HUP0300327A2

HUP0300327A2 - Percyquinnin, eljárás előállítására és gyógyászati alkalmazása

Info

Publication number: HUP0300327A2
Application number: HU0300327A
Authority: HU
Inventors: Cordula Hopmann; Michael Kurz; Günter Müller; Luigi Toti
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh.
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-03-24
Publication date: 2003-06-28
Also published as: HUP0300327A3; AU2006203704B2; CA2405066A1; KR100791798B1; NO20024772L; AU784902B2; EP1142886A1; MXPA02007895A; DK1274698T3; CZ20023310A3; EP1274698B1; NZ521782A; ATE269855T1; RU2002129890A; CN1199959C; SI1274698T1; YU74002A; CN1418203A; HRP20020796A2; PT1274698E

Abstract

A találmány tárgyát az ST 001837 (DSM 13303) gomba tenyésztésévelelőállítható, percyquinnin nevű vegyület, valamint ennekgyógyászatilag elfogadható sói képezik. A találmány további tárgyátképezi eljárás a percyquinnin előállítására, az ST 001837 (DSM 13303)mikroorganizmus, a percyquinnin és gyógyászatilag elfogadható sóigyógyszerként, különösen lipáz inhibitorként történő alkalmazása,valamint a percyquinnint vagy annak gyógyászatilag elfogadható sójáttartalmazó gyógyászati készítmény. Ó

Description

P03 00327

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

PERCYQUINNIN, ELJÁRÁS ELŐÁLLÍTÁSÁRA, ÉS GYÓGYÁSZATI ALKALMAZÁSA

A találmány a percyquinnin nevű vegyületre, ennek előállítására szolgáló eljárásra, és ennek gyógyszerként! alkalmazására vonatkozik.

A találmány a Basidiomycetes Stereum complicatum, ST 001837 (DSM 13303) tenyésztésével előállítható percyquinnin nevű vegyületre, valamint gyógyászatilag elfogadható sóira és származékaira vonatkozik. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a percyquinnin előállítására, az ST 001837 (DSM 13303) gomba, a percyquinnin és gyógyászatilag elfogadható sói és származékai alkalmazása gyógyszerként, és különösen ezek alkalmazása lipáz inhibitorként, valamint a percyquinnint vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját vagy származékát tartalmazó gyógyászati készítmény.

A lipid metabolizmus normálisan érzékeny egyensúlyt tart fenn a szintézis és lebontás között. Ha ez az egyensúly felborul, hiperlipidémia léphet fel, ami viszont atheroszklerózist, magas vérnyomást, cukorbetegséget, stb. okozhat. A lipid metabolizmus modulátorai várhatólag a fenti betegségek kézbentartására alkalmazhatók. A lipolízis gátlása nem inzulinfüggő diabetes

97354-9449 SI

- 2 mellitus (NIDDM) esetén feltételezhetően csökkenti a hiperglikémiát. A zsírok energiaforrásként történő hasznosításának kiindulási lépése a triacilglicerin hidrolízise lipázok, például hormonérzékeny lipáz és monoacilglicerin lipáz segítségével. A triacilglicerinek hidrolízise a glicerin és a zsírsavak szintjének növekedéséhez vezet a vérben. A lipáz inhibitorok várhatólag minimális mellékhatással csökkentik mind a plazma zsírsavszintjét, mind a hiperglikémiát.

Az elhízás és a hiperkoleszterinémia bizonyos mértékben kapcsolatban van a táplálkozás során történő nagy zsírfelvétellel. A táplálkozással kapcsolatos triglicerid abszorpció kulcsenzime a hasnyálmirigy lipáz. A hasnyálmirigy lipáz gátlása ezért a zsírok abszorpciójának gátlását eredményezheti.

Azt találtuk, hogy a percyquinninnek nevezett új vegyület gátolja a lipolízist. A találmány tehát az (1) képletű percyquinnin vegyületre, valamint ennek gyógyászatilag elfogadható sóira és származékaira, így például észtereire, étereire és kézenfekvő kémiai ekvivalenseire vonatkozik, beleértve az összes sztereoizomer formát és az összes tautomer formát is.

A percyquinnin összegképlete Ci₂Hi₆O₃ (208 Da), és az alábbiakban közölt egy vagy több fizikai-kémiai és spektrális tulajdonsággal jellemezhető, például 'H-NMR spektroszkópiás adatokkal és ^!3C-NMR spektroszkópiás adatokkal, amelyeket az 1. és 2. táblázatban ismertetünk.

A percyquinnin új β-laktonnak tekinthető, amely egy hidroximetilcsoportot tartalmazó 5-tagú gyűrűvel van annelálva, és a laktongyürű α-helyzetében egy 2,3-izopentenil oldalláncot tartalmaz. A percyquinnin ezidáig még nem ismertetett, új szer- 3 kezettel rendelkezik. A Chemical Abstract-ben foglalt szakirodalom ismeretében megállapítottuk, hogy a percyquinnin új vegyület. Egyetlen más vegyület sem rendelkezik a percyquinnin szerkezeti jellemzőivel.

A percyquinnint egy mikroorganizmus tenyésztésével állíthatjuk elő, amelyet a tenyészet számával, ST 001837-tel jelölünk (továbbiakban ST 001837). A percyquinnin előállítására alkalmazott fenti gombát a Mississippi Államban fekvő Park in Pike megyében lévő Percy Quinn-ben (USA) gyűjtöttük be. Az ST 001837 gomba a Basidiomycetes species Stereum complicatum rendjébe tartozik, és 2000. február 11-én helyeztük letétbe a DSMZ-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Németország), ahol a DSM 13303 letéti számot kapta.

A találmány további tárgyát képezi egy eljárás a percyquinninnek nevezett új vegyület előállítására a Basidiomycetes species ST 001837 vagy annak mutánsai vagy variánsai aerob körülmények között, egy vagy több szénforrást és egy vagy több nitrogénforrást, és adott esetben szervetlen só tápanyagot és/vagy nyomelemet tartalmazó tápközegben történő tenyésztésével, majd a vegyület szokásos módon történő izolálásával és tisztításával.

A tápközeg előnyösen szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen só tápanyagokat tartalmaz. Szénforrásként alkalmazható például a keményítő, glükóz, szacharóz, dextrin, fruktóz, melaszok, glicerin, laktóz vagy galaktóz, előnyös a glükóz. Nitrogénforrásként alkalmazható például szójabab-liszt, földimogyoró-liszt, élesztő extraktum, marhahús extraktum, pepton, . 4 maláta extraktum, kukorica áztatólé, zselatin vagy kazaminosavak, előnyös a maláta extrakum és az élesztő extraktum. A szervetlen só tápanyagok közé tartozik például a nátrium-hidrogén-foszfát, kálium-hidrogén-foszfát, ammónium-hidrogén-foszfát, nátrium-klorid, kalcium-klorid, kalcium-karbonát, káliumnitrát, ammónium-szulfát vagy magnézium-szulfát, előnyös az ammónium-hidrogén-foszfát.

Az ST 001837 tenyésztését 20 és 35 °C közötti hőmérsékleten, 3,0 és 8,0 közötti pH-tartományban végezhetjük. Az ST 001837-et előnyösen 25 ± 1 °C-on tenyésztjük pH 3 - 5 értéken.

Az ST 001837 tenyésztését előnyösen 96 - 300 órán keresztül folytatjuk, amikoris a találmány szerinti lipáz inhibitor percyquinnint optimális hozammal kapjuk. Különösen előnyös, ha a tenyésztést fermentálással végezzük 216 - 264 órán át, merített tenyészetben, például rázatott lombikokban, vagy laboratóriumi fermentorban. A fermentáció lefolyását és a percyquinnin képződését nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) és a tenyészlé bioaktivitásának mérésével mutathatjuk ki. A kapott tenyészlében a percyquinnin a tenyészet szűrletében és a micéliumban, előnyösen a micéliumban van jelen.

A percyquinnint ismert elválasztási módszerekkel izolálhatjuk. A vegyületet kinyerhetjük a tenyészet szűrletéből vízzel nem elegyedő oldószerrel, például etil-acetáttal, diklórmetánnal, kloroformmal vagy butanollal pH 5 - 8 értéken történő extrahálással, vagy hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával, polimer gyantákat, például Diaion HP-20®-at vagy MCI® Gél CHP-20P-at (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japán), Amberlite XAD® (Rohm and Haas Industries, USA) alkalmazva,

- 5 aktívszénnel vagy ioncserélő kromatográfiával pH 5-8 értéken. Előnyös módszer az MCI® Gél CHP-20P-vel végzett kromatográfia. A hatóanyagot a micélumból is kinyerhetjük vízzel elegyedő oldószerrel, például metanollal, acetonnal, acetonitrillel, n-propanollal vagy izopropanollal, vagy vízzel nem elegyedő oldószerrel, például etil-acetáttal, diklórmetánnal, kloroformmal vagy butanollal végzett extrahálással pH 5 - 8 értéken, előnyösen metanollal végezzük az extrakciót. Az extraktumok koncentrálása és liofilizálása eredményeként kapjuk a nyers hatóanyagot.

A találmány szerinti percyquinnin inhibitor a nyersanyagból például az alábbiak szerint nyerhető ki.

Frakcionálással az alábbi módszerek alkalmazásával: normális fázisú kromatográfiával (stacioner fázisként alumínium-oxid vagy szilikagél, és eluensként petroléter, etil-acetát, metilén-klorid, aceton, kloroform, metanol vagy ezek kombinációi és aminok, például trietil-amin adalékok alkalmazásával); fordított fázisú kromatográfiával [fordított fázisú szilikagél, például dimetiloktadecilszilil-szilikagél, más néven RP-18 vagy dimetiloktilszilil-szilikagél, más néven RP-8, mint stacioner fázis, és víz, pufferek, például foszfát, acetát, citrát (pH 2-8) és szerves oldószerek, például metanol, acetonitril, aceton, tetrahidrofurán, vagy a fenti oldószerek kombinációi alkalmazásával]; gél-permeációs kromatográfiával, gyanták, például Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Svédország), TSKgel °Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japán) alkalmazásával, oldószerben, például metanolban, kloroformban, acetonban, etil-acetátban vagy ezek kombinációiban, vagy

- 6 ®

Sephadex G-10 vagy G-25 alkalmazásával vízben; vagy ellenáramú kromatográfiával, kétfázisú eluens rendszert alkalmazva, amely két vagy több oldószerből áll, amelyekre példaként említhető a víz, metanol, etanol, izopropanol, n-propanol, tetrahidrofurán, aceton, acetonitril, metilén-klorid, kloroform, etil-acetát, petroléter, benzol és toluol. A fenti módszereket ismételten, vagy különféle módszerek kombinációjaként alkalmazhatjuk. Előnyös eljárás a fordított fázisú szilikagélen (RP-18) végzett kromatográfia.

A percyquinnin vegyület gyógyászatilag elfogadható sókká és származékokká, például észterekké és éterekké, és egyéb kézenfekvő kémiai ekvivalensekké alakítható át, amelyek mind a találmány tárgykörébe tartoznak. A sókat és származékokat szakember által ismert, szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő. A sókat, például nátrium- és káliumsókat például úgy állíthatjuk elő, hogy a percyquinnint megfelelő nátrium- vagy kálium-tartalmú bázisokkal kezeljük.

Az észtereket és étereket szakirodalomból ismert eljárásokkal állíthatjuk elő [lásd például Advanced Organic Synthesis, 4. kiadás, J. March, John Wiley & Sons (1992)]. Az észtereket például karbonsavakkal, vagy például aminosavakkal, így például leucinnal, glicinnel vagy alaninnal történő reagáltatással állíthatjuk elő. Az aminosav aminocsoportjából a védőcsoportot az észterezés után eltávolíthatjuk, vagy például formilcsoporttal védhetjük. Az észterezést dehidratáló szer, például diciklohexilkarbodiimid (DCC) jelenlétében hajthatjuk végre ismert módon [Smith és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 80, 6204 (1958); Arrieta és munkatársai, Synth. Commun. 13, 471

- 7 (1983)].

A kettős kötéseket a szakirodalomból ismert eljárásokkal redukálhatjuk [lásd például Advanced Organic Syntheis, 4. kiadás, J. March, John Wiley & Sons, 771-775 (1992) vagy R. Bloch és munkatársai, J. Org. Chem. 52, 4603-4605 (1987)]. A kettős kötést hidrohalogénezhetjük is ismert módon [Η. O. House, Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjymin, Inc., New York, 446-452 (1972)]. A hidroxilezett származékokat úgy állíthatjuk elő, hogy a kettős kötéseket megfelelő reagenssel, például OsO₄-gyel reagáltatjuk ismert módon [Chem. Rév. 80, 187 (1980)].

A származékokat úgy is előállíthatjuk, hogy a kettős kötéseket oxidálással, például MCPBA-val [lásd például Advanced Organic Synthesis, 4. kiadás, J. March, John Wiley & Sons, 826 (1992) vagy A. J. Person és munkatársai, J. Org. Chem. 51, 2505-2511 (1986)] epoxidokká alakítjuk.

Származékokat állíthatunk elő az izopentenil oldallánc kettős kötésének ozonolízisével is. A feldolgozási eljárástól függően ennek eredményeként funkciós csoportként kaphatunk aldehidet (például Zn/HOAc vagy dimetilszulfid/metanol alkalmazásával) vagy karbonsavat (például H₂O₂-vel) vagy alkoholt (például LiAlH₄-gyei vagy NaBH₄-gyel) mint [W. Curruthers,, Some Modern Methods of Organic Synthesis, Cambridge University Press Chpt. 6 (1971); White, King and O'Brien,, Tetrahedron Lett. 3591 (1971); Bailey P. S., Ozonisation in Organic Chemistry 1. és 2. kötet, New York, Academic Press (1978, 1982)]. Az így kapott aldehidet foszforánokkal reagáltatva - amely a szakirodalomból Wittig-reakcióként ismert -8- .:1. ^:.r ·. · <·

4-10 szénatomos oldalláncok vezethetők be. Az újonnan bevezetett láncok például OR (R¹ jelentese H vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport), NR²R³ (R²R³ = H vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport) F, Cl, Br vagy I funkciós csoportokat tartalmazhatnak [lásd H. J. Bestmann és munkatársai, Selected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Products, Topics in Current Chemistry 109, 85 (1983)].

A percyquinnin lipáz inhibitor IC₅₀ értéke 2 μΜ (NBD-vizsgálat, lásd 6. példát).

A találmány a percyquinnin racemátjai, racém elegyei vagy tiszta enantiomer vagy diasztereomer formái, vagy ezek elegyei alkalmazására is vonatkozik.

A gyógyászatilag elfogadható sók különösen alkalmasak gyógyászati alkalmazásokra, mivel ezek vízoldhatósága nagyobb a kiindulási vegyületekhez viszonyítva. Ezeknek a sóknak gyógyászatilag elfogadható aniont vagy kationt kell tartalmazniuk. A percyquinnin megfelelő, gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói a szervetlen savakkal, például sósavval, hidrogén-bromiddal, foszforsavval, metafoszforsavval, salétromsavval vagy kénsavval alkotott sók, és a szerves savakkal, például ecetsavval, benzolszulfonsavval, benzoesavval, citromsavval, etánszulfonsavval, fumársavval, glükonsavval, glikolsavval, izetionsavval, tejsavval, laktobionsavval, maleinsavval, almasavval, metánszulfonsavval, borostyánkősavval, p-toluolszulfonsavval, borkősavval és trifluorecetsavval alkotott sók. Különösen előnyös a kloridok alkalmazása gyógyászati célokra. A megfelelő, gyógyászatilag elfogadható bázikus sók közé tartoznak az ammóniumsók, az alkálifémsók (például nátrium- és

- 9 - 4». %.’ -.· V káliumsók) és az alkáliföldfém-sók (például magnézium- és kalciumsók).

A gyógyászatilag nem elfogadható anionnal alkotott sók is a találmány tárgykörébe tartoznak, mivel ezek hasznos köztitermékként alkalmazhatók a gyógyászatilag elfogadható sók előállítására vagy tisztítására, és/vagy nem-terápiás, például in vitro alkalmazásokra használhatók.

Fiziológiásán funkcionális származék alatt a leírásban a találmány szerinti vegyület bármely fiziológiásán tolerált származékát, például észterét értjük, amely egy emlősnek, például embernek történő adagolás után közvetett vagy közvetlen módon a fenti vegyületté vagy annak aktív metabolitjává képes átalakulni.

A találmány további vonását képezi a percyquinnin prodrog formáinak alkalmazása is. Az ilyen prodrogok in vivo percyquinninné képesek átalakulni. Ezek a prodrogok vagy önmaguk is aktívak, vagy nem.

A percyquinnin különféle polimorf formákban, például amorf és kristályos polimorf formákban létezhet. A percyquinnin összes polimorf formái a találmány tárgykörébe tartoznak, és a találmány további tárgyát képezik.

A továbbiakban percyquinnin alatt értjük magát a percyquinnint, valamint annak sóit, szolvátjait és fiziológiásán funkcionális származékait, amelyeket a leírásban ismertettünk.

A percyquinnin kívánt biológiai hatás eléréséhez szükséges mennyisége különféle faktoroktól függ, például a választott specifikus vegyülettől, a kívánt alkalmazástól, az adagolás módjától és a beteg klinikai állapotától. A napi dózis általában 0,3

- 10 mg - 100 mg (tipikusan 3 mg - 50 mg)/nap/testtömeg kg, például 3 - 10 mg/kg/nap. Az intravénás dózis például 0,3 mg - 1,0 mg/kg lehet, amelyet célszerűen infúzió formájában adagolunk 10 ng - 100 ng/kg/perc dózisban. A fenti célokra alkalmazható infúziós oldatok például 0,1 ng - 10 mg, tipikusan 1 ng - 10 mg hatóanyagot tartalmazhatnak milliliterenként. Az egyszeri dózis például 1 mg - 10 g hatóanyagot tartalmazhat. Tehát az injekciós ampullák például 1 mg - 100 mg hatóanyagot tartalmazhatnak, és az egydózis készítmények, amelyeket orálisan, például tabletta vagy kapszula formájában adagolhatunk, 1,0 - 1000 mg, rendszerint 10 - 600 mg hatóanyagot tartalmazhatnak. Gyógyászatilag elfogadható sók esetében a fenti tömegadatok a sóból származó aminotiazol-ion tömegére vonatkoznak. A percyquinnin a fent említett állapotok megelőzésére vagy kezelésére önmagában is, azonban előnyösen gyógyászati készítmény formájában alkalmazható, amelyet egy kompatíbilis hordozóanyaggal állítunk elő. A hordozóanyagnak természetesen kompatibilisnek kell lennie a készítményben levő egyéb komponensekkel is, valamint nem lehet ártalmas a beteg egészségére nézve. A hordozóanyag lehet egy szilárd anyag vagy folyadék, vagy mindkettő, és előnyösen a hatóanyaggal egyszeri dózissá, például tablettává formáljuk, amely 0,05 - 95 tömeg% hatóanyagot tartalmazhat. A találmány szerinti gyógyászati készítményeket a gyógyszerészeiben szokásosan alkalmazott eljárásokkal állítjuk elő, amelyek alapvetően a komponensek gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal és/vagy segédanyagokkal történő összekeveréséből állnak.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények közé tartóz- 11 nak az orális, rektális, topikális, perorális (például szublinguális) és parenterális (például szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy intravénás) adagolásra alkalmas készítmények, noha a legalkalmasabb adagolási mód minden esetben a kezelendő állapot természetétől és súlyosságától, és az adott esetben alkalmazott percyquinnin természetétől függ. A találmány oltalmi körébe tartoznak a bevonatos készítmények és a bevonatos, lassú hatóanyagfelszabadulást biztosító készítmények is. Előnyösek a savval és a gyomornedvvel szemben ellenálló készítmények. A megfelelő, gyomornedvvel szemben ellenálló bevonatok például a cellulóz-acetát-ftalátot, polivinil-acetát-ftalátot, hidroxipropilmetilcellulóz-ftalátot és a metakrilsav és metilmetakrilát anionos polimerjeit tartalmazzák.

Az orális adagolásra alkalmas gyógyászati készítmények lehetnek például fizikailag elkülönülő egységek formájában, mint amilyenek például a kapszulák, ostyás készítmények, pasztillák vagy tabletták, amelyek mindegyike a percyquinnin meghatározott mennyiségét tartalmazza, a porok és granulátumok, és a vizes vagy nem-vizes folyadékokkal alkotott oldatok vagy szuszpenziók; vagy az olaj-a-vízben vagy víz-az-olajban típusú emulziók. Ezek a készítmények - amint már említettük - a gyógyszerészeiben szokásosan alkalmazott eljárásokkal állíthatók elő, amelyek magukban foglalják a hatóanyag és a hordozóanyag (amely egy vagy több komponensből állhat) bensőséges összekeverésének lépését. Általában a készítményeket a hatóanyag cseppfolyós és/vagy finoman diszpergált szilárd hordozóanyaggal történő egységes és homogén keverésével állítjuk elő, amely után a terméket kívánt esetben formázzuk. Tehát

- 12 pédául egy tabletta úgy állítható elő, hogy a hatóanyagot és adott esetben egy vagy több további komponenst tartalmazó port vagy granulát sajtoljuk vagy formázzuk. A sajtolt tablettákat úgy állítjuk elő, hogy a szabadon folyó formában, például por vagy granula formájában lévő vegyületet adott esetben kötőanyaggal, csúsztatóanyaggal, inert hígítóanyaggal és/vagy egy vagy több felületaktív/diszpergálószerrel összekeverve megfelelő berendezésben tablettázzuk. A formázott tablettákat úgy állítjuk elő, hogy a por formában lévő vegyületet inert, folyékony hígítóanyaggal történő nedvesítés után, megfelelő berendezésben formázzuk.

A perorális (szublinguális) adagolásra alkalmas gyógyászati készítmények közé tartoznak a szopogatós tabletták, amelyek percyquinnint tartalmaznak egy ízesítőszerrel, rendszerint szacharózzal és gumiarábikummal vagy tragantgyantával együtt, valamint a pasztillák, amelyek a vegyületet egy inert bázisban, például zselatinban vagy glicerinben, vagy szacharózban és gumiarábikumban tartalmazzák.

A parenterális adagolásra alkalmas gyógyászati készítmények közé tartoznak előnyösen a percyquinnin steril vizes készítményei, amelyek előnyösen a recipiens vérével izotóniásak. Ezeket a készítményeket előnyösen intravénásán adagoljuk, noha az adagolás törénhet szubkután, intramuszkuláris vagy intradermális injektálással is. Ezek a készítmények előnyösen úgy állíthatók elő, hogy a vegyületet vízzel összekeverjük, és a kapott oldatot sterilizáljuk, és a vérrel izotóniássá tesszük. A találmány szerinti injektálható készítmények általában 0,1-5 tömeg% hatóanyagot tartalmaznak.

- 13 A rektális adagolásra alkalmas gyógyászati készítmények előnyösen egszeri dózist tartalmazó kúpok formájában vannak. Ezeket úgy állítjuk elő, hogy a percyquinnint egy vagy több szokásos szilárd hordozóanyaggal, például kakaóvajjal összekeverjük, és a kapott elegyet formázzuk.

A bőrre történő topikális adagolásra megfelelő gyógyászati készítmények előnyösen balzsam, krém, lemosószer, kenőcs, spray, aeroszol vagy olaj formájában vannak. Hordozóanyagként alkalmazhatunk például vazelint, lanolint, poli(etilénglikol)okat, alkoholokat és két vagy több fenti anyag kombinációit. A hatóanyag általában 0,1 - 15, például 0,5 - 2 tömeg%-át teszi ki a készítménynek.

Transzdermális adagolást is végezhetünk. A transzdermális adagolásra megfelelő gyógyászati készítmények formája lehet egyszeri tapasz, amely a beteg bőrével tartósan, szoros kapcsolatban van. Az ilyen típusú tapaszok célszerűen vizes oldatban tar-talmazzák a hatóanyagot, amely adott esetben pufferolva van, és ez egy tapadóanyagban van oldva vagy diszpergálva, vagy egy polimerben van diszpergálva. A megfelelő hatóanyag-koncentráció körülbelül 1 - 35%, előnyösen körülbelül 3 - 15%. Egy különleges megoldás szerint a hatóanyag elektrotranszporttal vagy iontoforézissel tehető szabaddá [lásd például Pharmaceutical Research 2(6), 318 (1986)].

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.

1. példa

Az ST 001837 tenyészet fenntartása

a) Fenntartó közeg összetétele és előállítása

A komponenseket melegítéssel feloldjuk, majd a kapott oldatot 121 °C-on 20 percen keresztül sterilizáljuk, és Petri-csészékbe osztjuk szét (15 ml/csésze). A lemezekre megszilárdulás után ráoltjuk a kiindulási tenyészetet, és 25 °C-on addig inkubáljuk, amíg jó növekedést észlelünk. A jól növekvő tenyészetet alkalmazzuk az ezt követő konzerválás! lépésekben.

Fenntartó közeg

Maláta extraktum

Élesztő extraktum

Glükóz (NH₄)₂HPO₄

Agar-agar

2,00 1,00 1,00

0,05 2,00

b) Tartósítás -135 °C-on

1,5 ml steril, 10%-os DMSO-oldatot töltünk 2 ml-es kriofiolákba. A fenntartó agar lemezről egy 2 cm²-es agar darabot helyezünk a DMSO-oldatba, 1 °C/perc sebességgel lefagyasztjuk, és -135 °C-on tároljuk.

c) Tartósítás cseppfolyós nitrogénben

1,5 ml steril, 50%-os glicerinoldatot töltünk 2 ml-es kriofiolákba. A fenntartó agar lemezről 2 cm²-es agar darabot helyezünk a glicerines oldatba, lefagyasztjuk (1 °C/perc) -80 °Cra, majd cseppfolyós nitrogénben tároljuk.

2. példa

Az ST 001837 tenyészet fermentálása rázott lombikban

Oltott tenyészet előállítása rázott lombikban

Az oltóközeget (lásd alább) 100 ml-es adagokban 300 ml-es rázólombikokba osztjuk szét, és 121 °C-on 20 percen keresztül autoklávozzuk. A lombikok tartalmát szobahőmérsékletre hűtjük, és 6 napos agar lemez tenyészetből vett 2 cm² agar darabokkal, vagy a -135 °C-on, vagy cseppfolyós nitrogénben tárolt fiolák tartalmával inokuláljuk. Az inkubálást 25 °C-on 96 órán

keresztül végezzük mellett.

rotációs rázógépen, 140 fordulat/perc

Oltóközeg	%
Kukoricalekvár	0,50
Paradicsompép Zabliszt	4,00 1,00
Glükóz	1,00
Nyomelem-oldat pH 6,8	1,00 ml

Nyomelem-oldat	%
FeSO₄x7H₂O	0,1000
MnSO₄xlH₂O	0,1000
CuC1₂x2H₂O	0,0025
CaCl₂x2H₂O	0,0100
h₃bo₃	0,0056

- 16 (NH₄)₆Mo₇O₂₄x4H₂O 0,0019

ZnSO₄x7H₂O 0,0200

Termelési körülmények

A termelőközeget (összetételét lásd alább) 100 ml-es adagokban 300 ml-es rázólombikokba osztjuk szét, és 121 °C-on 20 percen keresztül autoklávozzuk. A lombikok tartalmát szobahőmérsékletre hűtjük, és 2 ml 4 napos oltótenyészettel leoltjuk. Az inkubálást 25 °C-on 240 órán keresztül végezzük rotációs rázón, 140 fordulat/perc mellett. A percyquinnin inhibitor termelődését a lipáz gátló bioaktivitás meghatározásával (6. példa) és HPLC analízissel határozzuk meg.

Termelőközeg %

Maláta extraktum2,00

Élesztő extraktum0,20

Glükóz1,00 (NH₄)₂HPO₄0,05

3. példa

Az ST 001837 tenyészet tenyésztése fermentorokban (12 literes)

Oltótenyészet előállítása rázólombikban

Az oltóközeget 500 ml-es adagokban 2 literes Erlenmeyer-lombikokba osztjuk szét, és 125 °C-on 30 percen keresztül autoklávozzuk. Az oltótenyészetet a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő ezekben a lombikokban.

- 17 Nagyléptékű fermentálás

Termelőközeg összetétele literes fermentorban (két fermentor) 8 liter termelőközeget 1 ml(/10 liter fermentor) Desmophen® habzásgátló szerrel együtt in situ 121 °C-on 45 percen keresztül sterilizálunk, majd a közeget 25 ± 1 °C-ra hűtjük, és leoltjuk 0,5 liter (6,25% a 12 literes fermentorra számítva) fentiekben említett oltótenyészettel.

A fermentálást az alábbi körülmények között folytatjuk le: hőmérséklet: 25 °C keverés: 300 fordulat/perc (v_tip = 1,57 m/s) levegőztetés: 0,5 vvm tenyészet összegyűjtésének ideje: 237 óra

A lipáz inhibitor percyquinnin termelődését a lipáz gátlás vizsgálatával határozzuk meg a 6. példában ismertetett módon. A tenyészlé végső pH értéke 3 - 4. A tenyészlevet összegyűjtjük és centrifugáljuk, majd a percyquinnin vegyületet a tenyészet szűrletéből és a micéliumból izoláljuk és tisztítjuk a 4. példában ismertetett módon.

4, példa

Percyquinnin izolálása és tisztítása

A 3 liter tenyészlevet összegyűjtjük, és centrifugálással elválasztjuk a micéliumot (20 g) a tenyészet szűrletétől. A micélumot 3 liter metanollal extraháljuk, és az aktív extraktumokat összegyűjtjük, és vákuumban 50 ml térfogatra koncentráljuk. Ezt a nyersterméket preparatív HPLC-vel tisztítjuk az alábbi körülmények között:

1) oszlop:	MCI® Gel CHP-20P (BioCart, 50 x 100 mm, Kronlab)
eluens:	A) H₂O B) metanol
grádiens:	perc %A____%B 0 95 5 » 5 95 5 45 0 100
átfolyás:	45 ml/perc
detektálás:	220 és 254 nm

Az aktív frakciók 17 perc elteltével eluálódnak. Az összegyűjtött frakciókat vákuumban koncentráljuk, és fagyasztva szárítjuk.

A végső tisztítást preparatív HPLC-vel végezzük az alábbi körülmények között:

1) oszlop:	Purospher Star RP-18e (5 μ, 125 x 25 mm, Merck)
eluens:	A) 0,1% TFA B) acetonitril
grádiens:	perc %A_____%B 0 95 5 5 95 5 45 0 100
átfolyás:	38 ml/perc

detektálás: 210 és 300 nm

A percyquinnint tartalmazó frakciók 21 perc elteltével eluálódnak. Az összegyűjtött frakciókat vákuumban koncentráljuk, és fagyasztva szárítjuk.

- 19 2) oszlop: Purospher Star RP-18e (5 μ, 125 x 25 mm,

Merck) eluens: A) 0,1% TFA B) acetonitril

gradiens:	perc	%A	%B
	0	80	20
	10	80	20
	10,1	75	25
	17	75	25
	17,1	70	30
	50	70	30
	55	0	100
	100	0	100
átfolyás:	5 ml/perc
detektálás:	210 nm

A percyquinnint tartalmazó frakciók 37 perc elteltével eluálódnak. Az összegyűjtött frakciókat vákuumban koncentráljuk, és fagyasztva szárítjuk. Az összhozam 20 g micéliumból 2 mg percyquinnin vegyület.

A percyquinnin fizikai-kémiai és spektrális tulajdonságait az 1. és 2. táblázatban közöljük.

- 20 1. táblázat

Megjelenés:	halványsárga olaj
Oldhatóság:	metanol, DMSO
HPLC (nagynyomású	oszlop: Purospher Star RP.18e
folyadékkromatográfia):	(Merck), 55 x 4 mm, 3 pm
	eluens: CH₃CN/0,01% H₃PO₄ (85%)
	grádiens: idő % CH^CN 0,00 5,0 3,00 95,0 5,00 95,0 6,00 5,0 10,00 5,0 átfolyás: 2 ml/perc hőmérséklet: 40 °C detektálás: 210, 254, 280, 320, 380
EI-MS (56 eV):	nm retenciós idő: 2,1 min m/z = 208 Da [M⁺]
GC-MS (diklórmetán + MSTFA, 56 eV):	m/z = 280 Da [M⁺-H+TMS]
összegképlet:	Ci₂Hi₆O₃
‘H-NMR:	lásd 2. táblázatot
¹³C-NMR:	lásd 2. táblázatot

2. táblázat

Percyquiimin *H- és ⁿC-NMR spektroszkópiás adatai (DMSO, 300 K)

	’H	¹³c
1	-	172,97
2	-	74,24
3	-	148,37
4	5,51	120,45
___________5	2,73/2,57	36,99
6	4,93	78,41
7	2,54/2,37	27,05
8	5,11	117,92
9	-	134,66
10	1,60	17,77
11	1,68	25,57
12	4,01	59,39
12-OH	4,97	-

5. példa

Lipáz előállítása és tisztítása

Adipocitákat izoláltunk 220 - 250 g-os hím Wistar patkányokból kollagenázos kezeléssel, szakirodalomból ismert módon. A 10 patkányból származó zsírsejteket háromszor mostuk, minden egyes alkalommal 50 ml homogenizáló pufferrel (25 ml Tris/HCl (pH 7,4), 0,25 M szacharóz, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 pg/ml leupeptin, 10 pg/ml antipain, 20 pg/ml pepsztatin) végzett flotálással. Ezekután 10 ml homogenizáló puffért adtunk a sejtekhez. A zsírsejteket teflon bevonatú üvegedényben (Braun-Melsungen) homogenizáltuk 1500 fordulat/perccel, 15 °C-on. A homogén terméket centrifugáltuk (Sorvall SM24 cső, 500 fordulat/perc, 10 perc, 4 °C). A felső zsírréteg és az üledék közötti fázist elválasztottuk, és újból centrifugáltuk. Az alsó fázis elválasztását megismételtük, és harmadszor is centrifugáltuk 2000 fordulat/perccel 45 percen keresztül, 4 °C-on. A kapott anyafázist hozzáadtuk 1 g Heparin Sepharose-hoz [Pharmacia-Biotech, CL-6B, háromszor mosva 25 mM Tris/HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl összetételű pufferrel]. Az elegyet 60 percen keresztül inkubáltuk 4 °C-on (15 percenként felráztuk), majd az oldatot centrifugáltuk (Sorvall SM24 cső, 3000 fordulat/perc, 10 perc, 4 °C). A felső réteget pH 5,2 értékre állítottuk ecetsavval, és 4 °C-on 30 percen keresztül inkubáltuk. A csapadékot centrifugálással izoláltuk (Sorvall SS34 cső, 12000 fordulat/perc, 10 perc, 4 °C), és 2,5 ml 20 mM Tris/HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA, 65 mM NaCl, 13% szacharóz, 1 mM DTT, 10 pg/ml leupeptin/pepsztatin/antipain összetételű pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenziót egy éjszakán keresztül 4 °C-on

- 23 dializáltuk 25 mM Tris/HCl (pH 7,4), 50% glicerin, 1 mM DTT, 10 pg/ml leupeptin, pepsztatin, antipain összetételű pufferrel szemben, és ezután hidroxiapatit oszlopon [0,1 g/1 ml szuszpenzió, 10 mM kálium-foszfát (pH 7,0), 30% glicerin, 1 mM DTT összetételű pufferrel ekvilibrálva]. Az oszlopot az ekvilibráló pufferrel négyszer mostuk (átfolyási sebesség 20 - 30 ml/óra). A lipázt 0,5 M kálium-foszfát pufferrel eluáltuk. A terméket dializáltuk, és ultraszűréssel (Amicon Diaflo PM 10) 4 °C-on 5 - 10-szeresre koncentráltuk. A félig tiszta lipázt 4-6 héten keresztül lehet tárolni -70 °C-on.

6. példa

Bioaktivitás vizsgálata

Szubsztrátként egy fluoreszcens lipid analógot, a mono-NBD-acilglicerint (NAG) alkalmaztuk, amelynek színe a foszfolipid hólyagocskákba történő integrálódás után 481 nm-ről 550 nm-re tolódik el. A tesztvegyületet DMSO-ban oldottuk, és a vizsgálati pufferrel [összetétele: 25 mM Tris/HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl] 1:5 arányban hígítottuk. 2,5 μΐ így kapott oldathoz 180 μΐ szonikált szubsztrátoldatot adtunk (20 μg/ml foszfatidilkolin, 10 μg/ml foszfatidilinozit, 50 pg/ml NAG a vizsgálati pufferben). 30 °C-on 15 percen keresztül történő előinkubálás után hozzáadtunk 20 μΐ enzimoldatot, amelyet vizsgálati pufferrel 1:2 arányban előhígítottunk, és azonnal mértük az abszorpciót 485 nm-en. Az elegyet 60 percen keresztül inkubáltuk 30 °C-on, majd újból mértük az abszorpciót. Az enzimaktivitás mértéke az abszorpció növekedése volt 480 nm-en. Az IC₅₀ értékek meghatározását a frissen oldott tesztvegyületek 10 koncentrációjával végeztük. Az adatanalízist GRAPHIT (Elsvier-Biosoft) szoftver csomaggal végeztük.

A percyquinnin lipáz gátló aktivitást mutat, amelynek IC₅₀értéke 2 μΜ.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. (1) képletü percyquinnin, és gyógyászatilag elfogadható sói és származékai, bármely sztereoizomer és tautomer formában.
2. Percyquinnin, amelynek összegképlete Ci₂H₁₆O₃, és az ST 001837 (DSM 13303) gomba aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást tartalmazó tápközegben végzett tenyésztésével, majd szokásos módon végzett izolálással és tisztítással állítható elő, valamint ennek gyógyászatilag elfogadható sói és származékai, összes sztereoizomer és tautomer formában.
3. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti percyquinnin vagy annak sója vagy származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy a basidiomycetes species ST 001837 (DSM 13303) mikroorganizmust aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást tartalmazó tápközegben tenyésztjük, majd szokásos módon izolálást és tisztítást végzünk.
4. Basidiomycetes species ST 001837 (DSM 13303).
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti percyquinnin vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója vagy származéka, gyógyszerként történő alkalmazásra.
6. Gyógyászati készítmény, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti percyquinnin vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója vagy származéka hatékony mennyiségét, és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti percyquinnin vagy annak gyógyászatilag elfogadható sója vagy származéka, lipáz inhibitorként történő alkalmazásra.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

dr. Kiss Ildikó szabadalmi ügyvivő

Aktaszámunk: 97354-9449 Sí