、配列番号５１（ＫＰＣＰＰＣＫＣＰ）の少なくとも５、６、または７の連続するアミノ酸を含む。いくつかの態様では、スペーサーは、配列番号５１に示される配列（ＫＰＣＰＰＣＫＣＰ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、スペーサーは、配列番号５１に示される配列（ＫＰＣＰＰＣＫＣＰ）を含む、それから成る、または本質的にそれから成る。いくつかの態様では、スペーサーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換を除いて、配列番号５１に示される配列（ＫＰＣＰＰＣＫＣＰ）を含む。いくつかの態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、アミノ酸置換は少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を含む。
いくつかの態様では、本開示のスペーサーは、配列番号５１に示される配列から構成され、スペーサー配列はさらに、任意の柔軟なリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ（配列番号４０）のリンカー）を含む。したがって、いくつかの態様では、本開示のスペーサーは、スペーサー配列（例えば、配列番号５１）及び任意のＣ末端またはＮ末端の柔軟なリンカーを含む。いくつかの態様では、本明細書で開示されている任意の柔軟なリンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒが豊富なリンカー）は、スペーサーのＣ末端及び／またはＮ末端に付加され得る。
シグナルペプチド
本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本明細書で提供されている免疫細胞は、シグナルペプチドをさらに発現するように改変されている（例えば、シグナルペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列を含む）。シグナルペプチドは、コードされたタンパク質の細胞表面発現を促進し、その後、成熟タンパク質から切断され得る。いくつかの態様では、そのような免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されており（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることができる転写活性化因子を使用して）、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列、及びシグナルペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルが上昇するように改変されており、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列と、シグナルペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルが上昇するように改変されており、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列と、スペーサーをコードする外来性ヌクレオチド配列と、シグナルペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、１以上の外来性ヌクレオチド配列は、単一のポリシストロン性ポリヌクレオチドの一部である。
当該技術分野で知られている任意の好適なシグナルペプチドを本開示で使用することができる。シグナルペプチドの非限定的な例を表８（下記）に提供する。いくつかの態様では、シグナルペプチドはヒトＩｇカッパに由来する。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列（ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列（ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ）を含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドはＧＭ－ＣＳＦに由来する。いくつかの態様では、そのようなシグナルペプチドは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドは配列番号５３に記載のアミノ酸配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ）を含む。
Figure 2024540099000012
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞を改変するのに使用することができるポリヌクレオチドは、単一のシグナルペプチド（例えば、配列番号５３または５４）を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは複数のシグナルペプチド（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）を含む。複数のシグナルペプチドが関与する場合、いくつかの態様では、複数のシグナルペプチドのそれぞれが異なる。いくつかの態様では、複数のシグナルペプチドのうちの２以上は同じである。
リンカー
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養される）は、リンカーをコードする外来性ヌクレオチド配列をさらに含むように改変されている。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されており（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列及び／または内在性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることができる転写活性化因子を使用して）、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列、及びリンカーをコードする外来性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されており、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列と、リンカーをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されており、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列と、スペーサーをコードする外来性ヌクレオチド配列と、リンカーをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇しており、ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする外来性ヌクレオチド配列と、ＥＧＦＲｔをコードする外来性ヌクレオチド配列と、スペーサーをコードする外来性ヌクレオチド配列と、シグナルペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列と、リンカーをコードする外来性ヌクレオチド配列とを含む。
複数の外来性ヌクレオチド配列が関与する場合、いくつかの態様では、１以上の外来性ヌクレオチド配列は、単一のポリシストロン性ポリヌクレオチドの一部であることができる。そのような態様については、リンカーは本明細書に記載されているポリヌクレオチドの任意のさまざまな構成要素の間にあることができる。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ポリシストロン性）は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする第１の外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）リンカーをコードする第２の外来性ヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ｃａＴＣＲ、ＣＳＲ、またはＴＣＲ模倣体）をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、その際、第２のヌクレオチド配列が第１と第３のヌクレオチド配列の間にあるので、ｃ－Ｊｕｎタンパク質はリンカーによってＲＯＲ１結合タンパク質に連結される。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、リンカーをコードする複数のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも２つの別個のヌクレオチド配列）を含むことができる。いくつかの態様では、複数のリンカーは同じである。いくつかの態様では、複数のリンカーは異なる。
いくつかの態様では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、少なくとも約１アミノ酸、少なくとも約２アミノ酸、少なくとも約３アミノ酸、少なくとも約４アミノ酸、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも約６アミノ酸、少なくとも約７アミノ酸、少なくとも約８アミノ酸、少なくとも約９アミノ酸、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約１１アミノ酸、少なくとも約１２アミノ酸、少なくとも約１３アミノ酸、少なくとも約１４アミノ酸、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約１７アミノ酸、少なくとも約１８アミノ酸、少なくとも約１９アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、または少なくとも約３０アミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは、グリシンが豊富である（例えば、柔軟性のため）。いくつかの態様では、リンカーは、セリン及び／またはトレオニンを含む（例えば、溶解性のため）。いくつかの態様では、リンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーである。
いくつかの態様では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍ（配列番号７７）に従い、式中、ｎは１～１００の任意の整数であり、ｍは１～１００の任意の整数である。いくつかの態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－（Ｓｅｒ）ｙ］ｚ（配列番号７８）に従い、式中、ｘは１～４の整数であり、ｙは０または１であり、ｚは１～５０の整数である。いくつかの態様では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは配列Ｇｎ（配列番号７９）を含み、式中、ｎは１～１００の整数であることができる。いくつかの態様では、任意のリンカーは配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号８０）を含むことができ、式中、ｎは１～１００の整数である。
いくつかの態様では、任意のリンカーの配列はＧＧＧＧ（配列番号８１）である。いくつかの態様では、任意リンカーの配列はＧＧＧＳＧ（配列番号８２）である。
いくつかの態様では、任意のリンカーは配列（ＧＧＧＳＧ）ｎ（配列番号６４）を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６５）を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６６）を含むことができる。いくつかの態様では、任意のリンカーは配列（ＧＧＳ）ｎ（配列番号６７）を含むことができる。これらの例では、ｎは１～１００の整数であることができる。他の例では、ｎは、１～２０の整数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であることができる。いくつかの態様では、ｎは１～１００の整数である。
任意のリンカーの例には、例えば、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号６８）、ＧＧＳＧＧ（配列番号６９）、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号７０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号７１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号７３）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７４）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、任意のリンカーは配列ＰＧＧを含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、グリシン及びセリンに加えて追加のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、１、２、３、４、または５個の非ｇｌｙ／非ｓｅｒアミノ酸を含む。いくつかの態様では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－リンカーは、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも９５％のグリシンまたはセリンアミノ酸を含む。
いくつかの特定の態様では、任意のリンカーは、長さが１～１０のアミノ酸である。いくつかの態様では、任意のリンカーは、長さが約５～約１０の間、約１０～約２０の間、約２０～約３０の間、約３０～約４０の間、約４０～約５０の間、約５０～約６０の間、約６０～約７０の間、約７０～約８０の間、約８０～約９０または約９０～約１００の間のアミノ酸である。
いくつかの態様では、リンカーは切断可能ではないリンカーであるので、リンカーと本明細書で提供されているポリヌクレオチドのさまざまな構成要素（例えば、ｃ－Ｊｕｎ及びＲＯＲ１結合タンパク質）は単一のポリペプチドとして発現される。いくつかの態様では、リンカーは切断可能なリンカーである。本明細書で使用されるとき、「切断可能なリンカー」という用語は、発現されるときに選択的に切断されて２以上の生成物を生成することができるような、切断部位を含むリンカーを指す。いくつかの態様では、リンカーはＰ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、フーリン切断部位、またはそれらの任意の組み合わせから選択される（下記の表９を参照のこと）。いくつかの態様では、リンカーはさらにＧＳＧリンカー配列を含む。いくつかの態様では、本開示に有用なリンカーは、第１及び第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドが翻訳中に生成されるように、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。本開示で使用することができるリンカーの追加の記載は、例えば、ＷＯ２０２０／２２３６２５Ａ１及びＵＳ２０１９／０２７６８０１Ａ１に提供されており、そのそれぞれが参照によって全体として本明細書に組み込まれる。
Figure 2024540099000013
いくつかの態様では、リンカーはＰ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、Ｔ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、Ｅ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、フーリン切断部位を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。
上記の開示から明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して改変され、培養される）は（５’から３’へ）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第２のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１のシグナルペプチド（例えば、ｈＩｇκ）をコードする第３のヌクレオチド配列、（ｉｖ）ＲＯＲ１結合タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列（例えば、ｓｃＦｖ）、（ｖ）第２のリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ、配列番号４０）をコードする第５のヌクレオチド配列、（ｖｉ）スペーサー（例えば、ＩｇＧ２のヒンジ由来スペーサー）をコードする第６のヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）をコードする第７のヌクレオチド配列、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）をコードする第８のヌクレオチド配列、（ｉｘ）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）をコードする第９のヌクレオチド配列、（ｘ）第３のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第１０のヌクレオチド配列、（ｘｉ）第２のシグナルペプチド（例えば、ＧＭＣＳＦＲαＳＰ）をコードする第１１のヌクレオチド配列、及び（ｘｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードする第１２のヌクレオチド配列を含む外来性ポリヌクレオチドを含む。
送達ベクター
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、本明細書で提供されている方法を使用して培養される）を改変するのに使用することができるベクター（例えば、発現ベクター）である。いくつかの態様では、本明細書に記載されているベクターは、複数（例えば、２、３、もしくは４またはそれ以上）のポリヌクレオチドを含み、複数のポリヌクレオチドはそれぞれ、本明細書に記載されているタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）、またはＥＧＦＲｔ）をコードする。したがって、いくつかの態様では、ベクターは、ポリシストロン性ベクター（例えば、２シストロン性ベクターまたは３シストロン性のベクター）を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されているポリヌクレオチドは同じベクター（例えば、マルチシストロン性発現ベクター）上に含まれる。いくつかの態様では、本明細書に記載されているタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）、またはＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチドは１以上の別個のベクター上に提供される。
本明細書に記載されているように、そのようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入の標的とされる細胞における組換え発現に有用である。「ベクター」という用語は、本明細書で使用されるとき、連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子、または別の核酸を輸送することができるそのような核酸分子を含む存在を指すことが意図される。いくつかの態様では、ベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。いくつかの態様では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。特定のベクターまたはベクターの一部であるポリヌクレオチドは、それらが導入される宿主細胞にて自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書では、「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本開示において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、文脈に応じて同義に使用できる場合もある。しかしながら、本明細書で開示されているのはまた、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、複製欠損レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターである。
いくつかの態様では、ベクターは、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、及び／またはＥＧＦＲｔをコードするもの）及び調節要素を含む。例えば、いくつかの態様では、ベクターは、プロモーターに操作可能に連結された、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、及び／またはＥＧＦＲｔをコードするもの）を含む。いくつかの態様では、ベクターは、複数（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはそれ以上）のプロモーターを含むことができる。例えば、いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は第１のプロモーターの制御下にあることができ、ポリヌクレオチドの追加的な構成要素の１以上（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列は第２のプロモーターの制御下にあることができる。いくつかの態様では、複数のプロモーターのそれぞれは同じである。いくつかの態様では、複数のプロモーターのうちの１以上は異なる。
当該技術分野において既知の任意の適したプロモーターを本開示で使用することができる。いくつかの態様では、本開示に有用なプロモーターは、構成的または誘導的プロモーターのような哺乳類またはウイルスプロモーターを含む。いくつかの態様では、本開示のためのプロモーターは、少なくとも１つの構成的プロモーター及び少なくとも１つの誘導的プロモーター、例えば、組織特異的なプロモーターを含む。
構成的哺乳類プロモーターには、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼのプロモーター、β－アクチンプロモーター、及びその他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、及びその他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、本開示で使用され得るプロモーターは、誘導的プロモーターである。誘導的プロモーターは、誘導剤の存在下において発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下において転写及び翻訳を促進するよう誘導される。複数の誘導的プロモーターが存在する場合、同じ誘導分子または異なる誘導物質によって誘導することができる。
いくつかの態様では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、または双方を含む。
いくつかの態様では、本開示に有用なベクター（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／またはリガンド結合タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む）はさらに、１以上の追加の調節要素を含む。調節要素の非限定的な例には、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）、翻訳開始配列、マイクロＲＮＡ結合部位もしくはそのシード、連結ヌクレオシドの３’テーリング領域、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、転写後制御モジュレーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、局在化配列（例えば、膜局在化配列、核局在化配列、核排除配列、もしくはプロテアソーム標的化配列）、翻訳後修飾配列（例えば、ユビキチン化、リン酸化、もしくは脱リン酸化）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、ベクターはさらに、転位要素を含んでもよい。したがって、いくつかの態様では、ベクターは、少なくとも２つのトランスポゾン特異的な逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／またはリガンド結合タンパク質をコードする）を含む。いくつかの態様では、トランスポゾン特異的ＩＴＲはＤＮＡトランスポゾンによって認識される。いくつかの態様では、トランスポゾン特異的なＩＴＲはレトロトランスポゾンによって認識される。核酸分子を宿主細胞、例えば、免疫細胞のゲノムに導入するために、当該技術分野において既知の任意のトランスポゾン系を使用することができる。いくつかの態様では、トランスポゾンは、ｈＡＴ様Ｔｏｌ２、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙを含む。いくつかの態様では、トランスポゾンは、ｐＩｇｇｙＢａｃを含む。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（１）：１２０－２５（２０１６）（本明細書に参照によってその全容を援用する）を参照のこと。
いくつかの態様では、ベクターは移入ベクターである。「移入ベクター」という用語は、単離された核酸（例えば、本明細書に記載されているポリヌクレオチド）を含み、細胞の内部に単離された核酸を送達するのに使用することができる物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と関連づけられるポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当該技術分野で知られている。したがって、「移入ベクター」という用語は、自己複製のプラスミドまたはウイルスを含む。その用語はまた、細胞への核酸の移行を容易化する非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等をさらに含むように解釈されるべきである。ウイルス移入ベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、ベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、発現させられるヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によってまたは試験管内発現システムにて供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、むき出しまたはリポソームに含有される）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野で知られているすべてのものが含まれる。
いくつかの態様では、ベクターはウイルスベクター、哺乳類ベクター、または細菌ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ハイブリッドベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターから成る群から選択される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、第三世代アデノウイルスベクターである。ＡＤＥＡＳＹ（商標）は、アデノウイルスベクター構築物を生成するための群を抜いて人気のある方法である。そのシステムは、２つのタイプのプラスミド：シャトル（またはトランスファー）ベクター及びアデノウイルスベクターから成る。目的の導入遺伝子をシャトルベクターにクローニングし、検証し、制限酵素ＰｍｅＩで直鎖化する。次いで、この構築物を、ＰＡＤＥＡＳＹ（商標）を含むＢＪ５１８３大腸菌細胞であるＡＤＥＡＳＩＥＲ－１細胞に形質転換する。ＰＡＤＥＡＳＹ（商標）は、ウイルス産生に必要なアデノウイルス遺伝子を含んだ約３３Ｋｂのアデノウイルスプラスミドである。シャトルベクターとアデノウイルスプラスミドとは、アデノウイルスプラスミド内への導入遺伝子の相同組み換えを促進する一致した左右のホモロジーアームを有している。標準的なＢＪ５１８３に、スーパーコイルを形成したＰＡＤＥＡＳＹ（商標）とシャトルベクターを同時形質転換することもできるが、この方法は非組換えアデノウイルスプラスミドの高いバックグ回を生じる。次いで、組換えアデノウイルスプラスミドをサイズ及び適当な制限消化パターンについて検証し、導入遺伝子がアデノウイルスプラスミドに挿入され、他のパターンの組み換えが生じていないことを確認する。検証が済んだなら、組換えプラスミドをＰａｃＩで直鎖化してＩＴＲで挟まれた直鎖状ｄｓＤＮＡ構築物を作製する。２９３または９１１細胞に直鎖化した構築物を形質移入すると、ウイルスをおよそ７～１０日後に回収することができる。この方法以外にも、本明細書に開示されている方法を実施するために、本願が出願された時点で当該技術分野において周知のアデノウイルスベクター構築物を作製するための方法を用いることができる。
いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター（例えば、第三または第四世代レンチウイルスベクター）である。用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスのなかでも独特であり、有意な量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送達し得るので、遺伝子送達ベクターのうちで最も効率的な方法のうちの１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。用語「レンチウイルスベクター」という用語は、特にＭｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）で提供される自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。臨床において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステム等が含まれるが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者にはわかるであろう。
レンチウイルスベクターは、１つの細胞株に３つの別々のプラスミド発現システムを形質移入する一時的な形質移入システムで通常は作り出される。これらには、移入ベクタープラスミド（ＨＩＶプロウイルスの一部）、パッケージングプラスミドまたは構築物、及び異なるウイルスの異種エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）を持つプラスミドが含まれる。ベクターの３つのプラスミド構成要素がパッケージング細胞に入れられ、それが、その後、ＨＩＶシェルに挿入される。ベクターのウイルス部分は挿入配列を含んでいるため、ウイルスは細胞系で複製することはできない。現在の第３世代レンチウイルスベクターは、９つのＨＩＶ－１タンパク質のうちの３つのみ（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ）をコードしており、これらは組換えによる複製能を有するウイルスの生成を防止するために別々のプラスミドから発現させられる。第四世代レンチウイルスベクターでは、レトロウイルスゲノムはさらに減らされている（例えば、ＴＡＫＡＲＡ（登録商標）ＬＥＮＴＩ－Ｘ（商標）第四世代パッケージングシステムを参照のこと）。
いくつかの態様では、非ウイルス法を使用して、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／またはＲＯＲ１結合タンパク質をコードするもの）を免疫細胞に送達することができる。いくつかの態様では、非ウイルス法にはトランスポゾンの使用が挙げられる。いくつかの態様では、非ウイルス送達法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラム化、及び対象への細胞の直接的注入を可能にする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びゲノム編集代替手段、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼ（ＭＮ）を使用することによって標的細胞（例えば、Ｔ細胞）または宿主細胞（例えば、コードされるタンパク質の組換え発現のための細胞）のゲノムに挿入され得る。非ウイルス送達システムには、エレクトロポレーション、細胞圧搾法、脂質ナノ粒子、金ナノ粒子、ポリマーナノ粒子を含むナノ粒子も含まれる。非ウイルス送達システムの実例には、ＥｂｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０２１，Ｍａｙ；６７：１０３３５４が挙げられ、それには例について記載されている。
いくつかの態様では、本明細書で開示されているベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び（ｉｉ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１のｓｃＦｖ）をコードする１以上のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ベクターは（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質と、（ｉｉ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１のｓｃＦｖ）と、（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｔとをコードする１以上のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ベクターは（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質と、（ｉｉ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）と、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）と、（ｉｖ）共刺激ドメイン（４－１ＢＢ）と、（ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ）と、（ｖｉ）ＥＧＦＲｔとをコードする１以上のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、１以上のヌクレオチド配列はさらに、リンカー、スペーサー、シグナルペプチド、またはそれらの組み合わせをコードする。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載されているベクターは（５’から３’へ）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第２のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１のシグナルペプチド（例えば、ｈＩｇｋ）をコードする第３のヌクレオチド配列、（ｉｖ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１ｓｃＦｖ）をコードする第４のヌクレオチド配列、（ｖ）第２のリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ、配列番号４０）をコードする第５のヌクレオチド配列、（ｖｉ）スペーサー（例えば、ＩｇＧ２のヒンジ由来スペーサー）をコードする第６のヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）をコードする第７のヌクレオチド配列、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）をコードする第８のヌクレオチド配列、（ｉｘ）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）をコードする第９のヌクレオチド配列、（ｘ）第３のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第１０のヌクレオチド配列、（ｘｉ）第２のシグナルペプチド（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする第１１のヌクレオチド配列、及び（ｘｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードする第１２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されているポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／またはリガンド結合タンパク質をコードする）は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ分子もしくはその組み合わせ）、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ分子もしくはその組み合わせ）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ゲノムもしくはｃＤＮＡ形態の一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ）、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、そのそれぞれが化学的または生化学的に改変された、非天然の、または誘導化されたヌクレオチド塩基を含むことができる。本明細書に記載されているように、そのような核酸配列は、ポリＡ配列、改変コザック配列、ならびにエピトープタグ、搬出シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び細胞膜局在化シグナルをコードする配列を含むが、これらに限定されない、コードされたポリペプチドの発現及び／または精製を促進するうえで有用な追加の配列を含むことができる。本明細書の教示に基づいて、どのヌクレオチド配列が本明細書に記載されているさまざまなポリペプチド（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードするかは当業者には明らかであろう。
ＩＩＩ．本開示の組成物
本開示の特定の態様は、本明細書に開示されている方法に従って培養した免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）の集団を含む細胞組成物を対象とする。本開示の特定の態様は、参照免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する細胞）と比べて高いレベルのｃ－Ｊｕｎポリペプチドを発現するように改変され、本明細書で開示されている方法に従って培養された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞）の集団を含む細胞組成物を対象とする。本方法に従って、及び／または本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地にて培養した細胞集団は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて従来の方法に従って培養した同等の細胞と比べて、低分化細胞の数が増加する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、幹細胞様表現型に特有の１以上のマーカーの高い発現を示す。いくつかの態様では、本方法に従って、及び／または本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地にて培養した細胞集団は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて、従来の方法に従って培養した同等の細胞と比べて、エフェクター様細胞の数が増加する。いくつかの態様では、本方法に従って、及び／または本明細書に開示されている代謝再プログラム化培地にて培養した細胞集団は、例えば、５ｍＭ未満のＫ＋を含有する培地にて、従来の方法に従って培養した同等の細胞と比べて、幹細胞様細胞及びエフェクター様細胞の双方の数が増加する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、従来の方法に従って培養した細胞と比べてより高い増殖能を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、形質導入効率の増加を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、対象への移植時に生体内生存能の増加を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、分化能の増加を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、細胞疲弊の減少を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、対象への移植時に生体内持続性の増加を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、対象への移植時に生体内活性の増加を呈する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した細胞は、対象への移植時により持続的な生体内応答を呈する。いくつかの態様では、対象はヒトである。
いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約１０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約１５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約２０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約２５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約３０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約３５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約４０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約４５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約５０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約５５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約６０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約６５％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。いくつかの態様では、細胞組成物における少なくとも約７０％の細胞が、幹細胞様表現型を有する。
いくつかの態様では、いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物中におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％～少なくとも約７０％を構成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物中におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％を構成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、幹細胞様Ｔ細胞は、培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％を構成する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞（すなわち、ＴＰＥに特徴的な遺伝子発現が濃縮されたＴ細胞）の比率が約１．５倍から約２０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が約２倍から約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が約２倍から約５倍増加する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約２倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約２．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約３倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約３．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約４倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約４．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約５．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約６倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約６．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約７倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約７．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約８倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約８．５倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約９倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１０倍増加する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、疲弊したＴ細胞（例えば、ＴＴＥに特徴的な遺伝子発現が濃縮されたＴ細胞）の比率が少なくとも約１／４減少し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、疲弊したＴ細胞の比率が少なくとも約１／３減少し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、疲弊したＴ細胞の比率が少なくとも約１／２減少し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、疲弊したＴ細胞の比率が少なくとも約３／４減少し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。
いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約２倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約２．５倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約３倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約３．５倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約４倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約５倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている方法に従ってＴ細胞を培養した後、幹細胞様Ｔ細胞の比率が少なくとも約６倍増加し、前駆疲弊Ｔ細胞の比率が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または少なくとも約１０倍増加する。
いくつかの態様では、細胞組成物は、１以上の幹細胞様マーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び１以上のＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも２つの幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞及び１以上のＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも３つの幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞及び１以上のＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも４つの幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び１以上のＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、１以上の幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び少なくとも２つのＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、１以上の幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び少なくとも３つのＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、１以上の幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び少なくとも４つのＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、１以上の幹細胞様マーカーを発現する、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び少なくとも５つのＴＰＥマーカーを発現する高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。
いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、約４％～約１０％の間の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、約４％～約９％の間の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、約４％～約８％の間の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、約４％～約７％の間の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、約４％～約６％の間の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。
いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、且つ少なくとも約４％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、且つ少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、且つ少なくとも約４％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、且つ少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。
いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、約２０％未満の細胞が終末疲弊細胞（ＴＴＥ）である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞である免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、または約１５％未満の細胞が終末疲弊細胞（ＴＴＥ）である免疫細胞の集団を含む。
いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、少なくとも約４％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞であり、約２０％未満の細胞がＴＴＥである免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞であり、約２０％未満の細胞がＴＴＥである免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、少なくとも約４％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞であり、約２０％未満の細胞がＴＴＥである免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様では、本明細書の細胞組成物は、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が前駆疲弊Ｔ細胞であり、少なくとも約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の細胞が幹細胞様Ｔ細胞であり、約２０％未満の細胞がＴＴＥである免疫細胞の集団を含む。
いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約１．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約２．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約２．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約３．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約３．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約４．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約４．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約５．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約５．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約６．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約６．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約７．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約７．５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約８．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約９．０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約１５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約２０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約３０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約４０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約５０倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約７５倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約１００倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約５００倍増加する。いくつかの態様では、細胞組成物における幹細胞様表現型を有する細胞の数は、培養前の細胞組成物における細胞の数と比べて少なくとも約１０００倍増加する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％～少なくとも約７０％は、ＣＤ３９－／ＴＣＦ７＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、培養物におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％は、ＣＤ３９－／ＴＣＦ７＋Ｔ細胞である。いくつかの態様ではＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様ではＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ９５を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ４５ＲＯを発現しない。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ４５ＲＡを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＣＲ７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ６２Ｌを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＴＣＦ７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ３を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ２７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ９５及びＣＤ４５ＲＡを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、及びＴＣＦ７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、及びＴＣＦ７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞はＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＦ７、及びＣＤ２７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＦ７、及びＣＤ２７を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＦ７、及びＣＤ２７を発現し、ＣＤ４５ＲＯを発現せず、またはＣＤ４５ＲＯ低である。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＴＣＦ７、及びＣＤ２７を発現し、ＣＤ４５ＲＯを発現せず、またはＣＤ４５ＲＯ低である。
いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ３９及びＣＤ６９を発現しない。いくつかの態様では、細胞組成物は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の割合の増加を含み、これらの細胞は、ＣＤ８を発現し、ＣＤ３９及びＣＤ６９を発現しない。いくつかの態様では、いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、培養物中におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％～少なくとも約４０％はＣＤ３９－／ＣＤ６９－Ｔ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法によるＴ細胞の培養後、培養物中におけるＴ細胞の総数の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％は、ＣＤ３９－／ＣＤ６９－Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、細胞組成物は、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含み、これらの細胞は（ｉ）１以上の幹細胞様マーカー及び（ｉｉ）１以上のエフェクター様マーカーの双方を発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含み、これらの細胞は、少なくとも２つの幹細胞様マーカー及び１以上のエフェクター様マーカーを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含み、これらの細胞は少なくとも３つの幹細胞様マーカー及び１以上のエフェクター様マーカーを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含み、これらの細胞は少なくとも４つの幹細胞様マーカー及び１以上のエフェクター様マーカーを発現する。いくつかの態様では、細胞組成物は、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含み、これらの細胞は１以上の幹細胞様マーカー及び少なくとも２つエフェクター様マーカーを発現する。
いくつかの態様では、幹細胞様マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＢＡＣＨ２＋、ＬＥＦ１＋、ＴＣＦ７＋、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では幹細胞様マーカーはＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、及びＴＣＦ７＋、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞はＣＤ４５ＲＯ低を発現する。いくつかの態様では、幹細胞様マーカーは、特徴的な遺伝子発現の一部として本明細書で列挙される１以上の遺伝子を含む（上記を参照のこと；例えば、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１７（１０）：１２９０－９７（２０１１）またはＧａｌｌｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，１５５２－６２（２０２０）を参照のこと）。
いくつかの態様では、幹細胞様マーカーはＷＮＴシグナル伝達経路にて発現する遺伝子を含む。いくつかの態様では、幹細胞様マーカーは、Ｇｎｇ２、ＰＳＭＣ３、ＰＳＭＢ１０、ＰＳＭＣ５、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＡＫＴ１、ＭＹＣ、ＣＬＴＢ、ＰＳＭＥ１、ＤＶＬ２、ＰＦＮ１、Ｈ２ＡＦＪ、ＬＥＦ１、ＣＴＢＰ１、ＭＯＶ１０、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＦＺＤ３、ＩＴＰＲ３、ＰＡＲＤ６Ａ、ＬＲＰ５、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＤ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ３Ｈ２ＢＢ、ＤＡＣＴ１、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む。いくつかの態様では、幹細胞様マーカーは、ＭＹＣ、ＡＫＴ１、ＬＥＦ１、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む。
いくつかの態様では、エフェクター様マーカーは、ｐＳＴＡＴ５＋、ＳＴＡＴ５＋、ｐＳＴＡＴ３＋、ＳＴＡＴ３＋、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、エフェクター様マーカーはＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＩＳＨ、ＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＨ１、ＣＴＦ１、ＥＰ３００、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＧＨ１、ＧＨ２、ＧＨＲ、ＧＲＢ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＬＲ１、ＩＦＮＷ１、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１９、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＩＬ２６、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＲＦ９、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＬＥＰ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＭＹＣ、ＯＳＭ、ＯＳＭＲ、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ５、ＰＩＭ１、ＰＲＬ、ＰＲＬＲ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ６、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ７、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２、ＳＰＲＥＤ１、ＳＰＲＥＤ２、ＳＰＲＹ１、ＳＰＲＹ２、ＳＰＲＹ３、ＳＰＲＹ４、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＴＰＯ、ＴＳＬＰ、ＴＹＫ２、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるＳＴＡＴ標的を含む。
いくつかの態様では、エフェクター様マーカーはＴＢＣＤ、ＡＲＬ４Ｃ、ＫＬＦ６、ＬＰＧＡＴ１、ＬＰＩＮ２、ＷＤＦＹ１、ＰＣＢＰ４、ＰＩＫ３４３、ＦＡＳ、ＬＬＧＬ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＴＴＣ３９Ｃ、ＧＧＡ２、ＬＲＰ８、ＰＭＡＩＰ１、ＭＶＤ、ＩＬ１５ＲＡ、ＦＨＯＤ１、ＥＭＬ４、ＰＥＡ１５、ＰＬＥＫＨＡ５、ＷＳＢ２、ＰＡＭ、ＣＤ６８、ＭＳＣ、ＴＬＲ３、Ｓ１ＰＲ５、ＫＬＲＢ１、ＣＹＴＨ３、ＲＡＢ２７Ｂ、ＳＣＤ５、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含むエフェクターメモリー関連遺伝子である。いくつかの態様では、エフェクター様マーカーは、ＫＬＦ６、ＦＡＳ、ＫＬＲＢ１、ＴＬＲ３、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上の遺伝子を含む。
いくつかの態様では、細胞組成物は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＳＴＡＴ５＋、及びＳＴＡＴ３＋である、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＳＴＡＴ５＋、及びＳＴＡＴ３＋である、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、ＴＣＦ７＋、ＳＴＡＴ５＋、及びＳＴＡＴ３＋である、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＢＡＣＨ２＋、ＬＥＦ１＋、ＴＣＦ７＋、ＳＴＡＴ５＋、及びＳＴＡＴ３＋である、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＢＡＣＨ２＋、ＬＥＦ１＋、ＴＣＦ７＋、ｐＳＴＡＴ５＋、ＳＴＡＴ５＋、ｐＳＴＡＴ３＋、及びＳＴＡＴ３＋である、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。いくつかの態様では、細胞組成物は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＢＡＣＨ２＋、ＬＥＦ１＋、ＴＣＦ７＋、ｐＳＴＡＴ５＋、ＳＴＡＴ５＋、ｐＳＴＡＴ３＋、及びＳＴＡＴ３＋である、高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む。
いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＢＡＣＨ２＋、ＬＥＦ１＋、ＴＣＦ７＋、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上のマーカー、ならびにｐＳＴＡＴ５＋、ＳＴＡＴ５＋、ｐＳＴＡＴ３＋、ＳＴＡＴ３＋、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上のマーカーを含む。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ低を発現する。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＢＡＣＨ２＋、ＬＥＦ１＋、ＴＣＦ７＋、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上のマーカーならびに１以上のエフェクター様マーカーを含む。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、１以上の幹細胞様マーカーならびにｐＳＴＡＴ５＋、ＳＴＡＴ５＋、ｐＳＴＡＴ３＋、ＳＴＡＴ３＋、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上のマーカーを含む。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ低を発現する。
本開示のいくつかの態様は、免疫細胞の集団を含む細胞組成物を対象とし、免疫細胞の集団は（ｉ）１以上の幹細胞様マーカーを発現する免疫細胞（例えば、幹細胞様免疫細胞）の第１の亜集団及び（ｉｉ）１以上のエフェクター様マーカーを発現する免疫細胞（例えば、エフェクター様免疫細胞）の第２の亜集団を含み、免疫細胞の集団は、従来の培地、例えば、５ｍＭ未満のカリウムイオンを有する培地を使用して培養した免疫細胞の集団と比べて、１以上の幹細胞様マーカーを発現する、高い割合（すなわち、幹細胞様免疫細胞の数／免疫細胞の総数）の免疫細胞の第１の亜集団を含む。いくつかの態様では、ヒト免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの態様では、細胞はＮＫ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、これらの細胞組成物をもたらす。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法に従って培養した免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞は、高い発現、例えば、ＧＺＭＢ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及び／またはＮＫＧ７を発現する、さらに高い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞、及び低い発現、例えば、ＩＬ－３２を発現する、さらに低い割合の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞を有する。ＮＫＧ７について最も高い細胞はさらに良好なキラーであることが示されている（Ｍａｌａｒｋａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．）のに対して、ＩＬ－３２がさらに高い細胞は、活性化誘導細胞死を有することが示されている（Ｇｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）。いくつかの態様では、ＧＺＭＢ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及び／またはＮＫＧ７の発現がさらに高い免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞はエフェクター様マーカーを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＩＬ－３２の発現がさらに低い免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞はエフェクター様マーカーを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物（例えば、療法として使用するための最終細胞製剤の収率）は、少なくとも約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、または５×１０９の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、または５×１０９の幹細胞様細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１２×１０１０、１３×１０１０、１４×１０１０、または１５×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１×１０６の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１×１０６の幹細胞様細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約２×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約３×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約４×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約５×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約６×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約７×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約８×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約９×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１０×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１１×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１２×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１３×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１４×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意の方法によって得られる細胞組成物は、少なくとも約１５×１０１０の細胞を含む。いくつかの態様では、細胞収率はＣＤ３＋細胞の総数を表す。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、現在開示されている培地での培養の少なくとも約１０日目までに少なくとも約１×１０１０、少なくとも約１．１×１０１０、少なくとも約１．２×１０１０、少なくとも約１．３×１０１０、少なくとも約１．４×１０１０、少なくとも約１．５×１０１０、少なくとも約１．６×１０１０、少なくとも約１．７×１０１０、少なくとも約１．８×１０１０、少なくとも約１．９×１０１０、または少なくとも約２．０×１０１０の細胞を含む組成物を生成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、現在開示されている培地での培養の少なくとも約１０日目までに少なくとも約１．８×１０１０の細胞を含む組成物を生成する。
いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも約１×１０１０、少なくとも約１．１×１０１０、少なくとも約１．２×１０１０、少なくとも約１．３×１０１０、少なくとも約１．４×１０１０、少なくとも約１．５×１０１０、少なくとも約１．６×１０１０、少なくとも約１．７×１０１０、少なくとも約１．８×１０１０、少なくとも約１．９×１０１０、または少なくとも約２．０×１０１０の幹細胞様細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、培養の少なくとも約１０日目までに少なくとも約１×１０１０、少なくとも約１．１×１０１０、少なくとも約１．２×１０１０、少なくとも約１．３×１０１０、少なくとも約１．４×１０１０、少なくとも約１．５×１０１０、少なくとも約１．６×１０１０、少なくとも約１．７×１０１０、少なくとも約１．８×１０１０、少なくとも約１．９×１０１０、または少なくとも約２．０×１０１０個の幹細胞様細胞を含む組成物を生成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、本開示の培地にての培養の少なくとも約１０日目までに少なくとも約１．８×１０１０個の幹細胞様細胞を生成する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％生存性である免疫細胞を含む組成物を生成する。いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法は、少なくとも約９４％の細胞生存率である少なくとも約１．８×１０１０の幹細胞様細胞を含む組成物を生成する。
ＩＶ．治療方法
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養された）を投与する方法を対象とする。本開示のいくつかの態様は、対象に本明細書に記載されている免疫細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象にて疾患または障害を治療する方法を対象とする。例えば、いくつかの態様では、本明細書で開示されているのは、ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するよう操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象にて疾患または障害を治療する方法である。いくつかの態様では、疾患または状態は腫瘍、すなわち、がんを含む。いくつかの態様では、方法は、対象における標的の細胞集団または組織に対するＴ細胞が介在する免疫応答を刺激することを含み、本明細書に記載されている免疫細胞を投与することを含む。いくつかの態様では、標的細胞集団は腫瘍を含む。いくつかの態様では、腫瘍は固形腫瘍である。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）を投与すると、参照腫瘍体積と比べて対象における腫瘍体積が減少する。いくつかの態様では、参照腫瘍体積は投与前の対象における腫瘍体積である。いくつかの態様では、参照腫瘍体積は投与を受けなかった対応する対象における腫瘍体積である。いくつかの態様では、対象における腫瘍体積は、参照腫瘍体積と比べて投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。
いくつかの態様では、腫瘍を治療することは、対象にて腫瘍重量を減らすことを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）を投与すると、対象に投与されたときに対象の腫瘍重量を減らすことができる。いくつかの態様では、腫瘍重量は、参照腫瘍重量と比べて投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。いくつかの態様では、参照腫瘍重量は投与前の対象における腫瘍重量である。いくつかの態様では、参照腫瘍重量は投与を受けなかった対応する対象の腫瘍重量である。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養されたもの）を、例えば、腫瘍を患っている対象に投与すると、対象の血中のＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）の数及び／または割合を増やすことができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞は改変された免疫細胞である。いくつかの態様では、血中におけるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養されたもの）の数及び／または割合は、参照（例えば、投与を受けなかった対象または投与前の同じ対象の対応する値）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％またはそれを超えて増加する。いくつかの態様では、血中におけるＴ細胞の数及び／または割合は、参照（例えば、投与を受けていない対応する対象）と比べて少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍以上増加する。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に提供される方法を用いて培養されたもの）を、例えば腫瘍に罹患している対象に投与すると、対象の腫瘍及び／または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）の数及び／または割合を増やすことができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞は改変された免疫細胞である。いくつかの態様では、腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＴ細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変されたもの）の数及び／または割合は、参照（例えば、投与を受けなかった対象または投与前の同じ対象における対応する値）と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、もしくは少なくとも約３００％またはそれを超えて増加する。いくつかの態様では、腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＴ細胞の数及び／または割合は、参照（例えば、投与を受けなかった対応する対象）と比べて少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍以上増加する。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に提供される方法を用いて培養されたもの）を、例えば腫瘍に罹患している対象に投与すると、投与を受けなかった（例えば、対応する、しかしｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を欠いた細胞で治療した）対応する対象における免疫応答の持続期間と比べて、対象における免疫応答の持続期間を増加させることができる。いくつかの態様では、免疫応答の持続時間は、参照（例えば、投与を受けなかった対応する対象）と比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％以上増加する。いくつかの態様では、免疫応答の持続時間は、参照（例えば、投与を受けなかった対応する対象）と比べて、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍以上増加する。いくつかの態様では、免疫応答の持続時間は、参照（例えば、投与を受けなかった対応する対象）と比べて、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１ヵ月、少なくとも約２ヵ月、少なくとも約３ヵ月、少なくとも約４ヵ月、少なくとも約５ヵ月、少なくとも約６ヵ月、少なくとも約７ヵ月、少なくとも約８ヵ月、少なくとも約９ヵ月、少なくとも約１０ヵ月、少なくとも約１１ヵ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、または少なくとも約５年増加する。
本明細書に記載されているように、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）は種々のがんの治療に使用することができる。治療することができるがんの非限定例には、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭部及び下咽頭癌、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織における肉腫、基底細胞皮膚癌及び扁平上皮細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、がん治療によって引き起こされる続発性がん、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、がんは固形腫瘍と関連づけられる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）は、他の治療剤（例えば、抗がん剤及び／または免疫調節剤）と併用して使用される。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示されている疾患または障害（例えば、腫瘍）を治療する方法は、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養されたもの）を１以上の追加の治療剤と併用して投与することを含む。そのような薬剤には、例えば、化学療法薬、標的抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害性薬剤、免疫に基づく療法、サイトカイン、手術、放射線療法、共刺激分子の活性化剤、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）は、追加の治療剤の投与前または投与後に対象に投与される。いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）は追加の治療剤と同時に対象に投与される。いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）及び追加の治療剤は、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時に投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）及び追加の治療剤は、別の組成物として同時に投与される。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）は、ダサチニブまたはポナチニブのようなＢＣＲ－ＡＢＬ／Ｓｒｃキナーゼ阻害剤の投与前または投与後に対象に投与される。いくつかの態様では、ダサチニブまたはポナチニブは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で時々発生し得る細胞傷害性（例えば、サイトカインストーム）を軽減するために投与することができる。Ｓｒｃキナーゼは生理的なＴ細胞の活性化に重要な役割を担うことが知られている。これと一致して、ダサチニブは、抗原特異的な生理学的Ｔ細胞の活性化、増殖、サイトカイン産生、及び脱顆粒を用量依存性に大幅に阻害することが示されており（Ｓｃｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１１：１３６６－７７，２００８；Ｗｅｉｃｈｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４：２４８４－９１，２００８）、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法における細胞傷害性を軽減することが示されている（例えば、ＵＳ２０２１０３２３６３を参照のこと）。
いくつかの態様では、本明細書に記載されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書に記載されている方法を使用して培養されたもの）は、標準治療（例えば、手術、放射線療法、及び化学療法）と併用して使用される。本明細書に記載されている方法は、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を防止することを目的とした療法としても使用することができる。
いくつかの態様では、本明細書で提供されている免疫細胞（例えば、ＲＯＲ１結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが上昇するように改変され、本明細書で提供されている方法を使用して培養されたもの）は１以上の抗がん剤と併用して使用されるので、免疫経路の複数の要素を標的とすることができる。そのような併用の非限定例には、腫瘍抗原提示を増強する療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；例えば、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路の阻害、及び／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄系由来サプレッサー細胞）の枯渇もしくは遮断によって、負の免疫調節を阻害する療法；例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０、及び／またはＣＤ４０もしくはＧＩＴＲの経路を刺激する、及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストによる、正の免疫調節を刺激する療法；抗腫瘍Ｔ細胞の発生頻度を全身性に増やす療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用して、または生体外抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって腫瘍中のＴｒｅｇのようなＴｒｅｇを枯渇させる、または阻害する療法；腫瘍中のサプレッサー骨髄細胞の機能に影響を与える療法；腫瘍細胞の免疫原性を増強する療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子操作細胞、例えば、キメラ抗原受容体を発現するように操作された細胞（ＣＡＲ－Ｔ療法）を含む養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；代謝酵素、例えば、インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、または一酸化窒素合成酵素などを阻害する療法；Ｔ細胞のアネルギーまたは疲弊を元に戻す／防止する療法；腫瘍部位の自然免疫活性化及び／または炎症を誘発する療法；免疫刺激性サイトカインの投与；免疫抑制サイトカインの遮断；あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、抗がん剤は免疫チェックポイント阻害剤を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介するシグナル伝達を遮断する）。本発明の方法に使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。かかる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＴＳＲ－０４２、ＲＥＧＮ２８１０、ＪＳ００１、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０）、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ７５４０９１、ＳＨＲ－１２１０、及びそれらの組み合わせ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、ＲＧ７４４６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５９、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、ＬＹ３３０００５４、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、及びそれらの組み合わせ）、ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６）、ＡＧＥＮ－１８８４、ＡＴＯＲ－１０１５、及びそれらの組み合わせ）が挙げられる。
いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント活性化因子を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介してシグナル伝達を促進する）。いくつかの態様では、免疫チェックポイント活性化剤は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ－３アゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、ＴＩＭ３アゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を採用するであろう。そのような技術は文献にて十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４），Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７），Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４），Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６），Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）及びｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。
上記で引用されたすべての参考文献、と同様に本明細書にて引用されるすべての参考文献及びアミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号及び／またはＵｎｉＰｒｏｔ番号）は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、例示のために示すものであって、限定のためのものではない。
実施例１：ＣＡＲ形質導入効率の分析
ＣＡＲ形質導入効率に対して代謝再プログラム化培地が有する効果を評価するために、代謝再プログラム化培地（ＭＲＭ）またはＴ細胞馴化培地（すなわち、ＴＣＭ）のいずれかにてヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質導入した。本実施例を行う際に使用した例示的な方法を以下に提供する。
培地の調製
対照として使用されたＴ細胞馴化培地（ＴＣＭ）をＩｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、ＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－７（１２００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（２０ＩＵ／ｍＬ）で補完した。
代謝再プログラム化培地（ＭＲＭ）は、さまざまな濃度のナトリウム、カリウム、グルコース、及びカルシウムで補完したＴＣＭを使用して作り出した。最終濃度は：ＮａＣｌ（４０～８０ｍＭ）、ＫＣｌ（４０～８０ｍＭ）、カルシウム（０．５～２．８ｍＭ）、グルコース（１０～２４ｍＭ）及び浸透圧（約２５０～３４０ｍＯｓｍｏｌ）の範囲だった。表１０を参照のこと。
Figure 2024540099000014
 ＊張度を次の式に基づいて算出する：２×（Ｋの濃度＋ＮａＣｌの濃度）
レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）の構築及びレンチウイルスの産生
以下の成分：（ｉ）抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（Ｒ１２抗体に由来する）（本明細書では「Ｒ１２ ＣＡＲ」と呼ぶ）（配列番号８３）と、（ｉｉ）切り詰め型ＥＧＦＲ（「ＥＧＦＲｔ」）（配列番号２４）と、（ｉｉｉ）野生型ｃ－Ｊｕｎタンパク質（配列番号１３）（本明細書では「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ」と呼ぶ；配列番号８６）とを含む抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物を生成した。表１４（下記）を参照のこと。細胞（例えば、Ｔ細胞）にて形質導入された場合に、形質導入された細胞が、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔの表面発現と共に、増加したｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を呈するようにｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ構築物を設計した。対照として、ｃ－Ｊｕｎの代わりに切断型ＣＤ１９（「ＣＤ１９ｔ」）を含む対応する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物も生成した（本明細書で「対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ」と呼ばれる）。Ｔｅｒａｋｕｒａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１９（１）：７２－８２（２０１２）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
レンチウイルスベクターをＶＳＶ－Ｇエンベロープでシュードタイプ化し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質移入によって産生した。最終バルクを２～８℃で２４時間以下保持してからＬＶＶの１ｍＬのアリコートを充填し、－８０℃で保存した。ＬＶＶのアリコートを氷上で解凍してからＴ細胞形質導入をした。
Ｔ細胞の単離
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を３名の健康ドナーから単離し、ベンダーであるＢｌｏｏｄＷｏｒｋｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）及びＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して凍結した。ベンダーは、ドナーからすべての適切な同意書を入手し、管理した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために、試料をアフェレーシスを介して収集し、そのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を、最初にＣＤ８＋Ｔ細胞の陽性選択、続いてＣＤ８選択からのフロースルーのＣＤ４＋Ｔ細胞についての陽性選択の順序で別々に単離した。単離されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞をバイアル当たり２０Ｅ＋０６細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）又は５０Ｅ＋０６細胞（ＢｌｏｏｄＷｏｒｋｓ）のいずれかで凍結させた。
細胞培養及び形質導入
凍結保存された健康ドナーのヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞（すなわち、ベンダーからのもの）を適切な培地（すなわち、ＴＣＭまたはＭＲＭ）にて解凍し、１：１の比で組み合わせた。組み合わせたドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５が補充された適切な培地（すなわち、Ｔ細馴化培地またはＭＲＭ）に再懸濁した。次いでＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．）を使用して活性化した。ＴＣＭまたはＭＲＭのいずれかにおける活性化の２４時間後（すなわち、１日目）、Ｔ細胞を抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物（すなわち、「ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ」及び「対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ」）を含む上述したＬＶＶで形質導入した。非形質導入Ｔ細胞を対照として使用した。形質導入の翌日（すなわち、２日目）、新鮮な培地（すなわち、ＴＣＭまたはＭＲＭ）を添加してＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）を希釈し、Ｔ細胞活性化を終了させた。形質導入されたＴ細胞をさらに５日間（すなわち、７日目）さらに増殖させ、次いでその後分析し、または長期保存のために液体窒素にて凍結保存した。
形質導入効率の分析
さまざまな群（表１１を参照のこと）由来のＣＡＲ形質導入効率を比較するために、以下：（ｉ）ｃ－Ｊｕｎ、抗ＲＯＲ１ Ｒ１２ ｓｃＦｖと配列番号２４に示される配列を含むＥＧＦＲｔ、または（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ、抗ＲＯＲ１ Ｒ１２ ｓｃＦｖと切り詰め型ＣＤ１９を発現するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーを使用して決定した。
Figure 2024540099000015
図１Ａ～１Ｃに示されているように、ＴＣＭ群及びＭＲＭ群の双方にて及び各ドナー内で、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲとｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲとの間の形質導入効率は同等であった。同様に、ＴＣＭ群とＭＲＭ群との間で、形質導入されたＴ細胞（すなわち、ＥＧＦＲｔ及びＲ１２ ＣＡＲの双方を発現する）の割合は同等であった。また、各ドナー内のさまざまな群から形質導入されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合にて有意な差異は観察されなかった（図２Ａ～２Ｃを参照のこと）。興味深いことに、ＭＲＭ群からのｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、ＴＣＭ群からの対応する形質導入されたＴ細胞と比べて有意に高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質発現を発現した（図３Ａ～３Ｃを参照のこと）。高い発現は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質に特異的であり、他の導入遺伝子（すなわち、Ｒ１２ ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ）に包括的ではなかった。
これらの結果は、本明細書に記載されている抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物が双方の培養条件下で同様の程度でＴ細胞に形質導入できることを示唆している。結果はさらに、代謝再プログラム化培地条件が、本明細書で提供されている抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物のｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を選択的に増加させる際に有用であり得ることを示唆している。
実施例２：幹細胞様表現型発現の分析
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現させた形質転換Ｔ細胞の幹細胞様特性に対する代謝再プログラム化培地の影響を評価するために、実施例１（すなわち、ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲまたは対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ）に記載されているようにヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質転換した。次いで、細胞をさらに４～５日（すなわち、６または７日目）増殖させた後、形質導入したＴ細胞の幹細胞性をフローサイトメトリーを使用して評価した。
簡潔には、Ｔ細胞を最初に細胞染色緩衝液で洗浄し、抗ＣＣＲ７で３７℃にて１５分間染色した。次に、Ｔ細胞を再度洗浄し、次いでいくつかの他の抗原に対する抗体（以下に詳述されている）のマスターミックスを細胞に添加し、２５分間暗所で室温でインキュベートした。次いで細胞を細胞染色緩衝液で洗浄し、ＦＯ×Ｐ３染色キット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で製造業者のプロトコールに従って透過処理した。固定後、細胞を事前希釈された正常マウス血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍＭｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ－＃０１５－０００－１２０）及び正常ウサギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ－＃０１１－０００－１２０）で１５分間暗所で室温でブロッキングした。次いで細胞をＴＣＦ７及びｃ－Ｊｕｎの２×抗体カクテルで３０分間暗所で室温で染色した。細胞を完全に洗浄した後、それらをＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用してＣｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにてフローサイトメトリーによって分析した。
以下は、幹細胞性マーカーを評価するために使用した抗体のリストである：ＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ－＃５８－００８８－４２）、ＣＤ４（ＢＤ－＃６１２９３６）、ＣＤ２７（ＢＤ－＃６１２８２９）、ＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ－＃６１２８９６）、ＣＤ２８（ΒｉｏＬｅｇｅｎｄ－＃３０２９３６）、ＣＤ６２Ｌ（ＢＤ－＃７４０３０１）、Ｒ１２抗Ｉｄ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ－＃４８Ｆ６Ｈ５Ｅ１）、ＥＧＦＲ（ΒｉｏＬｅｇｅｎｄ－＃９８８１２）、ＣＤ４５ＲＯ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ－＃５６６１４３）、ＣＤ３９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ－＃３２８２３６）、ＴＣＦ７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ－＃９０６６Ｓ）、ｃ－Ｊｕｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ－＃１５６８３Ｓ）、ＣＣＲ７（ＢＤ－＃５６２３８１）、ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ－＃５６０６７３）、ＬＡＧ－３（Ｔｈｅｒｍｏ－＃６７－２２３９－４２）、ＴＩＭ－３（Ｔｈｅｒｍｏ－＃７８－３１０９－４２）、ＴＩＧＩＴ（Ｔｈｅｒｍｏ－＃４６－９５００－４２）、ＰＤ－１（Ｔｈｅｒｍｏ－＃２５－２７９９－４２）。具体的には、本明細書に記載されているように、「幹細胞様」細胞は、ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ＴＣＦ７＋として定義された。
図４Ａ～４Ｃに示されているように、ＴＣＭ群からの細胞と比べて、ＭＲＭにて抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞はそれらの表現型発現に関してさらに幹細胞様であった。これは一般に、ＣＤ４＋Ｔ細胞がｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたか、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたかにかかわらず、真実である（図４Ａ～４Ｃにおける最後の２つの棒を参照のこと）。同様に、ＭＲＭにて形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞は一般に、ＴＣＭにて形質導入された対応する細胞と比べてさらに幹細胞様であった（少なくともドナー＃１及び＃２に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の場合；図４Ｄ及び４Ｅを参照のこと）。しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なり、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲと比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞がｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入された場合、幹細胞様細胞の一貫した増加が観察された。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＲＭにてｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入された場合、最も高い割合の幹細胞様細胞が観察された。図４Ｇ～４Ｉに示すように、ＴＣＭ群の細胞と比べて、ＭＲＭにて抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物を形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞は、高い比率のナイーブＴ細胞と幹細胞メモリーＴ細胞を含有した（ＣＣＲ７＋及びＣＤ４５ＲＡ＋の発現によって証明される）（それぞれ最初の２つの棒と最後の２つの棒を比較）。一般的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞にｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲで形質導入した場合、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲと比べて、ナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞の比率の増加も観察された（図４Ｇ～４Ｉの２番目と４番目の棒を１番目と３番目の棒と比べること）。同様の結果がＣＤ８＋Ｔ細胞でも観察された（図４Ｊ～４Ｌを参照のこと）。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方では、ＭＲＭにてｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲで形質導入した場合に、一般に最も高い比率のナイーブＴ細胞及び幹細胞メモリーＴ細胞が観察された。
これらの結果は、低分化（すなわち、さらに幹細胞様）である形質導入されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を産生する際の本明細書に記載されている代謝再プログラム化培地の有用性を強調している。また、少なくともＣＤ８＋Ｔ細胞については、結果はさらに、転写因子、例えば、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現がさらに、形質導入されたＴ細胞の幹細胞様特性を改善し得ることを示唆している。
実施例３：表現型及び機能性の分析
抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞に対してＭＲＭが有する効果をさらに評価するために、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質導入し、実施例１に記載されているように増殖させた。６または７日目に、形質導入したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を表現型で（例えば、さまざまな表面マーカー、例えば、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ３の発現）及び機能的に（例えば、一次及び／または慢性抗原刺激後のＩＬ－２及び／またはＩＦＮ－γ産生及び試験管内殺傷）の双方で分析した。
表現型発現
形質導入されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上の表面マーカーの発現をＣｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。
細胞傷害性及びサイトカイン分泌
形質導入されたＴ細胞の細胞傷害活性を試験管内死滅アッセイを使用して測定した。簡潔には、形質導入されたＴ細胞（「エフェクター」）を標的腫瘍細胞（「標的）と１：４、１：１６、１：６４、及び１：１２８のエフェクター：標的比で共培養し、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して６時間ごとに４×の倍率で走査した（標的腫瘍細胞を表す赤色の核の数を追跡することによって細胞傷害活性を測定した）。共培養の２４時間後、上清を異なる条件から収集し、－８０℃で後のサイトカイン分析のために凍結した。次いで細胞を含有する培養プレートを継続周期スキャンのためにＩｎｃｕＣｙｔｅに戻した。
サイトカイン分泌分析のため、先に凍結した上清を解凍し、ある特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－ｇ）のレベルをＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）マルチプレックスプラットフォームを使用して評価し、ＭＳＤＭｅｓｏＳｅｃｔｏｒＳ６００装置で製造業者のプロトコールに従って測定した。
連続再刺激アッセイ
このアッセイでは、形質導入されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞をＡ５４９ＮＬＲ標的細胞で３日または４日毎に順次再刺激した。Ｔ細胞を合計２～４回の刺激について１：１のＥ：Ｔ比で播種した。試験全体を通して３×１０５の形質導入したＴ細胞／ｍＬの密度を維持した。各回の刺激を設定するために、Ｔ細胞を以下のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＡＲ、及びＥＧＦＲｔ（配列番号２４）で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析して、共培養物に存在する形質導入したＴ細胞集団の比率を計算した。上述したように、濃度設定Ｉｎｃｕｃｙｔｅ殺傷アッセイのために各試料のアリコートを保存した。
結果
図５Ａ～５Ｅ，６Ａ～６Ｅ及び７Ａ～７Ｅに示すように、ＴＣＭにて形質導入した対応する細胞と比べて、ＭＲＭにて抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞間の種々の表面マーカー発現レベルにおいて顕著な差異が観察された。ＣＤ８＋Ｔ細胞について同様の結果を観察し（図５Ｆ～５Ｊ、６Ｆ～６Ｊ、及び７Ｆ～７Ｊを参照のこと）、形質導入中に存在するカリウム濃度が形質導入したＴ細胞に対する効果を有し得ることをさらに確認した。
さらに、表現型の差異に加えて、形質導入したＴ細胞にて明確な機能的差異も観察された。図８Ａ～８Ｃに示すように、一次抗原刺激後、ＭＲＭにて形質導入及び培養されたＴ細胞は、ＴＣＭにて形質導入及び培養された対応する細胞と比べてさらに多量のＩＬ－２を産生した。また、先に実施例１にて観察されたように、形質導入したＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質発現の増加もさらに多くのＩＬ－２分泌をもたらした。例えば、ＴＣＭ及びＭＲＭ群の双方において、ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入された対応する細胞と比べて、一次刺激後にさらに高いレベルのＩＬ－２を産生した。したがって、最も多いＩＬ－２産生は通常、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変され、ＭＲＭにて培養されたＴ細胞において観察された。
連続／慢性の抗原刺激後に同様の結果を観察した。図９Ａ～９Ｃに示すように、最終回の抗原刺激後、ＭＲＭにて形質導入及び培養されたＴ細胞は、ＴＣＭ中にて形質導入及び培養された対応する細胞と比べてＩＦＮ－γを産生するそれらの能力を保持した。この場合もまた、ＭＲＭ群からのｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、他の群からの形質導入された細胞と比べてはるかに長くＩＦＮ－γを産生する能力を維持した。複数の抗原刺激の後の形質導入された細胞の細胞傷害性に関して、ＭＲＭにて形質導入及び培養されたＴ細胞は、ＴＣＭ群からの対応する細胞と比べて、はるかに長く腫瘍細胞を殺傷するそれらの能力を維持した（図１０Ａ～１０Ｅ）。
まとめると、ＭＲＭにて培養されたｃ－Ｊｕｎを過剰発現する（例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲ及びｃ－Ｊｕｎ過剰発現を有する）ように改変されたＣＡＲ Ｔ細胞は、慢性抗原刺激後であっても機能的なままである形質導入された幹細胞様Ｔ細胞の生成を可能にする。
実施例４：生体内抗腫瘍効果の分析
上記の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ＭＲＭにて形質導入され培養されたもの）が生体内で機能するかどうかを評価するために、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性をマウス動物モデルで調べた。簡潔には、腫瘍細胞（すなわち、ＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣ細胞株）を、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩをノックアウトしたＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ；ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの脇腹から皮下移植した。腫瘍が約１２５ｍｍ３に達したら、マウスに以下：（ｉ）ＭＲＭにて培養した見せかけ（未形質導入）のＴ細胞、（ｉｉ）対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（ｃ－ＪｕｎなしのＲ１２ ＣＡＲ）を形質導入しＭＲＭにて培養したＴ細胞、及び（３）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（ｃ－ＪｕｎありのＲ１２ ＣＡＲ）を形質導入しＭＲＭにて培養したＴ細胞のいずれかを静脈内注入した。Ｔ細胞は（ａ）５×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞または（ｂ）２．５×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞の２つの用量のいずれかでマウスに投与した。抗腫瘍活性は（ノギスを使用して）腫瘍体積を測定することによって評価し、生存及び処理関連毒性は動物の体重を測定することによって評価した。
図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、見せかけのＴ細胞または対照の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現していない）で処理した動物は双方とも、腫瘍の増殖を制御できず、最終的に腫瘍に屈した（生存データについては図１１Ｅ及び１１Ｆを参照のこと）。対照的に、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現している抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（双方の用量）で処理した動物は、有意に優れた腫瘍制御を示し、実験の全期間を通して生存した（図１１Ａ，１１Ｂ、１１Ｅ及び１１Ｆを参照のこと）。さらに、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現している抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した動物は実験期間全体を通して体重を維持したので、処理に関連する毒性はなかった（図１１Ｃ及び１１Ｄを参照のこと）。改善された抗腫瘍データと一致して、ＭＲＭにて形質導入され培養されたｃ－Ｊｕｎを過剰発現している抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞も生体内で長期持続性を示した（図１２）。
これらの結果は、以前の試験管内データを確認するものであり、本明細書に記載されている方法（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にての形質導入及び培養）が、強力な腫瘍特異的Ｔ細胞の生成に有用であることを実証している。
実施例５：臨床開発
ＲＯＲ１陽性再発性及び／または難治性ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ患者におけるｃ－Ｊｕｎを過剰発現している抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性、ＰＫ、及び抗腫瘍活性を評価するために設計された、ＦＩＨ第１相、単群、非盲検、用量漸増及び拡大、多施設共同試験が実施される。この第１相試験の主要目的は、再発性／難治性ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ患者におけるｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性及び忍容性を評価すること、ならびにｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のＲＰ２Ｄを特定することである。この第１相試験の副次的目的は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価すること、ならびにｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の末梢血試料におけるＰＫ（例えば、増殖及び持続性）を評価することである。
第１相設計案
これは、再発性及び／または難治性ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ患者におけるｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性、ＰＫ、及び抗腫瘍活性を評価するために設計された、単群、非盲検、用量漸増及び拡大、多施設共同試験である。用量漸増段階では、ＴＮＢＣの参加者のみが登録され、拡大段階では、ＴＮＢＣとＮＳＣＬＣの両試験コホートに登録が行われる。
他の適格基準に加えて、免疫組織化学によるＲＯＲ１陽性で、チェックポイント阻害剤及びアブラキサンを含む２ラインの治療が奏功しなかったＴＮＢＣ、またはＥＧＦＲ＋及びＡＬＫ＋疾患患者に対する標的療法を含む２ラインの治療が奏功しなかったＮＳＣＬＣの参加者は、登録する資格がある。すべての適格基準を満たす参加者が登録され、製品の生成を可能にする白血球アフェレーシスを受ける。製品の製造が成功した後、参加者は投与段階に入り、１サイクルの投与を受ける。投与サイクルは、フルダラビン及びシクロホスファミドによる３日間のリンパ球除去化学療法に続いて、プロトコールで定められた用量レベルの１つで細胞製剤を単回ＩＶ投与することを含む。細胞製剤は、医療モニターとの協議後に、臨床的または物流上の状況によりこのタイミングを後日変更する必要がない限り、リンパ球除去化学療法の完了から数日後に投与される。
参加者は、細胞製剤の投与後最大２年間、安全性、疾患状態、追加の抗がん療法、及び生存について経過観察される。ｃ－Ｊｕｎ過剰発現している抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたすべての参加者は、この試験の完了時または中止時にスポンサー付きの長期経過観察（ＬＴＦＵ）試験への登録を依頼される。
実施例６：トランスクリプトーム解析
ＭＲＭがＴ細胞に及ぼす影響を遺伝子レベルで評価するために、連続抗原刺激アッセイ後のＴ細胞に対して単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した（例えば、実施例３を参照のこと）。抗原刺激の前に、Ｔ細胞は（ｉ）ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含まないＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入され、対照培地で培養された（「対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ」）、または（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを含むＲ１２ ＣＡＲ）で形質導入され、ＭＲＭにて培養された（「ｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ」）。連続刺激アッセイのさまざまな時点でＲＮＡを抽出し、幹細胞様遺伝子とＴ細胞終末疲弊（ＴＴＥ）遺伝子が豊富なＴ細胞クラスターを評価した。幹細胞様遺伝子については、Ｃａｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１２６－１３２（２０２１）に記載されている遺伝子セットを使用した。ＴＴＥ遺伝子については、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１１９－１２５（２０２１）に記載されている遺伝子セットを使用した。Ｃａｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．及びＯｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．は双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれます。幹細胞様クラスターの同定は相対的分化度の低いＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を示しており、ＴＴＥクラスターの同定は特に連続抗原刺激後に疲弊した／機能不全のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を示している。
図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、対照培地にて培養された対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞では、連続抗原刺激の７日目と１０日目の双方で幹細胞様遺伝子セットが濃縮されたクラスターの比率が低いままであった一方で、ＴＴＥ遺伝子セットが濃縮されたクラスターの比率はさらなる刺激とともに増加した（例えば、図１３Ｂの７日目と１０日目を比較）。これらの結果は、長期の抗原刺激後、対照培地にて培養された対照のＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞はさらに高度に分化し、疲弊／機能不全に陥いることを示していた。対照的に、ＭＲＭにて培養されたｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は連続抗原刺激の７日目と１０日目の双方で、幹細胞様濃縮クラスターの比率が有意に高く（図１３Ａを参照のこと）、ＴＴＥ濃縮クラスターの比率が低下した（図１３Ｂを参照のこと）ということは、さらに大きな幹細胞様の集団が持続的に存在していることを実証している。
まとめると、上記で提供された結果は、本明細書に記載されている改変された免疫細胞、例えば、ＭＲＭで培養されたｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変された（例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲ及びｃ－Ｊｕｎ過剰発現を伴う）免疫細胞の治療可能性をさらに裏付けるものである。
実施例７：ＭＲＭ及びｃ－Ｊｕｎ過剰発現が抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞に及ぼす影響の追加トランスクリプトームプロファイリング
上記で提供された実施例６に加えて、次に、本明細書に記載されている形質導入したＴ細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）をＨ１９７５異種移植腫瘍担持ＮＳＧＭＨＣｄＫＯマウスに養子移入した後、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。具体的には、腫瘍が約４００ｍｍ３に達した時点で、ＭＲＭにて培養（形質導入及び増殖）されたｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現）（以下のいずれかの用量：１ｅ６、２．５ｅ６、及び５ｅ６細胞／動物）、またはＭＲＭにて培養された対照のＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞 （ｃ－Ｊｕｎを過剰発現していない）（２．５ｅ６細胞／動物）を動物に投与した。Ｔ細胞注入後１３日目に、マウスを屠殺し、切除した腫瘍を、ヒーター付きのｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒとヒト用腫瘍解離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を製造元のプロトコールに従って使用し、酵素混合物中の酵素Ｒの量を２０％に減らして分離した。分離した腫瘍細胞をＦＡＣＳ選別用に処理し、ｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を２．５ｅ６細胞／動物（ｎ＝５）及び５ｅ６細胞／動物（ｎ＝２）で投与した動物、及び対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を２．５ｅ６細胞／動物（ｎ＝５）で投与した動物から選別された生細胞のｍＣＤ４５－ｈＣＤ４５＋Ｔ細胞に対して単一細胞ＲＮＡ配列決定を実行した。
配列決定によるトランスクリプトームとエピトープのＣｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｄｅｘｉｎｇ（ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ）アッセイを使用して、試料を単一細胞ＲＮＡ配列決定用に処理した。ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ解析では、単一細胞ＲＮＡと細胞表面タンパク質を同時に測定することができる。ＦＡＣＳ選別用の蛍光色素結合抗体、ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ用の細胞表面タンパク質に対するＤＮＡ結合Ｔｏｔａｌ－ＳｅｑＣ抗体、及び細胞バーコード化用の固有のハッシュタグ抗体の混合物で細胞を染色した。すべての固有のバーコード付き試料から選別された生細胞のｍＣＤ４５－ｈＣＤ４５＋Ｔ細胞を一緒にプールし、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ単一細胞５’ｖ２試薬キット（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭチップＫに負荷した。単一細胞の捕捉と溶解後、細胞表面タンパク質に結合した抗体に結合したＤＮＡとともにｃＤＮＡを合成及び増幅し、最終的に製造元のプロトコール（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）に従って５’遺伝子発現（ＧＥＸ）及び抗体由来タグ（ＡＤＴ）ライブラリーを生成した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭチップＫの複数のチャネルから調製されたＧＥＸライブラリーとＡＤＴライブラリーは、Ｎｏｖａ Ｓｅｑ ６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎ）を使用して定量し、一緒にプールし、配列決定した。
参照ゲノム及び初期設定パラメータとしてのＧＲＣｈ３８（及び対照Ｒ１２ベクター配列と加えたｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲベクター由来のｃ－Ｊｕｎ配列）と共に１０Ｘ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒソフトウェアバージョン６．１．２（１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、単一細胞ＣＩＴＥ－Ｓｅｑデータを処理した。Ｓｅｕｒａｔパッケージ（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０２１，Ｃｅｌｌ，１８４（１３）：３５７３－３５８７）を使用して、細胞遺伝子マトリックスをさらに処理した。簡潔には、先ず細胞をフィルターにかけ（ミトコンドリアの割合、ｎＣｏｕｎｔ＿ＲＮＡ，ｎＦｅａｔｕｒｅ＿ＲＮＡ、二重ハッシュタグについての閾値を使用）、次にＣＩＴＥ－Ｓｅｑによって測定したＣＤ８及びＣＤ４タンパク質発現に基づいてゲートをかけることによってＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞またはｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した腫瘍からのＣＤ８＋Ｔ細胞を組み合わせて、単一細胞トランスクリプトーム解析を行った。フィルターにかけた細胞－遺伝子マトリックスを、可変特徴選択によって基準化し、調整した。細胞周期の不均一性の影響は、ＳｅｕｒａｔのＣｅｌｌＣｙｃｌｅＳｃｏｒｉｎｇ関数を使用して細胞周期段階スコア（Ｇ２Ｍスコア、Ｓスコア）を計算し、細胞周期段階スコアを回帰することによって補正した。細胞周期の不均一性の影響をさらに最小限に抑えるために、２つの細胞周期段階スコアのいずれかと相関する遺伝子（Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数が０．３を超える）を選択された特徴から除外した。ミトコンドリア、リボソーム、ＴＣＲ、及びＩＧ複合体関連遺伝子も選択された特徴から除外した。次に、フィルターをかけた特徴を使用してＲｕｎＰＣＡ関数によって上位５０のＰＣを計算した。その後、ＳｅｕｒａｔのＲｕｎＵＭＡＰ機能によるＵｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）を使用して、各ドットが細胞を表すように細胞を２次元空間にマッピングして視覚化した。ＳｅｕｒａｔのＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓの機能を使用するクラスター分析に細胞を供し、クラスター識別の精度向上のためにＦｉｎｄＳｕｂＣｌｕｓｔｅｒ機能を使用した。ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ解析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるタンパク質発現なしでＲＮＡ発現を使用して解析（ＵＭＡＰ、クラスター化）が行われたので、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ解析とも呼ばれる。
単一細胞クラスター化解析の詳細については、前の段落及び以前の実施例（例えば、実施例６を参照のこと）に記載された。幹細胞様遺伝子、Ｔ細胞活性化（Ｔａｃｔ）遺伝子、Ｔ細胞前駆疲弊（ＴＰＥ）遺伝子、及びＴ細胞終末疲弊（ＴＴＥ）遺伝子が豊富に含まれるクラスターを評価した。幹細胞様遺伝子については、Ｃａｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１２６－１３２（２０２１）に記載されている遺伝子セットを使用した。Ｔａｃｔ遺伝子、ＴＰＥ遺伝子、ＴＴＥ遺伝子については、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１１９－１２５（２０２１）に記載されている遺伝子セットを使用した。Ｃａｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．及びＯｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．は双方ともその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Ｔａｃｔ、ＴＰＥ、ＴＴＥ及び幹細胞様の遺伝子の非限定的な例は本開示の他の箇所に提供されている。幹細胞様クラスターの同定は、相対的分化度の低いＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を示し、Ｔａｃｔクラスターの同定は腫瘍内に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞が存在することを示す。ＴＰＥクラスターの同定は前駆疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を示し、ＴＴＥクラスターの同定は腫瘍内に疲弊した／機能不全のＣＤ８＋Ｔ細胞が存在することを示す。
図１４Ａ～１４Ｅに示すように、対照のＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した腫瘍から選別したＴ細胞と比べて、ｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した腫瘍から選別したＴ細胞では、ＴＴＥ遺伝子セットが豊富なクラスターの比率が有意に減少し（図１４Ｂ）、ＴＰＥ遺伝子セットが豊富なクラスターの比率が有意に増加した（図１４Ｃ）。ＴＰＥ細胞はＴＴＥ細胞よりも疲弊しておらず、メモリー関連転写物（ＴＣＦ７、ＣＣＲ７、ＩＬ７Ｒ）を発現していることが知られており、活性化によって増殖し、長期持続に関連する再活性化ＣＤ３９－メモリー表現型を獲得する可能性がある。［Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５９６：１１９－１２５（２０２１）］．ＴＴＥクラスターの減少とＴＰＥクラスターの増加は、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が対疲弊に効果的であることを示している。興味深いことに、ｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した腫瘍から選別したＴ細胞では、幹細胞様濃縮クラスターの比率が有意に高く（図１４Ｄ）、幹細胞様集団の存在と高い持続性を示している。ｃ－Ｊｕｎ ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した腫瘍から選別したＴ細胞では、Ｔ細胞活性化が豊富なクラスターの比率も高かった（図１４Ｅ）。
これらの結果は、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が幹細胞様集団の増加にてＭＲＭの効果を上回る追加の利点をもたらすことを示唆しているので、ＭＲＭとｃ－Ｊｕｎの過剰発現の組み合わせの利点を示している。
実施例８：種々の代謝再プログラム化培地で形質導入及び培養された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ保有免疫細胞のさらなる表現型及び機能の分析
本明細書に記載されている改変された細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）に対するＭＲＭが有する効果をさらに評価するために、実施例１に記載されているように、カリウムイオンの濃度が異なるいくつかのＭＲＭを調製した。具体的には、ＭＲＭのさまざまな成分の最終濃度はＮａＣｌ（５５～９０ｍＭ）、ＫＣｌ（４０～８０ｍＭ）、及び浸透圧（約２５０～２６０ｍＯｓｍｏｌ）の範囲であった。次に、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞（３人のドナーから単離）に、ｃ－Ｊｕｎの有無にかかわらず抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質導入し、基本的に実施例１で説明したように、さまざまなＭＲＭまたはＴＣＭを使用して増殖させた。次に、前の実施例（例えば、実施例２及び３）で説明したように、種々の特性、例えば、形質導入効率、ｃ－Ｊｕｎ発現、幹細胞様表現型発現、及び機能（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの産生、及び一次及び／または慢性抗原刺激後の試験管内殺傷）について、形質導入したＴ細胞を分析した。
結果：
以前の実施例（例えば、実施例１を参照のこと）と同様に、形質導入後及び分析前に、形質導入した細胞を、ＴＣＭまたはさまざまなカリウムイオン濃度（すなわち、４０～８０ｍＭの間）を有するさまざまなＭＲＭ製剤のいずれかで合計７日間培養し、増殖させた。
図１５Ａ～１５Ｃに示すように、また前述のデータ（例えば、図３Ａ～３Ｃを参照のこと）と一致して、調べたすべてのＭＲＭについて、ｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ構築物で形質導入し、その後ＭＲＭにて培養したＴ細胞は、ＴＣＭにて形質導入し、培養した対応するＴ細胞と比べてさらに高いｃ－Ｊｕｎ発現を有した。ｃ－Ｊｕｎ発現の最高の増加はカリウム濃度が最も高いＭＲＭにて観察された。
改変した細胞の幹細胞性に関しては、再び前述のデータと一致して（例えば、図４Ａ～４Ｃを参照のこと）、ＴＣＭ群の細胞と比べて、すべてのＭＲＭ製剤にて抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物で形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞は、その表現型の発現に関してさらに幹細胞に類似していた（例えば、図１６Ａ～１６Ｃ及び以下の表１２を参照のこと）。これは一般に、ＣＤ４＋Ｔ細胞がｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたか、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入されたかにかかわらず、真実である。ＣＤ４＋Ｔ細胞の幹細胞性割合は、ＴＣＭ培養Ｔ細胞と比べてＭＲＭ培養細胞で最も高く、幹細胞性に対するＭＲＭのカリウム濃度の用量依存性効果があった（最高カリウム濃度で幹細胞性も最高）。
Figure 2024540099000016
同様に、ＭＲＭにて形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞は一般に、ＴＣＭにて形質導入された対応する細胞と比べてさらに幹細胞様であった（図１７Ａ～１７Ｃ及び表１３を参照のこと）。ＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なり、対照ＣＤ１９ｔ－Ｒ１２ ＣＡＲと比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞がｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入された場合、幹細胞様細胞の一貫した増加が観察された。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＲＭにてｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲで形質導入された場合、カリウム濃度の範囲にわたって最も高い割合の幹細胞様細胞が観察された。ＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に、ＭＲＭ濃度の幹細胞性に対する用量依存性の効果が観察され、カリウム濃度が最も高いＭＲＭにて最も高い幹細胞性が観察された。
Figure 2024540099000017
さまざまなＭＲＭにて形質導入され培養されたＴ細胞の抗原刺激後にサイトカインを産生する能力を評価するために、ｃ－Ｊｕｎを含む（黒四角）及びｃ－Ｊｕｎを含まない（黒丸）形質導入していない（見せかけ、データは示さず）Ｔ細胞、ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞製剤（増殖７日目後）によるＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦαサイトカインの分泌を１：１及び１：４のＥ：ＴにてＡ５４９ＮＬＲがん細胞株とともに２０～２２時間共培養した後に評価した。図１８Ａ～１８Ｉ（エフェクター：ターゲット比１：１）及び１９Ａ～１９Ｉ（エフェクター：ターゲット比１：４）に示すように、ＭＲＭ群由来の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ｃ－Ｊｕｎ過剰発現の有無にかかわらず）は、ＴＣＭで改変され培養されたＴ細胞と比べてさらに高いレベルのＩＬ２、ＴＮＦα（すべてのドナーから）、及びＩＦＮγ（３人のドナーのうち２人から）を産生した。再び、カリウム濃度が最も高いＭＲＭにて最も高いサイトカインの産生が観察された。
改変した細胞の細胞溶解能力を評価するために、基本的に実施例３に記載された試験管内殺傷アッセイを使用した。連続再刺激アッセイの０、７、１４日目のＴ細胞と、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）標的細胞株Ａ５４９をＥ：Ｔ比１：１及び１：４で使用して９６ウェル平底モートアッセイプレートにてＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷アッセイを設定した。腫瘍生存率は、１：１及び１：４のＥ：Ｔ比でのＡ５４９ＮＬＲ標的細胞株との共培養の後、連続再刺激アッセイの０、７、１４日目（連続刺激（ＳＳ）１、３、５）にＴＣＭまたはＭＲＭ（高から低）にて培養した対照Ｒ１２ ＣＡＲ及びｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞製剤から得られたＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）（棒が低いほど細胞傷害性が高い）を使用して算出した。最後の刺激回（１６８時間から３００時間）のデータを示す。
直前に記載されているサイトカインデータと一致して、さまざまなＭＲＭ群の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は一般的にＴＣＭ群の細胞と比べて高い殺傷性を示した。図２０Ａ～２０Ｄに示すように、２回の抗原刺激後、ＭＲＭにて形質導入され、その後培養されたＴ細胞では、対照群の対応するＴ細胞と比べて大幅に改善された細胞溶解活性が観察された。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように改変されていない抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の双方で、改善された細胞溶解活性が観察された。
まとめると、上記の結果はさらに、本明細書で提供されている培養方法の治療上の利点を裏付けるものである。さらに具体的には、上記の結果はさらに、５ｍＭより高い濃度（例えば、４０～８０ｍＭの間）でのカリウムイオンを含む培地の存在下でＴ細胞を（例えば、リガンド結合タンパク質を発現するように、且つｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルを上昇させるように）改変すると、細胞の幹細胞性が大幅に増加し、慢性的な抗原刺激の存在下でさえ細胞が強力な機能活性を示すのを可能にすることを実証している。
Figure 2024540099000018
Figure 2024540099000019
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Claims (174)

  1. 生体外培養または試験管内培養の間に免疫細胞の幹細胞性を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  2. 生体外培養または試験管内培養の間に免疫細胞の収率を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  3. 免疫療法のために免疫細胞の集団を調製する方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  4. 生体外培養または試験管内培養の間に免疫療法のために免疫細胞の収率を高めながら、免疫細胞の幹細胞性を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  5. 生体外または試験管内にて幹細胞様免疫細胞の集団を増殖させる方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  6. 抗原刺激に応答した免疫細胞によるサイトカインの産生を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて前記免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  7. 前記サイトカインがＩＬ－２を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記培養の後、参照免疫細胞と比べて、前記抗原刺激に応答した前記サイトカインの前記産生が、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する、請求項６または７に記載の方法。
  9. 持続的抗原刺激に応答した免疫細胞のエフェクター機能を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  10. 前記免疫細胞が、参照免疫細胞と比べて、抗原刺激アッセイの少なくとも１回の、少なくとも２回の、または少なくとも３回の追加の回の間、エフェクター機能を保持する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記エフェクター機能が、（ｉ）標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激時にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方を含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記サイトカインがＩＦＮ－γを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記培養の後、持続的抗原刺激に応答した前記免疫細胞の前記エフェクター機能が参照免疫細胞と比べて少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上高められる、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 免疫細胞上の１以上のマーカーの表現型発現を変化させる方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記方法。
  15. 前記１以上のマーカーがＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 参照免疫細胞と比べて、前記１以上のマーカーの発現が、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低下する、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 参照免疫細胞と比べて、前記１以上のマーカーの発現が、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する、請求項１４または１５に記載の方法。
  18. 前記参照免疫細胞が、（ｉ）前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変され、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地で培養された対応する免疫細胞、（ｉｉ）前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されておらず、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む前記培地で培養された対応する免疫細胞、（ｉｉｉ）前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されておらず、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地で培養された対応する免疫細胞、または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）までの任意の組み合わせの対応する免疫細胞を含む、請求項８、１０～１３、１６及び１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記免疫細胞が、前記キメラポリペプチド、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、またはその双方をコードする外来性ポリヌクレオチドで改変されているので、前記改変後、前記免疫細胞は、前記対応する免疫細胞と比べて、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇している、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが前記免疫細胞に対して内在性であり、前記免疫細胞が内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を高めることができる転写活性化因子によって改変されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記転写活性化因子が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されているＣａｓタンパク質に結合される、請求項２０に記載の方法。
  22. 免疫療法のために免疫細胞を生体外または試験管内で調製する方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドと（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドとをコードする外来性ポリヌクレオチドで免疫細胞を改変することを含む、前記方法。
  23. 免疫療法のために生体外または試験管内で免疫細胞を調製する方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、（ｉ）内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を高めることができる転写活性化因子と、（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドとによって免疫細胞を改変することを含む、前記方法。
  24. 前記転写活性化因子が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されているＣａｓタンパク質に結合される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記キメラポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが前記免疫細胞の疲弊を防止する、または軽減することができる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 生体外培養及び試験管内培養の間に免疫細胞の幹細胞性を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている、前記方法。
  28. 生体外培養及び試験管内培養の間に免疫細胞の収率を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている、前記方法。
  29. 免疫療法のために免疫細胞の集団を調製する方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている、前記方法。
  30. 免疫療法のための生体外培養及び試験管内培養での増殖の間に免疫細胞の収率を高めながら免疫細胞の幹細胞性を高める方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている、前記方法。
  31. 生体外または試験管内にて幹細胞様免疫細胞の集団を増殖させる方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて免疫細胞を培養することを含み、その際、前記免疫細胞は（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドを発現するように改変されている、前記方法。
  32. さらに、前記キメラポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドで前記免疫細胞を改変することを含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 免疫療法のために生体外または試験管内で免疫細胞を調製する方法であって、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて、（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質と、（ｉｉ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含むキメラポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドで免疫細胞を改変することを含む、前記方法。
  34. 前記キメラポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記免疫細胞がさらに、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記免疫細胞が、前記キメラポリペプチド、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、またはその双方をコードする外来性ポリヌクレオチドで改変されているので、前記改変後、前記免疫細胞は、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇している、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが前記免疫細胞に対して内在性であり、前記免疫細胞が内在性ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現を高めることができる転写活性化因子によって改変されている、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記転写活性化因子が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されているＣａｓタンパク質に結合される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが前記免疫細胞の疲弊を防止する、または軽減することができる、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２６及び３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが、配列番号１２、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む外来性ポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１～２６及び３５～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される核酸配列に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号４に示される核酸配列に対して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号５に示される核酸配列に対して少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  50. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号６に示される核酸配列に対して少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  52. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号７に示される核酸配列に対して少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  54. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号８に示される核酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  56. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号９に示される核酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  58. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号１０に示される核酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
  60. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする前記外来性ポリヌクレオチドが配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び前記キメラポリペプチドが同じベクター上にある、請求項１～２６及び３５～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び前記キメラポリペプチドが異なるベクター上にある、請求項１～２６及び３５～６０のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質がＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質がＲ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質が、前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. ＶＨ ＣＤＲ１は配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. ＶＬ ＣＤＲ１は配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は配列番号６３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６５または６６に記載の方法。
  68. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質のＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＲＯＲ１結合タンパク質のＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質が配列番号８３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記キメラポリペプチドがさらに、膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記ＴＭドメインがＣＤ８ａ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ＴＭドメインがＣＤ２８に由来する、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ＴＭドメインが配列番号７５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記キメラポリペプチドがさらに、前記ＲＯＲ１結合タンパク質と前記ＴＭドメインとの間にスペーサーを含む、請求項７０～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記スペーサーが免疫グロブリンヒンジ領域またはＣＤ８に由来する、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記スペーサーが配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記スペーサーがさらにリンカーを含む、請求項７４～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記リンカーがＧＧＧＳＧ（配列番号４０）を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記キメラポリペプチドがさらに、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＣＤ３δ活性化ドメイン、ＣＤ３ε活性化ドメイン、ＣＤ３η活性化ドメイン、ＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＦＣＥＲ１Ｇ活性化ドメイン、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８活性化ドメイン、ＺＡＰ７０活性化ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ＣＤ３ζ活性化ドメインが配列番号８４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記キメラポリペプチドがさらに、細胞内共刺激ドメインを含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの共刺激ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記細胞内共刺激ドメインが４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号７６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び前記ＲＯＲ１結合タンパク質がリンカーによって連結される、請求項１～２６及び３５～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記切断可能なリンカーがＰ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、フーリン切断部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記キメラポリペプチドがさらに切り詰め型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む、請求項１～８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記ＥＧＦＲｔが配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ＥＧＦＲｔがリンカーによって前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び／または前記ＲＯＲ１結合タンパク質に連結される。請求項９１または９１に記載の方法。
  93. 前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記切断可能なリンカーがＰ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、フーリン切断部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記キメラポリペプチドがさらに、シグナルペプチドを含む、請求項１～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記シグナルペプチドがｈＩｇＫに由来する、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ｈＩｇＫシグナルペプチドが配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記キメラポリペプチドが配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. 前記キメラポリペプチドが配列番号８６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む外来性ポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１～９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記外来性ポリヌクレオチドがベクターを含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記外来性ポリヌクレオチドがさらに、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ユビキチンプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９９または１００に記載の方法。
  102. 前記ＭＮＤプロモーターが、配列番号９２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記カリウムイオンの濃度が、約１０ｍＭより高い、約１５ｍＭより高い、約２０ｍＭより高い、約２５ｍＭより高い、約３０ｍＭより高い、約３５ｍＭより高い、約４０ｍＭより高い、約４５ｍＭより高い、約５０ｍＭより高い、約５５ｍＭより高い、約６０ｍＭより高い、約６５ｍＭより高い、約７０ｍＭより高い、約７５ｍＭより高い、約８０ｍＭより高い、約８５ｍＭより高い、または約９０ｍＭより高い、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記カリウムイオンの濃度が、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、及び約８０ｍＭから成る群から選択される、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記カリウムイオンの濃度が、約３０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約５０ｍＭ～８０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約７０ｍＭ～約８０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約７０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約７０ｍＭの間、約６０ｍＭ～約７０ｍＭの間、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの間、約５０ｍＭ～約６０ｍＭの間、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間である、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記カリウムイオンの濃度が約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、または約７０ｍＭである、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記培地がさらにナトリウムイオンを含む、請求項１～１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記培地がさらにＮａＣｌを含む、請求項１～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記培地が、約１４０ｍＭ未満、約１３０ｍＭ未満、約１２０ｍＭ未満、約１１０ｍＭ未満、約１００ｍＭ未満、約９０ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６０ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、または約４０ｍＭ未満のＮａＣｌを含む、請求項１～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記培地が低張性または等張性である、請求項１～１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記培地が低張性であり、前記カリウムイオン濃度と前記ナトリウムイオン濃度の合計の２倍が２８０ｍＭ未満である、請求項１０７～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記培地が低張性であり、前記カリウムイオン濃度と前記ナトリウムイオン濃度の合計の２倍が２４０ｍＭを超えて２８０ｍＭ未満である、請求項１０７～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  113. 前記培地が等張性であり、前記カリウムイオン濃度と前記ナトリウムイオン濃度の合計の２倍が２８０ｍＭ以上で３００ｍＭ未満である、請求項１０７～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  114. 前記カリウムイオンの濃度が約６０ｍＭであり、前記ＮａＣｌの濃度が約８０ｍＭ未満、約７５ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、約６５ｍＭ未満、または約６０ｍＭ未満である、請求項１０８～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  115. 前記カリウムイオンの濃度が約５５ｍＭであり、前記ＮａＣｌの濃度が約８５ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、約７５ｍＭ未満、約７０ｍＭ未満、または約６５ｍＭ未満である、請求項１０８～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記カリウムイオンの濃度が約５０ｍＭであり、前記ＮａＣｌの濃度が約９０ｍＭ未満、約８５ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、または約７５ｍＭ未満、または約７０ｍＭ未満である、請求項１０８～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  117. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 前記免疫細胞が試験管内または生体外で操作されている、請求項１～１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 前記培地がさらに１以上のサイトカインを含む、請求項１～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記１以上のサイトカインがインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記１以上のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５を含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記培地が約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２を含む、請求項１１９または１２１に記載の方法。
  123. 前記ＩＬ－２の濃度が、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬである、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記ＩＬ－２の濃度が約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬである、請求項１２２または１２３に記載の方法。
  125. 前記ＩＬ－２の濃度が約２００ＩＵ／ｍＬである、請求項１２２～１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記培地が約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２１を含む、請求項１２０及び１２２～１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記ＩＬ－２１の濃度が、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬである、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記ＩＬ－２１の濃度が約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬである、請求項１２６または１２７に記載の方法。
  129. 前記ＩＬ－２１の濃度が約２００ＩＵ／ｍＬである、請求項１２６～１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. 前記培地が約５００ＩＵ／ｍＬ～約１，５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－７を含む、請求項１２０～１２９のいずれか１項に記載の方法。
  131. 前記ＩＬ－７の濃度が、約５００ＩＵ／ｍＬ、約５５０ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約６５０ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約７５０ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約８５０ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約９５０ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，０５０ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，１５０ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，２５０ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，３５０ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，４５０ＩＵ／ｍＬ、または約１，５００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記ＩＬ－７の濃度が約１，０００ＩＵ／ｍＬ～約１，４００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３０または１３１に記載の方法。
  133. 前記ＩＬ－７の濃度が約１，２００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３０～１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 前記培地が約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－１５を含む、請求項１３０～１３３のいずれか１項に記載の方法。
  135. 前記ＩＬ－１５の濃度が、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１７５ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２２５ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約２７５ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約３５０ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約４５０ＩＵ／ｍＬ、または約５００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記ＩＬ－１５の濃度が約１００ＩＵ／ｍＬ～約３００ＩＵ／ｍＬの間である、請求項１３４または１３５に記載の方法。
  137. 前記ＩＬ－１５の濃度が約２００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３４～１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 前記培地がさらに細胞増殖剤を含む、請求項１～１３７のいずれか１項に記載の方法。
  139. 前記細胞増殖剤が、ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、ＡＣＬＹ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がクエン酸ヒドロキシル、ＬＹ２９４００２、ピクチリシブ、ＣＡＬ１０１、ＩＣ８７１１４、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記ＡＫＴ阻害剤が、ＭＫ２２０６、Ａ４４３６５４、ＡＫＴｉ－ＶＩＩＩ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１３９に記載の方法。
  142. 前記培地が、出発免疫細胞と比べて、高い濃度でカリウムイオンを含まない培地にて培養された前記免疫細胞と比べて、及び／または前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない前記免疫細胞と比べて、最終細胞製剤にて
    ａ．低分化及び／または未分化の細胞の数及び／または割合を増やすことができる；
    ｂ．形質導入効率を高めることができる；
    ｃ．幹細胞様免疫細胞を増やすことができる；
    ｄ．生体内生存率を高めることができる；
    ｅ．細胞能力を高めることができる；
    ｆ．細胞疲弊を防ぐことができる；または
    ｇ．それらの任意の組み合わせが可能である、請求項１～１４１のいずれか１項に記載の方法。
  143. 前記培地がさらに、カルシウムイオン、グルコース、またはその双方を含む、請求項１～１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. 前記培地がさらにグルコースを含み、前記グルコースの濃度が約１０ｍＭを超える、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記グルコースの濃度が、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約１９ｍＭ、約１５ｍＭ～約１８ｍＭ、約１５ｍＭ～約１７ｍＭ、約１５ｍＭ～約１６ｍＭ、約１６ｍＭ～約２０ｍＭ、約１６ｍＭ～約１９ｍＭ、約１６ｍＭ～約１８ｍＭ、約１６ｍＭ～約１７ｍＭ、約１７ｍＭ～約２０ｍＭ、約１７ｍＭ～約１９ｍＭ、または約１７ｍＭ～約１８ｍＭである、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記グルコースの濃度が、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、または約２５ｍＭである、請求項１４４に記載の方法。
  147. 前記グルコースの濃度が、約１５．４ｍＭ、約１５．９ｍＭ、約１６．３ｍＭ、約１６．８ｍＭ、約１７．２ｍＭ、または約１７．７ｍＭである、請求項１４４に記載の方法。
  148. 前記培地がさらにカルシウムイオンを含み、前記カルシウムイオンの濃度が約０．４ｍＭを超える、請求項１４３～１４７のいずれか１項に記載の方法。
  149. 前記カルシウムイオンの濃度が、約０．４ｍＭ～約２．８ｍＭ、約０．４ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．１ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．２ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．３ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．４ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．６ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．６ｍＭ～約２．８ｍＭ、約１．７ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．８ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．２～約１．３ｍＭ、約１．２～約１．４ｍＭ、約１．２～約１．５ｍＭ、約１．２～約１．６ｍＭ、約１．２～約１．７ｍＭ、約１．２～約１．８ｍＭ、約１．３～約１．４ｍＭ、約１．３～約１．５ｍＭ、約１．３～約１．６ｍＭ、約１．３～約１．７ｍＭ、約１．３～約１．８ｍＭ、約１．４～約１．５ｍＭ、約１．４～約１．６ｍＭ、約１．４～約１．７ｍＭ、約１．４～約１．８ｍＭ、約１．５～約１．６ｍＭ、約１．５～約１．７ｍＭ、約１．５～約１．８ｍＭ、約１．６～約１．７ｍＭ、約１．６～約１．８ｍＭ、または約１．７～約１．８ｍＭである、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記カルシウムイオンの濃度が、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．１ｍＭ、約２．２ｍＭ、約２．３ｍＭ、約２．４ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約２．９ｍＭ、または約３．０ｍＭである、請求項１４８に記載の方法。
  151. 前記免疫細胞が、前記培養後にＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、またはＴＣＦ７＋、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１５０のいずれか１項に記載の方法。
  152. 前記免疫細胞が医薬組成物及び薬学的に許容される担体にて製剤化される、請求項１～１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. 請求項１～１５２のいずれか１項に記載の方法によって調製される免疫細胞の集団。
  154. 生体内で長期間の存続が可能である免疫細胞の集団であって、前記免疫細胞は（ｉ）５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含む培地にて培養されており、且つ（ｉｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されている、前記免疫細胞の集団。
  155. 投与を必要とする対象に投与されると、前記対象にて少なくとも約１ヵ月間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約３ヵ月間、少なくとも約４ヵ月間、少なくとも約５ヵ月間、または少なくとも約６ヵ月間存続することが可能である、請求項１５４に記載の免疫細胞の集団。
  156. 請求項１５３～１５５のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  157. 腫瘍の治療を必要とする対象にて腫瘍を治療する方法であって、前記対象に請求項１５３～１５５のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団、または請求項１５６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  158. 前記腫瘍が、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、腎癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（胃）癌、消化管癌、卵巣癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１５７または１５８に記載の方法。
  160. 前記投与の後、前記腫瘍のサイズ（腫瘍サイズ）が参照腫瘍サイズと比べて減少する、請求項１５６～１５９のいずれか１項に記載の方法。
  161. 前記参照腫瘍サイズが、（ｉ）前記投与の前の前記腫瘍サイズ、（ｉｉ）前記投与を受けなかった（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地にて形質導入され、培養された対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象における前記腫瘍サイズ、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方を含む、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記参照腫瘍サイズと比べて、前記腫瘍サイズが少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少する、請求項１６０または１６１に記載の方法。
  163. 前記投与の後、前記対象の生存期間が、参照生存期間と比べて増える、請求項１５７～１６２のいずれか１項に記載の方法。
  164. 前記参照生存期間が、前記投与を受けなかった（例えば、５ｍＭよりも高い濃度でカリウムイオンを含まない培地にて形質導入され、培養された対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象の生存期間を含む、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記参照生存期間と比べて、前記生存期間が少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約１ヵ月、少なくとも約２ヵ月、少なくとも約３ヵ月、少なくとも約４ヵ月、少なくとも約５ヵ月、少なくとも約６ヵ月、少なくとも約７ヵ月、少なくとも約８ヵ月、少なくとも約９ヵ月、少なくとも約１０ヵ月、少なくとも約１１ヵ月、または少なくとも約１年増える、請求項１６３または１６４に記載の方法。
  166. さらに、少なくとも１つの追加の治療剤を前記対象に投与することを含む、請求項１５７～１６５のいずれか１項に記載の方法。
  167. 前記少なくとも１つの追加の治療剤が、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害薬、免疫に基づく治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６６に記載の方法。
  168. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６７に記載の方法。
  169. ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞及び前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、その際、（ｉ）改変された前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性であり；（ｉｉ）改変された前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性であり、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方である、前記組成物。
  170. ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、前記細胞が、（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、その際、改変された前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性である、前記組成物。
  171. ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、前記細胞が、（ａ）ＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチドを発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、その際、改変された前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも約２０パーセントはＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡについて表面陽性である、前記組成物。
  172. 免疫細胞の集団を含む組成物であって、前記細胞は（ａ）操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、前記細胞の少なくとも約４％は前駆疲弊Ｔ細胞である、前記組成物。
  173. 免疫細胞の集団を含む組成物であって、前記細胞は（ａ）操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、前記細胞の約４％～約６％は前駆疲弊Ｔ細胞である、前記組成物。
  174. 免疫細胞の集団を含む組成物であって、前記細胞は（ａ）操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、且つ（ｂ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されていない対応する免疫細胞と比べて前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが上昇するように改変されており、前記細胞の少なくとも約４％は前駆疲弊Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも約４％は幹細胞様Ｔ細胞である、前記組成物。
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