JP2014511409A - 金属プロテアーゼを含む洗剤組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、洗浄方法、例えば洗濯及び食器洗い方法におけるサーモリシン様金属プロテアーゼの使用に関し、特に低温洗浄及び卵染みの除去における使用に関する。本発明はまた、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗剤組成物及び洗浄組成物に関する。

Description

配列表への言及
本願は、コンピューター読み込み可能形態の配列表を含む。斯かるコンピューター読み込み可能形態は、参照により本明細書に組み込まれている。

本発明は、金属プロテアーゼ（Ｅ．Ｃ３．４．２４）を含む洗浄及び／又は洗剤組成物に関する。さらに、本発明は、洗浄方法、例えば食器洗い及び洗濯への金属プロテアーゼの使用に関する。さらに、本発明は、洗浄、例えば食器洗い及び洗濯を実施する方法にも関する。

洗剤業界は３０年以上も洗剤処方に種々の酵素を利用しており、最も通常に使用される酵素には、プロテアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼが含まれ、それらの個々は種々のタイプの染みを除去することに適している。酵素の他に、洗剤組成物は典型的には、成分の複雑な組合せを含む。例えば、ほとんどの洗浄製品は界面活性剤系、漂白剤又はビルダー（builder）を含む。現在の洗剤は複雑であるにもかかわらず、新規酵素及び／又は酵素ブレンドを含む新規洗剤組成物を開発する必要性が残っている。

金属プロテアーゼは、それらの活性のために金属イオンについての絶対的必要性を有するタンパク質分解酵素である。ほとんどの金属プロテアーゼは亜鉛依存性であるが、但しそれらのいくつかは他の遷移金属を使用している。金属プロテアーゼは種々の業界、例えば食品及び醸造業界に広く使用されて来た。最も良く特徴づけられている金属プロテアーゼのグループの１つは、サーモリシンである。サーモリシンは、Ｍ４ファミリーの金属プロテアーゼに属し、そして例えば、ペプチド合成方法に使用されて来た。そのような用途のためには、サーモリシンは高温で活性的である必要があり、そして焦点は高温でのそれらの性能を増大させることに向けられて来た。国際公開第２００４／０１１６１９号（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においては、変更された切断特異性を有するサーモリシン様プロテアーゼの熱安定性変異体が記載されている。例えば、サーモリシンとして知られているＭ４金属プロテアーゼは、欧州特許第０３１６７２５号に記載されるように、ペプチド配列決定のためのフラグメントを得るために非特異的プロテアーゼとして使用されて来た。それはまた、人工甘味料アスパルテームの製造方法を開示する国際公開第２０００／３７４８６号に記載されるようにペプチド合成酵素としても使用されて来た。別のＭ４金属プロテアーゼは、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）としても知られているバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）金属プロテアーゼであり、これは種々の食品及び飼料製品及び例えば、醸造において添加剤として長年使用されて来た。この金属プロテアーゼはまた、例えば国際公開第２００７／０４４９９３号に記載されるように、洗剤及び清浄組成物、及び方法への使用、国際公開第２００９／０５８５１８号に記載されるように、洗剤への貯蔵安定性金属プロテアーゼの使用についても記載されており、そして欧州特許第１２８８２８２号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、食器洗いへの使用のための金属プロテアーゼ及びセリンプロテアーゼのブレンドを記載している。国際公開第２０００／６００４２号はまた、金属プロテアーゼを含む洗剤組成物を記載している。しかしながら、洗剤業界における金属プロテアーゼの使用は非常に制限されており、そして焦点は、国際公開第２００７／０４４９９３号に示されるように金属プロテアーゼＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）及び／又は「ＮｐｒＥ」の使用に向けられて来た。一般的に、金属プロテアーゼは、従来の洗浄条件下では及び従来の洗剤組成物中では非常に不安定である。従って、洗浄及び清浄方法、並びに洗剤における金属プロテアーゼの使用は制限されて来た。

洗浄方法を環境にやさしくするためにそれらの方法を改善することへの焦点の高まりは、洗浄時間の減少、ｐＨ及び温度の低下、環境に悪影響を及ぼすかもしれない洗剤成分の量の減少という広範囲な動きをもたらして来た。本発明は、それら及び他の重要な目的に向けられる。

本発明は、洗浄方法、例えば洗濯及び食器洗いにおけるサーモリシン様金属プロテアーゼの使用、及び特に、低温洗浄及び卵の染みの除去における使用に関する。本発明はまた、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗剤組成物及び洗浄組成物にも関する。

特定の実施形態によれば、本発明は、洗浄方法におけるサーモリシン様金属プロテアーゼの使用に関する。

特定の実施形態によれば、サーモリシン様金属プロテアーゼと、洗浄の必要な表面とを接触させる工程を含んで成る洗浄方法に関する。

特定の実施形態によれば、本発明は、サーモリシン様金属プロテアーゼ及び界面活性物質を含む組成物に関する。

特定の実施形態によれば、本発明は、本発明の組成物と表面を接触させることを含む、表面由来の染みを除去する方法に関する。

図１は、Ｍ４ドメインのアラインメントを示す。

定義
用語「プロテアーゼ活性」又は「ペプチダーゼ活性」とは、ポリペプチド鎖内のアミノ酸を一緒に連結するペプチド結合の加水分解により、タンパク質のアミド結合を分解する能力として本明細書で定義される。

用語「金属プロテアーゼ」とは、本明細書において使用される場合、結合／活性部位に１又は２以上の金属イオンを有するプロテアーゼを言及する。

用語「Ｍ４金属プロテアーゼファミリー」又は「Ｍ４金属プロテアーゼ」又は「Ｍ４」とは、本明細書において使用される場合、Rawlings et al., Biochem. J. , 290, 205-218 （1993）、さらにMEROPS - （Rawlings et al. , MEROPS: the peptidase database, NucI Acids Res, 34 Database issue, D270-272, 2006）に記載されるように、Ｍ４金属プロテアーゼファミリー内にあるポリペプチドを意味する。Ｍ４金属プロテアーゼは、主にエンドペプチダーゼを含む中性金属プロテアーゼである。このファミリー内のすべてのペプチドは、単一の触媒性亜鉛イオンを結合する。Ｍ４金属プロテアーゼファミリーメンバーは、共通ＨＥＸＸＨモチーフを含み、ここでヒスチジン残基が亜鉛リガンドとして作用し、そしてグルタミン酸は活性部位残基である。Ｍ４金属プロテアーゼは、中性ｐＨで主にｐＨ最適性を有する。Ｍ４金属プロテアーゼファミリーは、次のものを含む：Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）（ＭＥＲＯＰＳサブクラス Ｍ０４．０１４として分類される）、サーモリシン、バッシロリシン（ｂａｃｉｌｌｏｌｙｓｉｎ）、ビブリオリシン（ｖｉｂｒｉｏｌｙｓｉｎ）、シュードリシン（ｐｓｅｕｄｏｌｙｓｉｎ）、Ｍｓｐ ペプチダーゼ、ココリシン（ｃｏｃｃｏｌｙｓｉｎ）、アウレオリシン（ａｕｒｅｏｌｙｓｉｎ）、ビメリシン（ｖｉｍｅｌｙｓｉｎ）、λトキシン中性ペプチダーゼＢ、ＰＡペプチダーゼ（アエロモナス型（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ−ｔｙｐｅ））、グリセリシン（ｇｒｉｓｅｌｙｓｉｎ）、ステアロリシン（ｓｔｅａｒｏｌｙｓｉｎ）、Ｍｐｒｌｌｌ（アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）株０−７）、ｐａｐ６ペプチダーゼ、中性ペプチダーゼ（サーモアクチノミセス型（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ−ｔｙｐｅ））、ＺｍｐＡペプチダーゼ（バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．））、ｚｐｘペプチダーゼ、ＰｒｔＳペプチダーゼ（フォトラブダス・ルミネスセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ））、プロテアリシン（ｐｒｏｔｅａｌｙｓｉｎ）、ＺｍｐＢペプチダーゼ（バークホルデリア ｓｐ．）。ポリペプチドのＭ４金属プロテアーゼはさらに特徴づけられており、そして現在、ＭＥＲＯＰＳによれば、異なったＭＥＲＯＰＳ ＩＤ（すなわち、式Ｍ０４．ｘｘｘの識別子）が割り当てられている少なくとも２２種のサブクラス、並びに非ペプチダーゼ相同体及び割り当てられていないペプチダーゼを包含する。

用語「単離ポリペプチド」とは、本明細書において使用される場合、由来から単離されるポリペプチドを言及する。一態様において、変異体又はポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、少なくとも２０％の純度、より好ましくは少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、さらにより好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度、及びさらに最も好ましくは少なくとも９５％の純度を有する。

用語「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然又は組み換えにより結合された他のポリペプチド材料の含有率が、重量で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、より一層好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、及びさらに最も好ましくは最大０.５％であるポリペプチド調製物を指す。従って、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中の総ポリペプチド材料に対して、重量基準で少なくとも９２％の純度、好ましくは少なくとも９４％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９６％の純度、より好ましくは少なくとも９７％の純度、より好ましくは少なくとも９８％の純度、さらにより好ましくは少なくとも９９％の純度、最も好ましくは少なくとも９９.５％の純度、及びさらに最も好ましくは１００％の純度を有することが好ましい。本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは例えば、周知の組み換え法や従来の精製法を用いて変異体又はポリペプチドを調製することにより達成される。

用語「成熟ポリペプチドコード配列」とは、プロテアーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメーター「配列同一性」により記載される。本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティーが１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティーが０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）

本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の度合いは、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上；http://emboss.org）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティーが１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティーが０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）

用語「フラグメント」とは、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端から欠失された１又は２以上（数個）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで前記フラグメントはプロテアーゼ活性を有する。

用語「ポリペプチドの機能フラグメント」又は「その機能フラグメント」とは、より長いポリペプチド、例えば成熟ポリペプチドに由来し、そして親ポリペプチドのフラグメントを生成するためにＮ末端領域又はＣ末端領域、又は両領域のいずれかで切断されているポリペプチドを記載するために使用される。機能的ポリペプチドであるためには、フラグメントは、十分な長さ／成熟のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも１００％を維持するべきである。サーモリシン様金属プロテアーゼ等のＭ４金属プロテアーゼは、２００個未満のアミノ酸が成熟Ｍ４金属プロテアーゼから除去されている、好ましくは１５０個未満のアミノ酸、より好ましくは１２０、１００、８０、６０、４０、３０個未満のアミノ酸、さらにより好ましくは２０個未満のアミノ酸、及び最も好ましくは１０個未満のアミノ酸が成熟ポリペプチドから除去されているポリペプチドであり得る機能フラグメントを生成するために、あるドメインが除去されるよう切断され得る。

用語「サブシーケンス」とは、成熟ポリペプチドコード配列の５'及び／又は３'末端から１又は２以上（数個）のヌクレオチドが欠失されたポリヌクレオチドを意味し、ここでサブシーケンスはプロテアーゼ活性を有するフラグメントをコードする。

用語「対立遺伝子変異体」とは、同一の染色体座を占有する一遺伝子の複数形態の夫々を指す。対立遺伝子変異は自然界において突然変異により生じ、そしてこれにより個体集団内に多型をもたらすことができる。遺伝子の突然変異は無変化であり（コードされるポリペプチドは変化しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体とは、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。

用語「変異体」とは、１又は２以上（数個）の位置における１又は２以上（数個）のアミノ酸残基の変更、すなわち置換、挿入及び／又は欠失を含む、金属プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、１つの位置を占有するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換を意味し；欠失とは、１つの位置を占有するアミノ酸の除去を意味し；そして挿入とは、１つの位置を占有するアミノ酸に隣接しての１〜３個のアミノ酸の付加を意味する。

用語「洗浄組成物」及び「洗浄調合物」とは、洗浄されるべき品目、例えば布地、カーペット、ガラス製品を含む食器、コンタクトレンズ、硬表面、例えばタイル、亜鉛製品、床及びテーブル表面、髪（シャンプー）、皮膚（石鹸及びクリーム）、歯（マウスウォッシュ、歯磨き）、等からの所望しない化合物の除去に使用される組成物を言及する。前記用語は、組成物がその組成物に使用される金属プロテアーゼ及び他の酵素に適合できる限り、所望する洗浄組成物の特定型及び生成物の型（例えば、液体、ゲル、顆粒又は噴霧組成物）のために選択されるいずれかの材料／化合物を包含する。洗浄組成物材料の特定の選択は、洗浄されるべき表面、品目又は布地、及び使用の間、洗浄条件のための組成物の所望する形態を考慮して容易に行われる。それらの用語はさらに、いずれかの目的物及び／又は表面を洗浄し、漂白し、そして／又は滅菌するために適切であるいずれかの組成物も言及する。前記用語は、洗剤組成物（例えば、液体及び／又は固形洗濯洗剤及び微細な布用調合物；硬表面、例えばガラス、木材、セラミック及び金属カウンター上部及び窓用洗浄製剤；カーペット用クリーナー；オーブン用クリーナー；布用フレッシュナー；布用柔軟剤；及び繊維及び洗濯用プレスポッター（pre-spotter）並びに食品用洗剤）を包含するが、但しそれらだけには限定されないことを意図する。

用語「洗剤組成物」とは、特にことわらない限り、粒状又は粉末形態の万能又は「強力」洗浄剤、特に洗浄洗剤；液体、ゲル又はペースト形態の万能洗浄剤、特に、いわゆる強力液体（ＨＤＬ）型の洗浄剤：液体の微細な微細布地用洗剤；手洗い食器洗剤又は軽質食器洗浄剤、特に高起泡型のもの；家庭及び企業での使用のための、種々の錠剤、粒状、液体及びリンス補助型を含む機械食器洗浄剤；抗菌ハンドウォッシュ型、洗浄バー、うがい薬、義歯クリーナー、車又はカーペット用シャンプー、浴室クリーナーを含む液体洗浄剤及び消毒剤；ヘアーシャンプー及びヘアーリンス；シャワージェル、泡バス；金属クリーナー；並びに洗浄補助剤、例えば漂白添加剤及び「染み用スティック（stain-stick）」又は前処理型を包含する。

用語「洗剤組成物」及び「洗剤調合物」は、汚れた物体の洗浄のための洗浄媒体への使用を意図される混合物に関連して使用される。ある実施形態においては、その用語は、布地及び／又は衣服の洗濯に関連して使用される（例えば、「洗濯用洗剤」）。他の実施形態においては、その用語は、他の洗剤、例えば食器、刃物、等を洗浄するために使用されるそれらの洗剤を言及する（例えば、「食器洗い用洗剤」）。本発明はいずれか特定の洗剤調合物又は組成物に限定されるものではない。本発明のサーモリシン様金属プロテアーゼの他に、その用語は、例えば界面活性剤、ビルダー、キレーター又はキレート化剤、漂白剤系又は漂白剤成分、ポリマー、布地用コンディショナー、泡増強剤、泡抑制剤、染料、香料、黄褐色阻害剤、蛍光増白剤、殺菌剤、殺真菌剤、汚れ沈殿防止剤、防錆剤、酵素阻害剤又は安定剤、酵素活性化剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、オキシドレダクターゼ、ブルーイング剤、蛍光染料、酸化防止剤及び可溶化剤を含む洗剤を包含することが意図される。

用語「布地」（ｆａｂｒｉｃ）とは、いずれかの生地材料を包含する。従って、この用語は、衣類、並びに布地、糸、繊維、不織布材料、天然材料、合成材料及びいずれか他の織物材料を包含することが意図される。

用語「生地」（ｔｅｘｔｉｌｅ）とは、織物、並びに糸、織編物及び不織布への転換又はそれらとしての使用のために適切なステープル繊維及びフィラメントを言及する。この用語は、天然、及び合成（例えば、製造された）繊維から製造された糸を包含する。用語「生地材料」（ｔｅｘｔｉｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）とは、繊維、糸中間物、糸、布地、及び布地から製造される製品（例えば、衣服及び他の物品）のための一般的用語である。

用語「非布地洗剤組成物」は、非生地用表面洗剤組成物、例えば食器用洗剤組成物、経口洗剤組成物、義歯用洗剤組成物及びパーソナルクレンジング組成物を包含するが、それらに限定されない。

用語「有効量の酵素」とは、特定の用途、例えば定義される洗剤組成物に必要とされる酵素活性を達成するのに必要な量の酵素を言及する。そのような有効量は、当業者により容易に確認され、そして多くの要因、例えば使用される特定の酵素、洗浄適用、洗剤組成物の特定の組成、及び液体又は乾燥（例えば、粒状、バー）組成物が必要であるかどうか等に基づく。用語、金属プロテアーゼの「有効量」とは、例えば定義される洗剤組成物において所望レベルの酵素活性を達成する、前述の金属プロテアーゼの量を言及する。

用語、酵素の「洗浄性能」とは、組成物への酵素の添加を有さない洗剤に追加の洗浄性能を提供する洗浄への酵素の寄与を言及する。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。酵素の洗浄性能は便利には、適切な試験条件下で一定の代表的な染みを除去するそれらの能力により測定される。それらの試験システムにおいては、他の関連する要因、例えば洗剤組成物、洗剤濃度、水の硬度、洗濯方法、時間、ｐＨ及び／又は温度は、特定の市場セグメントにおける家庭適用のための典型的な条件が模倣されるような手段で調節され得る。

用語「水の硬度」又は「硬度」又は「ｄＨ」又は「°ｄＨ」とは、本明細書において使用される場合、Ｇｅｒｍａｎ硬度を言及する。１度は水１Ｌ当たり１０ｍｇの酸化カルシウムとして定義される。

用語「関連する洗浄条件」とは、洗剤市場セグメントにおける家庭で実際使用される条件、例えば洗浄温度、時間、洗濯力学、洗剤濃度、洗剤の型及び水硬度を示すために、本明細書において使用される。

用語「改善された性質」とは、酵素なしで行われる同じ方法と比較して、良好な最終結果が性質的に得られることを示すために使用される。好ましくは、本発明の方法において改善される典型的な性質は、洗濯性能、酵素安定性、酵素活性及び基質特異性を包含する。

用語「改善された洗浄性能」とは、酵素なしか又は対照酵素と比較して、関連する洗浄条件下で洗浄される物品（例えば、布地又は食器、及び／又は刃物）からの染みの除去において、良好な最終結果が得られるか、又は酵素なしか又は対照酵素と比較して同じ最終結果を得るために、必要な酵素が重量でより少ないことを示すために使用される。改善された洗浄性能は、同じ効果、例えば染みの除去効果がより短い洗浄時間で得られ、例えば酵素が試験される条件下でよりすばやくそれらの効果を提供することが考えられ得る。

用語「保持洗浄性能」とは、酵素の洗浄性能が重量基準に基づいて、関連する洗浄条件下で別の酵素と比較して少なくとも８０％であることを示すために使用される。

用語「酵素洗浄力」又は「洗浄力」又は「洗浄力効果」とは、酵素を有さない同じ洗剤と比較して、酵素が洗剤に添加される有益な効果として、本明細書で定義される。酵素により提供され得る重要な洗浄力有益性は、洗濯及び／又は洗浄の後、まったく見えないか又はほとんど見えない汚れを伴う染みの除去、洗濯方法において放される汚れの再付着の防止又は低減（再付着防止とも呼ばれる効果）、最初は白色であるが、しかし反復使用及び洗浄の後、灰色がかった又は黄色がかった外観を得た生地の白色性の完全な又は一部復元（白色化とも呼ばれる効果）である。触媒性染み除去、又は汚れの再付着の防止には直接的に関係しない生地保護有益性もまた、酵素洗浄力有益性のために重要である。そのような生地保護有益性の例は、１つの布地から他の布地又は同じ布地の別の部分への染みの移行の予防又は低減（染み移行阻害又は抗−バック染色とも呼ばれる）、ピリング傾向の減少又はすでに存在する毛玉又は毛羽立ちを除去するために、突出する又は壊れた繊維の布地表面からの除去（抗−ピリングとも呼ばれる）、布地の柔軟性の改善、布地の色の明確化、及び布地又は衣服の繊維の中に閉じ込められる粒状汚れの除去である。酵素漂白とは、触媒活性が一般的に、漂白成分、例えば過酸化水素又は他の過酸化物の形成を触媒するために使用される、さらなる酵素洗浄力有益性である。

用語「抗−再付着」（ａｎｔｉ−ｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）とは、本明細書において使用される場合、洗浄される目的物上の洗浄液に溶解されるか又は懸濁される汚れの再付着の低減又は防止を記載する。再付着は、１又は複数回の洗浄サイクルの後に見られ得る（例えば、灰色がかった、黄色がかった又は他の変色として）。

用語「補助材料」とは、特定型の所望する洗剤組成物及び製品形態（例えば、液体、粒状物、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル又はフォーム組成物）のために選択される、いずれかの液体、固体又は気体材料を意味し、前記材料はまた、好ましくは金属プロテアーゼに適合し得る。ある実施形態によれば、粒状組成物は「コンパクト」形態で存在するが、他の実施形態によれば、液体組成物は「濃縮」形態で存在する。

用語「染み除去酵素」とは、本明細書において使用される場合、布地又は硬表面からの染み又は汚れの除去を助ける酵素を記載する。染み除去酵素は、特定基質に対して作用し、例えばプロテアーゼはタンパク質に対して、アミラーゼは澱粉に対して、リパーゼ及びクチナーゼは脂質（脂肪及び油）に対し、ペクチナーゼはペクチンに対して、そしてヘミセルラーゼはヘミセルロースに対して作用する。染みはしばしば、それ自体による材料の局部変色をもたらすか、又は洗浄液に溶解される汚れを引き付けることができる、目的物上を粘性表面にする（それにより、染色された部分の変色をもたらす）、異なった成分の複雑な混合物の付着である。酵素が染みに存在するその特異的基質に対して作用する場合、酵素はその基質を分解するか、又は部分的に分解し、それにより、洗浄工程の間、基質に結合される汚れ及び染み成分の除去を助ける。例えば、プロテアーゼが草の染みに対して作用する場合、それは草におけるタンパク質成分を分解し、そして洗浄の間、緑色／褐色を放出し得る。

用語「減少量」とは、成分の量が、同じ条件下で対照方法に使用される量よりも少ないことを、本明細書において意味する。好ましい実施形態によれば、その量は例えば、少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又は他に本明細書に記載されるように減少される。

用語「低洗剤濃度」系は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を包含する。アジア、例えば日本の洗剤は典型的には、低洗剤濃度系と思われる。

用語「中洗剤濃度」系は、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を包含する。北アメリカ洗剤は一般的に、中洗剤濃度系であると思われる。

用語「高洗剤濃度」系は、約２０００ｐｐｍ以上の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を包含する。ヨーロッパの洗剤は一般的に、高洗剤濃度系であると思われる。

サーモリシン様金属プロテアーゼ（ＴＬＰ）
本発明は一般的に、Ｍ４金属プロテアーゼファミリーの単離ポリペプチドの使用に関する。よって、一実施形態において本発明は、Ｍ４金属プロテアーゼファミリーのサブクラスであって、本明細書中で「サーモリシン様金属プロテアーゼ」又は「ＴＬＰ」と呼ぶ単離ポリペプチドの使用に関する。

特に、本発明者はＭ４金属プロテアーゼファミリーに分類される約500もの公的に利用できる配列を検討し、サーモリシン様金属プロテアーゼであるそのサブセットを特定し、そして驚いたことにそれらが洗浄組成物及び洗浄方法、例えば食器及び洗濯等に有効であることを確認した。当業者は、MEROPS分類系、特にMEROPSのサブクラスの割当が、主に配列同一性に基づいているが、酵素活性及び関連文献に基づく他の特性等の他の要因もまた含むことが分かるであろう。

サーモリシン様金属プロテアーゼは、例えばBarret et al.（1998）Handbook of proteolytic enzymes. Academic Press, pp. 350-369に記載される。一部のTLPのアミノ酸配列は決定されており、一部のTLPの３次元構造が分かっている。TLPの熱安定性の増加にこれまで注目がされ、多くの論文、例えば、Veltman et al., （1998）Biochemistry 37（15）:5312-9においてバチルスTLPの熱安定性が記載される。TLPは、主にβストランドから成るαヘリックスのC末端ドメイン及びN末端ドメインから成る。ドメインは、中央のαヘリックスで結合される。斯かるヘリックスは、活性部位クレフトの下部に位置し、複数の酵素活性上重要な残基を含み、例えば４つの基質結合ポケット、S₂、S₁、S₁'及びS₂'が特定されている（Hangauer et al. （1984）Biochemistry 23:5730-5741）。

サーモリシン様金属プロテアーゼは熱安定性であるとして知られており、そしてこの理由のために、サーモリシン様金属プロテアーゼが本発明の洗剤洗浄組成物及び方法、例えば低温洗浄及び卵染みの除去において活性的であることは驚くべきことである。

特定の実施形態によれば、本発明の有用なサーモリシン様金属プロテアーゼは、次のものを包含する：
（ａ）ＭＥＲＯＰＳサブクラスＭ０４．００１のＭ４金属プロテアーゼ；
（ｂ）ＭＥＲＯＰＳサブクラスＭ０４．０１８のＭ４金属プロテアーゼ；
（ｃ）ＭＥＲＯＰＳサブクラスＭ０４．０２１のＭ４金属プロテアーゼ；
（ｄ）活性クレフトモチーフ：ＴＧ［ＴＳ］［ＱＳ］ＤＮＧＧＶＨ［ＴＩ］を有するＭ４金属プロテアーゼ；
（ｅ）活性クレフトモチーフ：ＤＰＤＨＹＳＫＲＹＴＧ［ＴＳ］［ＱＳ］ＤＮＧＧＶＨ［ＴＩ］ＮＳＧＩを有するＭ４金属プロテアーゼ；及び
（ｆ）活性クレフトモチーフ：ＮＴ［ＴＳ］［ＱＳ］ＤＮＧＧＶＨ［ＴＩ］ＮＳＧＩを有するＭ４金属プロテアーゼ。

上記モチーフにおいては、許容されるＩＵＰＡＣ一文字アミノ酸略語が使用される。また上記モチーフにおいては、括弧の使用は、特定位置での代替的アミノ酸の選択肢を示す。

本発明は、下記に示される典型的な単離サーモリシン様金属プロテアーゼを用いて示されてきた。それらのサーモリシン様金属プロテアーゼのいくつかは、十分に表されたタンパク質として、又はゲノム配列決定プロジェクトに起因するオープンリーディングフレームとしての配列データベースにより、公的に入手できる（表１を参照）。

表１は、本発明を示すために使用されており、そして本発明の使用にすべて適用され得るサーモリシン様金属プロテアーゼのリストである。

当業者は、一部の実施形態において成熟タンパク質は、例えば適切なプロペプチド及び／又はシグナルペプチド配列を含む長い配列の一部とすることができると理解することができるであろう。

表１の代表的なサーモリシン様金属プロテアーゼ間の配列同一性は以下の通りである。同一性は、ギャップを除くアラインメントのトータルの長さで割った正確な一致数に相当し、定義に示されるようにして計算される。

本発明の好ましい実施形態によれば、表２に示されるサーモリシン様金属プロテアーゼのサブセットが、本発明のすべての使用に適用され得る。

前述のように、本発明者により同定された活性クレフトモチーフは、他のＭ４金属プロテアーゼを包含する他の金属プロテアーゼと、本発明のサーモリシン様金属プロテアーゼとを区別するさらなるアミノ酸配列情報を提供する。

図１は、Ｍ４金属プロテアーゼＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）のＭ４ドメイン（図１の（Ａ）列）と比較して、本発明の典型的なサーモリシン様金属プロテアーゼのＭ４ドメイン（図１の（Ｂ）−（Ｆ）列）のアラインメントを提供する。アラインメンと情報から、本発明者は、本発明のサーモリシン様金属プロテアーゼを識別する活性クレフトモチーフを推定した。活性クレフトモチーフＴＧ［ＴＳ］［ＱＳ］ＤＮＧＧＶＨ［ＴＩ］は、Ｂｍ１、Ｂｃｅ１及びＢｃｅ２の位置２２３−２３７及びＧｓ１及びＢｃａ１の位置２２５−２３９で見られ得る。活性クレフトモチーフＤＰＤＨＹＳＫＲＹＴＧ[ＴＳ][ＱＳ]ＤＮＧＧＶＨ[ＴＩ]ＮＳＧＩは、Ｂｍ１、Ｂｃｅ１及びＢｃｅ２の位置１１４−２３７及びＧｓ１及びＢｃａ１の位置１１６−２３９で見られ得る。対照的にＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）は、それらの活性クレフトモチーフを有さない。

特定の実施形態によれば、本発明の有用な、典型的サーモリシン様金属プロテアーゼは、次のＭＥＲＯＰＳデータベース受託番号を有するペプチダーゼを包含する：

本発明の好ましい実施形態において、本発明の使用に適用されるサーモリシン様金属プロテアーゼは、成熟ポリペプチド又はその機能フラグメントである。より好ましくは、表１〜２の成熟サーモリシン様金属プロテアーゼの少なくとも１つ又はその機能フラグメントは、本発明の使用に適用される。より好ましくは、上記のMEROPSサブクラスの少なくとも１つ及び／又は活性クレフトモチーフ（a）-（d）又はその機能フラグメントを含むポリペプチドは、本発明の使用に適用される。

表１のサーモリシン様金属プロテアーゼの使用の他に、本発明は、配列番号１、２、３、４、又は５或いはその機能フラグメントのいずれか１つの成熟ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％。又はまさに１００％の配列同一性を有するポリペプチド（まだ、サーモリシン様金属プロテアーゼとして分類され得る（以降、「相同ポリペプチド」と称する））の使用を包含する。好ましい態様において、相同ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、又は５のいずれか１つに対して、１０個のアミノ酸、好ましくは５個のアミノ酸、より好ましくは４個のアミノ酸、さらにより好ましくは３個のアミノ酸、最も好ましくは２個のアミノ酸、及びさらに最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドは好ましくは、配列番号１、２、３、４又は５のアミノ酸配列、又はその対立遺伝子変異体；又はその機能フラグメントを含むか又はそれらから成る。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４又は５の成熟ポリペプチドを含むか又はそれらから成る。

前述の配列の実質的に相同のポリペプチドは、成熟ポリペプチドに、１又は２以上（数個）のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するものとして特徴づけられる。好ましくは、アミノ酸変更は、タンパク質の折りたたみ及び/又は活性に実質的に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換又は挿入；典型的には１〜約９個のアミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９個のアミノ酸；好ましくは１〜約１５個のアミノ酸、例えば１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸；及び最も好ましくは１〜約３０個のアミノ酸、例えば１６、１７、１８、９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端延長、例えばアミノ末端メチオニン残基の延長；約５〜１０個までの残基、好ましくは１０〜１５個の残基及び最も好ましくは２０〜２５個の残基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷又は他の機能、例えばポリヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、プロテインＡ、炭水化物結合モジュール又は別の結合ドメインを変えることにより精製を促進する小さな延長であるマイナーな性質のものである。

保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、特定の活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである：Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｙｒ/Ｐｈｅ、Ａｌａ/ Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/Ｖａｌ、Ａｌａ/Ｇｌｕ及びＡｓｐ/Ｇｌｙ。

２０個の標準アミノ酸の他に、非標準アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）が、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸は、アミノ酸残基により置換され得る。「非天然のアミノ酸」は、タンパク質合成の後、修飾され、そして／又は標準アミノ酸の化学構造とは異なる化学構造を、それらの側鎖に有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成でき、そして好ましくは、商業的に入手でき、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３，３−ジメチルプロリンンを含む。

或いは、アミノ酸変化は、ポリペプチドの生理化学的性質が変更されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改良し、基質特異性を変更し、pH最適性を変える等である。

親ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子が、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、洗浄力）について試験される。また、Hilton等の J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996も参照されたい。酵素の立体構造、例えばα−ヘリックス、β−シート、及び金属結合部位又は他の生物学的相互作用はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推定され得る。

単一又は多重のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を形成・検証するには、公知の突然変異誘発法、組み換え、及び／又はシャッフリングを用いた後、適切なスクリーニング法、例えば Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号等に開示の手法を用いることができる。他の使用可能な方法としては、error-prone ＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）（例えば Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／０６２０４号等）及び領域特異的突然変異誘発法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145；Ner et al., 1988, DNA 7:127）等が挙げられる。

突然変異誘発法／シャッフリング法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることにより、宿主細胞により発現されるクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出することが可能となる（Ness et ai, 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。当業界の標準法により、活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、即時に配列決定することができる。これらの手法により、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となり、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。

ポリペプチドは、１つのポリペプチドの一部が別のポリペプチドの一部のＮ−末端又はＣ−末端で融合されているハイブリッドポリペプチドとすることができる。

ポリペプチドは、別のポリペプチドが発明のポリペプチドのN−末端又はC−末端で融合されている、融合されたポリペプチド又は切断できる融合ポリペプチドであり得る。融合されたポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドにもう１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードするコード配列を、それらが整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう連結することを包含する。融合タンパク質はまた、融合が翻訳後に創造されるインテイン技法を用いて構成され得る（Cooper など., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson など. , 1994, Science 266: 776-779）。

さらに、融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位を含むことができる。融合タンパク質の分泌に基づいて、前記部位が切断され、２つのポリペプチドが開放される。切断部位の例は、Martin など. , 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3 : 568-576; Svetina など. , 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson など., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63 : 3488-3493; Ward など., 1995, Biotechnology 13 : 498-503; Contreras など., 1991, Biotechnology 9 : 378-381; Eaton など. , 1986, Biochemistry 25 : 505-512; Collins-Racie など., 1995, Biotechnology 13 : 982-987; Carter など., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; 及び Stevens, 2003, Drug Discovery World 4 : 35-48に開示される部位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

サーモリシン様金属プロテアーゼの源
本発明において有用なサーモリシン様金属プロテアーゼは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明の目的のためには、用語「〜から得られる」とは、所定の源に関して本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、天然に存在する源により、又はその源からのヌクレオチド配列が挿入されている株により生成されることを意味する。好ましい態様において、所定の源から得られるポリペプチドは細胞外に分泌される。

本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば金属プロテアーゼ活性を有する、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコーカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコーカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコーカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコーカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えばカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌi）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（ｌｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）又はウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）ポリペプチドであり得る。

一態様において、ポリペプチドは、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリペプチドである。別の態様において、ポリペプチドは、ゲオバチルス・カルドリチカス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチドである。

別の態様において、ポリペプチドは、ストレプトコーカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコーカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコーカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、又はストレプトコーカス・エクイ亜種ゼオエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ. Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）のポリペプチドである。別の態様において、ポリペプチドは、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）又はストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）のポリペプチドである。

本発明のポリペプチドはまた、菌類ポリペプチドとすることもでき、そしてより好ましくは、酵母ポリペプチド、例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチド；又はより好ましくは、糸状菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、カエトミジウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリプトコーカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポリス（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカノマスチックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポロニア（Ｐｏｒｏｎｉａ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、又はベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、のポリペプチドである。

好ましい態様において、ポリペプチドは、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）のポリペプチドである。

別の好ましい態様において、ポリペプチドは、アスペルギラス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギラス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギラス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギラス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギラス・ホエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギラス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギラス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギラス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギラス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、カエトミウム・グロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、ジプロジア・ゴシピナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｇｏｓｓｙｐｐｉｎａ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓａｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、マグナポルタ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプラソ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・キソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ポロニア・パンクタタ（Ｐｏｒｏｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、シュウードプレクタニア・ニグレラ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ ｎｉｇｒｅｌｌａ）、サーモアスカス・アウランチアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコダーマ・ハルジアナル（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコダーマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコダーマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコダーマ・サカタ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓａｃｃａｔａ）、又はベルチシリウム・テネラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｎｅｒｕｍ）のポリペプチドである。

好ましい態様において、ポリペプチドは、バチルス・カルドリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、又はゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のポリペプチドである。

前述の種に関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解するであろう。

それらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Collection （ATCC）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （DSM）、Centraalbureau Voor Schimmelcaltures （CBS）及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center （NRRL）。

さらに、そのようなポリペプチドは、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、堆肥、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて、同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く知られている。次に、ポリヌクレオチドは、そのような微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって得られる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがプローブにより検出されると、そのポリヌクレオチドは当業者に知られている技法を用いることによって単離され、又はクローン化され得る（例えば、Sambrook,et al, 1989,上記を参照のこと）。

本発明のポリペプチドはまた、融合されたポリペプチド又は切断できる融合ポリペプチドを包含し、ここで別のポリペプチドがポリペプチド又はそのフラグメントのＮ末端又はＣ末端で融合される。融合されたポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその一部）を、本発明のヌクレオチド配列（又はその一部）に融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、周知であり、そしてポリペプチドをコードするコード配列の連結を包含し、その結果、それらは読み取り枠内で整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現は同じプロモーター及びターミネーターの制御下にある。

組成物
本発明はまた、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む組成物にも関する。好ましくは、組成物はサーモリシン様金属プロテアーゼにおいて富化される。用語「富化され」とは、組成物のプロテアーゼ活性が、例えば少なくとも１．１の富化因子により増強されたことを示す。

一実施形態によれば、本発明は、組成物、特にサーモリシン様金属プロテアーゼ及び適切な担体及び／又は賦形剤を含む洗浄組成物及び／又は洗剤組成物に関する。

一実施形態によれば、洗剤組成物は、特定の使用、例えば洗濯、特に家庭用洗濯、食器洗い又は硬表面洗浄のために適合され得る。

本発明の洗剤組成物は、汚れた布地の前処理のために適切な洗濯添加剤組成物及びすすぎに添加される布地用ソフトナー組成物を含む手動又は機械洗濯洗剤組成物として配合され得るか、又は一般的な家庭用硬表面洗浄操作への使用のための洗剤組成物として配合され得るか、又は手動又は機械食器洗い操作のために配合され得る。本発明の洗剤組成物は、硬表面洗浄、自動食器洗い用途、並びに化粧品用途、例えば入れ歯、歯、髪及び肌に使用され得る。

好ましい実施形態によれば、洗剤組成物は、１又は２以上の従来の担体及び／又は賦形剤、例えば下記に例示されるそれらのものを含む。

本発明の洗剤組成物は、いずれかの従来の形態、例えば棒状形態、錠剤形態、粉末型、顆粒形態、ペースト形態又は液体形態で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、７０％までの水及び０−３０％の有機溶媒を含むか、又は非水性であり得る。

特にことわらない限り、本明細書において提供されるすべての成分又は組成レベルは、その成分又は組成の活性レベルを基準に作られ、そして市販の入手源に存在し得る不純物、例えば残留溶媒又は副産物を含まない。

サーモリシン様金属プロテアーゼは、０．０００００１％〜２％（重量基準）の酵素タンパク質／組成物のレベルで、好ましくは０．００００１％〜１％の酵素タンパク質／組成物、より好ましくは０．０００１％〜０．７５％の酵素タンパク質／組成物、さらにより好ましくは０．００１％〜０．５％の酵素タンパク質／組成物のレベルで洗剤組成物に通常組込まれる。

さらに、サーモリシン様金属プロテアーゼは、洗剤水中のそれらの濃度が０．００００００１％〜１％（重量基準）の酵素タンパク質／洗浄水のレベルで、好ましくは０．０００００５％〜０．０１％の酵素タンパク質／洗浄水、より好ましくは０．０００００１％〜０．００５％の酵素タンパク質／洗浄水、さらにより好ましくは０．００００１％〜０．００１％の酵素タンパク質／洗浄水のレベルで存在するような量で洗剤組成物に通常組込まれる。

良く知られているように、酵素の量はまた、特定の用途に従って、及び／又は組成物に含まれる他の成分の結果として変化するであろう。

自動食器洗い機（ＡＤＷ）に使用するための組成物は例えば、組成物の重量に対して０．００１％〜５０％、例えば０．０１％〜２５％、例えば０．０２％〜２０％、例えば０．１％〜１５％の酵素タンパク質を含むことができる。

洗濯粒状物に使用するための組成物は例えば、０．０００１％〜５０％（重量基準）、例えば０．００１％〜２０％、例えば０．０１％〜１５％、例えば０．０５％〜１０％の酵素タンパク質を含むことができる。

洗濯液に使用するための組成物は例えば、０．０００１％〜１０％（重量基準）、例えば０．００１％〜７％、例えば０．１％〜５％の酵素タンパク質を含むことができる。

ある好ましい実施形態によれば、本明細書において提供される洗剤組成物は、水性洗浄操作への使用の間、洗浄水は、約５．０〜約１１．５のｐＨ、又は他の実施形態によれば、さらに約６．０〜約１０．５、例えば約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９又は約７〜約８のｐＨを有するよう、典型的には配合される。ある好ましい実施形態によれば、粒状又は液体洗濯製品は、洗浄水が約５．５〜約８のｐＨを有するよう配合される。推薦される使用レベルでｐＨを調節するための技法は、緩衝液、アルカリ、酸、等の使用を包含し、そして十分に周知である。

酵素成分の重量は、全活性タンパク質に基づかれる。すべての百分率及び比率は、特にことわらない限り、重量により計算される。すべての百分率及び比率は、特にことわらない限り、全組成物に基づかれる。例示される洗剤組成物においては、酵素レベルは、全組成物中の重量による純粋酵素により表され、そして特にことわらない限り、全組成物中の重量により表される。

本発明の酵素はまた、洗剤添加剤製品にも使用される。サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗剤添加剤製品は、例えば温度が低いか、ｐＨが６〜８であるか、そして洗浄時間が短いか、例えば３０分以下である場合、洗浄方法に含まれるよう理想的には適合される。

洗剤添加剤製品は、サーモリシン様金属プロテアーゼ及び好ましくは、追加の酵素であり得る。一実施形態によれば、添加剤は、洗浄方法における添加のために投与形にパッケージされる。単一投与形態は、ピル形態、錠剤形態、ジェルキャップ形態、又は他の単一投与ユニット形態、例えば粉末及び／又は液体形態を包含する。ある実施形態によれば、賦形剤及び／又は担体材料が含まれ、それらの適切な賦形剤又は担体材料は、種々の硫酸塩、炭酸塩及び珪素塩、並びにタルク、クレー及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ある実施形態によれば、液体組成物のための賦形剤及び／又は担体は、水及び／又は低分子量一級及び二級アルコール、例えばポリオール及びジオールを含む。そのようなアルコールの例は、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールを包含するが、但しそれらだけには限定されない。

特に好ましい一実施形態によれば、本発明の金属プロテアーゼは、粒状組成物又は液体に使用され、金属プロテアーゼはカプセル封入された粒子の形態で存在することができる。一実施形態によれば、カプセル封入する材料は、炭水化物、天然又は合成ガム、キチン及びキトサン、セルロース及びセルロース誘導体、シリケート、ホスフェート、ボレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス及びそれらの組合せから成る群から選択される。

本発明の組成物は典型的には、１又は２以上の洗剤成分を含む。用語、洗剤組成物は、製品及び洗浄及び処理組成物を包含する。用語、洗浄組成物は、特にことわらない限り、錠剤、顆粒状又は粉末形態の万能又は「強力」（Ｈｅａｖｙ ｄｕｔｙ）洗浄剤、特に洗濯用洗剤；液体、ゲル又はペースト形態の万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体型；液体微細布地用洗剤；手洗い用食器洗い洗剤又は簡易（ｌｉｇｈｔ ｄｕｔｙ）食器洗い洗剤、特に泡立ち型のもの；家庭用及び業務用機械食器洗い洗剤、例えば種々の錠剤状、液状及びすすぎ補助型を包含する。組成物はまた、単位毎の個別包装としても良い。例としては、当業界に周知のもの、及び水溶性、水不溶性及び／又は透水性のものが挙げられる。

洗浄及び／又は洗剤成分が本発明の金属プロテアーゼに適合できない実施形態においては、適切な方法は、洗浄及び／又は洗剤成分及び金属プロテアーゼを、それらの２つの成分の組合せが適切に成るまで、分離して（すなわち、お互い接触しないで）、使用され得る。そのような分離法は、当業界において周知のいずれかの適切な方法（例えば、ジェルキャップ、カプセル封入、錠剤、物理的分離）を包含する。

言及されるように、本発明の金属プロテアーゼが洗剤組成物（例えば、洗濯用洗浄洗剤組成物、又は食器洗い用洗剤組成物）の成分として使用される場合、例えば、それは、非ダスト化顆粒、安定化された液体又は保護された酵素の形態で、洗剤組成物に含まれる。非粉化顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示の方法によって調製することができる。周知の方法により被覆してもよい。ワックス被覆材料の例としては、平均モル重量１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコール部分が１２〜２０の炭素原子を含み、１５〜８０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドが挙げられる。流動床法による適用に適した膜形成被覆材料の例は、英国特許出願第１４８３５９１号に記載のとおりである。

ある実施形態によれば、本明細書で使用される酵素は、最終的に調製された組成物中において、水溶性の亜鉛（II）、カルシウム（II）及び／又はマグネシウム（II）イオン源の存在により安定化される。これにより、前述のイオンや、その他の他の金属イオン（例えばバリウム（II）、スカンジウム（II）、鉄（II）、マンガン（II）、アルミニウム（III）、錫（II）、コバルト（II）、銅（II）、ニッケル（II）、及びオキソバナジウム（IV）等）が酵素に提供される。ある実施形態によれば、本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸を用いても安定化され得、そして組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載のようにして配合され得る。本発明の酵素はまた、例えばタンパク質型（欧州特許出願第０５４４７７７Ｂ１号に記載のような）又はボロン酸型の可逆性酵素阻害剤を添加することにより安定化され得る。他の酵素安定剤、例えばペプチドアルデヒド及びタンパク質加水分解物は、当業界において周知であり、例えば本発明の金属プロテアーゼは、国際公開第２００５／１０５８２６号及び国際公開第２００９／１１８３７５号に記載のように、ペプチドアルデヒド又はケトンを用いて安定化され得る。

本発明の洗剤組成物への包含のための保護された酵素は欧州特許出願第２３８２１６号に開示される方法に従って、上記のようにして調製され得る。

組成物は、バイオフィルムの形成を阻止するか又は除去するための１又は２以上の剤により増強され得る。それらの剤は、分散剤、界面活性剤、洗剤、他の酵素、抗菌剤及び殺生物剤を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

他の酵素
一実施形態によれば、サーモリシン様金属プロテアーゼは、１又は２以上の酵素、例えば少なくとも２種の酵素、より好ましくは少なくとも３、４又は５種の酵素と組合される。好ましくは、酵素は異なった基質特異性、例えばタンパク質分解活性、澱粉分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロース分解活性又はペクチン分解活性を有する。

洗剤添加物及び洗剤組成物は、１又は２以上の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペプチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び／又はペルオキシダーゼを含むことができる。一般的に、選択される酵素の性質は、選択される洗剤に適合できるべきであり（すなわち、ｐＨ−最適性、他の酵素及び非酵素成分との適合性、等）、酵素は有効量で存在すべきである。

セルラーゼ：適切なセルラーゼは、動物、植物又は微生物由来のものを包含する。特に適切なセルラーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。適切なセルラーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属由来のセルラーゼ、例えばヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフィソラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来の真菌セルラーゼ（米国特許第４，４３５，３０７号、米国特許第５，６４８，２６３号、米国特許第５，６９１，１７８号、米国特許第５，７７６，７５７号及び国際公開第８９／０９２５９号に開示）が挙げられる。

特に適切なセルラーゼは、色彩上の利点を有するアルカリ性又は中性のセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例としては、欧州特許出願第０ ４９５ ２５７号、欧州特許出願第０ ５３１ ３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、国際公開第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼが挙げられる。他のセルラーゼ変異体の例としては、例えば国際公開第９４／０７９９８号、欧州特許出願第０ ５３１ ３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、米国特許第５，６８６，５９３号、米国特許第５，７６３，２５４号、国際公開第９５／２４４７１号、国際公開第９８／１２３０７号及び国際出願第１９９９/００１５４４号に記載のものが挙げられる。

市販のセルラーゼとしては、セルザイム（Celluzyme）（登録商標）及びケアザイム（Carezyme）（登録商標）（Novozymes A/S）、クラジナーゼ（Clazinase）（登録商標）及びピュラダックスHA（Puradax HA）（登録商標）（Genencor International Inc.）、並びにKAC-500（B）（登録商標）（Kao Corporation）が挙げられる。

ペプチダーゼ及びプロテアーゼ：適切なペプチダーゼ及びプロテアーゼは、動物、植物又は微生物由来のものを包含する。微生物由来のものが好ましい。化学的に修飾された変異体又はタンパク質工学により操作された変異体も含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシン、特にバチルス由来のそれらのもの、例えばサブチリシンNovo、サブチリシン Carlsberg、サブチリシン 309、サブチリシン147及びサブチリシン168である（国際公開第８９／０６２７９号に記載される）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来のもの）、及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ（国際公開第８９／０６２７０号及び第９４／２５５８３号に記載される）である。
有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載の変異体、特に位置２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５及び２７４のうち１又は２以上の位置に置換を有する変異体が挙げられる。

好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、プリマーゼ（Primase）（登録商標）、ドゥララーゼ（Duralase）（登録商標）、エスペラーゼ（Esperase）（登録商標）、カンナーゼ（Kannase）、オボザイム（Ovozyme）（登録商標）、ポラルザイム（Polarzyme）（登録商標）、エバルラーゼ（Everlase）（登録商標）、コロナーゼ（Coronase）（登録商標）及びレラーゼ（Relase）（登録商標）（Novozymes A/S）、マキサターゼ（Maxatase）（登録商標）、マキサカル（Maxacal）（登録商標）、マキサペム（Maxapem）（登録商標）、プロペラーゼ（Properase）（登録商標）、プラフェクト（Purafect）（登録商標）、プラフェクトOxP（Purafect OxP）（登録商標）、FN2（登録商標）、FN3（登録商標）及びFN4（登録商標）（Genencor International、Inc.）が挙げられる。

リパーゼ：適切なリパーゼは、動物、植物又は微生物由来のものを包含する。特に、適切なリパーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Humicola）（別名テルモミセス（Thermomyces））由来のリパーゼ、例えばＨ．ラヌギノザ（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノザ（T. lanuginosus））由来のもの（欧州特許出願第２５８ ０６８号及び欧州特許出願第３０５ ２１６号に記載）、又はＨ．イソレンス（H. insolens）由来のもの（国際公開第９６／１３５８０号に記載）、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）又はＰ．フュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）（欧州特許出願第２１８ ２７２号）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）（欧州特許出願第３３１ ３７６号）、Ｐ．スツツゼリ（P. stutzeri）（英国特許出願第１，３７２，０３４号）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）、シュードモナス株（Pseudomonas sp. strain）SD705（国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensis）（国際公開第 号 ９６/１２０１２）、バチラス（Bacillus）リパーゼ、例えばＢ．サブチリス（B. subtilis）由来のもの（Dartois et al. 1993）, Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、Ｂ．ステアロテルモフィラス（B. stearothermophilus）（特開昭６４−７４４９９２）又はＢ．プミラス（B. pumilus）由来のもの（国際公開第９１／１６４２２号）が挙げられる。

他の例としては、例えば国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、欧州特許出願第４０７ ２２５号、欧州特許出願第２６０ １０５号、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号及び国際公開第９７／０７２０２号に記載のリパーゼ変異体が挙げられる。

好ましい市販のリパーゼ酵素としては、リポラーゼ（Lipolase）（登録商標）、リポラーゼウルトラ（Lipolase Ultra）（登録商標）、及びリペックス（Lipex）（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。

アミラーゼ：適切なアミラーゼは、動物、植物又は微生物由来のものを包含する。特に、適切なアミラーゼ（α及び／又はβ）としては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、バチラス（Bacillus）から得られるα−アミラーゼ、例えばＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）の特別株由来のものが挙げられる。詳細は英国特許出願第１,２９６,８３９号に記載されている。

有用なアミラーゼの例としては、国際公開第９４／０２５９７号、国際公開第９４／１８３１４号、国際公開第９６／２３８７３号、及び国際公開第９７／４３４２４号に記載の変異体、特に位置１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４のうち１又は２以上の位置に置換を有する変異体が挙げられる。

市販のアミラーゼとしては、ドゥラミル（Duramyl）（登録商標）、テルマミル（Termamyl）（登録商標）、フンガミル（Fungamyl）（登録商標）及びBAN（登録商標）（Novozymes A/S）、ラピダーゼ（Rapidase）（登録商標）及びピュラスター（Purastar）（登録商標）（Genencor International Inc.）が挙げられる。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体や、タンパク質工学により操作された変異体も含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Coprinus）由来、例えばＣ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びその変異体（国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記載）が挙げられる。

市販のペルオキシダーゼとしては、ガードザイム（Guardzyme）（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。

洗剤酵素を洗剤組成物に含めるには、１又は２以上の酵素を含む個別の添加剤を加えてもよく、これら全ての酵素を含む組み合わせ添加剤を加えてもよい。本発明の洗剤添加剤、即ち個別の添加剤又は組み合わせ添加剤は、例えば顆粒、液体、スラリー等として調製することができる。好ましい洗剤添加剤調合物は、顆粒、特に上記のような非ダスト化顆粒、液体、特に安定化した液体、又はスラリーである。

界面活性剤
典型的には、洗剤組成物は、１又は２以上の界面活性剤を、０％〜５０％、好ましくは２％〜４０％、より好ましくは５％〜３５％、より好ましくは７％〜３０％、最も好ましくは１０％〜２５％、さらに最も好ましくは１５％〜２０％（組成物中の重量基準に基づく）の範囲で含む。好ましい実施形態によれば、洗剤は、４０％未満、好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、さらにより好ましくは２０％未満（重量基準に基づく）の界面活性剤を含む液体又は粉末洗剤である。組成物は、１％〜１５％、好ましくは２％〜１２％、３％〜１０％、最も好ましくは４％〜８％、さらに最も好ましくは４％〜６％の１又は２以上の界面活性剤を含むことができる。好ましい界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及びそれらの混合物である。好ましくは、界面活性剤の主要部分はアニオン性である。適切なアニオン界面活性剤は、当業界において周知であり、そして脂肪酸カルボキシレート（石鹸）、枝分れ鎖、直鎖及びランダム鎖のアルキルスルフェート又は脂肪アルコールスルフェート又は第一アルコールスルフェート又はアルキルベンゼンスルホネート、例えばＬＡＳ及びＬＡＢ又はフェニルアルカンスルホネート又はアルケニルスルホネート、又はアルケニルベンゼンスルホネート又はアルキルエトキシスルフェート又は脂肪アルコールエーテルスルフェート、又はα−オレフィンスルホネート、又はドデセニル／テトラデセニル琥珀酸を含むことができる。アニオン性界面活性剤はアルコキシル化され得る。洗剤組成物はまた、１ｗｔ％〜１０ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜８ｗｔ％、より好ましくは３ｗｔ％〜７ｗｔ％、さらにより好ましくは５ｗｔ％未満の非イオン界面活性剤を含むことができる。適切な非イオン性界面活性剤は、当業界において周知であり、そしてアルコールエトキシレート、及び／又はアルキルエトキシレート、及び／又はアルキルフェノールエトキシレート、及び／又はグルカミド、例えば脂肪酸Ｎ−グルコシルＮ−メチルアミド、及び／又はアルキルポリグルコシド、及び／又はモノ−又はジエタノールアミド又は脂肪酸アミドを含むことができる。洗剤組成物はまた、０ｗｔ％〜１０重量％、好ましくは０．１ｗｔ％〜８ｗｔ％、より好ましくは０．５ｗｔ〜７ｗｔ％、さらにより好ましくは５ｗｔ％未満のカチオン性界面活性剤を含むことができる。適切なカチオン性界面活性剤は、当業界において周知であり、そしてアルキル四級アンモニウム化合物、及び／又はアルキルピリジニウム化合物、及び／又はアルキル四級ホスホニウム化合物、及び／又はアルキル第三スルホニウム化合物を含むことができる。組成物は好ましくは、洗濯工程の間、洗浄液に１００ｐｐｍ〜５，０００ｐｐｍの量の界面活性剤を含む。水との接触に基づいて組成物は典型的には、０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの洗剤組成物を含む洗浄液を形成する。多くの適切な界面活性化合物が入手でき、そして文献、例えば"Surface- Active Agents and Detergents", Volumes I and II, by Schwartz, Perry and Berchに十分に記載されている。

ビルダー
ビルダーの主要役割は、界面活性剤系と負の相互作用をする洗浄液が、二価の金属イオン（例えば、カルシウム及びマグネシウムイオン）を隔離することである。ビルダーはまた、布地表面から金属イオン及び無機汚れの除去で効果的であり、微粒子状及び飲料の汚れの改善された除去を導く。ビルダーはまた、アルカリ性の源であり、そして洗浄水のｐＨを９．５〜１１のレベルに緩衝する。緩衝能力はまた、予備アルカリ度と呼ばれ、そして好ましくは、４以上でなければならない。本発明の洗剤組成物は、１又は２以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含むことができる。多くの適切なビルダー系は、文献、例えPowdered Detergents, Surfactant science series, volume 71, Marcel Dekker, Inc.に記載されている。ビルダーは、０％〜６０％、好ましくは５％〜４５％、より好ましくは１０％〜４０％、最も好ましくは１５％〜３５％、さらにより好ましくは２０％〜３０％（重量基準による）の量で、対象組成物に含まれる。組成物は、０％〜１５％、好ましくは１％〜１２％、２％〜１０％、最も好ましくは３％〜８％、さらに最も好ましくは４％〜６％（重量基準による）のビルダーを含むことができる。

ビルダーは、ポリホスフェート（例えば、トリポリホスフェートＳＴＰＰ）のアルカリ金属、アンモニウム及びアルカノールアンモニア塩、アルカリ金属の珪酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノ珪酸塩ビルダー（例えば、ゼオライト）及びポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、エチレン又はビニルメチルエーテル、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸及びカルボキシメチルオキシ琥珀酸との無水マレイン酸のコポリマー、ポリ酢酸、例えばエチレンジアミン四酢酸及びニトロトリ酢酸、並びにポリカルボキシレート、例えばメリト酸、琥珀酸、クエン酸、オキシジ琥珀酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシ琥珀酸の種々のアルカリ金属、アンモニウム及び置換されたアンモニウム塩、及びそれらの可溶性塩を包含するが、但しそれらだけには限定されない。エタノールアミン（ＭＥＡ、ＤＥＡ及びＴＥＡ）もまた、液体洗剤において緩衝能力に寄与することができる。

漂白剤
本発明の洗剤組成物は、１又は２以上の漂白剤を含むことができる。特に、粉末洗剤は、１又は２以上の漂白剤を含むことができる。適切な漂白剤は、光漂白剤、予備形成された過酸、過酸化水素源、漂白活性化剤、過酸化水素、漂白触媒、及びそれらの混合物を包含する。一般的に、漂白剤が使用される場合、本発明の組成物は、約０．１％〜約５０％又はさらに、約０．１％〜約２５％（対象洗浄組成物の重量基準による）の漂白剤を含むことができる。適切な漂白剤の例は、次のものを含む：

（１）他の光漂白剤、例えばビタミンＫ３；

（２）予備形成された過酸：予備形成された適切な過酸としては、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、過イミド酸及び塩、ペルオキシモノ硫酸及び塩、例えばオキソン、及びそれらの混合物から成る群から選択される化合物を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。適切な過カルボン酸としては、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｏ−Ｍ（式中、Ｒは、過酸が疎水性である場合、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子を有し、そして過酸が親水性である場合、６個未満の炭素原子又はさらに４個未満の炭素原子を有する、任意に枝分れされたアルキル基であり；そしてＭはカウンターイオン、例えばナトリウム、カリウム又は水素である）を有する疎水性及び親水性過酸を挙げることができ；

（３）過酸化水素源、例えば無機過水和物塩、例えばアルカリ金属塩、例えば過ホウ酸ナトリウム塩（通常、一又は四水和物）、過炭酸ナトリウム塩、過硫酸ナトリウム塩、過リン酸ナトリウム塩、過珪酸ナトリウム塩、及びそれらの混合物。本発明の一態様において、無機過水和物塩は、ナトリウム過ボウ素酸塩、ナトリウム過炭酸塩及びそれらの混合物から成る群から選択される。使用される場合、無機過水和物塩は典型的には、全組成物中に、０．０５〜４０ｗｔ％又は１〜３０ｗｔ％の量で存在し、そして典型的には、被覆され得る結晶性固形物として、そのような組成物中に導入される。適切な被膜は、無機塩、例えばアルカリ金属の珪酸塩、炭酸塩又は硼酸塩又はそれらの混合物、又は有機材料、例えば水溶性又は分散性ポリマー、ワックス、油又は脂肪石鹸を包含する。有用な漂白組成物は、アメリカ特許第５，５７６，２８６号及びアメリカ特許第第６，３０６，８１２号に記載される；

（４）式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ（式中、Ｒは、漂白活性化剤が疎水性である場合、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子を有し、そして漂白活性化剤が親水性である場合、６個未満の炭素原子又はさらに４個未満の炭素原子を有する、任意に枝分れされたアルキル基であり；そしてＬは脱離基である）を有する漂白活性化剤。適切な脱離基の例としては、安息香酸及びその誘導体、特にベンゼンスルホン酸を挙げることができる。適切な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸又はその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）及びノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）を挙げることができる。適切な漂白活性化剤はまた、国際公開第９８／１７７６７号にも開示されている。いずれの適切な漂白活性化剤でも使用され得るが、本発明の一態様において、対象の洗浄組成物は、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤ又はそれらの混合物を含むことができる；及び

（５）ペルオキシ酸から酸素原子を受容でき、そしてその酸素原子を酸化できる基質に移行できる漂白触媒は、国際公開第２００８／００７３１９号に記載されている。適切な漂白触媒として、イミニウムカチオン及びポリイオン；イミニウム両性イオン；変性アミン；変性アミンオキシド；Ｎ−スルホニルイミン；Ｎ−ホスホニルイミン；Ｎ−アシルイミン；チアジアゾールジオキソド；ペルフルオロイミン；環状糖ケトン及びそれらの混合物を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。漂白触媒は典型的には、０．０００５％〜０．２％、０．００１％〜０．１％又はさらに０．００５％〜０．０５％（重量基準による）のレベルで、洗剤組成物に含まれるであろう。

存在する場合、過酸及び／又は漂白活性化剤は一般的に、組成物に基づいて、約０．１〜約６０ｗｔ％、約０．５〜約４０ｗｔ％又はさらに約０．６〜約１０ｗｔ％の量で組成物に存在する。１又は２以上の疎水性過酸又はその前駆体は、１又は２以上の親水性過酸又はその前駆体と組合して使用され得る。

過酸化水素源及び過酸又は漂白活性化剤の量は、利用できる酸素（過酸化物源からの）：過酸のモル比が１：１〜３５：１又はさらに２：１〜１０：１になるよう選択され得る。

補助材料
分散剤：本発明の洗剤組成物はまた、分散剤も含むことができる。特に、粉末洗剤は分散剤を含む。適切な水溶性有機材料は、ホモ−又はコポリマー酸又はそれらの塩を包含し、ここでポリカルボン酸が２個以下の炭素原子によりお互い分離される少なくとも２つのカルボキシル基を含む。適切な分散剤は例えば、Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.に記載される。

色素トランスファー阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、１又は２以上の色素トランスファー阻害剤を含む。適切なポリマー性色素トランスファー阻害剤として、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。対象組成物に存在する場合、色素トランスファー阻害剤は、組成物中に、約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％又はさらに約０．１％〜約３％（重量基準による）のレベルで存在することができる。

蛍光増白剤：本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは洗浄される製品に色を付けることができる追加の成分、例えば蛍光増白剤又は光学性光沢剤を含む。洗濯用洗剤組成物における使用のための適切ないずれかの蛍光増白剤が、本発明の組成物に使用され得る。最も通常使用される蛍光増白剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体及びビスフェニル−ジスチリル誘導体の種類に属するそれらである。蛍光増白剤のジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体型の例としては、下記のナトリウム塩を挙げることができる：
４，４′−ビス−（２−ジエタノールアミン−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２、２′−ジスルホネート；
４，４′−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２、２′−ジスルホネート；
４，４′−ビスー（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２′−ジスルホネート；
４，４′−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２、２’−ジスルホネート；
４，４′−ビス−（２−アミノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホネート；及び
２−（スチルビル−４′′−ナフト−１，２′：４，５）−１，２，３−トリゾール−２′′−スルホネート。
好ましい蛍光増白剤は、Ciba-Geigy AG, Basel, Switzerlandから入手できるチノパール（Ｔｉｎｏｐａｌ）ＤＭＳ及びチノパールＣＢＳである。チノパールＤＭＳは、４，４′−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。チノパールＣＢＳは、２，２′−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。

好ましい蛍光増白剤は、Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Indiaにより供給される市販のパラホワイトＫＸ（Ｐａｒａｗｈｉｔｅ KX）である。本発明への使用のために適切な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリン及び７−アルキルアミノクマリンを挙げることができる。適切な蛍光増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１又はさらに約０．２ｗｔ％の低レベル〜０．５又はさらに０．７５ｗｔ％の高レベルを包含する。

布地色調剤（ｆａｂｒｉｃ ｈｕｅｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）：本発明の洗剤組成物はまた、布地色調剤、例えば洗剤組成物に配合される場合、布地が前記洗剤組成物と接触される場合、その布地上に付着し、可視光の吸収により前記布地の色調を変更する染料又は顔料を含むことができる。蛍光増白剤は少なくともいくらかの可視光を放す。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの一部を少なくとも吸収するので、表面の色調を変える。適切な布地色調剤は、染料及び染料−クレー接合体を含み、そしてまた、顔料も含むことができる。適切な染料は小分子染料及びポリマー性染料を包含する。適切な小分子染料は、例えば国際公報第２００５／０３２７４号、国際公報第２００５／０３２７５号、国際公報第２００５／０３２７６号及び欧州特許第1 876 226号に記載のように、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレット、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット及びベーシックレッド、又はそれらの混合のカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類内にある染料からなる群から選択される小分子染料を含む。洗剤組成物は好ましくは、約０．００００３ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％、約０．００００８ｗｔ％〜約０．００５ｗｔ％、又はさらに、約０．０００１ｗｔ％〜０．０４ｗｔ％の布地色調剤を含む。組成物は、０．０００１ｗｔ％〜０．２ｗｔ％の布地色調剤を含むことができ、組成物が単位用量ポーチの形態で存在する場合、これは特に好ましい。

汚れ放出ポリマー
本発明の洗剤組成物はまた、布地、例えば綿及びポリエステル基材の布地からの汚れの除去、特にポリエステル基材の布地からの疎水性汚れの除去を助ける１又は２以上の汚れ放出ポリマーを含むことができる。汚れ放出ポリマーとしては、非イオン性又はアニオン性テレフタレート基材のポリマー、ポリビニルカプロラクタム及び関連コポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドを挙げることができ；例えば、Chapter 7 in Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.を参照されたい。別のタイプの汚れ放出ポリマーは、コア構造体及びそのコア構造体に結合される多くのアルコキシレート基を含む両親媒性アルコシル化グリース洗浄ポリマーである。コア構造体は、国際公開第２００９／０８７５２３号に詳細に記載されるように、ポリアルキレンイミン構造体又はポリアルカノールアミン構造体を含むことができる。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、適切な汚れ放出ポリマーである。適切なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号、国際公開第２００６／１０８８５６号、及び国際公開第２００６／１１３３１４号に、より詳細に記載される。他の汚れ放出ポリマーは、置換された多糖構造体、特に置換されたセルロース構造体、例えば変性セルロース誘導体、例えば欧州特許出願第１８６７８０８号又は国際公開第２００３／０４０２７９号に記載されるそれらである。適切なセルロースポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド及びそれらの混合物を挙げることができる。適切なセルロースポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、非イオン変性セルロース、カチオン性変性セルロース、両性イオン性変性セルロース、及びそれらの混合物を挙げることができる。適切なセルロースポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース及びそれらの混合物を挙げることができる。

再付着防止剤
本発明の洗剤組成物はまた、１又は２以上の抗再付着防止剤、例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレン及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸及びマレイン酸のコポリマー、及びエトキシル化されたポリエチレンイミンを含むことができる。上記汚れ放出ポリマー下に記載されるセルロースベースのポリマーもまた、再付着防止剤として機能することができる。

他の適切な補助材料としては、次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない：抗収縮剤、抗しわ剤、殺菌剤、結合剤、担体、染料、酵素安定剤、布地ソフトナー、賦形剤賦形剤、発泡調節剤、ヒドロトロープ剤、香料、顔料、泡立ち抑制剤、溶媒、液体洗剤のための構造体（structurant）及び／又は構造伸縮性付与剤。

一態様において、洗剤は、ａ）組成物の重量に基づいて、少なくとも約１０％、好ましくは２０〜８０％の、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、石鹸、及びそれらの混合物から選択される界面活性剤；ｂ）組成物の重量にもとづいて、約１〜約３０％、好ましくは５〜３０％の水；ｃ）組成物の重量に基づいて、約１％〜約１５％、好ましくは３〜１０％の非アミノ官能性溶媒；及びｄ）組成物重量に基づいて、約５％〜約２０％の、キレート剤、汚れ放出ポリマー、酵素及びそれらの混合物から選択される性能添加剤を含むコンパクト液体洗濯洗剤組成物であり；ここでコンパクト液体洗濯洗剤組成物は、次の少なくとも１つを含む：（ｉ）界面活性剤は約１．５：１〜約５：１の重量比のアニオン性界面活性剤：非イオン性界面活性剤を有し、界面活性剤は、組成物の重量に基づいて、約１５％〜約４０％のアニオン性界面活性剤及び約５％〜約４０％の石鹸を含み；（ｉｉ）組成物の重量に基づいて、約０．１％〜約１０％の、泡立ち促進ポリマー、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、アミンオキシド界面活性剤、両性界面活性剤、及びそれらの混合物：及び（ｉ）及び（ｉｉ）の両者から選択される泡立ち増強剤。すべての成分は、国際公開第２００７／１３０５６２号に記載されている。洗剤調合物において有用なさらなるポリマーは、国際公開第２００７／１４９８０６号に記載されている。

別の態様において、洗剤は、次のものを含むコンパクト粒状（粉末）洗剤である：（ａ）組成物の重量に基づいて、少なくとも１０％、好ましくは１５〜６０％の、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、石鹸及びそれらの混合物から選択される界面活性剤；ｂ）組成物の重量に基づいて、約１０〜８０％、好ましくは２０％〜６０％のビルダー、ここで前記ビルダーは、次のものから選択されるビルダーの混合物であり得：ｉ）合計ビルダーに基づいて、２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらにより好ましくは５％未満のリン酸塩ビルダー；ｉｉ）合計ビルダーの重量に基づいて、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらにより好ましくは５％未満のゼオライトビルダー；ｉｉｉ）合計ビルダーの重量に基づいて、好ましくは０〜５％のクエン酸塩ビルダー；ｉｖ）合計ビルダーの重量に基づいて、好ましくは０〜５％のポリカルボン酸塩ビルダー；ｖ）合計ビルダーの重量に基づいて、好ましくは０〜３０％の炭酸塩ビルダー；及びｖｉ）合計ビルダーの重量に基づいて、好ましくは０〜２０％の珪酸ナトリウムビルダー；ｃ）組成物の重量に基づいて、約０％〜２５％、好ましくは１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％、より好ましくは３％〜５％の賦形剤、例えば硫酸塩；及びｄ）組成物の重量に基づいて、約０．１％〜２０％、好ましくは１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％の酵素。

洗剤へのサーモリシン様金属プロテアーゼの使用
洗剤調合物のために重要である汚れ及び染みは、多くの異なった物質から構成され、そして広範囲の異なった酵素、すなわち異なった基質特異性を有するすべての酵素が洗濯及び硬表面洗浄、例えば食器洗いに関連して洗剤への使用のために開発されて来た。それらの酵素は、酵素なしでの同じ洗浄方法と比較して、それらが適用される洗浄方法において染みの除去を特異的に改善するので、酵素洗浄力有益性を提供すると思われる。当業界において知られている染み除去酵素としては、カルボヒドラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ及びペクチナーゼのような酵素を挙げることができる。

一態様において、本発明は、洗剤組成物及び洗浄方法、例えば洗濯及び硬表面洗浄へのサーモリシン様金属プロテアーゼの使用に関する。従って、一態様において、本発明は、種々の染みに対する及び種々の条件下で種々の典型的なサーモリシン様金属プロテアーゼの洗浄力効果を示す。本発明の特定の態様において、洗剤組成物及び洗浄方法における使用は、少なくとも１つの上記に言及される染み除去酵素、例えば別のプロテアーゼ及び特にセリンプロテアーゼと共にサーモリシン様金属プロテアーゼの使用に関する。

本発明の好ましい態様において、本発明に従っての有用なサーモリシン様金属プロテアーゼは、少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、４又は５種の酵素と共に組合され得る。それらの追加の酵素は、セクション「他の酵素」に詳細に記載されている。好ましくは、酵素は、異なった基質特異性、例えば炭水化物分解活性（ｃａｒｂｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、タンパク質分解活性、澱粉分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロール分解活性又はペクチン分解活性を有する。例えば、酵素の組合せは、次のような別の染み除去を酵素とサーモリシン様金属プロテアーゼとの組合せであり得る：サーモリシン様金属プロテアーゼ及びプロテアーゼ、サーモリシン様金属プロテアーゼ及びアミラーゼ、サーモリシン様金属プロテアーゼ及びセルラーゼ、サーモリシン様金属プロテアーゼ及びヘミセルラーゼ、サーモリシン様金属プロテアーゼ及びリパーゼ、サーモリシン様金属プロテアーゼ及びクチナーゼ、サーモリシン様金属プロテアーゼ及びペクチナーゼ又はサーモリシン様金属プロテアーゼ及び抗付着防止酵素。より好ましくは、次のように、サーモリシン様金属プロテアーゼは少なくとも２種の他の染み除去酵素と組合される：サーモリシン様金属プロテアーゼ、リパーゼ及びアミラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ及びペクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ及びセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ及びヘミセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ及びクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ及びペクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ及びクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ及びヘミセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、リパーゼ及びペクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、リパーゼ及びクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、リパーゼ及びセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、リパーゼ及びヘミセルラーゼ。さらにより好ましくは、サーモリシン様金属プロテアーゼは、次のように少なくとも３種の他の染み除去酵素と組合され得る：サーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及びアミラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ及びペクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ及びクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ及びヘミセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及びペクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及びクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及びセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及びヘミセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及びペクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及びクチナーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及びセルラーゼ;又はサーモリシン様金属プロテアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及びヘミセルラーゼ。本発明に従っての有用なサーモリシン様金属プロテアーゼは、カルボヒドラーゼ、例えばアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、キサンタナーゼ又はプルラナーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ又はリパーゼを包含する非包括的リストから選択されるいずれかの酵素と組合され得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、サーモリシン様金属プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、例えばＳ８ファミリーのプロテアーゼ、例えばサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）と組合される。

本発明の別の実施形態によれば、本発明の有効なサーモリシン様金属プロテアーゼは、１又は２以上の金属プロテアーゼ、例えば、Neutrase（登録商標）又はサーモリシンを含む他のＭ４金属プロテアーゼと組合せることができる。そのような組合わせはさらに、上記に概略されるような他の洗剤酵素の組合せを含むことができる。

洗浄方法又は生地ケアー方法は例えば、洗濯方法、食器洗い方法又は硬表面、例えば浴室のタイル、床、テーブルトップ、排水溝、シンク及び洗面台の洗浄であり得る。洗濯方法は例えば、家庭用洗浄であり得るが、しかしそれはまた、工業用洗浄でもあり得る。さらに、本発明は、洗剤組成物及び少なくとも１つのサーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗浄溶液により布地を処理することを含む、布地及び／又は衣服の洗浄方法に関する。洗浄方法又は生地ケアー方法は例えば、機械洗浄方法又は手洗い洗浄方法で行われ得る。洗浄溶液は例えば、洗浄組成物を含む洗浄水溶液であり得る。

本発明の洗濯、洗浄又は生地ケアー方法にゆだねられる布地及び／又は衣服は、従来の洗浄できる洗濯物、例えば家庭用洗濯物であり得る。好ましくは、洗濯物の主要部分は、衣服及び布地、例えばニット、不織布、デニム、不織布、フェルト、糸及びタオル地である。布地は、セルロース基材のもの、例えば天然セルロース、例えば綿、亜麻、リネン、ジュート、ラミー、サイザル又はコイア、又は合成セルロース（例えば、木材パルプ由来の）、例えばビスコース／レーヨン、ラミー、酢酸セルロース繊維（ｔｒｉｃｅｌｌ）、リヨセル、又はそれらのブレンドであり得る。布地はまた、非セルロース基材のもの、例えば天然ポリアミド、例えばウール、キャメル、カシミア、モヘア、ウサギの毛及び絹、又は合成ポリマー、例えばナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレン及びスパンデックス／エラスタン、又はそれらのブレンド、並びにセルロース基材の繊維及び非セルロース基材の繊維のブレンドでもあり得る。ブレンドの例としては、綿及び／又はレーヨン／ビスコースと、１又は２以上の他の材料、例えばウール、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻、リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リヨセル）を挙げることができる。

石油化学由来の洗剤中の成分を、再生可能な生物学的成分、例えば酵素及びポリペプチドにより、洗浄性能を損なわないで置換することに、ここ数年、関心が高まって来た。洗剤組成物中の成分が変化する場合、新規酵素活性、又は通常使用される洗剤酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ及びアミラーゼと比較して、代替的及び／又は改善された性質を有する新規酵素が、従来の洗剤組成物と比較して、類似するか又は改善された洗浄性能を達成するために必要とされる。

本発明はさらに、タンパク質性染み除去方法におけるサーモリシン様金属プロテアーゼの使用に関する。タンパク質性染みは、例えば食品の染み、例えば離乳食、皮脂、ココア、卵、血液、ミルク、インク、草又はそれらの組合せのような染みであり得る。

典型的な洗剤組成物は、酵素の他に種々の成分を含み、それらの成分は異なった効果を有し、界面活性剤のようないくつかの成分は洗剤における表面張力を減少し、これにより染みは洗浄され、持上げられ、そして分散され、そして次に洗い流され、漂白剤系のような他の成分はしばしば、酸化による変色を除去し、そして多くの漂白剤は強殺菌性質を有し、そして消毒及び滅菌のために使用される。ビルダー及びキレート化剤のようなさらなる他の成分は、例えば液体から金属イオンを除くことにより洗浄水を軟化する。

特定の実施形態によれば、本発明は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む組成物の使用に関し、ここで前記酵素組成物はさらに、洗濯又は食器洗浄において、少なくとも１又は２以上の次のもの、すなわち界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白剤系又は漂白剤成分を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白剤系及び／又は漂白剤成分の量は、添加される金属プロテアーゼなしで使用される、界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白剤系及び／又は漂白剤成分の量と比較して、減少される。好ましくは、界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白剤及び／又は漂白剤成分である、少なくとも１つの成分は、サーモリシン様金属プロテアーゼの添加なしでのシステムにおける成分の量、例えば成分の従来の量よりも、１％少ない、例えば２％少ない、例えば３％少ない、例えば４％少ない、例えば５％少ない、例えば６％少ない、例えば７％少ない、例えば８％少ない、例えば９％少ない、例えば１０％少ない、例えば１５％少ない、例えば２０％少ない、例えば２５％少ない、例えば３０％少ない、例えば３５％少ない、例えば４０％少ない、例えば４５％少ない、例えば５０％少ない量で存在する。一態様において、サーモリシン様金属プロテアーゼは、界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白系、又は漂白剤成分及び／又はポリマーである、少なくとも１つの成分を有さない洗剤組成物に使用される。

洗浄法
本発明の洗剤組成物は理想的には、洗濯用途への使用のために適している。従って、本発明は、布地の洗濯方法を包含する。前記方法は、洗濯されるべき布地と、本発明の洗剤組成物を含む洗浄洗濯溶液とを接触する段階を包含する。布地は、通常の消費者の使用条件下で洗濯できるいずれかの布地を包含する。前記溶液は好ましくは、約５．５〜約８のｐＨを有する。組成物は、溶液中、約１００ｐｍ、好ましくは５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用され得る。水温は典型的には、約５℃〜約９０℃の範囲、例えば約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃及び約９０℃である。水：布地の比は典型的には、約１：１〜約３０：１である。特定の実施形態によれば、洗浄法は、約５．０〜約１１．５のｐＨで、又は他の実施形態によれば、さらに約５．０〜約１１．５、又は他の実施形態によれば、さらに約６〜約１０．５、例えば約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５．５〜約１１、約５．５〜約１０、約５．５〜約９、約５．５〜約８、約５．５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約６．５〜約１1、約６．５〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９、又は約７〜約８、好ましくは約５．５〜約９、及びより好ましくは約６〜約８のｐＨで行われる。

特定の実施形態によれば、洗浄法は、約０°ｄＨ 〜約３０°ｄＨ、例えば約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨの硬度で行われる。典型的なヨーロッパ洗浄条件下では、硬度は約１５°ｄＨであり、典型的なアメリカ合衆国洗浄条件下では、約６°ｄＨであり、そして典型的なアジア洗浄条件下では、約３°ｄＨである。

本発明は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗剤組成物による布地、食器又は硬表面の洗浄方法に関する。

好ましい実施形態は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗浄組成物と目的物とを、前記目的物を洗浄するのに適切な条件下で接触せしめる段階を含む洗浄方法に関する。好ましい実施形態によれば、洗浄組成物は洗剤組成物であり、そして前記方法は洗濯又は食器洗い方法である。

さらなる別の実施形態は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む組成物と布地とを、前記布地を洗濯するのに適切な条件下で接触せしめる、布地からの染みの除去方法に関する。

好ましい実施形態によれば、上記方法への使用のための組成物はさらに、上記「他の酵素」セクションに示されるような少なくとも１つの追加の酵素、例えばカルボヒドラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ又はクチナーゼ、又はそれらの組合せから成る群から選択される酵素を含む。さらに別の好ましい実施形態によれば、組成物は、減じられた量の少なくとも１又は２以上の次の成分を含む：界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白剤系又は漂白剤成分、又はポリマー。

本発明はまた、本発明の１又は２以上の金属プロテアーゼを用いて布地を処理するための（例えば、生地を糊抜きするための）組成物及び方法も意図する。金属プロテアーゼは、当業界において周知であるいずれかの布地処理方法に使用され得る（例えば、アメリカ特許第６，０７７，３１６号を参照のこと）。例えば、一態様において、布地の感触及び外観は、溶液中、金属プロテアーゼと布地とを接触せしめる方法により改善される。一態様において、布地は前記溶液により圧力下で処理される。

一実施形態によれば、金属プロテアーゼは、生地の製織の間又は後、又は糊抜き段階の間、又は１又は２以上の追加の布地処理段階で適用される。生地の製織の間、ストレッドが相当の機械歪にさらされる。機械織機上での製織の前、縦糸は、それらの引張強度を高め、そして破断を防ぐためにサイジング澱粉又は澱粉誘導体によりしばしば被覆される。金属プロテアーゼは、それらのサイジング澱粉又はタンパク質誘導体を除くために適用され得る。生地が織られた後、布地は糊抜き段階に進むことができる。これに続いて、１又は２以上の追加の布地処理段階が存在する。糊抜きは、生地から糊を除く行為である。製織の後、糊被膜（ｓｉｚｅ ｃｏａｔｉｎｇ）は除去され、その後、均質で且つ洗浄プルーフ結果を確保するために布地が処理される。酵素の作用による糊の酵素的加水分解を包含する糊抜き方法もまた提供される。

低温使用
前述のように、本発明のサーモリシン様金属プロテアーゼは、Ｍ４金属プロテアーゼを包含する。Ｍ４金属プロテアーゼはまた、サーモリシンファミリーとも呼ばれている。なぜならば、「サーモリシン」として知られているＭ４金属プロテアーゼは最初の特徴づけられたＭ４金属プロテアーゼであり、そして特徴づけられた最良の１つであるからである。サーモリシンはそれらの高温性能のために知られている。サーモリシンが頻繁に使用されて来たタンパク質合成方法における高温性能が好ましい。従って、高温性能がそれらの方法において好都合であるので、数個のサーモリシンの熱安定性変異体が製造されて来た。

従って、驚くべきことには、本発明の有用な一部のＭ４金属プロテアーゼ、主にサーモリシン様金属プロテアーゼは、低温、例えば約６０℃以上の温度等のより高い温度よりも約４０℃以下の温度で、例えば下記実施例に記載されるように、ＡＭＳＡ下で試験される場合、実際に、比較的良好に機能した。

さらに、特定の好ましい実施形態によれば、サーモリシン様金属プロテアーゼは、本明細書に記載されるようにＡＭＳＡ下で試験される場合、約４０℃以下の洗浄温度で、サブチリシンプロテアーゼ、例えばサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）よりも比較的良好に機能する。

従って、本発明の一実施形態は、洗浄されるべき表面とサーモリシン様金属プロテアーゼとを接触せしめることを含む、洗濯、食器洗い又は工業用洗浄の方法に関し、そして前記洗濯、食器洗い、工業用洗浄は約４０℃以下の温度で実行される。本発明の一実施形態は、洗濯、食器洗い又は工業用洗浄方法における金属プロテアーゼの使用に関し、ここで洗濯、食器洗い又は工業用洗浄における温度は約４０℃以下である。

別の実施形態によれば、本発明は、タンパク質除去方法における金属プロテアーゼの使用に関し、ここで前記タンパク質除去方法での温度は、約４０℃以下である。

本発明はまた、セリンプロテアーゼ又はサビナーゼと比較して、少なくとも１つの改善された性質を有するサーモリシン様金属プロテアーゼの洗濯、食器洗い又は工業用洗浄方法における使用にも関し、ここで洗濯、食器洗い又は工業用洗浄方法における温度は、約４０℃以下の温度である。

上記特定の方法及び使用の個々においては、洗浄温度は、約４０℃以下、例えば約３９℃以下、例えば約３８℃以下、例えば約３７℃以下、例えば約３６℃以下、例えば約３５℃以下、例えば約３４℃以下、例えば約３３℃以下、例えば約３２℃以下、例えば約３１℃以下、例えば約３０℃以下、例えば約２９℃以下、例えば約２８℃以下、例えば約２７℃以下、例えば約２６℃以下、例えば約２５℃以下、例えば約２４℃以下、例えば約２３℃以下、例えば約２２℃以下、例えば約２１℃以下、例えば約２０℃以下、例えば約１９℃以下、例えば約１８℃以下、例えば約１７℃以下、例えば約１６℃以下、例えば約１５℃以下、例えば約１４℃以下、例えば約１３℃以下、例えば約１２℃以下、例えば約１１℃以下、例えば約１０℃以下、例えば約９℃以下、例えば約８℃以下、例えば約７℃以下、例えば約６℃以下、例えば約５℃以下、例えば約４℃以下、例えば約３℃以下、例えば約２℃以下、例えば約１℃以下である。

別の好ましい実施形態によれば、洗浄温度は、約５−４０℃、例えば約５−３０℃、約５−２０℃、約５−１０℃、約１０−４０℃、約１０−３０℃、約１０−２０℃、約１５−４０℃、約１５−３０℃、約１５−２０℃、約２０−４０℃、約２０−３０℃、約２５−４０℃、約２５−３０℃、又は約３０−４０℃の範囲である。特に好ましい実施形態によれば、洗浄温度は約３０℃である。

特定の実施形態によれば、低温洗浄方法は、約５．０〜約１１．５のｐＨ、又は他の実施形態によれば、さらに約６ 〜約１０．５、例えば約５ 〜約１１、約５ 〜約１０、約５ 〜約９、約５ 〜約８、約５ 〜約７、約５．５ 〜約１１、約５．５ 〜約１０、約５．５ 〜約９、約５．５ 〜約８、約５．５〜約７、約６ 〜約１１、約６ 〜約１０、約６ 〜約９、約６ 〜 〜約８、約６ 〜約７、約６．５ 〜約１１、約６．５ 〜約１０、約６．５ 〜約９、約６．５ 〜約８、約６．５ 〜約７、約７ 〜約１１、約７ 〜約１０、約７ 〜約９、又は約７ 〜約８、好ましくは約５．５ 〜約９、及びより好ましくは約６〜約８のｐＨで行われる。

特定の実施形態によれば、低温洗浄方法は、約０°ｄＨ 〜約３０°ｄＨ、例えば約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨの硬度で行われる。典型的な欧州洗浄条件下で、硬度は約１５°ｄＨであり、典型的なアメリカ洗浄条件下では、約６°ｄＨであり、そして典型的なアジア洗浄条件下では、約３°ｄＨである。

卵染み除去への使用
本発明の別の特定の実施形態は、卵染みの除去に関する。それらのタイプの染みはしばしば、完全に除去するには非常に困難である。卵染みは、硬表面洗浄、例えば染みが洗浄の後、プレート及び刃物上にしばしば残存する食器洗いにおいて特に、問題である。サーモリシン様金属プロテアーゼは、卵染みの除去のために特に適切である。

従って、本発明はさらに、生地、布地及び／又は硬表面、例えば食器及び刃物、特に布地及び生地から卵染みを除去するための方法に関する。本発明の好ましい観点は、卵染みの除去の必要な表面とサーモリシン様金属プロテアーゼとを接触せしめることを含む、生地及び／又は布地からの卵染みの除去方法に関する。一実施形態によれば、本発明は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗剤組成物と卵染みの除去の必要な表面とを接触せしめることを含む、生地及び／又は布地からの卵染みの除去方法を包含する。本発明はまた、生地及び／又は布地が種々の卵染みを含む、洗濯及び／又は洗浄方法にサーモリシン様金属プロテアーゼを添加することを包含する、卵染みの除去方法にも関する。

本発明の一実施形態は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗浄組成物と、卵染み含有硬表面又は卵染み含有洗濯物とを接触せしめることを含む、硬表面又は洗濯物からの卵染みの除去方法に関する。

別の実施形態は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む洗浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗浄組成物と、布地又は生地とを接触せしめることを含む、布地又は生地からの卵染みの除去方法に関する。

さらに他の実施形態は、サーモリシン様金属プロテアーゼを含む組成物と、布地又は生地とを接触せしめることを含む、布地又は生地からの卵染みの除去方法に関し、ここで前記組成物はさらに、上記「他の酵素」セクションに示されるような少なくも１つの追加の酵素、例えばカルボヒドラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ又はそれらの組合せから成る群から選択される酵素を含む。

特定の実施形態によれば、卵除去方法は、約５．０〜約１１．５、又は他の実施形態によれば、さらに約６ 〜約１０．５、例えば約５ 〜約１１、約５ 〜約１０、約５ 〜約９、約５ 〜約８、約５ 〜約７、約５．５ 〜約１１、約５．５ 〜約１０、約５．５ 〜約９、約５．５ 〜約８、約５．５〜約７、約６ 〜約１１、約６ 〜約１０、約６ 〜約９、約６ 〜 〜約８、約６ 〜約７、約６．５ 〜約１１、約６．５ 〜約１０、約６．５ 〜約９、約６．５ 〜約８、約６．５ 〜約７、約７ 〜約１１、約７ 〜約１０、約７ 〜約９、又は約７ 〜約８、好ましくは約５．５ 〜約９、及びより好ましくは約６ 〜約８のｐＨで行われる。

特定の実施形態によれば、卵除去方法は、約０°ｄＨ 〜約３０°ｄＨ、例えば約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨの硬度で行われる。典型的な欧州洗浄条件下で、硬度は約１５°ｄＨであり、典型的なアメリカ洗浄条件下では、約６°ｄＨであり、そして典型的なアジア洗浄条件下では、約３°ｄＨである。

本明細書に挙げられるすべての文書は、参照により全体に組込まれる。

本発明はさらに、次の実施例により記載されるが、但しそれらは本発明の範囲を制限するものではない。

材料及び方法
精製活性アッセイ:
Protazyme AK精製活性アッセイ:
基質: Protazyme AKタブレット末端（AZCL-カゼイン、Megazyme T-PRAK 1000）
温度: 37℃
アッセイ緩衝液: 50mM HEPES/NaOH、pH 7.0.
Protazyme AKタブレットを2.0ml 0.01%トリトンX-100中で穏やかな撹拌で懸濁する。この懸濁液の500μlと500μlアッセイ緩衝液をエッペンドルフチューブ中に分注し、氷上に置く。20μlのプロテアーゼ試料末端（0.01%末端トリトンX-100中に希釈）を氷冷チューブに添加する。エッペンドルフチューブをアッセイ温度にセットしたエッペンドルフサーモミキサーへ移すことによって、アッセイを始める。チューブを15分間エッペンドルフサーモミキサー上で最も早い撹拌速度（1400 rpm）でインキュベートする。チューブを氷浴に戻すことによってインキュベーションを停止する。続いてチューブを氷冷遠心機で数分間遠心分離し、200μlの上清をマイクロタイタープレートに移す。OD₆₅₀をプロテアーゼ活性の尺度として読む。緩衝液盲検がアッセイに含まれる（酵素の代わり）。

特徴づけ活性アッセイ:
Protazyme AK特徴づけアッセイ:
基質: Protazyme AKタブレット（AZCL-カゼイン、Megazyme T-PRAK 1000）
温度: 制御（アッセイ温度）
アッセイ緩衝液: HCl又はNaOHでpH値3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及び11.0に調整した、100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01% トリトンX-100
Protazyme AKタブレットを2.0mlの0.01%トリトンX-100中に穏やかな撹拌で懸濁する。この懸濁液500μl及び500μlアッセイ緩衝液を、エッペンドルフチューブに分注し、氷上に置く。20μl プロテアーゼ試料（0.01% トリトンX-100中に希釈）を、氷冷チューブに添加する。エッペンドルフチューブをアッセイ温度にセットしたエッペンドルフサーモミキサーに移すことによりアッセイを始める。チューブを15分間、エッペンドルフサーモミキサー上でその最も早い撹拌速度（1400 rpm）でインキュベートする。チューブを氷浴に戻すことによりインキュベーションを停止する。続いて、チューブを氷冷遠心機中で数分間遠心分離し、200μlの上清をマイクロタイタープレートに移す。OD₆₅₀をプロテアーゼ活性の尺度として読む。アッセイに緩衝液盲検を含む（酵素の代わり）。

Protazyme OL特徴づけアッセイ:
基質: Protazyme OLタブレット（AZCL-コラーゲン、Megazyme T-PROL 1000）
温度: 制御（アッセイ温度）
アッセイ緩衝液: HCl又はNaOHでpH値2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及び11.0に調整した、100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01% トリトン X-100
Protazyme OLタブレットを2.0ml 0.01% トリトンX-100中で穏やかな撹拌で懸濁する。500μlの懸濁液及び500μlアッセイ緩衝液を、エッペンドルフチューブに分注し、氷上に置く。20μlプロテアーゼ試料（0.01% トリトンX-100中に希釈）を、氷冷チューブに添加する。エッペンドルフチューブをアッセイ温度にセットしたエッペンドルフサーモミキサーに移すことによりによって、アッセイを始める。チューブを15分、エッペンドルフサーモミキサー上でその最も早い撹拌速度（1400 rpm）でインキュベートする。チューブを氷浴に戻すことによりインキュベーションを停止する。続いて、チューブを氷冷遠心機中で数分間遠心分離し、200μlの上清をマイクロタイタープレートに移す。OD₆₅₀をプロテアーゼ活性の尺度として読む。アッセイに緩衝液盲検を含む（酵素の代わり）。

洗濯についての自動機械負荷分析（ＡＭＳＡ）
洗濯における洗浄性能を評価するために、洗浄実験を、自動機械負荷分析（ＡＭＳＡ）を用いて実施する。ＡＭＳＡにより、少量ずつ多数の酵素−洗剤溶液の洗浄性能を実験することができる。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液用の多数スロット、及び洗濯サンプル、すなわちすべてのスロット開口部に対して洗浄される生地を硬く締め付けるリッドを有する。洗浄期間の間、プレート、試験溶液、生地及びリッドを激しく振盪し、試験溶液を生地に接触させ、そして定期的、周期的な振盪による機械的応力を適用する。さらなる説明については、国際公開第２００２／４２７４０号、特に２３〜２４頁の「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」のパラグラフを参照のこと。

洗濯実験を、下記に特定される実験下で実施する：

モデル洗剤及び試験材料は次の通りである：

すべての試験材料は、EMPA Testmaterials AG Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Switzerland、Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlands、及びWFK Testgewebe GmbH, Christenfeld 10, D-41379 Bruggen, Germanyから入手される。

試験系にＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂及びＮａＨＣＯ₃（Ｃａ²⁺：Ｍｇ²⁺：ＮａＨＣＯ₃＝４：１：７．５）を加えて、水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄後、生地を水道水で漱ぎ、乾燥した。

洗浄性能は、洗浄された生地の色の明度として測定する。明度は、白色光照射時のサンプルからの光の反射強度として表すこともできる。汚れたサンプルからの反射光強度は、きれいなサンプルからの反射光強度よりも低い。別の手段により表される場合、きれいなサンプルはより光を反射し、そしてより高い光強度を有するであろう。従って、反射光強度を用いて、洗浄性能を測定することができる。

測色は、専用フラットベッドスキャナー（Kodak iQsmart、Kodak、Midtager 29、DK-2605 Brandby、Denmark）を用い、洗浄された生地を撮像して行う。

スキャン撮像からの光強度値の抽出は、画像からの２４ビットピクセル値を、赤、緑及び青（ＲＧＢ）値に転換して行う。強度値（Ｉｎｔ）の算出は、ＲＧＢ値をベクトルとして加算し、得られたベクトルの長さを求めることにより行う。

実施例１：
ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのGs1、及びバチルス・カルドリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）からのBca1の精製
Gs1及びBca1プロテアーゼが共に、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）において発現された。

培養ブロスを遠心分離し（20000 x g、20分）、上清を慎重に容器を傾けて沈殿物から移した。ナルゲン0.2μm濾過ユニットを通して上清を濾過し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の残りを除去した。0.2μmの濾液を、G25 sephadexカラム（GE Healthcareから購入）上の50mM H₃BO_3、5mMジメチルグルタル酸、1mM CaCl₂、pH 7に移した。G25 sephadexに移した酵素を、50mM H₃BO₃、5mMジメチルグルタル酸、1mM CaCl₂、pH 7中で平衡化したバシトラシンアガロースカラム（Upfront chromatographyから購入）に適用した。平衡緩衝液での広範のカラムの洗浄後、サーモリシンプロテアーゼを25%（v/v）2-プロパノールでpH 6の100mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂、1M NaClで溶出した。プロテアーゼ活性に関してカラム由来の画分を分析し（pH 7でのProtazyme AK精製活性アッセイ）、活性画分をSDS-PAGEによってさらに分析した。クーマシー染色したSDS-PAGEゲル上でたった１つのバンドが確認された画分をプールし、G25 sephadexカラム上の50mM H₃BO₃、5mMジメチルグルタル酸、1mM CaCl₂、pH 7に精製調製物として移し、さらなる特徴づけのために使用した。

実施例２
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からのBm1並びにバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）からのBce1及びBce2の精製
Bm1、Bce1及びBce2プロテアーゼがＢ．サブチリス（B.subtilis）において発現された。

培養ブロスを遠心分離し（20000 x g、20分）、慎重に容器を傾けて上清を沈殿物から移した。上清をナルゲン0.2μm 濾過ユニットを介して濾過し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の残りを除去した。0.2μmの濾液を、G25 sephadexカラム（GE Healthcareから購入）上の50mM H₃BO₃、5mM ジメチルグルタル酸、1mM CaCl₂、pH 7に移した。G25 sephadexに移した酵素を、50mM H₃BO₃、5mM ジメチルグルタル酸、1mM CaCl₂、pH 7の平衡化したバシトラシンアガロースカラム（Upfront chromatographyから購入）に適用した。平衡緩衝液でのカラムの広範の洗浄後、M4プロテアーゼを、25%（v/v）2-プロパノールと共に100mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂、1M NaCl、pH 6で溶出した。カラム由来の画分をプロテアーゼ活性に関して分析し（pH 7でのProtazyme AK精製活性アッセイ）、活性画分をSDS-PAGEによってさらに分析した。クーマシー染色したSDS-PAGEゲル上でたった１つのバンドが確認された画分をプールし、G25 sephadexカラム上で50mM H₃BO₃、5mMジメチルグルタル酸、1mM CaCl₂、pH 7に精製調製物として移し、さらなる特徴づけのために使用した。

実施例３
Bm1、Bce1及びBce2プロテアーゼの特徴づけ: pH活性及びpH安定性
材料及び方法セクションで記載したように、Protazyme OL特徴づけアッセイを37℃でのpH活性特性及び最適pH値でのpH安定性特性（指示されたpH値で２時間後の残効性）を得るために使用した。pH安定性特性に関して、プロテアーゼを異なる特徴づけアッセイ緩衝液中で8倍希釈し、これらの緩衝液のpH値に達成させ、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、プロテアーゼインキュベーションのpHをプロテアーゼの最適pH値に、残効性のアッセイ前に最適pH値アッセイ緩衝液中で希釈によって移した。次の表に結果を示す。表3に関して、活性は酵素の最適ｐＨに関連する。表4に関して、活性は安定条件（5℃、最適pH値）で維持された試料に対する残効性である。

Gs1及びBca1プロテアーゼの特徴づけ: pH活性及びpH安定性
材料及び方法セクションで記載したように、Protazyme AK特徴づけアッセイを、37℃でpH活性特性、及び最適pH値でのpH安定性特性（指示されたpH値での2時間後の残効性）を得るために使用した。pH安定性特性に関して、プロテアーゼを異なる特徴づけアッセイ緩衝液中で少なくとも8倍希釈しこれらの緩衝液のpH値に達成させ、2時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、プロテアーゼインキュベーションのpHを、残効性のアッセイ前に、最適pH値アッセイ緩衝液中での希釈によってプロテアーゼの最適pH値に移した。以下の表に結果を示す。表3に関して、活性は酵素の最適ｐＨに関連する。表4に関して、活性は安定条件で維持された試料に対する残効性である（5℃、最適pH値）。

表3: 37℃でのpH活性特性

表4: pH安定性特性（37℃での2時間後の残効性）

他の特性
1,10-フェナントロリン及びEDTAによって、M4プロテアーゼを阻害する。
配列表は、確認されたN末端配列及びN末端配列及びインタクト質量測定から推定された成熟配列を供する。N末端配列及びインタクト質量分析に加えて、バチルス・カルドリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のM4プロテアーゼBca1を、成熟配列の72%をカバーしているペプチドマップによってチェックした。斯かる分析は、精製M4プロテアーゼが成熟配列にM44T置換を有することを示した。

ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のM4プロテアーゼGs1もまた、成熟配列の83%をカバーしているペプチドマップによってチェックした。斯かる分析は、分解できない14.56 Daの分子量の違いを供した。これは、配列の残りの17%中のメチル化又はアミノ酸置換に起因しうる。

実施例４：洗浄力の評価
種々の温度での典型的なサーモリシン様金属プロテアーゼ
Ｂｃａ1、Ｇｓ1、Ｂｃｅ1、Ｂｍ1及びＢｃｅ２プロテアーゼの洗浄力を、異なった染み及び温度に基づいて、上記のようにしてＡＭＳＡにより調べた。液体洗剤は、すべての場合、ｐＨ７に調節され、但し表６のＰＣ−０５（２０℃）についての実験は除く。表は、洗濯液体モデル洗剤（表５−６）及び洗濯粉末モデル洗剤（表７−８）の両システムを用いて、プロテアーゼを含まない洗剤に対する決定された強度値を示す。

表５：洗濯液体モデル洗剤におけるプロテアーゼを有さない洗剤に対する典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの決定された強度値

表６：洗濯液体モデル洗剤におけるプロテアーゼを有さない洗剤に対する典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの決定された強度値

表７：洗濯粉末モデル洗剤におけるプロテアーゼを有さない洗剤に対する典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの決定された強度値

表８：洗濯粉末モデル洗剤におけるプロテアーゼを有さない洗剤に対する典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの決定された強度値

上記表５−８から、サーモリシン様金属プロテアーゼは、プロテアーゼが存在しない場合と比較して、洗浄力を有意に高めることが明白である。

実施例５：
典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの低温性能の評価
サビナーゼと比較したサーモリシン様金属プロテアーゼＢａｃ１、Ｂｃｅ１、Ｂｃｅ２及びＢｍ１の低温機能を、上記のようにして、ＡＭＳＡにより調べた。液体洗剤は、ＥＭＰＡ１１２及びＣ−１０の場合、ｐＨ７に、及びＰＣ−０５の場合、ｐＨ６に調節された。表は、洗濯液体モデル洗剤（表９）及び洗濯粉末モデル洗剤（表１０）の両者において、サビナーゼを有する洗剤に対する、サーモリシン様金属プロテアーゼを有する洗剤の決定された洗浄性能を示す。

表９：洗濯液体モデル洗剤におけるサビナーゼに対する典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの比較

表１０：洗濯粉末モデル洗剤におけるサビナーゼに対する典型的サーモリシン様金属プロテアーゼの比較

サーモリシン様金属プロテアーゼＢｃａ１、Ｂｃｅ１、Ｂｍ１及びＢｃｅ２が全体的に、４０℃又はそれ以下の温度で、サブナーゼと比較して、増強された洗浄性能を有することが表９−１０から明白である。他方では、６０℃で、試験されたサーモリシン様金属プロテアーゼはサビナーゼとちょうど一致するか又はサビナーゼよりも悪い。これは、それらのサーモリシン様金属プロテアーゼが特に低温で良く機能することを明確に示す。

実施例7:
代表的なサーモリシン様金属プロテアーゼの卵への能力の評価
サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）と比較したBca1、Gs1、Bce1、Bm1及びBce2プロテアーゼの、異なる卵染みへの能力を、上記AMSAで調べた。液体洗剤をpH 7（表11）及びpH 6（表12）にそれぞれ調整した。表は、30℃（表11）及び20℃（表12）でのサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）を有する洗剤に対するサーモリシン様金属プロテアーゼを有する洗剤の測定した洗浄能力を示す。

表11: モデル洗剤（30℃）における代表的なサーモリシン様金属プロテアーゼのサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）との比較

表12: モデル洗剤（20℃）における代表的なサーモリシン様金属プロテアーゼのサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）との比較

サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）と比較してサーモリシン様金属プロテアーゼが様々な卵染みに増加した洗浄能力を有することは表11〜12から明らかである。

本発明は以下の特定の実施形態によっても記載できる。

実施形態1. 洗浄方法におけるサーモリシン様金属プロテアーゼの使用。

実施形態2. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ:TG[TS][QS]DNGGVH[TI]を含む、実施形態1に記載の使用。

実施形態3. サーモリシン様金属プロテアーゼが、活性クレフトモチーフ: DPDHYSKRYTG[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、実施形態1又は2に記載の使用。

実施形態4. サーモリシン様金属プロテアーゼが、活性クレフトモチーフ: NT[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、実施形態1に記載の使用。

実施形態5. サーモリシンMetallo-プロテアーゼが:
a） MEROPSサブクラスM04.001のM4金属プロテアーゼ;
b） MEROPSサブクラスM04.018のM4金属プロテアーゼ;及び
c） MEROPSサブクラスM04.021のM4金属プロテアーゼ、
から成る群から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の使用。

実施形態6. プロテアーゼが、配列番号1、2、3、4又は5の成熟ポリペプチドと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載の使用。

実施形態7. 洗浄方法が洗濯方法である、前記実施形態のいずれかに記載の使用。

実施形態8. 洗浄方法が食器洗い方法である、実施形態１〜６のいずれかに記載の使用。

実施形態9. ポリペプチドが、配列番号1、2、3、4又は5の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記実施形態のいずれかに記載の使用。

実施形態10. 洗浄方法が、40℃以下、好ましくは35℃以下、好ましくは30℃以下、好ましくは25℃以下、好ましくは20℃以下の温度で実施される、前記実施形態のいずれかに記載の使用。

実施形態11. 洗浄方法がpH5.5〜9、好ましくは6〜8で実施される、前記実施形態のいずれかに記載の使用。

実施形態12. 洗浄の必要な表面とサーモリシン様金属プロテアーゼとを接触させる工程を含む、洗浄方法。

実施形態13. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: TG[TS][QS]DNGGVH[TI]を含む、実施形態12の方法。

実施形態14. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: DPDHYSKRYTG[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、実施形態12又は13の方法。

実施形態15. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: NT[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、実施形態12の方法。

実施形態16. サーモリシン様金属プロテアーゼが:
a） MEROPSサブクラスM04.001のM4金属プロテアーゼ;
b） MEROPSサブクラスM04.018のM4金属プロテアーゼ;及び
c） MEROPSサブクラスM04.021のM4金属プロテアーゼ、
から成る群から選択される、実施形態12-15のいずれか１つの方法。

実施形態17. プロテアーゼが、配列番号1、2、3、4又は5の成熟ポリペプチドと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態12-16のいずれか１つの方法。

実施形態18. 洗浄方法が洗濯方法である、実施形態12-17のいずれか１つの方法。

実施形態19. 洗浄方法が食器洗い方法である、実施形態12-17のいずれか１つの方法。

実施形態20. ポリペプチドが、配列番号1、2、3、4又は5の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態12-19のいずれか１つの方法。

実施形態21. 洗浄方法が、40℃以下、好ましくは35℃以下、好ましくは30℃以下、好ましくは25℃以下、好ましくは20℃以下の温度で行われる、実施形態12-20のいずれか１つの方法。

実施形態22. 洗浄方法がpH5.5〜9、好ましくは6〜8で行われる、実施形態12-21のいずれか１つの方法。

実施形態23. サーモリシン様金属プロテアーゼ及び賦形剤界面活性剤を含む組成物。

実施形態24. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: TG[TS][QS]DNGGVH[TI]を含む、実施形態23の組成物。

実施形態25. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: DPDHYSKRYTG[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、実施形態23又は24の組成物。

実施形態26. サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: NT[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、実施形態23の組成物。

実施形態27. サーモリシン様金属プロテアーゼが:
a）MEROPSサブクラスM04.001のM4金属プロテアーゼ;
b）MEROPSサブクラスM04.018のM4金属プロテアーゼ;及び
c）MEROPSサブクラスM04.021のM4金属プロテアーゼ、
から成る群から選択される、実施形態23-26のいずれか１つの組成物。

実施形態28. プロテアーゼが、配列番号1、2、3、4又は5の成熟ポリペプチドと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態23-26のいずれか１つの組成物。

実施形態29. カルボヒドラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ又はクチナーゼ又はそれらの組合せから成る群から選択される少なくとも１つのさらなる酵素を含む、実施形態23-28のいずれか１つの組成物。

実施形態30. 洗浄組成物である、実施形態23-29のいずれか１つに記載の組成物。

実施形態31. 洗剤組成物である、実施形態23-29のいずれか１つに記載の組成物。

実施形態32. ポリペプチドが配列番号1、2、3、4又は5の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態23-31のいずれか１つに記載の組成物。

実施形態33. 低温洗浄方法における使用のための、実施形態23-32のいずれか１つに記載の組成物。

実施形態34. 卵染み除去方法における使用のための、実施形態23-32のいずれか１つに記載の組成物。

実施形態35. 実施形態23-32のいずれか１つに記載の組成物と表面とを接触させる工程を含む、表面からの染み除去方法。

実施形態36. 染みが卵染みである、実施形態35に記載の方法。

実施形態37. 食器洗い方法である、実施形態35-36のいずれか１つに記載の方法。

実施形態38. 表面が布地又は生地である、実施形態35-36のいずれか１つに記載の方法。

実施形態39. 染み除去方法がpH5.5〜9、好ましくは6〜8で行われる、実施形態35-38のいずれか１つに記載の方法。

Claims (17)

1. 洗浄方法における、サーモリシン様金属プロテアーゼの使用。
2. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: TG[TS][QS]DNGGVH[TI]を含む、請求項１に記載の使用。
3. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが活性クレフトモチーフ: DPDHYSKRYTG[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが、活性クレフトモチーフ: NT[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、請求項１に記載の使用。
5. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが:
   ａ）MEROPSサブクラスM04.001のM4金属プロテアーゼ;
   ｂ）MEROPSサブクラスM04.018のM4金属プロテアーゼ;
   ｃ）MEROPSサブクラスM04.021のM4金属プロテアーゼ、
   から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記プロテアーゼが、配列番号:１、２、３、４又は５の成熟ポリペプチドと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記洗浄方法が洗濯方法である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 前記洗浄方法が食器洗い方法である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記ポリペプチドが、配列番号:１、２、３、４又は５の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記洗浄方法が40℃以下、好ましくは35℃以下、好ましくは30℃以下、好ましくは25℃以下、好ましくは20℃以下の温度で行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記洗浄方法がpH5.5〜9、好ましくはpH6〜8で行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. サーモリシン様金属プロテアーゼと界面活性物質とを含む、組成物。
13. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが、活性クレフトモチーフ: TG[TS][QS]DNGGVH[TI]を含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが、活性クレフトモチーフ: DPDHYSKRYTG[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、請求項１２又は１３に記載の組成物。
15. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが、活性クレフトモチーフ: NT[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGIを含む、請求項１２に記載の組成物。
16. 前記サーモリシン様金属プロテアーゼが:
    ａ）MEROPSサブクラスM04.001のM4金属プロテアーゼ;
    ｂ）MEROPSサブクラスM04.018のM4金属プロテアーゼ;
    ｃ）MEROPSサブクラスM04.021のM4金属プロテアーゼ、
    から成る群から選択される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 前記プロテアーゼが、配列番号:１、２、３、４又は５の成熟ポリペプチドと少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。