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JP2017031216A - 細胞増殖関連疾患のための方法および組成物 - Google Patents

細胞増殖関連疾患のための方法および組成物 Download PDF

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JP2017031216A JP2016215133A JP2016215133A JP2017031216A JP 2017031216 A JP2017031216 A JP 2017031216A JP 2016215133 A JP2016215133 A JP 2016215133A JP 2016215133 A JP2016215133 A JP 2016215133A JP 2017031216 A JP2017031216 A JP 2017031216A
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Abstract

【課題】細胞増殖関連疾患のための方法および組成物の提供。
【解決手段】ネオ活性変異体を有する対象を治療および評価する方法が記載される。例えば、ｉ）２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨの存在、またはｉｉ）２ＨＧの上昇したレベルを特徴とする細胞増殖関連疾患を有する対象を治療する方法を提供し、対象は、２−ヒドロキシグルタル酸尿症を有しないか、または２−ヒドロキシグルタル酸尿症を有すると診断されていない対象であり、方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の、対象の２ＨＧの上昇したレベルを減少させる治療薬、２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨの阻害剤、対象の前記上昇したレベルの２ＨＧの望ましくない効果を改善する治療薬、または２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨをコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸に基づく阻害剤のうちの１つ以上を投与し、それによって、対象を治療することを含む。
【選択図】なし

Description

優先権の主張
本出願は、２００９年３月１３日に出願の米国特許出願第６１／１６０２５３号、２００９年３月１６日に出願の米国特許出願第６１／１６０６６４号、２００９年４月２８日に出願の米国特許出願第６１／１７３５１８号、２００９年５月２２日に出願の米国特許出願第６１／１８０６０９号、２００９年６月２５日に出願の米国特許出願第６１／２２０５４３号、２００９年７月２２日に出願の米国特許出願第６１／２２７６４９号、２００９年７月２９日に出願の米国特許出願第６１／２２９６８９号、２００９年１０月２１日に出願の米国特許出願第６１／２５３８２０号、および２００９年１２月４日に出願の米国特許出願第６１／２６６９２９号の優先権を主張し、それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、細胞増殖関連疾患、例えば、癌等の増殖性疾を評価および治療するための方法および組成物に関する。
ＩＤＨとしても知られているイソクエン酸脱水素酵素は、クエン酸回路に関与する酵素である。それは、回路の第３のステップ、つまりＮＡＤ＋をＮＡＤＨに転換する一方で、アルファケトグルタル酸（α−ケトグルタル酸またはα−ＫＧ）およびＣＯ２を産生する、イソクエン酸の酸化的脱炭酸反応を触媒する。これは、オキサロコハク酸塩（ケトン）へのイソクエン酸（第２級アルコール）の酸化、続いて、ケトンへのカルボキシル基ベータの脱炭酸化を含む２段階過程であり、アルファケトグルタル酸を形成する。酵素の別のアイソフォームは、同一の反応を触媒するが、しかしながら、この反応は、クエン酸回路に関連せず、細胞質ゾル、ならびにミトコンドリアおよびペルオキシソーム中で実行され、かつＮＡＤ＋の代わりに共同因子としてＮＡＤＰ＋を使用する。
本明細書に開示の方法および組成物は、ネオ活性変異体酵素、例えば、変異体代謝経路酵素によって産生されるネオ活性産物による疾病において果たされる役割に関する。本発明者は、とりわけ、ＩＤＨ変異体と関連するネオ活性、およびネオ活性の産物が癌細胞で著しく上昇し得ることを見出した。疾患、例えば、代謝経路酵素中のネオ活性、例えば、ＩＤＨネオ活性を特徴とする細胞増殖関連疾患を有するか、またはその危険性のある対象を治療するための方法および組成物、ならびに評価する方法が本明細書に開示される。そのような疾患には、例えば、癌等の増殖性疾患が含まれる。本発明者は、疾患、例えば、ネオ活性、ネオ活性タンパク質、ネオ活性ｍＲＮＡ、またはネオ活性変異の特徴がある癌の治療のための新規治療薬を見出し、本明細書に開示した。実施形態において、治療薬は、ネオ活性もしくはネオ活性産物のレベルを低下させるか、またはネオ活性産物の効果を改善する。本明細書に記載の方法は、ネオ活性遺伝子型もしくは表現型に基づいて、対象の同定、または対象への治療の同定も可能にする。この評価は、対象と、例えば、対象の選択、治療、または両方が、ネオ活性遺伝子型もしくは表現型の分析に基づく治療との最適適合を可能にし得る。例えば、本明細書に記載の方法は、新規化合物、例えば、本明細書に開示の新規化合物、または既知の化合物、例えば、選択された疾患に以前は推奨されなかった既知の化合物の投与を含む治療計画の選択を可能にすることができる。実施形態において、既知の化合物は、ネオ活性もしくはネオ活性産物のレベルを低下させるか、またはネオ活性産物の効果を改善する。本明細書に記載の方法は、新規化合物もしくは既知の化合物、または代謝経路酵素中の体細胞ネオ活性変異を特徴とする疾患を有する対象には以前は推奨されなかった化合物の組み合わせの選択および投与の基準を導き、かつ提供し得る。ネオ活性遺伝子型もしくは表現型がバイオマーカーの機能を果たすことができる実施形態において、その存在は、新規または以前から知られている化合物のいずれでも、代謝経路酵素中の体細胞ネオ活性変異を特徴とする疾患を治療するために、投与されるべきであることを示している。２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の産生をもたらすネオ活性を有するＩＤＨ１のネオ活性変異体および関連疾患が、本明細書で詳細に説明される。それらは例示的であるが限定的ではなく、本発明の実施形態の例である。
理論によって拘束されることを望むものではないが、ネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの産生と除去との間のバランスは、疾病において重要であると考えられる。他の過程、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ、例えば、２ＨＧデヒドロゲナーゼによる２ＨＧの酵素分解の事例がネオ活性産物のレベルを低下させる一方で、ネオ活性変異体は、異なる変異の異なる程度で、ネオ活性産物のレベルを増加させる。誤ったバランスが疾病に関連付けられる。実施形態では、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２中のネオ活性変異の最終結果が、罹患細胞中のネオ活性産物、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルをもたらす。
したがって、一態様では、本発明は、細胞増殖関連疾患、例えば、望ましくない細胞増殖、例えば、癌または前癌疾患を特徴とする疾患を有する対象を治療する方法を特色とする。細胞増殖関連疾患は、代謝経路酵素中の体細胞変異を特徴とする。変異は、ネオ活性産物の産生をもたらすネオ活性に関連する。方法は、本明細書に記載の治療的に有効な量の治療薬、例えば、選択的または変異体細胞対立遺伝子によってコードされるネオ活性産物のレベルを減少させる治療薬、例えば、代謝経路酵素（ネオ活性酵素）のネオ活性の阻害剤、ネオ活性産物の望ましくない効果を改善する治療薬、核酸に基づく阻害剤、例えば、ネオ活性酵素ｍＲＮＡを標的とするｄＲＮＡを対象に投与することを含み、
それによって、対象を治療する。
ある実施形態では、対象は、２−ヒドロキグルタル酸尿症を有しないか、またはそれを有すると診断されていない対象である。
ある実施形態では、対象は、細胞増殖関連疾患、例えば、選択的または変異体対立遺伝子によってコードされる代謝経路酵素のネオ活性を特徴とする癌を有する。
ある実施形態では、対象は、細胞増殖関連疾患、例えば、選択的または変異体対立遺伝子によってコードされる代謝経路酵素のネオ活性によって形成される産物を特徴とする癌を有する。
一実施形態では、代謝経路は、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路から選択される。
ある実施形態では、治療薬は、本明細書に記載の治療薬である。
ある実施形態では、方法は、選択的または変異体対立遺伝子、ネオ活性、またはネオ活性産物の上昇したレベルを特徴とする癌を有することに基づいて、対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、ネオ活性の産物、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、２−ヒドロキシグルタル酸（本明細書で２ＨＧと称される場合もある）、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸（本明細書でＲ−２ＨＧと称される場合もある）についての存在、分布、またはレベルを決定するために、選択的または変異体対立遺伝子、例えば、画像分析および／または分光分析、例えば、磁気共鳴に基づく分析、例えば、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）および／またはＭＲＳ（磁気共鳴分光法）によってコードされるタンパク質のネオ活性によって形成される産物を特徴とする癌を有することに基づいて、対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、（例えば、ＤＮＡ配列決定、免疫分析、または酵素活性のアッセイによる）例えば、対象、または試料、例えば、組織、産物（例えば、糞、汗、精液、呼気、毛髪、もしくは爪）、またはそれらからの体液（例えば、血液（例えば、血漿）、尿、リンパ液、もしくは脳脊髄液、または本明細書に開示の調達される他の試料）の直接検査もしくは評価によって確認もしくは判定すること、または癌が選択的または変異体対立遺伝子を特徴とする、対象についてのそのような情報を受信することを含む。
ある実施形態では、方法は、例えば、対象、ネオ活性のレベル、またはネオ活性の産物のレベルの直接検査もしくは評価によって確認もしくは判定すること、または対象についてのそのような情報を受信することを含む。ある実施形態では、ネオ活性の産物、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、Ｒ−２ＨＧについての存在、分布、またはレベルは、例えば、画像法、例えば、磁気共鳴に基づく方法によって非侵襲的に判定される。
ある実施形態では、方法は、第２の抗癌剤または治療を対象に投与すること、例えば、化学療法剤の外科的除去もしくは投与を含む。
別の態様では、本発明は、細胞増殖関連疾患、例えば、前癌疾患または癌を有する対象を治療する方法を特色とする。ある実施形態では、対象は、２−ヒドロキグルタル酸尿症を有しないか、またはそれを有すると診断されなかった。細胞増殖関連疾患は、体細胞対立遺伝子、例えば、事前選択的対立遺伝子、または変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、ネオ活性を有する酵素をコードするＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の変異体対立遺伝子を特徴とする。
実施形態では、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性である。本明細書で使用される、アルファヒドロキシネオ活性は、アルファケトンをアルファヒドロキシに転換する能力を指す。実施形態では、アルファヒドロキシネオ活性は、還元共同因子、例えば、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを進める。実施形態では、アルファヒドロキシルネオ活性は、２ＨＧネオ活性である。本明細書で使用される、２ＨＧネオ活性は、アルファケトグルタル酸を２−ヒドロキシグルタル酸（本明細書で２ＨＧと称される場合もある）、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸（本明細書でＲ−２ＨＧと称される場合もある）に転換する能力を指す。実施形態では、２ＨＧネオ活性は、還元共同因子、例えば、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを進める。ある実施形態では、ネオ活性酵素、例えば、アルファヒドロキシル、例えば、２ＨＧ、ネオ活性酵素は、１つより多い基質、例えば、１つより多いアルファヒドロキシ基質に作用することができる。
方法は、本明細書に記載の種類の有効量の治療薬を対象に投与し、それによって、対象を治療することを含む。
ある実施形態では、治療薬は、ネオ活性産物、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルを低下させることをもたらす。
ある実施形態では、方法は、ネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を低下させる治療薬を投与することを含む。ある実施形態では、方法は、変異体ＩＤＨタンパク質、例えば、ネオ活性を有する変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２タンパク質、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の阻害剤を投与することを含む。
ある実施形態では、治療薬は、表２４ａもしくは表２４ｂからの化合物、または本明細書に記載の式（Ｘ）または式（ＸＩ）の構造を有する化合物を含む。
ある実施形態では、治療薬は、核酸に基づく治療薬、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡを含む。
ある実施形態では、治療薬は、阻害剤、例えば、ポリペプチド、ペプチド、もしくは小分子（例えば、１，０００ダルトン未満の分子）、またはＩＤＨ１変異体または野生型サブユニットに結合し、例えば、二量体、例えば、変異体ＩＤＨ１サブユニットのホモ二量体、または変異体および野生型サブユニットのヘテロ二量体の形成を阻害することによってネオ活性を阻害するアプタマーである。ある実施形態では、阻害剤は、ポリペプチドである。ある実施形態では、ポリペプチドは、変異体酵素のネオ活性に対して、ドミナントネガティブの機能を果たす。ポリペプチドは、全長ＩＤＨ１またはその断片に相当し得る。ポリペプチドは、野生型ＩＤＨ１の対応する残基と同一である必要はないが、実施形態では、野生型ＩＤＨ１と少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５％の相同性を有する。
ある実施形態では、治療薬は、例えば、変異体酵素に結合するために競合することによって、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、もしくは二価金属イオン、例えば、Ｍｇ２＋もしくはＭｎ２＋に対するＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ネオ活性変異体タンパク質の親和性を減少させるか、またはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、もしくは二価金属イオン、例えば、Ｍｇ２＋もしくはＭｎ２＋のレベルまたは有効性を減少させる。ある実施形態では、酵素は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋をＣａ２＋に置換することによって阻害される。
ある実施形態では、治療薬は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性のレベルを低下させる阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異体のネオ活性を有する変異体の産物のレベルを低下させる阻害剤であり、例えば、それは、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルを低下させる。
ある実施形態では、治療薬は、
例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を特異的に阻害するか、または
ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の野生型活性およびネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の両方を阻害する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、それが、
例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を特異的に阻害するか、または
ＩＤＨ１、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の野生型活性およびネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の両方を阻害するということに基づいて選択される阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質またはｍＲＮＡの量を低下させる阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２ ｍＲＮＡと直接相互作用、例えば、それが結合する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２タンパク質と直接相互作用、例えば、それが結合する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、例えば、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２タンパク質と相互作用、例えば、結合することによって、ネオ活性酵素活性の量を低下させる阻害剤である。ある実施形態では、阻害剤は、抗体以外である。
ある実施形態では、治療薬は、小分子であり、かつ例えば、変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２ ｍＲＮＡ（例えば、変異体ＩＤＨ１ ｍＲＮＡ）と相互作用、例えば、結合する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質と直接相互作用、例えば、結合するか、または変異体ＩＤＨ ｍＲＮＡ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ ｍＲＮＡと直接相互作用、例えば、結合するかのいずれかの阻害剤である。
ある実施形態では、ＩＤＨは、ＩＤＨ１であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ１中の変異は、残基１３２で、例えば、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｇ、Ｒ１３２Ｌ、またはＲ１３２Ｖ（例えば、Ｒ１３２ＨもしくはＲ１３２Ｃ）の変異を含む。
ある実施形態では、ＩＤＨは、ＩＤＨ２であり、ＩＤＨ２変異体のネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２中の変異は、残基１７２、例えば、Ｒ１７２Ｋ、Ｒ１７２Ｍ、Ｒ１７２Ｓ、Ｒ１７２Ｇ、またはＲ１７２Ｗでの変異を含む。
本明細書に記載の治療法は、ネオ活性遺伝子型または表現型を評価することを含み得る。試料を入手および分析する方法、ならびに本明細書の他の箇所、例えば、「試料および／または対象を評価する方法」の見出しの項に記載される対象における生体内分析を、この方法と組み合わせることができる。
ある実施形態では、方法は、治療の前または後に、細胞増殖関連疾患の成長、大きさ、重量、侵襲性、病期、または他の表現型を評価することを含む。
ある実施形態では、方法は、治療の前または後に、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、アルファヒドロキシルネオ活性遺伝子型、例えば、２ＨＧ遺伝子型、またはアルファヒドロキシネオ活性表現型、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ表現型を評価することを含む。アルファヒドロキシル、例えば、２ＨＧ遺伝子型を評価することは、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有するＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有する本明細書に開示の変異が存在するかを判定することを含み得る。本明細書で使用される、アルファヒドロキシネオ活性表現型、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ表現型は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベル、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性のレベル、またはアルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性（もしくは対応するｍＲＮＡ）を有する変異体酵素のレベルを指す。評価は、本明細書に記載の方法により得る。
ある実施形態では、対象は、細胞増殖関連疾患がアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧを特徴とするかを判定するために、治療前または後に評価され得る。
ある実施形態では、対象における癌、例えば、神経膠腫または脳腫瘍は、これがアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在を特徴とするかを判定するために、例えば、治療前または後に、画像分析および／または分光分析、例えば、磁気共鳴に基づく分析、例えば、ＭＲＩおよび／またはＭＲＳによって分析され得る。
ある実施形態では、方法は、例えば、対象もしくは対象からの試料の直接検査または評価によって評価するか、または対象、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子型、またはアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、対象、例えば、細胞、例えば、細胞増殖関連疾患を特徴とする癌細胞のＲ−２ＨＧ表現型についてのそのような情報を受信することを含む。（本明細書の他の箇所により詳細に記載されるように、評価は、例えば、ＤＮＡ配列決定、免疫分析、分光分析、例えば、磁気共鳴に基づく分析、例えば、ＭＲＩおよび／またはＭＲＳ測定からのアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルの評価、血清もしくは脊髄液分析等の試料分析で、または外科器具の分析、例えば、質量分析で行われ得る。）実施形態では、この情報は、増殖関連疾患、例えば、癌が、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧを特徴とすることを判定または確認するために使用される。実施形態では、この情報は、細胞増殖関連疾患、例えば、癌が、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、変異を有するＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕ（例えば、残基１３２でのＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕ、より具体的には、残基１７２で変異を有するＨｉｓもしくはＣｙｓ、またはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｇ、またはＷを特徴とすることを判定または確認するために使用される。
ある実施形態では、対象は、例えば、対象を選択、診断、予後診断するために、阻害剤を選択するために、あるいは治療に対する応答もしくは疾病の進行を評価するために、治療が開始する前および／または開始した後に、本明細書に記載の方法、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルの分析によって評価または監視される。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＣＮＳの腫瘍、例えば、神経膠腫、白血病、例えば、ＡＭＬもしくはＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬもしくはＴ−ＡＬＬ、前立腺癌、線維肉腫、傍神経節腫、または骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群（例えば、Ｂ−ＡＬＬもしくはＴ−ＡＬＬ、前立腺癌、または骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群）であり、評価は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルの評価、またはＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、変異体タンパク質のネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の存在、分布、またはレベルの評価である。
ある実施形態では、疾患は、固形腫瘍以外である。ある実施形態では、疾患は、診断または治療時に壊死部分を有しない腫瘍である。ある実施形態では、疾患は、診断または治療時に、腫瘍細胞の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％が、ＩＨＤ、例えば、またはＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、２ＨＧネオ活性を有する変異を担持する腫瘍である。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、癌、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする、本明細書に記載の癌である。ある実施形態では、腫瘍は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの望ましくない（すなわち、増加した）レベルを特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＣＮＳ、例えば、神経膠腫の腫瘍であり、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。神経膠腫には、星状腫瘍、希突起膠腫、乏突起星細胞系腫瘍、未分化星状細胞腫、およびグリア芽腫が含まれる。ある実施形態では、腫瘍は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ）、またはＹａｎらに記載される任意の残基をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓを有するＩＤＨ１をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＳｅｒを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＡ（もしくはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）、またはヌクレオチド位置３９５でＡ（もしくはＧ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、Ｃ３９４Ａ、Ｃ３９４Ｇ、Ｃ３９４Ｔ、Ｇ３９５Ｃ、Ｇ３９５Ｔ、またはＧ３９５Ａ変異、具体的には、配列番号５の配列によるＣ３９４ＡまたはＧ３９５Ａ変異である。
ある実施形態では、方法は、神経膠腫を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、より具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ、またはＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、より具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ、またはＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、線維肉腫または傍神経節腫を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、線維肉腫または傍神経節腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、線維肉腫または傍神経節腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、限局性または転移性前立腺癌、例えば、前立腺腺癌であり、例えば、癌は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。
例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２５：３５３−３５５に記載される任意の残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ）をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（もしくはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）、またはヌクレオチド位置３９５でＡ（もしくはＧ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４ＴまたはＧ３９５Ａ変異である。
ある実施形態では、方法は、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２でＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子配列番号８）を特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、ＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、前立腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、血液癌、例えば、白血病、例えば、ＡＭＬまたはＡＬＬであり、血液癌は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、急性リンパ芽球性白血病（例えば、成人型または小児型）であり、例えば、急性リンパ芽球性白血病（本明細書でＡＬＬと称される場合もある）は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ＡＬＬは、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬであり得る。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、２アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２（配列番号８）で、Ａｒｇ以外を有するＩＤＨ１である。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇらに記載される任意の残基、より具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（またはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４Ｔ変異である。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬの対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、急性骨髄性白血病（例えば、成人型または小児型）であり、例えば、急性骨髄性白血病（本明細書でＡＭＬと称される場合もある）は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２（配列番号８）で、Ａｒｇ以外を有するＩＤＨ１である。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇらに記載される任意の残基をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＣｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、より具体的には、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（またはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４Ｔ変異である。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、より具体的には、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする急性骨髄性リンパ芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２でＣｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、より具体的には、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする癌に基づいて、急性骨髄性リンパ芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、急性骨髄性リンパ芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、ＮＲＡＳまたはＮＰＭｃ遺伝子中の変異の存在に関して対象を評価することをさらに含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、骨髄異形成または骨髄異形成症候群であり、例えば、骨髄異形成または骨髄異形成症候群は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を有することを特徴とする。ある実施形態では、疾患は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２（配列番号８）で、Ａｒｇ以外を有するＩＤＨ１である。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列によるＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇらに記載される任意の残基、より具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（またはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４Ｔ変異である。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、より具体的には、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２でＣｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、より具体的には、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする神経膠腫である。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、より具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、神経膠腫を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）でＬｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ、より具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒ、またはＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ、より具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒ、またはＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性と関連しているＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌である。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、より具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬもしくはＴ−ＡＬＬである。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とするＡＭＬである。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、より具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、もしくはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＧｌｙを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、ＡＭＬを有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、またはＭｅｔ、より具体的には、ＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２でＬｙｓ、Ｇｌｙ、またはＭｅｔ、より具体的には、ＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、ＡＭＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、ＡＭＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群である。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、より具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＧｌｙを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、またはＭｅｔ、特定の実施形態では、ＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、またはＭｅｔ、特定の実施形態では、ＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、ネオ活性の産物は、代謝産物の機能を果たす２ＨＧ（例えば、Ｒ−２ＨＧ）である。別の実施形態では、ネオ活性の産物は、毒素、例えば、発癌物質の機能を果たす２ＨＧ（例えば、Ｒ−２ＨＧ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、癌を治療する他の既知の方法と比較して、低下した副作用をもたらし得る。
本明細書に記載の対象評価の治療薬および方法を、他の治療法、例えば、当分野で既知の治療法と組み合わせることができる。
ある実施形態では、方法は、対象に、第２の治療、例えば、外科的除去、照射、または化学療法剤の投与、例えば、アルキル化剤の投与を提供することを含む。第２の治療の投与（または治療レベルの確立）は、阻害剤での治療の開始の前（もしくは治療レベルの確立の前）に始まるか、阻害剤での治療の開始の後（もしくは治療レベルの確立の後）に始まるか、または例えば、両方の治療レベルを同時に達成するために、阻害剤と同時に投与され得る。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＣＮＳ腫瘍、例えば、神経膠腫であり、第２の治療は、放射線療法、アルキル化剤、例えば、テモゾロミド、例えば、Ｔｅｍｏａｄｅｒ（登録商標）、もしくはＢＣＮＵ、またはＨＥＲ１／ＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤、例えば、エルロチニブ、例えば、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）のうちの１つ以上の投与を含む。
第２の治療、例えば、神経膠腫については、脳内にＢＣＮＵまたはカルムスチンの移植、例えば、Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標）ウエハーの移植を含み得る。
第２の治療、例えば、神経膠腫については、イマチニブ、例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）の投与を含み得る。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、前立腺癌であり、第２の治療は、アンドロゲン除去、微小管安定剤、例えば、ドセタキソール、例えば、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）の投与、またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ミトキサントロンの投与のうちの１つ以上を含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬであり、第２の治療は、
ステロイド、微小管重合、例えば、ビンクリスチンの阻害剤、アスパラギン、例えば、アスパラギナーゼの有効性を低下させる薬剤、アントラサイクリン、または代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート、例えば、髄腔内メトトレキサート、もしくは６−メルカプトプリンのうちの１つ以上の投与を含む誘導期治療、
誘導期に関して上に記載の薬物、代謝拮抗薬、例えば、グアニン類似体、例えば、６−チオグアニン、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、代謝拮抗薬、例えば、ＡｒａＣもしくはシタラビン、またはトポイソメラーゼＩの阻害剤、例えば、エトポシドのうちの１つ以上の投与を含む強化期治療、または誘導もしくは強化期治療に関して上に記載の薬物のうちの１つ以上の投与を含む維持期治療のうちの１つ以上を含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＡＭＬであり、第２の治療は、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤、例えば、ダウノルビシン、イダルビシン、トポテカン、もしくはミトキサントロン、トポイソメラーゼＩの阻害剤、例えば、エトポシド、または代謝拮抗薬、例えば、ＡｒａＣまたはシタラビンのうちの１つ以上の投与を含む。
別の態様では、本発明は、対象、例えば、２−ヒドロキグルタル酸尿症を有しないか、またはそれを有すると診断されていない対象を評価、例えば、診断する方法を特色とする。方法は、対象のネオ活性遺伝子型または表現型に関連するパラメータを分析、例えば、
ａ）ネオ活性産物、例えば、アルファヒドロキシネオ活性の産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベル、例えば、産物、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベル（本明細書で使用される、アルファヒドロキシネオ活性の産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ、もしくは同様の用語の増加したレベル、例えば、ネオ活性産物もしくはネオ活性産物の増加したレベルは、基準、例えば、ＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異を欠如するそれ以外は同様の細胞中、または変異を有しない対象からの組織もしくは産物中で見られるレベルと比較して、増加したことを意味し（本明細書で使用されるアルファヒドロキシルネオ活性の産物のレベルについて言及される増加および上昇したという用語は、互換的に使用される）、
ｂ）ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体タンパク質のネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の存在、分布、もしくはレベル、
ｃ）ネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、もしくは対応するＲＮＡを有するネオ活性変異体タンパク質、例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体タンパク質の存在、分布、もしくはレベル、または
ｄ）対象からの細胞増殖関連疾患を特徴とする細胞中で、ネオ活性を与える選択的体細胞対立遺伝子もしくは変異、例えば、ネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有するタンパク質をコードするＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、例えば、本明細書に開示の対立遺伝子の存在のうちの１つ以上を分析すること、を含み、
それによって、対象を評価する。
ある実施形態では、分析することは、ａ〜ｄのうちの１つ以上に関するデータまたは情報を提供するために、手順、例えば、試験を実行、例えば、試料、対象、または分析で使用されるデバイスもしくは試薬において物理的変化をもたらすか、またはデータの画像見本の形成をもたらす方法を実行することを含む。本明細書の他の箇所、例えば、「試料および／または対象を評価する方法」の見出しの項に記載される対象における試料ならびに生体内分析を入手および分析する方法を、この方法と組み合わせることができる。別の実施形態では、分析することは、別の団体からのそのような試験からのデータまたは情報を受信することを含む。ある実施形態では、分析することは、別の団体からのそのような試験からのデータまたは情報を受信することを含み、方法は、データまたは情報に応答して、対象に治療を投与することを含む。
本明細書に記載されるように、評価を、多数の適用、例えば、診断、予後診断、病期分類、治効の判定、特許選択、または薬物選択のために使用することができる。
したがって、ある実施形態では、方法は、例えば、ａ〜ｄの分析のうちの１つ以上に応答して、
対象を診断すること、例えば、細胞増殖関連疾患、例えば、望ましくない細胞増殖、例えば、癌を特徴とする疾患、または前癌疾患を有する対象を診断することと、
対象を病期分類すること、例えば、細胞増殖関連疾患、例えば、望ましくない細胞増殖、例えば、癌を特徴とする疾患、または前癌疾患の病期を判定することと、
対象に予後診断を提供すること、例えば、細胞増殖関連疾患、例えば、望ましくない細胞増殖、例えば、癌を特徴とする疾患、または前癌疾患に関する予後診断を提供することと、
治療の効力、例えば、化学療法剤、照射、または手術の効力を判定することと、
治療薬、例えば、本明細書に記載の阻害剤での治療の効力を判定することと、
細胞増殖関連疾患、例えば、望ましくない細胞増殖、例えば、癌を特徴とする疾患、または前癌疾患の治療において対象を選択することとをさらに含む。選択は、ネオ活性の低下の必要性、またはネオ活性に関連するか、もしくは由来している症状の改善の必要性に基づき得る。例えば、対象が、細胞増殖関連疾患、例えば、例えば、癌、もしくはアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする前癌疾患を有すると判定されるか、またはアルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧ、ネオ活性を有する変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２によって判定される場合に、本明細書に記載の治療薬、例えば、その変異体（例えば、２ＨＧへのアルファケトグルタル酸の転換、例えば、Ｒ−２ＨＧ）のネオ活性の阻害剤（例えば、小分子もしくは核酸に基づく阻害剤）での治療において対象を選択するか、
分析と結果もしくは予後診断の相互関係を示すか、
評価が基づく分析値、例えば、アルファヒドロキシルネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、もしくはレベルと相関するパラメータ値を提供するか、対象の治療の推奨を提供するか、または
方法の結果もしくは産出、例えば、方法を実行する過程でもたらされた測定を記録すること、および任意でその記録を団体、例えば、対象、ヘルスケア提供者、または対象の治療の支払いを行う事業体、例えば、政府、保険会社、もしくは他の第三者支払人に送信する。
本明細書に記載されるように、評価は、多数の決定または治療が基づく情報を提供し得る。
したがって、ある実施形態では、評価の結果、例えば、アルファヒドロキシルネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベル、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、ネオ活性、例えば、アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の存在、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有する変異体タンパク質（または対応するＲＮＡ）の存在、アルファヒドロキシルネオ活性、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に開示の対立遺伝子を有するＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の変異体対立遺伝子の存在は、
例えば、それが一次もしくは転移病巣を示す、細胞増殖関連疾患、例えば、癌、
細胞増殖関連疾患の病期、
例えば、それが疾患、例えば、低い侵襲性の癌の形態を示す、細胞増殖関連疾患における予後診断または結果を示している。例えば、神経膠腫において、アルファヒドロキシルネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在は、低い侵襲性の癌の形態、
治療の効力、例えば、化学療法剤、照射、または手術の効力、
本明細書に開示の治療、例えば、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、ネオ活性変異体のネオ活性の阻害の必要性を示し得る。ある実施形態では、比較的高いレベル（または変異体の存在）が、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体のネオ活性の阻害の必要性、または
治療に対する応答性に相関する。結果を、臨床応答への非侵襲バイオマーカーとして使用することができる。例えば、上昇したレベルは、神経膠腫患者におけるより良好な結果（例えば、より長い平均余命）を予測し得る。
本明細書に記載されるように、評価を対象の選択のために提供することができる。
したがって、ある実施形態では、方法は、例えば、ａ〜ｄの分析のうちの１つ以上に応答して、例えば、治療において、対象を選択することを含む。対象を、本明細書に記載の基準、例えば、
細胞増殖関連疾患、例えば、ＡＭＬもしくはＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬもしくはＴ−ＡＬＬ等の白血病、または腫瘍病巣、例えば、神経膠腫もしくは前立腺腫瘍を有し、細胞中に、正常なレベルよりも高いアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２−ヒドロキシグルタレート（例えば、Ｒ−２ＨＧ）の危険性があるか、またはそれを有する該対象、
アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有する、選択されたＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異を有する該対象、
アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有する、選択されたＩＤＨ対立遺伝子、例えば、選択されたＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子を有する該対象、
増殖関連疾患を有する該対象、
本明細書に記載の種類の治療薬を必要とするか、またはそれから利益を得ることができる該対象、
アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を阻害する化合物を必要とするか、またはそれから利益を得ることができる該対象、
アルファヒドロキシルネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルを低下させる化合物を必要とするか、またはそれから利益を得ることができる該対象に基づいて選択することができる。
ある実施形態では、評価は、対象が、増加したアルファヒドロキシルネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ、もしくは増加したアルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有するか、または対象が、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体のネオ活性の阻害を必要とすることを確立または判定する時に、例えば、抗腫瘍薬での治療において、対象を選択することを含む。
本明細書に記載されるように、本明細書に記載の方法によって提供される評価は、最適な治療計画の選択を可能にする。
したがって、ある実施形態では、方法は、例えば、ａ〜ｄのうちの１つ以上の分析に応答して、対象のために治療を選択、例えば、本明細書に開示の基準で治療を選択することを含む。治療は、本明細書に開示の治療薬の投与であり得る。治療は、
アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性（または対応するＲＮＡ）を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体タンパク質のうちの１つ以上特徴とする疾患を治療するのに有用であることと、対象からの細胞増殖関連疾患を特徴とする細胞中の、アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、対立遺伝子とタンパク質をコードするＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の選択的体細胞対立遺伝子または変異を特徴とする疾患を治療するのに有用であることと、
それが、アルファヒドロキシルネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルを低下させることと、
それが、アルファヒドロキシルネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性のレベルを低下させることとに基づいて選択され得る。
ある実施形態では、評価は、例えば、治療において、対象を選択することを含む。
実施形態では、治療は、本明細書に記載の治療薬の投与である。
方法は、例えば、方法からもたらされる評価に応答して、またはそれに基づいて選択される治療で、対象を治療することも含み得る。
したがって、ある実施形態では、方法は、例えば、ａ〜ｄのうちの１つ以上の分析に応答して、対象への治療を投与すること、例えば、本明細書に記載の種類の治療薬の投与を含む。
ある実施形態では、治療薬は、表２４ａもしくは表２４ｂからの化合物、または下に記載の式（Ｘ）もしくは（ＸＩ）の構造を有する化合物を含む。
ある実施形態では、治療薬は、核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡを含む。
ある実施形態では、治療薬は、阻害剤、例えば、ポリペプチド、ペプチド、もしくは小分子（例えば、１，０００ダルトン未満の分子）、またはＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体または野生型サブユニットに結合（例えば、ＩＤＨ１変異体に結合するアプタマー）し、かつ例えば、二量体、例えば、変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２サブユニットのホモ二量体（例えば、変異体ＩＤＨ１サブユニットのホモ二量体）、または変異体および野生型サブユニットのヘテロ二量体の形成を阻害することによって、ネオ活性を阻害するアプタマーである。ある実施形態では、阻害剤は、ポリペプチドである。ある実施形態では、ポリペプチドは、変異体酵素のネオ活性に対して、ドミナントネガティブの機能を果たす。ポリペプチドは、全長ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２またはその断片に相当し得る（例えば、ポリペプチドが全長ＩＤＨ１またはその断片に相当する）。ポリペプチドは、野生型ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２（例えば、野生型ＩＤＨ１）の対応する残基と同一である必要はないが、実施形態では、野生型ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２（例えば、野生型ＩＤＨ１）と少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５％の相同性を有する。
ある実施形態では、治療薬は、例えば、変異体酵素に結合するために競合することによって、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、または二価金属イオン、例えば、Ｍｇ２＋もしくはＭｎ２＋に対するＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ネオ活性変異体タンパク質の親和性を減少させるか、またはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、または二価金属イオン、例えば、Ｍｇ２＋もしくはＭｎ２＋のレベルもしくは有効性を減少させる。ある実施形態では、ある実施形態では、酵素は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋をＣａ２＋に置換することによって阻害される。
ある実施形態では、治療薬は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性のレベルを低下させる阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異体のネオ活性を有する変異体の産物のレベルを低下させる阻害剤であり、例えば、それは、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルを低下させる。
ある実施形態では、治療薬は、
例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を特異的に阻害するか、または
ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の野生型活性およびネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の両方を阻害する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、それが、
例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を特異的に阻害するか、または
ＩＤＨ１、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の野生型活性およびネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の両方を阻害するということに基づいて選択される阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質またはｍＲＮＡの量を低下させる阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２ ｍＲＮＡと直接相互作用する、例えば、それが結合する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２タンパク質と直接相互作用する、例えば、それが結合する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、例えば、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２タンパク質と相互作用する、例えば、結合することによって、ネオ活性酵素活性の量を低下させる阻害剤である。ある実施形態では、阻害剤は、抗体以外である。
ある実施形態では、治療薬は、小分子であり、かつ例えば、変異体ＲＮＡ、例えば、変異体ＩＤＨ１ ｍＲＮＡと相互作用、例えば、結合する阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質と直接相互作用、例えば、結合するか、または変異体ＩＤＨ ｍＲＮＡ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ ｍＲＮＡと直接相互作用、例えば、結合するかのいずれかの阻害剤である。
ある実施形態では、治療薬が投与される。
ある実施形態では、治療は、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性（例えば、ＩＤＨ１のネオ活性）、例えば、本明細書に記載のネオ活性を阻害するか、またはＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の野生型活性およびネオ活性（例えば、ＩＤＨ１のネオ活性）、例えば、本明細書に記載のネオ活性の両方を特異的に阻害する。ある実施形態では、対象は、続いて、例えば、治療に対する応答または疾病の進行を評価するために、本明細書に記載の方法、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、もしくはレベルの分析で評価または監視される。
ある実施形態では、治療は、それが、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性（例えば、ＩＤＨ１のネオ活性）、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を阻害するか、またはＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の野生型活性およびネオ活性（例えば、ＩＤＨ１のネオ活性）、例えば、本明細書に記載のネオ活性の両方を特異的に阻害するということに基づいて選択される。
ある実施形態では、方法は、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２での変異以外の変異の可能性を判定することを含む。実施形態では、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの比較的高いレベルは、別の変異を示す。
対象のために治療を選択もしくは投与することを含むある実施形態では、対象は、
対象の細胞増殖関連疾患がまだ治療されておらず、かつ選択もしくは投与された治療は、
最初もしくは１回目の治療であるか、
細胞増殖関連がすでに治療されており、かつ選択もしくは投与された治療は、現行の治療の変化をもたらすか、
細胞増殖関連がすでに治療されており、かつ選択された治療は、現行の治療の継続をもたらすか、または
細胞増殖関連疾患がすでに治療されており、かつ選択もしくは投与された治療は、例えば、評価の前に投与されたものもしくはアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの上昇したレベルの不在下で投与されるであろうものと比較して、異なる。
対象のために治療を選択もしくは投与することを含むある実施形態では、選択もしくは投与される治療は、
異なる（例えば、評価の前に投与されたものもしくはアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの上昇したレベルの不在下で投与されるであろうものと比較して異なる）、例えば、より多い（またはより少ない）投薬量で、治療薬の投与を含む治療、
異なる（例えば、評価の前に投与されたものもしくはアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの上昇したレベルの不在下で投与されるであろうものと比較して異なる）頻度、例えば、より高いかもしくは低い、または全く高くない頻度で、治療薬の投与を含む治療、または
異なる（例えば、評価の前に投与されたものもしくはアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの上昇したレベルの不在下で投与されるであろうものと比較して異なる）治療設定（例えば、治療計画から第２の治療を追加または削除する）で、治療薬の投与を含む治療を含み得る。
本明細書に記載の対象を評価する方法は、ネオ活性遺伝子型または表現型を評価することを含み得る。本明細書の他の箇所、例えば、「試料および／または対象を評価する方法」の見出しの項に記載される試料を入手および分析する方法、ならびに対象における生体内分析を、この方法と組み合わせることができる。
ある実施形態では、方法は、
例えば、腫瘍、例えば、神経膠腫に関連して、対象におけるアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルの判定を提供するために、対象（例えば、２−ヒドロキグルタル酸尿症を有しない対象）を、画像分析および／または分光分析、例えば、磁気共鳴に基づく分析、例えば、ＭＲＩおよび／またはＭＲＳ、例えば、画像分析に供すことと、
判定、例えば、画像分析からの画像に関連する画像または値に関連するパラメータを任意で保存することと、
判定に応答して、判定を結果もしくは予後診断の相互関係を示すこと、結果もしくは予後診断の指標を提供すること、評価が基づいている分析値、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルを提供すること、対象の治療への推奨を提供すること、対象のために一連の治療、例えば、本明細書に記載の一連の治療を選択、例えば、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子のネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を阻害することを含む一連の治療を選択すること、対象に一連の治療、例えば、本明細書に記載の一連の治療、例えば、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子のネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を阻害することを含む一連の治療を投与すること、ならびに方法の結果または方法の過程でもたらされた測定、例えば、上の１つ以上を記録すること、および／または上の１つ以上の記録を、団体、例えば、対象、ヘルスケア提供者、もしくは対象の治療の支払いを行う事業体、例えば、政府、保険会社、もしくは他の第三者支払人に送信することのうちの１つ以上を実行することとを含む。
ある実施形態では、方法は、対象の直接検査もしくは評価、または対象からの試料、例えば、組織もしくは体液（例えば、血液（例えば、血漿）、尿、リンパ液、もしくは脳脊髄液）によって（例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、もしくはレベルのＤＮＡ配列決定または免疫分析もしくは評価によって）確認または判定すること、または対象が、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕを有するＩＤＨ１対立遺伝子、特定の実施形態では、残基１３２でＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕを有するＩＤＨ１対立遺伝子、もしくは残基１３２でＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子、または残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌を有する、対象についてのそのような情報を受信することを含む。
ある実施形態では、方法は、治療の前または後に、細胞増殖関連疾患の成長、大きさ、重量、侵襲性、病期、または他の表現型を評価することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＣＮＳの腫瘍、例えば、神経膠腫、白血病、例えば、ＡＭＬもしくはＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ、前立腺癌、または骨髄異形成または骨髄異形成症候群であり、評価はａもしくはｂである。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧに関する試料、例えば、本明細書に記載の試料、例えば、組織、例えば、癌試料、または体液、例えば、血清もしくは血液を評価することを含む。
ある実施形態では、対象は、ＭＲＳに供され、評価は、磁気共鳴で判定される時に、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧと相関するか、または対応するピークの存在もしくは上昇量を評価することを含む。例えば、対象は、対象における２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在および／または量を判定するために、約２．５ｐｐｍでの信号の存在および／または強度に関して分析され得る。
ある実施形態では、方法は、対象から試料を入手して試料を分析するか、または例えば、対象を画像化し、任意で、コンピュータ上で画像の表現を形成することによって対象を分析することを含む。
ある実施形態では、分析の結果は、基準と比較される。
ある実施形態では、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルと相関するパラメータ値が判定される。それを、基準値、例えば、異常な存在、レベル、または分布を有しない参照対象、例えば、本明細書に記載のネオ活性を有するＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２で変異を有しない参照対象細胞の値と比較することができる。
ある実施形態では、方法は、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異体対立遺伝子が存在するかを判定することを含む。例えば、ＩＤＨ１においては、２ＨＧネオ活性に関連する残基１３２での変異の存在を判定することができる。ＩＤＨ２においては、２ＨＧネオ活性に関連する残基１７２での変異の存在を判定することができる。判定は、関連する１個または複数のアミノ酸をコードする、罹患細胞からの核酸、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの配列決定することを含み得る。変異は、欠失、挿入、再編成、または置換であり得る。変異は、単一ヌクレオチド、例えば、単一置換、または１つより多いヌクレオチド、例えば、１つより多いヌクレオチドの欠失を含み得る。
ある実施形態では、方法は、位置３９４もしくは３９５でＩＤＨ１遺伝子の配列を決定するか、または細胞増殖関連疾患を特徴とする細胞中のＩＤＨ１遺伝子におけるアミノ酸残基１３２（配列番号８）の同一性を決定することを含む。
ある実施形態では、方法は、ＤＮＡの配列を決定することによって、細胞増殖関連疾患を特徴とする細胞中のＩＤＨ２遺伝子の位置１７２で、アミノ酸配列を決定することを含む。
ある実施形態では、ネオ活性の産物は、代謝産物の機能を果たす２−ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧである。別の実施形態では、ネオ活性の産物は、毒素、例えば、発癌物質の機能を果たす２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧである。
ある実施形態では、疾患は、固形腫瘍以外である。ある実施形態では、疾患は、診断または治療時に、壊死部分を有しない腫瘍である。ある実施形態では、疾患は、診断または治療時に、腫瘍細胞の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％が、２ＨＧネオ活性を有するＩＨＤ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２を担持する腫瘍である。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、癌、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする本明細書に記載の癌である。ある実施形態では、腫瘍は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＣＮＳの腫瘍、例えば、神経膠腫であり、例えば、腫瘍が、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。神経膠腫には、星状腫瘍、希突起膠腫、乏突起星細胞系腫瘍、未分化星状細胞腫、およびグリア芽腫が含まれる。ある実施形態では、腫瘍は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＹａｎらに記載される任意の残基をコードする（図２１も参照）。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓを有するＩＤＨ１をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＳｅｒを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＡ（もしくはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）、またはヌクレオチド位置３９５でＡ（もしくはＧ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、Ｃ３９４Ａ、Ｃ３９４Ｇ、Ｃ３９４Ｔ、Ｇ３９５Ｃ、Ｇ３９５ＴまたはＧ３９５Ａ変異、具体的には、配列番号５の配列によるＣ３９４ＡもしくはＧ３９５Ａ変異である。
ある実施形態では、方法は、神経膠腫を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ、またはＨｉｓもしくはＣｙｓ）を有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕ（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ、またはＨｉｓもしくはＣｙｓ）を有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖疾患は、線維肉腫または傍神経節腫であり、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、細胞増殖疾患は、線維肉腫または傍神経節腫であり、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする。
ある実施形態では、細胞増殖疾患は、線維肉腫または傍神経節腫であり、癌は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、限局性または転移性前立腺癌、例えば、前立腺腺癌であり、例えば、癌は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。
例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２５：３５３−３５５に記載される任意の残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ）をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（もしくはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）、またはヌクレオチド位置３９５でＡ（もしくはＧ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４ＴまたはＧ３９５Ａである。
ある実施形態では、方法は、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、ＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、ＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、前立腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、血液癌、例えば、白血病、例えば、ＡＭＬまたはＡＬＬであり、血液癌は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの血清または血液試料を評価することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、急性リンパ芽球性白血病（例えば、成人型または小児型）であり、例えば、急性リンパ芽球性白血病（本明細書でＡＬＬと称される場合もある）は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ＡＬＬは、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬであり得る。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、２アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２（配列番号８）で、Ａｒｇ以外を有するＩＤＨ１である。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇらに記載される任意の残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ）をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（またはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４Ｔ変異である。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬの対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、急性骨髄性白血病（例えば、成人型または小児型）であり、例えば、急性骨髄性白血病（本明細書でＡＭＬと称される場合もある）は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を特徴とする。ある実施形態では、癌は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２（配列番号８）で、Ａｒｇ以外を有するＩＤＨ１である。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇらに記載される任意の残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ）をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＣｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、具体的には、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（またはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４Ｔ変異である。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、具体的には、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする、急性骨髄性リンパ芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙ、具体的には、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする癌に基づいて、急性骨髄性リンパ芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、急性骨髄性リンパ芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する対象を選択することを含む。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの血清または血液試料を評価することを含む。
ある実施形態では、方法は、ＮＲＡＳまたはＮＰＭｃ遺伝子における変異の存在に関して対象を評価することをさらに含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、骨髄異形成または骨髄異形成症候群であり、例えば、骨髄異形成または骨髄異形成症候群は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性、例えば、本明細書に記載の変異体を有するＩＤＨ１体細胞変異体を有することを特徴とする。ある実施形態では、疾患は、同一の種類の非病的細胞と比較して、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２（配列番号８）で、Ａｒｇ以外を有するＩＤＨ１である。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列によるＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＫａｎｇらに記載される任意の残基、具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＣｙｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、ヌクレオチド位置３９４でＴ（またはＣ以外の任意の他のヌクレオチド）を有する。ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号５の配列によるＣ３９４Ｔ変異である。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、配列番号８の配列による残基１３２で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｃｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を有することを特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの血清または血液試料を評価することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする神経膠腫である。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、神経膠腫を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒ、またはＬｙｓもしくはＭｅｔを有する、ＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒ、またはＬｙｓもしくはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、神経膠腫を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌である。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２で（配列番号１０）ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、前立腺癌、例えば、前立腺腺癌を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬもしくはＴ−ＡＬＬである。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）でＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬを有する対象を選択することを含む。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの血清または血液試料を評価することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とするＡＭＬである。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、ＡＭＬを有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）で、ＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、ＡＭＬを有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、ＡＭＬを有する対象を選択することを含む。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの血清または血液試料を評価することを含む。
ある実施形態では、細胞増殖関連疾患は、ＩＤＨ２の変異または事前選択的対立遺伝子を特徴とする、骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群である。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、方法は、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含み、癌は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）でＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を有することを特徴とする。
ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２（配列番号１０）でＬｙｓまたはＭｅｔを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。
ある実施形態では、方法は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの増加したレベルを特徴とする癌に基づいて、骨髄異形成または骨髄異形成症候群を有する対象を選択することを含む。ある実施形態では、方法は、増加したアルファネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの血清または血液試料を評価することを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の阻害剤（例えば、小分子または核酸に基づく阻害剤）の医薬組成物を特色とする。
ある実施形態では、変異体タンパク質特異試薬、例えば、ＩＤＨ変異体タンパク質に特異的に結合する抗体、例えば、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質に特異的に結合する抗体は、ネオ活性変異体酵素を検出するために使用され得、例えば、Ｙ．Ｋａｔｏ ｅｔ
ａｌ．，「Ａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩＭａｂ−１ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ，ｔｈｅｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｇｌｉｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ： （Ｋａｔｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００９）を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の態様では、本発明は、例えば、変異体酵素のネオ活性を阻害する能力に関して、例えば、抗増殖剤または抗癌剤としての使用に関して、候補化合物を評価する方法を特色とする。ある実施形態では、変異体酵素は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体、例えば、本明細書に記載の変異体である。ある実施形態では、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。方法は、
任意で候補化合物を供給することと、
候補化合物を、ネオ活性を有する変異体酵素、もしくはネオ活性と同一である、本明細書で代理活性と称される活性を有する本明細書で代理酵素と称される別の酵素と（または同一物を含む細胞または細胞溶解物と）接触させることと、
ネオ活性もしくは代理活性を調節、例えば、阻害または促進する候補化合物の能力を評価することと、を含み、
それによって、候補化合物を評価する。
ある実施形態では、変異体酵素は、変異体ＩＤＨ１、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１変異体であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。２ＨＧネオ活性に関連するＩＤＨ１中の変異は、残基１３２で、例えば、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｇ、Ｒ１３２Ｌ、またはＲ１３２Ｖ、より具体的には、Ｒ１３２ＨもしくはＲ１３２Ｃの変異を含む。
ある実施形態では、変異体酵素は、変異体ＩＤＨ２、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ２変異体であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。ＩＤＨ２における２ＨＧネオ活性に関連する変異は、残基１７２、例えば、Ｒ１７２Ｋ、Ｒ１７２Ｍ、Ｒ１７２Ｓ、Ｒ１７２Ｇ、またはＲ１７２Ｗでの変異を含む。
ある実施形態では、方法は、ネオ活性または代理活性を阻害する候補化合物の能力を評価することを含む。
ある実施形態では、方法は、非変異体もしくは野生型酵素活性の正反応、例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２において、α−ケトグルタル酸（または低下したヒドロキシル中間体を含む、その中間体）へのイソクエン酸の転換を阻害する候補化合物の能力を評価することをさらに含む。
ある実施形態では、接触させるステップは、候補化合物を、細胞もしくは細胞溶解物と接触させることを含み、細胞は、ネオ活性を有する変異体酵素または活性を有する酵素を含む。
ある実施形態では、細胞は、変異体ＩＤＨ１遺伝子の変異または事前選択的対立遺伝子を含む。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＹａｎらに記載される任意の他の残基、具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕをコードし得る。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＳｅｒを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号８（図２および２１を参照）の配列による、Ａｒｇ１３２Ｈｉｓ変異またはＡｒｇ１３２Ｓｅｒ変異である
ある実施形態では、細胞は、変異体ＩＤＨ２遺伝子の変異または事前選択的対立遺伝子を含む。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、細胞は、変異体ＩＤＨ遺伝子、例えば、変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子の異種複製を含む（異種複製は、遺伝子工学操作によって導入または形成された複製を指す）。
ある実施形態では、細胞は、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、例えば、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする核酸配列をトランスフェクト（例えば、一時的もしくは安定的にトランスフェクト）するか、または形質導入（例えば、一時的もしくは安定的に形質導入）する。ある実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２は、エピトープ標識、例えば、ｍｙｃ標識される。
ある実施形態では、細胞、例えば、癌細胞は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子の非変異体または野生型である。細胞は、異種ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体を含み得る。
ある実施形態では、細胞は、培養細胞、例えば、初代細胞、二次細胞、または細胞株である。ある実施形態では、細胞は、癌細胞、例えば、グリオーマ細胞（例えば、膠芽腫細胞）、前立腺癌細胞、白血病細胞（例えば、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ細胞もしくはＡＭＬ細胞）、または骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群を特徴とする細胞である。実施形態では、細胞は、２９３Ｔ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞、またはＬＮ−１８細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４もしくはＣＲＬ−２６１０）である。
ある実施形態では、細胞は、対象、例えば、癌、例えば、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕ、具体的には、ＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子、または残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒを有する、ＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする癌を有する対象由来である。
ある実施形態では、評価するステップは、例えば、細胞溶解物または培養培地中の、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在および／もしくは量を、例えば、ＬＣ−ＭＳによって評価することを含む。
ある実施形態では、評価するステップは、細胞溶解物または培養培地中のアルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の存在および／もしくは量を評価することを含む。
ある実施形態では、方法は、例えば、対照として、ＴＣＡ代謝産物、例えば、クエン酸塩、α−ＫＧ、コハク酸エステル塩、フマル酸エステル塩、および／またはリンゴ酸塩のうちの１つ以上の存在／量を、例えば、ＬＣ−ＭＳによって評価することをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、ＮＡＤＰＨの酸化状態、例えば、３４０ｎｍでの光吸収を、例えば、分光光度計によって評価することをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、第２の酵素活性、例えば、非変異体もしくは野生型酵素活性の正反応、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２（例えば、ＩＤＨ１）において、α−ケトグルタル酸（または低下したヒドロキシル中間体を含む、その中間体）へのイソクエン酸の転換を阻害する候補化合物の能力を評価することをさらに含む。
ある実施形態では、候補化合物は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物に基づく分子、またはアプタマー（例えば、核酸アプタマーもしくはペプチドアプタマー）である。方法を広範に使用することができ、例えば、この、または他の方法もしくはスクリーニングによって産生される候補を確認するために、または概して創薬もしくは薬物候補最適化を導くために、一次スクリーニングのうちの１つ以上として使用することができる。
ある実施形態では、方法は、第２のアッセイにおけるネオ活性または代理活性を阻害する候補化合物（例えば、評価するステップにおける阻害の事前決定されたレベルを満たす候補化合物）の能力を評価、例えば、確認することを含む。
ある実施形態では、第２のアッセイは、基本的な方法の接触および／または評価するステップのうちの１つ以上を繰り返すことを含む。
別の実施形態では、第２のアッセイは、第１とは異なる。例えば、第１のアッセイが細胞もしくは細胞溶解物または他の全体ではない動物モデルを使用することができる場合に、第２のアッセイは、動物モデル、例えば、腫瘍移植モデル、例えば、ＩＤＨ、例えば、その中に移植されるＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体細胞もしくは腫瘍を有するマウスを使用することができる。例えば、Ｕ８７細胞、または神経膠腫、例えば、トランスフェクトしたＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ネオ活性変異体を宿す膠芽腫細胞を、異種移植片として埋め込み、アッセイで使用することができる。一次ヒト神経膠腫またはＡＭＬ腫瘍細胞を、腫瘍の繁殖を可能にするためにマウス内に移植し、アッセイで使用することができる。ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異および／または他の変異、例えば、ｐ５３ヌル変異を宿す遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）もアッセイで使用することができる。
ある実施形態では、方法は、
任意で候補化合物を供給することと、
候補化合物を、核酸配列、例えば、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１、または残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２（具体的には、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１）をコードする異種配列を含む細胞と接触させることと、
細胞溶解物または培養培地中の、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在および／または量を、ＬＣ−ＭＳによって評価することと、を含み、
それによって、化合物を評価する。
ある実施形態では、評価の結果は、対照細胞、例えば、そこにＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２（例えば、ＩＤＨ１）の野生型または非変異体複製を挿入した細胞における基準、例えば、産物、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルと比較される。
別の態様では、本発明は、例えば、ネオ活性を有する変異体酵素をコードするＲＮＡを阻害する能力に関して、例えば、抗増殖剤または抗癌剤としての使用に関して、候補化合物を評価する方法を特色とする。ある実施形態では、変異体酵素は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体、例えば、本明細書に記載の変異体である。ある実施形態では、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。方法は、
任意で候補化合物、例えば、核酸に基づく阻害剤（例えば、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ）、アンチセンス、またはマイクロＲＮＡ）を供給すること、
候補化合物を、ＲＮＡ、例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、例えば、ネオ活性を有する変異体酵素をコードするＲＮＡをコードするｍＲＮＡと（または同一物を含む細胞もしくは細胞溶解物と）接触させることと、
ＲＮＡを阻害する候補化合物の脳威力を評価することと、を含み、
それによって、候補化合物を評価する。ＲＮＡを阻害するとは、ＲＮＡを切断、またはさもなければ不活性化することを意味する。
ある実施形態では、ＲＮＡは、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２野生型または変異体タンパク質の全てまたは一部から、第２のタンパク質、例えば、レポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色もしくは赤色蛍光タンパク質への融合物をコードする。
ある実施形態では、変異体酵素は、変異体ＩＤＨ１、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１変異体であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。
ある実施形態では、変異体酵素は、変異体ＩＤＨ２、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ２変異体であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。
ある実施形態では、接触させるステップは、候補化合物を、細胞、またはその細胞溶解物と接触させることを含み、細胞は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、例えば、変異体ＩＤＨ、例えば、ネオ活性を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２酵素を含む。
ある実施形態では、細胞は、変異体ＩＤＨ１遺伝子の変異または事前選択的対立遺伝子を含む。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ１対立遺伝子は、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＹａｎらに記載される任意の他の残基、具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕをコードし得る。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＳｅｒを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、配列番号８（図２および２１を参照）の配列による、Ａｒｇ１３２Ｈｉｓ変異またはＡｒｇ１３２Ｓｅｒ変異である。
ある実施形態では、細胞は、変異体ＩＤＨ２遺伝子の変異または事前選択的対立遺伝子を含む。例えば、ある実施形態では、ＩＤＨ２対立遺伝子は、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２をコードする。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒをコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、細胞は、野生型または変異体ＩＤＨ遺伝子、例えば、野生型または変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子の異種複製を含む（異種複製は、遺伝子工学操作によって導入または形成された複製を指す）。ある実施形態では、異種遺伝子は、レポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色または赤色蛍光タンパク質への融合を含む。
ある実施形態では、細胞は、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、例えば、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１、または残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２（例えば、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１）をコードする核酸配列をトランスフェクト（例えば、一時的もしくは安定的にトランスフェクト）するか、または形質導入（例えば、一時的もしくは安定的に形質導入）する。ある実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２は、エピトープ標識、例えば、ｍｙｃ標識される。
ある実施形態では、細胞、例えば、癌細胞は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子の非変異体または野生型である。細胞は、異種ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体を含み得る。
ある実施形態では、細胞は、培養細胞、例えば、初代細胞、二次細胞、または細胞株である。ある実施形態では、細胞は、癌細胞、例えば、グリオーマ細胞（例えば、膠芽腫細胞）、前立腺癌細胞、白血病細胞（例えば、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ細胞もしくはＡＭＬ細胞）、または骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群を特徴とする細胞である。実施形態では、細胞は、２９３Ｔ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞、またはＬＮ−１８細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４もしくはＣＲＬ−２６１０）である。
ある実施形態では、細胞は、対象、例えば、癌、例えば、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１３２配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕ、具体的には、ＨｉｓもしくはＣｙｓを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌を有する対象由来である。ある実施形態では、癌は、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ、具体的には、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする。
ある実施形態では、方法は、第２のアッセイを含み、第２のアッセイは、基本的な方法の接触および／または評価するステップのうちの１つ以上を繰り返すことを含む。
別の実施形態では、第２のアッセイは、第１とは異なる。例えば、第１のアッセイが細胞もしくは細胞溶解物または他の全体ではない動物モデルを使用することができる場合に、第２のアッセイは、動物モデルを使用することができる。
ある実施形態では、候補の効力は、レポータータンパク質活性へのその効果によって評価される。
別の態様では、本発明は、例えば、ネオ活性を有する変異体酵素をコードするＲＮＡの転写を阻害する能力関して、例えば、抗増殖剤または抗癌剤としての使用に関して、候補化合物を評価する方法を特色とする。ある実施形態では、変異体酵素は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体、例えば、本明細書に記載の変異体である。ある実施形態では、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。方法は、
任意で候補化合物、例えば、小分子、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、炭水化物に基づく分子、または核酸に基づく分子を供給することと、
候補化合物を、細胞もしくは細胞溶解物を含む系と接触させることと、
ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、ＲＮＡの翻訳を阻害する候補化合物の能力を評価して、例えば、
それによって、候補化合物を評価することを含む。
ある実施形態では、システムは、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２野生型または変異体タンパク質の全てまたは一部から、第２のタンパク質、例えば、レポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色または赤色蛍光タンパク質への融合遺伝子をコードすることを含む。
ある実施形態では、変異体酵素は、変異体ＩＤＨ１、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１変異体であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。
ある実施形態では、変異体酵素は、変異体ＩＤＨ２、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ２変異体であり、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性である。
ある実施形態では、システムは、野生型または変異体ＩＤＨ遺伝子、例えば、野生型または変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子異種複製を含む（異種複製は、遺伝子工学操作によって導入または形成された複製を指す）。ある実施形態では、異種遺伝子は、レポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色または赤色蛍光タンパク質への融合を含む。
ある実施形態では、細胞、例えば、癌細胞は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子の非変異体または野生型である。細胞は、異種ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体を含み得る。
ある実施形態では、細胞は、培養細胞、例えば、初代細胞、二次細胞、または細胞株である。ある実施形態では、細胞は、癌細胞、例えば、グリオーマ細胞（例えば、膠芽腫細胞）、前立腺癌細胞、白血病細胞（例えば、ＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ細胞もしくはＡＭＬ細胞）、または骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群を特徴とする細胞である。実施形態では、細胞は、２９３Ｔ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞、またはＬＮ−１８細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４もしくはＣＲＬ−２６１０）である。
ある実施形態では、細胞は、対象、例えば、癌、例えば、ＩＤＨ、例えば、本明細書に記載のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１３２（配列番号８）で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕ、具体的には、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕを有するＩＤＨ１対立遺伝子を特徴とする癌を有する対象由来である。ある実施形態では、癌は、残基１７２（配列番号１０）で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒを有するＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする。
ある実施形態では、方法は、第２のアッセイを含み、第２のアッセイは、方法を繰り返すことを含む。
別の実施形態では、第２のアッセイは、第１と異なる。例えば、第１のアッセイが細胞もしくは細胞溶解物または他の全体ではない動物モデルを使用することができる場合に、第２のアッセイは、動物モデルを使用することができる。
ある実施形態では、候補の効果は、レポータータンパク質活性へのその効果によって評価される。
別の態様では、本発明は、動物モデルにおいて、候補化合物、例えば、治療薬、または本明細書に記載の阻害剤を評価する方法を特色とする。候補化合物は、例えば、小分子、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、炭水化物に基づく分子、または核酸に基づく分子であり得る。方法は、候補を動物モデルと接触させること、および動物モデルを評価することを含む。
ある実施形態では、評価することは、
動物の総合的健康への化合物の効果を判定すること、
動物の体重への化合物の効果を判定すること、
肝機能、例えば、肝臓酵素への化合物の効果を判定すること、
動物の循環系への化合物の効果を判定すること、
神経機能、例えば、神経筋制御もしくは応答への化合物の効果を判定すること、
摂食もしくは摂飲への化合物の効果を判定すること、
動物における化合物の分布を判定すること、
動物または動物の組織もしくは臓器における化合物の持続性を判定、例えば、血漿半減期を判定すること、または
動物の選択された細胞への化合物の効果を判定すること、
腫瘍、例えば、内因性腫瘍または同一もしくは異なる種からの細胞の導入に起因する腫瘍の成長、大きさ、重量、侵襲性、または他の表現型への化合物の効果を判定することを含む。
ある実施形態では、動物は、非ヒト霊長類、例えば、カニクイザルまたはチンパンジーである。
ある実施形態では、動物は、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスである。
ある実施形態では、動物は、大型動物、例えば、イヌまたはブタ、非ヒト霊長類以外である。
ある実施形態では、評価は、記録され、かつ任意で別の団体に送信される。
一態様では、本発明は、治療薬、例えば、本明細書で言及される治療薬、例えば、ＩＤＨ、例えば、ネオ活性を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体の産物の低下したレベルをもたらす治療薬を評価および処理する方法を提供する。ある実施形態では、ネオ活性は、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性であり、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧのレベルが低下する。
方法は、
例えば、試料を試験することによって、治療薬の性質、例えば、２ヒドロキシグルタル酸（すなわち、２ＨＧ）、例えば、Ｒ−２ヒドロキシグルタル酸（すなわち、Ｒ−２ＨＧ）へのアルファケトグルタル酸の転換を阻害する能力に関連するパラメータ値（例えば、試験値）を提供することと、
任意で、判定されたパラメータ値が事前選択された判定基準を満たすか、例えば、存在するか、または事前選択された範囲内で存在するかの判定を提供することと、を含み、
それによって、治療薬を評価もしくは処理する。
ある実施形態では、治療薬は、政府機関、例えば、ＦＤＡによって、ヒトへの使用が承認される。
ある実施形態では、パラメータは、２ＨＧネオ活性を阻害する能力と相関しており、例えば、治療薬は、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質に結合し、かつアルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を低下させる阻害剤である。
ある実施形態では、パラメータは、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２，タンパク質のレベルと相関しており、例えば、治療薬は、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体タンパク質のレベルを低下させる阻害剤である。
ある実施形態では、パラメータは、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２をコードするＲＮＡのレベルと相関しており、例えば、治療薬は、ＲＮＡ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを低下させる。
ある実施形態では、方法は、治療薬を、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質（または対応するＲＮＡ）と接触させることを含む。
ある実施形態では、方法は、判定されたパラメータ値と、基準値または値との比較を提供し、それによって、治療薬を評価することを含む。ある実施形態では、比較は、治療薬の判定された試験値が、基準値との事前選択された関連性を有するかを判定すること、例えば、それが基準値を満たすかを判定することを含む。値は、数値である必要はないが、例えば、単に、活性が存在するかの指標であり得る。
ある実施形態では、方法は、試験値が、基準値と同等もしくはそれより大きいか、それが基準値未満もしくは同等であるか、またはそれが範囲内（一方または両方の終点を含むか除くかのいずれか）に収まるかを判定することを含む。ある実施形態では、試験値または事前選択された判定基準が満たされるかの指標は、コンピュータ可読の記録で記録され得る。
ある実施形態では、判定もしくはステップが行われ、例えば、治療薬または一群の治療薬を含有する試料が、分類され、選択され、容認もしくは廃棄され、公表もしくは保留され、製剤に加工され、出荷され、異なる所在地に移動され、製剤化され、ラベルを貼られ、包装され、容器、例えば、気密もしくは液密容器と接触するか、またはその中に投入され、商業用に公表され、または販売もしくは売り出されるか、あるいは事前選択された判断基準が満たされるかによって、判定を反映するために、記録が作られるか、もしくは変更される。例えば、判定の結果、もしくは活性が存在するかに基づいて、または参照基準との比較時に、試料が取られるバッチが、例えば、今しがた説明したように、処理され得る。
治療薬が参照基準を満たす場合に、活性の存在またはレベルの評価を示すことができる。
ある実施形態では、本明細書に開示の方法および組成物は、処理観点から、例えば、バッチ間の一貫性もしくは品質を監視または保証するのに、または基準、例えば、事前選択された値に関して試料を評価するのに有用である。
ある実施形態では、方法を、治療薬の試験バッチが性質のうちの１つ以上を有することが予想され得るかを判定するために使用することができる。そのような性質には、商業的使用のために、治療薬の製品添付文書に記載される性質、概論、例えば、米国薬局方で見られる性質、管理機関、例えば、ＦＤＡによって義務付けられている性質が含まれ得る。
ある実施形態では、方法は、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質の野生型活性へのその効果に関して治療薬を試験すること、および判定された値が事前選択された判定基準を満たすか、例えば、存在するか、または事前選択された範囲内に存在するかの判定を提供することを含む。
ある実施形態では、方法は、
ＩＤＨ１アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の阻害剤である治療薬を、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有するＩＤＨ１変異体と接触させることと、
アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の阻害に関連する値を判定することと、
判定された値を、基準値、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の阻害に関する値の範囲と比較することとを含む。ある実施形態では、基準値は、ＦＤＡが義務付ける値、例えば、公開判定基準である。
ある実施形態では、方法は、
アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨ１をコードするｍＲＮＡの阻害剤である治療薬を、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有するＩＤＨ１変異体をコードするｍＲＮＡと接触させることと、
ｍＲＮＡの阻害に関連する値を判定することと、
判定された値を、基準値、例えば、ｍＲＮＡの阻害に関する値の範囲と比較することとを含む。ある実施形態では、基準値は、ＦＤＡが義務付ける値、例えば、公開判定基準である。
一態様では、本発明は、治療薬、例えば、本明細書で言及される治療薬の試料を評価する方法を特色とし、それは、治療薬の活性に関するデータを受信すること、該データを含み、かつ任意で一群の治療薬に関する識別子を含む記録を提供すること、該記録を意思決定者、例えば、政府機関、例えば、ＦＤＡに提出すること、任意で該意思決定者から伝達情報を受信すること、意思決定者からの伝達情報に基づいて、任意で一群の治療薬を市場に公表するかを決定することを含む。一実施形態では、方法は、例えば、本明細書に記載される試料を公表、またはさもなければ処理することをさらに含む。
別の態様では、本発明は、細胞増殖関連疾患を有する対象のための、本明細書に記載の治療薬、例えば、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ネオ活性の阻害剤での治療に関する支払クラスを選択する方法を特色とする。方法は、
アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ、またはネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性（もしくは対応するＲＮＡ）を有する変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、または変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２体細胞遺伝子、例えば、本明細書に記載の変異体の増加したレベルにおいて陽性であるかの評価を提供（例えば受信）することと、
（１）対象が陽性である場合に、第１の支払クラスを選択すること、かつ（２）対象が陽性でない場合に、第２の支払クラスを選択することの少なくとも１つを実行することとを含む。
ある実施形態では、選択は、例えば、医療記録システムに記録される。
ある実施形態では、方法は、対象が、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧ、またはネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の増加したレベルにおいて陽性であるかの評価を含む。
ある実施形態では、方法は、評価を要請することを含む。
ある実施形態では、評価は、本明細書に記載の方法で対象に対して実行される。
ある実施形態では、方法は、選択を別の団体に、例えば、コンピュータ、コンパクトディスク、電話、ファックス、電子メール、または手紙で伝達することを含む。
ある実施形態では、方法は、該治療の支払いを行うか、または許可することを含む。
ある実施形態では、支払いは、第２の団体への第１の団体による。いくつかの実施形態では、第１の団体は、対象以外である。いくつかの実施形態では、第１の団体は、第三者支払人、保険会社、雇用主、健康保険をの資金を負担する雇用主、ＨＭＯ、または政府事業体から選択される。いくつかの実施形態では、第２の団体は、対象、ヘルスケア提供者、治療を行う医師、ＨＭＯ、病院、政府事業体、または薬物を販売または供給する事業体から選択される。いくつかの実施形態では、第１の団体は、保険会社であり、第２の団体は、対象、ヘルスケア提供者、治療を行う医師、ＨＭＯ、病院、政府事業体、または薬物を販売または供給する事業体から選択される。いくつかの実施形態では、第１の団体は、政府事業体であり、第２の団体は、対象、ヘルスケア提供者、治療を行う医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬物を販売または供給する事業体から選択される。
本明細書で使用される、細胞増殖関連疾患は、望ましくない細胞増殖または望ましくない細胞増殖につながる素因を特徴とする疾患である（前癌疾患と称される場合もある）。望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患の例には、癌、例えば、ＣＮＳの腫瘍、例えば、神経膠腫が挙げられる。神経膠腫には、星状腫瘍、希突起膠腫、乏突起星細胞系腫瘍、未分化星状細胞腫、およびグリア芽腫が含まれる。他の例には、血液癌、例えば、白血病、例えば、ＡＭＬ（例えば、成人型もしくは小児型）またはＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ（例えば、成人型もしくは小児型）、限局性または転移性前立腺癌、例えば、前立腺腺癌、線維肉腫、および傍神経節腫、具体的には、白血病、例えば、ＡＭＬ（例えば、成人型もしくは小児型）またはＡＬＬ、例えば、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ（例えば、成人型もしくは小児型）、限局性または転移性前立腺癌、例えば、前立腺腺癌が挙げられる。望ましくない細胞増殖につながる素因を特徴とする疾患の例には、骨髄血液細胞の無効性産生（または異形成）およびＡＭＬへの形質転換の危険性が特徴的である血液学的症状の様々な収集である骨髄異形成もしくは骨髄異形成症候群が挙げられる。
本明細書で使用される、ネオ活性を特異的に阻害する（および同様の言葉遣い）とは、変異体酵素のネオ活性が、野生型酵素活性よりも著しく大きな程度で阻害されることを意味する。例として、「変異体ＩＤＨ１（もしくはＩＤＨ２）の２ＨＧネオ活性を特異的に阻害する」とは、２ＨＧネオ活性が、野生型ＩＤＨ１（もしくはＩＤＨ２）活性の正反応（アルファケトグルタル酸へのイソクエン酸の転換）よりも著しく大きな程度で阻害されることを意味する。実施形態では、ネオ活性は、野生型活性の少なくとも２、５、１０、または１００倍以上阻害される。実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の２ＨＧネオ活性に対して特異的である阻害剤は、別のデヒドロゲナーゼ、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼも阻害する。他の実施形態では、特異的な阻害剤は、他のデヒドロゲナーゼ、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを阻害する。
本明細書で使用される、細胞増殖関連疾患、例えば、変異または対立遺伝子を特徴とする癌は、変異または対立遺伝子を担持する相当な数の細胞を有する細胞増殖関連疾患を意味する。ある実施形態では、細胞増殖関連疾患細胞、例えば、癌細胞、あるいは例えば、腫瘍または罹患した血液細胞からの癌細胞の代表的、平均的、もしくは典型的な試料の少なくとも１０、２５、５０、７５、９０、９５、もしくは９９％が、変異または対立遺伝子の少なくとも１つの複製を担持する。変異体ＩＤＨ、例えば、２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を特徴とする細胞増殖関連疾患が例となる。ある実施形態では、変異または対立遺伝子は、示された頻度でヘテロ接合体として存在する。
本明細書で使用される、「ＳＮＰ」は、ゲノム（または他の共通配列）中の単一ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、もしくはＧ）が間種のメンバー間（あるいは個別で対となる染色体間）で異なる時に起こるＤＮＡ配列変異である。
本明細書で使用される、対象は、ヒトまたは非ヒト対象であり得る。非ヒト対象には、非ヒト霊長類、齧歯類、例えば、マウスもしくはラット、または他の非ヒト動物が含まれる。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、下の記述で説明される。本発明の他の特長、目的、利点は、記述および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。

本発明の好ましい実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ｉ）２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨの存在、またはｉｉ）２ＨＧの上昇したレベルを特徴とする細胞増殖関連疾患を有する対象を治療する方法であり、前記対象は、２−ヒドロキシグルタル酸尿症を有しないか、または２−ヒドロキシグルタル酸尿症を有すると診断されていない対象であり、前記方法は、それを必要とする前記対象に、治療的に有効な量の
対象の２ＨＧの前記上昇したレベルを減少させる治療薬、
２ＨＧネオ活性を有する前記変異体ＩＤＨの阻害剤、
対象の前記上昇したレベルの２ＨＧの望ましくない効果を改善する治療薬、または
２ＨＧネオ活性を有する前記変異体ＩＤＨをコードするｍＲＮＡを標的とする、核酸に基づく阻害剤のうちの１つ以上を投与し、
それによって、前記対象を治療することを含む、方法。
（項目２）
前記細胞増殖関連疾患は、癌または前癌疾患である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記癌は、星状腫瘍、希突起膠腫、乏突起星細胞系腫瘍、未分化星状細胞腫、線維肉腫、傍神経節腫、前立腺癌、急性リンパ芽球性白血病、または急性骨髄性白血病である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記癌は、グリア芽腫である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記対象に、２ＨＧネオ活性を有する前記変異体ＩＤＨの阻害剤を投与することを含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記変異体ＩＤＨは、変異体ＩＤＨ１である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記変異体ＩＤＨ１は、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｘである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記変異体ＩＤＨ１は、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｓ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｇ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｌ、またはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｖである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記変異体ＩＤＨ１は、ＩＤＨ１Ｒ１３２ＨまたはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｃである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記変異体ＩＤＨは、変異体ＩＤＨ２である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記変異体ＩＤＨ２は、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｘである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記変異体ＩＤＨ２は、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｋ、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｍ、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｓ、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｇ、またはＩＤＨ２Ｒ１７２Ｗである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記変異体ＩＤＨ２は、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｋである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨの前記阻害剤は、
ａ． 式（Ｘ）の化合物であって、
式中、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキレン（例えば、メチレン）、Ｃ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキレンであり、Ｘは、任意で置換され、
Ｒ１は、ハロ（例えば、フルオロ）、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミド、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）ＯＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ
ｍは、０、１、２、または３であるか、あるいは
ｂ． 下の表中の化合物のいずれか１つから選択される化合物である、項目１または項目５に記載の方法。
（項目１５）
対象の前記上昇した２ＨＧの望ましくない効果を改善する治療薬を投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
２ＨＧネオ活性を有する前記変異体ＩＤＨをコードするｍＲＮＡを選択的に標的とする核酸に基づく阻害剤を投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
第２の抗癌剤または療法を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
癌の存在または感受性に関して、対象を評価する方法であって、
ａ）前記対象が、２−ヒドロキグルタル酸尿症を有しないか、または２−ヒドロキグルタル酸尿症を有すると診断されていない、２ＨＧの存在、分布、もしくはレベル、
ｂ）変異体ＩＤＨ１酵素または変異体ＩＤＨ２酵素のいずれかが２ＨＧネオ活性を有する、それらの存在、分布、もしくはレベル、
ｃ）変異体ＩＤＨ１酵素または変異体ＩＤＨ２酵素のいずれかが２ＨＧネオ活性を有する、それらをコードするＲＮＡの存在、分布、もしくはレベル、あるいは
ｄ）変異体ＩＤＨ１酵素または変異体ＩＤＨ２酵素のいずれかが２ＨＧネオ活性を有する、それらをコードするＤＮＡの存在、のうちの１つ以上に関して、前記対象または前記対象からの試料を分析し、
それによって、そのような癌に関して、前記対象を評価することを含む、方法。
（項目１９）
前記癌は、星状腫瘍、希突起膠腫、乏突起星細胞系腫瘍、未分化星状細胞腫、線維肉腫、傍神経節腫、前立腺癌、急性リンパ芽球性白血病、または急性骨髄性白血病である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記癌は、グリア芽腫である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
変異体ＩＤＨ１酵素または変異体ＩＤＨ２酵素のいずれかが２ＨＧネオ活性を有する、それらの存在、分布、もしくはレベル、あるいは変異体ＩＤＨ１酵素または変異体ＩＤＨ２酵素のいずれかが２ＨＧネオ活性を有する、それらをコードするＲＮＡを分析することを含む、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
ＤＮＡ配列決定、免疫分析、または酵素活性アッセイによる、前記対象の組織、産物、または体液の評価を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記変異体ＩＤＨ１は、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｘである、項目１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記変異体ＩＤＨ１は、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｓ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｇ、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｌ、またはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｖである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記変異体ＩＤＨ１は、ＩＤＨ１Ｒ１３２ＨまたはＩＤＨ１Ｒ１３２Ｃである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記変異体ＩＤＨ２は、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｘである、項目１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記変異体ＩＤＨ２は、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｋ、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｍ、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｓ、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｇ、またはＩＤＨ２Ｒ１７２Ｗである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記変異体ＩＤＨ２は、ＩＤＨ２Ｒ１７２Ｋである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記２ＨＧの存在、分布、またはレベルを分析することを含む、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記２ＨＧの存在、分布、またはレベルは、画像分析または分光分析によって非侵襲的に決定される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記画像分析または分光分析は、磁気共鳴画像法もしくは磁気共鳴分光法を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記２ＨＧの存在、分布、もしくはレベルは、前記対象の組織、産物、または体液を評価することによって決定される、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
項目２１〜２８のいずれか１項に記載の方法をさらに含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
項目２９〜３２のいずれか１項に記載の方法をさらに含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
変異体ＩＤＨの２ＨＧネオ活性を阻害する能力に関して、候補化合物を評価する方法であって、
前記候補化合物を、２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨと接触させることと、
前記２ＨＧネオ活性を調節する前記候補化合物の能力を評価することと、を含み、
それによって、前記候補化合物を評価することを含む、方法。
（項目３６）
２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨをコードするＲＮＡの翻訳を阻害するか、または２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨを阻害する能力に関して、候補化合物を評価する方法であって、
前記候補化合物を、２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨをコードするＲＮＡと、または細胞もしくは細胞溶解物を含む系と接触させることと、
前記ＲＮＡの前記翻訳を阻害するか、または２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨを阻害する前記候補化合物の能力を評価することと、を含み
それによって、前記候補化合物を評価する、方法。
（項目３７）
前記変異体ＩＤＨは、変異体ＩＤＨ１である、項目３５または項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記変異体ＩＤＨは、変異体ＩＤＨ２である、項目３５または項目３６に記載の方法。
（項目３９）
細胞増殖関連疾患を有する対象に対して、２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨの阻害剤での治療に関する支払クラスを選択する方法であって、
前記対象が、２ＨＧネオ活性産物もしくは２ＨＧネオ活性、または２ＨＧネオ活性を有する変異体ＩＤＨ１もしくは変異体ＩＤＨ２の増加したレベルにおいて陽性であるかの評価を提供することと、
（１）前記対象が陽性の場合に、第１の支払クラスを選択すること、および（２）前記対象が陽性ではない場合に、第２の支払クラスを選択すること、のうちの少なくとも１つを実行することと、を含む、方法。
（項目４０）
ａ． 式（Ｘ）の化合物であって、
式中、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキレンであり、Ｘは、任意で置換され、
Ｒ１は、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミド、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）ＯＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ
ｍは、０、１、２、または３であるか、あるいは
ｂ． 下の表中の化合物のいずれか１つから選択される化合物を含む、医薬組成物。
ｐＥＴ４１ａ−ＩＤＨ１のＤＮＡ配列検証および公開されたＩＤＨ１ ＣＤＳに照らした整列を示す。ＩＤＨ１（ＣＤＳ）の配列は、配列番号５に対応する。ｐＥＴ４１ａ−ＩＤＨ１の配列は、配列番号６に対応し、「コンセンサス」配列は、配列番号７に対応する。 配列番号８に従ったＲ１３２ＳおよびＲ１３２Ｈ変異体のＤＮＡ配列検証を示す。ＩＤＨ１（配列番号８）のアミノ酸配列を図２１に提供する。 Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上の野生型ＩＤＨ１タンパク質の分離を示す。 Ｎｉカラム分画前および後の、ＳＤＳゲル上の野生型ＩＤＨ１のタンパク質分析を示す。Ｔ：総タンパク質、Ｉ：不溶性画分、Ｓ：可溶性画分、Ｌ：Ｎｉ−カラム上の充填のための試料。図中の番号は、画分番号を示す。さらなる精製のために、画分１７番〜２７番が収集された。 ＳＥＣカラムＳ−２００を通した野生型ＩＤＨ１タンパク質の分離を示す。 Ｓ−２００カラム分画前および後の、ＳＤＳゲル上の野生型ＩＤＨ１のタンパク質分析を示す。Ｍ：分子量マーカー、Ｎｉ：Ｓ−２００前のニッケルカラム画分、Ｓ２００：ＳＥＣカラムからの画分。 Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上の変異体Ｒ１３２Ｓタンパク質の分離を示す。 Ｎｉカラム分画前および後の、ＳＤＳゲル上の変異体Ｒ１３２Ｓのタンパク質分析を示す。Ｍ：タンパク質マーカー（ＫＤａ）：１１６、６６．２、４５、３５、２５、１８．４、１４．４、Ｔ：総細胞タンパク質、Ｓｏ：可溶性画分、Ｉｎ：不溶性画分、Ｆｔ：通過画分。３番〜７番は、対応する溶出された画分番号を示す。 ＳＥＣカラムＳ−２００を通した変異体Ｒ１３２Ｓタンパク質の分離を示す。 Ｓ−２００カラム分画後の、ＳＤＳゲル上の変異体Ｒ１３２Ｓのタンパク質分析を示す。Ｍ：分子量マーカー、Ｒ１３２Ｓ：ＳＥＣカラムからの画分。 Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上の変異体Ｒ１３２Ｈタンパク質の分離を示す。 Ｎｉカラム分画前および後の、ＳＤＳゲル上の変異体Ｒ１３２Ｈのタンパク質分析を示す。Ｍ：タンパク質マーカー（ＫＤａ）：１１６、６６．２、４５、３５、２５、１８．４、１４．４、Ｔ：総細胞タンパク質、Ｓｏ：可溶性画分、Ｉｎ：不溶性画分、Ｆｔ：通過画分、５番〜１０番は、対応する溶出された画分番号を示す、Ｎｉ：Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの試料、５番〜１０番を共にプールする。 ＳＥＣカラムＳ−２００を通した変異体Ｒ１３２Ｈタンパク質の分離を示す。 Ｓ−２００カラム分画後の、ＳＤＳゲル上の変異体Ｒ１３２Ｈのタンパク質分析を示す。Ｍ：分子量マーカー、Ｒ１３２Ｈ：ＳＥＣカラムからの画分。 イソクエン酸のα−ケトグルタル酸への酸化的脱炭酸化におけるＩＤＨ１野生型のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットを示す。 イソクエン酸のα−ケトグルタル酸への酸化的脱炭酸化におけるＲ１３２Ｈ突然変異酵素のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットを示す。 イソクエン酸のα−ケトグルタル酸への酸化的脱炭酸化におけるＲ１３２Ｓ突然変異酵素のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットを示す。 ＩＤＨ１野生型のα−ＫＧ阻害を示す。 Ｒ１３２Ｈ突然変異酵素のα−ＫＧ阻害を示す。 Ｒ１３２Ｓ突然変異酵素のα−ＫＧ阻害を示す。 α−ケトグルタル酸塩の２−ヒドロキシグルタル酸塩への転換における、ＩＤＨ１野生型、Ｒ１３２Ｈ、およびＲ１３２Ｓを示す。 Ｒ１３２Ｈ突然変異酵素についての基質−濃度速度プロットを示す。 Ｒ１３２Ｓ突然変異酵素についての基質−濃度速度プロットを示す。 ＮＡＤＨによる２−ヒドロキシグルタル酸への転換α−ケトグルタル酸における、ＩＤＨ１野生型、Ｒ１３２Ｈ、およびＲ１３２Ｓを示す。 ＩＤＨ１野生型に対するオキサロリンゴ酸塩阻害を示す。 Ｒ１３２Ｈに対するオキサロリンゴ酸塩阻害を示す。 Ｒ１３２Ｓに対するオキサロリンゴ酸塩阻害を示す。 対照反応のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 酵素を含有する反応のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 スパイクされた対照反応のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 アルファ−ヒドロキシグルタル酸のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 Ｒ１３２Ｈがα−ＫＧを消費して２−ヒドロキシグルタル酸を産生することを示す、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５８８７．２（ＧＩ番号２８１７８８２５）（２００９年５月１０日付の記録）に記載されるＩＤＨ１（配列番号１３）のアミノ酸配列を示す。 ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５８９６．２（２００９年５月１０日付の記録、ＧＩ番号２８１７８８２４）で提示されるＩＤＨ１のｃＤＮＡ配列（配列番号８）である。 ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５８９６．２（２００９年５月１０日付の記録、ＧＩ番号２８１７８８２４）に記載されるＩＤＨ１のｍＲＮＡ配列（配列番号９）を示す。 ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２１６８．２（２００９年８月１６日付の記録、ＧＩ２８１７８８３１）で提示されるＩＤＨ２のアミノ酸配列（配列番号１０）である。 ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２１６８（２００９年８月１６日付の記録、ＧＩ２８１７８８３１）で提示されるＩＤＨ２のｃＤＮＡ配列（配列番号１１）である。 ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２１６８．２（２００９年８月１６日付の記録、ＧＩ２８１７８８３１）で提示されるＩＤＨ２のｍＲＮＡ配列（配列番号１２）である。 突然変異酵素Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓについての順反応（イソクエン酸からα−ＫＧ）の進行を示す。 誘導体化２−ＨＧラセミ混合物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 誘導体化Ｒ−２ＨＧ標準物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 誘導体化２−ＨＧラセミ化合物およびＲ−２−ＨＧ標準物の同時注入のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 誘導体化ネオ活性反応産物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 ネオ活性酵素反応産物およびＲ−２−ＨＧ標準物の同時注入のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 ネオ活性酵素反応産物および２−ＨＧラセミ混合物の同時注入のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 イソクエン酸のα−ＫＧへの野生型ＩＣＤＨ１触媒酸化的脱炭酸化上の、ＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈによるα−ＫＧの還元に由来する２−ＨＧの阻害効果を示す。 野生型またはＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を発現するＣＲＬ−２６１０細胞株中の２−ＨＧのレベルを示す。 野生型またはＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を発現するＨＴＢ−１４細胞株中の２−ＨＧのレベルを示す。 ヒトＩＤＨ１ゲノムＤＮＡを示す。イントロン／第２エクソン配列。 ＩＤＨ１においてＲ１３２突然変異を含有するヒト悪性神経膠腫における、２ＨＧの濃度を示す。野生型（ＷＴ）（Ｎ＝１０）として層別化するために遺伝子型決定されるか、またはＲ１３２突然変異対立遺伝子（Ｍｕｔａｎｔ）（ｎ＝１２）を担持する、外科的切除によって得られたヒト神経膠腫試料を急速凍結し、代謝産物をＬＣ−ＭＳ分析のために抽出した。１２個の突然変異腫瘍のうち、１０個はＲ１３２Ｈ突然変異、１個はＲ１３２Ｓ突然変異、１個はＲ１３２Ｇ突然変異を担持した。各記号は、各腫瘍試料中に見出される列挙された代謝産物の量を表す。赤線は、試料群の平均を示す。ＷＴとＲ１３２変異体ＩＤＨ１突然変異腫瘍との間で観察された２ＨＧ中の差異は、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０００１）により統計的に有意であった。ＷＴとＲ１３２変異体ＩＤＨ１腫瘍との間のαＫＧ、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、またはイソクエン酸レベルにおいて、統計的に有意な差異は存在しなかった。 Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１の構造分析を示す。左側には、「閉鎖した」立体配座における、Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１およびＷＴ ＩＤＨ１のオーバレイ構造が示される。右側には、「開放した」立体配座におけるＷＴ ＩＤＨ１のオーバレイ構造が、比較のために変異体ＩＤＨ１とともに示される。 αＫＧおよびＮＡＤＰＨの双方を含有する、Ｒ１３２Ｈ ＩＤＨ１（左）および野生型（ＷＴ）ＩＤＨ１（右）の活性部位の拡大された構造比較を示す。ＷＴ対Ｒ１３２Ｈ突然変異酵素において、残基１３２における変化に加えて、触媒残基Ｔｙｒ１３９およびＬｙｓ２１２の位置が異なり、またαＫＧは、触媒水素移動についてＮＡＤＰＨと比較して異なって配向される。 補因子としてのＮＡＤＰ＋によるイソクエン酸のαＫＧへの酸化的脱炭酸化について、組み換えヒト野生型（ＷＴ）およびＲ１３２Ｈ変異体（Ｒ１３２Ｈ）ＩＤＨ１酵素を評価したときの、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ変異体の酵素特性を示す。異なる濃度の酵素を使用して曲線を生成した。 補因子としてのＮＡＤＰＨによるαＫＧの還元について、ＷＴおよびＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１酵素を評価したときの、ＩＤＨ Ｒ１３２変異体の酵素特性を示す。異なる濃度の酵素を使用して曲線を生成した。 ＷＴおよびＲ１３２Ｈ ＩＤＨ１酵素について測定したときの、酸化および還元反応の動力学パラメータを示す。測定可能な酵素活性が、いずれの基質濃度でも検出可能でなかったため、ＷＴ酵素の還元活性についてのＫｍおよびｋｃａｔ値を決定することはできなかった。 組み換えヒトＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１の還元反応産物として２ＨＧを特定するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。 Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１によって産生される２ＨＧのキラリティーのジアセチル−Ｌ−酒石酸無水物誘導体化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。還元反応（ｒｘｎ）産物のみ、Ｒ（−）−２ＨＧ標準物のみ、およびこれら２つの共同（Ｒｘｎ＋Ｒ（−）−２ＨＧ）についての正規化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシグナル、ならびにＲ（−）およびＳ（＋）型（２ＨＧラセミ化合物）のみの、または反応産物との（Ｒｘｎ＋ラセミ化合物）ラセミ混合物についてのシグナルが示される。 結晶化に使用されるＣ末端親和性−精製タグ融合ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｓタンパク質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析を示す。 ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｓタンパク質試料のＦＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。 ５ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭイソクエン酸、１０ｍＭのＣａ２＋を含有するタンパク質溶液から得られた結晶を示す。沈殿剤溶液は、結晶化の懸滴法を用いて１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）および２０％ＰＥＧ６０００を含有した。 ５ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのα−ケトグルタル酸、１０ｍＭのＣａ２＋を含有するタンパク質溶液から得られた結晶を示す。沈殿剤は、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）および１２％ＰＥＧ２００００を含有した。 野生型ＩＤＨ２と比較したときの、ＩＤＨ２−Ｒ１７２Ｋ突然変異酵素における上昇したＮＡＤＰＨ還元触媒作用活性を示す棒グラフ。 以下、（Ａ）２−ＨＧのレベルを測定するためにＬＣ−ＭＳによって分析された、提示時および再発時に得られたＩＤＨ１／２野生型（ｎ＝１０）およびＩＤＨ１／２変異体（ｎ＝１６）患者白血病細胞、ならびに培養物中で１４日間成長させられたＩＤＨ１ Ｒ１３２変異体白血病細胞（ｎ＝１４）からの抽出物、ならびに（Ｂ）ＩＤＨ１野生型またはＩＤＨ１ Ｒ１３２変異体白血病を有する患者の血清中で測定された２−ＨＧを示すグラフである。（Ａ）および（Ｂ）において、各点は、個々の患者試料を表す。ひし形は、野生型を表し、丸は、ＩＤＨ１変異体を表し、三角は、ＩＤＨ２変異体を表す。水平棒は、平均を示す。（＊）は、野生型患者細胞と比較して統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異体およびＩＤＨ１野生型ＡＭＬ細胞の体外成長曲線を示す。 ａ−ＫＧ、コハク酸塩、リンゴ酸塩、およびフマル酸塩のレベルについてＬＣ−ＭＳによって検定された、最初の提示時および再発時に得られたＩＤＨ１／２変異体（ｎ＝１６）または野生型（ｎ＝１０）対立遺伝子を担持するＡＭＬ患者の白血病細胞からの抽出物の結果を示すグラフ。各点は、個々の患者試料を表す。白丸は野生型を表し、黒丸はＩＤＨ１変異体を表し、三角はＩＤＨ２変異体を表す。水平棒は、平均を表す。野生型ＡＭＬ試料とＩＤＨ１／２変異体ＡＭＬ試料との間に、統計的に有意な差異は存在しなかった。 イソクエン酸ではなく２−ＨＧが突然変異酵素反応の最終産物であることを裏付ける、組み換えＩＤＨ１ Ｒ１３２ＣおよびＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋを用いた体外反応のＬＣ−ＭＳ分析のグラフ表示を示す。 （Ａ）ＮＡＤＰのＮＡＤＰＨへの同時還元を伴う、イソクエン酸のアルファ−ケトグルタル酸への酸化的脱炭酸化の野生型ＩＤＨ１酵素触媒作用、および（Ｂ）ＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化させながらの、アルファ−ケトグルタル酸の２−ヒドロキシグルタル酸へのＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ突然変異還元を示す。これらは、それぞれ「正」反応および「一部逆」反応と称される。 （Ａ）ＮＡＤＰのＮＡＤＰＨへの同時還元を伴う、イソクエン酸のアルファ−ケトグルタル酸への酸化的脱炭酸化の野生型ＩＤＨ１酵素触媒作用、および（Ｂ）ＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化させながらの、アルファ−ケトグルタル酸の２−ヒドロキシグルタル酸へのＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ突然変異還元を示す。これらは、それぞれ「正」反応および「一部逆」反応と称される。
本発明者は、酵素（例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２）のある特定の変異型が、ネオ活性と本明細書で称される、細胞増殖関連疾患、例えば、癌等の増殖性疾患の治療において標的とされ得る機能獲得を有することを見出した。例えば、代謝経路酵素においては、機能獲得またはネオ活性は、癌治療のための標的として働き得る。細胞増殖関連疾患、例えば、癌等の増殖性疾患の治療のための方法および組成物が本明細書に記載される。方法は、対象に、治療的に有効な量のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２（例えば、ＩＤＨ１）、例えば、小分子または核酸の阻害剤を投与することによって、例えば、位置１３２でＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕ（例えば、Ｈｉｓ）を有するＩＤＨ１をコードする、事前選択されたＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、Ｃ３９４Ａ、Ｃ３９４Ｇ、Ｃ３９４Ｔ、Ｇ３９５Ｃ、Ｇ３９５Ｔ、もしくはＧ３９５Ａ変異等の、配列番号５の配列による位置３９４でＡ（例えば、Ｃ３９４変異体）、または位置３９５でＡ（例えば、Ｇ３９５変異体）を有する対立遺伝子、あるいは位置１３２でＬｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒを有するＩＤＨ２をコードし、かつ本明細書に開示のネオ活性を有する事前選択されたＩＤＨ２対立遺伝子を特徴とする神経膠腫もしくは脳腫瘍を有する対象を治療することを含む。核酸に基づく阻害剤は、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、表７〜１４のセンス鎖およびアンチセンス鎖の一次配列を含むｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡは、２つの別個の鎖、またはヘアピン構造（例えば、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を形成するように折り畳まれた一本鎖から成る。いくつかの実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、表７〜１４に提供されるアンチセンス配列を重複するか、または含む配列を有するアンチセンス等のアンチセンス核酸である。

酵素のネオ活性
本明細書で使用される、ネオ活性は、例えば、酵素の活性部位で、変異、例えば、点変異、例えば、置換の結果として生じる活性を意味する。ある実施形態では、ネオ活性は、実質的には、野生型または非変異体酵素から不在である。これは、本明細書で第１等級のネオ活性と称される場合もある。第１等級のネオ活性の例は「機能獲得」であり、変異体酵素は、新規の触媒活性を獲得する。ある実施形態では、ネオ活性は、野生型または非変異体酵素内に存在するが、変異体酵素で見られるものの１０、５、１、０．１、０．０１、または０．００１％未満であるレベルで存在する。これは、本明細書で第２級ネオ活性と称される場合もある。第２級ネオ活性の例は「機能獲得」であり、変異体酵素は、例えば、変異を欠如する時に酵素が有する触媒活性の５倍の速度の増加を有する。
いくつかの実施形態では、酵素を形成する非変異体、例えば、野生型形態は、物質Ａ（例えば、イソクエン酸）を、物質Ｂ（例えば、α−ケトグルタル酸）に転換し、かつネオ活性は、物質Ｂ（例えば、α−ケトグルタル酸）を、ネオ活性産物（例えば、２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸）と称される場合もある物質Ｃに転換する。いくつかの実施形態では、酵素、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２は、代謝経路、例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路内に存在する。
いくつかの実施形態では、酵素を形成する非変異体、例えば、野生型形態は、物質Ａを物質Ｂに転換し、かつネオ活性は、物質Ｂを物質Ａに転換する。いくつかの実施形態では、酵素は、代謝経路、例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路内に存在する。

イソクエン酸脱水素酵素
イソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）は、２−オキソグルタル酸（すなわち、α−ケトグルタル酸）へのイソクエン酸の酸化的脱炭酸反応を触媒する。これらの酵素は、２つのはっきりと異なるサブクラスに属し、そのうちの１つは、ＮＡＤ（＋）を電子受容体および他のＮＡＤＰ（＋）として利用する。５つのイソクエン酸脱水素酵素、すなわち、ミトコンドリアマトリックスに局在する３つのＮＡＤ（＋）依存性イソクエン酸脱水素酵素、そのうちの１つが、ミトコンドリアであり、他方が主に細胞質ゾルである２つのＮＡＤＰ（＋）依存性イソクエン酸脱水素酵素が報告されている。各々のＮＡＤＰ（＋）依存性アイソザイムは、ホモ二量体である。
ＩＤＨ１（イソクエン酸脱水素酵素１（ＮＡＤＰ＋）、細胞質ゾル）は、ＩＤＨ、ＩＤＰ、ＩＤＣＤ、ＩＤＰＣ、またはＰＩＣＤとしても知られている。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞質およびペルオキシソーム中に見られるＮＡＤＰ（＋）依存性イソクエン酸脱水素酵素である。それは、シグナル配列を標的とするＰＴＳ−１ペルオキシソームを含有する。ペルオキシソーム中でのこの酵素の存在は、３−エノイル−ＣｏＡｓへの２，４−ジエノイル−ＣｏＡｓの転換等の、ペルオキシソーム内減少のためのＮＡＤＰＨの再生における役割、ならびに２−オキソグルタル酸、すなわち、フィタン酸のアルファ水酸化を消費するペルオキシソーム反応における役割を示唆する。細胞質酵素は、細胞質ＮＡＤＰＨ産生における重大な役割を果たす。
ヒトＩＤＨ１遺伝子は、４１４個のアミノ酸のタンパク質をコードする。ヒトＩＤＨ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＭ＿００５８９６．２およびＮＰ＿００５８８７．２として見出され得る。ＩＤＨ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｎｅｋｒｕｔｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５：１６７４−１６８４（１９９８）、Ｇｅｉｓｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０５２７−３０５３３（１９９９）、Ｗｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：４２２−４３５（２００１）；ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：２１２１−２１２７（２００４）、Ｌｕｂｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（ＤＥＣ−２００８）ｔｏ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、Ｋｕｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（ＪＵＮ−１９９６）ｔｏ ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅｓ、ならびにＳｊｏｅｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：２６８−２７４（２００６）にも記載される。
ＩＤＨ２（イソクエン酸脱水素酵素２（ＮＡＤＰ＋）、ミトコンドリア）は、ＩＤＨ、ＩＤＰ、ＩＤＨＭ、ＩＤＰＭ、ＩＣＤ−Ｍ、またはｍＮＡＤＰ−ＩＤＨとしても知られている。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ミトコンドリア中に見られるＮＡＤＰ（＋）依存性イソクエン酸脱水素酵素である。それは、中間代謝およびエネルギー産生の役割を果たす。このタンパク質は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体と密に関連するか、または相互作用する。ヒトＩＤＨ２遺伝子は、４５２個のアミノ酸のタンパク質をコードする。ＩＤＨ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＭ＿００２１６８．２およびＮＰ＿００２１５９．２として見出され得る。ヒトＩＤＨ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｈｕｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（ＮＯＶ−１９９２）ｔｏ ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅｓ、ならびにＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：２１２１−２１２７（２００４）にも記載される。
非変異体、例えば、野生型、ＩＤＨ１は、α−ケトグルタル酸へのイソクエン酸の酸化的脱炭酸反応を触媒し、それによって、例えば、正反応でＮＡＤ＋（ＮＡＤＰ＋）をＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）に還元する：
イソクエン酸＋ＮＡＤ＋（ＮＡＤＰ＋）→α−ＫＧ＋ＣＯ２＋ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）＋Ｈ＋。
いくつかの実施形態では、変異体ＩＤＨ１のネオ活性は、α−ケトグルタル酸を２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸に転換する能力を有し得る：α−ＫＧ＋ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）＋Ｈ＋→２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸＋ＮＡＤ＋（ＮＡＤＰ＋）。
いくつかの実施形態では、ネオ活性は、対応するα−ヒドロキシル化合物へのピルビン酸塩またはリンゴ酸塩の還元であり得る。
いくつかの実施形態では、変異体ＩＤＨ１のネオ活性は、残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｅｕを有する変異体ＩＤＨ１、あるいはＹａｎらに記載される任意の他の変異（例えば、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ、またはＨｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、もしくはＬｙｓ）を有する変異体ＩＤＨ１から生じ得る。いくつかの実施形態では、変異体ＩＤＨ２のネオ活性は、残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ（例えば、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、もしくはＳｅｒ、またはＧｌｙ、Ｍｅｔ、もしくはＬｙｓ）、あるいはＹａｎらに記載の任意の他の変異を有する変異体ＩＤＨ２から生じ得る。例示的な変異には、以下：Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｇ、Ｒ１３２Ｌ、およびＲ１３２Ｖが含まれる。
いくつかの実施形態では、変異体ＩＤＨ１および／またはＩＤＨ２（例えば、本明細書に記載のネオ活性を有する変異体ＩＤＨ１および／またはＩＤＨ２）は、対象における２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の増加したレベルにつながり得る。対象、例えば、対象の脳内における、２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の蓄積は、有害であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の上昇したレベルは、中枢神経系の癌、例えば、脳腫瘍、例えば、神経膠腫、例えば、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）等の癌につながり得るか、および／または予測し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に、ネオ活性の阻害剤を投与することを含む。

２−ヒドロキシグルタル酸の検出
２−ヒドロキシグルタル酸を、例えば、ＬＣ／ＭＳによって検出することができる。培養培地中の分泌した２−ヒドロキシグルタル酸を検出するために、馴化培地の５００μＬの一定分量を収集し、メタノールと８０：２０で混合し、かつ３，０００ｒｐｍ、摂氏４度で２０分間、遠心分離することができる。２−ヒドロキシグルタル酸のレベルを評価するために、得られた浮遊物を収集し、かつＬＣ−ＭＳ／ＭＳの前に、摂氏−８０度で保存することができる。全細胞関連代謝産物を測定するために、培地を吸引することができ、かつ細胞を、例えば、非融合性の密度で、採取することができる。多種多様の異なる液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離法を使用することができる。各々の方法を、陰性エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、−３．０ｋＶ）によって、注入された代謝産物標準溶液上で最適化されるＭＳパラメータを伴う、多重反応監視（ＭＲＭ）様式で稼動する三重四重極質量分析計に共役することができる。以前に報告された方法（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １１４７，１５３−６４，２００７）の変異体に従って、代謝産物を、水系移動相で、イオン対剤として１０ｍＭのトリブチルアミンを使用する逆相クロマトグラフィーによって分離することができる。１つの方法は、ＴＣＡ代謝産物の分解を可能にする：ｔ＝０．５０％のＢ、ｔ＝５．９５％のＢ、ｔ＝７．９５％のＢ、ｔ＝８．０％のＢであり、Ｂは、１００％のメタノールの有機移動相を指す。別の方法は、２−ヒドロキシグルタル酸に対して特異的であり、５０％〜９５％のＢ（上で定義された緩衝液）からの高速直線勾配を、５分間にわたって実行する。上に記載されるように、Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ、１００ｍｍ×２ｍｍ、２．１μｍの粒子の大きさ（Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ）をカラムとして使用することができる。代謝産物を、純粋な代謝産物基準とのピーク面積の比較によって既知の濃度で定量化することができる。１３Ｃ−グルタミンからの代謝産物流動研究を、例えば、Ｍｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１１７９−８６，２００８に記載されるように実行することができる。
ある実施形態では、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧが評価され、判定が基づく検体は、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧである。ある実施形態では、判定が基づく検体は、解析法を実行する過程中に形成される２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの誘導体である。例として、そのような誘導体は、ＭＳ分析で形成される誘導体であり得る。誘導体は、例えば、ＭＳ分析で形成されるような塩付加物、例えば、Ｎａ付加物、水和反応変異体、または塩付加物、例えば、Ｎａ付加物でもある水和反応変異体を含み得る。例示的な２ＨＧ誘導体には、下に提供される化合物またはその塩付加物等の脱水誘導体が挙げられる。
試料および／または対象を評価する方法
この項は、試料を入手および分析する方法、ならびに対象を分析する方法を提供する。
方法の実施形態は、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２、２ＨＧネオ活性遺伝子型または表現型を評価するために、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性に関連する１つ以上のパラメータの評価を含む。評価は、例えば、対象を選択、診断、もしくは予後診断するため、治療薬、例えば、阻害剤を選択するため、あるいは治療に対する応答または疾病の進行を評価するために、実行され得る。ある実施形態では、治療が開始する前および／または治療が開始した後に実行され得る評価は、対象からの腫瘍試料、癌細胞試料、もしくは前癌細胞試料の分析に少なくともある程度基づいている。例えば、患者からの試料が、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在またはレベルと相関するパラメータを評価することによって、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在またはレベルに関して分析され得る。試料中のアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧは、クロマトグラフィー法によって、例えば、ＬＣ−ＭＳ分析によって判定され得る。これは、特異的結合剤、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧを結合する抗体と接触させることによっても判定され得、検出を可能にする。ある実施形態では、試料が、ネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性のレベルに関して分析される。実施形態では、試料が、変異体ＩＤＨ、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性（または対応するＲＮＡ）を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質の存在に関して分析される。例えば、変異体タンパク質特異的試薬、例えば、ＩＤＨ変異体タンパク質に特異的に結合する抗体、例えば、具体的には、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質もしくはＩＤＨ２−Ｒ１７２変異体タンパク質（例えば、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質）に結合する抗体は、ネオ活性変異体酵素を検出するために使用され得る。ある実施形態では、試料からの核酸は、本明細書に開示のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の選択的対立遺伝子または変異が存在するかを判定するために配列決定される。ある実施形態では、分析は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質（または対応するＲＮＡ）の存在を直接判定すること、あるいはＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子の配列決定すること以外である。ある実施形態では、分析は、残基１３２でのＩＤＨ１の変異および／または残基１７２でのＩＤＨ２の変異の存在を直接判定すること以外、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの配列決定すること以外である。例えば、分析は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの検出、または変異のアルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性の測定であり得る。ある実施形態では、試料が患者から除去され、分析される。ある実施形態では、評価は、試料の分析を実行すること、試料の分析を要請すること、試料の分析からの結果を要請すること、または試料の分析からの結果を受信することのうちの１つ以上を含み得る（概して、本明細書では、分析は、基礎的な方法を実行すること、または基礎的な方法を実行した別の者からデータを受信することの一方または両方を含み得る）。
ある実施形態では、治療が開始する前および／または治療が開始した後に実行され得る評価は、組織（例えば、腫瘍試料以外の組織）、または体液、または体からの産物の分析に少なくともある程度基づいている。例示的な組織には、リンパ節、皮膚、毛嚢、および爪が挙げられる。例示的な体液には、血液、血漿、尿、リンパ液、涙液、汗、唾液、精液、および脳脊髄液が挙げられる。例示的な体からの産物には、呼気が挙げられる。例えば、組織、流体、または産物が、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在もしくはレベルと相関するパラメータを評価することによって、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在もしくはレベルに関して分析される。試料中のアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧは、クロマトグラフィー法によって、例えば、ＬＣ−ＭＳ分析によって判定され得る。これは、特異的結合剤、例えば、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧを結合する抗体と接触させることによっても判定され得、検出を可能にする。実施形態では、十分なレベルが存在する場合に、流体または産物が、ネオ活性、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性のレベルに関して分析され得る。ある実施形態では、試料が、変異体ＩＤＨ、例えば、アルファヒドロキシネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性（または対応するＲＮＡ）を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質に関して分析される。例えば、変異体タンパク質特異的試薬、例えば、ＩＤＨ変異体タンパク質に特異的に結合する抗体、例えば、具体的には、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質もしくはＩＤＨ２−Ｒ１７２変異体タンパク質（例えば、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質）に結合する抗体が、ネオ活性変異体酵素を検出するために使用され得る。ある実施形態では、試料からの核酸は、本明細書に開示のＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２の選択的対立遺伝子または変異が存在するかを判定するために配列決定される。ある実施形態では、分析は、変異体ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質（または対応するＲＮＡ）の存在を直接判定すること、あるいはＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子の配列決定すること以外である。例えば、分析は、アルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの検出、または２ＨＧネオ活性の測定であり得る。ある実施形態では、組織、流体、または産物が患者から除去され、分析される。ある実施形態では、評価は、組織、流体、もしくは産物の分析を実行すること、組織、流体、もしくは産物を要請すること、組織、流体、もしくは産物の分析からの結果を要請すること、または組織、流体、もしくは産物の分析からの結果を受信することのうちの１つ以上を含み得る。
ある実施形態では、治療が開始する前および／または治療が開始した後に実行され得る評価は、対象のアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの画像に少なくともある程度基づいている。実施形態では、磁気共鳴法は、対象におけるアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルを評価するために使用される。ある実施形態では、対象は、画像分析および／または分光分析、例えば、磁気共鳴に基づく分析、例えば、ＭＲＩおよび／またはＭＲＳ、例えば、分析に供され、任意で、腫瘍のアルファヒドロキシネオ活性産物、例えば、２ＨＧ、例えば、Ｒ−２ＨＧの存在、分布、またはレベルに対応する画像が形成される。任意で、画像または画像に関連する値は、有形媒体内に保存されるか、および／または第２の場所に送信される。ある実施形態では、評価は、画像分析を実行すること、画像分析を要請すること、画像分析からの結果を要請すること、または画像分析からの結果を受信することのうちの１つ以上を含み得る。

増殖性疾患を治療する方法
例えば、変異体酵素、例えば、代謝経路、例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路内の酵素、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性を阻害することによって、細胞増殖関連疾患、例えば、癌、例えば、神経膠腫を治療する方法が、本明細書に記載される。癌は、１つ以上の変異体酵素（例えば、代謝経路、例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路内の酵素、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２）中における、機能獲得等のネオ活性の存在を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、機能獲得は、２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸へのα−ケトグルタレートの転換である。

癌治療のための化合物
候補化合物を、ネオ活性の調節（例えば、阻害）に関して、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて評価することができる。候補化合物はまた、野生型または非変異体活性の調節（例えば、阻害）に関しても評価することができる。例えば、任意の活性（例えば、酵素活性）の産物または副産物の形成をアッセイすることができ、それゆえに、候補化合物を評価することができる。いくつかの実施形態では、活性（例えば、野生型／非変異体またはネオ活性）を酵素アッセイからの１つ以上の読み出しを測定することによって評価することができる。例えば、基質ならびに／または産物の本質および／もしくは量における変化を、例えば、蛍光または放射性標識基質を用いて測定することができる。例示的な基質および／または産物には、α−ケトグルタル酸、ＣＯ２、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、および２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵素反応の本質および／または量を評価することができるように、酵素の反応の速度も評価することができる。可能性のある酵素活性の測定に加えて、活性（例えば、野生型／非変異体もしくはネオ活性）を、可能性のある基質、共同因子、または酵素活性修飾因子の酵素への結合時に、タンパク質蛍光を消光することによって検出することができる。
一実施形態では、アッセイの進行を、ＯＤ３４０またはＮＡＤもしくはＮＡＤＰ共同因子の蛍光における変化によって監視することができる。別の実施形態では、アッセイのダイナミックレンジを増加させるために、連続モードまたは終点モードで、反応の進行を二次酵素アッセイ系に共役することができる。例えば、過剰なジアフォラーゼおよびレサズリンを反応に添加することによって、終点アッセイを実行することができる。ジアフォラーゼは、残りのＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを消費する一方で、レサズリンからレゾルフィンを産生する。レゾルフィンは、Ｅｘ５４４ Ｅｍ５９０における蛍光で測定することができる高蛍光産物である。これは、反応を終了させるだけでなく、共同因子の蛍光よりも大きい量子収率で、容易に検出可能な信号を発生させる。
一次反応の産物を、より大きいダイナミックレンジの検出可能な結果またはより便利な検出モードを産出する二次酵素反応に共役することを介して、連続アッセイを実行することができる。例えば、ＮＡＤＰ＋依存性酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）および６−メトキシ−２−ナフトアルデヒド、ＡＬＤＨの発色基質の混合の反応における包含は、イソクエン酸脱水素酵素によるＮＡＤＰ＋の産生に依存した速度で、蛍光産物６−メトキシ−２−ナフトエ酸（Ｅｘ３１０ Ｅｍ３６０）の産生をもたらす。アルデヒドデヒドロゲナーゼ等の共役酵素の包含は、この酵素がＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋の両方を利用する能力があるため、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋が産生されるかに関係なく、ネオ活性のスクリーニングを可能にするさらなる利益を有する。さらに、「逆」アッセイを必要とするＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ共同因子が再生されるので、共同因子をＩＤＨ酵素に戻して循環させる役酵素系は、共同因子結合の競合阻害剤の検出を高める目的のために、Ｋｍをはるかに下回った共同因子濃度で連続アッセイを行うことを可能にするさらなる利点を有する。
活性（例えば、野生型／非変異体またはネオ活性）スクリーニングのさらなる第３の実施形態では、１つもしくはいくつかのＩＤＨ基質、共同因子、または産物を、化学反応を介して、続く特定の基質または基質の原子のために、定義された原子において放射性または「重」元素で同位体的に標識することができる。例えば、ａ−ＫＧ、イソクエン酸、または２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸のアルファ炭素は、１４Ｃもしくは１３Ｃであり得る。形成される産物の量、速度、同一性、および構造を、当業者に既知の手段、例えば、質量分光法または放射ＨＰＬＣで分析することができる。
ネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を阻害する化合物は、例えば、小分子、核酸、タンパク質、および抗体を含むことができる。
例示的な小分子には、例えば、酵素に結合し、かつそれらの活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を減少させる小分子が挙げられる。阻害剤の結合は、基質が酵素の活性部位に入るのを阻止するか、および／または酵素がその反応を触媒するのを妨害することができる。阻害剤結合は、可逆または不可逆のいずれかである。不可逆阻害剤は、通常、酵素に反応し、かつそれを化学的に変化させる。これらの阻害剤は、酵素活性に必要とされる主要なアミノ酸残基を修飾することができる。対照的に、可逆阻害剤は非共有的に結合し、異なる種類の阻害は、これらの阻害剤が酵素、酵素基質複合体、または両方を結合するかによって産生される。
いくつかの実施形態では、小分子は、オキサロリンゴ酸塩、オキサロフマル酸エステル塩、またはオキサロコハク酸塩である。
いくつかの実施形態では、小分子は、式（Ｘ）の化合物、または表２４ａに記載されるような化合物である。式（Ｘ）の化合物が、下に提供される：
式中、Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキレン（例えば、メチレン）、Ｃ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキレンであり、Ｘは、任意で置換され、
Ｒ１は、ハロ（例えば、フルオロ）、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミド、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはＣ（Ｏ）ＯＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつ
ｍは、０、１、２、または３である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＸＩ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩または表２４ｂに記載される化合物である。
式中、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれＣＨもしくはＮから独立して選択され、
ＢおよびＢ１は、水素、アルキルから独立して選択されるか、またはそれらが付着する炭素と一緒になると、カルボニル基を形成し、
Ｑは、Ｃ＝ＯまたはＳＯ２であり、
ＤおよびＤ１は、結合、酸素、またはＮＲｃから独立して選択され、
Ａは、任意で置換されたアリールまたは任意で置換されたヘテロアリールであり、
Ｒ１は、アルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、およびヘテロアラルキルから独立して選択され、それらの各々は、０〜３回発生のＲｄと任意で置換され得、
各Ｒ３は、ハロ、ハロアルキル、アルキル、および−ＯＲａから独立して選択され、
各Ｒａは、アルキル、およびハロアルキルから独立して選択され、
各Ｒｂは、独立してアルキルであり、
各Ｒｃは、水素、アルキル、およびアルケニルから独立して選択され、
各Ｒｄは、ハロ、ハロアルキル、アルキル、ニトロ、シアノ、および-ＯＲａから独立し
て選択されるか、もしくはそれらが付着する炭素原子と一緒になる２つのＲｄは、任意で置換されたヘテロシクリルを形成し、
ｎは、０、１、または２であり、
ｈは、０、１、２であり、かつ
ｇは、０、１、または２である。
いくつかの実施形態では、小分子は、（例えば、野生型活性と比較して）ネオ活性の選択的阻害剤である。
例えば、酵素の発現を減少させることによって、ネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を阻害するために、核酸を使用することができる。例示的な核酸には、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムが挙げられる。特定の遺伝子配列のために、阻害分子、例えば、ｓｉＲＮＡ分子を選択するために、当分野で既知の方法を使用することができる。
酵素および／または基質を直接的もしくは間接的に結合するか、あるいは酵素および／または基質への結合を競合することによって、ネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を阻害するために、タンパク質も使用することができる。例示的なタンパク質には、例えば、可溶性受容体、ペプチド、および抗体が挙げられる。例示的な抗体には、例えば、その酵素もしくは基質を結合する能力を保持する全体の抗体またはその断片が挙げられる。
本明細書に記載のネオ活性（例えば、変異体ＩＤＨ１に関連するネオ活性）の阻害に関して試験され得る例示的な候補化合物は、以下の参考文献に記載され、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８），１６（７），３５８０−３５８６、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００７），４２（１），４４−５１、ＫＲ２００５０３６２９３Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５），７１（９），５４６５−５４７５、ＫＲ ２００２０９５５５３Ａ、米国特許出願米国第２００４０６７２３４号Ａ１、ＰＣＴ国際出願（２００２）、ＷＯ２００２０３３０６３ Ａ１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６），６１（１４），４５２７−４５３１、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９７６），４５２（２），３０２−９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７５），２５０（１６），６３５１−４、Ｂｏｌｌｅｔｔｉｎｏ−Ｓｏｃｉｅｔａ Ｉｔａｌｉａｎａ ｄｉ Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（１９７２），４８（２３），１０３１−５、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９６９），２４４（２０），５７０９−１２。

異性体
ある特定の化合物は、シスおよびトランス形態、ＥおよびＺ形態、ｃ、ｔ、およびｒ形態、内部および外部形態、Ｒ、Ｓ、およびメソ形態、ＤおよびＬ形態、ｄおよびｌ形態、（＋）および（−）形態、ケト、エノール、およびエノラート形態、合成および抗形態、向斜および背斜形態、αおよびβ形態、軸および赤道形態、舟形、椅子形、捻れ、エンベロープ、および半椅子形形態、ならびにその組み合わせが含まれるが、それらに限定されない、１つ以上の特定の幾何、光学、鏡像異性、ジアステレオ異性、エピマー、アトロピック（ａｔｒｏｐｉｃ）、立体異性体、互変異性、配座、またはアノマー形態で存在し得、以下、集合的に「異性体」（または「異性体形態」）と称される。
一実施形態では、本明細書に記載の化合物、例えば、ネオ活性の阻害剤または２−ＨＧは、本明細書に記載の立体異性体の鏡像異性的に濃縮された異性体である。例えば、化合物は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の鏡像体過剰率を有する。本明細書で使用される時、光学異性体は、分子構造が相互に対して鏡像関係を有する化学化合物の一対のいずれかを指す。
一実施形態では、本明細書に開示の化合物の調製は、選択された立体化学、例えば、ＲまたはＳを有し、選択された立体中心、例えば、２−ヒドロキシグルタル酸の２−位置に対応する化合物の異性体のために濃縮される。２ＨＧを商業的供給源から購入することができるか、あるいは例えば、Ｏｒｇ．Ｓｙｎ．Ｃｏｌｌ ｖｏｌ．，７，Ｐ−９９，１９９０に記載されるような、当分野で既知の方法を用いて調製することができる。例えば、化合物は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の選択された立体中心の選択された立体化学を有する化合物に対応する純度を有する。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、選択された立体中心、例えば、２−ヒドロキシグルタル酸の２−位置で、選択された立体化学、例えば、ＲまたはＳを有する１つの構造または複数の構造のために濃縮される、本明細書に開示の化合物の調製を含む。例示的なＲ／Ｓ配置は、本明細書に記載の例に提供される配置であり得る。
本明細書で使用される「濃縮調製物」は、対象化合物内の１つ、２つ、３つ以上の選択された立体中心の選択された立体配置のために濃縮される。例示的な選択された立体中心およびその例示的な立体配置は、本明細書、例えば、本明細書に記載の例に提供されるものから選択され得る。濃縮されるとは、例えば、調製物中の化合物の分子の少なくとも６０％が、選択された立体中心の選択された立体化学を有することを意味する。ある実施形態では、それは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。濃縮されたとは、１つまたは複数の対象分子のレベルを指し、特定されない限り、処理限界を暗示しない。
留意すべき点は、互変異性形態に関して下で説明するものを除き、構造（または構成）異性体（すなわち、単に空間的な原子の位置によってというよりはむしろ、原子間の連結において異なる異性体）が、本明細書で使用される「異性体」という用語から具体的に除外されることである。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ３への言及は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基、−ＣＨ２ＯＨへの言及として解釈されるべきではない。同様に、オルトクロロフェニルへの言及は、その構造異性体であるメタクロロフェニルへの言及として解釈されるべきではない。しかしながら、構造の種類への言及は、その種類の範囲に収まる構造異性体形態を十分に含み得る（例えば、Ｃ１−７アルキルには、ｎ−プロピルおよびイソプロピルが含まれ、ブチルには、ｎ−、イソ−、ｓｅｃ−、およびｔｅｒｔ−ブチルが含まれ、メトキシフェニルには、オルト、メタ、およびパラメトキシフェニルが含まれる）。
上記の除外は、例えば、以下の互変異性対にあるような互変異性形態、例えば、ケト、エノール、およびエノラート形態に属さない：ケト／エノール（下に説明）、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ、およびニトロ／アシニトロ。
留意すべき点は、「異性体」という用語には、１つ以上の同位体置換を有する化合物が具体的に含まれるということである。例えば、Ｈは、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、および３Ｈ（Ｔ）を含む任意の同位体形態であり得、Ｃは、１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃを含む任意の同位体形態であり得、Ｏは、１６Ｏおよび１８Ｏを含む任意の同位体形態であり得る、等である。別途特定されない限り、特定の化合物への言及には、（全体または部分的）ラセミ混合物およびその他の混合物を含む全てのそのような異性体形態が含まれる。そのような異性体形態の調製（例えば、不斉合成）ならびに分離（例えば、分別結晶およびクロマトグラフ手段）のための方法は、当分野で既知であるか、あるいは本明細書で教授される方法または既知の方法を既知の様式で適応させることによって容易に得られる。

塩
活性化合物の対応する塩、例えば、薬学的に許容される塩を調製、浄化、および／または処理することが簡便あるいは望ましい場合がある。薬学的に許容される塩の例は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｓａｌｔｓ」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ＳｃＬ．Ｖｏｌ．６６，ｐｐ．１−１９で説明される。
例えば、化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ"であり得る）官能基を有する場合に、ひいては塩は、好適なカチオンと形
成され得る。好適な無機カチオンの例には、Ｎａ＋およびＫ＋等のアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、ならびにＡｌ＋３等の他のカチオン等のアルカリ土類カチオンが挙げられるが、それらに限定されない。好適な有機カチオンの例には、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）ならびに置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにリジンおよびアルギニン等のアミノ酸に由来するものである。一般的な第４級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
化合物がカチオン性であるか、またはカチオン性であり得る（例えば、ＮＨ２は−ＮＨ３＋であり得る）官能基を有する場合に、ひいては塩は、好適なアニオンと形成され得る。好適な無機アニオンの例には、以下の無機酸に由来するものが挙げられるが、それらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、および亜リン酸。
好適な有機アニオンの例には、以下の有機酸に由来するものが挙げられるが、それらに限定されない：２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、および吉草酸。好適なポリマー有機アニオンの例には、以下のポリマー酸に由来するものが挙げられるが、それらに限定されない：タンニン酸、カルボキシメチルセルロース。
別途特定されない限り、特定の化合物への言及には、その塩形態も含まれる。

化学的に保護された形態
化学的に保護された形態で活性化合物を調製、浄化、および／または処理することが簡便あるいは望ましい場合がある。「化学的に保護された形態」という用語は、従来の化学感覚において本明細書で使用され、かつ１つ以上の反応性官能基が特定の条件下（例えば、ｐＨ、温度、放射線療法、溶媒等）で望ましくない化学反応から保護される化合物に属する。実際には、特定の条件下においてさもなければ反応性であったであろう官能基を可逆的に非反応性にするために、周知の化学的方法が採用される。化学的に保護された形態において、１つ以上の反応性官能基は、被保護基または保護基（としても知られている、被マスク基またはマスク基あるいは被封鎖基または封鎖基）の形態である。反応性官能基を保護することで、被保護基に影響を及ぼすことなく、他の非保護反応性官能基が関与する反応を実行することができ、保護基を、分子の残りの部分に実質的に影響を及ぼすことなく、通常後続ステップで除去することができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｔ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｗｕｔｓ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）を参照されたい。別途特定されない限り、特定の化合物への言及には、その化学的に保護された形態も含まれる。
多種多様のそのような「保護」「封鎖」または「マスク」方法が広範に使用され、かつ有機合成において周知である。例えば、両方ともに特定の条件下で反応性であろう２つの不等価反応性官能基を有する化合物は、特定の条件下で官能基の１つを被保護、したがって、非反応性にし、そのようにして保護され、化合物は、１つの反応性官能基のみを効果的に有する反応物として使用され得る。所望の反応（他の官能基を含む）が完了した後に、被保護基は、それをその本来の官能性に戻すために「脱保護され」得る。
例えば、ヒドロキシ基は、エーテル（−ＯＲ）またはエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ）、例えば、ｔ−ブチルエーテル、ベンジル、ベンズヒドリル（ジフェニルメチル）、またはトリチル（トリフェニルメチル）エーテル、トリメチルシリルもしくはｔ−ブチルジメチエルシリルエーテル、あるいはアセチルエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＯＡｃ）として保護され得る。
例えば、アルデヒドまたはケトン基は、それぞれ、例えば、第一級アルコールとの反応によって、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）がジエテール（＞Ｃ（ＯＲ）２）に転換されるアセタール（Ｒ−ＣＨ（ＯＲ）２）またはケタール（Ｒ２Ｃ（ＯＲ）２）として保護され得る。アルデヒドまたはケトン基は、酸の存在下で、大過剰の水を用いる加水分解によって容易に再生される。
例えば、アミン基は、例えば、アミド（−ＮＲＣＯ−Ｒ）またはウレタン（−ＮＲＣＯ−ＯＲ）として、例えば、メチルアミド（−ＮＨＣＯ−ＣＨ３）、ベンジルオキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−Ｃｂｚ）、ｔ−ブトキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）３、−ＮＨ−Ｂｏｃ）として、２−ビフェニル−２−プロポキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ４Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシアミド（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）として、６−ニトロベラトリルオキシアミド（−ＮＨ−Ｎｖｏｃ）として、２−トリメチルシリルエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｅｏｃ）として、２，２，２−トリクロロエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）として、アリルオキシアミド（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）として、２（−フェニルスルホニル）エチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｐｓｅｃ）として、または好適な事例（例えば、環状アミン）では、ニトロキシドラジカル（＞Ｎ−Ｏ≪）として保護され得る。
例えば、カルボン酸基は、エステルとして、例えば、Ｃ＾アルキルエステル（例えば、メチルエステル、ｔ−ブチルエステル）、Ｃｖｒハロアルキルエステル（例えば、Ｃ１−７トリハロアルキルエステル）、トリＣ１−７アルキルシリル−Ｃｉ．７アルキルエステル、もしくはＣ５．２ｏアリール−Ｃ１−７アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル、ニトロベンジルエステル）、またはアミドとして、例えば、メチルアミドとして保護され得る。
例えば、チオール基は、チオエーテル（−ＳＲ）として、例えば、ベンジルチオエーテル、アセトアミドメチルエーテル（−Ｓ−ＣＨ２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３）として保護され得る。

核酸に基づく阻害剤
ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１の阻害のための核酸に基づく阻害剤は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ機構）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって機能する、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、標的ｍＲＮＡに結合し、例えば、標的ｍＲＮＡの切断によって、それからのタンパク質の産生を阻害する。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）
ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体機能を低下させるのに有用である核酸に基づく阻害剤は、例えば、ＲＮＡｉ機構で作用するｄｓＲＮＡ等のｄｓＲＮＡである。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを含むことが理解される。典型的には、ｄｓＲＮＡによるＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１の阻害は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらす、タンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介活性化に起因するインターフェロン応答性を引き起こさない。
ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１酵素、例えば、野生型もしくは変異体ＩＤＨ１を標的とするｄｓＲＮＡは、未修飾であるか、または化学的に修飾され得る。ｄｓＲＮＡは、化学的に合成されるか、ベクターから発現されるか、または酵素的に合成され得る。本発明は、ＩＤＨ１遺伝子発現またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による細胞中での活性を調節する能力のある様々な化学的に修飾された合成ｄｓＲＮＡ分子も特色とする。化学的に修飾されたｄｓＲＮＡの使用は、生体内のヌクレアーゼ分解への増加した耐性を介して、および／または改善された細胞取り込みを介して等、天然ｄｓＲＮＡ分子の様々な性質を改善する。
ｄｓＲＮＡ標的核酸は、２つの別個のＲＮＡから構成され得るか、またはヘアピン構造を形成するために折り畳まれる１つのＲＮＡ鎖から構成され得る。ヘアピンｄｓＲＮＡは、典型的には、ｓｈＲＮＡと称される。
ＩＤＨ、例えば、変異体もしくは野生型ＩＤＨ１遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡは、ベクター、例えば、レンチウイルスまたはアデノウイルスベクター等のウイルスベクターから発現され得る。ある特定の実施形態では、ＩＤＨ１遺伝子の発現を阻害するための好適なｄｓＲＮＡは、アデノウイルスまたはレンチウイルスｓｉＲＮＡライブラリ等のｓｉＲＮＡライブラリをスクリーニングすることによって同定され得る。
ある実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１を標的とするｄｓＲＮＡは、約１５〜約３０塩基対長（例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９塩基対長）である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１〜約３（例えば、約１、２、もしくは３）個のヌクレオチドのオーバーハング末端を含む。「オーバーハング」とは、ｄｓＲＮＡの１つの鎖の３’末端が、他の鎖の５’末端を超えて延在するか、または逆もまた同様であることを意味する。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子の一方または両方の末端にオーバーハングを有し得る。いくつかの実施形態では、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’終端に、またはあるいはセンス鎖の３’終端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＴＴまたはＵＵジヌクレオチドオーバーハング、例えば、ＴＴまたはＵＵジヌクレオチドオーバーハングである。例えば、ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２１ヌクレオチドアンチセンス鎖、１９塩基対二本鎖領域、および３’末端ジヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、両方の末端が平滑であるか、またはあるいは、末端の１つのが平滑である二本鎖核酸を含む。
ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、第１および第２の鎖を含み、各鎖は、約１８〜約２８ヌクレオチド長、例えば約１９〜約２３ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡの第１の鎖は、ｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉を介してＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１ ｍＲＮＡを直接切断するのに十分であるＩＤＨ、例えば、ＤＨ１ ＲＮＡに対する相補性を有するヌクレオチド配列を含み、ｄｓＲＮＡの第２の鎖は、第１の鎖に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、遺伝子の野生型および変異体形態を標的とし得るか、あるいは同一の遺伝子の異なる対立遺伝子アイソフォームを標的とし得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、異なるアイソフォームの２つ以上において同一である配列を標的とする。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、位置３９５でＧまたは位置３９４でＣを有するＩＤＨ１（例えば、野生型ＩＤＨ１ ＲＮＡ）、およびＣ３９４Ａ、Ｃ３９４Ｇ、Ｃ３９４Ｔ、Ｇ３９５Ｃ、Ｇ３９５ＴまたはＧ３９５Ａ変異等の、位置３９５でＡまたは位置３９４でＡを有するＩＤＨ１（例えば、Ｇ３９５Ａおよび／またはＣ３９４Ａ変異を担持するＩＤＨ１ ＲＮＡ）を標的とする（図２）。
ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、優先的もしくは特異的に、変異体ＩＤＨ ＲＮＡまたは特定のＩＤＨ多型を標的とする。いくつかの実施形態では、ＩＤＨは、Ｃ３９４Ａ、Ｃ３９４Ｇ、Ｃ３９４Ｔ、Ｇ３９５Ｃ、Ｇ３９５ＴまたはＧ３９５Ａ変異等の、位置３９４もしくは３９５で変異を有する。例えば、ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、位置３９５でＡ、例えば、Ｇ３９５Ａを担持するＩＤＨ１ ＲＮＡを標的とし、別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、位置３９４でＡ、例えば、Ｃ３９４Ａ変異を担持するＩＤＨ１ ＲＮＡを標的とする。
ある実施形態では、ＩＤＨ ＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡは、１つ以上の化学修飾を含む。そのような化学修飾の非限定的な例には、制限なく、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「環状」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ならびに末端グリセリルおよび／または逆位デオキシ脱塩基残基組込みが挙げられる。そのような化学修飾は、細胞中のＲＮＡｉ活性を保存することが示された一方で、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増加させた。さらに、１つ以上のホスホロチオエート置換は、良好な耐容性があり、修飾されたｄｓＲＮＡコンストラクトの血清安定性において実質的な増加を与えることが示された。
ある実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１、ＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを、安定性、活性、および／または生物学的利用能等の生体外もしくは生体内特性を改善するために使用することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、分子中に存在するヌクレオチドの総数の割合として修飾ヌクレオチドを含むことができる。そのようなものとして、ｄｓＲＮＡは、概して、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１を標的とするｄｓＲＮＡは、約２１ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、任意のリボヌクレオチドを含有せず、かつ別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のリボヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１５〜約３０個の（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の）ヌクレオチドを含み、各鎖は、他の鎖のヌクレオチドに対して相補的である約１５〜約３０個の（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の）ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ｄｓＲＮＡの鎖の１つは、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部分に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、ｄｓＲＮＡの第２の鎖は、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子またはその一部分のヌクレオチド配列と実質的に同様のヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態では、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２を標的とするｄｓＲＮＡは、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子またはその一部分のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域、ならびにＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２遺伝子またはその一部分のヌクレオチド配列と実質的に同様のヌクレオチド配列を有するセンス領域を含む。ある実施形態では、アンチセンス領域およびセンス領域は、独立して、約１５〜約３０個の（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の）ヌクレオチドを含み、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに対して相補的である、約１５〜約３０個の（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の）ヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、およびその他等の、配列特異的ＲＮＡｉを媒介する能力のある核酸分子を含むことを意味する。加えて、本明細書で使用される、「ＲＮＡｉ」という用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクス等の配列特異的ＲＮＡ干渉を含むことを意味する。
核酸に基づくＩＤＨ阻害剤
ある実施形態では、阻害剤は、変異体ＩＤＨ、例えば、変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２を標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡ等の核酸に基づく阻害剤である。
一実施形態では、核酸に基づく阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンス分子は、Ａｒｇ以外を有する、例えば、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＹａｎらに記載される任意の残基を有するＩＤＨ１の発現を減少あるいは阻害する。一実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、残基１３２でＨｉｓを有するＩＤＨ１酵素の発現を減少または阻害する。
ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、本明細書に記載のＩＤＨ１対立遺伝子、例えば、残基１３２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ１対立遺伝子をコードするｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡである。例えば、対立遺伝子は、配列番号８（図２１も参照）の配列による残基１３２で、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、もしくはＬｅｕ、またはＹａｎらに記載される任意の残基をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＨｉｓを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１３２でＳｅｒを有するＩＤＨ１をコードする。
ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、ＩＤＨ１、例えば、ヌクレオチド位置３９４でＡもしくはＴ（またはＣ以外のヌクレオチド）あるいはヌクレオチド位置３９５でＡ（またはＧ以外のヌクレオチド）を有するＩＤＨ１、例えば、配列番号８（図２１Ａも参照）のＩＤＨ１配列によるＣ３９４Ｔ変異またはＧ３９５Ａ変異を担持する変異体対立遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡである。
ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、野生型転写物と変異体転写物との間で同一であるＩＤＨ１ ｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ヌクレオチド位置３９４でＣ以外、例えば、ＴまたはＡ、あるいは３９５でＧ以外、例えば、Ａを有するＩＤＨ１（例えば、変異体）、ならびにヌクレオチド位置３９４でＣ、あるいはヌクレオチド位置３９５でＧを有するＩＤＨ１（例えば、野生型）を標的とする。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、特定の変異体または多型（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）等）を標的とするが、野生型対立遺伝子を標的としない。この場合、核酸に基づく阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、変異を含有するＩＤＨ１の領域を標的とする。
いくつかの実施形態では、核酸に基づく阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、野生型ＩＤＨ１の産物と比較して、優先的または特異的に、変異体ＩＤＨ１の産物を阻害する。いくつかの実施形態では、ＩＤＨは、Ｃ３９４Ａ、Ｃ３９４Ｇ、Ｃ３９４Ｔ、Ｇ３９５Ｃ、Ｇ３９５Ｔ、またはＧ３９５Ａ変異等の、位置３９４もしくは３９５で変異を有する。例えば、一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、変異（例えば、配列番号５によるＣ３９４ＴまたはＧ３９５Ａ変異のＣ３９４Ａ）を担持するＩＤＨ１ ｍＲＮＡの領域を標的とする。
一実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、表７〜１４に示される一次配列を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡである。別の実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、表７〜１４に示されるアンチセンス一次配列の全てもしくは一部を含むか、あるいは表７〜１４のｄｓＲＮＡと同一または実質的に同一の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、配列番号１０（図２２も参照）のアミノ酸配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基を有するＩＤＨ２の発現を減少あるいは阻害する。一実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２酵素の発現を減少または阻害する。
ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、本明細書に記載のＩＤＨ２対立遺伝子、例えば、残基１７２でＡｒｇ以外を有するＩＤＨ２対立遺伝子をコードするｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡである。例えば、対立遺伝子は、配列番号１０（図２２も参照）の配列による残基１７２で、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＹａｎらに記載される任意の残基を有し得る。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＬｙｓを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、対立遺伝子は、残基１７２でＭｅｔを有するＩＤＨ２をコードする。
ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、ＩＤＨ２、例えば、ヌクレオチド位置５１４でＧもしくはＴ（またはＡもしくはＣ以外のヌクレオチド）あるいはヌクレオチド位置５１５でＡもしくはＴまたはＣ（またはＧ以外のヌクレオチド）を有するＩＤＨ２、例えば、配列番号１０（図２２Ａ）のＩＤＨ２配列によるＡ５１４Ｇ変異またはＧ５１５ＴもしくはＧ５１５Ａ変異を担持する変異体対立遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡである。一実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、ＩＤＨ２、例えば、配列番号１０のＩＤＨ２配列によるヌクレオチド位置５１６で、ＣもしくはＴ（またはＧもしくはＡ以外のヌクレオチド）を有するＩＤＨ２を標的とするｄｓＲＮＡである。
ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、ＩＤＨ２、例えば、配列番号１０のＩＤＨ２配列によるヌクレオチド位置５１４でＧ、またはヌクレオチド位置５１５でＴ、あるいは位置５１５でＡを有するＩＤＨ２を標的とするｄｓＲＮＡである。
ある実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、野生型転写物と変異体転写物との間で同一であるＩＤＨ２ ｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ヌクレオチド位置５１４でＡ以外、例えば、ＧもしくはＴ、または位置５１５でＧ以外、例えば、ＡもしくはＣまたはＴ、あるいはＧ以外、例えば、ＣもしくはＴを有するＩＤＨ２（例えば、変異体）、ならびにヌクレオチド位置５１４でＡ、ヌクレオチド位置５１５でＧ、位置５１６でＧを有するＩＤＨ２（例えば、野生型）を標的とする。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、特定の変異体または多型（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）等）を標的とするが、野生型対立遺伝子を標的としない。この場合、核酸に基づく阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、変異を含有するＩＤＨ２の領域を標的とする。
いくつかの実施形態では、核酸に基づく阻害剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、野生型ＩＤＨ２の産物と比較して、優先的または特異的に、変異体ＩＤＨの産物を阻害する。例えば、一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、変異（例えば、配列番号１０によるＡ５１４ＧもしくはＧ５１５ＴまたはＧ５１５Ｕ変異）を担持するＩＤＨ２ ｍＲＮＡの領域を標的とする。
一実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、表１５〜２３に示される一次配列を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡである。別の実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、表１５〜２３に示されるアンチセンス一次配列の全てもしくは一部を含むか、あるいは表１５〜２３のｄｓＲＮＡと同一または実質的に同一の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、例えば、髄腔内または脳室内送達によって、脳、例えば、直接脳に送達される。核酸に基づく阻害剤は、埋め込み型デバイスからも送達され得る。ある実施形態では、核酸に基づく阻害剤は、例えば、カテーテル、および任意で、ポンプを用いる注入によって送達される。
アンチセンス
好適な核酸に基づく阻害剤は、アンチセンス核酸を含む。理論によって拘束されるものではないが、アンチセンス阻害は、少なくとも１つの鎖または断片が切断されるか、分解されるか、またはさもなければ手術不能にされるように、典型的には、オリゴヌクレオチド鎖または断片の水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づいていると考えられる。
アンチセンス剤は、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ ＤＮＡに結合することができる。実施形態では、それは、複製および転写を阻害する。理論によって拘束されるものではないが、アンチセンス剤は、例えば、タンパク質翻訳部位への標的ＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のＲＮＡ種を産出するためのＲＮＡのスプライシング、ならびにＲＮＡを含む触媒活性または複合体形成を阻害する働きをすることもできると考えられる。
アンチセンス剤は、ｄｓＲＮＡに好適であるように、上記の化学修飾を有することができる。
アンチセンス剤は、例えば、約８〜約８０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約８０個のヌクレオチド）、例えば、約８〜約５０個の核酸塩基、または約１２〜約３０個の核酸塩基を含み得る。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、標的の核酸にハイブリッド形成し、かつその発現を調節するおよび他の短い触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物は、標的遺伝子の配列に対して相補的である少なくとも８個の連続した核酸塩基の一続きを含み得る。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリッド形成可能であるために、その標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、有用性の喪失を引き起こすために標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常機能を妨害し、かつ特異的結合が所望される条件下、すなわち、生体内アッセイまたは治療処置において生理学的条件下で、あるいは生体外アッセイにおいてアッセイが行われる条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリッド形成可能である。
ｍＲＮＡ（例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２をコードするｍＲＮＡ）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの正常機能のうちの１つ以上を妨害し得る。理論によって拘束されるものではないが、妨害されるｍＲＮＡの機能は、全ての主要な機能、たとえば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のＲＮＡ種を産出するためのＲＮＡのスプライシング、ならびにＲＮＡによって係合され得る触媒活性を含むと考えられる。ＲＮＡへの１つまたは複数の特異タンパク質の結合はまた、ＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって妨害され得る。
例示的なアンチセンス化合物には、標的核酸、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２をコードするｍＲＮＡを特異的にハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡ配列が挙げられる。相補領域は、約８〜約８０個の核酸塩基にわたって延在し得る。化合物は、１つ以上の修飾核酸塩基を含み得る。修飾核酸塩基は、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、ならびにＣ５−プロピニルシトシンおよびＣ５−プロピニルウラシル等のＣ５−プロピニルピリミジン等の、例えば、５−置換ピリミジンを含み得る。他の好適な修飾核酸塩基は、Ｎ４−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルアミノシトシンおよびＮ４，Ｎ４−（Ｃ１−Ｃ１２）ジアルキルアミノシトシンを含む。修飾核酸塩基は、例えば、７−ヨード−７−デアザプリン、７−シアノ−７−デアザプリン、７−アミノカルボニル−７−デアザプリン等の、７−置換−５−アザ−７−デアザプリンおよび７−置換−７−デアザプリンも含み得る。これらの例には、６−アミノ−７−ヨード−７−デアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−デアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−ヨード−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−デアザプリン、および２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリンが挙げられる。さらに、Ｎ６−メチルアミノアデニンおよびＮ６，Ｎ６−ジメチルアミノアデニンを含むＮ６−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルアミノプリンおよびＮ６，Ｎ６−（Ｃ１−Ｃ１２）ジアルキルアミノプリンはまた、好適な修飾核酸塩基である。同様に、例えば、６−チオグアニンを含む他の６−置換プリンは、適切な修飾核酸塩基を構成し得る。他の好適な核酸塩基は、２−チオウラシル、８−ブロモアデニン、８−ブロモグアニン、２−フルオロアデニン、および２−フルオログアニンを含む。前述の修飾核酸塩基のいずれかの誘導体も適切である。前述の化合物のいずれかの置換基は、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル、Ｃ２−Ｃ３０アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、スルホニル、カルボキシル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル等を含み得る。

マイクロＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１を標的とするのに好適な核酸に基づく阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害、または異質染色質サイレンシングのいずれかによって、標的ｍＲＮＡの発現を制御する一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、１８〜２５ヌクレオチド長、典型的には、２１〜２３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、本明細書に記載の１つ以上の修飾等の化学修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＤＨを標的とする核酸に基づく阻害剤は、標的ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ ｍＲＮＡと部分的相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、核酸に基づく阻害剤のアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間にもたらされるバルジ、ループ、あるいはオーバーハングをもたらし得る、様々なミスマッチまたは非塩基対ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドバルジ等の１、２、３、４、５個以上のミスマッチまたは非塩基対ヌクレオチド）を含み得る。
本明細書に記載の核酸に基づく阻害剤、例えば、本明細書に記載のアンチセンス核酸は、細胞内に作用物質を発現および産生するために使用され得る核酸を送達するための遺伝子治療プロトコルの一部として使用するために、遺伝子コンストラクト内に組み込まれ得る。そのような成分の発現コンストラクトは、任意の生物学的に有効な担体、例えば、生体内で成分遺伝子を細胞に効果的に送達する能力のある任意の製剤または組成物で投与され得る。取り組みには、組み換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１、または組み換え細菌もしくは真核プラスミドを含むウイルスベクター内の対象遺伝子の挿入が含まれる。ウイルスベクターは、細胞に直接トランスフェクトし、すなわち、プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオンリポソーム（リポフェクチン）または誘導体化された（例えば、抗体接合された）ポリリシン接合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、あるいは他のそのような細胞内稼得物（ｅａｒｎｅｒ）、ならびに遺伝子コンストラクトの直接注射または生体内で行われるＣａＰＯ４沈降を援用して送達され得る。
ある実施形態では、細胞への核酸の生体内導入には、核酸、例えば、ｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用が含まれる。ウイルスベクターでの細胞の感染は、標的細胞の大部分が核酸を受容することができるという利点を有する。さらに、例えば、ウイルスベクター内に含有されたｃＤＮＡによってウイルスベクター内でコードされた分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現される。
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターを、特にヒトへの生体内での外来遺伝子の移動のための組み換え遺伝子送達系として使用することができる。これらのベクターは、細胞への遺伝子の効率的な送達を提供し、移動した核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ内に安定的に組み込まれる。組み換えレトロウイルスを生産するため、および生体外または生体内でそのようなウイルスで細胞を感染させるためのプロトコルを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０−９．１４、ならびに他の標準臨床の手引きで見出すことができる。好適なレトロウイルスの例には、当業者に既知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられる。同種指向性および両種性レトロウイルス系の両方を調製するための好適なパッケージングウイルス株の例には、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ、２、およびＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、生体外および／または生体内で上皮細胞を含む多くの異なる細胞型に様々な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１−６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−７６４４、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号および同４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０７１３６号、ＷＯ８９／０２４６８号、ＷＯ８９／０５３４５号、ならびにＷＯ９２／０７５７３号を参照）。
別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを利用する。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２４またはアデノウイルス他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。
対象遺伝子の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８、およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照されたい。

医薬組成物
本明細書で描写される組成物は、本明細書に記載のものを含む、疾病または病徴の調節を達成するのに有効な量の本明細書で描写される化合物、ならびに存在する場合に追加の治療薬を含む。
「薬学的に許容される担体または補助剤」という用語は、本発明の化合物とともに患者に投与され得、その薬理活性を破壊せず、かつ治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与する時に無毒性である担体または補助剤を指す。
本発明の医薬組成物において使用され得る薬学的に許容される担体、補助剤、および賦形剤は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル塩等の自己乳化薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ等の薬の剤形において使用される界面活性剤または他の同様のポリマー送達マトリックス、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等の塩もしくは電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ロウ、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含むが、それらに限定されない。α−、β−、およびγ−シクロデキストリン等のシクロデキストリン、または２−および３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリン等の化学的に修飾された誘導体あるいは他の可溶化誘導体は、本明細書に記載の処方の化合物の送達を高めるために、有利に使用され得る。
ＩＤＨ、例えば、ＩＤＨ１の阻害剤を含有する医薬組成物は、脳脊髄液内または脳内に等、中枢神経系に直接投与され得る。送達は、例えば、急速投与で、または連続ポンプ注入によって行われ得る。ある特定の実施形態では、送達は、髄腔内送達によって、または直接脳への脳室内注射によって行われる。送達のために、カテーテル、および任意でポンプを使用することができる。阻害剤を、埋め込み型デバイス、例えば、腫瘍組織の外科的除去に際して埋め込まれるデバイ内に送達し、それから放出することができる。例えば、脳への送達において、送達は、脳腫瘍を切除する時に作成される外科的空洞内にカルムスチンを直接送達するように設計されたバイオポリマーウエハーであるＧｌｉａｄｅｌを伴う送達と類似し得る。Ｇｌｉａｄｅｌウエハーは、カルムスチンを緩慢に分解し、送達する。
本明細書に開示の治療薬、例えば、核酸に基づく阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡを、例えば、ポンプおよび／またはカテーテルシステムを用いて、ＣＮＳ、例えば、脳に直接投与することができる。一実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれる。ある実施形態では、ポンプに取り付けたカテーテルは、ＣＮＳ、例えば、脳または脊椎内に挿入される。一実施形態では、ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社のＩｓｏＭｅｄ Ｄｒｕｇ Ｐｕｍｐ等）は、核酸に基づく阻害剤の投薬、例えば、一定の投薬を送達する。ある実施形態では、ポンプは、事前決定された時間間隔で、可変または一定の用量を投与するようにプログラム可能である。例えば、阻害剤の一定の供給を管理するためにＭｅｄｔｒｏｎｉｃ社のＩｓｏＭｅｄ Ｄｒｕｇ ｐｕｍｐ（もしくは同様のデバイス）を用いることができるか、または不定の投与計画を管理するためにＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄＩＩ Ｄｒｕｇ Ｐｕｍｐ（もしくは同様のデバイス）を用いることができる。
米国特許第７，０４４，９３２号、同第６，６２０，１５１号、同第６，２８３９４９号、ならびに同第６，６８５，４５２号に記載の方法およびデバイスを、本明細書に記載の方法で用いることができる。
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入によって、局所的に、直腸に、鼻に、頬に、膣に、または埋め込みリザーバーを介して、好ましくは、経口投与、あるいは注射での投与で投与され得る。本発明の医薬組成物は、任意の従来の無毒性で薬学的に許容される担体、補助剤、または賦形剤を含有し得る。ある場合において、製剤のｐＨは、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を高めるために、薬学的に許容される酸、基剤、もしくは緩衝液で調整され得る。本明細書で使用される、非経口的という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技法を含む。
医薬組成物は、無菌の注入可能な調製、例えば、無菌の注入可能な水性または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等）および懸濁化剤を用いて、当分野で既知の技法に従って製剤化され得る。無菌の注入可能な調製物は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注入可能な溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液でもあり得る。採用され得る許容される賦形剤および溶媒には、マンニトール、水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁化剤として従来法で採用される。このために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発性油が採用され得る。オレイン酸等の脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、特にそれらのポリオキシエチル化変形で、オリーブ油またはヒマシ油等の天然の薬学的に許容される油と同様に、注入可能物の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース、あるいは乳濁液およびまたは懸濁液等の薬学的に許容される剤形の製剤で一般的に用いられる同様の分散剤も含有し得る。ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎ等の他の一般に用いられる界面活性剤および／または他の同様の乳化剤、あるいは薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造において一般に用いられる生物学的利用能エンハンサーも、製剤の目的のために用いられ得る。
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、乳濁液、および水性懸濁液、分散剤、ならびに溶液が含まれるが、それらに限定されない任意の経口的に許容される投薬形態で、経口的に投与され得る。経口使用のための錠剤において、一般に用いられる担体には、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。ステアリン酸マグネシウム等の平滑剤も、典型的には添加される。カプセル形態における経口投与において、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。水性懸濁液および／もしくは乳濁液が経口的に投与される時に、活性成分は、乳化剤および／またはを懸濁化剤と相まって、油性相中で懸濁または分解され得る。所望の場合、ある特定の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤が添加され得る。
本発明の医薬組成物はまた、直腸投与のために、坐薬の形態で投与され得る。これらの組成物を、本発明の化合物を、室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、ひいては活性成分を放出するために直腸内で溶融する好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。そのような物質には、ココアバター、蜜ロウ、およびポリエチレングリコールが含まれるが、それらに限定されない。
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の治療が、局所適用により容易に接近可能な域または臓器を伴う場合に有用である。皮膚への局所的な適用において、医薬組成物は、担体中で懸濁または分解された活性成分を含有する好適な軟膏で製剤化されるべきである。本発明の化合物の局所投与のために担体には、鉱油、液体石油、白色石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウ、および水が含まれるが、それらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、好適な乳化剤を有する担体中で懸濁または分解された活性成分を含有する好適なローションまたはクリームで製剤化され得る。好適な担体には、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルロウ、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が含まれるが、それらに限定されない。本発明の医薬組成物はまた、直腸坐薬製剤によって、または好適な浣腸製剤で、下部腸管に局所的に適用され得る。局所的経皮パッチも本発明に含まれる。
本発明の医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。そのような組成物は、製剤処方の当分野で周知の技法に従って調製され、かつベンジルアルコールまたは他の好適な保存剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロ炭素、および／または当分野で既知の他の可溶化剤もしくは分散剤を採用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
本発明の組成物が、本明細書に記載の処方の化合物および１つ以上の追加の治療薬または予防薬の組み合わせを含む時に、化合物および追加の薬剤の両方は、単剤治療計画において通常投与される投薬量の約１〜１００％、より好ましくは、約５〜９５％の投薬量レベルで存在するはずである。追加の薬剤は、複数回用量計画の一部として、本発明の化合物とは別に投与され得る。あるいは、それらの薬剤は、単一組成物中で本発明の化合物とともに混合された、単一剤形の一部であり得る。
本明細書に記載の化合物を、体重の約０．０２〜約１００ｍｇ／ｋｇの投薬量で、あるいは、投薬量１ｍｇ〜１０００ｍｇ／用量で、４〜１２０時間おきに、あるいは特定の薬物の要件に従って、例えば、注射で、静脈内に、関節内に、皮下に、腹腔内に、筋肉内に、もしくは皮下に、または経口的に、頬に、鼻に、経粘膜に、局所的に、眼科用調製物で、あるいは吸入によって投与することができる。本明細書の方法は、所望の効果または定められた効果を達成するために、有効量の化合物もしくは化合物組成物の投与を企図する。典型的には、本発明の医薬組成物は、１日約１〜約６回、またはあるいは、連続注入として投与される。そのような投与を、長期または救急治療として用いることができる。単一剤形を産生するために担体物質と組み合わせられ得る活性成分の量は、治療される宿主および投与の特定の様式によって異なる。典型的な調製物は、約５％〜約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含有する。あるいは、そのような調製物は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含有する。
上に列挙した用量よりも少ないか、または多い用量が必要とされ得る。任意の特定の患者への特定の投薬量および治療計画は、採用される特定の化合物の活性、年齢、体重、総合的な健康状態、性別、食生活、投与時間、排出速度、複合薬、重症度、および疾病、状態、もしくは症状の経過、疾病、状態、もしくは症状に対する患者の素質、ならびに治療する医師の判断を含む、様々な要素によって決まる。
患者の状態の改善時に、必要であれば、本発明の化合物、組成物、またはその組み合わせの維持量が投与され得る。続いて、投薬量もしくは投与の頻度、または両方は、症状の関数として、症状が所望のレベルまで緩和された時に、改善された状態が保持されるレベルまで低下し得る。患者は、しかしながら、病徴の任意の再発時に、長期的に間欠的治療を必要とし得る。

キット
本明細書に記載の化合物がキット内に提供され得る。
ある実施形態では、キットは、（ａ）本明細書に記載の化合物、例えば、本明細書に記載の化合物を含む組成物（例えば、化合物が本明細書に記載の阻害剤であり得る）、および任意で（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、説明的、教育的、販売的、あるいは本明細書に記載の方法および／または本明細書に記載の方法のための本明細書に記載の化合物の使用に関する他の資料であり得る。
ある実施形態では、キットは、対象を評価するための資料を提供する。評価は、例えば、２ＨＧ、２ＨＧネオ活性、もしくは２ＨＧネオ活性（または対応するＲＮＡ）を有するか、またはネオ活性を特徴とするＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２中に体細胞変異を有する変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質のいずれかの望ましくないレベル（例えば、正常または野生型細胞に存在するよりも高い）を有する対象を同定するため、例えば、２ＨＧ、２ＨＧネオ活性、もしくは２ＨＧネオ活性（または対応するＲＮＡ）を有するか、またはネオ活性を特徴とするＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２中に体細胞変異を有する変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質の増加したレベルを有することに基づいて、対象を診断、予後診断、もしくは病期分類するため、例えば、２ＨＧ、２ＨＧネオ活性、もしくは２ＨＧネオ活性（または対応するＲＮＡ）を有するか、またはネオ活性を特徴とするＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２中に体細胞変異を有する変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２タンパク質の増加したレベルを有することに基づいて、治療のための治療法を選択するか、あるいは治療の効力を評価するためであり得る。キットは、評価において有用である１つ以上の試薬、例えば、本明細書の他の箇所で言及される試薬を含み得る。検出試薬、例えば、抗体または他の特異的結合試薬を含み得る。基準または参考試料、例えば、陽性もしくは陰性対照基準を含み得る。例えば、評価が２ＨＧの存在に基づく場合、キットは、試薬、例えば、アッセイ、例えば、ＬＣ−ＭＳアッセイに関する陽性もしくは陰性対照基準を含み得る。
評価が２ＨＧネオ活性の存在に基づく場合、キットは、２ＨＧネオ活性をアッセイするために、試薬、例えば、本明細書の他の箇所で言及される試薬のうちの１つ以上を含み得る。評価が配列決定に基づく場合、キットは、ＩＨＤ、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２ネオ活性変異体を同定するために、プライマーまたは関連する核酸を配列決定するのに有用な他の物質を含み得る。例えば、キットは、ネオ活性変異体が存在するかを判定するために、ＩＤＨ１の残基１３２の同一性の照会、すなわち、配列決定を提供する試薬を含有し得る。キットは、核酸、例えば、オリゴマー、例えば、ＩＤＨ１の残基１３２をコードするヌクレオチドの配列決定を可能にするプライマーを含み得る。ある実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーション、または増幅される能力がＩＤＨ１の残基１３２の同一性によって決まる核酸を含む。他の実施形態では、キットは、試薬、例えば、抗体またはネオ活性変異体、例えば、ＩＤＨ１の１３２でネオ活性変異体によってコードされるタンパク質の存在を同定することができる他の特異的結合分子を含む。下に説明されるように、キットは、緩衝液、溶媒、および評価に関連した情報も含み得る。
一実施形態では、情報資料は、化合物の産生、化合物の分子量、濃度、使用期限、バッチまたは生産地情報等についての情報を含み得る。一実施形態では、情報資料は、化合物を投与するための方法に関する。
一実施形態では、情報資料は、本明細書に記載の方法を実行するのに好適な様式、例えば、好適な用量、剤形、または投与方法（例えば、本明細書に記載の用量、剤形、または投与方法）で、本明細書に記載の化合物を投与するための説明書を含み得る。別の実施形態では、情報資料は、好適な対象、例えば、ヒト、例えば、本明細書に記載の疾患を有するか、またはその危険性のあるヒトに、本明細書に記載の化合物を投与するための説明書を含み得る。
キットの情報資料は、この形態に制限されない。多くの場合、情報資料、例えば、説明書は、印刷物、例えば、印刷文書、図面、および／または写真、例えば、ラベルもしくは印刷シートで提供される。しかしながら、情報資料は、Ｂｒａｉｌｌｅ、コンピュータ可読資料、録画、または録音等の他の形式でも提供され得る。別の実施形態では、キットの情報資料は、キットのユーザが、本明細書に記載の化合物および／または本明細書に記載の方法におけるその使用についての実質的な情報を得ることができる、連絡先、例えば、実際の住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号である。言うまでもなく、情報資料は、形式の任意の組み合わせでも提供され得る。
本明細書に記載の化合物に加えて、キットの組成物は、溶媒または緩衝液、安定剤、保存剤、香味剤（例えば、苦味のある拮抗剤もしくは甘味料）、香料または他の化粧品成分、および／あるいは本明細書に記載の状態もしくは疾患を治療するための第２の薬剤等の他の成分を含み得る。あるいは、他の成分は、キット内に含まれ得るが、本明細書に記載の化合物とは異なる組成物または容器で含まれ得る。そのような実施形態では、キットは、本明細書に記載の化合物および他の成分を混合するための、または他の成分とともに本明細書に記載の化合物を使用するための説明書を含み得る。
本明細書に記載の化合物は、任意の形態、例えば、液体、乾燥、または凍結乾燥形態で提供され得る。本明細書に記載の化合物が実質的には純粋および／または無菌であることが望ましい。本明細書に記載の化合物が液体溶液中に提供される時、液体溶液は、好ましくは、水性溶液であり、無菌の水性溶液が好まれる。本明細書に記載の化合物が乾燥形態として提供される時、再構成は、概して、好適な溶媒の添加による。溶媒、例えば、無菌水または緩衝液は、任意でキット内に提供され得る。
キットは、本明細書に記載の化合物を含有する組成物のための１つ以上の容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報資料のための別個の容器、仕切り、または区画を含有する。例えば、組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジ内に含有され得、情報資料は、プラスチックのスリーブもしくはパケット内に含有され得る。他の実施形態では、キットの個々の要素は、１つの分割されていない容器内に含有される。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料をそれに貼り付けた瓶、バイアル、またはシリンジ内に含有される。いくつかの実施形態では、キットは、それぞれが本明細書に記載の化合物の１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載の剤形）を含有する、複数（例えば、１箱）の個別の容器を含む。例えば、キットは、それぞれが本明細書に記載の化合物の単回単位用量を含有する、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、またはブリスターパックを含む。キットの容器は、気密、耐水（例えば、湿気もしくは蒸発の変化に不透過性）、および／または光密であり得る。
キットは、組成物の投与に好適なデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点滴器（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿スワブもしくは木製スワブ）、または任意のそのような送達デバイスを任意で含む。ある実施形態では、デバイスは、医療用埋め込みデバイスであり、例えば、外科的挿入のために包装される。

併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、追加の癌治療法とともに投与される。例示的な癌治療法には、例えば、手術、化学療法、抗体療法、免疫療法、およびホルモン療法等の標的療法が挙げられる。これらの治療法の各々の例が下に提供される。
化学療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、化学療法で投与される。化学療法は、癌細胞を破壊することができる薬物での癌の治療法である。「化学療法」は、通常、概して、標的療法とは対照的に分裂細胞に迅速に影響を及ぼす細胞毒性薬を指す。化学療法剤は、様々な可能性のある方法で、細胞分裂、例えば、ＤＮＡの複製または新しく形成された染色体の分離を妨害する。ある程度の特異性は、正常細胞が概してＤＮＡ損傷を修復できる一方で、多くの癌細胞が修復することができないことに由来し得るが、化学療法の大部分の形態が、全ての迅速に分裂する細胞を標的とし、癌細胞に対して特異的ではない。
癌治療で使用される化学療法剤の例には、例えば、代謝拮抗薬（例えば、葉酸、プリン、およびピリミジン誘導体）ならびにアルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金、スルホン酸アルキル、ヒドラジン、トリアジン、アジリジン、紡錘体毒、細胞毒性薬、トポイソメラーゼ阻害剤等）が挙げられる。例示的な薬剤には、アクラルビシン、アクチノマイシン、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミノプテリン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アトラセンタン、ベロテカン、ベキサロテン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カンプトセシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、クロルメチン、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デメコルシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エファプロキシラル、エレスクロモール（Ｅｌｅｓｃｌｏｍｏｌ）、エルサミトルシン、エノシタビン、エピルビシン、エストラムスチン、エトグルシド、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（５ＦＵ）、フォテムスチン、ゲムシタビン、グリアデル移植片、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イロフルベン、イクサベピロン、ラロタキセル（Ｌａｒｏｔａｘｅｌ）、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロニダミン、ロムスチン、ルカントン、マンノスルファン、マソプロコール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、アミノレブリン酸メチル、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニムスチン、オブリメルセン、オマセタキシン、オルタタキセル、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピラルビシン、ピクサントロン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニマスチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ラニムスチン、ルビテカン、サパシタビン、セムスチン、シチマジーンセラデノベック（Ｓｉｔｉｍａｇｅｎｅ ｃｅｒａｄｅｎｏｖｅｃ）、ストラタプラチン、ストレプトゾシン、タラポルフィン、テガフール−ウラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テセタキセル、テストラクトン、テトラニトレート、チオテパ、チアゾフリン、チオグアニン、ティピファニブ、トポテカン、トラベクテジン、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、トリプラチン、トレチノイン、トレオスルファン、トロホスファミド、ウラムスチン、バルルビシン、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボリノスタット、ゾルビシン、および本明細書に記載の他の細胞増殖抑制性剤または細胞毒性剤が挙げられる。
いくつかの薬物が、単独より併用でより良好に作用するため、２つ以上の薬物がしばしば同時に投与される。しばしば、２つ以上の化学療法剤が併用化学療法として使用される。いくつかの実施形態では、化学療法剤（併用化学療法を含む）を、本明細書に記載の化合物、例えば、フェンホルミンと併用で使用することができる。
標的療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、標的療法で投与される。標的療法は、癌細胞の調節解除されたタンパク質に対して特異的な薬剤の使用の構成要素となる。小分子標的療法剤は、概して、癌細胞内の変異、過剰発現、またはさもなければ重大なタンパク質上の酵素ドメインの阻害剤である。顕著な例には、アキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、およびバンデタニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤があり、ならびにアルボシディブおよびセリシクリブ等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤もある。モノクローナル抗体治療は、その中で治療薬が癌細胞の表面でタンパク質に特異的に結合する抗体である別の計略である。例には、典型的には乳癌において使用される抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ならびに典型的には多種多様のＢ−細胞悪性腫瘍において使用される抗ＣＤ２０抗体リツキシマブおよびトシツモマブが挙げられる。他の例示的な抗体には、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、およびゲムツズマブが挙げられる。例示的な融合タンパク質には、アフリベルセプトおよびデニロイキンジフチトクスが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的療法を、本明細書に記載の化合物、例えば、メトホルミンまたはフェンホルミン、好ましくはフェンホルミン等のビグアニドとの併用で用いることができる。
標的療法は、細胞表面受容体または腫瘍を包囲する罹患した細胞外マトリックスに結合することができる「ホーミングデバイス」として、小ペプチドも含むことができる。これらのペプチド（例えば、ＲＧＤ）に付着される放射性核種は、核種が細胞の周辺において減衰する場合に、最終的に癌細胞死滅させる。そのような治療の例には、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）が挙げられる。
免疫療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、免疫療法で投与される。癌免疫療法は、患者自らの免疫系が腫瘍に対抗させるように設計された治療方針の多様な集合を指す。腫瘍に対する免疫応答を発生させるための現代の方法には、表在性膀胱癌のための膀胱内ＢＣＧ免疫療法、ならびに腎細胞癌腫および黒色腫患者に免疫応答を誘発するためのインターフェロンおよび他のサイトカインの使用が含まれる。
同種造血幹細胞移植は、ドナーの免疫細胞がしばしば移植片対腫瘍効果において腫瘍を攻撃するため、免疫療法の形態と見なされ得る。いくつかの実施形態では、免疫療法剤を、本明細書に記載の化合物または組成物との併用で使用することができる。
ホルモン療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、ホルモン療法で投与される。いくつかの癌の成長を、ある特定のホルモンを提供または阻止することによって阻害することができる。ホルモン感受性腫瘍の一般的な例には、ある特定の種類の乳癌および前立腺癌が挙げられる。エストロゲンまたはテストステロンを除去もしくは阻止することは、しばしば重要な追加の治療である。ある特定の癌において、プロゲストゲン等のホルモンアゴニストの投与は、治療的に有益であり得る。いくつかの実施形態では、ホルモン療法剤を、本明細書に記載の化合物または組成物との併用で使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、神経系の癌、例えば、中枢神経系の癌、例えば、脳腫瘍、例えば、神経膠腫、例えば、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を治療する、追加の癌治療（例えば、外科的除去）とともに投与される。
いくつかの研究は、２５％超のグリア芽腫患者が、補助化学療法から著しい延命効果を得ることを示唆した。メタ分析は、補助化学療法が、１年生存率で６〜１０％の増加をもたらすことを示唆した。
テモゾロミドは、新たに多形性膠芽腫と診断された個人に対して使用される経口的に活性なアルキル化剤である。それは、２００５年３月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。研究は、薬物が良好な耐容性を示し、かつ延命効果を提供したことを示した。放射線療法を伴う補助および付随テモゾロミドは、放射線療法単独に対して、平均無増悪期間（６．９ヶ月対５ヶ月）、全体の生存期間（１４．６ヶ月対１２．１ヶ月）、ならびに２年後に生存している可能性２６％対１０％）における著しい改善に関連した。
ニトロソウレア：ＢＣＮＵ（カルムスチン）ポリマーウエハー（Ｇｌｉａｄｅｌ）は、２００２年にＦＤＡによって承認された。Ｇｌｉａｄｅｌウエハーは、初期治療のために一部の人々によって使用されるが、それらは、そのような最大の第３相試験において、プラセボに対して、平均生存期間のわずかな増加（１３．８ヶ月対１１．６ヶ月）のみを示しており、浮腫および質量効果に続発する脳脊髄液漏出の増加速度ならびに増加した頭蓋内圧に関連する。
ＭＧＭＴは、テモゾロミド抵抗性に寄与するＤＮＡ修復酵素である。約４５％の多形性膠芽腫で見られるＭＧＭＴプロモーターのメチル化は、ＤＮＡ修復のための腫瘍細胞の能力を減少させ、かつテモゾロミドに対する感受性を増加させる、遺伝子の後成的サイレンシングをもたらす。
ＭＧＭＴプロモーターメチル化を有する患者および有さない患者がテモゾロミドで治療された時に、その群は、それぞれ、２１．７ヶ月対１２．７ヶ月の平均生存期間、ならびに４６％対１３．８％の２年生存率を有した。
テモゾロミドは、現在、多形性膠芽腫の治療において第一選択薬であるが、好ましくないＭＧＭＴメチル化状態は、将来の治療研究に適切な患者を選択する手助けをし得る。
Ｏ６−ベンジルグアニンおよびＭＧＭＴの他の阻害剤、ならびにＭＧＭＴのＲＮＡ干渉媒介サイレンシングは、テモゾロミドおよび他のアルキル化抗腫瘍剤の有効性を増加させるための有望な手段を提供し、そのような薬剤は、活発な研究下にある。
カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびｃｉｓ−白金（シスプラチン）は、悪性神経膠腫に対して使用される主要な化学療法剤である。使用される全ての薬剤は、３０〜４０％以下の応答速度を有し、大部分が１０〜２０％の範囲に収まる。
サンフランシスコのカリフォルニア大学からのデータは、グリア芽腫の治療、手術に続く放射線治療は、それぞれ、４４％、６％、および０％の１年、３年、および５年生存率につながることを示す。比較すると、手術に続く放射線療法ならびにニトロソウレアに基づく投薬計画を用いる化学療法は、それぞれ、４６％、１８％、および１８％の１年、３年、および５年生存率をもたらした。
脳腫瘍のための化学療法剤の使用に対する主要な障害は、血液脳関門（ＢＢＢ）がＣＮＳから多くの薬剤を効果的に排除するという事実である。このため、これらの薬物療法の全身的な逆効果を回避しながら、より高い濃度の化学療法剤を腫瘍細胞に送達するための、頭蓋内薬物送達の新規の方法が開発されている。
対流増加送達（ＣＥＤ）としても知られている、頭蓋内カテーテルを通る化学療法剤の圧力駆動注入は、単純拡散でというよりはむしろ、圧力勾配に従って薬物を送達する利点を有する。ＣＥＤは、ＢＣＮＵおよびトポテカンを含む薬剤を有する動物モデルにおいて有望な結果を示した。
最初の試みは、静脈内経路よりはむしろ動脈内経路を介する化学療法剤の送達を研究した。残念ながら、延命効果は観察されなかった。
再発性多形性膠芽腫のための化学療法は、たとえあったとしても、わずかな利益を提供し、薬剤のいくつかの部類が使用される。治療群と深刻な頭蓋内感染との間に著しい関連性が存在したが、カルムスチンウエハーは、２２２名の患者の１つの無作為研究において、プラセボに対して、６ヶ月生存率を３６％から５６％に増加させた。
脳腫瘍の遺伝子型決定は、様々な新規療法の臨床試験のために患者を層別化する適用を有し得る。
血管新生阻害剤であるベバシズマブは、イリノテカンと使用される時、テモゾロミドで治療された患者における２１％と比較して、再発性神経膠腫患者において、６ヶ月生存率を４６％改善した。再発性多形性膠芽腫のためのこのベバシズマブおよびイリノテカンの併用は、ベバシズマブ単独に対して、生存率を改善することが示された。血管新生阻害剤は、腫瘍周囲の浮腫も減少させ、必須のコルチコステロイド用量を低下させる可能性がある。
いくつかのグリア芽腫は、ゲフィチニブまたはエルロチニブ（チロシンキナーゼ阻害剤）に応答する。膠芽腫細胞における変異体ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖｉｉｉ）およびＰＴＥＮの同時存在は、チロシンキナーゼ阻害剤への反応性に関連した一方で、増加したｐ−ａｋｔは、減少した効果を予測する。他の標的は、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ファルネシルトランスフェラーゼ、およびＰＩ３Ｋを含む。
他の考えられる治療様式には、イマチニブ、遺伝子治療、ペプチドおよび樹状細胞ワクチン、合成クロロトキシン、ならびに放射性標識薬物および抗体が含まれる。

患者選択／監視
対象の細胞増殖関連疾患、例えば、癌を治療する方法および本明細書に記載の治療のために対象を同定する方法が、本明細書に記載される。癌（例えば、酵素内の変異に関連する癌（例えば、ＩＤＨ１および／またはＩＤＨ２等の代謝経路における酵素））を発生する危険性のある対象を予測する方法も、本明細書に記載される。癌は、概して、１つ以上の変異体酵素（例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２につながる代謝経路内の酵素）内の機能の獲得等のネオ活性の存在を特徴とする。対象を、ネオ活性、例えば、本明細書に記載のネオ活性を有する変異体遺伝子を有する対象に基づいて選択することができる。本明細書で使用される「選択する」は、全体または一部の該基準で選択することを意味する。
いくつかの実施形態では、対象は、対象が本明細書に記載の変異体酵素（例えば、代謝経路、例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路内の酵素、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２）を有するという決定に基づいて、本明細書に記載の化合物での治療のために選択される。いくつかの実施形態では、変異体酵素はネオ活性を有し、患者はその基準で選択される。酵素のネオ活性を、基質、共同因子、および／または酵素の産物の存在もしくは量に関して、例えば、対象あるいはそれからの試料（例えば、組織もしくは体液）を評価することによって、同定することができる。基質、共同因子、ならびに／または産物の存在および／もしくは量は、野生型／非変異体活性に相当し得るか、あるいは酵素のネオ活性に相当し得る。酵素のネオ活性を同定（例えば、評価）するために使用することができる例示的な体液には、胎児を包囲する羊水、水性体液、血液（例えば、血漿）、脳脊髄液、耳垢、糜粥、Ｃｏｗｐｅｒの液体、女性の射精、間質液、リンパ液、母乳、粘液（例えば、鼻漏または痰）、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、涙液、尿、膣分泌物、または嘔吐物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、対象を、磁気共鳴を用いて、酵素のネオ活性に関して評価することができる。例えば、変異体酵素がＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２であり、かつネオ活性が２−ヒドロキシグルタル酸へのα−ケトグルタル酸の転換である場合に、対象を、上記のネオ活性を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２で変異を有さない対象に存在する２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の量と比較した、２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の存在および／または上昇した量に関して評価することができる。いくつかの実施形態では、磁気共鳴によって判定される２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸に対応するピークの存在または上昇した量によって、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性を判定することができる。例えば、対象を、対象における２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸の存在および／または量を判定するために、約２．５ｐｐｍでの信号の存在および／または強度に関して評価することができる。これは、変異体酵素ＩＤＨに関して、本明細書に記載のネオ活性と相関するか、および／またはそれを予測する。同様に、約２．５ｐｐｍでの信号の存在、強度、および／または不在は、治療に対する応答を予測し、それによって、臨床応答への非侵襲的バイオマーカーとして使用され得る。
ＩＤＨ等の変異体酵素のネオ活性を、当業者に既知の他の技法を用いても評価することができる。例えば、１３Ｃもしくは１４Ｃ標識基質、共同因子、および／または反応産物等の標識基質、共同因子、および／または反応産物の存在または量を測定することができる。ネオ活性を、野生型／非変異体酵素（変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２酵素、具体的には、変異体ＩＤＨ１酵素中のα−ケトグルタル酸へのイソクエン酸の酸化的脱炭酸反応等）の正反応および／またはネオ活性（例えば、変異体ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２酵素、具体的には、変異体ＩＤＨ１酵素中の２−ヒドロキシグルタル酸、例えば、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸へのα−ケトグルタル酸の転換）に対応する反応を評価することによって評価することができる。

疾患
本明細書に開示のＩＤＨに関連した方法、例えば、対象を評価または治療する方法は、ネオ活性、例えば、２ＨＧネオ活性を有するＩＤＨ変異体、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体を特徴とする細胞増殖関連疾患を有する対象を対象とする。下の疾患のいくつかの例は、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異を特徴とすることが示された。ＩＤＨ１のアミノ酸１３２での、またはＩＤＨ２のアミノ酸１７２での体細胞変異の存在を判定するために、例えば、細胞試料を配列決定することによって、その他を分析することができる。理論によって拘束されることなく、所与の種類の癌の腫瘍の一部は、ＩＤＨ、例えば、２ＨＧネオ活性を有するＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２変異体を有することが予測される。
開示される方法は、増殖性疾患を評価または治療、例えば、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、およびその転移癌を評価または治療するのに有用であり、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、またはその転移癌は、本明細書に記載の癌である。例示的な固形腫瘍には、脳、肺、胸、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、および胃腸管（例えば、腎臓、尿路上皮、または精巣腫瘍）、咽頭、前立腺、ならびに卵巣の悪性腫瘍等の、様々な臓器系の悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌、および癌腫）が挙げられる。例示的な腺癌には、肺の結腸直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞癌、および小腸の癌が挙げられる。開示される方法は、非固形癌を評価または治療するのにも有用である。
本明細書に記載の方法を、任意の癌、例えば、国立癌研究所によって記載される癌に用いることができる。それが本明細書に記載の方法を用いているかを判定するために、癌を評価することができる。国立癌研究所によって記載される例示的な癌には、急性リンパ芽球性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、成人副腎皮質癌、副腎皮質癌、小児ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳胆管癌、肝外膀胱癌、膀胱癌、小児骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、小児脳腫瘍、成人脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児脳腫瘍、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児脳腫瘍、上衣細胞腫、小児脳腫瘍、髄芽腫、小児脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児脳腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫、小児脳腫瘍、小児（他）乳癌、乳癌および妊娠、乳癌、小児乳癌、男性気管支腺腫／カルチノイド、小児カルチノイド腫瘍、小児カルチノイド腫瘍、胃腸癌腫、副腎皮質癌腫、原発不明膵島細胞癌、中枢神経系リンパ腫、原発性小脳星状細胞腫、小児大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、小児子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、腱鞘の明細胞肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、小児皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、小児上皮癌、卵巣癌、食道癌、食道癌、小児ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））癌、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））癌、小児胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、小児脳幹神経膠腫、小児視経路および視床下部ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、成人（原発性）肝細胞（肝臓）癌、小児（原発性）ホジキンリンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、小児妊娠中のホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視経路神経膠腫、小児眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、喉頭癌、小児白血病、急性リンパ芽球性、成人白血病、急性リンパ芽球性、小児白血病、急性骨髄性、成人白血病、急性骨髄性、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇および口腔癌、肝臓癌、成人（原発性）肝臓癌、小児（原発性）肺癌、非小細胞肺癌、小細胞リンパ芽球性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ性白血病、慢性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系（原発性）リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、成人リンパ腫、ホジキンリンパ腫、小児リンパ腫、妊娠中ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、成人リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小児リンパ腫、妊娠中非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム、男性乳癌、悪性中皮腫、成人悪性中皮腫、小児悪性胸腺腫、髄芽腫、小児黒色腫、黒色腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の悪性転移性頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、小児多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、小児急性骨髄腫、多発性骨髄増殖症候群、慢性鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、鼻咽頭癌、小児神経芽細胞腫、非ホジキンリンリンパ腫、成人非ホジキンリンリンパ腫、小児妊娠中の非ホジキンリンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、小児口腔および口唇癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、小児卵巣上皮癌、卵巣性胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、小児膵臓癌、島細胞膵臓癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠および乳癌、妊娠およびホジキンリンパ腫、妊娠および非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、成人原発性肝臓癌、小児前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞癌、小児腎盂および尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児唾液腺癌、唾液腺癌、小児肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、肉腫、カポジ肉腫（骨肉腫）／骨の悪性線維性組織球腫、肉腫、横紋筋肉腫、小児肉腫、成人軟組織肉腫、軟組織肉腫、小児セザリー症候群、皮膚癌、皮膚癌、小児皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌腫、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、成人軟部組織肉腫、小児原発不明の頸部扁平上皮癌、転移性胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））癌、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））癌、小児テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、小児胸腺腫、悪性甲状腺癌、甲状腺癌、小児腎盂および尿管の移行上皮癌、絨毛性腫瘍、妊娠中の原発部位不明の小児癌、小児のまれな癌、尿道および腎盂、移行上皮癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、視経路および視床下部神経膠腫、小児外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。前述の癌の転移癌を、本明細書に記載の方法に従って治療または予防することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、変異体酵素、例えば、代謝経路、例えば、脂肪酸生合成、解糖、グルタミノリシス、ペントースリン酸分路、ヌクレオチド生合成経路、または脂肪酸生合成経路につながる代謝経路内の酵素、例えば、ＩＤＨ１もしくはＩＤＨ２のネオ活性を阻害することによって、神経系の癌、例えば、脳腫瘍、例えば、神経膠腫、例えば、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を治療するのに有用である。
脳腫瘍の種類である神経膠腫を、世界保健機関（ＷＨＯ）によって確立された組織病理学的および臨床基準に基づいて、悪性度１から悪性度４に分類することができる。ＷＨＯの悪性度１の神経膠腫は、しばしば良性と見なされる。ＷＨＯの悪性度２または３の神経膠腫は侵襲的であり、より高い段階の病巣に進行する。ＷＨＯの悪性度４の腫瘍（グリア芽腫）は、最も侵襲的な形態である。例示的な脳腫瘍には、例えば、星状腫瘍（例えば、毛様細胞性星状細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、巨細胞グリア芽腫、グリア芽腫、二次グリア芽腫、第一級成人グリア芽腫、および原発性小児グリア芽腫）、希突起膠腫（例えば、乏突起膠腫、および未分化乏突起膠腫）、乏突起星細胞系腫瘍（例えば、乏突起星細胞腫、および退形成性乏突起星細胞腫）、上衣細胞腫（例えば、粘液乳頭型脳室上衣腫、および未分化上衣腫）、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、髄膜腫、異型性髄膜腫、未分化髄膜腫、ならびに下垂体腺腫．が挙げられる。例示的な癌は、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（２００８）１１６：５９７−６０２およびＮ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｆｅｂ １９；３６０（８）：７６５−７３に記載され、それらの内容は、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、疾患は、グリア芽腫である。
ある実施形態では、疾患は、前立腺癌、例えば、ＴＮＭ病期分類システムにおいて、Ｔ１期（例えば、Ｔ１ａ、Ｔ１ｂ、およびＴ１ｃ）、Ｔ２期（例えば、Ｔ２ａ、Ｔ２ｂ、およびＴ２ｃ）、Ｔ３期（例えば、Ｔ３ａおよびＴ３ｂ）、ならびにＴ４期である。実施形態では、前立腺癌は、悪性度Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、またはＧ４である（より高い数値が正常組織とのより大きな差異を示す）。前立腺癌の種類には、例えば、前立腺腺癌、小細胞癌腫、扁平上皮癌、肉腫、および移行上皮癌が含まれる。
本発明の方法および組成物を、当分野で既知の治療と組み合わせることができる。前立腺癌のための当分野で既知の治療には、例えば、積極的監視、手術（例えば、前立腺全摘出術、前立腺の経尿道的電気切除術、睾丸摘出、ならびに凍結手術）、近接照射療法（前立腺癌近接照射療法）および外照射療法を含む放射線治療、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、化学療法、凍結手術、ホルモン療法（例えば、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、ならびに酢酸シプロテロン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド）、ＧｎＲＨ拮抗剤（例えば、Ａｂａｒｅｌｉｘ））、またはその併用が含まれる。
本明細書に記載の全ての参考文献は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
実施例１ ＩＤＨ１クローン化、突然変異誘発、発現、および精製
１．野生型ＩＤＨ１をｐＥＴ４１ａへとクローン化し、Ｃ末端にＨｉｓ８タグを作り出した。
ｐＥＮＴＲ２２１ベクターにおけるＩＤＨ１遺伝子コード領域（ｃＤＮＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ、カタログ番号Ｂ−０６８４８７＿Ｕｌｔｉｍａｔｅ＿ＯＲＦ）。５’末端におけるＮｄｅＩおよび３’末端におけるＸｈｏＩと共に、ＩＤＨ１のコード領域の外側のＰＣＲに対してオリゴヌクレオチドを設計した（ＩＤＨ１−ｆ：ＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴ（配列番号１）、ＩＤＨ１−ｒ：ＴＡＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＧＴＴ（配列番号２））。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＥＴ４１ａベクターへとクローン化する。ベクターｐＥＴ４１ａのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ切断は、プラスミドのＧＳＴ部分を放出し、またＮ末端ＧＳＴ融合なしにＣ末端Ｈｉｓ８タグ（配列番号３）を作り出す。ＩＤＨ１の元の終止コドンは、セリンに変化するため、最終ＩＤＨ１タンパク質の接合部配列は次の通りである：Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｔｏｐ（配列番号４）。
Ｃ末端タグは、ＩＤＨ１タンパク質フォールディングまたは活性にマイナスの影響を及ぼさない可能性があるため、Ｎ末端Ｈｉｓタグ戦略の代わりにＣ末端Ｈｉｓタグ戦略を選択した。例えば、Ｘｕ Ｘ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４Ａｕｇ ６；２７９（３２）：３３９４６−５７を参照されたい。
ＤＮＡ塩基配列決定によって、ｐＥＴ４１ａ−ＩＤＨ１プラスミドについての配列を確認する。下の図１は、ｐＥＴ４１ａ−ＩＤＨ１の詳細な配列検証および公開されたＩＤＨ１
ＣＤＳに照らした整列を示す。

２．ＩＤＨｒ１３２ｓおよびＩＤＨｒ１３２ｈ変異体を作製するためのＩＤＨ１部位特異的突然変異誘発。
部位特異的突然変異誘発を行って、Ｒ１３２をＳまたはＨに転換し、ＤＮＡ塩基配列決定により、Ｇ３９５がＡに突然変異させられ（ＩＤＨ１タンパク質中でＡｒｇ→Ｈｉｓ突然変異を作り出す）、またＣ３９４がＡに突然変異させられる（ＩＤＨ１タンパク質中でＡｒｇ→Ｓｅｒを作り出す）ことを確認した。部位特異的突然変異誘発のための詳細な方法は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３１）のユーザーマニュアルに記載される。図２は、かかる突然変異のＤＮＡ配列検証を示す。ハイライトされたヌクレオチドが、次の突然変異誘発において首尾よく変化した：Ｇ３９５→Ａ突然変異によって、アミノ酸Ａｒｇ１３２→Ｈｉｓ、Ｃ３９４→Ａ突然変異によって、アミノ酸Ａｒｇ１３２→Ｓｅｒ。

３．ＩＤＨ１タンパク質発現および精製。
下の詳細な手順に従って、ＩＤＨ野生型、ＩＤＨＲ１３２Ｓ、およびＩＤＨＲ１３２Ｈタンパク質を大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ中で発現させ、精製した。活性ＩＤＨ１タンパク質は、二量体形であり、二量体形に対応するＳＥＣカラム画分／ピークを、これらのタンパク質の触媒活性の酵素学分析および交差比較のために収集した。

Ａ．細胞培養：
ＯＤ６００が０．６に到達するまで振とうしながら、細胞を３７℃のＬＢ（２０μｇ／ｍＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）中で成長させた。温度を１８℃に変化させ、１ｍＭの最終濃度になるまでＩＰＴＧを添加することによってタンパク質を誘導した。ＩＰＴＧ誘導の１２〜１６時間後に細胞を収集した。

Ｂ．緩衝剤系：
溶解緩衝剤：２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール。
Ｎｉ−カラム緩衝剤Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール。
Ｎｉ−カラム緩衝剤Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５００ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール。
ゲル濾過緩衝剤Ｃ：２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ７．５、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのＭｎＳＯ４、１０％のグリセロール。

Ｃ．タンパク質精製手順
１．細胞ペレットを溶解緩衝剤中に再懸濁させた（１グラム細胞／５〜１０ｍＬの緩衝剤）。
２．１５，０００ｐｓｉの圧力により細胞をＭｉｃｒｏｆｌｕｄｉｚｅｒに３回通過させることによって細胞を破壊した。
３．２０，０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２６ＸＰ）で、４℃で３０分間の遠心分離後、可溶性タンパク質を上清から収集した。
４．Ａ２８０値がベースラインに到達するまで、５〜１０ｍＬのＮｉ−カラムを緩衝剤Ａによって平衡化した。上清を５ｍＬのＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に充填した（２ｍＬ／分）。Ａ２８０がベースライン（２ｍＬ／分）に到達するまで、カラムを１０〜２０ＣＶの洗浄緩衝剤（９０％の緩衝剤Ａ＋１０％の緩衝剤Ｂ）によって洗浄した。
５．タンパク質を２ｍＬ／分の流速により１０〜１００％の緩衝剤Ｂ（２０ＣＶ）のライナー勾配によって溶出し、試料画分を２ｍＬ／管として収集した。
６．試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
７．試料を収集し、２００倍ゲル濾過緩衝剤に対して２回（１時間および４時間超）透析した。
８．試料を１０ｍＬになるまで濃縮した。
９．Ａ２８０値がベースラインに到達するまで、２００ｍＬのＳ−２００Ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカラムを緩衝剤Ｃによって平衡化した。試料をゲル濾過カラム（０．５ｍＬ／分）上に充填した。
１０．カラムを１０ＣＶの緩衝剤Ｃによって洗浄し、画分を２〜４ｍＬ／管として収集した。
１１．試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、タンパク質濃度を決定した。

Ｄ．タンパク質精製結果
野生型ＩＤＨ１の精製についての結果を図３、４、５Ａ、および５Ｂに示す。
変異体ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｓの精製についての結果を図６、７、８Ａ、および８Ｂに示す。
野生型ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈの精製についての結果を図９、１０、１１Ａ、および１１Ｂに示す。

実施例２ ＩＤＨ１野生型および変異体の酵素学分析
１．イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）への酸化的脱炭酸化における、ＩＤＨ１野生型ならびに変異体Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓの分析。
Ａ．方法
イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）方向への酸化的脱炭酸化における酵素の触媒効率を決定するために、反応を行って、イソクエン酸についてのＶｍａｘおよびＫｍを決定した。これらの反応では、基質を変化させた一方で、補因子を５００ｕＭで一定に保った。全ての反応を１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、および０．０３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ）中で行った。補因子の酸化状態の変化をモニターする３４０ｎＭの分光法によって、反応進行を追跡した。吸光度の直線変化を得るために十分な酵素を１０分間添加した。

Ｂ．イソクエン酸のα−ＫＧへの転換に代わり、ＩＣＤＨ１ Ｒ１３２ＨおよびＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｓが損なわれる。
イソクエン酸濃度と反応速度との関係についてのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットを図１２Ａ〜１２Ｃに提示する。動力学パラメータを表１に要約する。最小二乗回帰分析によって全てのデータをＨｉｌｌ方程式に適合させた。
イソクエン酸についての双方の突然変異酵素は、低下したＨｉｌｌ係数およびＫｍの増加を示し、基質結合における協同作用の喪失および／または基質に対する低下した親和性を示唆する。また、Ｒ１３２Ｈ酵素は、低下したＶｍａｘを示し、より低いｋｃａｔを示唆する。Ｒ１３２Ｓは、ｋｃａｔの増加を示唆するＶｍａｘの増加を示すが、これはＫｍの２０，０００倍の増加という代償で起こり、その結果、触媒効率に対する全体的な効果は、野生型酵素と比較して大幅に減少する。Ｖｍａｘ／Ｋｍとして記載される相対的触媒効率は、野生型と比較して、変異体について著しく低い。これらの突然変異の体内効果は、イソクエン酸のα−ＫＧへのフラックス転換を減少させることになるであろう。

Ｃ．ＩＣＤＨ１ Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓ変異体は、イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）への酸化的脱炭酸化において低下した産物阻害を示す。
代謝酵素の制御のための周知の調節機構は、フィードバック阻害であり、ここで反応の産物は、生成酵素に対する負の調節因子として作用する。Ｒ１３２ＳまたはＲ１３２Ｈ変異体がこの調節機構を維持するか否かを検査するために、イソクエン酸のα−ケトグルタル酸への酸化的脱炭酸化においてα−ＫＧに対するＫｉを決定した。データを図１３Ａ−１３Ｃに提示し、表２に要約する。全てのケースにおいて、α−ＫＧは、イソクエン酸基質の競合阻害剤として作用する。しかしながら、Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓは、野生型酵素と比較して、フィードバック阻害に対する感度における２０倍および１３倍の増加を示す。
Ｄ．イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）への酸化的脱炭酸化におけるＭｎＣｌ ２ の効果。
イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）への酸化的脱炭酸化において何らかの差異が存在するか否かを検査するために、ＭｎＣｌ２をＭｇＣｌ２で置換することができる。

Ｅ．ＩＤＨ１上のオキサロリンゴ酸塩の阻害効果に対する、Ｒ１３２突然変異の効果
この実施例の目的は、イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）への酸化的脱炭酸化における、既知のＩＤＨ１阻害剤オキサロリンゴ酸塩に対するＩＤＨ１ Ｒ１３２ＳおよびＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈの感受性を検査することである。Ｒ１３２突然変異がオキサロリンゴ酸塩による阻害を回避するか否かを検査するために、実験を行った。
最終濃度：２０ｍＭのＴｒｉｓ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｎＣｌ２、１０％のグリセロール、０．０３％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＮＡＤＰ、１．５ｕｇ／ｍＬのＩＤＨ１野生型、３０ｕｇ／ｍＬのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｓ、６０ｕｇ／ｍＬのＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ、ＤＬ−イソクエン酸（５〜６５０ｕＭ）。結果を図１７および表３に要約する。Ｒ１３２Ｓ突然変異は、オキサロリンゴ酸塩による阻害に対する感受性において約２倍の増加を示す一方で、Ｒ１３２Ｈ突然変異は、本質的に影響を受けない。３つ全てのケースにおいて、イソクエン酸に関して同様に完全な阻害の競合様式を観察した。

Ｆ．突然変異酵素の順反応（イソクエン酸からα−ＫＧ）は、完了に至らない。
ＩＣＤＨ１ Ｒ１３２ＳまたはＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈを含有する順反応物をまとめ、反応進行を還元したＮＡＤＰＨ補因子のＯＤ３４０における増加によってモニターした。これらの反応が一定期間順方向に、次いで逆方向に進行し、反応の早い段階で還元された補因子を、本質的に実験の開始時に存在する開始濃度になるまで酸化させることを観察した（図２３）。さらなるイソクエン酸の添加は、順反応を一定期間再開させたが、再び、反応が完了に至るまで進行するよう誘導はしなかった。むしろ、この体系は、ＮＡＤＰＨの最初の濃度に回帰した。この実験は、突然変異酵素がα−ＫＧのイソクエン酸への転換以外に逆反応を行っていることを示唆した。

２．α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）の還元における、ＩＤＨ１野生型ならびに変異体Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓの分析。
Ａ．方法
α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）の還元における酵素の触媒効率を決定するために、反応を行い、α−ＫＧについてのＶｍａｘおよびＫｍを決定した。これらの反応において、基質を変化させた一方で、補因子を５００ｕＭで一定に保った。５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．５、１０％のグリセロール、０．０３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および４０ｍＭの炭酸水素ナトリウム中で全ての反応を行った。補因子の酸化状態の変化をモニターする３４０ｎＭの分光法によって、反応進行を追跡した。吸光度の直線変化を得るために十分な酵素を１０分間添加した。

Ｂ．野生型酵素ではなく、Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓ突然変異酵素がα−ＫＧ還元を支援する。
変異体および野生型酵素の、α−ＫＧの還元を行う能力を試験するために、上記のα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）の還元のための条件下で４０ｕｇ／ｍＬの酵素をインキュベートした。結果を図１４に提示する。野生型酵素がＮＡＤＰＨを消費することができなかった一方で、Ｒ１３２ＳおよびＲ１３２Ｈは、α−ＫＧを還元し、ＮＡＤＰＨを消費した。

Ｃ．α−ＫＧのＲ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓ変異体による還元は、α−ＫＧの生理学的に関連する濃度で体外で生じる。
突然変異酵素によって行われるα−ＫＧの還元の動力学パラメータを決定するために、図１５Ａ−１５Ｂに提示するように、基質滴定実験を行った。Ｒ１３２Ｈは、イソクエン酸の酸化的脱炭酸化において見られるように、Ｈｉｌｌ型基質相互作用を維持したが、正の基質協合的結合を示した。Ｒ１３２Ｓは、イソクエン酸の酸化的脱炭酸化における野生型酵素と比較して、非競合基質阻害剤の添加によりＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動力学への転換を示した。突然変異酵素の酵素パラメータを表４に提示する。上記の実験において、野生型酵素は、測定可能なＮＡＤＰＨを消費しなかったため、完全な動力学処理は行わなかった。
α−ＫＧの還元の相対的触媒効率は、Ｒ１３２Ｓ変異体においてＲ１３２Ｈ変異体におけるよりも約１０倍高い。生物学的結果として、代謝フラックスの率は、Ｒ１３２Ｈと比較してＲ１３２Ｓを発現する細胞において高くなるはずである。

Ｄ．アルファ−ケトグルタル酸のＮＡＤＨによる還元における、ＩＤＨ１野生型ならびに変異体Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｓの分析。
突然変異酵素の、アルファ−ケトグルタル酸の還元においてＮＡＤＨを利用する能力を評価するために、次の実験を行った。最終濃度：４０ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロール、５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、０．０３％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、５ｕｇ／ｍＬのＩＤＨ１野生型、３０ｕｇ／ｍＬのＲ１３２Ｓ、６０ｕｇ／ｍＬのＲ１３２Ｈ、アルファ−ケトグルタル酸５ｍＭ。
結果を図１６および表５に示す。Ｒ１３２Ｓ変異体は、ＮＡＤＨを利用する能力を示した一方で、野生型およびＲ１３２Ｈは、アルファ−ケトグルタル酸の存在下で、測定可能なＮＡＤＨの消費を示さない。
要約
Ｒ１３２突然変異がＩＤＨ１の酵素特性を変化させる方法を理解するために、野生型およびＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１タンパク質を大腸菌から産生し、精製した。精製した野生型またはＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１タンパク質を用いてＮＡＤＰ＋依存性イソクエン酸の酸化的脱炭酸化を測定したとき、イソクエン酸およびＭｇＣｌ２の両方に対する結合親和性の喪失、ならびに触媒速度の１０００倍の減少によって明白であるように（図３０Ａおよび３０Ｃ）、Ｒ１３２Ｈ突然変異が、ＩＤＨ１の、この反応を触媒する能力を損なうことを確認した（Ｙａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３６０，７６５−７３（２００９）、Ｚｈａｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４，２６１−５（２００９））。対照的に、野生型またはＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１タンパク質のいずれかを用いてαＫＧのＮＡＤＰＨ依存性還元を評価したとき、Ｒ１３２Ｈ変異体のみが、測定可能な率でこの反応を触媒することが可能であった（図３０および３０Ｃ）。この増加したαＫＧ還元率の一部は、およびＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１における、補因子ＮＡＤＰＨ基質αＫＧの両者に対する結合親和性の増加からもたらされる（図３０Ｃ）。総合すれば、これらのデータは、Ｒ１３２Ｈ突然変異が、イソクエン酸の酸化的脱炭酸化のための酵素機能の喪失をもたらす一方で、この突然変異がまた、αＫＧのＮＡＤＰＨ依存性還元のための酵素機能の獲得をもたらすことを示す。

２：変異体ＩＤＨ１の分析

Ｒ１３２Ｈ変異体は、α−ＫＧのイソクエン酸への転換をもたらさない。
標準的実験方法を用いて、ＡＰＩ２０００質量分析計をα−ＫＧおよびイソクエン酸の最適な検出用に設定した（表６）。ＭＲＭトランジションを選択し、各分析物を固有のトランジションによってモニターするように調整した。次いで、１ｍＭのα−ＫＧ、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、およびＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈを含有する酵素反応物をまとめ、３４０ｎＭの光学吸光度のベースラインまでの減少によって判断される完了まで反応させた。酵素を除外した対照反応を平行して行った。反応を１：１メタノールにより停止処理し、抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析に供した。
図１８Ａは、酵素の非存在下でＫＧが消費されず、検出可能なイソクエン酸が存在しなかったことを示す対照反応を提示する。図１８Ｂは、Ｒ１３２Ｈ酵素を含有する反応物を提示し、ここでα−ＫＧは消費されているが、イソクエン酸は検出されなかった。図１８Ｃは、酵素を含有する反応物の第２の分析を提示し、ここでイソクエン酸は、１ｍＭの最終濃度になるまでスパイクされており、α−ＫＧが、０．０１％を超える感知され得る任意の濃度でイソクエン酸に転換された場合、酵素を含有する反応物中のその存在は、設定された分析システムにより検出され得たであろうことを示している。この実験からの結論は、α−ＫＧがＲ１３２Ｈによって消費された一方で、イソクエン酸は産生されなかったということである。この実験は、Ｒ１３２Ｈ変異体の１つのネオ活性が、α−ＫＧからイソクエン酸以外の化合物への還元であることを示す。
Ｒ１３２Ｈ変異体は、α−ＫＧを２−ヒドロキシグルタル酸に還元する。
標準的実験方法を用いて、ＡＰＩ２０００質量分析計を２−ヒドロキシグルタル酸の最適な検出用に設定した（表６および図１９）。２−ヒドロキシグルタル酸の存在について、上の対照および酵素含有反応の反応産物を調査した、図２０。対照反応において、２−ヒドロキシグルタル酸は検出されなかった一方で、Ｒ１３２Ｈを含有する反応においては、２−ヒドロキシグルタル酸が検出された。このデータは、Ｒ１３２Ｈ変異体の１つのネオ活性が、α−ＫＧから２−ヒドロキシグルタル酸への還元であることを確認する。
Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質が、αＫＧから２ＨＧを直接産生したか否かを判定するために、負イオンモード三重四重極エレクトロスプレイＬＣ−ＭＳを用いて変異体ＩＤＨ１反応の産物を検査した。これらの実験は、既知の代謝標準物との比較を通じて、２ＨＧが、精製したＲ１３２Ｈ変異体タンパク質によるＮＡＤＰＨ依存性のαＫＧ還元の直接産物であることを確認した（図３１Ａ）。αＫＧからイソクエン酸への転換は観察されなかった。
ＤＡＴＡＮ（ジアセチル−Ｌ−酒石酸）による誘導体化、およびその保持時間と既知のＲおよびＳ標準物の保持時間との比較を通じて、反応産物の鏡像異性的特異性を決定することができる。この方法は、Ｓｔｒｕｙｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ５０：１３９１−１３９５（２００４）に記載されている。ＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈによる、アルファ−ヒドロキシグルタル酸のＲまたはＳ鏡像異性体のいずれかの立体特異的産生は、細胞中に存在する他の酵素の生物学的活性を修飾することができる。また、ラセミ産生が生じる可能性がある。
例えば、基質としてα−ＫＧを利用する酵素の酵素活性に対する、アルファ−ヒドロキシグルタル酸の阻害効果を測定することができる。一実施形態では、アルファ−ヒドロキシグルタル酸は、野生型ＩＣＤＨ１の基質類似体阻害剤または産物類似体阻害剤であってもよい。別の実施形態では、アルファ−ヒドロキシグルタル酸は、ＨＩＦ１プロリルヒドロキシラーゼの基質類似体阻害剤または産物類似体阻害剤であってもよい。前者の場合、Ｒ１３２Ｈの酵素産物による野生型ＩＣＤＨ１の阻害が、細胞中のａＫＧの循環レベルを低下させるであろう。後者の場合、ＨＩＦ１プロリルヒドロキシラーゼの阻害が、ＨＩＦ１の安定化および細胞反応の低酸素反応コホートの誘導をもたらすであろう。

ＩＣＤＨ Ｒ１３２Ｈは、ａＫＧを２−ヒドロキシグルタル酸のＲ−鏡像異性体に還元する。
ＩＣＤＨＲ１３２Ｈ還元反応産物の２つの潜在的な鏡像異性体が存在し、それはアルファ−ケトグルタル酸を２−ヒドロキシグルタル酸に転換し、そのキラル中心は、アルファ−炭素位置に位置する。例示的産物を下に示す。
これらは当業者によって、それぞれＲ（またはプロ−Ｒ）およびＳ（またはプロ−Ｓ）鏡像異性体と称される。上記のＩＣＤＨ１ネオ活性の結果として、どちらの形態または両者が産生されるかを決定するために、反応産物における各キラル型の相対的量を下記の手順で決定した。
上記のＮＡＤＰＨの存在下でＩＣＤＨＲ１３２Ｈによってα−ＫＧから２−ＨＧへの還元を行い、３４０ｎＭのヌクレオチド補因子の吸光係数の変化によって反応進行をモニターし、反応が完了したと判断されると、反応物をメタノールにより抽出し、窒素ガス流中で完全に乾燥させた。平行して、キラル純Ｒ−２−ＨＧおよびＲ−２−ＨＧとＳ−２−ＨＧとのラセミ混合物（α−ＫＧから２−ＨＧへの純粋な化学還元によって産生される）の試料を、ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させ、同様にメタノールにより抽出し、乾燥させた。
次いで反応産物またはキラル標準物を、５０ｇ／ＬのＤＡＴＡＮを含有するジクロロメタン：酢酸（４：１）の溶液中に再懸濁させ、７５℃になるまで３０分間加熱して、下記の図式中の２−ＨＧの誘導体化を促進した：
室温まで冷却した後、誘導体化反応物を乾燥させて完了させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上での分析のためにｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させた。
２×１５０ｍＭのＣ１８カラムを用いて、９０：１０（ギ酸アンモニウム、ｐＨ３．６：メタノール）の２００μＬ／分の均一濃度の流動により、ＡＰＩ２０００ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上で反応産物およびキラル標準物の分析を行い、
ＸＩＣおよび負イオンモードの３６３／１４７の診断的ＭＲＭトランジションを用いて２−ＨＧ−ＤＡＴＡＮ複合体の保持時間をモニターした。
下記の実験における保持時間は、おおよそのものであり、＋／−１分以内まで正確であることに留意すべきであり、したがって４分で見られる大いに再現可能なピークは、カラムスイッチングバルブのアーチファクトであり、その存在は実験から導かれる結論の結果とは無関係である。
ラセミ混合物の注入は、８分および１０分の保持時間で２つの等しい面積のピークをもたらし他一方で（図２４Ａ）、Ｒ−２−ＨＧ標準物の注入は、１０分で９５％超の面積の主なピークおよび８分で５％未満の面積の小規模なピーク（図２４Ｂ）をもたらし、これはＲ−２−ＨＧ標準物が約９５％のＲおよび５％のＳであることを示している。したがって、この方法により、ＲおよびＳ−２−ＨＧキラル型を分離し、所定の試料中の各々の相対的量を決定することが可能である。ラセミ混合物およびＲ−２−ＨＧ標準物の同時注入は、８分および１０分の２つのピークをもたらし、このうち１０分のより大きいピークは、余剰のプロ−Ｒ−型（標準物）をＲ−２−ＨＧおよびＳ−２−ＨＧの従来等しい混合物に添加することによりもたらされた（図２４Ｃ）。こららの実験により、８分のピークをＳ−２−ＨＧ型に割り当て、１０分のピークをＲ−２−ＨＧ型に割り当てることが可能である。
誘導体化ネオ活性酵素反応産物のみの注入は、１０分の単一ピークをもたらし、ネオ活性反応産物がキラル純Ｒ−２−ＨＧであることを示唆している（図２４Ｄ）。ネオ活性反応産物とＲ−２−ＨＧ標準物との同時注入は、１０分で９５％超の領域の主なピーク（図２４Ｅ）および８分で５％未満の領域の単一の小規模なピーク（Ｒ−２−ＨＧ標準物のみの注入において従来観察された）をもたらし、ネオ活性産物のキラリティーがＲであることを裏付けている。ラセミ混合物およびネオ活性反応産物の同時注入（図２４Ｆ）は、１０分で６０％領域のピークおよび８分で４０％領域のピークをもたらし、したがって、ラセミ化合物試料中で観察されるこの従来対称なピークからの偏差は、ネオ活性反応産物の添加によって提供される過剰なＲ−２−ＨＧ型の存在に起因している。
これらの実験により、ＩＣＤＨ１ネオ活性が、α−ＫＧからＲ−２−ＨＧへの非常に特異的なキラル還元であると結論づけることが可能である。

他のＩＤＨ１突然変異の酵素特性
Ｒ１３２Ｈ突然変異からもたらされる変化した酵素特性が、ヒトグリア細胞腫中に見出される他のＲ１３２突然変異によって共有されるのか否かを決定するために、組み換えＲ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｌ、およびＲ１３２Ｓ変異体ＩＤＨ１タンパク質を生成し、酵素特性を評価した。Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｌ、およびＲ１３２Ｓ突然変異と同様に、αＫＧのＮＡＤＰＨ依存性還元のための機能獲得をもたらす（データ示されず）。したがって、損なわれたイソクエン酸の酸化的脱炭酸化に加えて、ヒトグリア細胞腫中に見出されるＩＤＨ１突然変異の間で共有される１つの共通特徴は、αＫＧの直接のＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する能力である。

ＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を含有する膠芽腫細胞株中の２−ＨＧ産生の特定。
野生型または変異体ＩＤＨ−１タンパク質を発現する遺伝子操作された膠芽腫細胞株の生成。ベクターｐＣＭＶ６中でクローン化されたヒトイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１、参照ＩＤ：ＮＭ＿００５８９６）のＡカルボキシ末端Ｍｙｃ−ＤＤＫタグオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）クローン商業者Ｏｒｉｇｅｎ Ｉｎｃ．から入手した。ベクターｐＣＭＶ６は、細菌および哺乳類細胞系両者における選択のためのカナマイシンおよびネオマイシン耐性力セットの両者を含有する。１３２位置でのアミノ酸コードのアルゲンチン（野生型）からヒスチジンへの変化（変異体、またはＲ１３２Ｈ）をもたらすグアニンからアデニンへの塩基対変化を導入するために、標準的分子生物学突然変異誘発技術を利用して、ＯＲＦの塩基対３６４のＤＮＡ配列を変化させた。ＤＮＡ配列分析のための標準的方法によって、特定のＤＮＡ配列変化を確認した。親ベクターｐＣＭＶ６（挿入なし）である、ｐＣＭＶ６野生型ＩＤＨ１またはｐＣＭＶ６−Ｒ１３２Ｈを、標準的成長培地中で不死化ヒト膠芽腫細胞株ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６１０（ＬＮ−１８）またはＨＴＢ−１４（Ｕ−８７）へとトランスフェクトした（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地）。トランスフェクションから約２４時間後、細胞培養物を、７５０ｕｇ／ｍＬ（ＣＲＬ−２６１０）または５００ｕｇ／ｍＬ（ＨＴＢ−１４）いずれかの濃度のＧ４１８ナトリウム塩を含有するＤＭＥＭに転移させて、ヒト野生型またはＲ１３２Ｈに対するネオマイシン選択マーカーおよびＯＲＦの両者を発現する統合ＤＮＡカセット発現した培養物中のそれらの細胞を選択した。Ｇ４１８耐性細胞のプールされた集団を生成し、ヒトＩＤＨ１抗原または操作されたカルボキシ末端ＭＹＣ−ＤＤＫ発現タグのいずれかを認識する市販の抗体を用いる細胞溶解物の標準的ウエスタンブロット分析によって、野生型ＩＤＨ１またはＲ１３２ ＩＤＨ１のいずれかの発現を確認した。次いでこれらの安定なクローンプールを代謝産物調製および分析のために利用した。
代謝産物調製および分析のための手順。トランスフェクトされた変異体発現配列を保つための継続的な選択を確保するために、１０％のＦＣＳ、２５ｍＭのグルコース、４ｍＭのグルタミン、およびＧ４１８抗生物質（７５０ｕｇ／ｍＬのＣＲＬ−２６１０、５００ｕｇ／ｍＬのＨＴＢ−１４）を含有するＤＭＥＭ培地上に、標準的哺乳類組織培養技術を用いて、野生型または変異体ＩＤＨ−１タンパク質を発現する膠芽腫細胞株（ＣＲＬ−２６１０およびＨＴＢ−１４）を成長させた。代謝産物抽出実験のための調製において、細胞を１ｘ１０６細胞の密度で１０ｃｍの円形培養皿中に継代させた。代謝産物抽出の約１２時間前に、培養培地を、前回のように、１０％の透析ＦＣＳ（１０，０００ｍｗｃｏ）、５ｍＭのグルコース、４ｍＭのグルタミン、およびＧ−４１８抗生物質を含有するＤＭＥＭに変更した（８ｍＬ／プレート）。この透析ＦＣＳは、培養培地から多数の小分子を除去し、代謝産物レベルの細胞培養特異的評価を可能にする。代謝産物抽出の２時間前に培地を再び変更した。代謝産物抽出に続いて、培地を滅菌フード中で培養皿から迅速に吸引し、ドライアイスを含有するトレーに皿を即座に配置してそれらを−８０℃に冷却し、可能な限り迅速に、ドライアイス／アセトン浴中で−８０℃に前冷却した８０％のＭｅＯＨ／２０％の水の２．６ｍＬを添加した。次いで、これらの冷却したメタノール抽出細胞を、滅菌ポリエチレンセルリフター（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３００８）により剥離することによって培養皿から物理的に分離し、懸濁させ、１５ｍＬコニカルバイアルに移し、次いで−２０℃に冷却した。さらなる８０％ＭｅＯＨ／２０％水の１．０ｍＬを冷却した培養皿に適用し、細胞リフティング手順を反復して３．６ｍＬの最終抽出容量を得た。抽出物を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞破片を沈降させ、３．０ｍＬの上清をねじ蓋式冷凍バイアルに移し、分析可能になるまで−８０℃で保存した。
分析のための調製において、抽出物を冷凍庫から取り出し、窒素ブロワー上で乾燥させてメタノールを除去した。１００％水性試料を次の通りＬＣＭＳによって分析した。抽出物（１０μＬ）を逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｎｅｒｇｉ１５０ｍｍ×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）上に注入し、１０ｍＭトリブチルアミン、１５ｍＭ酢酸（緩衝剤Ａ）水溶液中ＬＣＭＳグレードメタノール（緩衝剤Ｂ）の直線勾配を用いて、２００μＬ／分で４５分間にわたって３％の緩衝剤Ｂから９５％の緩衝剤Ｂまで実行しながら溶出した。トリプル四重極質量分析計を用いて、溶出した代謝産物を検出し、２−ヒドロキシグルタル酸を含む３８個の既知の中央代謝産物についての分子量および断片化パターンに従って（既知の化合物標準物の融合によってＭＲＭパラメータを最適化した）、多重反応モニタリングモードトランジションセット（ＭＲＭ）による負モードで検出するように調整した。Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてデータをプロセスし、既知の濃度の代謝標準物の注入した混合物からのシグナルビルドアップ曲線を用いて代謝産物シグナル強度を絶対濃度に転換した。最終代謝産物濃度を少なくとも３つの複製の平均として＋／−標準偏差で報告した。
結果。分析は、ＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を発現する細胞中の有意に高いレベルの２−ＨＧを示す。図２６Ａに示されるように、ＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を発現するＣＲＬ−２６１０細胞株中の２−ＨＧのレベルは、野生型タンパク質を発現する同一の株よりも約２８倍高い。同様に、図２６Ｂに示されるように、ＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を発現するＨＴＢ−１４細胞株中の２−ＨＧのレベルは、野生型タンパク質を発現する同一の株よりも約３８倍高い。

アミノ酸１３２のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）における突然変異を含有するヒト膠芽腫腫瘍中の２−ヒドロキシグルタル酸（２−ＨＧ）産生の評価。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）をコードする転写におけるヌクレオチド３９５位（アミノ酸コドン１３２）のヘテロ接合体細胞突然変異は、脳腫瘍中に生じ得る。
組織源：ヒト脳腫瘍を外科的切除中に得て、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。標準的臨床病理分類法およびグレード分けを用いて、グリア細胞腫としてのこの組織の臨床的分類を行った。
野生型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）または突然変異変化アミノ酸１３２のいずれかを含有する脳腫瘍試料を特定するゲノム配列分析。標準的方法を用いてゲノムＤＮＡを５０〜１００ｍｇの脳腫瘍組織から単離した。次いで、単離したゲノムＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を行い、ヒトＩＤＨ１のイントロンおよび第２エクソン配列の両方を含有するゲノムＤＮＡの２９５塩基対断片を増幅した（図２７）。図２７で、イントロン配列は、小文字フォントで示され、第２エクソンＩＤＨ１ ＤＮＡ配列は、大文字フォントで示され、順方向（５’）および逆方向（３’）プライマー配列は、下線付きフォントで示され、ヒト神経膠腫腫瘍のサブセット中で突然変異したグアニンヌクレオチドは、太字下線付きフォントで示される。
次いで、標準的プロトコルを用いて、増幅されたＤＮＡ断片を配列決定し、配列整列を行い、配列を増幅されたＰＣＲ断片の塩基対１７０のグアニンヌクレオチドにおける野生型または変異体のいずれかとして分類した。グアニン（野生型）の２コピー、あるいはグアニンを含有する１つのＩＤＨ１対立遺伝子と、増幅された産物の塩基対１７０におけるもう１つのアデニン（変異体）配列との混合の組み合わせもしくは単一対立遺伝子の組み合わせのいずれかを有するゲノムＤＮＡを含有するものとして、腫瘍を特定した（表１５）。以前に報告されているように、ヌクレオチド変化は、ヒトＩＤＨ１タンパク質のアミノ酸１３２位における、アルギニン（野生型）からヒスチジン（変異体）への変化をもたらす。
代謝産物調製および分析のための手順。１０倍容量（質量／容量比）の−８０℃のメタノール：水混合（８０％：２０％）を、脳組織（約１００ｍｇ）に添加することによって代謝産物抽出を達成し、続いて４℃で３０秒間の均質化を行った。次いでこれらの冷却したメタノール抽出された均質化組織を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、細胞および組織破片を沈降させ、浄化した組織上清をねじ蓋式冷凍バイアルに移し、−８０℃で保存した。分析のために、２倍容量のトリブチルアミン（１０ｍＭ）酢酸（１０ｍＭ）ｐＨ５．５を試料に添加し、次の通りＬＣＭＳによって分析した。Ｍｉｌｌｅｘ−ＦＧ０．２０ミクロンディスクを用いて試料抽出物を濾過し、１０μＬを逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｎｅｒｇｉ １５０ｍｍ×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）上に注入し、１０ｍＭのトリブチルアミンおよび１０ｍＭの酢酸による直線勾配ＬＣＭＳグレードメタノール（５０％）を用いて、８０％メタノール：１０ｍＭトリブチルアミン：１０ｍＭ酢酸に傾斜させながら、２００μＬ／分で６分間にわたって溶出した。トリプル四重極質量分析計を用いて、溶出した代謝産物を検出し、２−ヒドロキシグルタル酸を含む８個の既知の中央代謝産物についての分子量および断片化パターンに従って（既知の化合物標準物の融合によってＭＲＭパラメータを最適化した）、（ＭＲＭの）多重反応モニタリングモードトランジションセットによる負モードで検出するように調整した。Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてデータをプロセスし、標準的ピーク積分法によって代謝産物シグナル強度を得た。
結果。分析は、ＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｈ変異体タンパク質を発現する細胞腫瘍試料中の著しく高いレベルの２−ＨＧを示す。データを表１６および図２８に要約する。
２ＨＧ産生がＩＤＨ１中に突然変異を有する腫瘍の特徴であるか否かを決定するために、ＩＤＨ１に対する野生型あるいは変異体のいずれかであるヒト悪性神経膠腫から代謝産物を抽出した。変異体ＩＤＨ１によりトランスフェクトした細胞中でαＫＧレベルが減少することが示唆されている（Ｚｈａｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，２６１−５（２００９））。種々のＲ１３２突然変異を有する１２個の腫瘍試料からの平均αＫＧレベルは、ＩＤＨ１に対する野生型である１０個の腫瘍中で観察された平均αＫＧレベルよりも若干低かった。αＫＧにおけるこの差異は、統計的には有意でなく、野生型および突然変異腫瘍の両方において一連のαＫＧレベルを観察した。対照的に、Ｒ１３２ ＩＤＨ１突然変異を含む全ての腫瘍中に増加した２ＨＧレベルを見出した。検査された全てのＲ１３２変異体ＩＤＨ１腫瘍は、５〜３５μｍｏｌ／腫瘍グラムの２ＨＧを有する一方で、野生型ＩＤＨ１を有する腫瘍は、１００倍超少ない２ＨＧを有した。Ｒ１３２突然変異腫瘍中の２ＨＧのこの増加は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。（Ｒ）−２ＨＧが腫瘍試料中に存在する異性体であることを確認した（データ示されず）。これらのデータは合わせて、ＩＤＨ１中のＲ１３２突然変異に関連する新規の酵素活性が、これらの突然変異を有するヒト脳腫瘍における２ＨＧの産生をもたらすことを立証する。
２ＨＧは、遺伝性の代謝障害２−ヒドロキシグルタル酸尿症において蓄積することが知られている。この疾患は、２ＨＧをαＫＧに転換する酵素２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの欠乏によって引き起こされる（Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ７６，３５８−６０（２００５））。ＭＲＩおよびＣＳＦ分析によって評価されたとき、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠乏症を有する患者は、脳中に２ＨＧを蓄積し、白質脳症を発症し、脳腫瘍を発症するリスクが上昇する（Ａｇｈｉｌｉ，Ｍ．，Ｚａｈｅｄｉ，Ｆ．＆Ｒａｆｉｅｅ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ９１，２３３−６（２００９）、Ｋｏｌｋｅｒ，Ｓ．，Ｍａｙａｔｅｐｅｋ，Ｅ．＆Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｇ．Ｆ．Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ３３，２２５−３１（２００２）、Ｗａｊｎｅｒ，Ｍ．，Ｌａｔｉｎｉ，Ａ．，Ｗｙｓｅ，Ａ．Ｔ．＆ Ｄｕｔｒａ−Ｆｉｌｈｏ，Ｃ．Ｓ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ２７，４２７−４８（２００４））。さらに、２ＨＧの上昇した脳レベルは、上昇したＲＯＳレベルをもたらし（Ｋｏｌｋｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１６，２１−８（２００２）、Ｌａｔｉｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１７，２０１７−２２（２００３））、それは潜在的に癌のリスク上昇に寄与する。ＮＭＤＡ受容体アゴニストとして作用する２ＨＧの能力は、この影響に寄与し得る（Ｋｏｌｋｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６，２１−８（２００２））。また、２ＨＧは、グルタミン酸塩および／またはαＫＧを利用する酵素を競合的に阻害することによって細胞に対して毒性となり得る。これには、アミノ酸および核酸生合成のための窒素グルタミン酸の利用を可能にするトランスアミナーゼ、およびＨｉｆ１αレベルを調節する酵素等のαＫＧ依存性プロリルヒドロキシラーゼが含まれる。Ｈｉｆ１αにおける変化は、変異体ＩＤＨ１タンパク質発現からもたらされることが報告されている（Ｚｈａｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，２６１−５（２００９））。機構に関わらず、ＩＤＨ１中のＲ１３２突然変異の結果として２ＨＧを産生する、細胞の機能獲得能力は、腫瘍発生に寄与する可能性が高いと思われる。２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠乏症を有する患者は、ＣＮＳ悪性腫瘍の高いリスクを有する（Ａｇｈｉｌｉ，Ｍ．，Ｚａｈｅｄｉ，Ｆ．＆Ｒａｆｉｅｅ，Ｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ９１，２３３−６（２００９））。αＫＧに直接作用する変異体ＩＤＨ１の能力は、ＣＮＳ組織からの腫瘍中のＩＤＨ１突然変異の蔓延を説明することができ、それはそれらの高レベルのグルタミン酸塩取り込みおよびサイトゾル中のαＫＧへのその容易な転換において固有であり（Ｔｓａｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐａｒｉｓ９６，２８３−８（２００２））、それによって２ＨＧ産生のための高レベルの基質を提供する。変異体ＩＤＨ１の活性の、野生型酵素の活性との見かけの共優性は、遺伝子の単一コピーのみが突然変異するこの疾患の遺伝子と一致する。上記のように、野生型ＩＤＨ１は、ＮＡＤＰＨおよびαＫＧを突然変異酵素に直接提供することができた。また、これらのデータは、Ｒ１３２のヒスチジン、セリン、システイン、グリシン、またはロイシンへの突然変異が、αＫＧから２ＨＧへのＮＡＤＰＨ依存性転換を触媒する共通の能力を共有することを示す。これらの所見は、触媒活性に必須の他の残基を含む、ＩＤＨ１の他のアミノ酸残基における突然変異が見出されない理由を明確にする一助となる。最後に、これらの知見は、それらが、２ＨＧ産生がＩＤＨ１変異体脳腫瘍を有する患者を特定するであろうことを示唆するという点で臨床的意味を有する。ＩＤＨ１突然変異を有する患者は、他の突然変異によって特徴付けられるグリア細胞腫を有する患者よりも長く生存するため、これは予後にとって重要となるであろう（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，１８０７−１２（２００８））。加えて、より低いグレードのグリア細胞腫を有する患者は、２ＨＧ産生の治療的阻害によって利益を得ることができる。変異体ＩＤＨ１による２ＨＧ産生の阻害は、より低いグレードの神経膠腫が致死的二次性膠芽腫に転換するのを遅延または停止させ得、疾患の経過を変化させる。

α−ＫＧのＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ還元の反応産物は、野生型ＩＣＤＨ１によるイソクエン酸の酸化的脱炭酸化を阻害する。
野生型ＩＣＤＨ１、ＮＡＤＰ、およびα−ＫＧを含有する反応物をまとめ（上記の条件下で）、そこへ滴定系で（Ｒ）−２−ヒドロキシグルタル酸、またはＫＧから２−ヒドロキシグルタル酸へのＩＣＤＨ１ Ｒ１３２１Ｈ突然変異還元の反応産物のいずれかを添加した。反応産物２−ＨＧは、野生型ＩＣＤＨ１によるイソクエン酸の酸化的脱炭酸化を阻害することが示された一方で、（Ｒ）−２−ヒドロキシグルタル酸は、反応率に対して何の効果も示さなかった。α−ＫＧから２−ＨＧへのＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ突然変異還元の潜在的なキラル産物は２つしか存在せず、またこの検定において（Ｒ）−２−ＨＧは阻害を示さなかったため、変異体反応の産物は、（Ｓ）−２−ＨＧ型であることになる。この実験を図２５に提示する。
産生された２ＨＧのキラリティーを決定するために、Ｒ１３２Ｈ反応の産物をジアセチル−Ｌ−酒石酸無水物により誘導体化し、それによって単純な逆相ＬＣにより２ＨＧの（Ｓ）および（Ｒ）鏡像異性体を分離し、タンデム質量分析によって産物を検出することが可能となった（Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｅ．Ｅ．，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ｎ．Ｍ．＆Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５０，１３９１−５（２００４））（図３１Ｂ）。ラセミおよびＲ（−）−２ＨＧ標準物を用いて、２ＨＧの（Ｓ）および（Ｒ）異性体に対応するピークを確認した。Ｒ（−）−２ＨＧピークと同時溶出したＲ１３２Ｈからの反応産物は、Ｒ（−）立体異性体が、Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１によってαＫＧから産生された産物であることを示している。
突然変異酵素の反応産物が、細胞中で生じることが知られる代謝反応を阻害することができるという観察は、この反応産物がまた、基質としてα−ＫＧ、イソクエン酸、またはクエン酸塩を利用する他の反応を阻害し得るか、またはそれらを体内もしくは体外産物として産生し得ることを示唆する。

実施例３ ＩＤＨ１野生型および変異体のメタボロミクス分析
メタボロミクス研究は、Ｒ１３２突然変異が、かかる突然変異を担持するＧＢＭ患者に生存優位性を与える理由についての機構的根拠を提供することができる。
１．ＧＢＭ腫瘍細胞株のメタボロミクス：野生型対Ｒ１３２変異体
Ｒ１３２突然変異を有する細胞株を特定し、プロフィール決定することができる。広範な代謝産物を有する近位代謝産物プール中で実験を行った。

２．ＧＢＭ細胞株のオキサロリンゴ酸塩処置
オキサロリンゴ酸塩は、ＩＤＨ１の競合阻害剤である。ＩＤＨ１が小分子によって阻害されるときのＮＡＤＰＨ（メタボロミクス）の変化を検査することができる。

３．原発性ＧＢＭ腫瘍のメタボロミクス：野生型対Ｒ１３２突然変異
Ｒ１３２突然変異を有する原発性腫瘍を特定することができる。広範な代謝産物を有する近位代謝産物プール中で実験を行うことができる。

４．ＩＤＨ１ １３２変異体を過剰発現する細胞中の２−ヒドロキシグルタル酸の検出
細胞中のＩＤＨ１ １３２変異体の過剰発現は、２−ヒドロキシグルタル酸レベルの上昇および／またはアルファ−ケトグルタル酸レベルの低下を引き起こし得る。メタボロミクス実験を行い、細胞代謝産物プール上のこの突然変異の結果を示すことができる。

実施例４ 癌標的としてのＩＤＨ１の評価
ｓｈＲＮＡｍｉｒ誘発性ノックダウンを行い、細胞表現型およびメタボロミクスプロフィールを検査することができる。ＨＴＳグレードＩＤＨ１酵素が利用可能である。本明細書に記載されるＩＤＨ突然変異を患者の選択のために使用することができる。

実施例５ ｓｉＲＮＡ
ＩＤＨ１
例示的なｓｉＲＮＡを以下の表に提示する。当技術分野で既知の方法を使用して、他のｓｉＲＮＡを選択することができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、ＨｅＬａ細胞もしくは培養神経膠腫細胞等の培養細胞等のインビトロシステムにおける、ＩＤＨ１等のＩＤＨをサイレンシングするｓｉＲＮＡの能力を決定することによって、評価することができる。また、標的をサイレンシングために当技術分野で既知のｓｉＲＮＡを、使用することもできる。例えば、Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤＰ＋ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｃｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｓｔａｕｒｏｐｉｎｅ，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：１６５−１７３を参照されたい。
表７（エントリ１３５６を除く）中のｓｉＲＮＡは、ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／．のワールドワイドウェブ上で利用可能なｓｉＲＮＡ選択ツールを用いて、生成することができる。（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００４ ３２：Ｗ１３０−Ｗ１３４）。他の選択ツールも使用することができる。エントリ１３５６は、Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤＰ＋ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｃｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｙ
ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｓｔａｕｒｏｐｉｎｅ，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：１６５−１７３から適合された。
表７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４のｓｉＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５８９６．２の配列（配列番号９、図２２）に従ってヌクレオチド位置６２８および６２９で、ＩＤＨ１ ｍＲＮＡに及ぶ候補を表す。
表のＲＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように、修飾することができる。修飾には、例えば、分解耐性、またはオーバーハングの使用等の特性を亢進するための化学修飾が含まれる。例えば、表のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれた１つまたは両方は、３’末端でさらなるジヌクレオチド、例えば、ＴＴ、ＵＵ、ｄＴｄＴ等を含むことができる。

ＩＤＨ２
例示的なｓｉＲＮＡを以下の表に提示する。当技術分野で既知の方法を使用して、他のｓｉＲＮＡを選択することができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、ＨｅＬａ細胞もしくは培養神経膠腫細胞等の培養細胞等のインビトロシステムにおける、ＩＤＨ２等をサイレンシングするｓｉＲＮＡの能力を決定することによって、評価することができる
表１５中のｓｉＲＮＡは、ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／のワールドワイドウェブ上で利用可能なｓｉＲＮＡ選択ツールを用いて、生成することができる（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００４ ３２：Ｗ１３０−Ｗ１３４）。他の選択ツールも使用することができる。エントリ１３５６は、Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤＰ＋ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｃｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｓｔａｕｒｏｐｉｎｅ，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：１６５−１７３から適合された。
表１６〜２３中のｓｉＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２１６８．２によって表されるｍＲＮＡ配列（２００９年８月１６日付の記録、ＧＩ２８１７８８３１）に従ってヌクレオチド位置６００、６０１、および６０２で、ＩＤＨ２ ｍＲＮＡに及ぶ候補を表す（配列番号１２、図２２Ｂ、配列番号１１によって表されるｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置５１４、５１５、および１６に相当、図２２Ａ）。
表のＲＮＡは、例えば、本明細書に記載されるように、修飾することができる。修飾には、例えば、分解耐性、またはオーバーハングの使用等の特性を亢進するための化学修飾が含まれる。例えば、表のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれた１つまたは両方は、３’末端でさらなるジヌクレオチド、例えば、ＴＴ、ＵＵ、ｄＴｄＴ等を含むことができる。

実施例６ Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１の構造分析
いかにＲ１３２突然変異がＩＤＨ１の酵素特性を変化させるかを画定するために、αＫＧ、ＮＡＤＰＨ、およびＣａ２＋に結合するＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１の結晶構造を、２．１Åの分解能で溶解した。
ホモ二量体Ｒ１３２Ｈ突然変異酵素の全体的な四次構造は、野生型酵素について前述されている同じ閉鎖触媒的に有能な立体配座（図２９Ａにモノマーとして示される）を採用する（Ｘｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７９，３３９４６−５７（２００４））。αＫＧへの水素化物移動が予想されるようにＮＡＤＰＨが、Ｒ（−）−２ＨＧを産生する配向に位置付けられ、これは、２ＨＧ産物のキラル決定と一致する。
２つの重要な特徴は、ヒスチジンへのＲ１３２の変化：触媒立体配座の平衡における効果および活性部位の再組織化によって示された。比較的硬い小さなドメインのβ−シート上に位置して、Ｒ１３２は、ゲートキーパー残基として作用し、開放立体配座と閉鎖立体配座との間のヒンジ運動を統合すると見られる。Ｒ１３２のグアニジン部分は、ほぼ８Åの距離で、開放立体配座から閉鎖立体配座に移った。アルギニンに対するヒスチジンの置換は、効率よく結合する補因子および基質のための触媒クレフトを形成する閉鎖立体配座に有利になるように平衡を変化させる可能性があり、これは、Ｒ１３２Ｈ突然変異酵素によって示されたＮＡＤＰＨに対する高親和性を部分的に説明する。この特徴は、ＮＡＤＰＨ濃度が低い環境において、Ｒ（−）−２ＨＧへのαＫＧのＮＡＤＰＨ依存性還元に対して有利であり得る。第２に、野生型酵素と比較して、変異体ＩＤＨ１構造の触媒ポケットのさらに精密な検査は、Ｒ１３２のグアニジンとイソクエン酸のα／βカルボン酸塩との間の重要な塩橋相互作用の予想された喪失、ならびに金属イオンを調整するネットワークの変化だけでなく、活性部位の予想されない再組織化を示した。ヒスチジンへの突然変異は、Ａサブユニットからの高度に保存された残基Ｙ１３９およびＢサブユニットからのＫ２１２’の位置で有意な変化をもたらし（図２９Ｂ）、これらの両方は、この酵素ファミリーの触媒作用にとって重要であると考えられる（Ａｋｔａｓ，Ｄ．Ｆ．＆ Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｆ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４８，３５６５−７７（２００９））。特に、Ｙ１３９のヒドロキシル部分は、現在、イソクエン酸のβ−カルボン酸塩の空間を占有する。加えて、αＫＧの末端カルボン酸塩が、これで上に向いて、Ｎ９６およびＳ９４との新しい接点を形成するイソクエン酸と比較して、αＫＧの有意な再配置が観察された。概して、この単一のＲ１３２突然変異は、野生型ＩＤＨ１と比較して、はっきりと異なる活性部位の形成をもたらす。

実施例７材料および方法
要約
Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｌ、およびＲ１３２Ｓ突然変異は、標準的分子生物学技術によってヒトＩＤＨ１に導入された。２９３Ｔならびにヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧおよびＬＮ−１８を、ＤＭＥＭ、１０％のウシ胎児血清中で培養した。標準技術を用いて、細胞をトランスフェクトし、選択した。タンパク質発現レベルは、ＩＤＨｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＩＤＨ１抗体（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ＭＹＣタグ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＩＤＨ２抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたウエスタンブロット分析によって決定した。細胞を分離させるために、８０％の水性メタノール（−８０℃）、および細胞剥離あるいは均質化のいずれかを用いて、すでに報告された方法（Ｌｕ，Ｗ．，Ｋｉｍｂａｌｌ，Ｅ．＆ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｄ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ１７，３７−５０（２００６））の閉鎖変異体に従って、代謝産物を、培養細胞および組織試料から抽出した。細胞溶解物の酵素活性は、イソクエン酸およびＮＡＤＰ、またはαＫＧおよびＮＡＤＰＨの存在下で、時間経過に伴う、ＮＡＤＰＨ蛍光の変化に従うことによって評価された。組み換えＩＤＨ１酵素を用いた酵素アッセイのために、タンパク質を大腸菌において産生し、ニッケル親和性クロマトグラフィー、続いて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。組み換えＩＤＨ１タンパク質の酵素活は、イソクエン酸およびＮＡＤＰ、またはαＫＧおよびＮＡＤＰＨの存在下で、ストップフロー分光光度計を用いて、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ紫外線吸光度の変化に従うことによって評価された。前述のように、２ＨＧのキラリティーを決定した（Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｅ．Ｅ．，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ｎ．Ｍ．＆ Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ５０，１３９１−５（２００４））。結晶学研究のために、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬで精製した組み換えＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）を、１０ｍＭのＮＡＤＰＨ、１０ｍＭの塩化カルシウム、および７５ｍＭのαＫＧを用いて、６０分間、プレインキュベートした。２０℃で、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、２０％のＰＥＧ６０００のウェル溶液に対して、２：１（タンパク質：沈殿剤）で混合した３μＬの液滴を用いて、蒸気拡散平衡法によって、結晶を得た。ＵＣＬＡ ＩＲＢで承認された研究プロトコルの一部として告知に基づく同意後に、患者腫瘍試料を得た。 外科的切除後、脳腫瘍試料を得、液体窒素によって冷却されたイソペンタン中で急速凍結され、−８０℃で保存された。それぞれの試料のＩＤＨ１突然変異状態は、前述されるように、標準的分子生物学技術を用いて決定した（Ｙａｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３６０，７６５−７３（２００９））。上記のように、代謝産物を抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された。完全な方法は、補助的材料において利用可能である。

補助的な方法
大腸菌におけるＩＣＤＨ１野生型および変異体のクローニング、発現、および精製。ヒトイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ｃＤＮＡ）（ＩＤＨ１、参照ＩＤ ＮＭ＿００５８９６）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）クローンをｐＥＮＴＲ２２１についてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびｐＣＭＶ６についてはＯｒｉｇｅｎｅ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。野生型または変異体ＩＤＨ１と細胞をトランスフェクトするために、１３２位のアミノ酸コードのアルギニン（野生型）からヒスチジンへの変化（変異体、またはＲ１３２Ｈ）をもたらすグアニンからアデニンへの塩基対変化を導入するために、標準的分子生物学突然変異誘発技術を利用して、ｐＣＭＶ６におけるＯＲＦの塩基対３９５のＤＮＡ配列を変化させ、標準的ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認された。２９３Ｔ細胞のトランスフェクションのために、野生型およびＲ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１を、カルボキシ末端Ｍｙｃ−ＤＤＫ−タグを用いて、または用いないで、ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６にサブクローン化した。安定した細胞株を生成するために、ｐＣＭＶ６の構造を使用した。大腸菌の発現のために、コード領域は、５’末端および３’末端で、それぞれ、ＮＤＥＩおよびＸＨＯ１制限部位を加えるように設計されたプライマーを用いるＰＣＲによってｐＥＮＴＲ２２１から増幅された。得られた断片を、Ｃ末端Ｈｉｓ８標識タンパク質の大腸菌の発現を可能にするベクターｐＥＴ４１ａ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローン化した。Ｇ３９５からＡに変化させるために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ｐＥＴ４１ａ−ＩＣＨＤ１プラスミドにおいて部位特異的突然変異誘発を行い、ＡｒｇからＨｉｓへの突然変異をもたらした。Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｌ、およびＲ１３２Ｓ変異体を、類似の方法において、ｐＥＴ４１ａ−ＩＣＨＤ１に導入した。
野生型および変異タンパク質を、次の通りＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に発現させ、精製した。ＯＤ６００が０．６に到達するまで、細胞を、３７℃で振とうしながらＬＢ（２０μｇ／ｍＬのカナマイシン）に増殖させた。温度は、１８℃に変え、タンパク質発現を、１ｍＭの最終濃度にＩＰＴＧを添加することによって誘導した。ＩＰＴＧを誘導してから１２〜１６時間後、細胞を、溶解緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール）で再懸濁させ、マイクロ流体によって破壊した。２０，０００ｇの上清を、ニッケルカラム緩衝剤Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール）で平衡化した金属キレート親和性樹脂（ＭＣＡＣ）に充填し、２０カラム容量で洗浄した。カラムからの溶出は、ニッケルカラム緩衝剤Ａ中の１０％〜１００％のニッケルカラム緩衝剤Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５００ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール）の２０カラム容量の直線勾配によって達成された。目的のタンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特定し、プールし、２００容量の過剰のゲル濾過緩衝剤（２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのＭｎＳＯ４、１０％のグリセロール）に対して２回透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）遠心濃縮器を用いて、１０ｍＬまで濃縮した。活性ダイマーの精製は、ＭＣＡＣカラムから濃縮溶出液をゲル濾過緩衝剤で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）カラムに応用することによって達成され、２０カラム容量の同じ緩衝剤でカラムを溶出した。二量体タンパク質の保持時間に対応する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特定し、−８０℃で保存するためにプールした。
細胞株および細胞培養。２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養し、製造業者の指示に従って、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む６ウェルプレートにｐＣＭＶ−６ベースのＩＤＨ−１構造を用いてトランスフェクトした。親ベクターｐＣＭＶ６（挿入なし）、ｐＣＭＶ６−野生型ＩＤＨ１、またはｐＣＭＶ６−Ｒ１３２Ｈを、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で培養したヒト膠芽腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、ＬＮ−１８（それぞれ、ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１４、およびＣＲＬ−２６１０）とトランスフェクトした。トランスフェクションしてから約２４時間後、細胞培養物を、５００ｕｇ／ｍＬ（Ｕ８７ＭＧ）あるいは７５０ｕｇ／ｍＬ（ＬＮ−１８）のいずれかの濃度で、Ｇ４１８ナトリウム塩を含有する培地に移動した。Ｇ４１８耐性細胞のプールした集団を、生成し、野生型ＩＤＨ１あるいはＲ１３２ ＩＤＨ１のいずれかの発現を標準的ウエスタンブロット分析によって確認した。
ウエスタンブロット。２９３細胞における過渡トランスフェクション実験のために、細胞を、標準的なＲＩＰＡ緩衝剤を用いてトランスフェクションしてから７２時間後に溶解した。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに移し、ヤギ−抗−ＩＤＨｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ４９９９６）またはウサギ−抗−ＭＹＣタグ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃２２７８）でプローブし、次いで、ＨＲＰ共役ロバ抗ヤギまたはＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ２００４）で検出した。野生型およびＲ１３２Ｈ ＩＤＨ１の両方の発現を確認するためにＩＤＨ１抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈから得た。使用したＩＤＨ２マウスモノクローナル抗体は、Ａｂｃａｍから得た。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって精製した酵素反応におけるイソクエン酸、αＫＧ、および２ＨＧの検出。文書に記載されるように行った酵素反応は、３４０ｎｍでＮＡＤＰＨの酸化状態の測定によって判断される完了まで反応させた。反応物を、８容量のメタノールで抽出し、遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去した。上清を、窒素ガス流下で乾燥させ、Ｈ２Ｏに再懸濁させた。ＡＰＩ２０００ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上での分析を行った。ＭＲＭトランジションを用いた緩衝剤Ａ（１０ｍＭのトリブチルアミン、１５ｍＭの酢酸、３％（ｖ／ｖ）の水中メタノール）および緩衝剤Ｂ（メタノール）の勾配を用いて、１５０×２ｍｍ、４ｕＭのＳｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ８０Ａカラム上で試料分離および分析を行った。
細胞溶解物ベースの酵素アッセイ。酵素活性を測定するために２９３Ｔ細胞溶解物は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充したＭ−ＰＥＲ溶解緩衝剤を用いて、トランスフェクションしてから４８時間後に得た。溶解物を超音波で分解し、１２，０００ｇで遠心分離した後、上清を収集し、全タンパク質濃度に正規化した。ＩＤＨ酸化活性を測定するために、３μｇの溶解タンパク質を、３３ｍＭのトリス酢酸塩緩衝剤（ｐＨ７．４）、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３３ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭのβ−ＮＡＤＰ、および様々な濃度のＤ−（＋）−ｔｈｒｅｏ−イソクエン酸を含む２００μＬのアッセイ溶液に添加した。ＮＡＤＰＨ産生を反映する、３４０ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３０分間２０秒ごとに測定した。データポイントは、５分ごとに集めた５回のポイントの間で平均化した溶解物ごとの３つの複製の平均活性を表す。ＩＤＨ還元活性を測定するために、３μｇの溶解タンパク質を、３３ｍＭのトリス酢酸塩（ｐＨ７．４）、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μＭのβ−ＮＡＤＰＨ、４０ｍＭのＮａＨＣＯ３、および０．６ｍＭのαＫＧを含んだ２００μＬのアッセイ溶液に添加した。時間経過に伴う３４０ｎｍでの吸光度の減少を、溶解物ごとに３つの複製を用いて、ＮＡＤＰＨ消費を評価するために測定した。
組み換えＩＤＨ１酵素アッセイ。標準酵素反応緩衝剤（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．０３％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン）において、全ての反応を行った。動力学パラメータの判定のために、十分な酵素を添加し、１〜５秒間線形反応を得た。ＳＦＭ−４００ストップフロー分光光度計（ＢｉｏＬｏｇｉｃ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）において、３４０ｎｍでの補因子の還元状態を観察することによって、反応進行をモニターした。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアパッケージ（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、標準的な動力学モデルへの曲線適合アルゴリズムを用いて、酵素構造を決定した。
酵素反応および腫瘍からの反応産物のキラリティーの決定。酵素反応は、完了するまで反応させ、上記のメタノールで抽出し、次いで、分解する前に鏡像異性的に純粋な酒石酸で誘導体化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。完全に乾燥させた後、試料を、ジクロロメタン：酢酸（４：１）中の新たに調製した５０ｍｇ／ｍＬの（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸で再懸濁し、７５℃で３０分間インキュベートした。室温まで冷却した後、試料を、１４，０００ｇで短期間遠心分離し、窒素ガス流下で乾燥させ、Ｈ２Ｏで再懸濁した。Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１５０×２ｍｍ、５ｕＭカラム上で、９０：１０（２ｍＭのギ酸アンモニウム、ｐＨ３．６：ＭｅＯＨ）のアイソクラッティクフロー（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｆｌｏｗ）を用いて、ＡＰＩ２００ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で分析を行った。３６２．９／１４６．６ＭＲＭトランジションおよびＤＰ−１、ＦＰ−３１０、ＥＰ−４、ＣＥ−１２、ＣＸＰ−２６の機器設定を用いて、酒石酸で誘導体化した２ＨＧを検出した。（Ｒ）−２ＨＧ標準物、２ＨＧラセミ混合物、およびメタノールで抽出された腫瘍バイオマス（任意の量）の分析を同様に行った。
結晶学的条件。２０℃で、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、２０％のＰＥＧ６０００のウェル溶液に対して、２：１（タンパク質：沈殿剤）で混合した３μＬの液滴を用いて、蒸気拡散平衡法によって、結晶を得た。
タンパク質の特徴付け。約９０ｍｇのヒトサイトゾルイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＨｃＩＤＨ）を、ＡｇｉｏｓによってＸｔａｌ ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓに供給された。このタンパク質は、１１残基のＣ末端親和性精製タグ（配列ＳＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ）を有する操作された変異型Ｒ１３２Ｓであった。計算された単量体の分子量は、４８．０ｋＤａであり、理論ｐＩ値は、６．５０であった。約６ｍｇ／ｍＬの濃度で、タンパク質を、８０℃で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１０％のグリセロール中の１ｍＬのアリコートに保存した。図３２Ａに示すように、タンパク質の純度を試験するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ヒスチジンでのウエスタンブロットを行い、タンパク質が実際、ヒスチジンで標識されたことを実証した。タンパク質の試料を、ＦＰＬＣサイズ排除カラムに注入し、試料の純度を評価し、溶液中の重合状態を判定した。図３２Ｂは、およそ８７．６ｋＤａで流出する単一ピークを示すこの流出のクロマトグラムであり、ＩＤＨが、ｐＨ７．４で二量体として存在することを示唆している。結晶化する前に、タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ遠心濃縮器を用いて、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１００ｍＭのＮａＣｌに交換した。また、この時、約１５ｍｇ／ｍＬまでタンパク質を濃縮した。このタンパク質濃度およびイオン強度で、タンパク質は、沈殿物の検出可能なレベルを形成する傾向があった。沈殿物を回転除去した後、溶液は、４℃で約１０ｍｇ／ｍＬで安定した。
結晶化での最初の試み。回折品質結晶を得るための戦略は、文献の条件、具体的には、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｒｅｖｅａｌ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｌｆ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｘｕ， ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３３９４６−５６に由来した。この研究において、２つの結晶型のＨｃＩＤＨ野生型タンパク質を産生した。ある結晶型は、正方空間群Ｐ４３２１２における懸滴から結晶化したＩＤＨ−ＮＡＤＰの「二元複合体」を含んだ。この液滴は、等量のタンパク質溶液（１５ｍｇ／ｍＬのＩＤＨ、１０ｍＭのＮＡＤＰ）および１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）および１２％のＰＥＧ２００００からなる沈殿剤から形成された。他の結晶型は、沈殿剤として、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．９）および２０％のＰＥＧ６０００を用いて、単斜晶空間群Ｐ２１において結晶化したそれらの「四元複合体」であるＩＤＨ−ＮＡＤＰ／イソクエン酸／Ｃａ２＋を含んだ。ここで、１０ｍＭのＤＬ−イソクエン酸および１０ｍＭの塩化カルシウムをタンパク質溶液に添加した。本研究において、Ｒ１３２Ｓ変異体を結晶化する最初の試みは、変形がほとんどなくこれらの２つの報告された条件を中心とした。以下に異なり得る結晶化の構成要素を列挙し、これらの構成要素の幾つかの異なる組み合わせをスクリーニングプロセスにおいて試みた。
懸滴を形成した後、乳白色の沈殿物が、常に観察された。２０℃での２〜４日後の検査において、ほとんどの液滴は、濃厚な沈殿物または相分離を示した。場合によっては沈殿物が沈下し、例えば、図３３に示すように、小さな結晶が成長したのは、これらの種類の液滴からであった。
結晶最適化。正真正銘の結晶が達成されると、次のステップは、時宜を得た一貫性のある方法で、ＩＤＨ−ＮＡＤＰ／イソクエン酸／Ｃａ２＋のより大きな、さらに規則的に成形した結晶を得るための条件を最適化することであった。最適化スクリーニングは、５．７〜６．２のｐＨ、５０〜２００ｍＭのＭＥＳ濃度、および２０〜２５％のＰＥＧ６０００濃度を変化させることに集中した。また、さらに大きな液滴（５〜６μＬ）を設定し、液滴比を再度変えた。これらの試みは、より大きな回折品質結晶を産生することができなかったが、上記に報告された結果を再現した。濃厚な沈殿物、油状の相分離、または小結晶が観察された。
α−ケトグルタル酸を用いる。イソクエン酸結晶の最適化と同時に、α−ケトグルタル酸と複合するＩＤＨ（Ｒ１３２Ｓ）の結晶を得るために他のスクリーニングを行った。タンパク質溶液は、常に、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１００ｍＭのＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬのＩＤＨであった。以下のものを、この順序で添加した：５ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのα−ケトグルタル酸（遊離酸、ＮａＯＨでバランスをとったｐＨ）、および１０ｍＭの塩化カルシウム。タンパク質は、液滴を設置する前に、少なくとも１時間、これらの化合物でインキュベートさせた。沈殿剤は、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）および１２％のＰＥＧ２００００、あるいは１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）および２０％のＰＥＧ６０００のいずれかであった。また、沈殿物または相分離が主として見られたが、幾つかの液滴においては、小結晶を形成した。液滴のうちの１つの縁で、以下に示されるように、単一の大きな結晶を形成した。これは、以下の構造決定に使用された単一の結晶であった。図３４は、５ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのα−ケトグルタル酸、１０ｍＭのＣａ２＋を含むタンパク質溶液から得られた結晶を示す。沈殿剤は、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）および１２％のＰＥＧ２００００を含んだ。
冷凍条件。結晶をＸ線源に輸送し、冷凍結晶中、それを保護するために、好適な冷凍保護剤を必要とした。グリセロールは、かなり広く使用されており、第一選択であった。冷凍溶液は、基本的に、タンパク質緩衝剤および沈殿剤溶液に加えて、グリセロールの混合物として作製された：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのα−ケトグルタル酸、１０ｍＭの塩化カルシウム、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１２％のＰＥＧ２００００、および１２．５％のグリセロールあるいは２５％のグリセロールのいずれか。結晶を、２つのステップにおいて、冷凍溶液に移した。第１に、５μＬの１２．５％グリセロール溶液を、液滴に直接添加し、１０分間インキュベートし、起こり得る結晶のクラッキングを監視した。液体を液滴から除去し、１０μＬの２５％グリセロール溶液を結晶の上部に添加した。再度、これを１０分間インキュベートし、ナイロン製のループに採取し、液体窒素に投入した。輸送のために、液体窒素デュワーに浸漬した結晶を保存した。
データ収集および処理。冷凍結晶を、ほぼ−１７０℃の温度、窒素ガス流下で、Ｒｉｇａｋｕ ＲＡＸＩＳ ＩＶ Ｘ線機器上に取り付けた。回転銅陽極ホーム源からの１．５４Å波長の放射、１°振動、および１０分間の曝露を用いて、画像プレート検出器を用いて２００°データセットを収集した。抗凍結剤として、２５％のグリセロールの存在は、適切な冷凍には十分であり、結晶のクラッキングの兆候（分裂スポットまたは多層構造の格子）は観察されなかった。３．６Å分解能で、拡散環が観察され、これは、氷結による可能性が最も高かった。Ｘ線回折パターンは、明らかな格子面および適切なスポット分離を示したが、片方の逆軸に沿う間隔は、かなり小さかった（ｂ＝２７５．３）。データを、ＨＫＬ２０００で、空間群Ｐ２１２１２に対して２．７Å分解能まで指数化した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ，１９９７）。閉鎖形態（１Ｔ０Ｌ）、開放形態（１Ｔ０９サブユニットＡ）、および半開放形態（１Ｔ０９サブユニットＢ）と指定される、ＨｃＩＤＨに対する３つの構造が知られている。これらの３つの形式からタンパク質原子のみを用いたＣＣＰ４プログラムＰＨＡＳＥＲ（Ｂａｉｌｅｙ，１９９４）を用いて、分子置換を行った。閉鎖形態のみ、非対称ユニットにおいて、６タンパク質サブユニットによる成功した分子置換の結果を得た。単位格子は、約５３．８％の溶媒を含有する。
モデルの精密化。＿ＣＣＰ４プログラムＲＥＦＭＡＣ５を用いて、非対称ユニットにおいて、６つのＩＤＨサブユニットのそれぞれに適合する剛体精密化を行った。これを、それぞれのタンパク質サブユニットにおける３つのドメインの剛体精密化によって追跡した。サブユニットの関連対の非結晶学的対称性の平均化を利用する抑制した精密化により、３３％のＲｃｒｙｓｔおよび４２％のＲｆｒｅｅを有する初期構造を得た。＿画像プログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を用いてモデル構築および実空間の精密化を行った。差の分布図を計算し、これは、強力な電子密度を示し、ここに、ＮＡＤＰリガンドおよびカルシウムイオンの６個の個々の複製が、ＣＯＯＴと手動で適合した。α−ケトグルタル酸構造の密度は、あまり定義されず、結合部位タンパク質残基を適合した後、２Ｆｏ−Ｆｃコンポジットオミットマップ（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｏｍｉｔ ｍａｐ）を用いて、適合された。手動実空間密度フィッティングに加えて、自動ラマチャンドランプロット最適化は、全体の幾何学的適合を改善するために応用された。ＮＣＳにより制限された精密化の最終ラウンドにより、３０．１％のＲｃｒｙｓｔおよび３５．２％のＲｆｒｅｅを得た。
全てのデータおよび最高分解能殻におけるデータに対する完全性およびＲ−マージを得た。最高殻値は、カッコ内にある。
ａＲ因子＝Σｈｋｌ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜／ΣｈｋｌＦｏ、ここで、ＦｏおよびＦｃは、それぞれ、精密化に使用された全ての反射に対して、観察され、かつ計算された構造因子振幅である。
ｂＲ−ｆｒｅｅは、精密化に使用されなかったデータの５％に対して計算される。
ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ＲＡ，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ ＭＷ，Ｍｏｓｓ
ＤＳ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＪＭ（１９９３）Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ２６：２８３−２９１）によって生成する。
主鎖および側鎖のねじれ角に対するｄＧ因子、および主鎖の共有結合力（結合長および結合角）。値は、理想的には、−０．５または−１．０を超えなければならない。
臨床材料、代謝産物抽出、および分析。外科的切除中、ヒト脳腫瘍を得、液体窒素によって冷却されたイソペンタン中で急速凍結され、−８０℃で保存した。標準的臨床病理分類法およびＷＨＯによって構築された格付けを用いて組織の臨床的分類を行った。ゲノム配列分析を展開し、野生型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）あるいは突然変異を変換するアミノ酸１３２のいずれかを含む脳腫瘍試料を特定した。ゲノムＤＮＡは、標準的方法を用いて、５０〜１００ｍｇの脳腫瘍組織から単離した。単離したゲノムＤＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、標準的分子生物学技術によって評価されたヒトＩＤＨ１および突然変異状態のイントロンおよび第２エクソン配列の両方を含むゲノムＤＮＡの２９５塩基対断片を増幅した。
代謝産物抽出物は、１０倍容量（質量／容量比）の−８０℃のメタノール：水の混合物（８０％：２０％）を脳組織（約１００ｍｇ）に添加し、４℃で３０秒間の均質化を行うことによって達成された。これらの冷却したメタノールで抽出された均質化組織を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、細胞および組織破片を沈降させ、浄化した組織上清をねじ蓋式冷凍バイアルに移し、−８０℃で保存した。分析のために、２倍容量のトリブチルアミン（１０ｍＭ）、酢酸（１０ｍＭ）、ｐＨ５．５を試料に添加し、次の通りＬＣＭＳによって分析した。Ｍｉｌｌｅｘ−ＦＧ０．２０ミクロンディスクを用いて試料抽出物を濾過し、１０μＬを逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｎｅｒｇｉ１５０ｍｍ×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）上に注入し、１０ｍＭのトリブチルアミンおよび１０ｍＭの酢酸による直線勾配ＬＣＭＳグレードメタノール（５０％）を用いて、８０％メタノール：１０ｍＭトリブチルアミン：１０ｍＭの酢酸に傾斜させながら、２００μＬ／分で、６分間にわたって溶出した。トリプル四重極質量分析計を用いて、溶出した代謝産物イオンを検出し、上記の２−ヒドロキシグルタル酸を含む８個の既知の中央代謝産物についての分子量および断片化パターンに従って、多重反応モニタリングモードトランジションセット（ＭＲＭ）による負モードで検出するように調整した。Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてデータをプロセスし、代謝産物のシグナル強度を、標準的ピーク積分法によって得た。

実施例９ ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈを阻害する化合物
７６ｕＬのアッセイ緩衝剤（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０３％のウシ血清アルブミン）の容量中で、標準的３８４ウェルプレート中で以下のように、アッセイを行った：２５ｕＬの基質混合（８ｕＭのＮＡＤＰＨ、２ｍＭのａＫＧ）に、ＤＭＳＯ中の１ｕＬの試験化合物を添加した。プレートを簡単に遠心分離し、次いで、２５ｕＬの酵素混合（０．２ｕｇ／ｍＬのＩＣＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ）を添加し、続いて、簡単な遠心分離し、１００ＲＰＭで振とうした。反応物を室温で５０分間インキュベートし、次いで、２５ｕＬの検出混合（３０ｕＭのレザズリン、３６ｕｇ／ｍＬ）を添加し、この混合物をさらに、室温で５分間インキュベートした。レソルフィンへのレザズリンの変換を、Ｅｘ５４４ Ｅｍ５９０ ｃ／ｏ ５９０で蛍光分光法によって検出した。
表２４ａは、ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ阻害剤の５つの例の野生型対変異体の選択性プロフィールを示す。ＮＡＤＰＨの１０倍または１００倍のＫｍでのＩＤＨＲ１３２Ｈとは対照的に、ＮＡＤＰＨの１倍のＫｍでのＩＤＨ１野生型アッセイを行った。第２の例は、１００ｕＭででさえ、阻害を示さなかった。また、第１の例は、ＩＣ５０＝５．７４ｕＭを有するが、直接ＮＡＤＰＨ競合阻害剤を示す、１００倍のＫｍで検定された場合、有意にシフトした。野生型対変異体の選択性は、２０倍を超える場合がある。
ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈを阻害するさらに例示的な化合物を、下表２４ｂに提供する。
実施例１０．突然変異酵素ＩＤＨ２−Ｒ１７２Ｋは、野生型ＩＤＨ２酵素と比較して、上昇したＮＡＤＰＨ還元触媒反応活性を有する。
酵素ＩＤＨ２−Ｒ１７２Ｋ、ＩＤＨ２野生型、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ、およびＩＤＨ１野生型に対するＮＡＤＰＨ還元活性が、測定された。それぞれの反応に対する最終反応物濃度は次の通りであった：２０ｍＭのＴｒｉｓ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｎＣｌ２、１０％のグリセロール、０．０３％のＢＳＡ、酵素（１〜１２０μｇ／ｍＬ）、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、および５ｍＭのａＫＧ（アルファケトグルタル酸）。得られた特異的活性（μｍｏｌ／分／ｍｇ）を図３５のグラフに提示する。結果は、変異体ＩＤＨ２が、野生型ＩＤＨ２と比較して、上昇した還元活性を有し、変異体および野生型ＩＤＨ２酵素が、反応物ａＫＧおよびＮＡＤＰＨの飽和レベルで、２ＨＧ（２−ヒドロキシグルタル酸）を作製可能であったことを示す。

実施例１１：２−Ｈは、ＩＤＨ１／２突然変異を有するＡＭＬにおいて蓄積する。
患者および臨床データ
末梢血および骨髄を、ＲＥＢに承認された告知に基づく同意に従って、診断時、および再発時に、ＡＭＬ患者から収集した。細胞をフィルコールハイパック遠心分離によって分離し、１０％のＤＭＳＯ、４０％のＦＣＳ、および５０％のアルファ−ＭＥＭ培地中に−１５０℃で保存した。患者血清を−８０℃で保存した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）の診断研究所において、細胞遺伝的および分子試験を行った。ダウノルビシンおよびシタラビンからなる標準誘導および地固め化学療法計画を用いて、患者のサブグループ（ｎ＝１３２）に一貫した初期治療を施した。
ＩＤＨ１およびＩＤＨ２遺伝子型
ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を用いて白血病細胞および細胞株から抽出した。試料のサブセット（ｎ＝９６）のために、ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを用いて白血病細胞から抽出し、ＩＤＨ１およびＩＤＨ２遺伝子型のｃＤＮＡに逆転写した。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）プラットフォーム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）で、ＩＤＨ１およびＩＤＨ２遺伝子型を決定した。陽性結果は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ＸＬ遺伝子分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）における直接配列決定によって確認された。
細胞株
ＡＭＬ細胞株（ＯＣＩ／ＡＭＬ−１、ＯＣＩ／ＡＭＬ−２、ＯＣＩ／ＡＭＬ−３、ＯＣＩ／ＡＭＬ−４、ＯＣＩ／ＡＭＬ−５、ＨＬ−６０、ＭＶ−４−１１、ＴＨＰ−１、Ｋ５６２、およびＫＧ１Ａ）および５６３７細胞は、Ｍａｒｋ Ｍｉｎｄｅｎの研究所（Ｏｎｔａｒｉｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。一次ＡＭＬ細胞を、前述のように、２０％のウシ胎児血清、および１０％の５６３７細胞条件付培地を補充したアルファ−ＭＥＭ培地中に培養した１３。成長曲線は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ自動細胞計数装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌａｒｔｏｎ，ＣＡ）におけるトリパンブルー排除によって評価されるように、生存細胞を計数することによって生成した。
ＩＤＨ１およびＩＤＨ２タンパク質の発現／精製
ヒトＩＤＨ１ ｃＤＮＡ（参照ＩＤ ＮＭ＿００５８９６）およびＩＤＨ２ ｃＤＮＡ（参照ＩＤ ＮＭ＿００２１６８）は、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。大腸菌の発現のために、コード領域は、５’末端および３’末端で、それぞれ、ＮＤＥＩおよびＸＨＯ１制限部位を加えるように設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって増幅された。ＩＤＨ１（全長）およびＩＤＨ２（残基４０〜４５２）に対して得られた断片を、Ｃ末端Ｈｉｓ８標識タンパク質の大腸菌の発現を可能にするベクターｐＥＴ４１ａ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローン化した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてｐＥＴ４１ａ−ＩＤＨ１およびｐＥＴ４１ａ−ＩＤＨ２プラスミドにおける部位特異的突然変異誘発を行い、Ｒ１３２Ｃ突然変異をもたらすＩＤＨ１ ｃＤＮＡ中のＣ３９４からＴへと変化させ、Ｒ１７２Ｋ突然変異をもたらすＩＤＨ２ ｃＤＮＡ中のＧ５１５からＡへと変化させた。野生型および変異体ＩＤＨ１タンパク質を、製造業者の指示に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に発現させ、精製した。ＩＤＨ２タンパク質の過剰発現は、それぞれのＩＤＨ２クローンおよびｐＧ−ＫＪＥ８を発現するシャペロンタンパク質をコードする発現プラスミドの共トランスフェクションによって達成された。
ＩＤＨ１／２活性アッセイ
酵素活性は、イソクエン酸およびＮＡＤＰ＋（順反応）、またはα−ＫＧおよびＮＡＤＰＨ（逆反応）の存在下で、ＳＦＭ−４００ストップフロー分光光度計（ＢｉｏＬｏｇｉｃ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）において、時間経過に伴う３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸光度の変化に従うことによって評価された。標準酵素反応緩衝剤（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．０３％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン）において、全ての反応を行った。動力学パラメータの判定のために、十分な酵素を添加し、１〜５秒間線形反応を得た。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアパッケージ（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、標準的な動力学モデルへの曲線適合アルゴリズムを用いて、酵素構造を決定した。ｋｃａｔの判定のために、酵素を、Ｋｍの５倍の基質および補因子でインキュベートし、時間経過に伴う、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰの消費をＯＤ３４０の変化によって判定した。いずれにしても、６２００Ｍ−１ ｃｍ−１の吸光係数をＮＡＤＰＨに対して用いた。２−ＨＧおよび代謝産物分析
代謝産物を、前述のように、８０％の水性メタノール（−８０℃）を用いて、培養細胞、一次白血病細胞、および血清から抽出した。細胞抽出のために、凍結生検を、３７℃で、急速解凍し、２００万個の細胞のアリコートを４℃で沈降させた。ペレットを、−８０℃の８０％メタノール中で再懸濁させた。血清抽出のために、１ｍＬの血清を急速解凍し、４ｍＬの−８０℃のメタノールと混合した。全ての抽出物は、１３０００ｒｐｍで、４℃で遠心分離し、沈殿物を除去し、室温で乾燥させ、ＬＣ−ＭＳで分析するまで−８０℃で保存した。代謝産物レベル（２−ＨＧ、α−ＫＧ、コハク酸塩、フマル酸塩、およびリンゴ酸塩）は、多重反応モニターを用いた、負モードエレクトロスプレイトリプル四重極ＭＳと連結させたイオン対逆相ＬＣによって決定し、積分溶出ピークを、記載されるように、絶対的定量に対する代謝産物標準的曲線と比較した。
統計的分析
フィッシャーの直接確率検定を用いて、ＩＤＨ１／２野生型患者とＩＤＨ１／２変異体患者との間のカテゴリ変数の差異を検定した。多重比較の修正を有する一元配置分散分析、続いて、スチューデントｔ検定を用いて、ＩＤＨ１活性および代謝産物濃度の差異を検定した。ｐ＜０．０５の差異は、有意であると考えられた。

結果
ＡＭＬにおけるＩＤＨ１ Ｒ１３２突然変異の役割を調査するために、生存細胞組織バンクにおいて、変異体試料を特定する目的で、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌで治療された一連の１４５人のＡＭＬ患者から最初の発現で得た白血病細胞は、遺伝子型決定された。ヘテロ接合ＩＤＨ１ Ｒ１３２突然変異は、これらの患者の１１（８％）に見出された（表２５）。ＡＭＬにおいて観察されたＩＤＨ１突然変異のスペクトルは、ＣＮＳ腫瘍において見られるものとは異なると見られる。ＣＮＳにおいて、突然変異の大部分（８０〜９０％）は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ置換である一方で、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、およびＲ１３２Ｇ突然変異を有する、５人、４人、および２人の患者が、それぞれ、観察された（表２５）。４つの例において、白血病細胞は、再発時に採取した試料からも入手可能であった。ＩＤＨ１突然変異は、これらの試料の４／４に保持された（表２５）。ＩＤＨ１突然変異を有する患者の１人は、初期の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からＡＭＬに進行していた。この患者における事前ＭＤＳからの細胞を分析した際、ＩＤＨ１は、野生型であることが見出された。ＭＤＳに罹患しているさらに１４人の患者を遺伝子型決定し、全ての患者が、ＩＤＨ１の野生型であることが見出され、これにより、ＩＤＨ１突然変異はこの疾患の共通特性ではないことを示唆する。ＩＤＨ１変異体患者のサブセット（ｎ＝８）からの試料において、変異体および野生型対立遺伝子の相対的発現を評価するために、逆転写したＲＮＡを用いて、遺伝子型決定した。Ｓｅｑｅｎｏｍ遺伝子型は、これらの試料に対してバランスのとれた対立遺伝子を示し、これにより、野生型および変異体遺伝子の両方が発現することを示す。また、１０個の確立されたＡＭＬ細胞株は、遺伝子型を決定されたが（ＯＣＩ／ＡＭＬ−１、ＯＣＩ／ＡＭＬ−２、ＯＣＩ／ＡＭＬ−３、ＯＣＩ／ＡＭＬ−４、ＯＣＩ／ＡＭＬ−５、ＨＬ−６０、ＭＶ−４−１１、ＴＨＰ−１、Ｋ５６２、およびＫＧ１Ａ）、いずれもＩＤＨ１ Ｒ１３２突然変異がなかった。

表２５：ＩＤＨ１ Ｒ１３２またはＩＤＨ２ Ｒ１７２の突然変異を担持する１３人のＡＭＬ患者の特定＊
＊ ＮＰＭ１は、ヌクレオフォスミン１、およびＦＬＴは、ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ３を意味する。ｎａは、いくつかのデータが一部の患者から得られなかったことを示す。
ＡＭＬ試料のセットにおける２−ＨＧを測定するための代謝産物スクリーニングアッセイを設定した。２−ＨＧのレベルは、ＩＤＨ１ Ｒ１３２突然変異を有する試料中で約５０倍高かった（表２５、図３６Ａ、表２６）。また、２−ＨＧは、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異体ＡＭＬを有する患者の血清を上昇した（図３６Ｂ）。この患者群において、ＩＤＨ１の残基１３２での特異的なアミノ酸置換と２−ＨＧのレベルとの間に関係はなかった。
ＩＤＨ１を有する２つの試料野生型はまた、高レベルの２−ＨＧを示した（表２５）。高い２−ＨＧ濃度は、これらの２つのＡＭＬ試料中のＩＤＨ２遺伝子の配列決定を促し、これは、両方の試料において、ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋ突然変異の存在を確立した（表２５）。
ＩＤＨ１／２突然変異を有するか、あるいは、有さない患者の臨床的特徴の評価は、ＩＤＨ１／２突然変異と正常な核型との間の有意な相関関係を示した（ｐ＝０．０５）が、これらの２つの群間の他の差異はなかった（表２７）。特に、一貫した治療を受けた患者のサブグループ（ｎ＝１３６）に対する治療応答の差異はなかった。これらの所見は、ＡＭＬにおけるＩＤＨ１突然変異を特定する初期報告と一致する。
野生型およびＩＤＨ１変異体患者からのＡＭＬ細胞のパネルは、体外で培養された。ＤＨ１ Ｒ１３２変異体および野生型細胞の成長率または生存能力の差異はなく、両群は、一次ＡＭＬ細胞の特徴であるように、培養において増殖する能力において、高い変動を示した（図３６Ｃ）。ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異細胞の２−ＨＧレベルと培養におけるそれらの成長率または生存能力との間の関係はなかった。培養から１４日後、変異体ＡＭＬ細胞は、それらのＩＤＨ１ Ｒ１３２突然変異（１１／１１）を保持し、高レベルの２−ＨＧを蓄積し続け（図３６Ａ）、さらに、ＩＤＨ１ Ｒ１３２突然変異が、ＡＭＬ細胞において、２−ＨＧの産生および蓄積をもたらすことを裏付けた。
ＩＤＨ反応の近位にある細胞代謝産物の濃度におけるＩＤＨ１／２突然変異の効果を調査するために、α−ＫＧ、コハク酸塩、リンゴ酸塩、およびフマル酸塩レベルが、ＩＤＨ１／２突然変異を有するＡＭＬ細胞ならびにＡＭＬサブタイプおよび細胞遺伝学的プロフィールに適合している一連の野生型ＡＭＬ細胞において測定された。ＩＤＨ１野生型細胞と比較して、ＩＤＨ１変異体の著しい変化は、いずれの代謝産物にも、見出されなかった（図２７、追加の表２６）。α−ＫＧの平均レベルは、ＩＤＨ１／２変異体ＡＭＬ細胞において変化せず、これは、既に仮定されているように、突然変異が、この代謝産物の濃度を低下させないことを示唆した。
ＩＤＨ１のＲ１３２Ｃ突然変異、およびＩＤＨ２のＲ１７２Ｋ突然変異が、２−ＨＧを産生する新規の酵素活性を与えることを確認するために、組み換え突然変異酵素が、α−ＫＧのＮＡＤＰＨ依存性還元について検定された。酵素アッセイが完了してから、試料が、ＬＣ−ＭＳによって分析された場合、２−ＨＧは、ＩＤＨ１ Ｒ１３２ＣおよびＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋ突然変異酵素の両方に対する最終産物として特定された（図３８）。ＬＣ−ＭＳによって、イソクエン酸が検出できず、これにより、２−ＨＧが、この反応の唯一の産物であることを示した（図３８）。この観察は、還元反応が、ＣＯ２で飽和されたＮａＨＣＯ３を含有する緩衝剤中で行われた場合でさえ、あてはまった。
ＡＭＬにおいて、ＩＤＨ１変異体患者の大部分は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ突然変異を有する（表２５）。変異体ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃを生物学的に特徴付けるために、組み換えＲ１３２Ｃタンパク質の酵素特性が対外で評価された。動力学分析は、補因子ＮＡＤＰ＋の親和性が、本質的に変化しないままであっても、Ｒ１３２Ｃ置換が、ｋｃａｔの有意な低下を有する、α−ＫＧへのイソクエン酸の酸化的脱炭酸化を著しく損なうことを示した（表２８）。しかしながら、既に記載されたＲ１３２Ｈ突然変異酵素とは異なって、Ｒ１３２Ｃ突然変異は、イソクエン酸の親和性（ＫＭ）の劇的な喪失、および正味のイソクエン酸の代謝効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）の６桁を超える減少をもたらす（表２８）。これは、ＡＭＬとの関連で酵素活性の基質レベルの調節の潜在的な差異を示唆する。Ｒ１３２でシステインの置換が、α−ＫＧへのイソクエン酸の正準転換を不活性化する一方、ＩＤＨ１
Ｒ１３２Ｃ突然変異酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性様式において、α−ＫＧから２−ＨＧへの還元を触媒する能力を必要とする（図３９）。変異体ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃのこの還元反応は、ＮＡＤＰＨおよびα−ＫＧ基質（ＫＭ）の両方の結合親和性の大幅な増加により、野生型酵素と比較して、高効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）である（表２８）。

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  1. 細胞増殖関連疾患のための方法および組成物など。
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