JP2014503223A - 免疫多様性の評価方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
正常、健康な個体の免疫レパートリーと、症候性および／または非症候性の疾患を有する個体の免疫レパートリーとを区別する方法を開示する。
Description
本願は、2011年1月14日出願の米国仮出願第61/432,638号の優先権の恩典を主張し、適用される法律および／または規則が許す場合はこれを参照により本明細書に組み入れる。
発明の分野
本発明は、診断テストを実施する方法に関する。より具体的には、本発明は、免疫細胞集団の多様性レベルの評価のための診断テストに関する。
本発明は、診断テストを実施する方法に関する。より具体的には、本発明は、免疫細胞集団の多様性レベルの評価のための診断テストに関する。
発明の背景
一つの診断テストが個々の疾患の確定的な診断をなすことはほとんどない。しかし、正常な状態の存在または不存在を検出するために複数の診断テストが使用され得、これらのテストの結果は患者を選別するのに使用され得、集合的に診断に役立っている。例えば、正常な白血球細胞数は、1マイクロリットルあたり4,500〜10,000個の細胞である。白血球細胞数の増加は特定の疾患を決定づけるものではないが、それは医学的評価を必要とする問題が水面下に存在することを示している可能性がある。女性と男性の赤血球細胞数の正常範囲は一般に異なっており、男性については1マイクロリットルあたり5〜6百万個が正常であり、女性については3.6〜5.6百万個が正常である。血小板数は、それらが150,000〜400,000個の範囲内にある場合に正常である。例えば、炎症の存在下では、赤血球細胞数が減少し得、白血球細胞数が増加し得、そして血小板数も増加し得る。
一つの診断テストが個々の疾患の確定的な診断をなすことはほとんどない。しかし、正常な状態の存在または不存在を検出するために複数の診断テストが使用され得、これらのテストの結果は患者を選別するのに使用され得、集合的に診断に役立っている。例えば、正常な白血球細胞数は、1マイクロリットルあたり4,500〜10,000個の細胞である。白血球細胞数の増加は特定の疾患を決定づけるものではないが、それは医学的評価を必要とする問題が水面下に存在することを示している可能性がある。女性と男性の赤血球細胞数の正常範囲は一般に異なっており、男性については1マイクロリットルあたり5〜6百万個が正常であり、女性については3.6〜5.6百万個が正常である。血小板数は、それらが150,000〜400,000個の範囲内にある場合に正常である。例えば、炎症の存在下では、赤血球細胞数が減少し得、白血球細胞数が増加し得、そして血小板数も増加し得る。
血中グルコースレベルは、クッシング症候群、甲状腺機能亢進症、膵癌、膵炎、糖尿病前症および糖尿病等の様々な疾患に関連する初期診断因子として使用され得る。心疾患、心疾患を有する傾向、特定のがんの兆候および様々な遺伝的疾患は、それらの初期兆候として、様々な診断テストにおいて1つまたは複数の異常な結果を示し得る。個々におよび／または集合的に正常な健康状態または正常な健康状態の不存在（すなわち、疾患）を示す診断テストには、例えば、アルブミン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、血中尿素窒素（BUN）、血清カルシウム、血清クロール、二酸化炭素、クレアチニン、直接ビリルビン、ガンマ-グルタミル-トランスペプチダーゼ（ガンマ-GT）、グルコース、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、血清リン、カリウム、血清ナトリウム、総ビリルビン、総コレステロール、総タンパクおよび尿酸が含まれる。
疾患の予防には、正常な状態をより正確に把握することも必要となる。なぜならば、何が正常であるかを我々が十分に把握できる場合にのみ、我々は正常または亜正常からの逸脱を同定することができ、かつ予防的手段の効果を評価することができるからである。
現在多くの診断テストが利用可能となっており、正規の手段として実施されているが、多くの疾患、例えばがんおよび心疾患は、それらが明白な身体的症状の存在する時点まで進行するまで検出されないことがある。その時点では効果的な処置を提供するのに遅すぎることが頻繁にある。したがって、患者の健康を評価するためおよび深刻な疾患またはそのような疾患の素因が存在するシグナルであり得る異常な状態を同定するために使用され得るさらなるテストが常に求められている。
本発明は、個体の正常な免疫状態または異常な免疫状態を同定する方法に関し、検出可能な免疫系細胞の多様な標的集団の存在によって正常な免疫状態が示され、そのような多様性の欠如によって異常な免疫状態が示される。この方法は、免疫系細胞のクロノタイプを定量する工程と、その集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程とを含む。正常な状態は、細胞の総数における有意な割合に相当するクロノタイプの多様度（または多様性）が高いことによって特徴づけられ、そして異常な状態は、細胞の総数における有意な割合に相当するクロノタイプの数が有意に少ないことによって特徴づけられる。例えば、TCRの最も重要な領域は、そのヌクレオチド配列が各T細胞クローンに特有のものである第3相補性決定領域（CDR3）である。有意な割合は、約25〜約75パーセントの数値であり得る。本発明の様々な局面において、本発明者らは、50パーセント（50%）という有意な割合が有用な診断結果を提供することを見出した。細胞の総数における「有意な割合」が50パーセント（50%）の場合、その多様性指数（D50）は、riがi番目に豊富なCDR3の存在量、r1が最も豊富なCDR3の存在量、r2が2番目に豊富なCDR3の存在量等というように順位付けされた優占度構成の、S個の別個のCDR3から構成されるJ個の個々の細胞の免疫レパートリーの多様性（CDR3の総数）の尺度となる。Cは、総配列リードの≧50%に達する別個のCDR3の最小数である。したがってD50は、C/S x 100によって与えられる。
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本発明の様々な局面において、定量される免疫系細胞には、例えば、全T細胞［汎T］、T細胞の機能上のサブセット（例えばCD8+ T細胞［細胞傷害性T（Tc）］、CD4+ T細胞およびそれらのサブセット［TH1、TH2、TH17、制御性T（Treg）および濾胞性T（TFH）］）またはT細胞の発達上のサブセット（例えばナイーブT（Tn）、活性化T（Ta）、記憶T（Tm））、全B細胞（汎B）およびそれらのサブセット（例えばナイーブB（Bn）、活性化B（Ba）、記憶B（Bm）、形質B細胞および形質芽球B細胞）が含まれ得る。本発明の様々な局面において、有意な割合は、約25%〜約75%の任意の値であり得る。いくつかの局面において、有意な割合は、50%であり得る。
本発明はまた、正常な免疫状態または異常な免疫状態を同定するために免疫レパートリーの多様性のレベルを評価する方法であって、（a）標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中でヒトまたは動物対象由来の白血球細胞の集団からポリヌクレオチドを増幅し、第1アンプリコンセットを生成する工程であって、増幅時に、標的特異的なネステッドプライマーの少なくとも一部が、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を第1アンプリコンに組み込むためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含む、工程；（b）第1アンプリコンを含む第1反応混合物の一部を、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2反応混合物に移す工程；（c）少なくとも1つの共通プライマーを用いて第1アンプリコンを増幅し、第2アンプリコンセットを生成する工程；（d）第2アンプリコンを配列決定し、白血球細胞の亜集団におけるV(D)J再構成配列を同定する工程、ならびに（e）同定されたV(D)J再構成配列を使用して免疫系細胞の集団内の細胞の総数およびその集団内で同定された各クロノタイプごとの細胞の総数の両方を定量する工程；ならびに（f）その集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程、を含み、ここで、正常な状態は、細胞の総数における有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの多様度が高いことによって特徴づけられ、そして異常な状態は、細胞の総数における有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの数が少ないことによって特徴づけられる、方法、に関する。
本発明の方法はまた、微生物の多様性の評価に関連する用途を有する。微生物集団および集団数のシフトは、例えば、肥満、糖尿病および腸の炎症状態で見られる。本発明の方法を用いる正常および異常な多様性プロフィールの同定は、例えば、鼻道、口腔、皮膚、胃腸管および／または尿生殖路から採取された臨床サンプルを用いる診断テストとして有用であり得る。
詳細な説明
本発明者らは、正常、健康な個体の免疫レパートリーと、症候性および／または非症候性疾患を有する個体の免疫レパートリーとを区別する方法を開発した。この方法は、正常、健康な個体において一般的に見られる免疫細胞の多様性レベルと、1つまたは複数の疾患状態を有する個体において見られる一般的に低い多様性レベルとの間の差異を、正常または異常な免疫状態の存在の診断指標として使用する。本発明の１つの局面において、多様性レベルはD50と称され、D50は免疫系細胞の集団または亜集団における全CDR3のうち少なくとも半分を構成する別個のCDR3の最小割合と定義される。第3相補性決定領域（CDR3）は、そのヌクレオチド配列が各T細胞またはB細胞クローンに特有のものである領域であり、CDR3の数が多いほど多様性レベルが高い。D50は、以下のように説明され得る。細胞の総数における「有意な割合」が50パーセント（50%）の場合、その多様性指数（D50）は、riがi番目に豊富なCDR3の存在量、r1が最も豊富なCDR3の存在量、r2が2番目に豊富なCDR3の存在量等というように順位付けされた優占度構成の、S個の別個のCDR3から構成されるJ個の個々の細胞の免疫レパートリー（CDR3の総数）の多様性の尺度とも定義され得る。Cは、総配列リードの≧50%に達する、別個のCDR3の最小数である。したがってD50は、C/S x 100によって与えられる。
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本発明者らは、正常、健康な個体の免疫レパートリーと、症候性および／または非症候性疾患を有する個体の免疫レパートリーとを区別する方法を開発した。この方法は、正常、健康な個体において一般的に見られる免疫細胞の多様性レベルと、1つまたは複数の疾患状態を有する個体において見られる一般的に低い多様性レベルとの間の差異を、正常または異常な免疫状態の存在の診断指標として使用する。本発明の１つの局面において、多様性レベルはD50と称され、D50は免疫系細胞の集団または亜集団における全CDR3のうち少なくとも半分を構成する別個のCDR3の最小割合と定義される。第3相補性決定領域（CDR3）は、そのヌクレオチド配列が各T細胞またはB細胞クローンに特有のものである領域であり、CDR3の数が多いほど多様性レベルが高い。D50は、以下のように説明され得る。細胞の総数における「有意な割合」が50パーセント（50%）の場合、その多様性指数（D50）は、riがi番目に豊富なCDR3の存在量、r1が最も豊富なCDR3の存在量、r2が2番目に豊富なCDR3の存在量等というように順位付けされた優占度構成の、S個の別個のCDR3から構成されるJ個の個々の細胞の免疫レパートリー（CDR3の総数）の多様性の尺度とも定義され得る。Cは、総配列リードの≧50%に達する、別個のCDR3の最小数である。したがってD50は、C/S x 100によって与えられる。
本発明の方法は、免疫レパートリーの多様性レベルを評価するために、以下の工程：（a）標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中でヒトまたは動物対象由来の白血球細胞の集団からポリヌクレオチドを増幅し、第1アンプリコンセットを生成する工程であって、標的特異的なネステッドプライマーの少なくとも一部が、増幅時に、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を第1アンプリコンに組み込むためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含む、工程；（b）第1アンプリコンを含む第1反応混合物の一部を、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2反応混合物に移す工程；（c）少なくとも1つの共通プライマーを用いて第1アンプリコンを増幅し、第2アンプリコンセットを生成する工程；（d）第2アンプリコンの配列を決定し、白血球細胞の亜集団におけるV(D)J再構成配列を同定する工程、（e）同定されたV(D)J再構成配列を使用して免疫系細胞の集団内の細胞の総数およびその集団内で同定された各クロノタイプごとの細胞の総数の両方を定量する工程；ならびに（f）その集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程、を使用して実施され得、正常な状態は、細胞の総数における有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの多様度が高いことによって特徴づけられ、異常な状態は、細胞の総数における有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの数が少ないことによって特徴づけられる。
ヒトまたは動物の免疫系の細胞の数および多様度は非常に高くそのため小さな細胞サブセット以外の配列決定はほとんど不可能であったことから、以前は免疫系を広範に評価することが困難であった。本発明者らは、以前から利用可能であった方法よりも高い感度および特異性を提供しつつ半定量的な結果を生成する半定量PCR法（米国特許出願公開第20090253183号により詳細に記載される、アームPCR（arm-PCR））を開発した。この方法を免疫レパートリーのクロノタイプの相対数の検出に理想的なものにしているのは、この、特異性および感度を高めそれによって単一サンプル内の検出可能な標的の数を増やす能力である。本発明者らは、より最近になって、この配列決定法を使用することで個々の対象の免疫レパートリーを比較できることを発見し、それによって本発明の完成に至ったのである。本発明者らは、この方法を、例えば、正常、健康および無症候性とみられる対象ならびに様々な形態のがんを有すると診断された対象を評価するために使用し、本発明の方法を用いることで容易に検出できる免疫レパートリーの多様性の低下と、疾患の存在とが相関していることを実証した。したがってこの方法は、細胞数および生化学テストが現在の臨床実務において使用されているのと同様に、診断指標として有用であり得る。
免疫レパートリーのクロノタイプ（すなわち、クローン型）は、免疫系の免疫グロブリン（Ig）およびT細胞受容体（TCR）産生の初期段階における体細胞組み換えを通じた可変（V)、多様（D)および結合（J)遺伝子セグメントの再構成によって決定される。V(D)J再構成は、T細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ鎖からならびに免疫グロブリン重鎖（IgH）および軽鎖（IgK、IgL）から増幅および検出され得る。細胞は、例えば、末梢血、リンパ組織、がん組織またはその他の臓器および／もしくは臓器系の組織もしくは体液を取得することによって、患者から取得され得る。これらのサンプル（例えば血液サンプル）を取得する技術は、当業者に公知である。「クロノタイプを定量する」とは、本明細書で使用される場合、特定のクロノタイプに属する細胞の数を計数するか、またはその信頼できる近似値を取得することを意味する。細胞数は、PCR増幅および配列決定によって検出された配列の数から推定され得る。
約30〜90ヌクレオチドを含むCDR3領域は、その遺伝子の組み換えられた可変（V)、多様（D)および結合（J)セグメントの結合体を含む。これは、受容体の結合特異性をコードしており、特有のV(D)J再構成を同定するための配列タグとして有用である。
Wang et al.は、試料中の標的分子の数の定量的または半定量的評価の取得にPCRが使用され得ることを明らかにした（Wang, M. et al., "Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction," (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 86: 9717-9721）。定量的増幅を達成するのに特に効果的な方法は、以前に本発明者らによって報告されている。1つのそのような方法は、アームPCRとして公知であり、これは米国特許出願公開第20090253183A1号に記載されている。
本発明の局面は、T細胞、B細胞および／またはT細胞もしくはB細胞のサブセットからのCDR3のアームPCR増幅を含む。したがって細胞の「集団」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に細胞の「集団」または「亜集団」のいずれかと称されるものを含む。多量の増幅産物は、その後、例えば、454またはIllumina等のプラットフォームを用いる次世代配列決定を用いて効率的に配列決定され得る。選択された有意な割合が50%の場合、その数は「D50」と称され得る。D50は、その場合、サンプル内で計数された総TまたはB細胞の50パーセント（50%）を構成する優占的かつ特有のTまたはB細胞クローンの割合であり得る。例えば、高スループット配列決定の場合、D50は、総有効リードの50%を構成する、すべての特有のCDR3の中で最も優占的なCDR3の数であり得、総有効リードは、一連のエラーフィルターを通して選別することに成功した、同定可能なVおよびJ遺伝子セグメントを含む配列の数と定義される。
アームPCR法は、1回の反応で複数のポリヌクレオチドの高感度、半定量的な増幅を提供する。アームPCR法はまた、自動化された方法により閉鎖カセットシステム（iCubate（登録商標）、Huntsville、Alabama）内で実施され得、例えば様々なTおよびB細胞のレパートリーは非常に大きいのでこれは本発明において有益である。アームPCR法では、DNAポリメラーゼにより推進される反応において、当該反応に標的特異的プライマーが導入される結果として、標的の数が増加する。この増幅反応のさらなる結果は、共通プライマーに対する結合部位の導入であり、これはその後の増幅において第1アンプリコンセットを含む第1反応混合物の一部を共通プライマーを含む第2反応混合物に移すことによって使用される。「少なくとも1つの共通プライマー」は、本明細書で使用される場合、そのような結合部位に結合する少なくとも1つのプライマーを表し、これにはプライマー対、例えばフォワードおよびリバースプライマーが含まれる。この移行は、第1増幅反応から反応混合物の一部を回収し、そのサンプルを第2反応用チューブまたはチャンバーに導入するか、または完了した第1増幅から液体の一部を除去して一部を残し、第1増幅が行われたチューブに新しい試薬を添加するかのいずれかによって実施され得る。いずれの場合も、その後に、共通プライマーと共に追加の緩衝液、ポリメラーゼ等が添加され、検出用の増幅サンプルが生成され得る。共通プライマーを用いる標的分子の増幅は、半定量的な結果をもたらし、この間、第1増幅で増幅された定量的な数の標的は、共通の、標的特異的でないプライマーを用いて増幅され、それによって、有意に多い数の標的を検出用に生成することができ、かつ様々な再構成を含む細胞の、患者血液サンプル内での相対量を決定することができるようになる。また、第2反応混合物を第1反応混合物の一部と組み合わせることで、より高濃度の標的特異的プライマーを第1反応混合物に添加し、第1増幅反応においてより大きな感度を得ることができる。この特異性および感度の組み合わせこそが、アームPCR法等の方法の使用により定量的な結果を達成する能力と共に、診断に使用される多様性指数を生成するのに十分な感度ならびに細胞集団内のクロノタイプのタイプおよび数の定量的評価を実現するのである。
抗原認識に基づくクローナルな増殖は、その抗原を認識する細胞の大集団を形成し、それらの相対数による細胞評価は、抗原暴露が抗体産生B細胞または受容体保持T細胞の増殖に影響したかどうかを決定する方法を提供する。これは、例えば、特定の疾患を有すると診断された個体において頻出する特定の細胞集団が存在し得るかどうかを評価する助けとなり、特に、あるワクチンがそのワクチンを投与された個体において望ましい免疫応答を達成するかしないかを評価する助けとなり得る。
免疫系細胞の様々な領域を増幅および配列決定するためのプライマーが市販されており、かつ刊行物、例えば本発明者らによる公開された特許出願WO2009137255およびUS201000021896A1に記載されている。
市販されている高スループット配列決定技術は、Hoffman-LaRoche, Inc.の454（登録商標）配列決定システム等、いくつか存在する。454（登録商標）配列決定法においては、例えば、AおよびBアダプターが、PCRの間にPCR産物に連結されるかまたはPCR反応後にライゲートされるかのいずれかである。アダプターは、増幅および配列決定工程に使用される。アームPCR技術と組み合わせて行われる場合、AおよびBアダプターは、増幅反応において共通プライマー（「共用プライマー（communal primer）」または「スーパープライマー」と称されることもある）として使用され得る。AおよびBアダプターをサンプルライブラリ（例えば、PCRアンプリコン）に物理的に結合した後、当業者に公知の技術を用いて一本鎖DNAライブラリが調製される。一本鎖DNAライブラリは、特別設計されたDNA捕捉ビーズ上に固定される。各ビーズは、特有の一本鎖DNAライブラリ断片を保持する。ビーズに結合されたライブラリは、油中水混合物中で増幅試薬により乳化され、各々が1つの特有のサンプルライブラリ断片を有する1つのビーズのみを含むマイクロリアクタが生成される。特有のサンプルライブラリ断片は各々、競合または混入配列が排除されたそれぞれのマイクロリアクタ内で増幅される。全断片コレクションの増幅は、平行して行われる。これにより、各断片につき、ビーズあたり数百万のコピー数が得られる。その後、エマルジョンPCRは中断されるが、増幅された断片はそれらの個々のビーズに結合した状態で維持される。クローン増幅された断片は、配列決定のために濃縮されてPicoTiterPlate（登録商標）デバイスに投入される。PicoTiterPlate（登録商標）のウェルの直径は、ウェルあたり1つのみのビーズを収容するものである。配列決定酵素の添加後、配列決定機器の流体工学サブシステムは、個々のヌクレオチドを、決まった順で、各々1つのビーズを含む数十万個のウェルに流し込む。テンプレート鎖に相補的な1つ（または複数）のヌクレオチドが添加されると化学発光シグナルが生じ、これが機器内部のCCDカメラによって記録される。PicoTiterPlate（登録商標）デバイスを通じて生成されたシグナル強度および位置情報の組み合わせにより、ソフトウェアは、GS FLXシステムにおいて、各々最大約450塩基対の1,000,000超の個々のリードの配列を決定することができる。
定量的および／または半定量的方法を用いて配列を取得した後、例えばその患者サンプルで検出された総クローンの少なくとも約50%を構成するクローンの割合を決定することによって、D50を計算することが可能である。個々の患者で取得された数は正常な範囲と比較され得、その結果が、数量としておよび正常または異常な結果としての両方として報告され得る。これは、診断目的のさらなる臨床テストを医師に提供する。健康な個体、結腸癌患者および肺癌患者由来の患者サンプルの結果が以下の表1に示されている。これらの結果は、T細胞集団由来のものであり、8（年齢一致させた正常）〜10（結腸癌、肺癌）サンプルの結果の平均が示されている。
各数値は評価された集団において検出された配列の総数の約50パーセントを構成するクローンの割合を表しているので、上記の数値から、正常からの逸脱と表現される、免疫レパートリーの多様性の欠如が、診断テストパネルにおいて使用するのに有用な基準であり得ることが明らかである。本発明の方法は、特に本発明者らによって米国特許出願公開第201000291668A1号に記載されている自動化されたシステムにおいて使用される場合、複数の患者由来のサンプルの分析に使用され、増幅された標的配列の検出は1つまたは複数のマイクロアレイの使用によって実施され得る。
少なくとも1つのマイクロアレイを用いるハイブリダイゼーションも、個人の免疫レパートリーのD50を決定するのに使用され得る。そのような方法において、D50は、全ての可変遺伝子（Vおよび／またはJ遺伝子）由来の総シグナルの少なくとも50%を構成する最も優占的なVおよび／またはJ遺伝子の割合として算出される。
表2は、（8名の）正常、健康な個体および（20名の）慢性リンパ球性白血病の個体および（12名の）ループス患者の間の、D50によって明らかにされたB細胞の多様性の違いを示している。
最近、様々な研究所の研究者は、ヒトまたは動物内での微生物の多様性（「ミクロビオーム（microbiome）」）もまた、その健康状態がより不健康な状態に変化する際にシフトすることを報告している。例えば、微生物集団におけるシフトは、様々な胃腸障害、肥満、および糖尿病と関連する。Zaura et al.（Zaura, E. et al. "Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities." BMC Microbiology (2009) 9: 259）は、関連性のない健康な個体における細菌配列の大部分は一致しており、この部分は、経口疾患を有する個体においてシフトすることを報告している。アームPCR法は、高スループット配列決定と組み合わせることで、微生物集団の多様性を評価し、例えば、様々なヒトまたは動物組織における微生物D50値を得るための、比較的高速、高感度、特異的かつ半定量的な方法を提供する。アームPCRは、臨床サンプルから取得された混在集団内の細菌を同定するのに極めて有効であることが示されている。
患者サンプル
ヘパリンナトリウム中に回収された10名の肺癌患者および10名の結腸癌患者および10名の乳癌患者に由来する全血サンプル（40ml）を、Conversant Healthcare Systems（Huntsville, Alabama）から購入した。ヘパリンナトリウム中に回収された8名の正常対照サンプル由来の全血サンプル（40ml）を、ProMedDx（Norton, MA）から購入した。
ヘパリンナトリウム中に回収された10名の肺癌患者および10名の結腸癌患者および10名の乳癌患者に由来する全血サンプル（40ml）を、Conversant Healthcare Systems（Huntsville, Alabama）から購入した。ヘパリンナトリウム中に回収された8名の正常対照サンプル由来の全血サンプル（40ml）を、ProMedDx（Norton, MA）から購入した。
T細胞サブセットの単離
T細胞の単離は、各々のT細胞サブセットに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた超常磁性ポリスチレンビーズ（MiltenyiBiotec）を用いて行った。全血からFicollプレップによって単核細胞を取得し、そして抗CD14マイクロビーズを用いて単球を除去した。この単球枯渇単核細胞フラクションを、その後、個々のT細胞サブセットのフラクションの供給源として使用した。
T細胞の単離は、各々のT細胞サブセットに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた超常磁性ポリスチレンビーズ（MiltenyiBiotec）を用いて行った。全血からFicollプレップによって単核細胞を取得し、そして抗CD14マイクロビーズを用いて単球を除去した。この単球枯渇単核細胞フラクションを、その後、個々のT細胞サブセットのフラクションの供給源として使用した。
細胞傷害性CD8+ T細胞は、抗CD4マルチソートビーズ（MiltenyiBiotec）を用いるネガティブセレクションおよびその後の抗CD8ビーズを用いるポジティブセレクションによって単離した。CD4+ T細胞は、抗CD4ビーズを用いるポジティブセレクションによって単離した。抗CD25ビーズ（MiltenyiBiotec）を使用してCD4+CD25+制御性T細胞を選別した。単離された細胞集団はすべて、直ちにRNAprotect（Qiagen）中に再懸濁した。
RNAの抽出およびレパートリーの増幅
RNAの抽出は、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を製造元のプロトコルに従い用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いて配列特異的なネステッドプライマーのセット（フォワード・アウト、Fo；フォワード・イン、Fi；リバース・アウト、Ro；およびリバース・イン、Ri）を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー（FiおよびRi）に連結した。これらのタグ配列が最初の数サイクルの増幅においてPCR産物に組み込まれることで、共用プライマー対による指数関数的増殖フェーズが実行された。第1増幅ラウンドでは、配列特異的なネステッドプライマーのみを使用した。次いで、このネステッドプライマーをエキソヌクレアーゼ消化によって除去し、そして、共用プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによって、第1ラウンドのPCR産物を第2増幅ラウンドのテンプレートとして使用した。PCRプライマーによって、同じサンプル由来のアンプリコンに各々個別のバーコードタグを導入した。
RNAの抽出は、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を製造元のプロトコルに従い用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いて配列特異的なネステッドプライマーのセット（フォワード・アウト、Fo；フォワード・イン、Fi；リバース・アウト、Ro；およびリバース・イン、Ri）を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー（FiおよびRi）に連結した。これらのタグ配列が最初の数サイクルの増幅においてPCR産物に組み込まれることで、共用プライマー対による指数関数的増殖フェーズが実行された。第1増幅ラウンドでは、配列特異的なネステッドプライマーのみを使用した。次いで、このネステッドプライマーをエキソヌクレアーゼ消化によって除去し、そして、共用プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによって、第1ラウンドのPCR産物を第2増幅ラウンドのテンプレートとして使用した。PCRプライマーによって、同じサンプル由来のアンプリコンに各々個別のバーコードタグを導入した。
配列決定
異なるサンプル由来のバーコードタグ付アンプリコン産物を一箇所にプールし、2%アガロースゲルにロードした。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250〜500bp断片に対応するDNAバンドからDNA断片を精製した。DNAは、454 GS FLXシステムを用いてチタニウムキット（SeqWright, Inc.）により配列決定した。
異なるサンプル由来のバーコードタグ付アンプリコン産物を一箇所にプールし、2%アガロースゲルにロードした。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250〜500bp断片に対応するDNAバンドからDNA断片を精製した。DNAは、454 GS FLXシステムを用いてチタニウムキット（SeqWright, Inc.）により配列決定した。
配列決定データの分析
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがって整理した。配列の分類の後、Wang et al.（Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523）により報告されたアプローチと類似の様式で配列分析を行った。簡潔に説明すると、IMGTサーバ（http://www.imgt.org）からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、IRmapプログラムを用いて配列リード上にマップした。参照配列においてCDR3領域を定義する境界を、マッピング情報を通じて配列リードに反映させた。配列リードに内包されるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがって整理した。配列の分類の後、Wang et al.（Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523）により報告されたアプローチと類似の様式で配列分析を行った。簡潔に説明すると、IMGTサーバ（http://www.imgt.org）からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、IRmapプログラムを用いて配列リード上にマップした。参照配列においてCDR3領域を定義する境界を、マッピング情報を通じて配列リードに反映させた。配列リードに内包されるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
Claims (8)
- 個体の正常な免疫状態または異常な免疫状態を同定する方法であって、
（a）患者サンプル中の免疫系細胞の集団または亜集団内の免疫系細胞のクロノタイプを定量する工程；
（b）該集団または該亜集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程
を含み、ここで、正常な免疫状態は、細胞の総数における該有意な割合によって表されるクロノタイプの多様性が高いことによって特徴づけられ、異常な免疫状態は、細胞の総数における該有意な割合によって表されるクロノタイプの数が有意に少ないことによって特徴づけられる、方法。 - 前記有意な割合が、約25〜約75から選択されるパーセント値である、請求項1記載の方法。
- 前記有意な割合が50パーセントである、請求項1記載の方法。
- 50パーセントが、C/S x 100によって決定され、式中、Cは、前記細胞集団から単離されたポリヌクレオチドの増幅および配列決定後に得られる総配列リードの50パーセント以上に達する別個のクロノタイプの最小数である、請求項4記載の方法。
- 前記細胞集団が、全T細胞［汎T］、CD8+ T細胞［細胞傷害性T（Tc）］、CD4+ T細胞およびそれらのサブセット［TH1、TH2、TH17、制御性T（Treg）、濾胞性T（TFH）］、ナイーブT（Tn）、活性化T（Ta）、記憶T（Tm）、全B細胞（汎B）、ナイーブB（Bn）、活性化B（Ba）、記憶B（Bm）、形質B細胞および形質芽球B細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 免疫レパートリーの多様性のレベルを評価する方法であって、
（a）標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中でヒトまたは動物対象由来の白血球細胞の集団からポリヌクレオチドを増幅して第1アンプリコンセットを生成する工程であって、標的特異的な該ネステッドプライマーの少なくとも一部が、増幅時に、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を第1アンプリコンに組み込むためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含む、工程；
（b）第1アンプリコンを含む第1反応混合物の一部を、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2反応混合物に移す工程；
（c）少なくとも1つの共通プライマーを用いて第1アンプリコンを増幅し、第2アンプリコンセットを生成する工程；
（d）第2アンプリコンを配列決定して白血球細胞の亜集団におけるV(D)J再構成配列を同定する工程；
（e）同定されたV(D)J再構成配列を使用して免疫系細胞の集団内の細胞の総数および該集団内で同定された各クロノタイプごとの細胞の総数の両方を定量する工程；ならびに
（f）該集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程
を含み、ここで、正常な状態は、細胞の総数における該有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの多様度が高いことによって特徴づけられ、異常な状態は、細胞の総数における該有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの数が少ないことによって特徴づけられる、方法。 - 前記有意な割合が、約25〜約75のパーセント値である、請求項6記載の方法。
- 前記有意な割合が約50パーセントである、請求項6記載の方法。
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