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JP2008501658A - 非ヒトｔｎｆ−ペプチドの担体コンジュゲートの医学上の使用 - Google Patents

非ヒトｔｎｆ−ペプチドの担体コンジュゲートの医学上の使用 Download PDF

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JP2008501658A
JP2008501658A JP2007513854A JP2007513854A JP2008501658A JP 2008501658 A JP2008501658 A JP 2008501658A JP 2007513854 A JP2007513854 A JP 2007513854A JP 2007513854 A JP2007513854 A JP 2007513854A JP 2008501658 A JP2008501658 A JP 2008501658A
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seq
tnf
protein
amino acid
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JP2007513854A
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マルチン， エフ． バッハマン，
パトリック マオラー，
ギュンター シュポーン，
Original Assignee
サイトス バイオテクノロジー アーゲー
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Publication date
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Abstract

本発明は、分子生物学、ウイルス学、、免疫学および医学の分野に関連する。本発明は、自己免疫疾患および骨関連疾患の治療および免疫応答、特に抗体応答を効率よく誘導するためのワクチンの産生における使用のための、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)およびそれらに結合するＴＮＦスーパーファミリーのポリペプチド由来の特定のペプチドを含有する修飾されたＶＬＰを提供する。さらに本発明の組成物は、特に本明細書中に挙げる自己特異性免疫応答を効率よく誘導するために有用である。

Description

(発明の背景)
発明の分野
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、特に、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と、それらに結合するＴＮＦスーパーファミリーのポリペプチド由来の少なくとも一の特定のペプチドを含んでなる修飾ウイルス様粒子(ＶＬＰ)に関する。また、本発明は修飾ＶＬＰの産生方法にも関する。本発明の修飾ＶＬＰは、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のため、および免疫応答、特に抗体応答を効率的に引き起こすためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は特に、本明細書中の自己特異的免疫応答を効率的に誘導するために有用である。
(関連技術)
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)ファミリのメンバーは、発達および免疫系の機能に重要な役割を果たす(F.MackayおよびS.L.Kalled, Current Opinion in Immunology, 14: 783-790 (2002))。大多数のこれらのメンバーは、重要な免疫機能の強力なモジュレータであって、自己免疫性疾患に至る病原性メカニズムに関与する。例えば、ＴＮＦαの調節が変化すると、免疫寛容の破壊および自己免疫性疾患の発達が起こりうる。一方、例えば、ＲＡＮＫＬは、ＴおよびＢ細胞免疫寛容を制御して、自己免疫状態の組織破壊に関与する新規な機能を有することが明らかとなった(F.MackayおよびS.L.Kalled, Current Opinion in Immunology, 14: 783-790 (2002))。
一般的に、自己抗原に対する抗体応答を誘発することは困難である。ワクチン接種の効率を改善する一つの方法は、用いる抗体の反復程度を増やすことである。単離したタンパク質とは異なって、ウイルスはＴ細胞の援助がある時でもないときでも任意のアジュバントの不在下にて即時的な効率のよい免疫応答が誘導される(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1991))。ウイルスの多くはわずかなタンパク質からなるにもかかわらず、それらの単離した成分よりもより強い免疫応答の誘因となりうる。Ｂ細胞応答について、ウイルスの免疫厳正の重要な一因子は表面上エピトープの反復と配列であることが知られている。多くのウイルスはＢ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンと効率よく架橋する一定のエピトープ配列を表示する類似の結晶性表面を提示している(Bachmann及びZinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996))。このＢ細胞上の表面免疫グロブリンの架橋は細胞周期の進行及びＩｇＭ抗体の産生を直接的に誘導する強い活性化シグナルである。さらに、このように引き起こされたＢ細胞はヘルパーＴ細胞を活性化することができ、それによって次に、ワクチン接種の目標である、Ｂ細胞でのＩｇＭからＩｇＧ抗体産生の転換と長く残るＢ細胞メモリーの生成が起こる(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。ウイルス構造は、自己免疫疾患の抗-抗体の生成と病原体への自然な応答の一部にも関連している(Fehr, T., 等, J Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)を参照)。ゆえに、非常に体系化されたウイルス表面によって提示される抗原は抗原に対する強い抗体応答を誘導することができる。
記載したように、通常免疫系は自己由来の構造に対して抗体を生成することはない。低濃度で存在する可溶性抗原はＴｈ細胞レベルでの耐性によるものである。この条件下で、Ｔヘルプを運搬しうる担体に自己抗原を結合すると寛容性が壊れうる。可溶性タンパク質が高濃度であるか膜タンパク質が低濃度であるためにはＢ及びＴｈ細胞が寛容でありうる。しかしながら、Ｂ細胞の寛容性は可逆的(無反応)であり、外来性の担体に結合した非常に体系化された様式の抗体の投与により破壊されうる(Bachmann及びZinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。
近年、ＴＮＦファミリー由来の自己抗原に対する予防接種の方法は、例えば国際公報９５／０５８４９、国際公報００／２３９５５、国際公報０２／０５６９０５および国際公報０３／０３９２２５において開示されている。これらの特許出願の多くに開示されるワクチンは、ＴＮＦファミリー由来の自己抗原が接着する担体タンパク質、特にウイルス様粒子(ＶＬＰ)を含有する。しかしながら、マウスタンパク質由来のタンパク質またはペプチドを含有する予防接種ワクチンによる自己耐性または無知(ignorance)を破壊する概念を確認するために、疾患のマウスモデルにおいて試験された(例えば国際公報００／２３９５５を参照)。あるいは、マカクタンパク質由来のタンパク質またはペプチドを含有するワクチンは、マカクにおいて試験された(国際公報００／２３９５５を参照)。ゆえに、示唆は、自己寛容を破壊するためにワクチン接種を受けなければならない多くの種のタンパク質から得られるペプチドを用いることが示唆される。したがって、ヒト疾患を治癒するために、ヒトのためのワクチンが対応するヒトのタンパク質又はペプチドから成ることが考えられる。
(発明の概要)
驚くべきことに、本発明者等は、非ヒト、特にマウス、ネコまたはイヌのＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ここでは特にＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬに対して誘導された抗体が、それぞれのヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーとそのヒトレセプターとの結合を阻害することができることを発見した。
したがって、非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーを用いた予防接種によって、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の中でＴＮＦスーパーファミリーのメンバーが関与するいくつかのヒト疾患および疾病の治療方法が提供される。
さらに、本発明者等は、非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーを用いた予防接種に特に有用なエピトープ同定した。特にある非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーのＴＮＦ様ドメインの特定のＮ末端領域に対する抗体は、それぞれのヒトのＴＮＦスーパーファミリーのメンバーに対して予想外に有効である。したがって、本発明は自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のための予防的治療的方法を提供するものであり、この方法はコア粒子に結合された特定の非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバー由来のペプチドの投与、特にＶＬＰ-ＴＮＦスーパーファミリーメンバー由来のペプチドコンジュゲートおよび特に順序や反復配列に基づく。本発明の好適な非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバー由来のペプチドは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８に相同または同一なペプチド配列を含有する。この予防的および治療的組成物は、予防接種したヒトにおいて高力価の抗ＴＮＦスーパーファミリーメンバー抗体を誘導することができる。
記載したように、コア粒子に共役した非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーに由来するペプチド断片が用いられ、アジュバントの有無にかかわらず、ヒトにおいてＴＮＦスーパーファミリーメンバー特異的な抗体を誘導するために選択的に投与されうる。
したがって、非ヒトＴＮＦ-スーパーファミリ-メンバー由来のペプチド、Ｃ-末端又はＮ-末端の何れかがコア粒子、好ましくはウイルス様粒子(ＶＬＰ)に共役しているものは、疾患又は疾病関連の病状に不必要な効果を及ぼす前に、一般的にヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーの機能を中和することができる非常に特異的な抗ＴＮＦスーパーファミリーメンバー抗体を誘導することができる。
本発明者等は、コア粒子、または好ましくはＶＬＰにＣ末端またはＮ末端的に結合した本発明の非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバー由来のペプチドを用いた予防接種により産生された抗体が、それぞれのヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合することができることを発見した。したがって、本発明は、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療として、疾患に伴われるＴＮＦスーパーファミリーメンバーに対する予防接種方策に着目する。
本明細書、特に実施例１および６に示すように、本発明のコア粒子または好ましくはＶＬＰにＣ末端またはＮ末端的に結合したＴＮＦαペプチド、特にＮ末端的に結合したＴＮＦαペプチドにより、ＴＮＦαのタンパク質型、特にヒト型に結合しうる抗体が誘導される。さらに、特に実施例７に示すように、コア粒子または好ましくはＶＬＰにＣ末端またはＮ末端的に結合したＲＡＮＫＬペプチド、特にＮ末端的に結合したＲＡＮＫＬペプチドを用いた予防接種により、ＲＡＮＫＬのタンパク質型、特にヒト型に結合しうる抗体が誘導される。ＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬそれぞれを標的とする抗体は、それぞれ自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の潜在的な治療法である。
また、本発明は、本発明のまたは本発明の組成物のまたは本発明の医薬組成物の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰの、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のための医薬の調整のための使用に関する。治療は治療的処置またはあるいは予防的処置であることが好ましい。好適な自己免疫性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、自己免疫甲状腺病、自己免疫肝炎、乾癬又は乾癬の関節炎である。好適な骨関連の疾患は、骨粗鬆症、歯周炎、周囲補綴骨変性、骨転移、骨癌疼痛、パジェット病、多発性骨髄腫、シェーグレン症候群および原発性胆管萎縮症である。
したがって、更なる態様では、本発明は、(ａ) ウイルス様粒子(ＶＬＰ)および、(ｂ) 保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８に相同なペプチド配列、好ましくは保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜８に相同なペプチド配列、より好ましくは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１１に相同なペプチド配列、さらにより好ましくは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１３に相同なペプチド配列を含んでなる少なくとも一つの非ヒトＴＮＦ-ペプチドを含有する本発明の修飾ＶＬＰを被検体に、好ましくはヒトに投与することによって自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患方法を提供するものであり、ここで、ａ)およびｂ)は互いに連結しており、好ましくは、自己免疫性疾患または骨関連の疾患は、(ａ) 乾癬；(ｂ)関節リウマチ；(ｃ)多発性硬化症；(ｄ)糖尿病；(ｅ)骨粗鬆症；(ｆ)強直性脊椎炎；(ｇ)アテローム性動脈硬化；(ｈ)自己免疫肝炎；(ｉ)自己免疫甲状腺疾患；(ｊ)骨癌疼痛；(ｋ)骨転移；(ｌ)炎症性腸疾患；(ｍ)多発性骨髄腫；(ｎ)重症筋無力症；(ｏ)心筋炎；(ｐ)パジェット病；(ｑ)歯周病；(ｒ)歯周炎；(ｓ)周囲補綴骨変性；(ｔ)多発性筋炎；(ｕ)原発性胆管萎縮症；(ｖ)乾癬の関節炎；(ｗ)シェーグレン症候群；(ｘ)スティル病；(ｙ)全身性エリテマトーデス；および、(ｚ)血管炎からなる群から選択されるものである。
他の態様では、本発明はさらに、本発明の修飾ＶＬＰの、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のための医薬の製造における使用を提供するものであり、ここで、好ましくは自己免疫性疾患または骨関連の疾患は、(ａ) 乾癬；(ｂ)関節リウマチ；(ｃ)多発性硬化症；(ｄ)糖尿病；(ｅ)骨粗鬆症；(ｆ)強直性脊椎炎；(ｇ)アテローム性動脈硬化；(ｈ)自己免疫肝炎；(ｉ)自己免疫甲状腺疾患；(ｊ)骨癌疼痛；(ｋ)骨転移；(ｌ)炎症性腸疾患；(ｍ)多発性骨髄腫；(ｎ)重症筋無力症；(ｏ)心筋炎；(ｐ)パジェット病；(ｑ)歯周病；(ｒ)歯周炎；(ｓ)周囲補綴骨変性；(ｔ)多発性筋炎；(ｕ)原発性胆管萎縮症；(ｖ)乾癬の関節炎；(ｗ)シェーグレン症候群；(ｘ)スティル病；(ｙ)全身性エリテマトーデス；および、(ｚ)血管炎からなる群から選択されるものである。
本発明による使用のための修飾コア粒子および特に修飾ＶＬＰは、(ａ) コア粒子および好ましくはＶＬＰと、(ｂ) 保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８に相同なペプチド配列、好ましくは保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜８に相同なペプチド配列を含んでなる少なくとも一つのペプチド(ＴＮＦ-ペプチド)を含有、あるいはからなるものであり、このａ)およびｂ)は互いに連結している。
本発明の好ましい実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、４、５ないしは６〜５０のアミノ酸残基長の、好ましくは４、５ないしは６〜４０のアミノ酸残基長の、より好ましくは４、５ないしは６〜３０のアミノ酸残基長の、さらにより好ましくは４〜２０のアミノ酸残基長の、さらにより好ましくは４、５ないしは６〜１８のアミノ酸残基長の、そして、さらにより好ましくは４、５ないしは６〜１６のアミノ酸残基長の、そして、さらにより好ましくは４、５ないしは６〜１３のアミノ酸残基長の、そして、さらにより好ましくは４、５ないしは６〜１１のアミノ酸残基長のペプチドからなる。
本発明に用いられる組成物は、(ａ)少なくとも一つの第一付着部位を有するコア粒子；と、(ｂ)少なくとも一つの第二付着部位を有する少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を含有してもよく、該抗原又は抗原決定基は、本発明の非ヒトＴＮＦスーパーファミリーメンバー由来のペプチド（本明細書ではＴＮＦペプチドと称する）であり、該第二付着部位は(ｉ)該抗原又は抗原決定基によって天然に生じない付着部位；および、(ｉｉ)該抗原又は抗原決定基によって天然に生じる付着部位からなる群から選択されるものであって、該第二付着部位は該第一付着部位に対合が可能であり；そして、該抗原又は抗原決定基および該コア粒子は該対合を介して相互作用し、好ましくは規則的で反復性の抗原配列(アレイ)を形成する。本発明の使用に好適なコア粒子の好ましい実施態様は、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、バクテリオファージ、ＲＮＡ-ファージのウイルス様粒子、細菌性線毛ないしは鞭毛又は固有の反復性構造を有する任意のコア粒子、好ましくは、本発明の規則的な反復性抗原配列を形成しうる反復性構造である。
より具体的に、本発明は、本発明の使用のために、ウイルス様粒子とそれに結合する本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドを含んでなる修飾ＶＬＰを提供する。また、本発明は本発明の修飾ＶＬＰの産生方法を提供する。本発明の修飾ＶＬＰおよび組成物は、自己免疫性疾患と骨関連の疾患の治療のためのワクチンの産生、および、自己免疫性疾患および骨関連の疾患を予防するかまたは治癒させる医薬として、および、免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘発するために有用である。さらに、本発明の修飾ＶＬＰおよび組成物は、記載した内容の範囲内で自己特異的な免疫応答を効率的に誘発するために有用である。
本発明において、本発明のＴＮＦペプチドは、好ましくは規則的に反復したＴＮＦペプチド抗原配列を産生する適した方法で、コア粒子およびＶＬＰそれぞれに結合する。さらに、コア粒子およびＶＬＰの反復性が高く、組織化された構造はそれぞれ、非常に組織化されて反復性の抗原配列となる非常に規則的かつ反復性の様式でＴＮＦペプチドのディスプレイを媒介しうる。さらに、コア粒子およびＶＬＰは、コア粒子-ＴＮＦペプチド配列とＶＬＰ-ＴＮＦペプチド配列それぞれによって免疫化される宿主とは合わないので、コア粒子およびＶＬＰへの本発明のＴＮＦペプチドの結合はそれぞれ、何か理論に基づくものではないが、Ｔヘルパー細胞エピトープを提供することによって機能しうる。好適な配列は、特にそれらの非常に組織化された構造、寸法、および、配列の表面上の抗原の反復において、従来技術コンジュゲートと異なる。
本発明の一態様では、本発明のＴＮＦペプチドは好適な発現宿主において発現されるか、合成され、コア粒子およびＶＬＰはそれぞれ発現されて、コア粒子およびＶＬＰそれぞれのフォールディングおよび集積に好適な発現宿主から精製される。本発明のＴＮＦペプチドは化学的に合成されてもよい。次いで、本発明のＴＮＦペプチド配列はコア粒子およびＶＬＰそれぞれに対する本発明のＴＮＦペプチドの結合によって集積される。
好適な実施態様では、本発明は、(ａ)ウイルス様粒子、および(ｂ)本発明の少なくとも一のＴＮＦペプチドを含んでなる修飾ＶＬＰを提供するものであり、本発明の該ＴＮＦペプチドは本発明の使用のために該ウイルス様粒子に結合されているものである。
更なる態様では、本発明は、本発明の使用のために、(ａ)修飾コア粒子、医薬組成物の場合には特に修飾ＶＬＰ、および(ｂ)受容可能な製剤的担体を含んでなる組成物および医薬組成物を提供するものである。
更なる態様では、本発明は、(ａ)ウイルス様粒子、および(ｂ)本発明の少なくとも一のＴＮＦペプチドを含んでなる医薬組成物、好ましくはワクチンを提供するものであり、本発明の該ＴＮＦペプチドは、本発明の使用のために、該ウイルス様粒子に結合されるものである。
より更なる態様では、本発明は、(ａ)ウイルス様粒子を提供すること；および(ｂ)本発明の少なくとも一のＴＮＦペプチドを提供すること；(ｃ)本発明の該ウイルス様粒子と該ＴＮＦペプチドを組み合わせて、特にＶＬＰとＴＮＦペプチドとの結合を媒介するのに適した条件下にて該ＴＮＦペプチドを該ウイルス様粒子に結合させることを含む、本発明の修飾ＶＬＰの産生方法を提供する。
同じように、本発明は、(ａ)少なくとも一つの第一付着部位を有するコア粒子を提供すること；(ｂ)少なくとも一つの第二付着部位を有する本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドを提供すること、このときの該第二付着部位は(ｉ)本発明の該ＴＮＦペプチドによって天然に生じない付着部位；および(ｉｉ)本発明の該ＴＮＦペプチドによって天然に生じる付着部位からなる群から選択されたものであり；該第二付着部位が該第一付着部位への対合が可能である；(ｃ)本発明の該コア粒子と該ＴＮＦペプチドの少なくとも一つを組み合わせること、このときの本発明の該ＴＮＦペプチドおよび該コア粒子は該対合を介して相互作用し、本発明の使用のために好ましくは規則的で反復性の抗原配列(アレイ)を形成することを含む、本発明の修飾コア粒子の産生方法を提供する。
他の態様では、本発明は、本発明の修飾ＶＬＰ、組成物または医薬組成物がヒトに投与されることを含む、免疫化の方法を提供する。
本発明の修飾ＶＬＰ、組成物または医薬組成物は自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のための医薬の製造に用いる。
より更なる態様では、本発明は、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療的処置または予防的処置のための医薬の製造における本発明の修飾ＶＬＰ、組成物または医薬組成物の使用を提供する。さらに、より更なる態様では、本発明は、自己免疫性疾患および骨関連の疾患の治療または予防のための組成物、ワクチン、薬剤または医薬の製造における、および／またはヒト免疫系を刺激するための、本発明の修飾ＶＬＰ、組成物または医薬組成物の単独使用あるいは他の薬剤と組み合わせての使用を提供する。
したがって、本発明は、自己免疫を破壊するために十分な用量のワクチン組成物が投与されることを含む、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患ないしはそれに関する症状の治療方法において、上記の疾患および疾病を予防するおよび／または減退させるないしは治癒するのに適したワクチン組成物を特に提供する。さらに、本発明は、動物の、特にネコやイヌなどの愛玩動物並びにヒトの自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患ないしはそれに関する症状を予防するおよび／または減退させるないしは治癒するための、免疫化方法および予防接種方法をそれぞれ提供する。本発明は、予防的または治療的に用いられうる。
具体的な実施態様では、本発明は、「自己」遺伝子産物、すなわち本明細書では「自己抗原」によって生じるまたは悪化する自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患ないしはそれに関する症状を予防する、治癒するおよび／または軽減するための方法を提供する。関連の実施態様では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって生じるまたは悪化する自己免疫性疾患および骨関連の疾患ないしはそれに関する症状を予防する、治癒するおよび／または軽減する抗体の産生を引き起こす、動物および個体それぞれの免疫学的応答を誘発する方法を提供する。
本発明の目的、すなわちヒトの自己寛容を破壊するために本発明の非ヒトＴＮＦペプチドを使用することが、他の動物においても同様に実施可能であることは、当業者に理解されるであろう。例えば、本発明のペプチドに対応する「非イヌ」ＴＮＦペプチドは、イヌのＴＮＦファミリーメンバーそれぞれに対する自己寛容を破壊するために用いることができ、または、本発明のペプチドに対応する「非ネコ」ＴＮＦペプチドは、ネコのＴＮＦファミリーメンバーそれぞれに対する自己寛容を破壊するために用いることができる。ゆえに、ある実施態様では、本発明は、一般的に動物の自己寛容を破壊するための本発明の非自己ＴＮＦペプチドの使用に関する。次いで、「非ヒト」なる用語は、「非自己」なる用語で置き換えてもよい。しかしながら、「非ヒト」なる用語は、「ヒト以外」、例えばホモサピエンス由来でない(ポリ)ペプチド配列を意味するのが好ましい。
通常の当業者が理解されるように、本発明の組成物が動物またはヒトに投与される場合、組成物の有効性を向上するために適する塩類、バッファ、アジュバンドまたは他の物質を含有する組成物中にあってもよい。医薬組成物の調製に使用するために適する物質の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, 編集, Mack Publishing Co. (1990))を含む多くの出典に示される。
投与されてレシピエント個体に許容される場合、本発明の組成物は「製薬的に許容可能」であると言える。さらに、本発明の組成物は「治療的有効量」(すなわち、所望の生理学的効果が生じる量)で投与されるであろう。
本発明の組成物は、当分野で公知の様々な方法によって投与されてもよいが、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な物理的な方法によって通常投与される。あるいは、組成物は、筋内、静脈内または皮下に投与されてもよい。投与のための組成物の成分は、無菌水（例えば生理食塩液）ないしは非水溶液および懸濁液とが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。担体または閉鎖包帯を用いると、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるのことができる。
本発明の他の実施態様は当分野で公知のもの、以下の本発明の説明、および特許請求の範囲を考慮して、通常の当業者に明らかであろう。
(発明の詳細な説明)
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同等あるいは均等である任意の方法および物質を、本発明を実施又は試験する際に使用することができるが、好適な方法および物質は、本明細書で以下に記載する。
１．定義
アジュバント：本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチンおよび薬剤組成物のそれぞれと組み合わせると、より亢進した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。様々なアジュバントが用いられうる。例として、完全および不完全なフロイントアジュバント、アルミニウム水酸化物および修飾ムラミルジペプチドなどがある。更なるアジュバントは、ミネラルゲル、例えば酸化アルミニウム三水和物、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ (ウシ型弱毒結核菌ワクチン)およびコリネバクテリウムパルバムである。このようなアジュバントも当分野で公知である。本発明の組成物とともに投与されうる更なるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ-２１、ＱＳ-１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類(ミョウバン)、ＭＦ-５９、ＯＭ-１７４、ＯＭ-１９７、ＯＭ-２９４およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術が含まれるが、これらに限定するものではない。また、アジュバントは、これらの物質の混合物を含んでもよい。
南米の木キラヤ属サボンソウ属モリナの樹皮から得られるアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画は、当分野において周知である。例えば、ＱＳ２１(別名ＱＡ２１)はキラヤ属サボンソウ属モリナ木のＨｐｌｃ精製分画であり、その産生方法は米国特許第５,０５７,５４０号において(ＱＡ２１として)開示される。また、キラヤサポニンはScott 等, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409によってアジュバントとして開示された。モノスホリルリピドＡおよびその誘導体は当分野において周知である。好適な誘導体は、３ｄｅ-ｏ-アシル化モノホスホリルリピドＡであって、英国特許第２２２０２１１号から知られている。更なる好適なアジュバントは国際公報００／００４６２において記述されており、その開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
しかしながら、本発明の有益な特徴は、アジュバントがない場合においてさえ、本発明の修飾コア粒子の免疫原性が高いことにある。既に本明細書で概説したかあるいは以降の明細書にて明らかになるように、アジュバントを欠いたワクチンおよび医薬組成物が提供され、更なる代替又は好適な実施態様においては、結果として、アジュバントを欠いているためにアジュバントが引き起こしうる副作用がないので優れた安全性性質を有する、自己免疫性疾患および骨関連の疾患の治療のためのワクチンおよび医薬組成物が導かれる。本明細書中で自己免疫性疾患および骨関連の疾患の治療のためのワクチンおよび医薬組成物の文脈において用いられる「欠く」なる用語は、基本的にアジュバントなしで、好ましくは検出可能な量のアジュバントを含まないで用いられるワクチンおよび医薬組成物を意味する。
アミノ酸リンカー：本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」、又は本明細書中で単に「リンカー」と呼ばれるものは、本発明のＴＮＦペプチドを第二付着部位と会合させるか、あるいは、必ずしもではないが典型的には、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として、既に第二付着部位からなっているか、あるいはそれを含むことがより好ましい。しかしながら、本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを、示すことを目的とするものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。しかしながら、スルフヒドリル基又はシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明内に含まれる。このような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分を好ましくは含み、任意のアミノ酸を欠いているリンカーも、本発明内に含まれるものとする。本発明のＴＮＦペプチド、又は場合によっては第二付着部位と、アミノ酸リンカーの間の会合は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
動物：本明細書で使用するように、「動物」という用語は、たとえばヒト、ヒツジ、エルク、シカ、ミュールジカ、ミンク、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、また鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類、昆虫、および蛛形網を含むことを意味する。好適な動物は脊椎動物であり、より好適な動物は哺乳動物であり、さらにより好適な動物は真獣類綱である。
抗体：本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、エピトープ又は抗原決定基と結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含めた、すべての抗体およびそれらの抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はヒト抗原結合抗体断片であることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ(ａｂ’)２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、およびＶＬ又はＶＨドメインを含む断片だけには限られないが、これらを含む。抗体は、鳥類および哺乳動物を含めた、任意の動物起源のものであってよい。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ラット、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、あるいは、たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等による米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されたような、１つ又は複数の免疫グロブリンの遺伝子が導入され、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体(ＴＣＲ)によって結合することができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系によって認識することができ、及び／又は、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に与えられることを必要とする可能性がある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ(ＢおよびＴ細胞エピトープ)を有することができる。前述の特異的反応は、抗原は、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことが示されることを意味する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。好適な抗原、したがって好適なＴＮＦペプチドはＴ細胞応答が起こらない短い(４〜８アミノ酸残基、好ましくは６〜８アミノ酸残基)ペプチド(Ｂ細胞エピトープのみ)である。
抗原決定基：ここで用いる「抗原決定基」なる用語は、Ｂ又はＴリンパ球によって特異的に認識される抗原の、その一部分を指すことを意味する。抗原決定基に応答したＢリンパ球は抗体を産生し、一方Ｔリンパ球は細胞性免疫及び／又は体液性免疫の媒介に重要なエフェクター機能の核酸や構築によって抗原決定基に応答する。
会合(association)：ここで用いる第一および第二の付着部位に適用する際の「会合」なる用語は、好ましくは少なくとも一非ペプチド結合によるものである第一付着部位と第二付着部位の結合を指す。会合の性質は共有性、イオン性、疎水性、極性、又はこれらの何れかの組合せであってよく、好ましくは会合の性質は共有性である。
第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、本発明のＴＮＦペプチド上に位置する第二付着部位が会合しうる非天然又は天然起源の要素を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位は、典型的かつ好ましくは、好ましくはウイルス様粒子などのコア粒子の表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、コア粒子およびウイルス様粒子それぞれの表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位が、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のぺぷちど結合を介してＶＬＰと会合する。更なる好適な実施態様では、第一付着部位はＶＬＰに天然に生じている。あるいは、好適な実施態様では、第一付着部位は人工的にＶＬＰに付加されている。
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、コア粒子およびウイルス様粒子それぞれの表面上に位置する第一付着部位が会合することができる、本発明のＴＮＦペプチドと関係がある構成成分を指す。ＴＮＦペプチドの第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。本発明のある実施態様では、少なくとも１つの第二付着部位が本発明のＴＮＦペプチドに付加されてもよい。したがって、「少なくとも１つの第二付着部位を有する本発明のＴＮＦペプチド」なる用語は、少なくとも１つの本発明のＴＮＦペプチドおよび第二付着部位を含む、本発明のＴＮＦペプチドを指す。しかしながら、特に、非天然起源である、すなわち本発明のＴＮＦペプチド内に本来存在しない第二付着部位に関しては、これらの本発明の修飾されたＴＮＦペプチドは、「アミノ酸リンカー」も含む。
結合(bound)：本発明で同等に用いられる「結合(bound)」並びに「連結(linked)」なる用語は、共有、たとえば化学的結合、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などによるものである結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、たとえばチオエーテル、炭素−リン結合などであってよい。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位とは、(i)少なくとも一の共有結合、又は(ii)少なくとも一の非ペプチド結合、好ましくは少なくとも一の共有非ペプチド結合、さらにより好ましくは単に非ペプチド結合、さらに好ましくは単に非ペプチド結合と共有結合を介して連結する。しかしながら、本明細書中で用いられる「連結(linked)」なる用語は、少なくとも一のＴＮＦペプチドとウイルス様粒子との直接連結だけでなく、あるいは好ましくは、中間分子、および典型的に好ましくは少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤によって、少なくとも一のＴＮＦペプチドとウイルス様粒子との間接連結も含みうる。さらに、本明細書中で用いられる「連結(linked)」なる用語は、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との直接連結だけでなく、あるいは好ましくは、中間分子、および典型的に好ましくは少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤によって、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との間接連結も含みうる。
コート・タンパク質：ここで用いる「コート・タンパク質」なる用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、「ＣＰ」なる用語を使用する。たとえば、ＲＮＡファージＱβのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼び、一方でバクテリオファージＱβの「コート・タンパク質」は、「ＱβＣＰ」並びにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコート・タンパク質は、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
コア粒子：本明細書中で「コア粒子」なる用語は、固有の反復性の構成を有する剛性構造を指す。本明細書中のコア粒子は合成工程の産物または生物的工程の産物であってよい。
有効量：本明細書で使用するように、「有効量」なる用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要あるいは十分量を指す。組成物の有効量は、この選択した結果を得る量であると思われ、このような量は当業者により常套法にて決定することができると思われる。たとえば、免疫系不全を治療するのに有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露により抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であると思われる。この用語は、「十分量」とも同義である。
任意の個々の適用例に関する有効量は、治療する疾患又は状態、投与される個々の組成物、被験体の大きさ、及び／又は疾患又は状態の重度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
エピトープ：ここで用いる「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒト中で、抗原又は免疫活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的一部分を指す。エピトープはＭＨＣ分子の関係でそのＴ細胞レセプターを介して抗体又はＴ細胞により認識される。ここで用いる「免疫原生エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される(たとえば、Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3998-4002(1983)を参照のこと)、動物の抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、タンパク質の一部分として定義し、抗体はその抗原に免疫特異的に結合することができる。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原性エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞レセプターによって免疫特異的に結合させることができる。
エピトープは、空間構造中に３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般にエピトープは、少なくとも約４個のこのようなアミノ酸からなり、少なくとも約４、５、６、７、８、９ないしは１０個のこのようなアミノ酸からなることがより普通である。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニルと同じくらい小さくてよい。好適なエピトープは、Ｂタイプエピトープと思われる本発明のＴＮＦペプチドである。
融合(fusion)：ここで用いる「融合」なる用語は、コード化ヌクレオチド配列をイン・フレームで組み合わせることによる、一つのポリペプチド中の異なる起源のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」なる用語は、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入、さらにその末端の一端への融合を明確に含む。
ＴＮＦスーパーファミリーメンバー：本明細書中で用いられる「ＴＮＦスーパーファミリーメンバー」なる用語は、ＴＮＦ様ドメインを含有するタンパク質を指す。本明細書中で用いられる「ＴＮＦスーパーファミリーメンバー」には、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ラット、一般的には真獣類、一般的には哺乳類、並びに他の動物で公知のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのすべての形態が含まれる。基本のメンバーＴＮＦの構造は、Ｘ線結晶学を用いた２．９オングストロームの解像度に則した。タンパク質は、三量体、各々がアンチパラレルβ-サンドイッチからなるサブユニットである。新規のβシートのエッジトゥフェイスパッキング(edge-to-face packing)を介してサブユニットは三量体化する。他のタンパク質のものとサブユニットフォールドを比較してみると、ウイルスコートタンパク質に特徴的な「ゼリーロール」構造モチーフに類似している。ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーはおよそ１５０の残基の球状ＴＮＦ様細胞外ドメインを含んでなり、該ドメインは保存されたドメインデータベースＣＤＤのｃｄ００１８４、ｐｆａｍ００２２９又はｓｍａｒｔ００２０７に分類される (Marchler-Bauer A, 等 (2003), "CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments", Nucleic Acids Res. 31: 383-387)。さらに、ＴＮＦ-スーパーファミリのタンパク質は、一般におよそ１５０残基の前記球状ＴＮＦ様細胞外ドメイン、細胞外軸、短い膜貫通部分、および細胞内Ｎ末端ドメインを有する。いくつかのメンバーは、この一般的な立体構造と多少異なる(下記参照)。通常、各々のＴＮＦ分子が３つのレセプター-相互作用部位（３つのサブユニット間に）があるので、レセプタークラスター化によるシグナル伝達が可能となると思われる。ＴＮＦαは、それから、細胞外ドメインを遊離させている翻訳後切断を行うタイプＩＩ膜タンパク質として合成される。また、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＬＴ-β、４-１ＢＢＬおよびＴＲＡＩＬもタイプＩＩ膜タンパク質であるように見える。ＬＴ-αは分泌型タンパク質である。これらすべてのサイトカインは、特定のレセプターによって認識されるホモ三量体（または、ＬＴα／βの場合ヘテロ三量体）複合体のようである。好ましくは、ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーは非ヒトである。
ファミリーメンバーには、関連したレセプター、細胞内死ドメインを有するものに結合することによってアポトーシスを引き起こしうる。本明細書中で用いられるＴＮＦスーパーファミリメンバーには、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴα／β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３０Ｌ、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬおよびＢＡＦＦ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＴＬ1Ａ、ＥＤＡおよびＴＮＦ様ドメインがみられる他の任意のポリペプチドが含まれる。当業者に公知の様々な方法、例えば、ＮＣＢＩのウェブページ(ＵＲＬ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上でアクセスできるプログラムＢｌａｓｔＰ(タンパク質-タンパク質Ｂｌａｓｔ)によるなどして、同定されうる。Ｂｌａｓｔｐプログラムの初期設定(database = nrを選択, Do CD-search = on, advanced blastingのオプション: from = all organisms,を選択 composition-based statistics = on, filter = low complexityを選択, expect = 10, word size = 3, Matrix = Blosum 62, gap costs = existence 11 extension 1)を用いることによりドメインの同定を行ってもよい。このような検索は、ＴＮＦ様ドメインを有する対象のポリペプチドのＴＮＦ様ドメインを検出する助けとなる。
本明細書にて用いられるＴＮＦ-スーパーファミリメンバーには、タンパク質修飾、例えばリン酸化、グリコシル化又はユビキチン結合の有無にかかわらずＴＮＦ-スーパーファミリメンバーが含まれる。さらに、ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーなる用語も、ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーが存在するすべてのスプライシング変異体が含まれる。加えて、異なる種の同じＴＮＦスーパーファミリメンバー間で配列同一性が高いため、ヒトＴＮＦスーパーファミリメンバーそれぞれと７５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上およびさらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するＴＮＦ-スーパーファミリメンバーの遺伝子操作によって生成される、異なる変異形およびすべての天然の変異形は、本明細書において「ＴＮＦ-スーパーファミリメンバー」と称する。
本明細書で用いられる「ＴＮＦ-ペプチド」又は「本発明のＴＮＦペプチド」なる用語は、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８に相同なペプチド配列、好ましくは保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜８に相同なペプチド配列、より好ましくは当該コンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１１に相同なペプチド配列、さらにより好ましくは当該コンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１３に相同な、すなわちこの文脈ではこれらのアミノ酸残基に一致するペプチド配列を含んでなるペプチドである。
相同なペプチドは、非自己動物のＴＮＦ-スーパーファミリメンバー由来のペプチドであり、例えば、ヒトがワクチン接種を受ける場合には、非ヒトＴＮＦ-スーパーファミリメンバー由来のペプチドが用いられる。特に、ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーは非ヒト哺乳類の、例えばマウスＲＡＮＫＬ又はマウスＴＮＦαのようなＴＮＦスーパーファミリメンバーであり、配列番号：１に対応するそれらのアミノ酸残基を表すものである。これらの相同なペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリ（配列番号：１）のコンセンサス配列に他の動物の該ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーを合わせることによって、当業者に明らかとなる。上記のように、ＴＮＦ-ペプチドは、コンセンサス配列の上記のアミノ酸残基に対応するペプチド配列を含んでなる。つまり、コンセンサス配列（例えばコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８）を有する特定の相同領域以外では、ＴＮＦペプチドは、ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーであるポリペプチドと異なってもよい。しかしながら、上記のコンセンサス配列と相同な領域以外のＴＮＦペプチドの一部は、ＴＮＦスーパーファミリメンバーであるポリペプチドと少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はさらに１００％同一であることが好ましい。本発明の好適な使用では、ヒト疾患の治療のための医薬の調製における使用であり、好適なＴＮＦ-スーパーファミリメンバーは非ヒト哺乳類のＴＮＦ-スーパーファミリメンバーである。
このような場合、本発明のＴＮＦペプチドをより大きな要素で構成される場合、すなわち融合ポリペプチドまたはリンカーペプチドないしは付着部位が付加されたＴＮＦペプチドである場合、本発明のＴＮＦペプチドは、ＴＮＦペプチドが由来するポリペプチドの場合に続くアミノ酸残基が続かないのが好ましい。
ＴＮＦペプチドは、ＴＮＦペプチド単独として、好ましくは他のアミノ酸ないしはタンパク質との融合として、例えば、ＴＮＦペプチドのフォールディング、発現ないしは溶解性を容易にするため、またはＴＮＦペプチドの精製を容易にするために、真核生物又は原核生物の発現系の組換え発現によって得られてもよい。ＴＮＦペプチドとＶＬＰないしはキャプシドのサブユニットタンパク質との融合が好適である。この場合、一つ以上のアミノ酸がＴＮＦペプチドのＮ末端ないしはＣ末端に付加されてもよく、ＴＮＦペプチドが融合ポリペプチドのＮ末端である、すなわちそれ自体のＣ末端を介してその融合パートナーに共役されるか連結されるのが好ましい。
二者択一として、好ましくは、ＶＬＰのサブユニットタンパク質又はキャプシド又はコア粒子にＴＮＦペプチドを共役するために、少なくとも一つの第二付着部位がＴＮＦペプチドに加えられてもよい。あるいは、ＴＮＦ-ペプチドは、当業者に公知の方法、特に有機化学ペプチド合成によって合成されてもよい。このようなペプチドは、対応するＴＮＦスーパーファミリメンバータンパク質に存在しないアミノ酸をさらに含有してもよい。ペプチドは、例えばリン酸化によって修飾されてもよいが、この修飾は本発明の効果的な修飾ＶＬＰのために必要でない。
残基：本明細書中で用いる「残基」なる用語は、ポリペプチド主鎖又は側鎖の特定のアミノ酸を意味することを意図する。
免疫応答：本明細書中で用いる「免疫応答」なる用語は、抗原提示細胞および／またはＢおよび／またはＴリンパ球の活性化又は増殖を引き起こす細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。
しかしながら、いくつかの場合、免疫応答は強度が低い可能性があり、本発明の少なくとも１つの物質を使用するときのみ、検出可能となる可能性がある。「免疫原」は、免疫系の１つ又は複数の機能が高まり、免疫原物質を対象とするように、生物の免疫系を刺激するために使用される作用剤を指す。免疫応答を「亢進する」物質は、該物質を添加しない場合に測定する同じ免疫応答と比較して、該物質の添加によってより大きいまたは増強したまたは偏向した免疫応答が観察される物質を意味する。
免疫化：本明細書で使用するように、「免疫化する」又は「免疫化」なる用語、又は関連用語は、標的抗原又はエピトープに対する、十分な免疫応答(抗体及び／又は細胞免疫、エフェクターＣＴＬなどを含む)を備えるための能力を与えることを指す。これらの用語は、完全な免疫が生み出されることは必要としないが、基本レベルより大幅に免疫応答の増強が生じることを必要とする。たとえば哺乳動物は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞性及び／又は体液性免疫応答が起こる場合、標的抗原に対して免疫化することができると考えられる。
天然の供給源：本明細書中で用いられる「天然の供給源」なる用語は、全体またはその一部が合成のものでなく存在するものであるか自然に生成されるものを意味する。
非天然：本明細書中で用いられるように、一般的にこの用語は天然由来のものでないことを意味し、より具体的にはこの用語は人工的なものを意味する。
非天然の供給源：本明細書中で用いられるように「非天然の供給源」なる用語は合成ないしは天然由来のものでないことを意味し；より具体的には、この用語は人工的なものを意味する。
規則的に反復する抗原または抗原決定配列(アレイ)：本明細書中で用いられる「規則的に反復する抗原または抗原決定配列」は、一般的に抗原または抗原決定基の反復パターンを意味し、典型的に好ましくは、コア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれに関して抗原または抗原決定基の均一の空間的なアラインメントに特徴がある。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何的なパターンでもよい。好適な規則的に反復する抗原または抗原決定配列の典型的に好ましい例は、好ましくは１〜３０ナノメートル、好ましくは２〜１５ナノメートル、さらにより好ましくは２〜１０ナノメートル、さらにより好ましくは２〜８ナノメートル、さらにより好ましくは、３〜７ナノメートルの間隔の抗原または抗原決定基の、厳密に反復される準結晶の整列を有するものである。
線毛：本明細書中で用いられる「線毛(pili)(ピリ)」(「線毛(pilus)」の単数形)なる用語は、規則的に反復するパターンに編成されるタンパク質単量体(例えば線毛単量体)から成る細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに、線毛は、例えば宿主細胞表面レセプターへの細菌細胞の付着、細胞間遺伝子交換および細胞間認識などの工程に伴う構造である。線毛の例として、タイプ１線毛、Ｐ-線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ-線毛、９８７Ｐ-線毛などがある。線毛の付加的な例を以下に挙げる。
線毛様構造：本明細書中で用いられる「線毛様構造」なる句は、線毛のものに類似の特徴を有する構造を指し、タンパク質単量体から成る。「線毛様構造」の一例としては、天然の線毛のものと同一である規則的な反復する配列を形成しない修飾線毛タンパク質を発現する細菌細胞によって形成される構造である。
ポリペプチド：本明細書で用いられる「ポリペプチド」および「ペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結した単量体(アミノ酸)から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示す。本発明の好適なペプチドは、３００、好ましくは２５０、さらにより好ましくは２００、さらにより好ましくは１５０、およびさらにより好ましくは１００、およびさらにより好ましくは７５、およびさらにより好ましくは５０アミノ酸残基以下の長さのすべての他のペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチドノナペプチドおよびデカペプチドである。本発明の目的のためのポリペプチドは５０以上から１００００以下のアミノ酸残基からなる。本発明の目的のためのタンパク質はポリペプチドとする。また、この用語は、たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、発現後に修飾されたポリペプチドないしはペプチドを指すことを目的とする。組み換え体又は誘導ポリペプチドないしはペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。それらは、ペプチドの好適な化学合成を含めた任意の方法で生成させることができる。
自己抗原：本明細書で使用するように、「自己抗原」なる用語は、宿主のＤＮＡによってコードされたタンパク質と、宿主のＤＮＡによってコードされたタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を指し、自己として定義する。さらに、２またはいくつかの自己分子の組合せから生じるタンパク質も自己とみなす。
治療：本明細書で使用するように、「治療」、「治療する」、「治療した」、又は「治療している」なる用語は、哺乳動物、特にヒトの予防及び／又は療法を指す。自己免疫性疾患または骨関連の疾患(ＡＩまたはＢＲ)に関して使用するとき、たとえば、この用語は、ＡＩまたはＢＲに対する被検体の耐性を増大させる、あるいは言い換えると、被検体がＡＩまたはＢＲを進行するか、あるいはＡＩまたはＢＲに起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療、並びにＡＩまたはＢＲと戦うため、たとえばＡＩまたはＢＲを低下させるか除外するため、あるいは悪化するのを防ぐための、被検体がＡＩまたはＢＲを進行した後の治療を指す。
ワクチン：本明細書で使用するように、「ワクチン」という用語は、本発明の修飾コア粒子および特に修飾ＶＬＰを含み、動物に投与することができる形である調合物を指す。典型的にはワクチンは、通常の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含み、本発明の組成物がその中に懸濁又は溶解している。この形で、本発明の組成物を都合よく使用して、疾患を予防、改善、あるいはそれ以外の場合は治療することができる。宿主に導入することによって、ワクチンは、これだけに限らないが、抗体及び／又はサイトカインの生成、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／又は他の細胞応答を含む免疫応答を誘発することができる。典型的には、本発明の修飾コア粒子、好ましくは本発明の修飾ＶＬＰは、顕著なＢタイプ応答を引き起こすことが好ましく、より好ましくはさらに有用となりうるＢタイプ応答のみを引き起こす。
場合によっては、本発明のワクチンは、本発明の化合物に比較して少量又は多量で存在しうるアジュバントをさらに含む。
ウイルス様粒子：本明細書で使用するように、「ウイルス様粒子」(ＶＬＰ)なる用語は、ウイルスに似ている構造を指す。さらに、本発明のウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有していない。一般に、ウイルス様粒子はウイルス・ゲノムを欠いており、したがって非感染性である。さらにウイルス様粒子は、異種の発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。いくつかのウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。一般的に、本発明のウイルス様粒子は、非反復性かつ非感染性である。なぜならそれは、ウイルス・ゲノムのすべて又は一部、特にウイルス・ゲノムの反復性かつ感染性要素を欠いているからである。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、又はＲＮＡファージのウイルス・キャプシドなどの、ウイルス・キャプシドである。本明細書で互換的に使用する、「ウイルス・キャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。典型的かつ好ましくは、ウイルス・タンパク質のサブユニットは、固有の反復編成である構造を有する、ウイルス・キャプシドおよびキャプシド中にそれぞれ集合し、前記構造は典型的には球状又は管状である。たとえば、ＲＮＡファージ又はＨＢｃＡｇのキャプシドは、正二十面体様対称性の球状形を有する。本明細書で使用するように、「キャプシド様構造」なる用語は、前に定義した意味でキャプシドの形態に似ているが十分な程度の状態および反復性を保ちながらも、典型的な対称集合体からは逸脱する、ウイルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で用いられる「バクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語、または本明細書中で同等に用いられる「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」なる用語は、バクテリオファージの構造に似ているウイルス様粒子であり、複製せず、非感染性であり、そして、バクテリオファージの複製可動をコードする少なくとも一遺伝子又は複数の遺伝子が欠失しており、そしてまた、一般的に、宿主へのウイルス付着又は侵入せしめる一タンパク質又は複数のタンパク質をコードする一遺伝子又は複数の遺伝子を欠失しているものを意味する。しかしながら、この定義にはバクテリオファージのウイルス様粒子が包含され、上述の一遺伝子又は複数の遺伝子が存在しているが、不活性であり、それゆえに、複製不可能な非感染性のバクテリオファージのウイルス様粒子となる。
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０サブユニットの自己組織化体(アセンブリ)から形成され、場合によっては宿主のＲＮＡを含むキャプシド構造を、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と呼ぶ。１つの具体例は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰは、(たとえば、抑制によって大きなＡ１タンパク質の任意の発現を防止するＴＡＡ停止コドンを含む、ＱβＣＰ遺伝子の発現によって生じる)ＱβＣＰサブユニット(Kozlovska,T.M.等, Intervirology 39:9-15(1996)を参照のこと)であり、あるいはキャプシド集合体中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含んでもよい。
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」は、ウイルスの形態学的形態を意味する。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造(例えばエンベロープ、テイルなど)を有する。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。好ましくはそれらは「一」を意味する。
当業者には明らかであろうが、本発明のいくつかの実施態様は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核および真核細胞などにおける組み換えタンパク質の発現などの、核酸組み換え技術の使用に関するものである。このような方法は当業者によく知られており、公開されている研究室の方法マニュアル中で都合よく発見することができる(たとえば、Sambrook, J.他, eds.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL, 2nd.edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)；Ausubel,F.他, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H.Wiley & Sons,Inc.(1997))。組織培養細胞株を用いた作業に関する、基礎的な研究室の技法(Cells,J.,ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition, (1998))、および抗体系の技術(Harlow,E.and Lane,D., 「Antibodies:A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988)；Deutscher,M.P., 「Guide to Protein Purification」Meth.Enzymol.128, Academic Press San Diego(1990)；Scopes,R.K., 「Protein Purification Principles and Practice」3rd ed., SpringerVerlag, New York(1994))も文献中に十分に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。
２．免疫応答を高めるための組成物および方法
さらに、本発明は、自己免疫性疾患および骨関連の疾患の治療のための医薬の製造における本発明のまたは、本発明の組成物のまたは、本発明の医薬組成物の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰの使用に関する。この治療は治療的処置ないしは予防的処置であることが好ましい。好適な自己免疫性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、自己免疫甲状腺病、自己免疫肝炎、乾癬又は乾癬の関節炎である。好適な骨関連の疾患は、骨粗鬆症、歯周炎、周囲補綴骨変性、骨転移、骨癌疼痛、パジェット病、多発性骨髄腫、シェーグレン症候群および原発性胆管萎縮症である。
本発明の修飾コア粒子または組成物は、ａ) コア粒子および好ましくはＶＬＰと、ｂ) 好ましくは非ヒトの、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８に相同なペプチド配列、好ましくは保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜８に相同なペプチド配列、より好ましくは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１１に相同なペプチド配列、さらにより好ましくは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１３に相同なペプチド配列を含んでなる少なくとも一つの非自己ペプチド、好ましくは非ヒトペプチド(ＴＮＦ-ペプチド)を含有、あるいはこれらからなるものであり、このａ)およびｂ)は互いに連結している。
ＴＮＦα由来の非自己、および好ましくは非ヒトＴＮＦペプチドは、 ペプチドVAHVVA (配列番号:31)を含む、より好ましくはこれからからなる、より好ましくはペプチド KPVAHVVA (配列番号:32)を含む、より好ましくはこれからからなる、より好ましくはペプチドKPVAHVVAN (配列番号:33)を含む、より好ましくはこれからからなる。さらに好適なＴＮＦα由来の非自己、非ヒトＴＮＦペプチドは、 ペプチドSSQNSSDKPVAHVVANHQVE (配列番号:129) またはSSQNSSDKPVAHVVANHQAE (配列番号:130)またはSSRTPSBKPVAHVVANPQAE (配列番号:131)またはSSRTPSDKPVAHVVANPEAE (配列番号:132)またはSKPVAHVVAN (配列番号:191)またはSSRTPSDKPVAHVVANPEAE (配列番号:194)またはSSRTPSDKPVAHVVANPEAE (配列番号:195)を含む、より好ましくはこれからなる。
好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGVAHVVA (配列番号:134)またはペプチドCGGKPVAHVVA (配列番号:29)またはペプチドCGGKPVAHVVAN (配列番号:135)またはペプチドCGGSSQNSSDKPVAHVVANHQVE (配列番号:127)またはペプチドCGGSSQNSSDKPVAHVVANHQAE (配列番号:136)またはペプチドCGGSSRTPSBKPVAHVVANPQAE (配列番号:137)またはペプチドCGGSSRTPSDKPVAHVVANPEAE (配列番号:128)またはペプチドCGGSKPVAHVVAN (配列番号:192)を含む、より好ましくはこれからなる。
好適な実施態様では、本発明の非自己、好ましくは非ヒトＴＮＦペプチドは、規則的に反復した抗原-ＶＬＰ配列を形成するためにウイルス様粒子に結合する。さらに好適な実施態様では、非自己、好ましくは非ヒト、ＴＮＦペプチドは４から７５アミノ酸残基長、好ましくは４から５０アミノ酸残基長、より好ましくは４から４０アミノ酸残基長、より好ましくは４から３５アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から３０アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から２５アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から２０アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から１８アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から１６アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から１４アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から１３アミノ酸残基長、さらにより好ましくは４から１２アミノ酸残基長のペプチドからなる。あるいは、上記よりも短い範囲の限定(４から５０、４から４０、４から３０、４から２５、４から２０、４から１８、４から１６、４から１４、４から１３および４から１２)、５、６、７または８アミノ酸残基が好ましい。
さらに好適な実施態様では、非自己、好ましくは非ヒト、ＴＮＦペプチドは、最も相同性が高い自己、好ましくはヒトＴＮＦペプチドの１から１０位置、より好ましくは２から８位置、さらにより好ましくは２から６位置、さらにより好ましくは２から４位置、最も好ましくは３から４位置で異なるペプチドからなる。
さらに好適な実施態様では、非自己、好ましくは非ヒト、ＴＮＦペプチドは、最も相同性が高い自己、好ましくはヒトＴＮＦペプチドに７５％から９８％の同一性、好ましくは８０％から９７％の同一性、さらにより好ましくは８５％から９６％の同一性、さらにより好ましくは８５％から９５％の同一性、最も好ましくは９０％から９５％の同一性であるペプチドからなる。
さらに好適な実施態様では、治療される動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシまたはウマである。前記の治療される動物はヒトであることが好ましい。次いで、非ヒトＴＮＦペプチドは非ヒト脊椎動物ＴＮＦペプチド、より好ましくは非ヒト真獣類ＴＮＦ-ペプチド、さらにより好ましくはネコ、イヌ、ウシ又はマウスＴＮＦペプチド、最も好ましくはマウスＴＮＦペプチドである。治療される動物がイヌである場合、非自己ＴＮＦペプチドは非イヌＴＮＦペプチド、好ましくは非イヌ脊椎動物ＴＮＦペプチド、より好ましくは非イヌ真獣類ＴＮＦペプチド、さらにより好ましくはネコ、ヒト、ウシまたはマウスＴＮＦペプチドである。治療される動物がネコである場合、非自己ＴＮＦペプチドは非ネコＴＮＦペプチド、好ましくは非ネコ脊椎動物ＴＮＦペプチド、より好ましくは非ネコ真獣類ＴＮＦペプチド、さらにより好ましくはイヌ、ヒト、ウシまたはマウスＴＮＦペプチドである。
さらに好適な実施態様では、非自己、好ましくは非ヒト、ＴＮＦペプチドは、マウスＴＮＦα(配列番号:２)のアミノ酸残基１０から１５、より好ましくはアミノ酸残基８から１５、さらにより好ましくはアミノ酸残基８から２０、最も好ましくはアミノ酸残基１から２０に相同なペプチド配列を含む、好ましくはそれからなる。
さらに好適な実施態様では、ＴＮＦペプチドは、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴα／β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３０Ｌ、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬおよびＢＡＦＦ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＴＬ１Ａ、ＥＤＡからなる群から選択される、好ましくはＴＮＦα、ＬＴαおよびＬＴα／βからなる群から選択される、またはＴＲＡＩＬおよびＲＡＮＫＬからなる群から選択される、またはＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０ＬおよびＢＡＦＦからなる群から選択される、または４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＬＩＧＨＴからなる群から選択される、またはＬＴα、ＬＴα／β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３０Ｌ、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬおよびＢＡＦＦからなる群から選択される脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは真獣類ポリペプチドに由来する。
好適な実施態様では、用いられる修飾コア粒子、好ましくは修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、ＴＮＦα、ＬＴαおよびＬＴα／βからなる群から選択される脊椎動物ポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、乾癬、乾癬の関節炎、重症筋無力症、シェーグレン症候群および多発性硬化症、最も好ましくは乾癬の治療のための医薬の製造における使用に好適である。
ＴＮＦペプチドがＬＴαに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAAHLVG (配列番号:34)またはペプチドAAHLIG (配列番号:35)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドKPAAHLVG (配列番号:36)またはKPAAHLIG (配列番号:37)を含むか、これからなり、さらにより好ましくはペプチドLKPAAHLVG (配列番号:38)またはLKPAAHLIG (配列番号:39)またはHLTHGILKPAAHLVGYPSKQ (配列番号:133)またはHLTHGLLKPAAHLVGYPSKQ (配列番号:139)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGHLTHGILKPAAHLVGYPSKQ (配列番号:140)またはペプチドCGGHLTHGLLKPAAHLVGYPSKQ (配列番号:141)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＬＴβに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAAHLIG (配列番号:40)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドPAAHLIGA (配列番号:41)またはペプチドPAAHLIGI (配列番号:42)またはペプチドETDLNPELPAAHLIGAWMSG (配列番号:142)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGETDLNPELPAAHLIGAWMSG (配列番号:143)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＬＩＧＨＴポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチおよび糖尿病の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＬＩＧＨＴに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAAHLTG (配列番号:91)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドNPAAHLTG (配列番号:92)またはAAHLTGAN (配列番号:93)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドVNPAAHLTGANS (配列番号:94)またはANPAAHLTGANA (配列番号:95)またはDQRSHQANPAAHLTGANASL (配列番号:144)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGDQRSHQANPAAHLTGANASL (配列番号:145)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＦａｓＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス、糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性肝炎および多発性硬化症の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＦａｓＬに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドVAHLTG (配列番号:51)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドRSVAHLTG (配列番号:52)またはRKVAHLTG (配列番号:53)またはRRAAHLTG (配列番号:54)またはKKAAHLTG (配列番号:55)またはPSEKKEPRSVAHLTGNPHSR (配列番号:146)またはPSETKKPRSVAHLTGNPRSR (配列番号:147)またはPSEKRELRKVAHLTGKPNSR (配列番号:198)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGPSEKKEPRSVAHLTGNPHSR (配列番号:148)またはペプチドCGGPSETKKPRSVAHLTGNPRSR (配列番号:149)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＣＤ４０Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群およびアテローム性動脈硬化症の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＣＤ４０Ｌに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAAHVIS (配列番号:43)またはペプチドAAHVVS (配列番号:44)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドQIAAHVIS (配列番号:45)またはRIAAHVIS (配列番号:46)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドNPQIAAHVIS (配列番号:47)またはDPQIAAHVIS (配列番号:48)またはDPQIAAHVVS (配列番号:49)またはEPQIAAHVIS (配列番号:50)またはQRGDEDPQIAAHVVSEANSN (配列番号:150)またはQKGDQDPRIAAHVISEASSN (配列番号:196)またはQKGDQDPRVAAHVISEASSS (配列番号:197)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGQRGDEDPQIAAHVVSEANSN (配列番号:151)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＴＲＡＩＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、多発性硬化症および自己免疫性甲状腺疾患の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＴＲＡＩＬに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAAHIT (配列番号:64)またはペプチドAAHLT (配列番号:65)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドVAAHITG (配列番号:66)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドPQKVAAHITG (配列番号:67)またはPQRVAAHITG (配列番号:68)またはPRGGRPQKVAAHITGITRRS (配列番号:152)またはPRGRRPQRVAAHITGITRRS (配列番号:153)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGPRGGRPQKVAAHITGITRRS (配列番号:154)またはペプチドCGGPRGRRPQRVAAHITGITRRS (配列番号:155)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＲＡＮＫＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、骨粗鬆症、乾癬、乾癬の関節炎、多発性骨髄腫、歯周炎、前立腺周囲骨変性、骨転移、骨癌疼痛、歯周病およびパジェット病、最も好ましくは乾癬の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＲＡＮＫＬに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドFAHLTI (配列番号:69)またはペプチドSAHLTV (配列番号:70)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドEAQPFAHLTI (配列番号:71)またはQPFAHLTIN (配列番号:72)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドKPEAQPFAHLTINA (配列番号:73)またはAQPFAHLTIN (配列番号:190)またはKLEAQPFAHLTINA (配列番号:74)またはKRSKLEAQPFAHLTINATDI (配列番号:75)またはQRGKPEAQPFAHLTINAASI (配列番号:76)またはRRGKPEAQPFAHLTINAADI (配列番号:156)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGQRGKPEAQPFAHLTINAASI (配列番号:157)またはペプチドCGGRRGKPEAQPFAHLTINAADI (配列番号:158)またはペプチドCGGAQPFAHLTIN (配列番号:189)を含み、より好ましくはこれからなる。
さらに好適な実施態様では、非自己、好ましくは非ヒトのＴＮＦペプチドは、配列番号：２２(マウスＲＡＮＫＬタンパク質完全長)のアミノ酸残基１６４から１６９、より好ましくは配列番号：２２のアミノ酸残基１６２から１６９、さらにより好ましくは配列番号：２２のアミノ酸残基１６０から１７０、さらにより好ましくは配列番号：２２のアミノ酸残基１６０から１７１、最も好ましくは配列番号：２２のアミノ酸残基１５５から１７４、すなわち配列番号：３に相同なペプチド配列を含む、好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＣＤ３０Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、心筋炎および原発性胆汁性肝硬変の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＣＤ３０Ｌに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドWAYLQV (配列番号:111)またはペプチドAAYMRV (配列番号:112)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドKGAAAYMRV (配列番号:113)またはペプチドKKSWAYLQV (配列番号:114)またはペプチドLKSTPSKKSWAYLQVSKHLN (配列番号:159)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGLKSTPSKKSWAYLQVSKHLN (配列番号:160)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類の４-１ＢＢＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、炎症性腸疾患および多発性硬化症、好ましくは関節リウマチの治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドが４-１ＢＢＬに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドFAQLVA (配列番号:115)またはペプチドFAKLLA (配列番号:116)またはペプチドLVAQNVLL (配列番号:117)またはペプチドLLAKNQAS (配列番号:118)またはペプチドQGMFAQLVA (配列番号:119)またはペプチドNTTQQGSPVFAKLLAKNQAS (配列番号:161)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGNTTQQGSPVFAKLLAKNQAS (配列番号:162)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＯＸ４０Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチおよび炎症性腸疾患の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＯＸ４０Ｌに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドFILTSQ (配列番号:120)またはペプチドFIGTSK (配列番号:121)またはペプチドFILPLQ (配列番号:122)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドKGFILTSQK (配列番号:123)またはペプチドRLFIGTSKK (配列番号:124)またはAVTRCEDGQLFISSYKNEYQ (配列番号:163)またはPVTGCEGGRLFIGTSKNEYE (配列番号:164)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGAVTRCEDGQLFISSYKNEYQ (配列番号:165)またはペプチドCGGPVTGCEGGRLFIGTSKNEYE (配列番号:166)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＢＡＦＦポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群の治療のための医薬の製造における使用に適する。
ＴＮＦペプチドがＢＡＦＦに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドLQLIAD (配列番号:88)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドQDCLQLIADS (配列番号:89)またはQACLQLIADS (配列番号:90)またはNLRNIIQDCLQLIADSDTPT (配列番号:167)またはNLRNIIQDSLQLIADSDTPT (配列番号:193)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGNLRNIIQDCLQLIADSDTPT (配列番号:168)またはペプチドCGGNLRNIIQDSLQLIADSDTPT (配列番号:138)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＣＤ２７Ｌに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAELQLN (配列番号:56)またはLQLNLT (配列番号:57)またはLQLNHT (配列番号:58)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドVAELQLN (配列番号:59)またはTAELQLN (配列番号:60)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドTAELQLNL (配列番号:61)またはVAELQLNL (配列番号:62)またはVAELQLNH (配列番号:63)またはPEPHTAELQLNLTVPRKDPT (配列番号:169)またはPELHVAELQLNLTDPQKDLT (配列番号:170)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGPEPHTAELQLNLTVPRKDPT (配列番号:171)またはペプチドCGGPELHVAELQLNLTDPQKDLT (配列番号:172)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＴＷＥＡＫに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAAHYEV (配列番号:77)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドRAIAAHYEV (配列番号:78)またはAAHYEVHP (配列番号:79)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドARRAIAAHYEVHP (配列番号:80)またはPRRAIAAHYEVHP (配列番号:81)またはRKARPRRAIAAHYEVHPRPG (配列番号:173)またはRKARPRRAIAAHYEVHPQPG (配列番号:174)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGRKARPRRAIAAHYEVHPRPG (配列番号:175)またはペプチドCGGRKARPRRAIAAHYEVHPQPG (配列番号:176)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＡＰＲＩＬに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドSVLHLV (配列番号:82)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドHSVLHLVP (配列番号:83またはQSVLHLVP (配列番号:84)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドKKQHSVLHLVP (配列番号:85)またはKKKHSVLHLVP (配列番号:86)またはKKKQSVLHLVP (配列番号:87)またはQKHKKKHSVLHLVPVNITS (配列番号:177)またはQKHKKKQSVLHLVPINITS (配列番号:178)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGQKHKKKHSVLHLVPVNITS (配列番号:179)またはペプチドCGGQKHKKKQSVLHLVPINITS (配列番号:180)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＴＬ１Ａに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドRAHLTV (配列番号:96)またはペプチドRAHLTI (配列番号:97)またはペプチドKAHLTI (配列番号:98)またはペプチドTQHFKN (配列番号:99)またはPPRGKPRAHLTIKKQTP (配列番号:181)またはPSRDKPKAHLTIMRQTP (配列番号:182)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGPPRGKPRAHLTIKKQTP (配列番号:183)またはCGGPSRDKPKAHLTIMRQTP (配列番号:184)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＥＤＡに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドAVVHLQ (配列番号:100)またはペプチドVVHLQG (配列番号:101)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドQPAVVHLQG (配列番号:102)またはPAVVHLQGQG (配列番号:103)を含むか、これからなり、さらにより好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドTRENQPAVVHLQ (配列番号:104)またはENQPAVVHLQGQGS (配列番号:105)またはQPAVVHLQGQGSAI (配列番号:106)またはTGTRENQPAVVHLQGQGSAI (配列番号:185)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGTGTRENQPAVVHLQGQGSAI (配列番号:186)を含み、より好ましくはこれからなる。
ＴＮＦペプチドがＧＩＴＲに由来する場合、前記ＴＮＦペプチドは、ペプチドCMVKF (配列番号:107)またはペプチドCMAKF (配列番号:108)を含むか、これからなり、より好ましくは前記ＴＮＦペプチドはペプチドESCMVKFE (配列番号:109)またはEPCMAKFG (配列番号:110)またはKPTVIESCMVKFELSSSKW (配列番号:187)を含むか、これからなる。好適な実施態様では、第二付着部位を有するＴＮＦペプチドは、ペプチドCGGKPTVIESCMVKFELSSSKW (配列番号:188)を含み、より好ましくはこれからなる。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＣＤ２７Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくはアテローム性動脈硬化症および心筋炎の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＴＷＥＡＫポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＡＰＲＩＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＴＬ１Ａポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは炎症性腸疾患の治療のための医薬の製造における使用に適する。
一実施態様では、前記コア粒子は、ウイルス、細菌性線毛、細菌性線毛から形成される構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ＲＮＡファージのウイルス様粒子、ウイルスキャプシド粒子又はその組換え型を含むか、あるいはそれらからなる群から選択される。規則的な反復するコートおよび／またはコアタンパク質構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のコア粒子として選択されてもよい；好適なウイルスの例として、シンドビスおよび他のアルファウイルス、ラブドウィルス(例えば水疱性口炎ウイルス)、ピコルナウィルス(例えばヒトライノウイルス、アイチウイルス)、トガウィルス(例えば風疹ウィルス)、オルトミクソウィルス(例えばＴｈｏｇｏｔｏウイルス、Ｂａｔｋｅｎウイルス、トリペストウイルス)、ポリオーマウイルス(例えばポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、鳥ポリオーマウイルスＢＦＤＶ)、パルボウィルス、ロタウィルス、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、タバコモザイク病ウイルス、Ｆｌｏｃｋハウスウイルスおよびヒトパピローマウイルス、そして好ましくはＲＮＡファージ、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ2、バクテリオファージｆ2、バクテリオファージＰＰ7 (例として、Bachmann, M.F. およびZinkernagel, R.M., Immunol. Today 17:553-558 (1996)の表１を参照)などがある。
更なる実施態様では、本発明は、規則的に反復するウイルスエンベロープタンパク質と本発明のＴＮＦペプチドとの融合を生成するためにウイルスの遺伝的操作を行う。あるいは、ウイルスエンベロープタンパク質は第一付着部位を含有し、あるいはまたは好ましくは、該第一付着部位は異種性タンパク質、ペプチド、抗原決定基または選択される反応性アミノ酸残基である。更なる実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、付加された第二付着部位を有する。当業者に公知の他の遺伝的操作が本発明の構成の構築に包含されうる；例えば、遺伝的変異による組み換えウイルスの複製能を制限するのが望ましいこともある。さらに、本発明に用いるウイルスは、複製能ゲノムが欠損しているためないしは、記載のように、化学的ないしは物理的に不活性化しているために複製能を有さない。本発明のＴＮＦペプチドに融合させるために選択されるウイルスタンパク質、またはあるいは第一付着部位は、編成され、反復性のある構造を有するのがよい。このような編成され、反復性の構造には、３〜３０ｎｍ、好ましくは３〜１５ｎｍ、さらにより好ましくは３〜８ｎｍのウイルスの表面と本発明のＴＮＦペプチドとの付着または連結の間隔をもって編成される準結晶が内包される。このタイプの融合タンパク質が作製されると、ウイルスの表面上に複数の、規則的に反復した本発明のＴＮＦペプチドないしは第一付着部位となり、天然のウイルスタンパク質の正常な編成を表す。当業者に理解されるように、第一付着部位は、規則的で反復性の抗原配列を引き起こす抗原ないしは抗原決定基に特異的に接着する助けとなる、任意の好適なタンパク質、ポリペプチド、糖類、ポリヌクレオチド、ペプチド(アミノ酸)、天然ないしは合成のポリマー、二次代謝産物またはその組合せであるか、またはそれらの一部でもよい。もちろん、本発明のＴＮＦペプチド上のウイルスエンベロープタンパク質の直接融合は、第一および／または第二の付着部位の導入なしで作製されうる。
本発明の他の実施態様では、コア粒子は、組換えアルファウイルスおよびより具体的には組換えシンドビスウイルス(Sinbis virus)である。アルファウイルスファミリ、シンドビス(Sindbis)(Xiong, C.等, Science 243:1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993))、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス (SFV) (Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991))およびその他(Davis, N.L. 等, Virology 171:189-204 (1989))のいくつかのメンバーは、様々な異なるタンパク質(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997); Liljestrom, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5:495-500 (1994))のウイルスベースの発現ベクターとして、そして、ワクチン開発の候補としての用途が注目されている。近年、発行される多くの特許は、異種タンパク質の発現およびワクチンの開発のためのアルファウイルスの使用に関する(米国特許第５,７６６,６０２号；同第５，７９２，４６２号；同第５，７３９，０２６号；同第５，７８９，２４５号および同第５，８１４，４８２号を参照)。
ウイルスベースのコア粒子産生のための適切な宿主細胞は、国際公報０２／０５６９０５の２８ページ第３７行から２９ページ第１２行において開示される。さらに、国際公報０２／０５６９０５の２９ページ第１３−２７行には、宿主細胞内へのポリヌクレオチドベクターの導入方法が開示される。さらに、ウイルスベースのコア粒子の産生のための組換え宿主細胞としての哺乳動物細胞は、国際公報０２／０５６９０５の２９ページ第２８−３５行において開示される。上記のパラグラフは出典明記によって本願明細書に明確に組み込まれる。
更なる本発明のコア粒子としての用途に適切なＲＮＡウィルスの例として、限定するものではないが、国際公報０３／０３９２２５の３２ページ第５行から３４ページ第１３行(パラグラフ００９６)に開示されるものなどが含まれる。さらに、コア粒子として用いられうる例示的ＤＮＡウィルスには、限定するものではないが、国際公報０３／０３９２２５の３４ページ第１４行から３５ページ第１３行(パラグラフ００９７)に開示されるものなどが含まれる。
他の実施の形態では、細菌性線毛、細菌性線毛の準線毛部分、又は細菌性線毛又はその準線毛部分の何れかを含有する融合タンパク質は、本発明の修飾コア粒子および組成物およびワクチン組成物を調製するために用いられる。細菌性線毛は、天然から精製されてもよく、二者択一的に、組み換えて生産されてもよい。線毛タンパク質の例には、大腸菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、ナイセリアゴノロエエ、コーロバクター属クレセンタス、シュードモナススタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)および緑膿菌によって生産される線毛などが含まれる。本発明の用途に適切な線毛タンパク質のアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋ届出のＡＪ０００６３６、ＡＪ１３２３６４、ＡＦ２２９６４６、ＡＦ０５１８１４、ＡＦ０５１８１５および、Ｘ００９８１の一群などが含まれ、その開示内容全体は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
細菌性線毛タンパク質は、通常プロセシングされて、細菌の周辺質内のタンパク質の輸出の前にＮ末端リーダー配列が除去される。さらに、当業者が認識するように、本発明の組成物およびワクチン組成物それぞれを調製するために用いられる細菌線毛タンパク質は、一般に天然に存在するリーダー配列を有しない。
本発明の使用に適切な線毛タンパク質の具体的な好適な例は、国際公報０２／０５６９０５の４１ページ第１３行から第２１行に開示される。ゆえに、本発明の使用に適切な線毛タンパク質のある特定の例は、大腸菌のＰ-線毛(ＧｅｎＢａｎｋ届出ＡＦ２３７４８２)である。本発明の用途に適切なタイプ１大腸菌線毛の例はＧｅｎＢａｎｋ届出Ｐ０４１２８に示されるアミノ酸配列を有する線毛であり、それはＧｅｎＢａｎｋ届出Ｍ２７６０３に示されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる。これらのＧｅｎＢａｎｋ届出の全ての開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。また、上述したタンパク質の成熟形態は、一般的に好ましくは、本発明の組成物およびワクチン組成物それぞれを調製するために用いられる。
本発明を実施するために適切な細菌の線毛又は準線毛部分は、通常、規則的で反復性の抗原配列を形成するために対合することが可能であろう。したがって、例えば、限定するものではないが、切断などの線毛突然変異体は本発明の範囲内である。
線毛および線毛様構造のインビトロ調整法、並びに本発明に有用な線毛および線毛様構造の好適な修飾方法は、国際公報０２／０５６９０５の４１ページ第２５行から４３ページ第２２行に開示される。
ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物に用いられる線毛又は線毛様構造は、単一のタイプの線毛サブユニットから成るであろう。同一のサブユニットから成る線毛又は線毛様構造が一般的に用いられる。
しかしながら、本発明の組成物はまた、異種性線毛サブユニットから形成される線毛および線毛様構造を含有する組成物およびワクチンを含む。本発明の好ましい実施態様の可能な発現方法は、国際公報０２／０５６９０５の４３ページ第２８行から４４ページ第６行に開示される。
線毛タンパク質は本発明のＴＮＦペプチドに融合してもよい。好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドは、共有結合的架橋によって線毛又は線毛様構造に連結される。非常に好適な実施態様では、第一付着部位は線毛に天然ないしは非天然に生じるリジンのアミノ基であり、および第二付着部位は本発明のＴＮＦペプチドと関係するシステインのスルフヒドリル基である。次いで、第一および第二の付着部位はヘテロ二官能性架橋剤によって連結される。
本出願中のウイルス様粒子はウイルス粒子に似ている構造を指すが、病原性はない。一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠いているので、非伝染性である。また、ウイルス様粒子は異種性の発現によって多量に生産されてもよくて、容易に精製されうる。
好ましい実施態様では、コア粒子はウイルス様粒子であり、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。当業者は、組み換えＤＮＡ技術と公に用意に利用可能なウイルスコード配列を用いてＶＬＰを生産してもよい。例えば、ウイルスエンベロープ又はコアタンパク質のコード配列は、ウイルスプロモータの制御調節の下で、制御配列をコード配列に機能的に連結させる配列の適当な修飾を有する市販のバキュロウイルスベクターを用いてバキュロウイルス発現ベクター内で発現させるように操作することができる。例えば、ウイルスエンベロープ又はコアタンパク質のコード配列はまた、細菌性発現ベクターの発現のために操作されうる。
ＶＬＰの例として、限定するのものではないが、Ｂ型肝炎ウイルス(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))、はしかウイルス(Warnes, 等, Gene 160:173-178 (1995))、シンドビスウイルス、ロタウイルス(米国特許第５，０７１，６５１号および同第５，３７４，４２６号)、手足口病ウイルス(Twomey, 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))、ノーウォークウイルス(Jiang, X., 等, Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., 等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))、レトロウイルスのＧＡＧタンパク質(国際公報９６／３０５２３)、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質(国際公報９２／１１２９１)、ヒトパピローマウイルス(国際公報９８／１５６３１)、Ｔｙおよび好ましくはＲＮＡファージ、例えばｆｒファージ、ＧＡファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＱβファージ）のキャプシドタンパク質などがある。
より具体的な実施態様では、ＶＬＰは、ロタウイルスの組換えポリペプチド、ノーウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファウイルスの組換えポリペプチド、手足口病ウイルスの組換えポリペプチド、はしかウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス(例えばＨＢｃＡｇ)の組換えポリペプチド、タバコモザイク病ウイルスの組換えポリペプチド、Ｆｌｏｃｋハウスウイルスの組換えポリペプチド、ヒトパピローマウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組換えポリペプチド、Ｔｙの組換えポリペプチド、ｆｒファージの組換えポリペプチド、ＧＡファージの組換えポリペプチドおよびＱβファージの組換えポリペプチドから選択される組み換えポリペプチドないしはその断片を含みうる、あるいは基本的にこれからなりうる、あるいはこれからなりうる。さらに、ウイルス様粒子は、一以上のこのようなポリペプチドの断片並びにこのようなポリペプチドの変異形を含みうる、あるいは基本的にこれからなりうる、あるいはこれからなりうる。ポリペプチドの変異形は、例えば、それらの野生型相対物とアミノ酸レベルで、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性を共有しうる。
好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質ないしはその断片を含んでなるか、好ましくは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。好ましくは、ＲＮＡ-ファージは、ａ)バクテリオファージＱβ；ｂ)バクテリオファージＲ１７；ｃ)バクテリオファージｆｒ；ｄ)バクテリオファージＧＡ；ｅ)バクテリオファージＳＰ；ｆ)バクテリオファージＭＳ２；ｇ)バクテリオファージＭ１１；ｈ)バクテリオファージＭＸ１；ｉ)バクテリオファージＮＬ９５；ｋ)バクテリオファージｆ２；ｌ)バクテリオファージＰＰ７、および、ｍ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明の他の好ましい実施例では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβまたはＲＮＡ-バクテリオファージｆｒまたはＲＮＡ-バクテリオファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質ないしはその断片を含んでなるか、好ましくは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
本発明のさらに好適な実施態様において、組換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコートタンパク質を含んでなるか、好ましくは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
したがって、キャプシドないしはＶＬＰを形成するＲＮＡファージコートタンパク質、又はキャプシドないしはＶＬＰへの自己アセンブリに適するバクテリオファージコートタンパク質の断片は、本発明のさらに好ましい実施態様である。例えば、バクテリオファージＱβコートタンパク質は、大腸菌中で組み換えて発現させてもよい。さらに、このような発現の際に、これらのタンパク質は自然発生的にキャプシドを形成する。加えて、これらのキャプシドは、固有の反復性編成構造形成する。
本発明の組成物を調製するために用いられうるバクテリオファージコートタンパク質の具体的な例として、ＲＮＡバクテリオファージ、例えばバクテリオファージＱβ(配列番号:４；ＰＩＲデータベース、受託番号ＶＣＢＰＱβ、ＱβＣＰと称する、および配列番号:５；受託番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ Ａ１たんぱく質と称する)、バクテリオファージＲ１７(配列番号:６；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７)、バクテリオファージｆｒ(配列番号:７；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ)、バクテリオファージＧＡ(配列番号:８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ-０４０７５４)、バクテリオファージＳＰ(配列番号:９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４、ＳＰＣＰと称する、および配列番号:１０；受託番号ＮＰ６９５０２６、ＳＰ Ａ１タンパク質と称する)、バクテリオファージＭＳ２(配列番号:１１；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２)、バクテリオファージＭ１１(配列番号:１２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０)、バクテリオファージＭＸ１(配列番号:１３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９)、バクテリオファージＮＬ９５(配列番号:１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４)、バクテリオファージｆ２(配列番号:１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１)、バクテリオファージＰＰ７(配列番号:１６)、およびバクテリオファージＡＰ２０５(配列番号:２８)のコートタンパク質などがある。さらに、バクテリオファージＱβ(配列番号:５)のＡ１タンパク質又はそのＣ末端から１００、１５０または１８０のアミノ酸を欠失するＣ末端切断型は、Ｑβコートタンパク質のキャプシドアセンブリ内に取り込まれうる。通常、キャプシド形成を確認するために、キャプシドアセンブリ内のＱβＣＰに関連するＱβＡ１タンパク質の割合は限定するだろう。
大腸菌内で発現されると、Ｑβコートタンパク質はキャプシド内に自己アセンブリするようである(Kozlovska TM.等, GENE 137:133-137 (1993))。得られたキャプシド又はウイルス様粒子は、２５ｎｍの直径とＴ＝3擬似対称性を有する二十面体のファージ様キャプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造が解明された。キャプシドはコートタンパク質を１８０コピー含有し、Ｑβコートタンパク質のキャプシドの顕著な安定性を引き起こすジスルフィド架橋(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-5554 (1996))によって五量体および六量体に共有結合的に連結される。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド内で他のサブユニットへジスルフィド結合を介して連結されないか、あるいは不完全に連結されたサブユニットを含有してもよい。しかしながら、一般的に、サブユニットのおよそ８０％以上は、ＶＬＰ内で互いにジスルフィド架橋を介して連結される。ゆえに、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥに組換えＱβキャプシドを流すと、単量体Ｑβコートタンパク質に対応するバンド並びにＱβコートタンパク質の六量体又は五量体に対応するバンドが見える。不完全にジスルフィド結合されたサブユニットは、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥの二量体、三量体又はさらに四量体のバンドとして現れる。また、Ｑβキャプシドタンパク質は、有機溶媒および変性剤に対して並外れた耐性を示す。驚くべきことに、本発明者等は、ＭＤＳＯおよび３０％程度の濃度のアセトニトリルおよび、１Ｍ程度の濃度のグアニジニウムはキャプシドの安定性に影響しないことを観察した。Ｑβコートタンパク質のキャプシドの高い安定性は、特に本発明の哺乳動物およびヒトの免疫化および予防接種における使用のために有益な特徴である。
本発明者等がStoll, E. 等, J. Biol. Chem. 252:990-993 (1977)に記載のＮ末端エドマン配列決定によって述べたように、大腸菌内の発現の際に、Ｑβコートタンパク質のＮ末端メチオニンは通常取り除かれる。Ｎ末端メチオニンが取り除かれなかった場合のＱβコートタンパク質からなるＶＬＰ、又はＮ末端メチオニンが切断されているか存在するかの何れかの場合のＱβコートタンパク質の混合物からなるＶＬＰも本発明の範囲内である。
本発明のＲＮＡファージ、特にＱβのさらに好適なウイルス様粒子は国際公報０２／０５６９０５に開示され、その開示内容は出典明記によりその全体が本明細書内に組み込まれる。特に、ＱβからのＶＬＰ粒子の調製の詳細な説明は、国際公報０２／０５６９０５の実施例１８に開示される。
さらにまた、ＲＮＡファージコートタンパク質は、細菌宿主内での発現の際に自己アセンブリすることが示唆された(Kastelein, RA. 等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. 等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. 等, Virology 170:238-242 (1989)、Ni, CZ., 等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Priano, C. 等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。Ｑβファージキャプシドは、コートタンパク質に加えていわゆるリードスルータンパク質Ａ１および成熟タンパクＡ２を含有する。Ａ１は、ＵＧＡ停止コドンでの抑制によって生成され、３２９アミノ酸の長さを有する。本発明で用いられるファージＱβ組換えコートタンパク質のキャプシドはＡ２細胞溶解タンパク質を欠損し、宿主のＲＮＡを含有する。ＲＮＡファージのコートタンパク質はＲＮＡ結合タンパク質であって、ウイルスのライフサイクルの間に翻訳リプレッサとして機能するレプリカーゼ遺伝子のリボゾーム結合部位のステムループと相互作用する。相互作用の配列および構造的要素は公知である(Witherell, GW. & Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28:71-76 (1989)；Lim F. 等, J. Biol. Chem. 271:31839-31845 (1996))。一般的なステムループおよびＲＮＡは、ウイルスアセンブリに関与することが公知である(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-5554 (1996))。
本発明の更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質ないしはその断片を含むか、あるいは基本的になるか、あるいはなり、該組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異形コートタンパク質、好ましくは上記のＲＮＡファージの変異形コートタンパク質を含むか、あるいは基本的になるか、あるいはなる。一実施態様では、変異形コートタンパク質は本発明のＴＮＦペプチドとの融合タンパク質である。他の好適な実施態様では、ＲＮＡファージの変異形コートタンパク質は、置換によって少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基を除去する、あるいは置換によって少なくとも１のリジン残基を付加することによって修飾されている；あるいはＲＮＡファージの変異形コートタンパク質は、少なくとも１あるいは少なくとも２のリジン残基の欠損か、挿入による少なくとも１のリジン残基の付加によって修飾されている。少なくとも１のリジン残基の欠損、置換ないしは付加によって、ワクチンの必要性に合わせて適応させるために共役の程度、すなわち、ＲＮＡファージのＶＬＰのサブユニット当たりのＴＮＦペプチドの量を変えることができる。
他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組み換えタンパク質ないしはその断片を含むか、あるいは基本的になるか、あるいはなり、該組み換えタンパク質は、配列番号：４のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、または配列番号：４と配列番号：５ないしは配列番号：５の変異形のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合を含むか、あるいは基本的になるか、あるいはなり、Ｎ末端メチオニンは切断されているのが好ましい。
本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質ないしはその断片を含むか、あるいは基本的になるか、あるいはなり、該組み換えタンパク質は、変異形Ｑβコートタンパク質を含むか、あるいは基本的になるか、あるいはなる。他の好適な実施態様では、これら変異形コートタンパク質は、置換によって少なくとも１のリジン残基を除去する、あるいは置換によって少なくとも１のリジン残基を付加することによって修飾されている。あるいは、これら変異形コートタンパク質は少なくとも１のリジン残基の欠損、あるいは挿入による少なくとも１のリジン残基の付加によって修飾されている。
４つのリジン残基は、Ｑβコートタンパク質のキャプシドの表面上に露出する。また、露出したリジン残基がアルギニンによって置換されているＱβ突然変異体が本発明に用いられてもよい。したがって、以下のＱβコートタンパク質変異体および変異形ＱβＶＬＰが本発明の実施に用いられてもよい：「Ｑβ-２４０」(Ｌｙｓ１３-Ａｒｇ；配列番号：１７)、「Ｑβ-２４３」(Ａｓｎ１０-Ｌｙｓ；配列番号：１８)、「Ｑβ-２５０」(Ｌｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３-Ａｒｇ）；配列番号：１９)、「Ｑβ-２５１」(配列番号：２０)、および、「Ｑβ-２５９」(Ｌｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６-Ａｒｇ；配列番号：２１)。ゆえに、本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、変異形Ｑβコートタンパク質の組換えタンパク質を含んでなるか、基本的になるかまたは、二者択一的になり、ａ)配列番号：１７のアミノ酸配列；ｂ)配列番号：１８のアミノ酸配列；ｃ)配列番号：１９のアミノ酸配列；ｄ)配列番号：２０のアミノ酸配列；および、ｅ)配列番号：２１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含んでなる。上記のＱβコートタンパク質、変異形Ｑβコートタンパク質ＶＬＰおよびキャプシドの構築、発現および精製それぞれは、国際公報０２／０５６９０５に記述される。上述の出願の実施例１８が特に参照される。
本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子はＱβの組換えタンパク質又はその断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなり、該組換えタンパク質は前述のＱβ変異体および対応するＡ１タンパク質のいずれか一つの混合物を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージＡＰ205の組み換えタンパク質あるいはその断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
ＡＰ205ゲノムは、関連するファージに存在しない２つのオープンリーディングフレーム；細胞溶解遺伝子および成熟遺伝子の翻訳に役割を果たすオープンリーディングフレーム、レプリカーゼ、コートタンパク質、および成熟タンパク質からなる(Klovins,J., 等, J. Gen. Virol. 83:1523-33 (2002))。国際公報２００４／００７５３８は、実施例１および実施例２に特に、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するＶＬＰを得る方法、およびこれによって特に発現とその精製について記述する。国際公報２００４／００７５３８および上記の実施例は出典明記によって本明細書に組み込まれる。ＡＰ２０５ ＶＬＰは免疫原性が高く、反復して正しく配位される本発明のＴＮＦペプチドを表出するワクチンコンストラクトを生成するために、本発明のＴＮＦペプチドに連結されてもよい。本発明の結合したＴＮＦペプチドが抗体分子と相互作用するために接触可能であることを示す本発明の表出されたＴＮＦペプチドに対して抗力価が引き起こされ、免疫原性となる。
本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異形コートタンパク質ないしはその断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含むＡＰ２０５ ＶＬＰのアセンブリ適合変異形は本発明の実施に使用してもよく、本発明のさらに好適な実施態様となる。ＡＰ２０５Ｐｒｏ-５-ＴｈｒのクローニングおよびＶＬＰの精製は、国際公報２００４／００７５３８の特に実施例１および実施例２に開示される。国際公報２００４／００７５３８の特に実施例１および実施例２の開示内容は出典明記によって直接組み込まれる。
本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質ないしはその断片および、ＲＮＡ-ファージＡＰ２０５の組換え変異形コートタンパク質ないしはその断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
本発明のさらに好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質ないしは組み換え変異形コートタンパク質の断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
また、ＶＬＰおよびキャプシドにアセンブリすることができる組換えＡＰ２０５コートタンパク質断片それぞれは、本発明の実施に有用である。これらの断片は、コートタンパク質および変異形コートタンパク質の末端ないしは内部でそれぞれ欠損させて生成されてもよい。コートタンパク質および変異形コートタンパク質配列内の挿入又はコートタンパク質および変異形コートタンパク質配列への本発明のＴＮＦペプチドの融合、および、ＶＬＰ内へのアセンブリとの適合は本発明の更なる実施態様であり、キメラＡＰ２０５コートタンパク質および粒子それぞれを引き起こす。挿入、欠損およびコートタンパク質への融合の結果やＶＬＰ内へのアセンブリに適合するかどうかは電子顕微鏡法で測定されてもよい。
上記のＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質断片およびキメラコートタンパク質によって形成される粒子は、沈殿による分画工程と、例えばセファロースＣＬ-４Ｂ、セファロースＣＬ-２Ｂ、セファロースＣＬ-６Ｂカラムおよびその組合せを用いたゲル濾過による精製工程の組合せによって、純粋型に単離されてもよい。ウイルス様粒子を単離する他の方法は当業者に公知であり、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子(ＶＬＰ)を単離させるために用いられてもよい。例えば、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離するための超遠心分離の使用については、米国特許第４,９１８,１６６号に記載されており、出典明記によってその全体が組み込まれる。
ＲＮＡバクテリオファージの結晶構造がいくつか測定されている(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-554 (1996))。このような情報から表面に露出した残基を同定してもよく、したがって、一つ以上の反応性のアミノ酸残基が挿入又は置換によって挿入されるように、ＲＮＡ-ファージコートタンパク質は修飾されてもよい。結果として、バクテリオファージコートタンパク質の修飾型も、本発明に用いることができる。ゆえに、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成するタンパク質(例えばバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＡＰ２０５およびバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質)の変異形も、修飾されたコア粒子、好ましくは修飾されたＶＬＰおよび本発明の組成物を調製するために用いられてもよい。
上記の変異形タンパク質の配列がそれらの野生型相対物と異なるにもかかわらず、これら変異形タンパク質は通常、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成する能力を保持する。ゆえに、本発明は組成物およびワクチン組成物それぞれを更に包含し、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異形、並びにその組成物およびワクチン組成物それぞれの調整方法、その組成物を調整するために用いる個々のタンパク質サブユニット、およびこれらタンパク質サブユニットをコードする核酸分子をさらに包含する。ゆえに、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成し、キャプシドないしはキャプシド様構造を対合および形成する能力を保持する野生型タンパク質の変異形も本発明の範囲内に含む。
その結果、本発明は、規則的な配列を形成する野生型タンパク質に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなるタンパク質を含有し、固有の反復性構造を有する組成物およびワクチン組成物それぞれをさらに包含する。さらに、本発明の組成物を調製するために用いられるタンパク質をコードする核酸分子が本発明の範囲内に包含される。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：４−２１に示すアミノ酸配列の何れかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなるタンパク質を含有する組成物をさらに包含する。
本発明の使用に好適なタンパク質は、キャプシドあるいはキャプシド様構造を形成するタンパク質、またはＶＬＰのＣ末端切断変異体も包含される。このような切断変異体の具体例として、Ｃ末端の１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸が除去されている配列番号：４−２１の何れかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質などがある。一般的に、これらＣ末端切断変異体は、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成する能力を保持するであろう。
本発明の使用に好適なタンパク質は、キャプシドあるいはキャプシド様構造を形成するタンパク質のＮ末端切断変異体も包含される。このような切断変異体の具体例として、Ｎ末端の１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸が除去されている配列番号：４−２１の何れかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質などがある。一般的に、これらＮ末端切断変異体は、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成する能力を保持するであろう。
本発明の使用に好適なタンパク質は、キャプシドあるいはキャプシド様構造を形成するＮ末端およびＣ末端の切断変異体も包含される。好適な切断変異体には、Ｎ末端の１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸と、Ｃ末端の１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸が除去されている配列番号：４−２１の何れかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質などがある。一般的に、これらＮ末端およびＣ末端の切断変異体は、キャプシドないしはキャプシド様構造を形成する能力を保持するであろう。
本発明は、上記の切断型変異体に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなるタンパク質を含有する組成物をさらに包含する。
したがって、本発明は修飾コア粒子、好ましくは修飾ＶＬＰ、およびキャプシドないしはＶＬＰを形成するタンパク質から調整された組成物およびワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニットおよびＶＬＰないしはキャプシドからの組成物の調整方法、個々のタンパク質サブユニットの調整方法、これらサブユニットをコードする核酸分子、および本発明のこれら組成物を用いた個体の免疫応答を誘発する方法および／または予防接種方法を包含する。
一実施態様では、本発明は、アジュバントをさらに含有してなる本発明のワクチン組成物を提供する。他の実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを欠いている。本発明の更なる実施態様では、ワクチン組成物は、本発明のコア粒子を含有しており、該コア粒子はウイルス様粒子を含む、好ましくはウイルス粒子であり、該ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子であることが好ましい。好ましくは、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージ、好ましくはＲＮＡファージのコートタンパク質の組換えタンパク質ないしはその断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。好ましい実施態様では、ＲＮＡファージのコートタンパク質は、(ａ)配列番号：４；(ｂ)配列番号：４および配列番号：５の混合物；(ｃ)配列番号：６；(ｄ)配列番号：７；(ｅ)配列番号：８；(ｆ)配列番号：９；(ｇ)配列番号：９および配列番号：１０の混合物；(ｈ)配列番号：１１；(ｉ)配列番号：１２；(ｋ)配列番号：１３；(ｌ)配列番号：１４；(ｍ)配列番号：１５；(ｎ)配列番号：１６；および、(ｏ)配列番号：２８からなる群から選択されるアミノ酸を有する。あるいは、本発明のワクチン組成物のウイルス様粒子の組換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異形コートタンパク質を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなり、該ＲＮＡ-ファージは、(ａ)バクテリオファージＱβ；(ｂ)バクテリオファージＲ１７；(ｃ)バクテリオファージｆｒ；(ｄ)バクテリオファージＧＡ；(ｅ)バクテリオファージＳＰ；(ｆ)バクテリオファージＭＳ２；(ｇ)バクテリオファージＭ１１；(ｈ)バクテリオファージＭＸ１；(ｉ)バクテリオファージＮＬ95；(ｋ)バクテリオファージｆ２；(ｌ)バクテリオファージＰＰ７；および、(ｍ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
好ましい実施態様では、前記ＲＮＡファージの変異形コートタンパク質は、置換による少なくとも一つのリジン残基の除去または付加によって修飾されている。他の好ましい実施態様では、前記ＲＮＡファージの変異形コートタンパク質は、少なくとも一つのリジン残基の欠失によって、または、挿入による少なくとも一つのリジン残基の付加によって修飾されている。好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージＱβ、あるいはＲＮＡ-ファージｆｒ、あるいはＲＮＡ-ファージＡＰ２０５の組換えタンパク質ないしはその断片を含んでなる。
上記したように、本発明はウイルス様粒子ないしはその組換え型を含む。さらに好適な一実施態様では、本発明の組成物に用いられる粒子はＢ型肝炎コアタンパク質(ＨＢｃＡｇ)ないしはＨＢｃＡｇの断片からなる。さらなる実施態様では、本発明の組成物に用いられる粒子はＢ型肝炎コアタンパク質(ＨＢｃＡｇ)ないしはＨＢｃＡｇタンパク質の断片からなり、遊離するシステイン残基の数を減らすか、除去するために修飾されている。Zhou 等 (J. Virol. 66:5393 5398 (1992))は、天然に存在するシステイン残基を取り除くために修飾されたＨＢｃＡｇがキャプシドを対合して形成する能力を保持することを示した。ゆえに、本発明の組成物の使用に適切なＶＬＰには、修飾されたＨＢｃＡｇないしはその断片を含んでなるものが含まれ、天延に存在するシステイン残基の一つ以上は欠失されるか他のアミノ酸残基(例えばセリン残基)に置換されている。
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセシングによって生成されるタンパク質である。ＨＢｃＡｇの多くのアイソタイプが同定されており、それらのアミノ酸配列は当業者に容易に利用できる。ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、ＨＢｃＡｇ(すなわちＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が取り除かれたＨＢｃＡｇ)のプロセシング型を用いて調整される。
さらに、プロセシングが起こらない条件下でＨＢｃＡｇが産生される場合、ＨＢｃＡｇは通常、「プロセシング」型と表現される。例えば、細胞質へのタンパク質の発現を導く大腸菌発現系を用いて本発明のＨＢｃＡｇを産生する場合、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように、これらのタンパク質は通常、発現される。
本発明に使用されるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えば国際公報００／３２２２７の特に実施例１７〜１９および２１〜２４、並びに国際公報０１／８５２０８の特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１および４１、および、国際公報０２／０５６９０５に開示される。後願のために、特に実施例２３、２４、３１および５１が参照される。これら３つの文書は出典明記によって本明細書中に明らかに組み込まれる。
また、本発明は、一つ以上の付加的なシステイン残基を欠失させるかまたは置換するために修飾されているＨＢｃＡｇ変異形を含む。遊離のシステイン残基が多くの化学的な副反応に伴うことが公知である。これらの副反応には、ジスルフィド交換、例えば他の物質と野併用療法で注入されるか構成される化学物質または代謝産物との反応又は、紫外線へさらされる際のヌクレオチドとの反応および直接酸化などが含まれる。したがって、毒性付加生成物が生成され、特にＨＢｃＡｇには核酸を結合する強い傾向があるという事実が考慮される。毒性付加生成物は多くの種の間に存在し、それぞれ個々には低濃度で存在するが合わさると毒性の濃度に達する。
上記からみて、天然に存在するシステイン残基を除去するために修飾されるワクチン組成物におけるＨＢｃＡｇの使用の一つの利点は、抗原又は抗原決定基が接着する場合に毒性のものが結合する部位の数が減るか、完全に除去されることである。
本発明の実施に適切な多くの天然に生じるＨＢｃＡｇ変異形が同定されている。多くのＨＢｃＡｇ変異形、並びにいくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体変異形のアミノ酸配列が、GenBank届出 AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520、P03153、AF110999およびM95589に開示されており、それぞれの開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。前述のＢ型肝炎コア抗原前駆体変異形の配列は、国際公報０１／８５２０８の配列番号：８９−１３８にさらに開示される。さらに、本発明の組成物の使用に適切なＨＢｃＡｇ変異形、および、この明細書の開示に従ってさらに修飾されうるものは、国際公報００／１９８３３３、国際公報００／１７７１５８および国際公報００／２１４４７８に記載される。
別の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、配列番号：２５の組換えタンパク質を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
ポリペプチドのアミノ酸配列が上記のアミノ酸配列のうちの１、あるいはその一部と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するかどうかは、最も適するプログラムなどの公知のコンピュータプログラムを用いて従来どおり決定することができる。特定の配列が参照アミノ酸配列と例えば９５％の同一性であるかどうかを決定するための最も好適なコンピュータプログラムか他の配列アラインメントプログラムを用いる場合、参照アミノ酸配列の完全長に対して同一性の割合を算出し、参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％まで相同性間隙が可能なようにパラメータを設定する。
前述のＨＢｃＡｇ変異形および前駆体のアミノ酸配列は互いに比較的類似している。ゆえに、配列番号：２５の特定の位置に対応する位置にあるＨＢｃＡｇ変異形のアミノ酸残基の表示は、配列番号：２５に示すアミノ酸配列の位置に存在するアミノ酸残基を意味する。これらＨＢｃＡｇ変異形間の相同性は、当業者が配列番号：２５に示すアミノ酸配列と特定のＨＢｃＡｇ変異形のアミノ酸とを比較して「対応する」アミノ酸残基を容易に同定できるように、哺乳動物を感染させるＢ型肝炎ウイルスの中で十分に高いものである。
また、本発明は、トリを感染させるＢ型肝炎ウイルスのＨＢｃＡｇ変異形を含有するワクチン組成物、並びにこれらＨＢｃＡｇ変異形の断片を含んでなるワクチン組成物を包含する。これらＨＢｃＡｇ変異形には、これらのポリペプチドに天然に存在する１、２、３ないしはそれ以上のシステイン残基は、他のアミノ酸残基によって置換されるか本発明のワクチン組成物への封入の前に欠失させてもよい。
上記のように、遊離システイン残基の除去により、有毒成分がＨＢｃＡｇと結合しうる部位の数が減少し、更に、同じないしは隣接するＨＢｃＡｇ分子のリジン残基とシステイン残基の架橋が起こりうる部位が除去される。したがって、本発明の他の実施態様では、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の一つ以上のシステイン残基は、除去するか他のアミノ酸残基によって置換してある。
他の実施態様では、本発明の組成物およびワクチン組成物それぞれは、Ｃ末端領域(例えば配列番号：２５のアミノ酸残基１４５−１８５又は１５０−１８５)が取り除かれたＨＢｃＡｇｓを含有する。ゆえに、本発明の実施に適切な付加的な修飾ＨＢｃＡｇｓにはＣ末端切断変異体が含まれる。好適な切断変異体には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から取り除かれているＨＢｃＡｇなどがある。
本発明の実施に適切なＨＢｃＡｇにはＮ末端切断変異体が含まれる。好適な切断変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７のアミノ酸がＮ末端から取り除かれている修飾ＨＢｃＡｇなどがある。
さらに、本発明の実施に適切なＨＢｃＡｇにはＮ末端およびＣ末端の切断変異体が含まれる。好適な切断変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７のアミノ酸がＮ末端から取り除かれ、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から取り除かれているＨＢｃＡｇなどがある。
さらに、本発明は、上記の切断型変異体に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチン組成物それぞれを包含する。
本発明の特定の実施態様では、リジン残基がＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、ＨＢｃＡｇのＶＬＰへの本発明のＴＮＦペプチドの結合を媒介する。
本発明の好ましい実施態様では、修飾コア粒子および特に本発明の修飾ＶＬＰ、および本発明の組成物は、配列番号：２５のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含んでなるか、あるいはそれからなるＨＢｃＡｇを用いて調整され、位置７９および８０に対応するアミノ酸がＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ(配列番号：２７)のアミノ酸配列を有するペプチドに置換されて配列番号：２６に示す配列を有するＨＢｃＡｇポリペプチドとなるように修飾される。更なる好ましい実施態様では、配列番号：２５の位置４８および１０７のシステイン残基はセリンに変異される。さらに本発明は、上記のＢ型肝炎コア抗原前駆体変異形の何れかに示すアミノ酸配列を有し、上記のアミノ酸変異も有する対応するポリペプチドを含有する組成物を包含する。さらに、キャプシドないしはＶＬＰを形成するために対合することができ、上記のアミノ酸置換を有する付加的なＨＢｃＡｇ変異形が、本発明の範囲内に包含される。ゆえに、本発明は、野生型アミノ酸配列、Ｎ末端リーダー配列が適切に除去されるようにプロセシングされて上記の変異で修飾されたタンパク質の形態の何れかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含んでなるか、あるいはそれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物およびワクチン組成物のそれぞれを包含する。
本発明の組成物又はワクチン組成物は異なるＨＢｃＡｇの混合物を含んでもよい。ゆえに、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇから成ってもよい。例えば、ワクチン組成物は、「野生型」ＨＢｃＡｇおよび一つ以上のアミノ酸残基が変異した(例えば、欠失、挿入または、置換)修飾ＨＢｃＡｇを含んで調製されうる。さらに、本発明の好適なワクチン組成物は、非常に規則的に反復する配列を有するものであり、抗原が本発明のＴＮＦペプチドである。
本発明の更なる好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドは、少なくとも一つの共有結合によって前記コア粒子およびウイルス様粒子それぞれに結合する。好ましくは、少なくとも一つのＴＮＦペプチドはコア粒子およびウイルス様粒子それぞれに、少なくとも一つの共有結合によって結合するものであり、該共有結合はコア粒子-ＴＮＦペプチド配列又はコンジュゲートを引き起こす非ペプチド結合であり、該配列又はコンジュゲートは典型的に好ましくは規則的に反復するものである。少なくとも１、通常は１以上の本発明のＴＮＦペプチドが適する様式でＶＬＰおよびコア粒子それぞれに結合するので、このＴＮＦペプチド-ＶＬＰ配列およびコンジュゲートのそれぞれは、典型的に好ましくは反復する規則的な配列である。好ましくは１２０以上、好ましくは１８０以上、より好ましくは２７０以上およびさらにより好ましくは３６０以上の本発明のＴＮＦペプチドがＶＬＰに結合する。反復性の規則的なＴＮＦ-ＶＬＰおよびコア粒子それぞれ、配列およびコンジュゲートそれぞれの形成は、ＶＬＰおよびコア粒子それぞれに対する少なくとも一の本発明のＴＮＦペプチドの適切で関係する、並びに定義された結合および付着それぞれによって確認される。このことは以下の記載で明らかになるであろう。さらに、ＶＬＰおよびコア粒子の典型的な固有の非常に反復性のある組織化された構造はそれぞれ、好適に規則的で反復する様式で本発明のＴＮＦペプチドを表出して非常に組織化された反復性のＴＮＦペプチド-ＶＬＰ／コア粒子配列およびコンジュゲートそれぞれとなる能力に有利に働く。
本発明の更なる好ましい実施態様では、コア粒子又はウイルス様粒子が少なくとも一つの第一付着部位を含有し、前記の少なくとも一つのＴＮＦペプチドが、(i)少なくとも一のＴＮＦペプチドによって天然に生じない付着部位；および(ii)少なくとも一のＴＮＦペプチドによって天然に生じる付着部位からなる群から選択される少なくとも一つの第二付着部位を含有し、ＴＮＦペプチドのコア粒子およびウイルス様粒子への結合が該第一付着部位と該第二付着部位との対合により影響を受け、該対合が少なくとも一の非ペプチド結合によるものであるのが好ましい。
本発明の更なる好ましい実施態様では、修飾ＶＬＰが少なくとも一つの第一付着部位を有するＶＬＰを含有し、さらに、修飾ＶＬＰが、(i)少なくとも一のＴＮＦペプチドによって天然に生じない付着部位；および(ii)少なくとも一のＴＮＦペプチドによって天然に生じる付着部位からなる群から選択される少なくとも一つの第二付着部位を有するＴＮＦペプチドを含有し、第二付着部位が第一付着部位に対合することができるものであり；ＴＮＦペプチドとＶＬＰが該対合を介して相互作用して規則的な反復する抗原配列を形成することが好ましい。対合は少なくとも一つの非ペプチド結合によるものであることが好ましい。
本発明は、本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドのコア粒子およびＶＬＰそれぞれへの結合方法を開示する。上記のように本発明の好適な一態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、化学的な架橋剤により、一般的に好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を用いることにより、コア粒子およびＶＬＰそれぞれに結合する。いくつかのヘテロ二機能性架橋剤は当分野で公知である。好ましい実施態様では、ヘテロ二機能性架橋剤が、好適な第一付着部位、すなわちコア粒子およびＶＬＰないしは少なくとも一のＶＬＰサブユニットそれぞれのリジン残基の側鎖アミノ基と反応しうる官能基、および好適な第二付着部位、すなわち本発明のＴＮＦペプチドに付加されたないしは遺伝的に付加された、場合によっては還元による反応に有用なシステイン残基と反応しうる官能基を含有する。一般的には誘導体化と称される手順の第一工程では、コア粒子又はＶＬＰの架橋剤による反応である。この反応の産物は、活性化担体とも称される活性化コア粒子または活性化ＶＬＰである。第二工程では、反応していない架橋剤は、通常の方法、例えばゲル濾過又は透析を用いて除去される。第三工程では、本発明のＴＮＦペプチドは活性化担体と反応し、この処置は一般的に共役工程と称されている。場合によっては本発明の反応していないＴＮＦペプチドは、第四工程で、例えば透析によって除去されてもよい。いくつかのヘテロ二機能性架橋剤は当分野で公知である。これには、好適な架橋剤ＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡおよび、例えばPierce Chemical社(Rockford, IL, USA)から入手可能な他の架橋剤、アミノ基と反応する１の官能基およびシステイン残基と反応する１の官能基を有するものが含まれる。上記の架橋剤すべてにより、アミノ基との反応およびシステインとのチオエーテル結合の後、アミド結合の形成が引き起こされる。本発明の実施に適切な架橋剤の他の種類は、共役の際に本発明のＴＮＦペプチドおよびコア粒子又はＶＬＰとのジスルフィド結合の導入に特徴がある。この種類に属している好適な架橋剤には、例えばＳＰＤＰおよびスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。架橋剤によるコア粒子およびＶＬＰそれぞれの誘導体化の程度は、各々の反応パートナーの濃度、他のものに対する一試薬の超過濃度、ｐＨ、温度およびイオン強度などの実験条件を変えることによって影響されうる。共役の程度、すなわちコア粒子およびＶＬＰそれぞれのサブユニット当たりの本発明のＴＮＦペプチドの量は、ワクチンの必要に応じて上記の実験条件を変えることによって調整されてもよい。本発明のＴＮＦペプチドの溶解性は、それぞれのサブユニットに共役しうる本発明のＴＮＦペプチドの量を制限してもよく、得られたワクチンが不溶解性である場合には、サブユニット当たりの本発明のＴＮＦペプチドの量を減少するのが有用である。
コア粒子およびＶＬＰそれぞれに対する本発明のＴＮＦペプチドの特に有用な結合方法は、本発明のＴＮＦペプチド上のシステイン残基と、コア粒子およびＶＬＰそれぞれの表面上のリジン残基との結合である。ゆえに、本発明の好ましい実施態様では、第一付着部位はリジン残基であり、第二付着部位はシステイン残基である。いくつかの実施態様では、それぞれコア粒子およびＶＬＰへの共役のための本発明のＴＮＦペプチドに対する第二付着部位として、またはその一部として、システイン残基を含有するアミノ酸リンカーの遺伝的操作を加えてもよい。あるいは、本発明のＴＮＦペプチドに加えることによってシステインを導入してもよい。あるいは、化学的共役によってシステイン残基を導入してもよい。
本発明の更なる好ましい実施態様では、少なくとも一つの第一付着部位はアミノ基を含んでなるか、好ましくはアミノ基であり、よりさらに好ましくは該第一付着部位はリジン残基のアミノ基である。
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一つの第二付着部位はスルフヒドリル基を含んでなるか、好ましくはスルフヒドリル基であり、よりさらに好ましくは該第二付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。
本発明のより更なる好ましい実施態様では、第一付着部位は、スルフヒドリル基でないか、好ましくはスルフヒドリル基を含まないものであり、さらに好ましくは、第一付着部位は、システイン残基のスルフヒドリル基でないか、好ましくはそれを含まないものである。
アミノ酸リンカーの選択は、本発明のＴＮＦペプチドの性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布およびグリコシル化に依存する。一般的に、順応性があるアミノ酸リンカーが特別に有用である。アミノ酸リンカーの好ましい実施態様は、国際公報０３／０３９２２５の６０ページ第２４行から６１ページ第１１行(パラグラフ００１７９および００１８０)に開示されており、出典明記により本明細書中に明らかに組み込まれる。
本発明の更なる好ましい実施態様では、特に、本発明のＴＮＦペプチドがＲＡＮＫＬ又はＴＮＦαに由来する場合、好適なアミノ酸リンカーは、ペプチドのＣ末端がＧＧＣＧ(配列番号：２４)、ＧＧＣ又はＧＧＣ-ＮＨ２(「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ末端がＣＧＧである。一般に、グリシン残基はシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて第二付着部位として用いられ、共役反応のより大きなアミノ酸の潜在的な立体障害を回避する。
本発明のＴＮＦペプチドに付加されるシステイン残基が還元状態にあり、活性化ＶＬＰ上のヘテロ二機能性架橋剤により反応すると、遊離スルフヒドリル基による遊離システイン又はシステイン残基は有用となりうる。結合部位として機能するシステイン残基が酸化型である場合、例えば、それがジスルフィド架橋を形成していると、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はβ-メルカプトエタノールによるこのジスルフィド架橋の還元が必要である。
上記の好適な方法によるヘテロ二機能性架橋剤を用いたコア粒子およびＶＬＰそれぞれに対する本発明のＴＮＦペプチドの結合により、本発明のＴＮＦペプチドが好適な様式でコア粒子およびＶＬＰそれぞれに共役する。本発明のＴＮＦペプチドのコア粒子およびＶＬＰそれぞれに結合する他の方法には、本発明のＴＮＦペプチドがカルボジイミドＥＤＣ及びＮＨＳを用いた、コア粒子およびＶＬＰそれぞれに架橋される方法が含まれる。本発明のＴＮＦペプチドも、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランとの反応を介して最初にチオレート化されてもよい。本発明のＴＮＦペプチドは、必要であれば脱保護の後に、以下のようにコア粒子およびＶＬＰそれぞれに連結してもよい。過剰なチオレート化試薬の分離の後、本発明のＴＮＦペプチドは、予めシステイン反応性の成分を含有するヘテロ二機能性架橋剤によって活性化されて、少なくとも１ないしはいくつかの官能基、好ましくはシステイン残基に対して反応性の、上記のようなチオレート化されたＴＮＦペプチドが反応しうる１の官能基を表出するコア粒子およびＶＬＰそれぞれと反応する。場合によって、低濃度の還元剤が反応混合物に含まれる。更なる方法では、本発明のＴＮＦペプチドは、グルタールアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３(Pierce, Chemical Company, Rockford, USA)などのホモ二機能性架橋剤、又は、コア粒子およびＶＬＰそれぞれのアミン基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の公知のホモ二機能性架橋剤を用いて、コア粒子およびＶＬＰそれぞれに付着する。
本発明のＴＮＦペプチドへのＶＬＰの他の結合方法には、コア粒子およびＶＬＰそれぞれがビオチン化される方法や、ストレプトアビジン-融合タンパク質として発現される本発明のＴＮＦペプチドや、例えば国際公報００／２３９５５に記載のような、本発明のＴＮＦペプチドおよびコア粒子およびＶＬＰがそれぞれビオチン化される方法などがある。この場合、本発明のＴＮＦペプチドが、遊離結合部位がコア粒子およびＶＬＰそれぞれの結合に依然として利用できるように、本発明のＴＮＦペプチドの割合をストレプトアビジンに調節することによって第一にストレプトアビジンないしはアビジンに結合してもよい。あるいは、すべての成分が「ワンポット(one pot)」反応に混合されてもよい。レセプターおよびリガンドの可溶性型が利用でき、コア粒子およびＶＬＰそれぞれないしは本発明のＴＮＦペプチドに架橋することができる他のリガンド-レセプター対は本発明のＴＮＦペプチドとコア粒子およびＶＬＰそれぞれとの結合のための結合試薬として用いてもよい。
あるいは、リガンド又はレセプターは本発明のＴＮＦペプチドに融合されてもよく、化学的に結合するか、レセプターないしはリガンドの何れかと融合して、コア粒子およびＶＬＰへの結合を媒介してもよい。また、融合は挿入又は置換によって影響されうる。
すでに記載したように、本発明の特別に有利な実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰである。
１又はいくつかの抗原分子、すなわち本発明のＴＮＦペプチドは、好ましくは立体配置的に許容可能であるならばＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリジン残基を介して、キャプシド又はＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの一サブユニットに付着されてもよい。したがって、ＲＮＡファージのコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰのある特徴は、一サブユニットにいくつかの抗原が共役するという可能性である。これにより密度の高い抗原配列を生成することができる。
本発明の好ましい実施態様では、コア粒子およびウイルス様粒子それぞれに対する本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドの結合および接着のそれぞれは、ウイルス様粒子の少なくとも一の第一付着部位と本発明のＴＮＦペプチドに付加される少なくとも一の第二付着部位との相互作用および対合によるものである。
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰ又はキャプシドは、表面上に規定された数のリジン残基を表出しており、キャプシドの内部に向かって位置してＲＮＡと相互作用する３つのリジン残基と、キャプシドの外側にさらされるさらに４つのリジン残基を有する定められた幾何的位相を有する。この明らかとなった性質により、リジン残基がＲＮＡと相互作用する粒子の内部よりもむしろ粒子の外側に抗原が接着する。他のＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰも、その表面上に決まった数のリジン残基と幾何的位相を有する。
本発明の更なる好ましい実施態様では、第一付着部位はリジン残基であり、および／または、第二付着部位はスルフヒドリル基又はシステイン残基を含んでなる。本発明のとても好ましい実施態様では、第一付着部位はリジン残基であり、第二付着部位はシステイン残基である。
本発明の更なる好ましい実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドはシステイン残基を介して結合し、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰのリジン残基に、本発明のＴＮＦペプチドを付加している。
ＲＮＡファージから得られるＶＬＰの他の利点は、手頃なコストで大量の材料の産生が可能となる細菌における高い発現効率である。他の好ましい実施態様は、本発明のＴＮＦポリペプチドとＲＮＡファージコートタンパク質との融合タンパク質から得られるＶＬＰである。
担体としてのＶＬＰを使用することにより、可変的な抗原密度を有する強い抗原配列の形成とコンジュゲートが得られる。特にＲＮＡファージのＶＬＰの使用、特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰの使用により、非常に高いエピトープ又は抗原密度が達成される。高いエピトープ又は抗原密度を有するＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの組成物の調製は、この出願の教示によるものである。好ましい実施態様では、本発明の組成物およびワクチンは、０．０５から４．０の抗原密度を有する。本明細書において用いられる「抗原密度」なる用語は、ＶＬＰのサブユニット当たり、好ましくはコートタンパク質当たり、さらに好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰ当たりに結合される本発明のＴＮＦペプチドの平均数を指す。ゆえに、この値は、本発明の組成物又はワクチン中のすべてのＶＬＰ、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのサブユニット又は単量体の平均として算出される。本発明の更なる好ましい実施態様では、抗原密度は０．１と４．０の間であることが好ましい。
上述の通り、４つのリジン残基はＱβコートタンパク質のＶＬＰの表面に露出する。一般的に、これらの残基は架橋剤分子との反応の際に誘導される。露出したリジン残基の全てが抗原に共役していない場合、架橋剤と反応したリジン残基は、誘導工程の後にεアミノ基に付着した架橋分子とともに残る。これによって１又はいくつかの正電荷が起こり、ＶＬＰの溶解性および安定性に不利益となりうる。本発明者等は、以下に記載の開示されたＱβコートタンパク質変異体のように、アルギニン残基が好適な架橋剤と反応しないので、いくつかのリジン残基をアルギニンへ置換することによって正電荷の過剰な消失を予防する。さらに、抗原との反応に利用可能な部位が少ないほど、アルギニンによるリジン残基の置換によりより多くの定義された抗原配列が生じる。
したがって、露出したリジン残基は、以下のＱβコートタンパク質変異体および変異形Ｑβ ＶＬＰのアルギニンによって置換された。ゆえに、本発明の他の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、変異形Ｑβコートタンパク質を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。好ましくは、これらの変異形コートタンパク質は、ａ)Ｑβ-２４０(Ｌｙｓ１３ -Ａｒｇ；配列番号：１７)、ｂ)Ｑβ-２４３(Ａｓｎ１０-Ｌｙｓ；配列番号：１８)、ｃ)Ｑβ-２５０(Ｌｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３-Ａｒｇ)；配列番号：１９)、ｄ)Ｑβ-２５１(配列番号：２０)、および、ｅ)Ｑβ-２５９(Ｌｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６-Ａｒｇ；配列番号：２１)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。上記のＱβコートタンパク質、変異形Ｑβコートタンパク質ＶＬＰおよびキャプシドの構造、発現および精製は、それぞれ、国際公報０２／０５６９０５に記述される。上述した出願の実施例１８が特に参照される。他の本発明の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＱβの組換えタンパク質又はその断片を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなり、該組換えタンパク質は前述の変異体および対応するＡ１タンパク質のいずれか一つの混合物を含んでなるか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
ＶＬＰ、特にＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰに対する抗原の特別に有利な接着方法は、抗原上に天然に存在するかあるいは遺伝的に操作して存在するシステイン残基と、ＲＮＡファージコートタンパク質、すなわち本発明のＴＮＦペプチドのＶＬＰの表面上に存在するリジン残基の結合である。システイン残基が第二付着部位として有効であるためには、スルフヒドリル基は共役に利用可能でなくてはならない。ゆえに、システイン残基は還元状態、つまり遊離スルフヒドリル基を有する遊離システイン又はシステイン残基でなければならない。第二付着部位として機能するシステイン残基が酸化型である場合、例えば、それがジスルフィド架橋を形成している場合には、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はβメルカプトエタノールによるジスルフィド架橋の還元が必要である。抗原に対する還元剤の濃度および還元剤のモル過剰量は、各々の抗原ごとに調整されなければならない。必要な場合には、還元剤を１０ｍＭかより低い濃度から滴定を開始し、１０〜２０ｍＭ以上までの範囲で試験を行い、担体に対する抗原の共役を評価する。国際公報０２／０５６９０５に記載のように、低濃度の還元剤は共役反応に適するが、高い濃度であれば共役反応を阻害する。これは当業者であれば知りうることであり、その場合には、還元剤は透析又はゲル濾過によって取り除かなければならない。好ましくは、透析又は平衡化緩衝液のｐＨは７より低く、好ましくは６である。抗原活性又は安定性に低ｐＨ緩衝液が適合するかどうかは試験すべきである。
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度は、架橋剤および他の反応条件の選択によって調整されてもよい。例えば、架橋剤スルホ-ＧＭＢＳおよびＳＭＰＨは、一般的に高いエピトープ密度が達成される。誘導は反応物の濃度の高さに明らかに影響され、反応条件を操作して、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに共役される抗原の数を調整することができる。
非天然の第二付着部位の設定の前に、融合、挿入または一般的には遺伝子操作する位置を選択すべきである。ゆえに、第二付着部位または第二付着部位を含有する任意のアミノ酸リンカーからの立体障害を避けるために、第二付着部位の位置を選択する。更なる実施態様では、その天然リガンドと自己抗原との相互作用部位と異なった部位に対する抗体応答が望ましい。このような実施態様では、その天然リガンドと自己抗原との相互作用部位に対する抗体の生成が阻害されるように、第二付着部位を選択してもよい。
好ましい実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、コア粒子およびＶＬＰないしはＶＬＰサブユニット上の第一付着部位との対合が可能な付加された単一の第二付着部位又は単一の反応性付着部位を含んでなる。これにより、少なくとも一、しかし典型的には一以上、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３６０、４００、４５０以上の本発明のＴＮＦペプチドのコア粒子およびＶＬＰそれぞれへの定義された、均一な結合および対合が生じる。したがって、抗原上の単一の第二付着部位又は単一の反応性付着部位の供給により、非常に規則的な反復性の配列が生じる、単一で均一な結合および対合が生じる。例えば、結合および対合がそれぞれ、リジン-(第一付着部位として)およびシステイン-(第二付着部位として)相互作用によりもたらされる場合、本発明の好ましい実施態様では、本発明の１つのＴＮＦペプチドに対して１つの付加されたシステイン残基だけが、コア粒子のＶＬＰおよび第一付着部位と結合および対合が可能である。
いくつかの実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドの上の第二付着部位の遺伝子操作により、本発明で開示される第二付着部位として適切なアミノ酸を含有するアミノ酸リンカーの融合が達成される。したがって、本発明の好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーは、好ましくは少なくとも一つの共有結合によってＴＮＦペプチドに結合している。好ましくは、アミノ酸リンカーは第二付着部位を含んでなるか、あるいはそれからなる。更なる好適な実施態様では、アミノ酸リンカーはスルフヒドリル基又はシステイン残基を含んでなる。他の好適な実施態様では、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカー並びに本発明のアミノ酸リンカーの更なる好適な実施態様の選別の基準のいくつかはすでに上記で言及した。
本発明の更なる好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドは、コア粒子およびウイルス様粒子それぞれに融合する。上記に概説されるように、ＶＬＰは一般的に、ＶＬＰ内にアセンブリしている少なくとも一つのサブユニットから成る。ゆえに、本発明の更なる好ましい実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、ウイルス様粒子の、または、キメラＶＬＰ-サブユニットＴＮＦペプチドタンパク質融合を生成するＶＬＰ内に組み込まれることが可能なタンパク質の少なくとも一つのサブユニットに融合する。
本発明のＴＮＦペプチドの融合は、ＶＬＰサブユニット配列内への挿入、または、ＶＬＰ-サブユニットのＮ末端ないしはＣ末端またはＶＬＰ内に組み込まれることが可能なタンパク質への融合によってもたらされてもよい。以下に、ＶＬＰサブユニットへのペプチドの融合タンパク質を指すとき、サブユニット配列の何れかの末端への融合またはサブユニット配列内のペプチドの内部挿入が包含され、本発明のＴＮＦペプチドとの融合は融合ポリペプチドのＮ末端で、すなわちＶＬＰサブユニットのＣ末端を介して融合している。
また、本発明のＴＮＦペプチドの配列をサブユニット配列の一部を欠失しているＶＬＰサブユニットの変異形に挿入することによって融合してもよく、さらにこれを切断変異体と称する。切断変異体は、ＶＬＰサブユニットの配列の一部のＮ末端又はＣ末端、又は内部を欠失していてもよい。例えばアミノ酸残基７９−８１の欠失を有するあるＶＬＰ ＨＢｃＡｇは、内部欠損を有する切断変異体である。また、切断変異体ＶＬＰ-サブユニットのＮ末端又はＣ末端の何れかへの本発明のＴＮＦ-ペプチドの融合も本発明の実施態様である。同様にまた、例えば特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇのアミノ酸７９−８１が外来性のエピトープによって置換されることによって、ＶＬＰサブユニットの配列内へエピトープを融合してもよい。ゆえに、以下で述べるように、ＶＬＰサブユニットの配列内への本発明のＴＮＦペプチドの配列の挿入、本発明のＴＮＦペプチドの配列へのＶＬＰサブユニットの配列の一部の置換、または、欠失、置換ないしは挿入の組合せによって融合してもよい。
キメラＴＮＦペプチド-ＶＬＰサブユニットは、一般にＶＬＰ内への自己アセンブリが可能である。それらのサブユニットに融合したエピトープを表出するＶＬＰも本明細書においてキメラＶＬＰと称される。上記のように、ウイルス様粒子は少なくとも一つのＶＬＰサブユニットを含んでなるか、あるいはそれからなる。本発明の更なる実施態様では、ウイルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットおよび非キメラＶＬＰサブユニット、すなわち融合した抗原を有さないＶＬＰサブユニット、いわゆるモザイク粒子となるものの混合を含んでなるか、あるいはそれからなる。これはＶＬＰの形成およびＶＬＰへのアセンブリを確認するために有益であるそれらの実施態様では、総ＶＬＰサブユニットのキメラＶＬＰ-サブユニットの割合は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％以上であってもよい。
側方アミノ酸残基は本発明のＴＮＦペプチドの配列のいずれかの末端に付加されてもよく、ＶＬＰのサブユニットの配列の何れかの末端に融合するため、または、ＶＬＰのサブユニットの配列内へのペプチド配列の内部挿入のために、上記の本発明の融合ポリペプチドについて述べられた必要性を満たすものである。グリシンおよびセリン残基は、融合する本発明のＴＮＦペプチドに付加する隣接配列に用いるために特に優れたアミノ酸である。グリシン残基は付加的なフレキシビリティを与え、これによってＶＬＰサブユニットの配列内への外来性配列の融合を潜在的に不安定にする効果を減少させうる。
本発明の特定の実施態様では、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。HBcAgのＮ末端(Neyrinck, S. 等, Nature Med. 5: 1157-1163 (1999))又はいわゆる主要抗原決定領域(ＭＩＲ)内の挿入部位何れかへの融合タンパク質が記載されており(Pumpens, P. およびGrens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)、国際公報01/98333)、本発明の好ましい実施態様である。また、ＭＩＲに欠失を有するＨＢｃＡｇの天然に生じる変異形も記載されており(Pumpens, P.およびGrens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)、出典明記によってその全体が特別に組み込まれる)、Ｎ末端又はＣ末端に対する融合、並びにｗｔ ＨＢｃＡｇと比較したときの欠損部位に対応するＭＩＲの位置の挿入は、本発明の更なる実施態様である。また、Ｃ末端に対する融合も記載されている(Pumpens, P. およびGrens, E., Intervirology 44:98-114 (2001))。当業者は、典型的な分子生物学技術を用いた融合タンパク質の構築方法については容易に理解されるであろう(Sambrook, J.等, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ho 等, Gene 77:51 (1989))。
本発明の更なる好適な実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要なコートタンパク質は、細菌、特に大腸菌内で発現されると、ＶＬＰ内に自然発生的にアセンブリされる。本発明の組成物を調製するために用いられうるバクテリオファージコートタンパク質の具体例には、ＲＮＡバクテリオファージ、例えばバクテリオファージＱβ (配列番号:4；PIRデータベース、受託番号VCBPQβ、QβCPと称する、および配列番号:5；受託番号AAA16663 、Qβ A1タンパク質と称する)、およびバクテリオファージfr (配列番号:7；PIR 受託番号VCBPFR)のコートタンパク質などがある。
より好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドはＱβコートタンパク質に融合される。エピトープがＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合されるか、またはＡ１タンパク質の範囲内で挿入される融合タンパク質コンストラクトが記載されている(Kozlovska, T. M., 等, Intervirology, 39:9-15 (1996))。Ｎ末端メチオニンの切断が考えられる場合、Ａ１タンパク質はＵＧＡ停止コドンでの抑制によって生成され、３２９ａａ又は３２８ａａの長さを有する。アラニンの前のＮ末端メチオニン(ＱβＣＰ遺伝子にコードされる第二アミノ酸)の切断は、通常大腸菌内で起こり、これはＱβコートタンパク質ＣＰのＮ末端の場合である。Ａ１遺伝子の一部、ＵＧＡアンバーコドンの３'は、ＣＰ伸展をコードしており、１９５のアミノ酸の長さを有する。ＣＰ伸展の位置７２と７３の間の本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドの挿入は、本発明の更なる実施態様である(Kozlovska, T. M., 等, Intervirology 39:9-15 (1996))。Ｃ末端切断型ＱβＡ1タンパク質のＣ末端での本発明のＴＮＦペプチドの融合は、本発明の更なる好適な実施態様となる。例えば、Kozlovska 等(Intervirology, 39: 9-15 (1996))は、エピトープが位置１９で切断されたＱβＣＰ伸展のＣ末端で融合されたＱβＡ1タンパク質融合を記述する。
Kozlovska 等 (Intervirology, 39:9-15 (1996))によって記述されるように、融合されたエピトープを表出する粒子のアセンブリは、一般的に、モザイク粒子を形成するためにＡ１タンパク質-ＴＮＦペプチド融合とｗｔ ＣＰの存在を必要とする。しかしながら、融合する本発明の少なくとも一つのＴＮＦペプチドを有するＶＬＰサブユニットのみからなるウイルス様粒子、特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰを含んでなる実施態様もまた、本発明の範囲内である。
モザイク粒子の産生は多くの方法で行われてもよい。Kozlovska 等, Intervirolog, 39:9-15 (1996)は、本発明の実施に用いることができる２つの方法を記述している。第一の方法では、ＵＧＡコドンをＴｒｐに翻訳するクローン化ＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドを保持する大腸菌株内での、ＣＰとＣＰ伸展の間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβＡ１タンパク質融合をコードするプラスミドの発現によって、ＶＬＰ上で融合したエピトープが効率よく表出される(pISM3001プラスミド(Smiley B.K., 等, Gene 134:33-40 (1993)))。第二の方法では、ＣＰ遺伝子停止コドンはＵＡＡ内で修飾され、Ａ１タンパク質-ＴＮＦペプチド融合を発現する第二のプラスミドが同時に形質移入される。第二のプラスミドは異なる抗生物質耐性をコードし、複製開始点は第一プラスミドと互換性を持つ(Kozlovska, T. M., 等, Intervirology 39:9-15 (1996))。Kozlovska 等, Intervirology, 39:9-15 (1996)の図１に記載のように、第三の方法では、ＣＰおよびＡ１タンパク質-ＴＮＦペプチド融合はバイシストロン性にコードされており、場合によってはＴｒｐプロモータなどのプロモータに連結されている。
さらなる実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドがアミノ酸２と３(切断されたＣＰの番号であり、Ｎ末端メチオニンが切断されているもの)の間に挿入されることによって、ＴＮＦペプチド-ｆｒＣＰ融合タンパク質となる。ＶＬＰに自己アセンブリされ、本発明の実施に有用なｆｒＣＰ融合タンパク質の構築と発現のためのベクターおよび発現について記載されている(Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。特定の実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドの配列は、ｆｒＣＰの残基３および４が欠失されているｆｒＣＰの欠失変異体のアミノ酸２の後に挿入されている(Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。
ＲＮＡファージＭＳ-２のコートタンパク質のＮ末端突出βヘアピン内のエピトープの融合および続いて起こるＲＮＡファージＭＳ-２の自己アセンブリされたＶＬＰ上の融合したエピトープ提示についても記述されており(国際公報９２／１３０８１)、ＭＳ-２ＲＮＡファージのコートタンパク質内への挿入または置換による本発明のＴＮＦペプチドの融合も本発明の範囲内である。
本発明の他の実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは乳頭腫ウイルスのキャプシドタンパク質に融合されている。より具体的な実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、ウシ乳頭腫ウイルスタイプ１(ＢＰＶ-１)の主要なキャプシドタンパク質Ｌ1に融合される。バキュロウイルス／昆虫細胞株におけるＢＰＶ-１融合タンパク質の構築および発現のためのベクターおよび発現系について記述されている(Chackerian, B. 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公報００／２３９５５)。本発明のＴＮＦペプチドによるＢＰＶ-１ Ｌ1のアミノ酸１３０−１３６の置換によりＢＰＶ-１ Ｌ1-ＴＮＦペプチド融合タンパク質が生じる。これは本発明の好ましい実施態様である。バキュロウイルスベクターのクローニングおよびバキュロウイルス感染したＳｆ9細胞内での発現について記述されており、本発明の実施に用いることができる(Chackerian, B. 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公報００／２３９５５)。本発明の融合したＴＮＦペプチドを表出するアセンブリされた粒子の精製は、多くの方法、例えばゲル濾過又は蔗糖勾配超遠心分離によって行うことができる(Chackerian, B. 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公報００／２３９５５))。
本発明の更なる実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、Ｔｙ ＶＬＰ内に組み込まれることが可能なＴｙタンパク質に融合される。より具体的な実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、ＴＹＡ遺伝子にコードされるキャプシドタンパク質またはｐ１に融合される(Roth, J.F., Yeast 16:785-795 (2000))。酵母レトロトランスポゾンＴｙ1、２、３および４はパン酵母から単離され、レトロトランスポゾンＴｆ1は分裂酵母から単離されている (Boeke, J.D.およびSandmeyer, S.B., "Yeast Transposable elements," in The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics., p. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991))、。レトロトランスポゾンＴｙ1および２は、植物および動物の成分のコピア種類に関連し、Ｔｙ3は植物および動物のレトロウイルスに関連するレトロトランスポゾンのｇｙｐｓｙファミリに属する。Ｔｙ1レトロトランスポゾンでは、ｐ1タンパク質は、ガーグ(Gag)又はキャプシドタンパク質とも称され、４４０のアミノ酸の長さを有する。Ｐ１は位置４０８でＶＬＰの成熟の間に切断され、ＶＬＰの必須成分であるｐ2タンパク質となる。
ｐ1への融合タンパク質および酵母内での該融合タンパク質の発現のためのベクターについて記述されている(Adams, S.E., 等, Nature 329:68-70 (1987))。そのため、例えば、本発明のＴＮＦペプチドは、本発明のＴＮＦペプチドをコードする配列をｐＭＡ5620プラスミドのＢａｍＨ1部位に挿入することによって、ｐ1に融合してもよい(Adams, S.E., 等, Nature 329:68-70 (1987))。ｐＭＡ5620ベクター内に外来性エピトープをコードする配列をクローニングすることにより、外来性エピトープのＮ末端にＣ末端を融合したＴｙ1-１５のｐ1のアミノ酸１−３８１を含んでなる融合タンパク質が発現される。同様に、本発明のＴＮＦペプチドのＮ末端融合、または、ｐ1配列への内部挿入、またはｐ1配列の一部の置換も本発明の範囲内であることを意図する。特に、Ｔｙタンパク質ｐ1(ＥＰ0677111)のアミノ酸３０−３１、６７−６８、１１３−１１４および１３２−１３３間のＴｙ配列内への本発明のＴＮＦペプチドの挿入は本発明の好ましい実施態様である。
さらに、本発明のＴＮＦペプチドの融合に適切なＶＬＰは、例えばレトロウイルス様粒子(国際公報9630523)、ＨＩＶ2 Ｇａｇ (Kang, Y.C., 等, Biol. Chem. 380:353-364 (1999))、Ｃｏｗｐｅａモザイクウイルス(Taylor, K.M.等, Biol. Chem. 380:387-392 (1999))、パルボウィルスＶＰ2 ＶＬＰ (Rueda, P. 等, Virology 263:89-99 (1999))、HBsAg(米国特許第４，７２２，８４０号、欧州特許第0020416号Ｂ1)である。
本発明の実施に適切なキメラＶＬＰの例には、Intervirology 39:1 (1996)に記述されるものもある。本発明における使用を考慮するＶＬＰの更なる例は、ＨＰＶ-１、ＨＰＶ-６、ＨＰＶ-１１、ＨＰＶ-１６、ＨＰＶ-１８、ＨＰＶ-３３、ＨＰＶ-４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ ＧＡＧ、タバコモザイクウイルスである。ＳＶ-４０、ポリオーマウイルス属、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルスおよびノーウォークウイルスのウイルス様粒子も作製されており、それらＶＬＰのキメラＶＬＰも本発明の範囲内である。
本発明のＴＮＦペプチドは、強いプロモータの制御下で、本発明のＴＮＦペプチドをコードするＤＮＡを発現させることによって生産することができる。これに関して様々な例が文献に記載されており、好ましくは融合ポリペプチド、例えばＧＳＴ又はＤＨＦＲとの融合の場合に、任意の望ましい種の本発明のＴＮＦペプチドを発現させるために用いられうる。
本発明のこのようなＴＮＦペプチドは、対象とする断片をコードするヌクレオチド配列がＰＣＲによって増幅され、ポリペプチドタグ、例えばヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ又は抗体(Ｆｃ領域)の恒常領域への融合としてクローニングされる標準的な分子生物学的技術を用いて生産することができる。本発明のＴＮＦペプチドとタグの間にエンテロキナーゼ切断部位を導入することによって、本発明のＴＮＦペプチドは、エンテロキナーゼによる消化による精製の後、タグから切り離すことができる。他の方法では、本発明のＴＮＦペプチドは、当業者に公知の標準的なペプチド合成反応を用いて、リン酸化-修飾の有無にかかわらず、インビトロ合成されてもよい。
本出願の全体にわたって、本発明のＴＮＦペプチドを修飾する方法、特にウイルス様粒子への結合についての教示がされている。コア粒子およびＶＬＰそれぞれを結合した、本発明のＴＮＦペプチド、好ましくは本発明のヒトＴＮＦペプチドを含んでなる発明の組成物を用いたＴＮＦ-スーパーファミリのメンバーに対する免疫化によって、自己免疫性疾患および骨関連の疾患を治療する方法が提供されうる。
本発明のなお更なる好適な実施態様では、本発明のＴＮＦペプチドは、本発明の前記ＴＮＦペプチド内で天然に生じない少なくとも一つの第二付着部位を更に含む。好ましい実施態様では、前記付着部位は、本発明のアミノ酸リンカー、好ましくはＣ、ＣＧ、ＧＣ、ＧＧＣ又はＣＧＧのリンカー配列を含んでなる。
本発明のいくつかの非常に好適なＴＮＦペプチドは、実施例に記述される。これらのペプチドは、ＶＬＰへの共役のために付加された第二付着部位としてＮ末端又はＣ末端のシステイン残基を含んでなる。本発明の非常に好適な、非自己、好ましくは非ヒトＴＮＦペプチドは、ＶＬＰおよびコア粒子のそれぞれに共役する際に、非常に亢進した免疫原性を有することができる。
本発明の更なる好適な実施態様では、４〜８アミノ酸残基の長さ、好ましくは４〜７アミノ酸残基の長さ、より好ましくは４〜６アミノ酸残基の長さのペプチドから成るＴＮＦペプチドは、短い断片であればあるほどＴ細胞エピトープを含まないようなので、自己タンパク質を標的とした場合には克服可能な安全性のあるものとなる。一般的にペプチドが短ければ短いほど、Ｔ細胞活性化に関してより安全である。
ＴＮＦスーパーファミリのさらに好適なメンバーおよびこれらの分子から得られる本発明のＴＮＦペプチドが、配列情報がまだ利用できない種において、将来発見されうる。ＴＮＦ-スーパーファミリメンバーの定義において説明した上述のＢｌａｓｔｐ検索により、これらのタンパク質に存在するＴＮＦドメインを同定することができる。
本発明は、修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰの、自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のための医薬の調整のための使用、並びに、被検体、好ましくはヒトに本発明の修飾ＶＬＰを投与することによる自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療方法に関する。治療は治療的処置またはあるいは予防的処置であることが好ましい。好適な自己免疫性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、自己免疫甲状腺病、自己免疫肝炎、乾癬又は乾癬の関節炎である。好適な骨関連の疾患は、骨粗鬆症、歯周炎、周囲補綴骨変性、骨転移、骨癌疼痛、パジェット病、多発性骨髄腫、シェーグレン症候群および原発性胆管萎縮症である。
好適な実施態様では、用いられる修飾コア粒子、好ましくは修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、ＴＮＦα、ＬＴαおよびＬＴα／βからなる群から選択される脊椎動物ポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、乾癬、乾癬の関節炎、重症筋無力症、シェーグレン症候群および多発性硬化症、最も好ましくは乾癬の治療のための医薬の製造における使用に好適である。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＬＩＧＨＴポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチおよび糖尿病の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＦａｓＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス、糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性肝炎および多発性硬化症の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＣＤ４０Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群およびアテローム性動脈硬化症の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＴＲＡＩＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、多発性硬化症および自己免疫性甲状腺疾患の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＲＡＮＫＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、骨粗鬆症、乾癬、乾癬の関節炎、多発性骨髄腫、歯周炎、前立腺周囲骨変性、骨転移、骨癌疼痛、歯周病およびパジェット病、最も好ましくは乾癬の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＣＤ３０Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、心筋炎および原発性胆汁性肝硬変の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類の４-１ＢＢＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、炎症性腸疾患および多発性硬化症、好ましくは関節リウマチの治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＯＸ４０Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチおよび炎症性腸疾患の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＢＡＦＦポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＣＤ２７Ｌポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくはアテローム性動脈硬化症および心筋炎の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＴＷＥＡＫポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＡＰＲＩＬポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本発明の更なる好適な実施態様では、本発明の修飾コア粒子、特に修飾ＶＬＰのＴＮＦペプチドは、脊椎動物、特に真獣類のＴＬ１Ａポリペプチドに由来する。このようなコンジュゲートは、自己免疫性疾患および骨関連の疾患、好ましくは炎症性腸疾患の治療のための医薬の製造における使用に適する。
本明細書中に記載した方法および実施への他の適切な変更や応用は容易に明らかであり、本発明の範囲および任意の実施形態から逸脱することなく行われうることは、当分野の通常の技術者には理解されることであろう。現段階で本発明を詳細に記載し、以下の実施例を参照することによってより明確になるであろう。以下の実施例は単なる例示的なものであり、本発明を制限するためのものではない。
理解を深めるために図および実施例によっていくらか詳細に本発明を現段階で完全に記載したので、条件、製剤および他のパラメータの広い範囲および均等の範囲内で、本発明またはその任意の特定の実施態様の権利範囲を犯すことなく本発明を修飾するかまたは変更することによって同じことが実行できること、および、このような修飾又は変更が添付の特許請求の範囲内に包含されるものであることは、通常の当業者に明らかであろう。
個々の刊行物、特許または特許出願は出典明記によって組み込まれたことが具体的かつ個別に示されているので、この明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、この発明が関係する当業者の技術のレベルを表しており、出典明記によって本明細書中に同程度に組み込まれる。
実施例１
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのマウスＴＮＦα(４-２３)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の３ｍｌの溶液を９９．２μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析した６９μｌのＱβ溶液を、２６５．５μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２および第二付着部位(配列番号：１２７ ＣＧＧＳＳＱＮＳＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＨＱＶＥ)(ＤＭＳＯ中２３．６ｍｇ／ｍｌ)を有する７．５μｌのｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。クーマシー染色ゲルを図１に示す。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＴＮＦα(４-２３)の架橋が成功していることが示唆された。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドの免疫化
４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１６、および第２３日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。２匹のマウスはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの２匹のマウスはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３２日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡおよびヒトＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートした。プレートの反応を止めて、第３２日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均の抗マウスＴＮＦα力価は、アジュバント非添加で免疫されたマウスでは１８８００、ミョウバン存在下で免疫されたマウスでは１６２００であった。驚くべきことに、同じ血清の抗ヒトＴＮＦα力価の測定値は有意に同じ値となり、それぞれ平均して１７９００と１２９００であった。これらのデータより、Ｑβに共役したｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドでの免疫化によりマウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質を同じように認識する抗体が得られることが示唆された。
Ｄ．中和抗体の検出
マウスにおいて生成された抗体が中和活性を有するかどうかを試験するために、マウスおよびヒトのＴＮＦαとその同族のレセプターマウスＴＮＦＲＩおよびヒトＴＮＦＲＩの両方についてインビボ結合アッセイを行った。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウスとヒトの何れかのＴＮＦαタンパク質でコートして、それぞれ組み換えマウスＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質または組み換えヒトＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質の段階希釈液とともにインキュベートした。結合タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。両ＴＮＦＲＩ／ｈＦｃ融合タンパク質はそれぞれのリガンドと高い親和性(０．１−０．５ｎＭ)で結合することが明らかとなった。次いで、Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦα(４-２３)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートし、第３２日目のマウス血清の段階希釈液およびそれぞれ０．２５ｎＭのマウスまたはヒトのＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。免疫化したＴＮＦαタンパク質に対するレセプターの結合を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。図２Ａに、レセプターに対するマウスＴＮＦαタンパク質の結合を特異的に阻害したすべての血清を示す。さらに、図２Ｂに示すように、同じ血清もその同族レセプターに対するヒトＴＮＦαタンパク質の結合が同じ有効性で阻害された。これらのデータにより、Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドでの免疫化により、マウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質両方とそれらの同族レセプターとの相互作用を中和しうる抗体が得られることが示唆された。
実施例２
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのネコ(ｆ)ＴＮＦα(４-２３)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の３ｍｌの溶液を２５．２μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析した３０μｌのＱβ溶液を、１６７．８μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２および第二付着部位(配列番号：１２８ ＣＧＧＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＥＡＥ)(ＤＭＳＯ中２３．６ｍｇ／ｍｌ)を有する２．２μｌのｆＴＮＦα(４-２３)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｆＴＮＦα(４-２３)ペプチドによるマウスのの免疫化
６匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｆＴＮＦα(４-２３)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２１日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。３匹のマウスはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの３匹のマウスはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡおよびヒトＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１ｍｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均の抗ヒトＴＮＦα力価は、アジュバント非添加で免疫されたマウスでは４４９１、ミョウバン存在下で免疫されたマウスでは２１５３８であった。同じ血清の抗マウスＴＮＦα力価を測定すると、ミョウバンなしのワクチンを接種されたマウスでは１４７０、ミョウバンありのワクチンを接種したマウスでは６００７であった。これらのデータより、Ｑβに共役したｆＴＮＦα(４-２３)ペプチドでの免疫化によりマウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質をともに認識する抗体が得られることが示唆された。
Ｄ．中和抗体の検出
Ｑβキャプシドに共役したｆＴＮＦα(４-２３)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液およびそれぞれ０．２５ｎＭのマウスまたはヒトのＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。免疫化したＴＮＦαタンパク質に対するレセプターの結合を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。図３Ａに、レセプターに対するマウスＴＮＦαタンパク質の結合を特異的に阻害したすべての血清を示す。さらに、図３Ｂに示すように、同じ血清もその同族レセプターに対するヒトＴＮＦαタンパク質の結合が同じ有効性で阻害された。これらのデータにより、Ｑβキャプシドに共役したｆＴＮＦα(４-２３)ペプチドでの免疫化により、マウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質両方とそれらの同族レセプターとの相互作用を中和しうる抗体が得られることが示唆された。
実施例３
Ａ．ＱβキャプシドへのマウスＴＮＦαタンパク質の共役
Ｎ末端、システイン含有リンカー、ヘキサヒスチジンタグ及び成熟マウスＴＮＦαタンパク質(未成熟タンパク質のアミノ酸７８から２３３に相当)(配列番号：２３)からなる融合タンパク質を組み換えて大腸菌内で発現させ、均一になるまでアフィニティクロマトグラフィによって精製した。１．４ｍｇ／ｍｌのこのタンパク質を含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２溶液を等量のＴＣＥＰとともに室温で６０分間インキュベートして、Ｎ末端システイン残基の還元を行った。３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の５００μｌの溶液を４．２μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ２時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析した６０μｌのＱβ溶液を、３０μｌのＨ２Ｏと１８０μｌの精製物および予め還元したマウスＴＮＦαタンパク質と混合し、１５℃で４時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドを、３０００００Ｄａの分子量カットオフを有するセルロースエステル膜を用いて、ＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。
Ｂ．Ｑβキャプシドに共役したマウスＴＮＦαタンパク質によるマウスの免疫化
４匹の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＱβキャプシドタンパク質共役マウスＴＮＦαタンパク質にて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第３５日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０および第４９日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡおよびヒトＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートした。プレートの反応を止めて、第４９日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均の抗マウスＴＮＦα力価は２１９４０であるのに対して、同じ血清の平均の抗ヒトＴＮＦα力価は１６０であった。これにより、完全なマウスＴＮＦαタンパク質のみに共役したＱβにて免疫化すると、上記の実施例１で得られた結果と異なり、マウスＴＮＦαに高い特異性がある抗体が産生されることが示唆された。
Ｄ．中和抗体の検出
Ｑβキャプシドに共役したマウスＴＮＦαにて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスおよびヒトのＴＮＦαタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートし、第４９日目のマウス血清の段階希釈液およびそれぞれ０．２５ｎＭのマウスまたはヒトのＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。免疫化したＴＮＦαタンパク質に対するレセプターの結合を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。図４Ａに、レセプターに対するマウスＴＮＦαタンパク質の結合を特異的に阻害したすべての血清を示す。これに対して、図４Ｂに示すように、同じ血清がその同族レセプターに対するヒトＴＮＦαタンパク質の結合を阻害しなかった。これらのデータにより、Ｑβキャプシドに共役したマウスＴＮＦαでの免疫化により、マウスＴＮＦαとそのレセプターとの相互作用は中和しうるが、ヒトＴＮＦαとそのレセプターとの相互作用は中和しない抗体が得られることが示唆された。
実施例４
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＴＮＦα(１１-１８)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の溶液を１０倍モル濃度のＳＭＰＨ溶液(ＳＭＰＨ溶液をＤＭＳＯに溶解)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析したＱβ溶液を、第二付着部位(配列番号：２９ ＣＧＧＫＰＶＡＨＶＶＡ)を有する５倍モル濃度のｍＴＮＦα(１１-１８)ペプチドと混合し、１６℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。沈降する場合、低濃度のＳＭＰＨおよび／またはペプチドを用いた。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、クーマシーにて染色して、ＱβキャプシドへのｍＴＮＦαペプチドの架橋を同定した。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＴＮＦα(１１-１８)ペプチドによるマウスの免疫化
８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＴＮＦα(１１-１８)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２１日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。４匹のマウスはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの４匹のマウスはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＴＮＦαタンパク質特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈プールとともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。抗マウスＴＮＦαタンパク質力価を測定し、ＴＮＦαタンパク質を認識する抗体の誘導を証明した。
Ｄ．中和抗体の検出
マウスにおいて生成された抗体が中和活性を有するかどうかを試験するために、マウスまたはヒトのＴＮＦαとその同族のレセプターＴＮＦＲＩについてインビボ結合アッセイを行った。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウスとヒトの何れかのＴＮＦαタンパク質でコートして、マウスＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質またはヒトＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質の段階希釈液とともにインキュベートした。結合タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦα(１１-１８)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスまたはヒトのＴＮＦαタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよび０．３５ｎＭのマウスまたはヒトのレセプター融合タンパク質とともにインキュベートした。固定されたＴＮＦαタンパク質に対するレセプターの結合と血清によるその阻害を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。
実施例５
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＴＮＦα(９-２０)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の溶液を１０倍モル濃度のＳＭＰＨ(ＳＭＰＨ溶液をＤＭＳＯに溶解)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析したＱβ溶液を、第二付着部位(配列番号：３０ ＣＧＧＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＨＱ)を有する５倍モル濃度のｍＴＮＦα(９-２０)ペプチドと混合し、１６℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。沈降する場合、低濃度のＳＭＰＨおよび／またはペプチドを用いた。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、クーマシーにて染色して、ＱβキャプシドへのｍＴＮＦαペプチドの架橋を同定した。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＴＮＦα(９-２０)ペプチドによるマウスの免疫化
８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＴＮＦα(９-２０)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２１日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。４匹のマウスはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの４匹のマウスはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＴＮＦαタンパク質特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈プールとともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。抗マウスＴＮＦαタンパク質力価を測定し、ＴＮＦαタンパク質を認識する抗体の誘導を証明した。
Ｄ．中和抗体の検出
マウスにおいて生成された抗体が中和活性を有するかどうかを試験するために、マウスまたはヒトのＴＮＦαとその同族のレセプターＴＮＦＲＩについてインビボ結合アッセイを行った。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウスとヒトの何れかのＴＮＦαタンパク質でコートして、組み換えマウスまたはヒトのＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質の段階希釈液とともにインキュベートした。結合タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦα(９-２０)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスまたはヒトのＴＮＦαタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよび０．３５ｎＭのマウスまたはヒトのレセプター融合タンパク質とともにインキュベートした。固定されたＴＮＦαタンパク質に対するレセプターの結合と血清によるその阻害を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。
実施例６
コラーゲン誘導性関節炎モデルにおけるＱβ-ｍＴＮＦα(４-２３)の有効性
Ｑβ-ｍＴＮＦα(４-２３)免疫化の有効性をコラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)モデルにおいて試験した。このモデルは、ヒト関節リウマチの免疫学的および組織学的態様の多くを反映しているので、通常抗炎症剤の有効性のアッセイに用いられる。雄ＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＱβ-ｍＴＮＦα(４-２３)(ｎ＝１５)又はＱβ単独(ｎ＝１５)の何れかを３回(第０、１４および２８日目)、皮下に免疫化し、次いで、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを皮内に２回(第３４および５５日目)接種した。２回目のコラーゲン／ＣＦＡ接種の後、マウスを定期的に調べ、赤くなる程度および観察される腫脹に応じて、各々の肢に０から３までの範囲の臨床スコアを付けた。２回目のコラーゲン／ＣＦＡ接種の３週間後、Ｑβ-ｍＴＮＦα(４-２３)で免疫化したグループでは、肢当たりの平均的臨床スコアが０．０４であり、Ｑβ単独で免疫化したグループでは０．６７であった。さらに、Ｑβを接種されたマウスでは３３％のみであるのに対して、Ｑβ-ｍＴＮＦα(４-２３)を接種されたマウスの８０％は実験の全課程を通して症状を示さなかった。本発明者等は、Ｑβ-ｍＴＮＦα(４-２３)での免疫化によってＣＩＡモデルにおける関節炎の臨床徴候からマウスが保護されると結論付ける。
実施例７
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の３ｍｌの溶液を２５．２μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析した３０μｌのＱβ溶液を、１６７．８μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２および第二付着部位(配列番号：１５７ ＣＧＧＱＲＧＫＰＥＡＱＰＦＡＨＬＴＩＮＡＡＳＩ)(ＤＭＳＯ中２３．６ｍｇ／ｍｌ)を有する２．２μｌのｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドと混合し、１６℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。クーマシー染色ゲルを図５に示す。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)の架橋が成功していることが示唆された。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドによるマウスの免疫化
８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２１日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。４匹のマウスはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの４匹のマウスはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＲＡＮＫＬ特異的ＥＬＩＳＡおよびヒトＲＡＮＫＬ特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質とヒトＲＡＮＫＬタンパク質の何れかにてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。抗マウスＲＡＮＫＬ力価は、アジュバント非添加で免疫されたマウスでは８６００、ミョウバン存在下で免疫されたマウスでは５４０００であった。同じ血清の抗ヒトＴＮＦαＲＡＮＫＬ力価の測定値は有意に同じ値となり、それぞれ平均して１１２００と５５８００であった。これらのデータより、Ｑβに共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドでの免疫化によりマウスおよびヒトのＲＡＮＫＬタンパク質を同じように認識する抗体が得られることが示唆された。
Ｄ．中和抗体の検出
マウスにおいて生成された抗体が中和活性を有するかどうかを試験するために、マウスおよびヒトのＲＡＮＫＬとその同族のレセプターマウスＲＡＮＫおよびヒトＲＡＮＫの両方についてインビボ結合アッセイを行った。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウスとヒトの何れかのＲＡＮＫＬタンパク質でコートして、それぞれ組み換えマウスＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質または組み換えヒトＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質の段階希釈液とともにインキュベートした。結合タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。両ＲＡＮＫ／ｈＦｃ融合タンパク質はそれぞれのリガンドと高い親和性(０．１−０．５ｎＭ)で結合することが明らかとなった。次いで、Ｑβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスおよびヒトのＲＡＮＫＬタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質とヒトＲＡＮＫＬタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよびそれぞれ０．３５ｎＭのマウスまたはヒトのＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。免疫化したＲＡＮＫＬタンパク質に対するレセプターの結合を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。図６Ａに、レセプターに対するマウスＲＡＮＫＬタンパク質の結合を特異的に阻害したすべての血清を示す。さらに、図６Ｂに示すように、同じ血清プールもその同族レセプターに対するヒトＲＡＮＫＬタンパク質の結合が同じ有効性で阻害された。これらのデータにより、Ｑβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドでの免疫化により、マウスおよびヒトのＲＡＮＫＬタンパク質両方とそれらの同族レセプターとの相互作用を中和しうる抗体が得られることが示唆された。
実施例８
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＲＡＮＫＬ(１６２-１７０)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の溶液を１０倍モル濃度のＳＭＰＨ(ＳＭＰＨ溶液をＤＭＳＯに溶解)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析したＱβ溶液を、第二付着部位(配列番号：１２５ ＣＧＧＱＰＦＡＨＬＴＩＮ)を有する５倍モル濃度のｍＲＡＮＫＬ(１６２-１７０)ペプチドと混合し、１６℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。沈降する場合、低濃度のＳＭＰＨおよび／またはペプチドを用いた。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、クーマシーにて染色して、ＱβキャプシドへのｍＲＡＮＫＬペプチドの架橋を同定した。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＲＡＮＫＬ(１６２-１７０)ペプチドによるマウスの免疫化
８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＲＡＮＫＬ(１６２-１７０)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２１日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。４匹のマウスにはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの４匹のマウスにはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＲＡＮＫＬ特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈プールとともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。抗マウスＲＡＮＫＬ力価を測定し、ＲＡＮＫＬタンパク質を認識する抗体の誘導を証明した。
Ｄ．中和抗体の検出
マウスにおいて生成された抗体が中和活性を有するかどうかを試験するために、マウスまたはヒトのＲＡＮＫＬとその同族のレセプターＲＡＮＫ-ｈＦｃについてインビボ結合アッセイを行った。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウスとヒトの何れかのＲＡＮＫＬタンパク質でコートして、組み換えマウスまたはヒトのＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質の段階希釈液とともにインキュベートした。結合タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。Ｑβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１６２-１７０)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスまたはヒトのＲＡＮＫＬタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質とヒトＲＡＮＫＬタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよび０．３５ｎＭのマウスまたはヒトのレセプター融合タンパク質とともにインキュベートした。固定されたＲＡＮＫＬタンパク質に対するレセプターの結合と血清によるその阻害を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。
実施例９
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＲＡＮＫＬ(１６０-１７１)ペプチドの共役
３．０６ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の溶液を１０倍モル濃度のＳＭＰＨ(ＳＭＰＨ溶液をＤＭＳＯに溶解)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２にて２回、それぞれ４時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析したＱβ溶液を、第二付着部位(配列番号：１２６ ＣＧＧＥＡＱＰＦＡＨＬＴＩＮＡ)を有する５倍モル濃度のｍＲＡＮＫＬ(１６０-１７１)ペプチドと混合し、１６℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドをＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。沈降する場合、低濃度のＳＭＰＨおよび／またはペプチドを用いた。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、クーマシーにて染色して、ＱβキャプシドへのｍＲＡＮＫＬペプチドの架橋を同定した。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＲＡＮＫＬ(１６０-１７１)ペプチドによるマウスの免疫化
８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＲＡＮＫＬ(１６０-１７１)ペプチドにて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２１日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。４匹のマウスにはアジュバントを添加していないワクチンを、残りの４匹のマウスにはミョウバンを有するワクチンを投与した。第０および第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＲＡＮＫＬ特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈プールとともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。抗マウスＲＡＮＫＬ力価を測定し、ＲＡＮＫＬタンパク質を認識する抗体の誘導を証明した。
Ｄ．中和抗体の検出
マウスにおいて生成された抗体が中和活性を有するかどうかを試験するために、マウスまたはヒトのＲＡＮＫＬタンパク質とその同族のレセプターＲＡＮＫ-ｈＦｃについてインビボ結合アッセイを行った。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのマウスとヒトの何れかのＲＡＮＫＬタンパク質でコートして、マウスまたはヒトのＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質の段階希釈液とともにインキュベートした。結合タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。Ｑβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１６０-１７１)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスまたはヒトのＲＡＮＫＬタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質とヒトＲＡＮＫＬタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよび０．３５ｎＭのマウスまたはヒトのレセプター融合タンパク質とともにインキュベートした。固定されたＲＡＮＫＬタンパク質に対するレセプターの結合と血清によるその阻害を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。
実施例１０
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)ペプチドの共役
２．８ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の溶液を２０倍モル濃度のＳＭＰＨ(ＳＭＰＨ溶液をＤＭＳＯに溶解)と室温で３５分間反応させた。反応溶液を５ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４にて２回、合わせて４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析したＱβ溶液を、第二付着部位(ＣＧＧＡＱＰＦＡＨＬＴＩＮ、配列番号：１８９)を有する５倍モル濃度のｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドを５ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４にて４℃で終夜、さらに３ｌの同じバッファにて４℃で２時間透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、クーマシーにて染色して、ＱβキャプシドへのｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)ペプチドの架橋を同定した。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)の架橋が成功していることが示唆された。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)ペプチドによるマウスの免疫化
４匹の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)ペプチドにて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２８日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第２８日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＲＡＮＫＬ特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第２８日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均抗マウスＲＡＮＫＬ力価は１９５００であり、Ｑβに共役したｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)ペプチドによる免疫化により完全長ｍＲＡＮＫＬタンパク質を認識する抗体が得られることが示された。
Ｄ．中和抗体の検出
Ｑβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１６１-１７０)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスまたはヒトのＲＡＮＫＬタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲＡＮＫＬタンパク質とヒトＲＡＮＫＬタンパク質の何れかにてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよび０．３５ｎＭのマウスまたはヒトのｍＲＡＮＫ-ｈＦｃレセプター融合タンパク質とともにインキュベートした。固定されたＲＡＮＫＬタンパク質に対するレセプターの結合と血清によるその阻害を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。
実施例１１
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＴＮＦα(１０-１９)ペプチドの共役
２．８ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の溶液を２０倍モル濃度のＳＭＰＨ(ＳＭＰＨ溶液をＤＭＳＯに溶解)と室温で３５分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４にて２回、合わせて６時間、４℃で透析した。誘導体化して透析したＱβ溶液を、第二付着部位(配列番号：１９２、ＣＧＧＳＫＰＶＡＨＶＶＡＮ)を有する５倍モル濃度のｍＴＮＦα(１０-１９)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４にて４℃で２時間、２回透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、クーマシーにて染色して、ＱβキャプシドへのｍＴＮＦαペプチドの架橋を同定した。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＴＮＦα(１０-１９)ペプチドの架橋が成功していることが示唆された。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＴＮＦα(１０-１９)ペプチドによるマウスの免疫化
４匹の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＴＮＦα(１０-１９)ペプチドにて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２８日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第２８日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＴＮＦαタンパク質特異的ＥＬＩＳＡまたはヒトＴＮＦαタンパク質特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質とヒトＴＮＦαタンパク質の何れかにてコートした。プレートの反応を止めて、第２８日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均抗マウスＴＮＦα力価は２４５００であり、平均抗ヒトＴＮＦα力価は２５０００であった。Ｑβに共役したｍＴＮＦα(１０-１９)ペプチドによる免疫化によりヒトおよびマウスのＴＮＦαタンパク質の両方を同じように認識する抗体が得られることが示された。
Ｄ．中和抗体の検出
Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦα(１０-１９)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスＴＮＦαタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＴＮＦαタンパク質にてコートし、第３５日目のマウス血清の段階希釈液プールおよび０．３５ｎＭの組み換えマウスＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。固定されたＴＮＦαタンパク質に対するレセプターの結合と血清によるその阻害を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にて検出した。
実施例１２
Ａ．Ｑβキャプシドタンパク質へのマウス(ｍ)ＣＤ４０Ｌ(２-２３)ペプチドの共役
２ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の２．７８ｍｌの溶液を１５８μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中５０ｍＭ)と室温で３０分間反応させた。反応溶液を３ｌのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２にて２回、それぞれ２時間および１４時間、４℃で透析した。誘導体化して透析した２．７８ｍｌのＱβ溶液を、９２５μｌのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２および第二付着部位(配列番号：１５１ ＣＧＧＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮ)(ＤＭＳＯ中２３．５ｍｇ／ｍｌ)を有する７９４μｌのｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドを３ｌのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２にて４℃で２時間を２回と１４時間を１回、計３回透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)の架橋が成功していることが示唆された。
Ｂ．Ｑβキャプシドタンパク質に共役したｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)ペプチドによるマウスの免疫化
４匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＱβキャプシドタンパク質共役ｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)ペプチドにて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳで希釈して２００μｌにし、第０、第１４、および第２８日に皮下的に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０および第４２日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＣＤ４０Ｌ特異的ＥＬＩＳＡにて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のｍＣＤ４０Ｌタンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第４２日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。第４２日目の平均抗ｍＣＤ４０Ｌ力価は１２８７であった。
Ｄ．抗体による可溶性ｍＣＤ４０Ｌタンパク質の認識
マウスにおいて生成された抗体が可溶性組み換えｍＣＤ４０Ｌに結合できるかどうかを試験するために、ｍＣＤ４０Ｌについてインビトロ阻害アッセイを行った。ｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)ペプチドにて免疫化したマウスの血清プールを、可溶性組み換えｍＣＤ４０Ｌの濃度を０ｎＭから１５０ｎＭの範囲で変えて１：１０００の希釈でインキュベートした。この混合液を０．５μｇ／ｍｌのｍＣＤ４０Ｌタンパク質でコートしたＥＬＩＳＡプレートに移し、結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。この条件下において、６０ｎＭの可溶性ｍＣＤ４０Ｌと抗体を予め十分にインキュベートして、４５０ｎｍの最大半量の吸光度を測定して、プレート結合ｍＣＤ４０Ｌへの抗体の続く結合を２だけ減らした。これにより、ｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)ペプチドにて免疫化したマウスの抗体が可溶性ｍＣＤ４０Ｌとプレート結合ｍＣＤ４０Ｌの両方に結合しうることが示唆された。
Ｅ．中和抗体の試験
ｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)によって免疫化されるマウスの抗体を用いて、マウス(ｍ)ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０ライゲーションによって誘導されるインビトロＢ細胞増殖を中和した。Ｂ細胞は、脾臓およびリンパ節を含むマウスリンパ系器官の細胞懸濁液から得て、磁気ビーズ分離または流動血球計算器を用いた細胞選別によって更に精製してもよい。標準的な方法ではあるが、ｍＣＤ４０Ｌおよび生存因子、例えばマウスＩＬ-４の供与源を用いたＢ細胞ｍＣＤ４０のライゲーションによって、インビトロでＢ細胞増殖を誘発した。ｍＣＤ４０Ｌは、例えば、可溶性組換えｍＣＤ４０Ｌによって (Craxton 等 (2003) Blood 101, 4464-4471)、組み換え的に発現された膜結合型ｍＣＤ４０Ｌによって (Hasbold J. 等 (1998) Eur. J. Immunol. 28, 1040-1051)、活性化されたマウスＴ細胞によって、または、精製され活性化されたマウスＴ細胞膜(Hodgkin P. 等(1996) J. Exp. Med. 184, 277-281)上のｍＣＤ４０Ｌによって提供される。Ｂ細胞増殖は、標準方法、例えばフローサイトメトリベースの蛍光色素希釈物アッセイ(Lyons A.B.およびParish C.R. (1994) J. Immunol. Methods 171, 131-137)または放射性ないしは化学的に修飾したＤＮＡ塩基類似体、例えば[３Ｈ]-チミジン又は５-ブロモ-２'−デオキシウリジンの取込みによって測定される。ｍＣＤ４０Ｌに対する中和抗体の存在により、、Ｑβ単独で免疫化されたマウスからの抗体または免疫化していないマウスからの抗体と比較して、ｍＣＤ４０Ｌ(２-２３)で免疫化したマウスからの抗体存在下において、Ｂ細胞増殖の阻害が示された。抗体は、全血清、または、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィによって血清から単離された精製されたＩｇＧ分画の何れかとして上記のＢ細胞増殖培養物に添加した。
実施例１３
Ｑβキャプシドタンパク質へのマウス(ｍ)ＢＡＦＦ(３６-５５)ペプチドの共役
２ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の３ｍｌの溶液を１７１μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中５０ｍＭ)と室温で３０分間反応させた。反応溶液を３ｌのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２にて２時間で２回と１４時間で１回、計３回、４℃で透析した。誘導体化して透析した３ｍｌのＱβ溶液を、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２および第二付着部位(配列番号：１３８ ＣＧＧＮＬＲＮＩＩＱＤＳＬＱＬＩＡＤＳＤＴＰＴ)(ＤＭＳＯ中２４．４ｍｇ／ｍｌ)を有する２１４．５μｌのｍＢＡＦＦ(３６-５５)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドを３ｌのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２にて２時間で２回と１４時間で１回、計３回、４℃で透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＢＡＦＦ(３６-５５)の架橋が成功していることが示唆された。
実施例１４
Ｑβキャプシドタンパク質へのマウス(ｍ)ＬＴβ(３４-５３)ペプチドの共役
２ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の３ｍｌの溶液を８５．８μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中５０ｍＭ)と室温で３０分間反応させた。反応溶液を３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２にてそれぞれ２時間で３回、４℃で透析した。誘導体化して透析した３ｍｌのＱβ溶液を、９９３μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２および第二付着部位(配列番号：１４３、ＣＧＧＥＴＤＬＮＰＥＬＰＡＡＨＬＩＧＡＷＭＳＧ)(ＤＭＳＯ中２３．４ｍｇ／ｍｌ)を有する４２９μｌのｍＬＴβ(３４-５３)ペプチドと混合し、１５℃で２時間インキュベートして化学的な架橋を行った。非共役ペプチドを３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２にて２時間で２回と１４時間で１回、計３回、４℃で透析することによって除去した。共役された産物を還元条件下において１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。Ｑβキャプシド単量体に関して分子量の増加を示すバンドがいくつか見られ、明らかにＱβキャプシドへのｍＬＴβ(３４-５３)ペプチドの架橋が成功していることが示唆された。
実施例１５
ｍＴＮＦ(４-２３)Ｑβで免疫化したヒト患者の血清によって阻害されうるヒトＴＮＦαのレセプターｈＴＮＦ-ＲＩへの結合
ヒトボランティアの皮下に１００μｇのｍＴＮＦ(４-２３)Ｑβを接種した。２８日後に、同じ用量で２回目の免疫処置を行った。抗ＴＮＦα特異的抗体レベルは、最終免疫化の２週後に行う血清のＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡプレート(Maxisorp, Nunc)を、ｈＴＮＦα(Peprotech)(１μｇ／ｍｌ)にて終夜コートし、遮断剤Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ(Pierce)にて反応を止めた。洗浄後、プレートは、実験用血清の８つの希釈液とともに２時間インキュベートした。更なる洗浄工程の後、二次抗ヒトＩｇＧ西洋ワサビオキシダーゼコンジュゲート(Jackson ImmunoResearch)を加えて１時間おいた。結合した酵素を、４．５分の間のｏ-フェニレンジアミン(OPD, Fluka)と４．５分間反応させることによって検出し、硫酸の添加によって反応を止めた。ＥＬＩＳＡリーダーで４９２ｎｍの光学密度を読み取った。ＥＬＩＳＡにより、マウスＴＮＦ(４-２３)Ｑβにてヒト患者を予防接種することによってヒトＴＮＦαと結合する抗体が誘導されたことが示された。実施例１に記載のアッセイを用いると、レセプターｈＴＮＦ-ＲＩに対するヒトＴＮＦαの結合がｍＴＮＦ(４-２３)Ｑβにて免疫化された患者の血清によって阻害されたことが示され、さらにこれにより、ヒトＴＮＦαタンパク質に対するｍＴＮＦ(４-２３)の予防接種によって抗体の交差反応が誘導されたことが示唆された。
実施例１６
ｍＴＮＦ(４-２３)Ｑβによる乾癬の治療
中程度から重度のプラーク乾癬に罹患している患者を、１００μｇまたは３００μｇのｍＴＮＦ(４-２３)Ｑβによって第０日目および第２８日目に免疫化した。第８４日目にさらに追加免疫をした。臨床有効性は、乾癬領域および重症度インデックス(ＰＡＳＩ)および医師広域評価(ＰＧＡ)判定基準を用いて評価した。基準時と隔週間隔で臨床スコアを付けた。抗体価に変動が予想されるので、予防接種の臨床有効性の評価は、抗体応答の程度によって、応答の大きさ(ＰＡＳＩスコアまたはＰＧＡスコア)区別した。抗体応答に応じて、患者の層別化または共分散として抗体価を用いて評価した。この結果、ｍＴＮＦ(４-２３)Ｑβによる予防接種によってプラーク乾癬患者の臨床スコアに減少が見られた。
Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドの共役。タンパク質を、還元条件の下で１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで着色した。マーカータンパク質の分子量は左側に、タンパク質バンドは右側に示した。レーン１：前染色タンパク質マーカー(New England Biolabs)。レーン２：誘導体化されたＱβキャプシドタンパク質。レーン３：Ｑβ-ＴＮＦα(４-２３)ペプチド共役反応(不溶性分画)。レーン４：Ｑβ-ＴＮＦα(４-２３)ペプチド共役反応(可溶性分画)。 Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦα(４-２３)ペプチドにて免疫化されたマウスにおける中和抗体の検出。Ａ．ｍＴＮＦα／ｍＴＮＦＲＩ相互作用の阻害。ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌのマウスＴＮＦαタンパク質でコートして、第３２日目のマウス血清の段階希釈液と０．２５ｎＭのマウスＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。Ｂ．ｈＴＮＦα／ｈＴＮＦＲＩ相互作用の阻害：ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαタンパク質でコートして、第３２日目のマウス血清の段階希釈液と０．２５ｎＭのヒトＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。 Ｑβキャプシドに共役したｆＴＮＦα(４-２３)ペプチドにて免疫化されたマウスにおける中和抗体の検出。Ａ．ｍＴＮＦα／ｍＴＮＦＲＩ相互作用の阻害。ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのマウスＴＮＦαタンパク質でコートして、第３５日目のマウス血清の段階希釈液と０．２５ｎＭのマウスＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。Ｂ．ｈＴＮＦα／ｈＴＮＦＲＩ相互作用の阻害：ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαタンパク質でコートして、第３５日目のマウス血清の段階希釈液と０．２５ｎＭのヒトＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。 Ｑβキャプシドに共役したｍＴＮＦαタンパク質にて免疫化されたマウスにおける中和抗体の検出。Ａ．ｍＴＮＦα／ｍＴＮＦＲＩ相互作用の阻害。ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのマウスＴＮＦαタンパク質でコートして、第４９日目のマウス血清の段階希釈液と０．２５ｎＭのマウスＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。Ｂ．ｈＴＮＦα／ｈＴＮＦＲＩ相互作用の阻害：ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαタンパク質でコートして、第３５日目のマウス血清の段階希釈液と０．２５ｎＭのヒトＴＮＦＲＩ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。 Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＲＡＮＫＬペプチドの共役。タンパク質を、還元条件の下で１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで着色した。マーカータンパク質の分子量は左側に、タンパク質バンドは右側に示した。レーン１：前染色タンパク質マーカー(New England Biolabs)。レーン２：誘導体化されたＱβキャプシドタンパク質。レーン３：Ｑβ-ｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチド共役反応(不溶性分画)。レーン４：Ｑβ-ｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチド共役反応(可溶性分画)。 Ｑβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドにて免疫化されたマウスにおける中和抗体の検出。Ａ．ｍＲＡＮＫＬ／ｍＲＡＮＫ相互作用の阻害。ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌのマウスＲＡＮＫＬタンパク質でコートして、ミョウバンのない条件下でＱβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドで免疫化した(最初のワクチン接種から３５日後)４匹のマウス血清プールの段階希釈液と０．３５ｎＭのマウスＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。Ｂ．ｈＲＡＮＫＬ／ｈＲＡＮＫ相互作用の阻害：ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのヒトＲＡＮＫＬタンパク質でコートして、ミョウバンのない条件下でＱβキャプシドに共役したｍＲＡＮＫＬ(１５５-１７４)ペプチドで免疫化した(最初のワクチン接種から３５日後)４匹のマウス血清プールの段階希釈液と０．３５ｎＭのヒトＲＡＮＫ-ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ｈＦｃ抗体にてレセプター結合を検出した。

Claims (25)

  1. (ａ) ウイルス様粒子(ＶＬＰ)および、
    (ｂ) 保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基３〜８に相同なペプチド配列、好ましくは保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜８に相同なペプチド配列、より好ましくは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１１に相同なペプチド配列、さらにより好ましくは、保存されたドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：１)のコンセンサス配列のアミノ酸残基１〜１３に相同なペプチド配列を含んでなる少なくとも一つの非ヒトＴＮＦ-ペプチド、
    を含有し、
    (ａ)と(ｂ)が互いに連鎖していて、
    自己免疫性疾患および／または骨関連の疾患の治療のための医薬の製造における修飾ウイルス様粒子の使用であって、好ましくは該自己免疫性疾患又は該骨関連の疾患が、
    ａ) 乾癬；
    ｂ) 関節リウマチ；
    ｃ) 多発性硬化症；
    ｄ) 糖尿病；
    ｅ) 骨粗鬆症；
    ｆ) 強直性脊椎炎；
    ｇ) アテローム性動脈硬化；
    ｈ) 自己免疫肝炎；
    ｉ) 自己免疫甲状腺の疾患；
    ｊ) 骨癌疼痛；
    ｋ) 骨転移；
    ｌ) 炎症性腸疾患；
    ｍ) 多発性骨髄腫；
    ｎ) 重症筋無力症；
    ｏ) 心筋炎；
    ｐ) パジェット病；
    ｑ) 歯周疾患；
    ｒ) 歯周炎；
    ｓ) 周囲補綴骨変性；
    ｔ) 多発性筋炎；
    ｕ) 原発性胆管萎縮症；
    ｖ) 乾癬の関節炎；
    ｗ) シェーグレン症候群；
    ｘ) スティル病；
    ｙ) 全身性エリテマトーデス；および
    ｚ) 血管炎
    からなる群から選択される、使用。
  2. 前記ＴＮＦ-ペプチドがＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴα／β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３０Ｌ、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬおよびＢＡＦＦ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＴＬ１Ａ、ＥＤＡからなる群から選択される、好ましくはＴＮＦα、ＬＴαおよびＬＴα／βからなる群から選択される、または、ＴＲＡＩＬおよびＲＡＮＫＬからなる群から選択されるか、またはＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０ＬおよびＢＡＦＦからなる群から選択されるか、または４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＬＩＧＨＴからなる群から選択されるか、またはＬＴα、ＬＴα／β、Ｆａｓｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬおよびＢＡＦＦからなる群から選択される、非ヒト、脊椎動物のポリペプチドから得られる、請求項１に記載の使用。
  3. 前記修飾ＶＬＰが順に並び、反復性抗原アレイを形成する、請求項１ないし２の何れか一に記載の使用。
  4. 前記ＶＬＰ(ａ)および前記ＴＮＦ-ペプチド(ｂ)が共有的に連結される、請求項１ないし３の何れか一に記載の使用。
  5. 前記修飾ＶＬＰの前記ＴＮＦ-ペプチドが、６から７５のアミノ酸残基の長さ、好ましくは６〜５０のアミノ酸残基、より好ましくは６〜４０のアミノ酸残基、さらにより好ましくは６〜３０のアミノ酸残基、よりさらにより好ましくは６〜２５のアミノ酸残基、よりさらに好ましくは６〜２０のアミノ酸残基の長さのペプチドを含有する、請求項１ないし４の何れか一に記載の使用。
  6. 前記修飾ＶＬＰの前記非ヒトＴＮＦ-ペプチドが、最も相同なヒトＴＮＦ-ペプチドの１〜１０の位置で、より好ましくは２〜８の位置、さらにより好ましくは２〜６の位置で、さらにより好ましくは２〜４の位置で、最も好ましくは３〜４の位置で異なる、請求項１ないし５の何れか一に記載の使用。
  7. 前記修飾ＶＬＰの前記非ヒトＴＮＦ-ペプチドが、最も相同なヒトＴＮＦ-ペプチドと７５％〜９８％の同一性、より好ましくは８０％〜９７％、さらにより好ましくは８５％〜９５％、および最も好ましくは９０％〜９５％の同一性である、請求項１ないし６の何れか一に記載の使用。
  8. 前記非ヒトＴＮＦ-ペプチドが、脊椎動物のＴＮＦ-ペプチド、好ましくは真獣類ＴＮＦ-ペプチド、そしてさらにより好ましくはネコ、イヌ、ウシ又はマウスＴＮＦ-ペプチド、最も好ましくはマウスＴＮＦ-ペプチドである、請求項１ないし７の何れか一に記載の使用。
  9. 前記非ヒトＴＮＦ-ペプチドが、配列番号：２のアミノ酸残基１３〜１８、好ましくは配列番号：２のアミノ酸残基１１〜１８、より好ましくは配列番号：２のアミノ酸残基１１〜２３、より好ましくは配列番号：２のアミノ酸残基４〜２３に相同ないしは同一なペプチド配列を含有する、ないしはからなる、請求項１ないし８の何れか一に記載の使用。
  10. 前記修飾ＶＬＰの前記ＴＮＦ-ペプチドが、脊椎動物のポリペプチド、好ましくは真獣類綱ポリペプチド由来のものであり、ＴＮＦα、ＬＴαおよびＬＴα／βからなる群から選択されるものであり、自己免疫性疾患又は骨関連の疾患の治療のための医薬の製造のためのものであり、好ましくは該自己免疫性疾患または骨関連の疾患が：
    ａ) 乾癬；
    ｂ) 関節リウマチ；
    ｃ) 乾癬の関節炎；
    ｄ) 炎症性腸疾患；
    ｅ) 全身性エリテマトーデス；
    ｆ) 強直性脊椎炎；
    ｇ) スティル病；
    ｈ) 多発性筋炎；
    ｉ) 血管炎；
    ｊ) 糖尿病；
    ｋ) 重症筋無力症；
    ｌ)シェーグレン症候群；および、
    ｍ) 多発性硬化症
    からなる群から選択されるものである、請求項１ないし９の何れか一に記載の使用。
  11. 前記ＴＮＦ-ペプチドが、配列番号：２または配列番号：１２９を含有する、ないしは好ましくはからなるものであり、さらに好ましくは、該ＴＮＦ-ペプチドが配列番号：１２９を含有する、ないしは好ましくはからなる、請求項１０に記載の使用。
  12. 前記修飾ＶＬＰの前記ＴＮＦ-ペプチドが、
    (i) 関節リウマチおよび糖尿病からなる群から選択される自己免疫性疾患または骨関連の疾患の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＬＩＧＨＴポリペプチド；又は
    (ii) 全身性エリテマトーデス、糖尿病、自己免疫甲状腺の疾患、多発性硬化症および自己免疫肝炎からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＦａｓＬポリペプチド；又は
    (iii) 関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患およびシェーグレン症候群からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＣＤ４０Ｌポリペプチド；又は
    (iv) 関節リウマチ、多発性硬化症および自己免疫甲状腺の疾患からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＴＲＡＩＬポリペプチド；又は
    (v) 乾癬、関節リウマチ、骨粗鬆症、乾癬の関節炎、歯周炎、歯周病、前立腺周囲骨変性、骨異形、多発性骨髄腫、骨癌疼痛およびパジェット病からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＲＡＮＫＬポリペプチド
    に由来するものである、請求項１ないし９の何れか一に記載の使用。
  13. 前記ＴＮＦ-ペプチドが、配列番号：２２のアミノ酸残基１６４〜１６９、配列番号：２２のアミノ酸残基１６２〜１６９、配列番号：２２のアミノ酸残基１６２〜１７４、配列番号：２２のアミノ酸残基１６０〜１７０、配列番号：２２のアミノ酸残基１６０〜１７１、および配列番号：２２のアミノ酸残基１５５〜１７４からなる群から選択されるペプチド配列を含有するおよび好ましくはからなり、さらに好ましくは前記ＴＮＦ-ペプチドが、配列番号：３を含有するおよび好ましくはそれらからなる、請求項１２に記載の使用。
  14. 前記修飾ＶＬＰの前記ＴＮＦ-ペプチドが、
    (i) 関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺の疾患、心筋炎、シェーグレン症候群および原発性胆管萎縮症からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＣＤ３０Ｌポリペプチド；又は
    (ii) 関節リウマチ、炎症性腸疾患および心筋炎からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物の４-１ＢＢＬポリペプチド；又は
    (iii) 関節リウマチ、多発性硬化症および炎症性腸疾患からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＯＸ４０Ｌポリペプチド；又は
    (iv) 関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン症候群からなる群から選択される自己免疫性疾患又は骨関連の治療のための医薬の製造のためには脊椎動物のＢＡＦＦポリペプチド
    に由来するものである、請求項１ないし９の何れか一に記載の使用。
  15. 前記ＶＬＰが、ＲＮＡ-ファージの組換えタンパク質ないしはそれらの断片を含有するか、ないしは選択的にそれらからなり、好ましくは該ＲＮＡ-ファージはＲＮＡ-ファージＱβ、ＲＮＡ-ファージｆｒ又はＲＮＡ-ファージＡＰ２０５であり、そして、さらに好ましくは該ＲＮＡ-ファージがＲＮＡ-ファージＱβである、請求項１ないし１４の何れか一に記載の使用。
  16. 前記組換えタンパク質が、ＲＮＡファージのコ−トタンパク質を含有するか、ないしは基本的にそれらからなるか、ないしは選択的にそれらからなり、好ましくはアミノ酸を有するＲＮＡファージの該コートタンパク質が：
    (ａ) 配列番号：４；
    (ｂ) 配列番号：４および配列番号：５の混合物；
    (ｃ) 配列番号：６；
    (ｄ) 配列番号：７；
    (ｅ) 配列番号：８；
    (ｆ) 配列番号：９；
    (ｇ) 配列番号：９および配列番号：１０の混合物；
    (ｈ) 配列番号：１１；
    (ｉ) 配列番号：１２；
    (ｋ) 配列番号：１３；
    (ｌ) 配列番号：１４；
    (ｍ) 配列番号：１５；
    (ｎ) 配列番号：１６；および、
    (ｏ) 配列番号：２８
    からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の使用。
  17. 前記組換えタンパク質が、ＲＮＡファージの突然変異体コートタンパク質を含有する、ないしは基本的にそれらからなる、ないしは選択的にそれらからなり、好ましくは前記ＲＮＡ-ファージが：
    (ａ) バクテリオファージＱβ；
    (ｂ) バクテリオファージＲ１７；
    (ｃ) バクテリオファージｆｒ；
    (ｄ) バクテリオファージＧＡ；
    (ｅ) バクテリオファージＳＰ；
    (ｆ) バクテリオファージＭＳ２；
    (ｇ) バクテリオファージＭ１１；
    (ｈ) バクテリオファージＭＸ１；
    (ｉ) バクテリオファージＮＬ９５；
    (ｋ) バクテリオファージｆ２；
    (ｌ) バクテリオファージＰＰ７；および、
    (ｍ) バクテリオファージＡＰ２０５
    からなる群から選択されるものである、請求項１ないし１５の何れか一に記載の使用。
  18. 前記ＲＮＡファージの前記突然変異体コートタンパク質が、；
    (i)置換による少なくとも一つのリジン残基の除去；
    (ii)置換による少なくとも一つのリジン残基の添加；
    (iii)少なくとも一つのリジン残基の欠失；および／または
    (iv)挿入による少なくとも一つのリジン残基の添加
    によって修飾されている、請求項１７に記載の使用。
  19. 前記ＶＬＰ(ａ)が、少なくとも一つの非ペプチド結合によって前記ＴＮＦ-ペプチド(ｂ)と連鎖している、請求項１ないし１８の何れか一に記載の使用。
  20. 前記ＴＮＦ-ペプチドが前記ＶＬＰに融合しており、好ましくは前記ＴＮＦ-ペプチドがＶＬＰにそのＣ末端を介して、又は選択的にそのＮ末端を介して融合しているものである、請求項１ないし１８の何れか一に記載の使用。
  21. さらに、前記ＶＬＰ(ａ)と前記ＴＮＦ-ペプチド(ｂ)との間にアミノ酸リンカー(ｃ)を含有し、(ｃ)と(ｂ)は共にヒトＴＮＦαの配列を有するペプチドを形成せず、好ましくは、(ｃ)と(ｂ)は共にヒト又はマウスＴＮＦαの配列を有するペプチドを形成しないものであり；好ましくは該アミノ酸リンカーが：
    ａ) ＧＧＣ；
    ｂ) ＧＧＣ-ＣＯＮＨ２；
    ｃ) ＧＣ；
    ｄ) ＧＣ-ＣＯＮＨ２；
    ｅ) Ｃ；および、
    ｆ) Ｃ-ＣＯＮＨ２
    からなる群から選択されるものである、請求項１ないし２０の何れか一に記載の使用。
  22. 前記修飾ＶＬＰは、少なくとも一つの第一付着部位を有する前記ＶＬＰを含んでなり、該修飾ＶＬＰは少なくとも一つの第二付着部位を有する前記ＴＮＦペプチドを含んでなり、該第二付着部位は該第一付着部位に対合が可能であり；そして、好ましくは該ＴＮＦペプチドおよびＶＬＰは該対合を介して作用して、順に並び、反復性抗原アレイを形成する、請求項１ないし２１の何れか一に記載の使用。
  23. 前記第一付着部位がアミノ基を含有するか好ましくはアミノ基であって、よりさらに好ましくは該第一付着部位がリジン残基のアミノ基である、請求項２２に記載の使用。
  24. 前記第二付着部位がスルフヒドリル基を含有するか好ましくはスルフヒドリル基であって、よりさらに好ましくは該第二付着部位がシステイン残基のスルフヒドリル基である、請求項２２ないし２３の何れか一に記載の使用。
  25. 前記第一付着部位がスルフヒドリル基でなく、好ましくはスルフヒドリル基を含有せず、さらに好ましくは前記第一付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基でなく、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含有しない、請求項２２ないし２４の何れか一に記載の使用。
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