JP2006154290A

JP2006154290A - Fluorescence microscope system

Info

Publication number: JP2006154290A
Application number: JP2004344681A
Authority: JP
Inventors: Susumu Terakawa; 進寺川; Yoshihiko Wakazono; 佳彦若園; Koji Sakurai; 孝司櫻井; Seiji Yamamoto; 清二山本; Atsuo Miyagawa; 厚夫宮川
Original assignee: Hamamatsu University School of Medicine NUC
Current assignee: Hamamatsu University School of Medicine NUC
Priority date: 2004-11-29
Filing date: 2004-11-29
Publication date: 2006-06-15

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a fluorescence microscope system observing two kinds of fluorescent images at the same time. <P>SOLUTION: The fluorescence microscope system is provided with: a sample (S) containing fluorescent substance; a glass plate (G) for supporting the sample; an illumination light source (I<SB>L</SB>) used for illuminating the sample; and a microscopic optical system (M) including an objective lens (Ob) facing the sample so as to obtain the illuminated image. 1st illumination and 2nd illumination for the sample are performed by the illumination optical system through the objective lens of the microscopic optical system. A DVD including a micromirror, functioning as a luminous flux controller is arranged in the crossing area of respective optical axes of the illuminating light and the microscopic optical system, and the illumination light is separated by the DMD so as to perform the 1st illumination and the 2nd illumination, and the 1st and 2nd optical images formed by the aforesaid illumination are separated by the DMD. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、同一の標本について異なる照明による蛍光像の同時取得を可能にした蛍光顕微鏡システムに関する。 The present invention relates to a fluorescence microscope system that enables simultaneous acquisition of fluorescence images by different illumination for the same specimen.

同一の対物レンズや、照明系を異なった目的で使用する顕微鏡技術が数多く提案されている。特許文献１記載の走査型近接場光学顕微鏡の発明は、走査型近接場光学顕微鏡であって、ケーラー照明系とエバネッセント波発生系を備え、可動全反射ミラー（ＤＭＤ）を光路上に配置したり、そこから外したりすることによってケーラー照明系とエバネッセント波発生系の切り替えを行う記述を開示している。
特許文献２記載の観察対象の立体像を生成する方法および立体観察装置の発明は、観察対象物からの光をＤＭＤにより時分割で左右に振り分ける技術を開示している。
特許文献３記載の発明は、光源から出た光がＤＭＤのオン素子により反射され対物平面に焦点を結ぶ技術を開示している。対物平面で励起された蛍光光は同一の光路を経てＤＭＤに戻り、半透明ミラーで反射されて一方のカメラに達する。焦点が外れた位置から発生した光はオフ素子によりミラーで反射され他方のカメラに達する。
特許文献４記載の照明光学系及び照明光学系を備えた顕微鏡の発明は、光ファイバの出射端の位置を移動させることにより落射照明とエバネッセント照明が行える技術を開示している。
特許文献５記載の走査型顕微鏡、走査型顕微鏡法における結像のための光学装置および方法の発明はレーザー光をマイクロミラーで反射させて標本に当て、反射された光を検出する共焦点走査型顕微鏡を開示している。
特許文献６記載のレーザー顕微鏡は、走査型と全反射型との両方の機能を選択的に使用できるレーザー顕微鏡であって、ビームの光路上に集光レンズと平行平面版とからなる挿脱装置を置くことによりビームを結像レンズの中央から所定距離オフセットさせた位置に入射させ、対物レンズを経てカバーガラスに斜めから照射させ、標本との界面で全反射させる。また、ビームの光路上から前記挿脱装置を除くことにより走査型として使用する。
特許文献７記載の顕微鏡システムは、共焦点走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡として同時に使用する場合、ダイクロイックミラーを用い、共焦点走査型レーザー顕微鏡用として波長４８８ｎｍの発振線が標本に照射され、全反射蛍光顕微鏡用として波長５４３ｎｍの発振線が標本に照射される技術を開示している。
特開平０８−２２０１１３特開平１０−１３３３０７特開平１１−１９４２７５特開２００１−２７２６０６特開２００２−１３１６４９特開２００３−０２９１５３特開２００３−２７０５３８ Many microscopic techniques that use the same objective lens or illumination system for different purposes have been proposed. The invention of the scanning near-field optical microscope described in Patent Document 1 is a scanning near-field optical microscope, which includes a Koehler illumination system and an evanescent wave generation system, and a movable total reflection mirror (DMD) is arranged on the optical path. And a description of switching between the Koehler illumination system and the evanescent wave generation system by removing it.
The method of generating a stereoscopic image of an observation object and the invention of the stereoscopic observation apparatus described in Patent Document 2 disclose a technique for distributing light from the observation object to the left and right in a time-sharing manner using DMD.
The invention described in Patent Document 3 discloses a technique in which light emitted from a light source is reflected by an on-element of a DMD and focused on an object plane. The fluorescent light excited on the object plane returns to the DMD through the same optical path, is reflected by the semitransparent mirror, and reaches one camera. Light generated from a position out of focus is reflected by the mirror by the off element and reaches the other camera.
The invention of the illumination optical system and the microscope equipped with the illumination optical system described in Patent Document 4 discloses a technique capable of performing epi-illumination and evanescent illumination by moving the position of the exit end of the optical fiber.
Patent Document 5 discloses a scanning microscope, an optical device for imaging in scanning microscope, and a method of confocal scanning for detecting reflected light by reflecting a laser beam with a micromirror and applying it to a specimen. A microscope is disclosed.
The laser microscope described in Patent Document 6 is a laser microscope that can selectively use both functions of a scanning type and a total reflection type, and is an insertion / removal device comprising a condenser lens and a parallel plane plate on the optical path of the beam , The beam is made incident at a position offset by a predetermined distance from the center of the imaging lens, irradiates the cover glass obliquely through the objective lens, and is totally reflected at the interface with the specimen. Further, it is used as a scanning type by removing the insertion / removal device from the beam optical path.
When the microscope system described in Patent Document 7 is used simultaneously as a confocal scanning laser microscope and a total reflection fluorescence microscope, a dichroic mirror is used, and an oscillation line having a wavelength of 488 nm is irradiated to the sample for the confocal scanning laser microscope. A technique for irradiating a specimen with an oscillation line having a wavelength of 543 nm for a total reflection fluorescent microscope is disclosed.
JP 08-220113 A JP-A-10-133307 JP-A-11-194275 JP 2001-272606 A JP 2002-131649 A JP 2003-029153 A JP2003-270538

前記特許文献７記載の顕微鏡は多岐にわたる用途を示しているが可動部分が多く設けられている。前記特許文献３記載の発明は対物平面で励起された蛍光光をＤＭＤのオン素子により一方のカメラに導き、焦点が外れた位置から発生した光をＤＭＤのオフ素子により他方のカメラに導く技術が開示しているが、エバネッセンス法におよんでいない。
また前述の特許文献を含めてＤＬＰ（Digital Light Processing）技術の共焦点顕微鏡への応用に関する提案は数多くなされている。
ＤＬＰ共焦点顕微鏡は、共焦点顕微鏡の基本原理であるニプコウ円盤のピンホールを、ＤＬＰの根幹を成すＤＭＤ（Digital Micromirror Device）上の個々の微小ミラーに代替させることによって成立している。
その結果、光源からの光はその一部のみを標本に照射しているに過ぎない（ＤＭＤ上の“ＯＮ" 状態の微小ミラーのみが標本を照射）。それゆえ、残りの光（ＤＭＤ上の“ＯＦＦ" 状態の微小ミラーからの光; 光源の光の９０％以上）は利用されていないことになる。他方のカメラに導く技術が開示しているが、エバネッセンス法におよんでいない。 Although the microscope described in Patent Document 7 shows various uses, it has many movable parts. The invention described in Patent Document 3 is a technique in which fluorescent light excited on the object plane is guided to one camera by an on-element of the DMD, and light generated from an out-of-focus position is guided to the other camera by an off-element of the DMD. Although disclosed, it does not extend to the evanescence method.
In addition, many proposals have been made regarding the application of DLP (Digital Light Processing) technology to a confocal microscope, including the aforementioned patent documents.
The DLP confocal microscope is established by replacing the pinhole of the Nipkou disk, which is the basic principle of the confocal microscope, with individual micromirrors on a DMD (Digital Micromirror Device) that forms the basis of DLP.
As a result, only a part of the light from the light source irradiates the sample (only the micro mirror in the “ON” state on the DMD irradiates the sample). Therefore, the remaining light (light from the micromirror in the “OFF” state on the DMD; 90% or more of the light from the light source) is not used. Although the technology leading to the other camera is disclosed, it does not reach the evanescence method.

蛍光顕微鏡が、医療の診断のために広く用いられている（特許文献８〜１０）。
特表平１１−５０５５２６特表２００２−５３０７１５特表２００２−５４１４８２ Fluorescence microscopes are widely used for medical diagnosis (Patent Documents 8 to 10).
Special table flat 11-505526 Special table 2002-530715 Special table 2002-541482

蛍光顕微鏡には様々な方式があり、それぞれの方式によって得られる像の性質に違いがあるため、観察したい対象の特徴に応じて、顕微鏡の方式を選択する必要があった。
ひとつの方式を実現するには、照明の光路と観察の光路の設け方を一定のものとする必要がある。
異なる方式とするには、その組み合わせを取り替えるために、これまでは、光学素子の交換などの操作を必要とした。したがって、二つの異なる蛍光顕微鏡方式を重ねて、異なる性質の蛍光像を同時に複数得るということはできなかった。
一般的に用いられている蛍光顕微鏡の方式としては、
１）落射照明蛍光法、
２）共焦点蛍光法、
３）全反射照明蛍光法（別名エバネッセンス顕微鏡法）、
４）斜光照明蛍光法
などがある。
１）は単純な光学系で明るい像が得られる。
２）は１）より暗いが、被写界深度の浅い像、すなわち観察対象を光軸に垂直な面で光学的に薄く切断した様な像が得られる。３）は細胞膜など光学系の最終端にあるガラスに接着した対象をきわめて薄く切断した様な画像が得られ、背景光が最も低くなるため、一分子からの蛍光像も得られる。４）は細胞などの内部を観察するものであるが、像の光学切断性は２）と３）の中間の性能となる。この方式でも辛うじて一分子像が観察できる。 There are various types of fluorescence microscopes, and there are differences in the properties of images obtained by the respective methods, so it was necessary to select a microscope type according to the characteristics of the object to be observed.
In order to realize one method, it is necessary to make the way of providing the illumination optical path and the observation optical path constant.
In order to change the combination, an operation such as replacement of optical elements has been required so far in order to change the combination. Therefore, it was impossible to obtain two or more fluorescence images having different properties at the same time by superimposing two different fluorescence microscope systems.
As a commonly used fluorescence microscope system,
1) Epi-illumination fluorescence method,
2) Confocal fluorescence method,
3) Total reflection illumination fluorescence method (also known as evanescence microscopy),
4) There is an oblique illumination fluorescence method.
1) A bright image can be obtained with a simple optical system.
Although 2) is darker than 1), an image having a shallow depth of field, that is, an image obtained by optically thinning an observation target on a plane perpendicular to the optical axis is obtained. In 3), an image obtained by cutting an object adhered to the glass at the end of the optical system such as a cell membrane very thinly is obtained, and since the background light is the lowest, a fluorescence image from one molecule is also obtained. 4) is for observing the inside of a cell or the like, but the optical cutability of the image is intermediate between 2) and 3). Even with this method, a single molecule image can be observed.

本発明では、画素であるマイクロミラーを多数２次元的に配列したデジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）を用い、異なる方式の蛍光顕微鏡法を同時に実現するものである。
特に、共焦点蛍光顕微鏡法と全反射照明蛍光法、または、
共焦点蛍光顕微鏡法と斜入照明顕微鏡法を同時に実現することにより、常に２種類の異なる蛍光顕微鏡像を連続、経時的に得られるようにしたものである。 In the present invention, a digital micromirror device (DMD) in which a number of micromirrors as pixels are two-dimensionally arranged is used to simultaneously realize different types of fluorescence microscopy.
In particular, confocal fluorescence microscopy and total reflection illumination fluorescence, or
By simultaneously realizing confocal fluorescence microscopy and oblique illumination microscopy, two types of different fluorescence microscope images can be obtained continuously and over time.

本発明の基本的な目的は、光束制御装置を用いて、顕微鏡観察の光源及び像面を、各々二つに分けることにより同一の標本の異なる照明によるそれぞれの像を同時に観察することができる顕微鏡システムを提供することにある。
本発明の目的は、同一の標本のエバネッセンス像と共焦点像を同一の対物レンズを介して同時に観察を可能にした２像同時観察を可能にする蛍光顕微鏡システムを提供することにある。
本発明のさらに詳細な目的は、蛍光顕微鏡において同一の標本の斜入光照明像と共焦点像を同一の対物レンズを介して２像同時観察を可能にする蛍光顕微鏡システムを提供することにある。 A basic object of the present invention is to use a light beam control device to divide a microscope observation light source and an image plane into two, respectively, so that respective images of the same specimen by different illuminations can be observed simultaneously. To provide a system.
An object of the present invention is to provide a fluorescence microscope system that enables two-image simultaneous observation that enables simultaneous observation of an evanescence image and a confocal image of the same specimen through the same objective lens.
A more detailed object of the present invention is to provide a fluorescence microscope system that enables simultaneous observation of two images of an oblique illumination light image and a confocal image of the same specimen through the same objective lens in a fluorescence microscope. .

前記目的を達成するために本発明による請求項１記載の蛍光顕微鏡システムは、
蛍光物質を含む標本と、
前記標本を支持するガラスプレートと、
前記標本の照明光を発生する照明光源と、
前記照明光による像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に第１および第２の照明をする照明光学系と、
前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、前記第１および第２の照明のために照明光を分離するとともに前記分離された照明光により形成された第１および第２の像光を分離する光束制御装置と、
前記第１および第２の像光を結像して第１および第２の像を得る結像光学系と、
から構成されている。
前記構成によれば、前記第１および第２の像光を選択的にまたは同時に観察することができる。 In order to achieve the object, the fluorescence microscope system according to claim 1 according to the present invention comprises:
A specimen containing a fluorescent substance;
A glass plate that supports the specimen;
An illumination light source for generating illumination light of the specimen;
A microscope optical system including an objective lens directed to the specimen to acquire an image by the illumination light;
An illumination optical system for performing first and second illumination on the specimen via an objective lens of the microscope optical system;
Arranged in the crossing area of the illumination light and each optical axis of the microscope optical system, the light beam can be split, and the change of the position and size ratio of the split area can be designated from the outside, and the change can be continuously performed at high speed. A light flux control device that can be modified to separate illumination light for the first and second illumination and to separate first and second image light formed by the separated illumination light;
An imaging optical system that images the first and second image lights to obtain first and second images;
It is composed of
According to the said structure, the said 1st and 2nd image light can be observed selectively or simultaneously.

本発明による請求項２記載の蛍光顕微鏡システムは、
蛍光物質を含む標本と、
前記標本を支持するガラスプレートと、
前記標本のエバネッセンス照明と共焦点照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
前記エバネッセンス照明と前記共焦点照明のための照明光を発生する照明光源と、
前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、共焦点照明光とエバネッセンス照明光を分離しさらに共焦点像光とエバネッセンス像光を分離する光束制御装置と、
前記光束制御装置で分離された前記エバネッセンス照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズの周縁から前記標本と前記ガラスプレートに向けて全反射エバネッセンス照明光が発生するよう投射するエバネッセンス照明光学系と、
前記光束制御装置で分離された前記共焦点照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に向けて投射する共焦点照明光学系と、
分離された前記エバネッセンス像光を結像するエバネッセンス像結像レンズと、
分離された前記共焦点像光を結像する共焦点像結像レンズと、
前記各結像レンズで形成される像の位置に配置されているイメージセンサと、
から構成されている。
前記構成によれば、エバネッセンス像と共焦点像を選択的にまたは同時に観察することができる。 The fluorescence microscope system according to claim 2 according to the present invention comprises:
A specimen containing a fluorescent substance;
A glass plate that supports the specimen;
A microscope optical system including an objective lens that is directed to the specimen to obtain images of evanescence illumination and confocal illumination of the specimen;
An illumination light source that generates illumination light for the evanescence illumination and the confocal illumination;
Arranged in the crossing area of the illumination light and each optical axis of the microscope optical system, the light beam can be split, and the change of the position and size ratio of the split area can be designated from the outside, and the change can be continuously performed at high speed. A light flux control device that can change, separates the confocal illumination light and the evanescence illumination light, and further separates the confocal image light and the evanescence image light;
An evanescence illumination optical system that projects the evanescence illumination light separated by the light flux control device from the periphery of the objective lens of the microscope optical system toward the sample and the glass plate so that total reflection evanescence illumination light is generated;
A confocal illumination optical system that projects the confocal illumination light separated by the light flux control device toward the sample via an objective lens of the microscope optical system;
An evanescence image forming lens that forms the separated evanescence image light; and
A confocal image forming lens that forms the separated confocal image light; and
An image sensor disposed at a position of an image formed by each imaging lens;
It is composed of
According to the said structure, an evanescence image and a confocal image can be observed selectively or simultaneously.

本発明による請求項３記載の蛍光顕微鏡システムは、請求項２記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記照明光源の光軸は前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交叉するものである。
本発明による請求項４記載の蛍光顕微鏡システムは、請求項３記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記エバネッセンス照明像用の結像レンズは、前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交わる軸上に配置されている。
本発明による請求項５記載の蛍光顕微鏡システムは、請求項３記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記共焦点照明像用の結像レンズは、前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交わる照明光軸とダイクロイックミラーの位置で交わる他の軸上に配置されている。 The fluorescence microscope system according to claim 3 according to the present invention is the fluorescence microscope system according to claim 2,
The optical axis of the illumination light source intersects the optical axis of the objective lens at the position of the light flux control device.
The fluorescence microscope system according to claim 4 according to the present invention is the fluorescence microscope system according to claim 3,
The imaging lens for the evanescence illumination image is disposed on an axis that intersects the optical axis of the objective lens and the position of the light beam control device.
The fluorescence microscope system according to claim 5 according to the present invention is the fluorescence microscope system according to claim 3,
The imaging lens for the confocal illumination image is disposed on another axis that intersects at the position of the dichroic mirror and the illumination optical axis that intersects the optical axis of the objective lens and the position of the light beam control device.

本発明による請求項６記載の蛍光顕微鏡システムは、
蛍光物質を含む標本と、
前記標本を支持するガラスプレートと、
前記標本の斜入照明と共焦点照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
前記斜入照明と前記共焦点照明のための照明光を発生する照明光源と、
前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、共焦点照明光と斜入照明光を分離しさらに共焦点像光と斜入像光を分離する光束制御装置と、
前記光束制御装置で分離された前記斜入照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズの周縁から前記標本と前記ガラスプレートに向けて斜入照明光が発生するよう投射する斜入照明光学系と、
前記光束制御装置で分離された前記共焦点照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に向けて投射する共焦点照明光学系と、
分離された前記斜入像光を結像する斜入像結像レンズと、
分離された前記共焦点像光を結像する共焦点像結像レンズと、
前記各結像レンズで形成される像の位置に配置されているイメージセンサと、
から構成されている。
前記構成によれば、斜入像結像と共焦点像結像を同時にまたは選択的に観察できる。
本発明による請求項７記載の蛍光顕微鏡システムは、
請求項１〜６記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、前記光束制御装置をＤＭＤとしたものである。 The fluorescence microscope system according to claim 6 according to the present invention comprises:
A specimen containing a fluorescent substance;
A glass plate that supports the specimen;
A microscope optical system that includes an objective lens that is directed to the specimen to acquire oblique and confocal illumination images of the specimen;
An illumination light source that generates illumination light for the oblique illumination and the confocal illumination;
Arranged in the crossing area of the illumination light and each optical axis of the microscope optical system, the light beam can be split, and the change of the position and size ratio of the split area can be designated from the outside, and the change can be continuously performed at high speed. A light flux control device that can be changed, separates the confocal illumination light and the oblique illumination light, and further separates the confocal image light and the oblique illumination light;
An oblique illumination optical system that projects the oblique illumination light separated by the light flux control device from the periphery of the objective lens of the microscope optical system so that oblique illumination light is generated toward the sample and the glass plate;
A confocal illumination optical system that projects the confocal illumination light separated by the light flux control device toward the sample via an objective lens of the microscope optical system;
An oblique image forming lens for forming the separated oblique image light; and
A confocal image forming lens that forms the separated confocal image light; and
An image sensor disposed at a position of an image formed by each imaging lens;
It is composed of
According to the configuration, oblique image formation and confocal image formation can be observed simultaneously or selectively.
The fluorescence microscope system according to claim 7 according to the present invention comprises:
7. The fluorescence microscope system according to claim 1, wherein the light flux control device is a DMD.

本発明によれば、同一の標本のエバネッセンス像と共焦点像を同一の対物レンズを介して同時にまたは選択的に観察が可能である。また、蛍光顕微鏡において同一の標本の斜入光照明像と共焦点像を同一の対物レンズを介して同時にまた選択的に観察することも可能になった。 According to the present invention, an evanescence image and a confocal image of the same specimen can be observed simultaneously or selectively through the same objective lens. In addition, it is also possible to selectively and simultaneously observe obliquely incident illumination images and confocal images of the same specimen through the same objective lens in a fluorescence microscope.

以下図面等を参照して本発明による装置の実施形態を説明する。
図１は、本発明による蛍光顕微鏡システムの基本構成を示すブロック図である。ガラスプレート（Ｇ）の上に標本（Ｓ）が搭載されている。この標本（Ｓ）は後述するように２種類の像すなわち、第１の照明と第２の照明の各像を形成するように照明される。顕微鏡光学系（Ｍ）は前記標本（Ｓ）の第１の照明と第２の照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズ（Ｏｂ）を含んでいる。
前記対物レンズ（Ｏｂ）を含む顕微鏡光学系（Ｍ）の光軸上に光束制御装置が配置されている。光束制御装置は、前記第１および第２の照明のために照明光を分離し、前記分離された照明光により形成された第１および第２の像光を分離するために用いられる。前記光束制御装置は、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、それらの変化を高速でかつ連続的に変更できる装置である。 Embodiments of an apparatus according to the present invention will be described below with reference to the drawings.
FIG. 1 is a block diagram showing a basic configuration of a fluorescence microscope system according to the present invention. A specimen (S) is mounted on a glass plate (G). As will be described later, the specimen (S) is illuminated so as to form two types of images, that is, images of the first illumination and the second illumination. The microscope optical system (M) includes an objective lens (Ob) that is directed to the specimen to acquire images of the first illumination and the second illumination of the specimen (S).
A light flux controller is disposed on the optical axis of the microscope optical system (M) including the objective lens (Ob). The light flux control device is used to separate illumination light for the first and second illuminations, and to separate first and second image lights formed by the separated illumination light. The light beam control device is a device that can split a light beam, can specify a change in the position and size ratio of the divided region from the outside, and can change these changes continuously at high speed.

ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）は前記光束制御装置として適している。
このディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）は前記第１および第２の照明像の取得のために駆動される多数のマイクロミラーを含んでいる。ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）は、外部の制御回路（ＣＰＵ）により任意のマイクロミラーがオンオフ制御される。オフ状態のマイクロミラーが第１の照明（およびこの照明により形成された像の取得）に寄与する。他方オン状態のマイクロミラーが第２の照明（およびこの照明により形成された像の取得）に寄与する。 A digital micromirror device (DMD) is suitable as the light flux control device.
The digital micromirror device (DMD) includes a number of micromirrors that are driven to acquire the first and second illumination images. In the digital micromirror device (DMD), an arbitrary micromirror is on / off controlled by an external control circuit (CPU). The off-state micromirror contributes to the first illumination (and the acquisition of the image formed by this illumination). On the other hand, the micromirror in the on state contributes to the second illumination (and the acquisition of the image formed by this illumination).

照明光源（Ｉ_L ）は、前述の第１の照明のための照明光と第２の照明のための照明光を含んでおり、前記ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）に向けて照明光を放出する。
この照明光はディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）で第１の照明光と第２の照明光に分離されそれぞれ標本の第１の像と第２の像の形成に利用される。それぞれの光で照明された標本（Ｓ）において、第１の像と第２の像を形成する。これらの像はそれぞれ顕微鏡光学系（Ｍ）で拡大され、第１および第２の結像光学系でそれぞれの画像センサ（Ｉ_s1, Ｉ_s2) に結像させてそれぞれディスプレイ（Ｄ_i1, Ｄ_i2）により表示される。
つまり、ＤＬＰ技術を利用し、例えば共焦点法とエバネッセンス法の同時観察を可能にするものである。（なお他の組み合わせもある。）要するに今回のアイデアの本質的な部分は、ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）のマイクロミラーを駆動して顕微鏡観察の光源及び像面を、各々二つに分けることができるというところである。ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）により分光された光源を、既存の顕微鏡観察法の光源として利用することにより、様々な顕微鏡観察法との同時観察が可能になる。 The illumination light source (I _L ) includes illumination light for the first illumination and illumination light for the second illumination, and emits illumination light toward the digital micromirror device (DMD). .
This illumination light is separated into a first illumination light and a second illumination light by a digital micromirror device (DMD) and used to form a first image and a second image of the specimen, respectively. In the specimen (S) illuminated with each light, a first image and a second image are formed. Each of these images is magnified by the microscope optical system (M), and is imaged on the respective image sensors (I _s1, I _s2 ) by the first and second imaging optical systems to be respectively displayed (D _i1, D _i2). ) Is displayed.
That is, using the DLP technique, for example, simultaneous observation of the confocal method and the evanescence method is enabled. (There are other combinations as well.) In short, the essential part of this idea is to drive the micromirror of the digital micromirror device (DMD) to divide the light source and image plane for microscopic observation into two parts respectively. You can do it. By using a light source dispersed by a digital micromirror device (DMD) as a light source for an existing microscope observation method, simultaneous observation with various microscope observation methods becomes possible.

図２は、本発明による蛍光顕微鏡システムの実施例の略図である。図３は前記顕微鏡の実施例のエバネッセンス顕微鏡動作に関連する光学要素および光束を取り出して示した略図である。図４は前記顕微鏡の実施例の共焦点顕微鏡動作に関連する光学要素および光束を取り出して示した略図である。本発明ではエバネッセンス顕微鏡動作に関連する光学要素を利用して、若干の配置の修正等により、前記標本の斜入照明と共焦点照明の各像を取得することができる。まず始めに光学系について説明する。 FIG. 2 is a schematic diagram of an embodiment of a fluorescence microscope system according to the present invention. FIG. 3 is a schematic view showing optical elements and light fluxes extracted from the operation of the microscope according to the evanescence microscope. FIG. 4 is a schematic view showing optical elements and light fluxes extracted from the confocal microscope operation of the microscope embodiment. In the present invention, each of the oblique illumination and confocal illumination images of the sample can be acquired by using optical elements related to the operation of the evanescence microscope and slightly correcting the arrangement. First, the optical system will be described.

各図において、顕微鏡の主軸または光軸（ＯＡ₁ ）に沿って、カバーガラス６、対物レンズを構成する第２レンズ５、結像用のレンズである第１レンズ４およびディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）がこの順で配置されている。カバーガラス６の上には励起光により蛍光を発する物質を含む標本（または試料）３０が配置される。
標本３０の例として、緑色蛍光蛋白とインスリンの融合蛋白を分泌顆粒内に発現した細胞を挙げることができる。
光束制御装置であるディジタルマイクロミラー装置はそのマイクロミラーがオフの状態の光路に着目してＤＭＤ１（マイクロミラーがオフの状態）、そのマイクロミラーがオンの状態の光路に着目してＤＭＤ２（マイクロミラーがオンの状態）と表すものとする。 In each figure, along the main axis or optical axis (OA ₁ ) of the microscope, a cover glass 6, a second lens 5 constituting an objective lens, a first lens 4 as an imaging lens, and a digital micromirror device (DMD) ) Are arranged in this order. A specimen (or sample) 30 containing a substance that emits fluorescence by excitation light is disposed on the cover glass 6.
An example of the specimen 30 is a cell in which a fusion protein of green fluorescent protein and insulin is expressed in secretory granules.
The digital micromirror device, which is a light beam control device, focuses on the optical path when the micromirror is off, DMD1 (micromirror is off), and focuses on the optical path when the micromirror is on DMD2 (micromirror) Is in an on state).

照明光源の主軸または光軸（ＯＡ₂ ）に沿って、前述のＤＭＤ、ダイクロイックミラー１１、集光レンズ８、照明光源１５がこの順で配置されている。
照明光源として、レーザ光源（波長５３２ｎｍ、４８８ｎｍ等を含む）とか水銀灯、またはメタルハライド等を使用できる。分光特性はレーザ照明の場合は単色であり、他の場合はフィルタを用いて制限する。各フィルタ１８，１９，２０はそのために用いられる。
ダイクロイックミラー１１で反射された像光（図２，図４）はフィルタ１８、共焦点用の第２結像レンズ１２を介して２次元光検出器１３上に結像される。
ダイクロイックミラー１１は光源からの照明光を透過し、試料３０からの共焦点蛍光像光をフィルタ１８、レンズ１２方向に反射する。 The DMD, the dichroic mirror 11, the condenser lens 8, and the illumination light source 15 are arranged in this order along the main axis or the optical axis (OA ₂ ) of the illumination light source.
As the illumination light source, a laser light source (including wavelengths of 532 nm and 488 nm), a mercury lamp, a metal halide, or the like can be used. The spectral characteristics are monochromatic in the case of laser illumination, and are limited using a filter in other cases. Each filter 18, 19, 20 is used for that purpose.
The image light (FIGS. 2 and 4) reflected by the dichroic mirror 11 is imaged on the two-dimensional photodetector 13 through the filter 18 and the second imaging lens 12 for confocal.
The dichroic mirror 11 transmits the illumination light from the light source and reflects the confocal fluorescent image light from the sample 30 toward the filter 18 and the lens 12.

図３に示すように、照明光源１５から、光軸（ＯＡ₂ ）に沿って供給された照明光の内ＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラー）により光路が変更された照明光は補助レンズ１６、光路ミラー３を通過し、一旦集束され、第２レンズ５の周縁で屈折され、カバーガラス６と標本の界面に向けられる。
ＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラー）により光路が変更された像光は、視野絞り１４を介し、第１結像レンズ９、フィルタ２０を介して、光検出器１０にもたらされる。 As shown in FIG. 3, the illumination light whose optical path is changed by the DMD 1 (micromirror in the off state) of the illumination light supplied from the illumination light source 15 along the optical axis (OA ₂ ) is the auxiliary lens 16, The light passes through the optical path mirror 3, is once focused, refracted at the periphery of the second lens 5, and directed toward the interface between the cover glass 6 and the specimen.
The image light whose optical path is changed by DMD 1 (micromirror in the off state) is brought to the photodetector 10 through the field stop 14, the first imaging lens 9, and the filter 20.

以下、さらに詳細な構成を動作と共に説明する。ＤＭＤのマイクロミラー素子へ向かって集束するような照明光束を当てる。
ＤＭＤのマイクロミラー素子（画素対応）がすべてオフ状態すなわちＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラー）では照明光束は一定の角度で緩やかに発散する。
この光束を補助レンズ１６とミラー３等によって変える。この光束の軸が、光学系の主軸（ＯＡ₁ ）に対してやや傾くようにミラー３を設置しておく。補助レンズ１６により、照明用の光束は、第２レンズ５の後側焦点に一度集束してから発散するような光束となる。 Hereinafter, a more detailed configuration will be described together with the operation. An illumination light beam that focuses toward the micromirror element of the DMD is applied.
When all of the DMD micromirror elements (corresponding to pixels) are in the off state, that is, DMD1 (micromirror in the off state), the illumination light beam gently diverges at a constant angle.
This light beam is changed by the auxiliary lens 16 and the mirror 3. The mirror 3 is installed so that the axis of the light beam is slightly inclined with respect to the main axis (OA ₁ ) of the optical system. By the auxiliary lens 16, the illumination light beam becomes a light beam that converges once at the rear focal point of the second lens 5 and then diverges.

第２レンズ５の位置は、使用目的に応じて変えることができるが、一例として、その前方焦点がカバーガラス６の表面から離れた点に来るような位置に置かれているものとする。なお後述するようにカバーガラス６と第２レンズ５の間には、浸漬油（オイル）２８を浸積して使用する（図５参照）。
得られた光束は第２レンズ５の周辺とそれに近い領域を通過してから強く屈折し、第２レンズ５の前方焦点よりレンズに近い点で光軸と交差する平行光となり、カバーガラス６の表面で全反射する光となる。この全反射に際してカバーガラス６の表面にエバネッセント光が生じ、これによってカバーガラス表面とそのごく近傍（〜１００ｎｍ）にある標本中の蛍光分子の励起ができる。 The position of the second lens 5 can be changed according to the purpose of use, but as an example, it is assumed that its front focal point is located at a point away from the surface of the cover glass 6. As described later, immersion oil (oil) 28 is immersed between the cover glass 6 and the second lens 5 for use (see FIG. 5).
The obtained light beam is refracted strongly after passing through the periphery of the second lens 5 and a region close thereto, and becomes parallel light that intersects the optical axis at a point closer to the lens than the front focal point of the second lens 5. The light is totally reflected on the surface. During this total reflection, evanescent light is generated on the surface of the cover glass 6, which allows excitation of fluorescent molecules in the sample on the surface of the cover glass and in the vicinity thereof (˜100 nm).

このような標本中の蛍光分子より生じた蛍光は、第２レンズ５によって集められ、ＤＭＤの上に集光されるが、その集束点は正確にはＤＭＤ上には無く、ＤＭＤのオフ状態のミラー群（ＤＭＤ１）によって反射されたあとに一点に集束し、続いて発散する。
これを第１結像レンズ９で集め、２次元光検出器１０へ送ると、エバネッセント光によって励起された蛍光の像、すなわち、エバネッセンス像が得られる。 Fluorescence generated from the fluorescent molecules in the specimen is collected by the second lens 5 and collected on the DMD, but the focal point is not exactly on the DMD, and the DMD is in the OFF state. After being reflected by the mirror group (DMD1), it converges to one point and then diverges.
When this is collected by the first imaging lens 9 and sent to the two-dimensional photodetector 10, an image of fluorescence excited by the evanescent light, that is, an evanescence image is obtained.

前述のような光学系において、今度は、ＤＭＤの任意のマイクロミラーをオン状態にする。すなわち、ＤＭＤ２（マイクロミラーがオンの状態）にすると、このマイクロミラーを仮想的な点光源とする光束が生じ、これは、第１レンズ４の中心領域を通過する光束として平行光に変換される。
この平行光は、第２レンズ５の中心領域を通って、第２レンズ５の前方焦点に集光する。前方焦点はカバーガラス６表面（図４中上表面）から上に離れたところに置かれており、その領域に蛍光分子があればこれを励起する。
この領域で生じた蛍光は第２レンズ５によって集光されて平行光に変換され、第１レンズ４を通って、仮想光源であった前述のオン状態のマイクロミラー（蛍光の発生点と共役位置）に集光される。集光された蛍光は、オン状態のマイクロミラーによって反射され、発散光となる。そしてダイクロイックミラー１１によって反射させると、励起光の光路から分離された蛍光となり、第２結像レンズ１２によって２次元検出器１３に導かれ点像を形成する。 In the optical system as described above, this time, an arbitrary micromirror of the DMD is turned on. That is, when DMD 2 (micro mirror is in an on state), a light beam using this micro mirror as a virtual point light source is generated, and this is converted into parallel light as a light beam passing through the central region of the first lens 4. .
The parallel light passes through the central region of the second lens 5 and is collected at the front focal point of the second lens 5. The front focal point is placed at a position away from the surface of the cover glass 6 (upper surface in FIG. 4), and if there is a fluorescent molecule in that region, it is excited.
Fluorescence generated in this region is condensed by the second lens 5 and converted into parallel light, passes through the first lens 4, and is the above-described on-state micromirror that is a virtual light source (fluorescence generation point and conjugate position). ). The condensed fluorescence is reflected by the on-state micromirror and becomes divergent light. When reflected by the dichroic mirror 11, fluorescence is separated from the optical path of the excitation light, and is guided to the two-dimensional detector 13 by the second imaging lens 12 to form a point image.

ＤＭＤのマイクロミラーのオンの状態（ＤＭＤ２）は、従来の共焦点光学系の回転ディスクのピンホールの作用をし、その位置と数を高速に制御することにより、標本内に蛍光励起能力のある光の輝点を走査でき、実用上の短時間における走査の後に、２次元検出器１３上に蛍光像を形成する。 The DMD micromirror is in an on state (DMD2), which acts as a pinhole of a rotating disk of a conventional confocal optical system, and has a fluorescence excitation capability in the specimen by controlling its position and number at a high speed. A bright spot of light can be scanned, and a fluorescent image is formed on the two-dimensional detector 13 after scanning in a practical short time.

大部分のＤＭＤのマイクロミラーをオフ状態（ＤＭＤ１）にしてエバネッセンス像を得る光学系とするが、特定の少数のマイクロミラーのみをオン状態（ＤＭＤ２）になるように選ぶと、カバーガラス６上のエバネッセント光励起によって生ずる蛍光は大部分が、オフ状態のミラー（ＤＭＤ１）で反射される方向へ向かう。 Most DMD micromirrors are in an off state (DMD1) to obtain an evanescence image. However, if only a specific small number of micromirrors are selected to be in an on state (DMD2), the optical system on the cover glass 6 is selected. Most of the fluorescence generated by the evanescent light excitation is directed to the direction reflected by the off-state mirror (DMD1).

わずかな部分は、オン状態のミラー（ＤＭＤ２）によって反射されるものとは別の方向へ向かうが、その割合は小さい（全光量の５％以下となる）ので、共焦点蛍光像へのエバネッセント光励起による蛍光の混入は小さく、かつそれぞれの像面の位置（レンズからの距離）も異なるので、像の形成に影響を与えることはなく、わずかな背景光のレベルの増大にとどまる。 A small part goes in a direction different from that reflected by the on-state mirror (DMD2), but the ratio is small (below 5% of the total light amount), so that evanescent light excitation to the confocal fluorescent image Fluorescence is small and the position of each image plane (distance from the lens) is different. Therefore, the image formation is not affected, and the background light level is slightly increased.

一方、第２レンズ５の前方焦点面上の一点から発する蛍光は、その共役点であり励起光が発散してくる仮想的な点光源であるオン状態のマイクロミラーＤＭＤ２に集束されるので、共焦点効果が生ずる。ＤＭＤ２によって効率よく反射され、共焦点像の形成に寄与する。
第２レンズ５の前方焦点面より上下にずれた面からの蛍光は、オンミラー上に完全には集光されず、オンミラーでの反射効率が下がるため、共焦点像への焦点面外からの蛍光の混入が妨げられる。 On the other hand, the fluorescence emitted from one point on the front focal plane of the second lens 5 is focused on the on-state micromirror DMD2 which is a conjugate point and a virtual point light source from which the excitation light diverges. Focus effect occurs. The light is efficiently reflected by the DMD 2 and contributes to the formation of a confocal image.
Fluorescence from the surface shifted from the front focal plane of the second lens 5 is not completely condensed on the on-mirror, and the reflection efficiency at the on-mirror is lowered, so that the fluorescence from the out-of-focus plane to the confocal image is obtained. Mixing is prevented.

共焦点蛍光光学系における照明光が、第２レンズ５の中心領域を含む広い部分を通過して標本内に集束すると、これは、エバネッセント光によって照明されているカバーガラス面上の視野中心領域をも通過することになる。
これは、エバネッセント光の照明と重なり、エバネッセント光の持つ光強度分布と異なる特徴の光強度分布をもたらす。そこで、第２レンズ５の片側においてその中心に光を遮蔽するマスク７を置き、カバーガラス６の視野中心領域には共焦点光学系の照明光が通過しないようにする。これによって、カバーガラス６上にはエバネッセント光が、カバーガラス表面から離れたところに共焦点光学系の集束光が独立に存在することになる。
以上の光学系により、カバーガラス６上のエバネッセント光により励起された蛍光像と、共焦点光学系による蛍光像が、ＤＭＤにおけるオンミラーの順次選択終了後（走査時間）に同時的に観察でき、エバネッセンス顕微鏡像と共焦点蛍光像が同時に観察できる蛍光顕微鏡が成立する。 When the illumination light in the confocal fluorescence optical system passes through a wide portion including the central region of the second lens 5 and is focused in the sample, this causes the central region of the field of view on the cover glass surface illuminated by the evanescent light to be focused. Will also pass.
This overlaps with the illumination of the evanescent light, resulting in a light intensity distribution having a characteristic different from the light intensity distribution of the evanescent light. Therefore, a mask 7 that shields light is placed at the center of one side of the second lens 5 so that the illumination light of the confocal optical system does not pass through the central region of the field of view of the cover glass 6. As a result, the evanescent light exists on the cover glass 6 and the converging light of the confocal optical system exists independently at a position away from the cover glass surface.
With the above optical system, the fluorescence image excited by the evanescent light on the cover glass 6 and the fluorescence image by the confocal optical system can be observed simultaneously after the sequential selection of the on-mirror in the DMD (scanning time). A fluorescence microscope capable of simultaneously observing a microscope image and a confocal fluorescence image is established.

（エバネッセンス顕微鏡像と共焦点蛍光像の同時観察）
図５は、本発明による顕微鏡システムのエバネッセンス顕微鏡および共焦点顕微鏡動作時の試料部分の拡大図である。図左側は照明光の経路、右側は蛍光発光点からの光の経路を示している。対物レンズ５とカバーガラス６の間には浸漬油２８があり、いわゆる油浸光学系となっている。対物レンズは油浸超高開口数（ＮＡ＝１．４５またはＮＡ＝１．６５）のものを使用している。したがって、対物レンズからカバーガラスまでの屈折率は一定で、光はこの間を直進するのと同等である。カバーガラスの表面を斜めに横切る光（左図の共焦点励起光と右図の１からの蛍光）は屈折する。図において３０は細胞等の蛍光標本（観察対象）であり７は光を遮るマスクである。
右図において、共焦点励起の蛍光（蛍光発光点１）はレンズ５を通って光軸に平行な光線となる。エバネッセンス光励起により発生した蛍光（右図の２）は、レンズ５を通って少し広がる光となる。 (Simultaneous observation of evanescence microscope image and confocal fluorescence image)
FIG. 5 is an enlarged view of a sample portion during operation of the evanescence microscope and the confocal microscope of the microscope system according to the present invention. The left side of the figure shows the path of illumination light, and the right side shows the path of light from the fluorescent light emission point. There is immersion oil 28 between the objective lens 5 and the cover glass 6 to form a so-called oil immersion optical system. An objective lens having an oil immersion ultra high numerical aperture (NA = 1.45 or NA = 1.65) is used. Therefore, the refractive index from the objective lens to the cover glass is constant, and light is equivalent to traveling straight through this. Light that crosses the surface of the cover glass obliquely (confocal excitation light in the left figure and fluorescence from 1 in the right figure) is refracted. In the figure, 30 is a fluorescent specimen (observation target) such as a cell, and 7 is a mask that blocks light.
In the right figure, confocal excitation fluorescence (fluorescence emission point 1) passes through a lens 5 and becomes a light beam parallel to the optical axis. Fluorescence generated by evanescence light excitation (2 in the right figure) becomes light that spreads slightly through the lens 5.

（斜入照明顕微鏡像と共焦点蛍光像の同時観察）
図６は、本発明による顕微鏡システムの斜入顕微鏡および共焦点顕微鏡動作時の試料部分の拡大図である。図左側は照明光の経路、右側は蛍光発光点からの光の経路を示している。先に説明したエバネッセンス顕微鏡および共焦点顕微鏡動作用の蛍光顕微鏡を僅かに変更することにより、斜入照明顕微鏡像と共焦点蛍光像の同時に観察することができる。
図２または図３に示すミラー３の位置を変えることにより、斜入照明用の光束を対物レンズ１５の後方焦点面に集束し、そこから光軸にわずかに傾いた角度（図６左側の図）でレンズ５の左側の縁に入射して、カバーガラスの６の表面で屈折し、光軸に斜めになる方向に投影される。光軸中心では、この光束はカバーガラス６の表面から少し離れた所を通過し、カバーガラス６には必ずしも接着しない蛍光物質（右の図の２の示す位置を占める）を励起する。共焦点光学系の照明光はレンズの中側（マスク７を除く）を通過して、蛍光物質（右の図の１の示す位置を占める）を励起する。 (Simultaneous observation of oblique illumination microscope image and confocal fluorescence image)
FIG. 6 is an enlarged view of the sample portion during operation of the oblique insertion microscope and the confocal microscope of the microscope system according to the present invention. The left side of the figure shows the path of illumination light, and the right side shows the path of light from the fluorescent light emission point. The oblique illumination microscope image and the confocal fluorescence image can be simultaneously observed by slightly changing the fluorescence microscope for operating the evanescence microscope and the confocal microscope described above.
By changing the position of the mirror 3 shown in FIG. 2 or FIG. 3, the light beam for oblique illumination is focused on the rear focal plane of the objective lens 15 and then slightly tilted toward the optical axis (see the left side of FIG. 6). ) Is incident on the left edge of the lens 5, refracted on the surface of the cover glass 6 and projected in a direction oblique to the optical axis. At the center of the optical axis, this light beam passes through a part of the surface of the cover glass 6 and excites a fluorescent material (occupying the position indicated by 2 in the right figure) that does not necessarily adhere to the cover glass 6. The illumination light of the confocal optical system passes through the inside of the lens (excluding the mask 7) and excites the fluorescent material (occupying the position indicated by 1 in the right figure).

次に図６の右側の励起された蛍光発光点１，２からの像光の経路を説明する。蛍光発光点１（共焦点像）からの蛍光はレンズ５を通過して光軸に平行な光線となる。斜入によって励起された蛍光発光点２からの光はレンズ５を通過して少し広がる光となる。なお、この斜入照明蛍光光学系の基本的な考え方については、本件発明者のひとりが特願２００３−１８７１４２号ですでに示している。 Next, the path of image light from the excited fluorescent emission points 1 and 2 on the right side of FIG. 6 will be described. Fluorescence from the fluorescence emission point 1 (confocal image) passes through the lens 5 and becomes a light beam parallel to the optical axis. The light from the fluorescence emission point 2 excited by the oblique insertion passes through the lens 5 and becomes a little light. The basic idea of this oblique illumination fluorescent optical system has already been shown in Japanese Patent Application No. 2003-187142 by one of the inventors.

本発明による蛍光顕微鏡システムは、２種類の像を同時に観察できるので、生命科学の研究分野等で広く利用できる。 Since the fluorescence microscope system according to the present invention can simultaneously observe two types of images, it can be widely used in life science research fields and the like.

本発明による蛍光顕微鏡システムのブロック図である。It is a block diagram of the fluorescence microscope system by this invention. 本発明による蛍光顕微鏡システムの実施例の略図である。1 is a schematic diagram of an embodiment of a fluorescence microscope system according to the present invention. 前記顕微鏡の実施例のエバネッセンス顕微鏡動作に関連する光束を取り出して示した略図である。4 is a schematic diagram showing a light beam extracted from an operation of an evanescence microscope according to an embodiment of the microscope. 前記顕微鏡の実施例の共焦点顕微鏡動作に関連する光束を取り出して示した略図である。FIG. 6 is a schematic view showing a light beam extracted from the confocal microscope operation of the embodiment of the microscope. FIG. 本発明による顕微鏡のエバネッセンス照明動作と共焦点照明動作を同時に行うときの試料部の拡大図である。It is an enlarged view of a sample part when performing the evanescence illumination operation and the confocal illumination operation of the microscope according to the present invention at the same time. 本発明による顕微鏡の斜入照明動作と共焦点照明動作を同時に行うときの試料部の拡大図である。It is an enlarged view of a sample part when performing oblique illumination operation and confocal illumination operation of the microscope according to the present invention at the same time.

Explanation of symbols

１，２標本（試料）内の蛍光物質の発光点
ＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラーの機能的な表現）
ＤＭＤ２（オンの状態のマイクロミラーの機能的な表現）
３ミラー
４第１レンズ（結像用）
５第２レンズ（対物レンズ）
６カバーガラス
７視野中心の光を遮るマスク
８集光レンズ
９第１結像レンズ
１０２次元光検出器（エバネッセンス）
１１ダイクロイックミラー
１２第２結像レンズ
１３２次元光検出器（共焦点）
１４視野絞り
１５光源
１６補助レンズ
１８，１９，２０フィルタ
２８浸漬油（オイル）
３０標本（試料） 1, 2 Luminescent point of fluorescent substance in specimen (sample) DMD1 (functional representation of micromirror in OFF state)
DMD2 (functional representation of the micromirror in the on state)
3 Mirror 4 1st lens (for image formation)
5 Second lens (objective lens)
6 Cover glass 7 Mask for blocking light at the center of the field of view 8 Condensing lens 9 First imaging lens 10 Two-dimensional photodetector (evanescence)
11 Dichroic mirror 12 Second imaging lens 13 Two-dimensional photodetector (confocal)
14 Field stop 15 Light source 16 Auxiliary lens 18, 19, 20 Filter 28 Immersion oil
30 specimens

Claims

A specimen containing a fluorescent substance;
A glass plate that supports the specimen;
An illumination light source for generating illumination light of the specimen;
A microscope optical system including an objective lens directed to the specimen to acquire an image by the illumination light;
An illumination optical system for performing first and second illumination on the specimen via an objective lens of the microscope optical system;
Arranged in the crossing area of the illumination light and each optical axis of the microscope optical system, the light beam can be split, and the change of the position and size ratio of the split area can be designated from the outside, and the change can be continuously performed at high speed. A light flux control device that can be modified to separate illumination light for the first and second illumination and to separate first and second image light formed by the separated illumination light;
An imaging optical system that images the first and second image lights to obtain first and second images;
Including fluorescence microscope system.

A specimen containing a fluorescent substance;
A glass plate that supports the specimen;
A microscope optical system including an objective lens that is directed to the specimen to obtain images of evanescence illumination and confocal illumination of the specimen;
An illumination light source that generates illumination light for the evanescence illumination and the confocal illumination;
Arranged in the crossing area of the illumination light and each optical axis of the microscope optical system, the light beam can be split, and the change of the position and size ratio of the split area can be designated from the outside, and the change can be continuously performed at high speed. A light flux control device that can change, separates the confocal illumination light and the evanescence illumination light, and further separates the confocal image light and the evanescence image light;
An evanescence illumination optical system that projects the evanescence illumination light separated by the light flux control device from the periphery of the objective lens of the microscope optical system toward the sample and the glass plate so that total reflection evanescence illumination light is generated;
A confocal illumination optical system that projects the confocal illumination light separated by the light flux control device toward the sample via an objective lens of the microscope optical system;
An evanescence image forming lens that forms the separated evanescence image light; and
A confocal image forming lens that forms the separated confocal image light; and
An image sensor disposed at a position of an image formed by each imaging lens;
A fluorescence microscope system composed of

The fluorescence microscope system according to claim 2,
The fluorescence microscope system in which the optical axis of the illumination light source intersects with the optical axis of the objective lens at the position of the light beam control device.

The fluorescence microscope system according to claim 3,
The imaging lens for the evanescence illumination image is a fluorescence microscope system arranged on an axis that intersects with the optical axis of the objective lens at the position of the light beam control device.

The fluorescence microscope system according to claim 3,
The imaging lens for the confocal illumination image is a fluorescence microscope system arranged on another axis that intersects at the position of the dichroic mirror and the illumination optical axis that intersects the optical axis of the objective lens and the position of the light beam control device.

A specimen containing a fluorescent substance;
A glass plate that supports the specimen;
A microscope optical system that includes an objective lens that is directed to the specimen to acquire oblique and confocal illumination images of the specimen;
An illumination light source that generates illumination light for the oblique illumination and the confocal illumination;
Arranged in the crossing area of the illumination light and each optical axis of the microscope optical system, the light beam can be split, and the change of the position and size ratio of the split area can be designated from the outside, and the change can be continuously performed at high speed. A light flux control device that can be changed, separates the confocal illumination light and the oblique illumination light, and further separates the confocal image light and the oblique illumination light;
An oblique illumination optical system that projects the oblique illumination light separated by the light flux control device from the periphery of the objective lens of the microscope optical system so that oblique illumination light is generated toward the sample and the glass plate;
A confocal illumination optical system that projects the confocal illumination light separated by the light flux control device toward the sample via an objective lens of the microscope optical system;
An oblique image forming lens for forming the separated oblique image light; and
A confocal image forming lens that forms the separated confocal image light; and
An image sensor disposed at a position of an image formed by each imaging lens;
A fluorescence microscope system composed of

The fluorescence microscope system according to claim 1, wherein the light flux control device is a DMD.