HUP0104327A2 - Az MP1 receptorhoz kötődő és trombopoietikus aktivitással rendelkező dimer trombopoietin peptid mimetikumok - Google Patents

Description

72.255/SZE

KÖZZÉTÉTELI

PÉLD^·

Szabadalmi Iroda

H-1062 Budapest. Andrássy út 113.

Teiefo.1: 34-24-950, Fax: 34-24.JJ3

Az MP1 receptorhoz kötődő és trombopoietikus aktivitással rendelkező dimer trombopoietin peptid mimetikumok

A jelen találmány tárgyát trombopoietikus aktivitással rendelkező vegyületek, főleg peptidek és polipeptidek képezik. A találmány szerinti vegyületek használhatók a vérlemezkék vagy vérlemezke prekurzorok (azaz például a megakariociták) termelődésének növelésére egy emlősben.

A jelen találmány tárgyát olyan vegyületek, főleg peptidek képezik, amik olyan képességgel rendelkeznek, hogy serkentik a vérlemezkék és prekurzor sejtjeik, azaz például a megakariociták in vitro és in vivő termelődését. Mielőtt megtárgyalnánk a találmány szerinti vegyületek természetét, háttérként az alábbiakat ismertetjük két, trombopoietikus aktivitással rendelkező fehérjére, a trombopoietinre, valamint a megakariocita növekedési és fejlődési faktorra (MGDF).

Az endogén trombopoietin (TPO) klónozása [Lók és mtsai:, Nature 369, 568-571 (1994); Bartley és mtsai: Cell 77, 11171124 (1994); Kuter és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 11104-11108 (1994); de Sauvage és mtsai: Nature 369, 533-538 (1994); Kato és mtsai: Journal of Biochemistry 119, 229-236 (1995); Chang és mtsai: Journal of Biological Chemistry 270, 511-514 (1995)] nagymértékben fokozta a megakariopoiézis (megakariocita termelődés) és a trombopoiézis (vérlemezke termelődés) megértését.

Az endogén humán trombopoietin egy 60-70 kDa méretű glikozilezett fehérje, ami elsődlegesen a májban és a vesében keletkezik, 332 aminosavból áll [Bartley és mtsai: Cell 77, 11171124 (1994); Chang és mtsai: Journal of Biological Chemistry 270, 511-514 (1995)]. A fehérje nagyon erősen konzerválódott a fajok között, és a humán eritropoietinnel [Gurney és mtsai: Blood 85, 981-988 (1995)]az N-terminálison (1-172-es aminosavak) 23%-os homológiát mutat [Bartley és mtsai: Cell 77, 1117-1124 (1994)]. Az endogén trombopoietinről kimutatták, hogy a trombopoiézis biológiai kulcsszabályozójának összes jellemzőjével rendelkezik. In vitro hatásai közé tartozik a megakariocita telepek indukciója mind tisztított rágcsáló hematopoietikus őssejtekből [Ziegler és mtsai: Blood 84, 4045-4052 (1994)], mind humán CD34⁺ sejtekből [Lók és mtsai:, Nature 369, 568-571 (1994); Rasko és mtsai: Stem Cells .15, 33-42 (1997)], a megnőtt ploiditású megakariociták generálása [Broudy és mtsai: Blood 85, 402-413 (1995)]. Ezzel szemben a trombopoietin receptor (cMpl) elleni szintetikus antiszérum oligonukleotidok szignifikánsan gátolják a megakariocita őssejtek telepképző tulajdonságait [Methia és mtsai: Blood 82, 1395-1401 (1993)]. Továbbá a c-MpI knockout egerek súlyosan trombocitopéniások és megakariocita deficiensek [Alexander és mtsai: Blood 87, 21622170 (1996)].

A rekombináns humán MGDF (rHuMGDF, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA) egy másik, a trombopoietinnel rokon trombopoietikus polipeptid. Előállításához olyan Escherichia coli-t használunk, ami olyan plazmiddal van transzformálva, ami a humán trombopoietin N-terminális receptorkötő doménjére kiterjedő csonkított fehérjét kódoló cDNS-t tartalmaz [Ulich és mtsai: Blood 86, 971-976 (1995)]. A polipeptidet extraháljuk, térszerkezetét újra kialakítjuk és tisztítjuk, majd az N-terminálisához kovalens kötéssel egy polietilénglikol (PEG) egységet csatolunk. A kapott molekula jelölése PEG-rHuMGDF, vagy röviden MGDF.

Számos különböző, állatmodellt használó kísérletben [Ulich, T.R. és mtsai: Blood 86, 971-976 (1995); Hokom, M.M. és mtsai: Blood 86, 4486-4492 (1992)] világosan kimutatták a trombopoietin és MGDF terápiás hatékonyságát csontvelő átültetésben és trombocitopénia kezelésébe, amely állapot gyakran beáll a kemoterápiás vagy besugárzásos terápia hatására. Az embereken kapott előzetes adatok igazolták az MGDF használhatóságát a vérlemezke-szám növelésében, különböző elrendezésben [Basser és mtsai: Lancet 348, 1279-1281 (1996); Kato és mtsai: Journal of Biochemistry 119, 229-236 (1995); Ulich és mtsai: Blood 86, 971-976 (1995)]. Az MGDF-et arra használhatjuk, hogy fokozzuk a vérlemezke-adási eljárást, mivel az MGDF beadása az egészséges vérlemezke donorokban mért eredeti értéknek körülbelül háromszorosára növeli a keringésben levő vérlemezkék számát.

A trombopoietin és az MGDF hatását a c-MpI receptorhoz kötődve fejti ki, ami főleg bizonyos hematopoietikus sejtek, azaz például a megakariociták, a vérlemezkék, a CD34⁺ sejtek és a primitív őssejtek felszínén expresszálódik [Debili, N. és mtsai: Blood 85, 391-401 (1995); de Sauvage, F.J. és mtsai: Nature 369, 533-538 (1994); Bartley és mtsai: Cell 77, 1117-1124 (1994); Lok és mtsai:, Nature 369, 568-571 (1994)]. Az interleukinok és fehérje-hormonok legtöbb receptorához hasonlóan a cMpl az I. osztályú citokin receptor szupercsaládba tartozik [Vigon, I. és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 5640-5644 (1992)]. Ennek a receptorosztálynak az aktiválása magában foglalja a ligandum-kötődéssel indukált receptor homodimerizációt [Vigon, I. és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 56405644 (1992)]. Az ilyen receptor-osztálynak az aktiválása magában foglalja a receptor homodimerizációnak a ligandum-kötéssel való indukálását, ami viszont a szignál-transzdukciós események kaszkádját indítja be.

Általánosságban, a fehérje ligandumnak a receptorával való kölcsönhatása gyakran egy viszonylag széles interface-n játszódik le. Azonban, amint azt a receptorához kötődő humán növekedési faktor esetében kimutatták, az interface-en csak pár kulcs-csoport járul hozzá a kötési energia legnagyobb részéhez [Clackson, T. és mtsai: Science 267, 383-386 (1995)]. Ez, valamint az a tény, hogy a fehéije-ligandum többi része csak azt a célt szolgálja, hogy a kötő epitopokat a helyes topológiával mutassa be, lehetővé teszi, hogy sokkal kisebb méretű aktív ligandumot találjunk.

Egy erre irányuló erőfeszítésben a fág peptid könyvtár display rendszer egy erőteljes technikának bizonyult abban, hogy nagy fehérje ligandumok kis peptid mimetikumait azonosítsák [Scott, J.K. és mtsai: Science 249, 386 (1990); Devlin, J.J. és mtsai: Science 249 404 (1990)]. Ennek a technikának a használatával olyan kis peptidmolekulákat fedeztek fel, amik a c-Mpl receptor agonistáiként hatnak [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)].

Egy ilyen vizsgálatban véletlenszerű kis peptid-szekvenciákat, amik fűziók formájában lettek bemutatva a fonalas fágok burokfehérjéinek, affinitás-eluálták a c-Mpl ellenanyag-immobilizált extracelluláris doménjével szemben, és a visszamaradt fágokat egy második affinitás-tisztítási körben dúsították. A kötési szelekciós és repropagációs eljárást többször megismételték, hogy feldúsítsák az erősebben kötők pool-ját. Ennek eredményeképpen először a c-Mpl-kötő peptideknek két családját azonosították, amiknek a szekvenciája nem áll rokonságban egymással. Ezután mutagenezis könyvtárakat hoztak létre, hogy tovább optimalizálják a legjobban kötőket, amik végülis egy nagyon aktív peptid izolálásához vezettek, aminek az IC50 értéke 2 nM volt, EC50 értéke pedig 400 nM [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)]. Ez a 14 csoportból álló peptid, jelölése TMP (azaz TPO Mimetikus Peptid) látszólag nem mutat homológiát a TPO-hoz vagy az MGDF-hez. Ennek a TMP vegyületnek a struktúrája az alábbi:

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá 1. számú szekvencia, vagy IEGPTLRQWLAARA, az egybetús aminosav rövidítések használatával.

Korábban, EPO mimetikus peptidekkel végzett hasonló vizsgálatban egy EPO mimetikus peptidet (EMP) fedeztek fel, ugyanezt a technikát használva [Wrighton, N.C. és mtsai: Science 273, 458-463 (1996)], amiről kiderítették, hogy dimerként hat az EPO receptorhoz (EPOR) való kötődésben. Az így létrejött (ligandum)a/(receptor^ komplex a röntgen-krisztallográfiai adatok szerint C2 szimmetriát mutatott [Livnah, O. és mtsai: Science 273, 464-471 (1996)]. Ennek a strukturális információnak az alapján az EMP egy kovalensen kötött dimerjét tervezték meg, amiben két EMP monomer C-terminálisát egy flexibilis karral kötik össze, és erről kiderült, hogy nagymértékben megnövelik a kötődést, valamint az in vitro/ in vivo biológiai aktivitását [Wrighton, N.C. és mtsai: Nature Biotechnology 15, 1261-1265 (1997)].

Egy hasonló C-terminális dimerizációs stratégiát használtak a TPO mimetikus pepiidre (TMP) [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)]. Kiderült, hogy a TMP-nek egy C-terminálison kötött dimere (C-C kapcsolat) megnőtt kötési affinitással rendelkezik (0,5 nM), és jelentősen megnőtt az in vitro aktivitása (EC.5o=O,1 nM) a sejtszaporodási vizsgálatokban [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)]. Ennek a TMP C-C dimernek a struktúráját az I. ábrán mutatjuk be, aminek a szekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a tandem dimereket tovább csatolhatjuk egy vagy több más egységhez, amik immunglobulin fehérjékből származnak, ezeket általánosságban az ilyen immunglobulinok Fc régiójaként említik. A kapott vegyúleteket a TMP tandem dimerek Fc fúziójaként említik.

Az alábbiakban egy rövid, háttér-információkat bemutató szekció következik, ami azoknak az ellenanyagoknak az Fc régióira vonatkozik, amik jól használhatók néhány, a jelen találmány szerinti vegyülettel kapcsolatban.

Az ellenanyagok két, funkcionálisan független részből állnak, egy variábilis doménből, ami „Fab” néven ismert, ez köti meg az antigéneket, és egy konstans doménből, ami „Fc” néven ismert, ami biztosítja a kapcsolatot az effektor funkciókhoz, azaz például a komplement fixáláshoz vagy fagocitózishoz. Egy immunglobulin Fc része hosszú ideig megmarad a plazmában, míg a Fab rövid ideig marad meg [Capon és mtsai: Nature 337, 525-531 (1989)].

Az Fc dómén felhasználásával terápiás fehérjetermékeket konstruáltak, amikkel arra tettek kísérletet, hogy hosszabb féléletidőt biztosítsanak, vagy hogy beépítsenek különböző funkciókat, azaz például az Fc receptorhoz való kötődést, a protein A kötést, a komplement fixálást és a placenta transzfert, ami az immunglobulinok Fc régiójának összes csoportját igénybe veszi [Capon és mtsai: Nature 337, 525-531 (1989)]. Például egy IgGl ellenanyag Fc régióját fúzionáltattuk a CD30-L-hez, egy olyan molekulához, ami a Hodgkin betegség tumorsejtekben, anaplasztikus limfóma sejtekben, T-sejt leukémia sejtekben és más rosszindulatú sejtekben expresszált CD30 receptorokhoz kötődik [5,480,981 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás]. Az IL-10-et, egy gyulladásellenes és kilökődést gátló ágenst fúzionáltattunk rágcsáló Fcgamma2a-val, azzal a céllal, hogy fokozzuk a citokin rövid keringési fél-életidejét [Zheng, X. és mtsai: The Journal of Immunology 154, 5590-5600 (1995)]. Voltak olyan vizsgálatok is, amikben kiértékelték a humán IgG Fc fehérjéjéhez kötődő tumor nekrózis faktor receptor felhasználását szeptikus sokkban szenvedő betegek esetében [Fisher, C. és mtsai: The New England Journal of Medicine 334, 1697-1702 (1996); Van Zee, K. és mtsai: The Journal of Immunology 156, 2221-2230 (1996)]. Az Fc-t CD4 receptorhoz is fúzionáltatták, ezzel az AIDS kezelésére használható terápiás fehérjét lehetett előállítani [Capon és mtsai: Nature 337, 525-531 (1989)]. Emellett az interleukin-2-t a IgGl vagy IgG3 Fc részéhez fúzionáltatták, hogy leküzdjék az interleukin-2 rövid fél-életidejét és szisztémás toxicitását [Harvill és mtsai: Immunotechnology 1., 95-105 (1995)].

A TPO és MGDF hozzáférhetősége ellenére megmarad az igény további vegyületek biztosítására, amik biológiai aktivitással ⁹ ·*.’· ?? ”? :

rendelkeznek a vérlemezkék termelésének serkentésében (trombopoietikus aktivitás), és/vagy a vérlemezkék prekurzor sejtjeinek, főleg a megakariociták termelésének serkentésében (megakariopoietikus aktivitás). A jelen találmány tárgyát új vegyületek képezik, amik ilyen aktivitásokkal rendelkeznek, valamint a rokon aspektusok.

A jelen találmány tárgyát egy vegyületcsoport képezi, ami képes kötődni, és egy transzmembrán szignált megindítani, például a c-Mpl receptor aktiválásán keresztül, ami ugyanaz a receptor, ami befolyásolja az endogén trombopoietin (TPO) aktivitását. Tehát a jelen találmány szerinti vegyületek trombopoietikus aktivitással rendelkeznek, azaz képesek in vivő és in vitro serkenteni a vérlemezkék termelődését és/vagy megakariocitopoietikus aktivitással, azaz képesek ín vivo és in vitro serkenteni a vérlemezke prekurzorok termelődését.

Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti vegyületek az alábbi általános struktúrával rendelkeznek:

TMPi-(Li)_n-TMP₂ amiben TMPi-et és TMP₂-t egymástól függetlenül az alábbi központi struktúrával rendelkező vegyületek csoportjából választjuk ki:

X₂-X3-X4-X₅-X6-X7-X8-X9-X10 amiben

X₂-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

Xa-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

X4 jelentése Pro;

Xs-öt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

Xó-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, He, Val, Alá és Phe;

X?-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

Χβ-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

X₉-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr és Phe;

Xio-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, He, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

Li egy, az alábbiakban ismertetett linker; és n értéke 0 vagy 1;

valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

Az egyik megvalósítási mód szerint Li jelentése (Gly)_n, amiben n értéke 1-20, és ha n értéke 1-nél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a fele helyettesíthető egy másik aminosawal, amit a többi természetes aminosav, vagy azok sztereoizomerei közül választjuk ki.

Az előzőkben a TMPi-re és TMP2-re megadott X2-X10 központi struktúrája mellett más rokon struktúrák is lehetnek, aholis az alábbiak közül egyet vagy többet hozzáadunk a TMPi és/vagy a TMP2 központi struktúrájához: Xi kapcsolódik az Nterminálishoz és/vagy az Xu-et, Xi2-t, Xi3-at és/vagy az Xi4-et a C-terminálishoz kapcsoljuk, aholis Xi, X12, X13 és X14 jelentése az alábbi:

Xi-et az alábbi csoportból választjuk ki: He, Alá, Val, Leu, Ser és Arg;

Χιι-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, He, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His és Glu;

Xi2-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, He, Val, Leu, Phe, Gly, Ser és Gin;

Xu-at az alábbi csoportból választjuk ki: Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Gly; és

Xi4-et az alábbi csoportból választjuk ki: Ala, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly.

Egy második előnyben részesített megvalósítási mód szerint a találmány szerint vegyület általános képlete az alábbi:

(Fc)_m-(L₂)_q-TMPi-( L₂)n-TMP₂-(L3)r-(Fc)p amiben TMPi, TMP₂ és n jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk, Li, L₂, és L3 jelentése linkercsoport, amiket egymástól függetlenül az itt ismertetett linkercsoportok közül választunk ki, az Fc egy immunglobulin Fc régiója (amint az alábbiakban definiáljuk); m, p, q és r értéke egymástól függetlenül 0 és 1, és m vagy p közül legalább az egyik 1, továbbá ha m egyenlő O-val, akkor q értéke is 0, és ha p értéke 0, akkor r értéke 0, valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói. Az egyik megvalósítási mód szerint Li, L₂ és L3 egymástól függetlenül tartalmazzák a (Gly)n-t, amiben n értéke 1-20, és ha n értéke egynél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak több mint a felét egy másik aminocsoporttal lehet helyettesíteni, amit a többi 19 természetes aminosavból, vagy azok sztereoizomerjeiből választhatjuk ki.

A fenti vegyületek (amiket az alábbiakban ismertetünk) szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A jelen találmány szerinti peptidek előnyösen peptidek, amiket standard szintetikus módszerekkel, valamint bármely más peptid-előállítási módszerrel előállíthatunk. A jelen találmány szerinti vegyületeket, amik nem-peptid részeket jelentenek, standard szerves kémiai reakciókkal állíthatjuk elő, a standard peptidkémiai reakciók mellett, ha ez a megközelítés alkalmazható.

A jelen találmány szerinti vegyületek használhatók terápiás vagy profilaktikus célokra, ha megfelelő gyógyászati hordozókkal szereljük ki őket, és hatékony mennyiséget adunk be egy alanynak, azaz például embernek (vagy más emlősnek).

A jelen találmány számos más aspektusa és előnyei nyilvánvalóak lesznek az alábbi részletes leírás alapján, az alábbi rajzok alapján:

Az 1. ábrán a példaként a humán IgGl megadott Fc polinukleotid és fehérjeszekvenciákat adjuk meg (a 3. számú szekvencia a kódoló szál, 5'-3'; a 4. számú szekvencia a komplementer szál, leolvasása 3'-5'; és az 5. számú szekvencia a kódolt aminosav szekvencia), ami a jelen találmány szerinti vegyületek Fc fúzióiban használható.

A 2. ábrán a pegilezett 19-es peptid (17. számú szekvencia) előállításának szintetikus sémája látható.

A 3. ábrán a pegilezett 20-as peptid (18. számú szekvencia) előállításának szintetikus sémája látható.

A 4. ábrán különböző vegyületekkel kezelt 100 pg/kg bólus injekcióval kezelt normális nőstény BDF1 egerekben in vivő generált vérlemezkék számát láthatjuk, a kezelést az alábbiak szerint hajtjuk végre: a PEG-MDF jelentése 20 kDa átlagos molekulasúlyú PEG, a humán természetes TPO 1-163-as aminosavai reduktív aminálásával az N-terminális aminocsoporthoz kötve, amely TPO Escherichia coli-ban expresszálódik (úgy, hogy nincs glikozilezve) (lásd a WO 95/26746 számú szabadalmi bejelentést, címe: „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation”); a TMP jelentése az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott vegyület; a TMP-TMP jelentése a 21. számú szekvenciavázlaton bemutatott fehérje; a PEG-TMP-TMP kifejezés a 18. számú szekvenciavázlaton bemutatott vegyületet jelenti, aholis a PEG csoport egy 5 kDa átlagos molekulasúlyú PEG, a 3. ábrán bemutatott módon kapcsolva; a TMP-TMP-Fc-t az alábbiakban definiáljuk, és az Fc-TMP-TMP jelentése ugyanaz mint a TMP-TMP-Fc-nek, azzal az eltéréssel, hogy az Fc csoport a TMP-TMP peptidnek az N-terminálisához kapcsolódik, és nem a C-terminálisához.

Az 5. ábrán normális BDF1 egerekben in vivo generált vérlemezkék száma látható, amely egereket különböző vegyületekkel kezeltünk, a vegyületeket beültetett ozmotikus pumpákkal adva be hétnapos periódus alatt. A vegyületeket ugyanúgy határozzuk meg, mint a 4. ábra esetében.

A 6A., 6B. és 6C ábrán a jelen találmány szerint előnyben részesített vegyületek sematikus ábráit mutatjuk be. A 6A. ábrán egy Fc fúziós vegyület látható, amiben az Fc egység a TMP dimer N-terminálisához van fúzionáltatva, és az Fc rész egy monomer (egyláncú) forma. A 6B. ábrán egy Fc vegyületet mutatunk be, amiben az Fc vegyület a TMP dimer N-terminálisához van fúzionáltatva, amiben az Fc rész dimer, és egy Fc monomer kapcsolódik egy TMP dimerhez. A 6C. ábrán egy Fc fúziós vegyület látható, amiben az Fc egység a TMP dimer N-terminálisához van fúzionáltatva, és az Fc rész dimer, és mindegyik Fc monomer egy TMP dimerhez van kapcsolva.

Abbéli erőfeszítésünkben, hogy lead vegyületként kis struktúrákat keressünk jobb tulajdonságokkal rendelkező terápiás ágensek kifejlesztése során, a TMP dimer eltérő típusát és a rokon struktúrákat egy második TMP peptid N-terminálisához kapcsoljuk, vagy közvetlenül, vagy egy linkeren keresztül, és vizsgáljuk ennek a dimerizációs stratégiának a hatását a kapott dimer molekulák biológiai aktivitására. Néhány esetben ezeket az úgynevezett tandem dimereket (C-N kapcsolat) úgy terveztük meg, hogy a két monomer között linkerek legyenek, a linkerek előnyösen természetes aminosavakból állnak, ennek következtében a szintézisüket a rekombináns technológiákkal hozzáférhetővé tesszük.

A jelen találmány egy olyan vegyületcsoporton alapul, ami trombopoietikus aktivitással rendelkezik, és amiről azt gondoljuk, hogy aktivitását az endogén TPO receptorhoz, a c-Mplhez kapcsolódva fejti ki.

Vegyületek és származékok

Az első előnyben részesített megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti vegyületek az alábbi általános struktúrával rendelkeznek:

TMPi-(Li)_n-TMP₂ amiben TMPi-et és TMP₂-t egymástól függetlenül az alábbi központi struktúrával rendelkező vegyületek csoportjából választjuk ki:

X₂-X₃-X4-X5-X6-X7-X₈-X9-Xio amiben

X₂-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

X₃-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

X4 jelentése Pro;

Xs-öt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

Xö-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Ue, Val, Alá és Phe;

Χγ-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

Χβ-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

Xg-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr és Phe;

Χίο-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, He, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

Li egy, az alábbiakban ismertetett linker; és n értéke 0 vagy 1;

valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

Az egyik megvalósítási mód szerint Li jelentése (Gly)_n, amiben n értéke 1-20, és ha n értéke 1-nél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a fele helyettesíthető egy másik amino savval, amit a többi természetes aminosav, vagy azok sztereoizomerei közül választjuk ki.

Az előzőkben a TMPi-re és TMPa-re megadott X2-X10 központi struktúrája mellett más rokon struktúrák is lehetnek, aholis az alábbiak közül egyet vagy többet hozzáadunk a TMPi és/vagy a TMP2 központi struktúrájához: Xi kapcsolódik az Nterminálishoz és/vagy az Xu-et, Xi2-t, Xu-at és/vagy az Xi4-et a C-terminálishoz kapcsoljuk, aholis Xi, X12, X13 és X14 jelentése az alábbi:

Xi-et az alábbi csoportból választjuk ki: He, Alá, Val, Leu, Ser és Arg;

Xu-et az alábbi csoportból választjuk ki: Ala, He, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His és Glu;

Xi2-t az alábbi csoportból választjuk ki: Ala, He, Val, Leu, Phe, Gly, Ser és Gin;

Xi3-at az alábbi csoportból választjuk ki: Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Gly; és

Xi4-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly.

A „TMP” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan egység, ami például 9 alegységet (X2-X10) tartalmaz, aholis X2-X10 a központi struktúra. Az X2-X14 alegységek előnyösen aminosavak, amiket egymástól függetlenül választhatunk ki a 20 természetes aminosav közül, azonban a találmány olyan vegyületekre vonatkozik, amikben X2-Xi4-et egymástól függetlenül atipikus, nem-természetes,a szakterületen jól ismert aminosavak közül választjuk ki. A specifikus, előnyben részesített aminosavakat minden egyes pozícióban azonosítjuk. Az X2 lehet például Glu, Asp, Lys vagy Val. Az aminosavaknál a továbbiakban mind a hárombetűs, mind az egybetús rövidítéseket használjuk; a rövidítések minden esetben a 20 természetes aminosavra használt standard rövidítések, vagy azok jól ismert variációi. Ezek az aminosavak lehetnek L vagy D optikai konfigurációjűak (a Gly kivételével, ami sem L sem D konfigurációval nem rendelkezik), és a TMP-k tartalmazhatják az optikai konfigurációk kombinációit. Azonban a TMP láncban mindegyik aminosav esetében az L optikai konfigurációt részesítjük előnyben. A találmány tárgyát képezik továbbá a reverz TMP molekulák, amikben az aminosavaknak az N-terminálistól a C-terminálisig terjedő szekvenciája meg van fordítva. Például egy X1-X2-X3 normális szekvenciával rendelkező molekula reverze az X3-X2-X1. A találmány tárgyát képezik továbbá a retro-reverz TMP molekulák, amikben, a reverz TMP-hez hasonló módon, az aminosavaknak az N-terminálistól a C-terminálisig terjedő szekvenciája meg van fordítva, és a normálisan „L” enantiomerek a „D” sztereoizomer formájára vannak változtatva.

Emellett a találmány tárgyát képezik továbbá a TMP-k fiziológiásán elfogadható sói is. A „fiziológiásán elfogadható sók” szakkifejezés bármilyen sót jelent, ami ismert, vagy a későbbiekben derítik ki róla, hogy gyógyászatilag elfogadható. Néhány specifikus, előnyben részesített példa a következő: acetát, trifluoracetát, hidroklorid, hidrobromid, szulfát, citrát, tartarát, glikolát, oxalát.

Azt is megfontoltuk, hogy a TMP-1 „származékai” lehetnek az előzőkben ismertetett TMP-k helyettesített formái. A TMP-k ilyen származékok közé tartoznak azok az egységek, amikben az alábbi módosítások közül egyet vagy többet végrehajtunk:

a peptidil (-CO(O)NR-] kapcsolatok (kötések) közül egyet vagy többet egy nem-peptidil kötéssel helyettesítünk, azaz például egy -CH^-karbamát kötéssel [-CH2-OC(O)NR-]; egy foszfonát kötéssel; egy -CHa-szulfonamid [-CH2-S(O)2NR-] kötéssel; egy karbamid (-NHC(O)NH-] kötéssel; egy -CH2- szekunder amin kötéssel; vagy egy alkilezett peptid kötéssel (-C(O)NR⁶, amiben R⁶ jelentése alkilcsoport];

a peptidekben az N-terminálisból egy -NRR¹ csoporttal; egy -NRC(O)R csoporttal; egy -NRC(O)OR csoporttal; egy NRS(Ü2)R csoporttal; egy NHC(O)NHR csoporttal készítünk származékot, amikben R¹ jelentése hidrogénatom vagy alacsony szénatomszámú alkilcsoport, azzal a feltétellel, hogy R és R¹ egyszerre nem lehet hidrogénatom; egy szukcinimid csoport; egy benziloxikarbonil-NH-(CBZ-NH-) csoport; vagy egy benziloxikarbonil-NH-csoport, ami a fenilgyúrún 1-3 helyettesítést tartalmaz, amely helyettesítőket az alábbi csoportból választjuk ki: alacsony szénatomszám alkilcsoport, alacsony szénatomszámú alkoxi csoport, klóratom és brómatom; és azok a peptidek, amikben a szabad C-terminálisból a C(O)R²-vel készítünk származékot, amiben R²-t az alábbi cső portból választjuk ki: alacsony szénatomszámú alkoxi csoport és -NR³R⁴, amiben R³ és R⁴ egymástól függetlenül lehet hidrogénatom és alacsony szénatomszámú alkilcsoport. Az „alacsony” alatt olyan csoportot értünk, ami 1-6 szénatomot tartalmaz.

Emellett a TMP molekulába az egyes aminosavak módosítását vihetjük be, oly módon, hogy a peptid megcélzott aminosav csoportjait reagáltatjuk egy szerves származékképzö reagenssel, ami képes reakcióba lépni a kiválasztott aminosav oldallánccal vagy ternibális csoporttal. Az alábbiakban példákat adunk meg:

A lizinil és amino terminális csoportokat reagáltathatjuk szukcinanhidriddel vagy más karbonsavanhidriddel. Az ezekkel a reagensekkel végzett származékképzésnek az a hatása, hogy megfordítja a lizinil-csoportok töltését. Az alfa-aminocsoportot tartalmazó csoportokból származék készítésére alkalmas reagensek közé tartoznak az imidoészterek, azaz például a metilpikolinimidát; a piridoxál foszfát; a piridoxál; a klórborohidrid; a trinitrobenzolszulfonsav; az O-metilizokarbamid; a 2,4pentándion; és a transzaminázzal katalizált reakció glioxaláttal.

Az arginil-csoportok egy vagy több hagyományos reagenssel való reakcióval módosíthatók, azaz például fenilglioxállal, 2,3butándionnal, 1,2-ciklohexándionnal és ninhidrinnel. Az argininszármazék készítéséhez arra van szükség, hogy a reakciót lúgos körülmények között hajtsuk végre, mivel a guanidin funkciós csoportnak magas a pKa értéke. Emellett ezek a reagensek reagálhatnak a lizin csoportjaival, valamint az arginin guanidincsoportjaival is.

A tirozil-csoportok specifikus módosítását önmagában is alaposan tanulmányozták, és különösen alaposan vizsgálták spektrális jelölések bejuttatását a tirozil-csoportokba, aromás diazónium vegyületekkel vagy tetranitrometánnal végzett reakcióban. Az a legáltalánosabb, ha N-acetilimidazolt és tetranitrometánt használunk O-acetil tirozil-csoportok és 3-nitro származékok előállítására.

A karboxil oldalláncokat (aszpartil vagy glutamil csoportokat) szelektíven módosíthatjuk, karbodiimidekkel (R'-N=C=N-R', azaz például l-ciklohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)-karbodiimiddel vagy l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) karbodiimiddel reagáltatva. Emellett az aszpartil- és glutamil-csoportokat ammóniumionokkal aszparaginil- és glutaminil-csoportokká alakíthatjuk át.

A glutaminil- és aszparaginil-csoportokat gyakran dezaminálják a megfelelő glutamil- és aszpartil csoportokká. Egy másik változat szerint ezeket a csoportokat enyhén savas körülmények között dezamidálhatjuk. Ezeknek a csoportoknak akármelyik formája a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

A bifunkciós ágensekkel kapott származékok jól használhatók a peptidek vagy funkcionális származékaik egy vízben oldhatatlan hordozóhoz vagy más makromolekuláris hordozóhoz keresztkötésekkel való hozzákötéséhez. Az általánosan használt keresztkötéses ágensek közé tartozik például az 1, l-bisz(diazoacetil)-2-feniletán, a glutáraldehid, az N-hidroxiszukcinimid észterek, például a 4-azido szalicilsav észterei, a homobifunkcionális imidoészterek, beleértve a diszukcinimidil észtereket, azaz például a 3,3'-ditiobisz (szukcinimidilpropionát), és a bifunkciós maleimidek, azaz például a bisz-N-maleimido1,8-oktán. A származékképzö ágensek, azaz például a metil-3[(p-azidofenil) ditio]propioimidát fénnyel aktiválható intermediereket eredményeznek, amik fény jelenlétében képesek keresztkötéseket létrehozni. Egy másik változat szerint a fehérje immobilizálására reaktív vízben oldhatatlan mátrixokat, azaz például brómciánnal aktivált szénhidrátokat használhatunk, és a reakcióképes szubsztrátokat a 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 és 4,330,440 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban írták le.

Más lehetséges módosítás lehet a prolin és a lizin hidroxilezése, a szeril- vagy treonil-csoportok foszforilezése, a kénatomok oxidálása a Cys aminosavban, a lizin, arginin és hisztidin oldalláncok alfa-amino csoportjainak metilezése [Creighton, T.E.: „Proteind: Structure and Molecule Properties”, 79-86. oldal. W.H. Freeman & Co., San Francisco (1983)], az N-terminális amin acetilezése, és néhány esetben a C-terminális karboxicsoportok amidálása.

Ezeknek az egységeknek a származékai előnyösen javítják a találmány szerint vegyületek egy vagy több jellemzőjét, beleértve a trombopoietikus aktivitást, az oldhatóságot, az abszorpciót, a biológiai fél-életidőt és a hasonlókat. Egy másik változat szerint az egységek származékai olyan vegyületek, amik ugyanazokkal, vagy lényegében ugyanazokkal a jellemzőkkel és/vagy tulajdonságokkal rendelkeznek, mint azok a vegyületek, amikből nem készült származék. Az egységek egy másik változat szerint eliminálják vagy legyengítik a vegyületek bármelyik nemkívánatos tulajdonságát és a hasonlókat.

Az előzőkben megadott központi struktúrák, azaz az X2-X10 mellett más struktúrákat is megfontolunk, amikben egy vagy több további X csoport kapcsolódik a központi struktúrához. így az Xi, és/vagy az Xu, X12, X13 és az Xi4 kapcsolható a központi struktúrához. Példaként néhány további struktúrát adunk meg:

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11;

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12;

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13;

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11;

Xi- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12;

Xi- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13;

Xi- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

amikben X1-X14 jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk. Mindegyik TMPi-nek és TMP2-nek lehet azonos vagy eltérő a szekvenciája és/vagy hossza. Néhány előnyben részesített megvalósítási mód szerint a TMPi és a TMP2 azonos.

Egy különösen előnyben részesített TMP a következő:

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá (1. számú szekvencia)

A továbbiakban a „tartalmaz” szakkifejezés jelentése többek között az, hogy egy vegyület további aminosavakat tartalmazhat, egy adott szekvencia mindkét, vagy C-terminálisán. Azonban ameddig például az X2-X10, X1-X14 struktúra, vagy egy másik, példaként megadott struktúra jelen van, a kémiai struktúra többi része kevésbé fontos. Természetesen a központi X2-X10 struktúrán, vagy az X1-X14 struktúrán kívül bármilyen struktúra nem zavarhatja jelentősen a vegyület trombopoietikus aktivitását. Például egy N-terminális Met csoportról is azt gondoljuk, hogy a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. Emellett, bár számos találmány szerinti vegyület tandem dimer, amennyiben két TMP egységet tartalmaznak, a jelen találmány szerinti más vegyületek a TMP-k tandem multimerjei, azaz az alábbi, példaként megadott struktúrával rendelkeznek:

TMP1-L-TMP2-L-TMP3;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4; TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-TMP5;

aholis TMPi, TMP2, TMP3, TMP4 és TMP5 jelentése lehet ugyanaz, vagy más struktúra, és amiben mindegyik TMP és L jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben definiáltunk, és mindegyik linker opcionális. A jelen találmány szerinti vegyületek előnyösen 2-5 TMP egységet tartalmaznak, különösen előnyösen 2-3 egységet, és legelőnyösebben 2 egységet. A jelen találmány ezen megvalósítási módja szerint előnyösen összesen körülbelül hatvannál kevesebb, még előnyösebben negyvennél kevesebb aminosavat tartalmaznak (azaz peptidek).

Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány első megvalósítási módja szerinti vegyületek előnyösen TMP dimerek, amik vagy közvetlenül kapcsolódnak egymáshoz, vagy egy linker csoporton keresztül. A monomer TMP egységeket a hagyományos orientációban mutatjuk be, balról jobbra, az N-terminálistól a C-terminális felé olvasva. Ennek megfelelően látható, hogy mindegyik találmány szerinti vegyületnek olyan az orientációja, hogy a TMPi C-terminálisa vagy közvetlenül, vagy egy linkeren keresztül a TMP2 N-terminálisához kapcsolódik. Ezt az orientációt nevezzük tandem orientációnak, és a találmány szerinti vegyületeket általában „tandem dimerekként” említjük. Ezeket a vegyületeket dimerekként említjük, akkor is, ha a TMPi és a TMP2 szerkezete eltérő. Azaz mind homodimerekre, mind heterodimerekre gondolunk.

A „linker” csoport („Li”) opcionális. Ha jelen van, akkor nem kritikus, hogy mi a kémiai struktúrája, mivel főleg térkitöltőként szolgál. A linkért úgy kell kiválasztani, hogy ne zavarja a végső vegyület biológiai aktivitását, és figyelembe kell venni, hogy ne növelje meg szignifikánsan a végső vegyület immunogenicitását. A linker előnyösen peptidkötésekkel összekötött aminosavakból áll. Tehát az előnyben részesített megvalósítási módok szerint a linker Y_n-t tartalmaz, aholis Y jelentése egy természetes amino sav, vagy annak sztereoizomerje, és „n” jelentése 1 és 20 között bármilyen szám. Tehát a linker 1-20 aminosavból áll, amiket peptidkötések tartanak össze, és az aminosavakat a 20 természetes aminosav közül választhatjuk ki. Egy ennél is jobban előnyben részesített megvalósítási mód szerint az 1-20 aminosavat az alábbi csoportból választjuk ki: Gly, Alá, Pro, Asn, Gin, Cys, Lys. Még ennél is előnyösebb, ha a linkerben az aminosavak többsége szférikusán nem gátolt, azaz Gly, Gly-Gly-[(Gly)2], Gly-Gly-Gly[(Gly)3]... (Glyjao, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, stb. A linkerekre más specifikus példák az alábbiak:

(Gly)3Lys(Gly)4 (6. számú szekvencia);

(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (7. számú szekvencia);

(ez a struktúra egy glikozilezési helyet biztosít, ha rekombináns DNS technológiával állítjuk elő olyan emlős sejtrendszerben, ami képes glikozilezni az ilyen helyeket);

(Gly)3Cys(Gly)4 (8. számú szekvencia); és GlyProAsnGly (9. számú szekvencia).

A fenti nevezéktan magyarázatához annyit, hogy a (Gly)3Lys(Gly)4 jelentése Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. A Gly és az Alá kombinációit is előnyben részesítjük.

Nem-peptides linkerek is lehetségesek. Ilyenek például az alkil-linkerek, úgymint a -HN-(CH2)_S-CO-, ahol s értéke 2 és 20 között lehet. Ezek az alkil linkerek tovább helyettesíthetők szférikusán nem gátolt csoporttal, azaz például alacsony szénatomszámú alkilcsoporttal (például Ci-Ce), alacsony szénatom számú acilcsoporttal, halogénnel (például Cl, Br), CN csoporttal, NH₂ csoporttal, fenilcsoporttal, stb.

A nem-peptid linker egy másik típusa egy polietilénglikol csoport, azaz például

-HN-CH₂-CH2-(O-CH2-CH₂)n-CH2-COahol n értéke akkora, hogy a linker teljes molekulasúlya körülbelül 101 és 5000 között legyen, előnyösen 101 és 500 között.

Általánosságban felfedezték, hogy egy körülbelül 0-14 alegységet (azaz aminosavat) tartalmazó linker az előnyös a jelen találmány első megvalósítási módja szerinti trombopoietikus vegyületekhez.

A peptid linkerek megváltoztathatók, ugyanolyan származékok készítésével mint amit az előzőkben a TMP-kre leírtunk.

Az ebbe az első csoportba tartozó vegyületek lehetnek továbbá lineárisak vagy ciklikusak. A „ciklikus” szakkifejezés azt jelenti, hogy a molekulának legalább két külön, azaz nem folyamatos részét egymáshoz kötjük. Például a molekula N-terminális és C-terminális végét kovalens kötéssel egymáshoz kapcsolhatjuk, ciklikus molekula előállításával. Egy másik változat szerint a molekula tartalmazhat két vagy több Cys csoportot (azaz például a linkerben), ami diszulfid-híd képződése közben ciklizálódik. Továbbá azt is megfontoljuk, hogy egynél több tandem peptid dimer kapcsolódhat össze, ezzel a dimerek dimerjét képezve. így például egy Cys csoportot tartalmazó tandem dimer intermolekuláris diszulfid-hidat képezhet egy másik ilyen dimer Cys csoportjával. Lásd például az alábbiakban a 20. számú szekvenciát.

A jelen találmány szerinti vegyületek kovalens kötéssel vagy nem kovalens kötéssel asszociálódhatnak egy hordozó molekulához, azaz például egy lineáris polimerhez (például polietilénglikol, polilizin, dextrán, stb.), egy elágazó láncú polimerhez [lásd például a 4,289,872 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, benyújtó Denkenwalter és munkatársai, kibocsátva 1981. szeptember 15-én; az 5,229,490 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtó Tam, kibocsátva 1993. július 20-án; a WO 93/21259 számú szabadalmi leírás, benyújtó Frechet és munkatársai, kibocsátva 1993. október 28-ánJ; egy lipidhez; egy koleszterin csoporthoz (azaz például szteroidhoz); vagy egy szénhidráthoz vagy oligoszacharidhoz. Más lehetséges hordozó lehet egy vagy több vízoldható polimer, azaz például a polioxietilénglikol vagy a polipropilénglikol amint azt a 4,640,835, 4,496,689, 4,301133, 4,670,417, 4,791,192 és 4,179,337 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban említik. A szakterületen ismert más használható polimerek közé tartozik például a monometoxi-polietilénglikol, a dextrán, a cellulóz, vagy más szénhidrát alapú polimerek, a poli(N-vinil-pirrolidon)-polietilénglikol, a propilénglikol homopolimerek, a polipropilénoxid/etilénoxid kopolimer, a polioxietilezett poliolok (mint például a glicerin) és a polivinil-alkohol, valamint ezeknek a polimereknek az elegye.

Egy előnyben részesített ilyen hordozó a polietilénglikol (PEG). A PEG csoport molekulasúlya megfelelő érték lehet, és lehet egyenes- vagy elágazó szénláncú. A PEG átlagos molekulasúlya előnyösen 2 kDa és 100 kDa között lehet, még előnyösebben körülbelül 5 kDa és körülbelül 50 kDa között, legelőnyösebben körülbelül 5 kDa és körülbelül 10 kDa között.

A PEG csoportok általában acilezéssel, reduktív alkilezéssel, Michael addícióval, tiol-alkilezéssel vagy más kemoszelektív konjugációs/ligációs módszerrel kapcsolhatók a találmány szerinti vegyületekhez, a PEG csoporton levő reakcióképes csoporton (azaz például egy aldehiden, amino-, észter-, tiol-, alfa-haloacetil-, maleimido- vagy hidrazin-csoporton) keresztül a megcélzott vegyület egy reakcióképes csoportjához (azaz például egy aldehid-, amino-, észter-, tiol-, alfa-haloacetil-, maleimido- vagy hidrazin) csoporthoz.

A szénhidrát (oligoszacharid) csoportok egyszerűen kapcsolhatók azokhoz a helyekhez, amikről ismert, hogy a fehérjékben glikozilezési helyek. Általában az O-kapcsolt oligoszacharidok a szerin (Ser) vagy treonin (Thr) csoporthoz kapcsolódnak, míg az N-kapcsolt oligoszacharidok az aszparagin (Asn) csoportokhoz kapcsolódnak, amennyiben azok az Asn-XSer/Thr szekvencia részét képezik, ahol X jelentése bármilyen aminosav lehet, a prolin kivételével. X jelentése előnyösen a 19 természetes aminosav bármelyike lehet, a prolin kivételével. Az N-kapcsolt és O-kapcsolt oligoszacharidok struktúrád, és az egyes típusokban talált cukormaradékok eltérőek. A cukrok egyik ti pusa, ami mindkettőn megtalálható, az N-acetilneuraminsav (másnéven sziálsav). A sziálsav általában mind az N-kapcsolt, mind az O-kapcsolt oligoszacharid végcsoportja, és negatív töltése miatt savas tulajdonságot ad a glikozilezett vegyületnek. Az ilyen helyeket beépíthetjük a jelen találmány szerinti vegyületek linkerébe, és a polipeptid vegyület rekombináns módszerrel való előállítása során egy sejt (azaz például emlős sejt, mint például a CHO, a BHK, a COS) képes glikozilezni. Azonban ezek a helyek tovább glikozilezhetők a szakterületen ismert szintetikus vagy félszintetikus eljárásokkal.

A jelen találmányban példaként megadott peptidek közül néhányat az alábbiakban sorolunk fel. Egybetüs aminosav rövidítéseket használunk, és a linkereket az egyszerűség kedvéért vonalakkal elválasztva mutatjuk be. További rövidítések: BrAc jelentése brómacetil (BrCHíCfO)), míg a PEG jelentése polietilénglikol. IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (10. számú szekvencia) IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (ciklikus) i I i I (11. számú szekvencia)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineáris) (12. számú szekvencia)

IEGPTLRQALAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQALAARA (13. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (14. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGK(BrAc)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (15. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (16. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGK(PEG)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (17. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGC(PEG)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (18. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGNGSGGG- IEGPTLRQWLAARA (19. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (20. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (21. számú szekvencia)

Mindegyik előzőkben említett vegyúletben egy N-terminális Met-et (vagy M-et, az egybetüs kód szerint) is megfontoltunk. A fenti vegyületek multimerjeit (azaz tandem és nem-tandem, kovalens kötéssel vagy nem kovalens kötéssel összekapcsolva) is megfontoltuk.

A jelen találmány egy második megvalósítási módja szerint az előzőkben ismertetett vegyületeket egy vagy több Fc csoporttal fúzionáltathatjuk, akár közvetlenül, akár linker csoportokon keresztül. Ennek a második csoportnak a képlete általánosságban az alábbi:

(Fc)_m-(L₂)_q-TMPi-(L₂)n-TMP₂-(L3)r-(Fc)p aholis TMPi, TMP2 és n jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk; Li; La és L3 jelentése linkercsoport, amiket egymástól függetlenül választhatunk az előzőkben ismertet linker csoportokból; az Fc jelentése egy immunglobulin Fc csoportja; m, p, q és r értéke egymástól függetlenül lehet 0 és 1, azzal a feltétellel, hogy m és p közül legalább egynek az értéke 1, emellett, ha m értéke 0 akkor q értéke is 0, és ha p értéke 0, akkor r értéke is 0; valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

Ennek megfelelően, az ebbe a második csoportba tartozó vegyületek struktúrája ugyanaz, mint az előzőkben meghatározott vegyületeknek, de ezeket a vegyületeket még legalább egy Fc csoporthoz fúzionáltatjuk, közvetlenül, vagy egy vagy több linker csoporton keresztül.

A fenti vegyületek Fc szekvenciája lehet a humán immunglobulin IgG-1 nehéz lánca [Ellison, J.W. és mtsai: Nucleic Acids Research 10, 4071-4079 (1982)], vagy bármelyik másik, a szakterületen ismert Fc szekvencia (azaz például más IgG osztályok, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat az IgG-2-t, az IgG-3-at és az IgG4-et, vagy más immunglobulinokat) .

Az közismert, hogy az ellenanyagok Fc régiói monomer polipeptid szegmensekből tevődnek össze, amik dimer vagy multimer formákká kapcsolódhatnak össze, diszulfid-hidakkal vagy nemkovalens asszociációval. A természetes Fc molekulák monomer alegységei közötti intermolekuláris diszulfid-hidak száma 1 és 4 között változik, a szóban forgó ellenanyag-osztálytól (azaz például

IgG. IgA, IgE) vagy -alosztálytól (azaz például IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2) függően. Az „Fc” szakkifejezés jelentése a továbbiakban gyűjtőnév, ami vonatkozik az Fc molekulák monomer, dimer és multimer formáira is. Meg kell jegyeznünk, hogy az Fc monomerek spontán dimerizálnak a megfelelő Cys csoportok jelenlétében, hacsak nem olyanok a körülmények, amik megakadályozzák a diszulfid-híd képződésével lejátszódó dimerizációt. Még akkor is, ha a Cys csoportokat, amik normális körülmények között diszulfid-hidakat képeznek az Fc dimerben, eltávolítjuk, vagy más csoportokkal helyettesítjük, a monomer láncok általában dimerizálódnak nem-kovalens kölcsönhatásokkal. Az „Fc” szakkifejezés a továbbiakban az alábbiak közül bármelyiket jelenti: természetes monomer, természetes dimer (diszulfid-híddal összekötve), módosított dimerek (diszulfiddal és/vagy nem-kovalens kötéssel összekapcsolva) és módosított monomerek (azaz származékok).

Az Fc rész variánsai, analógjai vagy származékai előállíthatok például a csoportok vagy szekvenciák különböző helyettesítéseivel.

A variáns (vagy analóg) polipeptidek közé tartoznak az inszerciós variánsok, amikben egy vagy több aminosav csoport helyettesít egy Fc aminosav szekvenciát. Az inszerciók elhelyezkedhetnek a fehérje mindkét, vagy bármelyik végén, vagy elhelyezhetők az Fc aminosav szekvencia belső régióiban. Az inszerciós variánsok, amik további csoportokat tartalmaznak mindkét, vagy bármelyik végen, lehetnek például fúziós fehérjék, valamint olyan fehérjék, amik aminosav jelöléseket vagy címkéket tartalmaznak. Az Fc molekula például adott esetben tartalmaz egy N-terminális Met csoportot, főleg akkor, amikor a molekula rekombináns módszerekkel expresszálódik egy bakteriális sejtben, azaz Escherichia coli-ban.

Az Fc deléciós variánsok esetében egy Fc polipeptidből egy vagy több aminosav csoportot eltávolítottunk. A deléciók lehetnek az Fc polipeptid mindkét, vagy bármelyik végén, de lehet az is, hogy egy vagy több csoportot eltávolítottunk az Fc aminosav szekvencia belsejéből. A deléciós variánsok tehát egy Fc polipeptid szekvencia összes fragmensét tartalmazzák.

Az Fc szubsztitúciós variánsokban egy Fc polipeptid egy vagy több aminosav csoportját eltávolítjuk, és más csoportokkal helyettesítjük. Az egyik megvalósítási mód szerint a helyettesítések konzervatív természetűek, azonban a találmány oltalmi körébe tartoznak a nem-konzervatív helyettesítések is.

A cisztein csoportokat például kivághatjuk, vagy más aminosav csoportokkal helyettesíthetjük, hogy ezzel megakadályozzuk néhány, vagy az összes diszulfid-híd kialakulását az Fc szekvenciákban. Pontosabban, az 5. számú szekvencia 7-es és 10-es pozíciójában levő aminosav cisztein. Ezeket a cisztein csoportokat eltávolíthatjuk, vagy egy vagy több ilyen ciszteint más aminosawal, például alaninnal vagy szerinnel helyettesíthetünk. Ugyanúgy mint más példáknál, olyan módosítások is tehetők, amikkel (1) eltávolítjuk az Fc receptor kötőhelyet; (2) eltávolítjuk a komplement (Clq) kötőhelyet; és/vagy (3) eltávolítjuk az ellena nyag-dependens, sejtek által közvetített citotoxicitási (ADCC) helyet. Az ilyen helyek ismertek a szakirodalomban, és bármilyen ismert helyettesítés, ami az IgG 1-ben levő ADCC helyekre vonatkozik, az itt használt Fc oltalmi körébe tartozik [Molecular Immunology 29(5), 633-639 (1992)].

Hasonlóképpen, egy vagy több tirozin csoport helyettesíthető fenilalanin csoporttal is. Emellett más variáns aminosav inszerciók, deléciók (ami lehet például 1-25 aminosavra kiterjedő), szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. Általában a konzervatív aminosav helyettesítéseket részesítjük előnyben. Emellett, a változások lehetnek megváltoztatott aminosav formájúak, azaz például peptidomimetikumok vagy D-aminosavak.

A TMP vegyület Fc szekvenciáiból is készíthetők származékok, azaz olyanok, amik aminosav inszerciótól, deléciótól vagy helyettesítéstől eltérő módosításokkal rendelkeznek. A módosítások előnyösen kovalens természetűek, és ide tartozik például a polimerekkel, lipidekkel más szerves és szervetlen anyagokkal való kémiai kötődés. A jelen találmány szerint olyan származékok készíthetők, amik megnövelik a keringési fél-életidőt, vagy úgy tervezhetők meg, hogy javítsák a polipeptidnek a kívánt sejtekre, szövetekre vagy szervekre való célzási kapacitását.

Az is lehetséges, hogy az érintetlen Fc molekula kimentő receptorkötő doménjét használjuk a jelen találmány szerinti vegyületek Fc részeként, ahogy azt például a WO 96/32478 számú szabadalmi leírásban közzétették, aminek címe: „Altered polypeptides with Increased Half-Life”. Az itt Fc néven említett molekula-osztály további tagjai a WO 97/34631 számú szabadalmi leírásban említettek, amely leírásnak a címe: „Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives”. Az ebben a fejezetben idézett mindkét PCT publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük.

Az Fc fúziókat létrehozhatjuk a TMPi vagy a TMP2 N-terminálisán vagy C-terminálisán, illetve a TMP-k mindkét végén. Meglepő módon felfedeztük, hogy azok a peptidek, amikben egy Fc egység ligálódik a TMP csoport N-terminálisához, biológiailag aktívabbak, mint a többi lehetséges fúziós molekulák, tehát előnyben részesítjük azt a fúziót, amiben a TMPi N-terminálisán egy Fc dómén van (azaz az általános képletben r és p értéke 0, valamint m és q értéke 1). Ha az Fc lánc a TMP vagy a linker Nterminálisához fuzionálódik, akkor az ilyen fúzió általában az Fc lánc C-terminálisán jön létre, és fordítva.

Emellett előnyben részesítjük azokat a vegyületeket, amik az előzőkben ismertetett általános képletnek megfelelő vegyületek dimerei (ami lehet tandem és nem-tandem). Ezekben az esetekben mindegyik Fc lánc kötődhet a TMP peptidek tandem dimerjéhez. Egy ilyen vegyület sematikus példáját a 6C. ábrán mutatjuk be. Az ilyen típusú vegyület egy előnyben részesített példája a 6C. ábrán alapul, aholis az Fc az 5. számú szekvencia szerinti vegyület dimerje, mindegyik L2 jelentése (Gly)s, mind a TMPi, mind a TMP2 az 1. számú szekvenciának megfelelő vegyület, és mindegyik Li jelentése (Gly)s. Ezt a vegyületet nevezzük még „Fc-TMPi-L-TMP2”-nek is. Ez reprezentálható a 34. számú szekvencia dimerjeként is (az Fc részen keresztül). Az analóg vegyületet is megfontoltuk, amelyben az Fc csoport egy linkeren keresztül kapcsolódik a 6C. ábráin a TMP2 csoportokhoz, ezt a továbbiakban TMP1-L-TMP2-FC jelöléssel használjuk.

A második csoportba tartozó vegyületek néhány specifikus példáját az alábbiakban adjuk meg Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (22. számú szekvencia) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (23. számú szekvencia) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (24. számú szekvencia) Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (25. számú szekvencia) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA 26. számú szekvencia) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (ciklikus) (27. szekvencia) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineáris) 28. számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (29. számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (30. számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (31. számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (32. számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (33. számú szekvencia)

Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (34. számú szekvencia)

Mindegyik előzőkben említett vegyületben lehet egy további N-terminális metionin (Met, vagy az egybetús kóddal M) is. A Met csoport az Fc csoport N-terminálisához kapcsolódhat, azokban az esetekben, amikben az Fc csoport a TMP N-terminálisához kapcsolódik. Azokban az esetekben, amikben az Fc csoport a TMP Cterminálisához kapcsolódik, a Met csoport a TMP csoport N-terminálisához kapcsolódhat.

Mindegyik előzőkben említett esetben Fc jelentése előnyösen a humán IgGl immunglobulin nehéz lánc Fc régiója, vagy annak biológiailag aktív fragmense, származéka vagy dimere [Ellison, J.W. és mtsai: Nucleic Acids Research 10, 4071-4079 (1982)]. Az 5. számú szekvenciavázlaton bemutatott Fc szekvencia az előzőkben említett vegyületek közül a leginkább előnyben részesített Fc. Emellett az előzőkben említett vegyületek közül előnyben részesítjük azokat, amikben az Fc az 5. számú szekvencia az 5. számú szekvencia dimer formája, és mindegyik Fc lánc egy TMP tandem dimerhez kapcsolódik.

Emellett, bár a második megvalósítási mód szerint előnyben részesített vegyületek közül számos tartalmaz egy vagy több tandem dimert, amennyiben két kapcsolt TMP egységet tartalmaznak, a jelen találmány szerinti más vegyületek közé tartoznak a TMP-k tandem multimerei, azaz az alábbi, példaként megadott struktúrák:

Fc-TMPi-L-TMP₂-L-TMP₃;

FC-TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4;

FC-TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-TMP5;

TMP_t-L-TMP₂-L-TMP-Fc;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-FC;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-TMP5-FC;

amikben TMPi, TMP2, TMP3, TMP₄ és TMP5 jelentése lehet azonos vagy eltérő struktúra, és amikben az Fc és mindegyik TMP és L jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk, és a linkerek opcionálisak. Mindegyik előzőkben említett esetben az Fc csoport lehet monomer vagy dimer, és azokban az esetekben, amikor az Fc jelentése dimer, egy vagy több TMP multimert kapcsolhatunk mindegyik Fc lánchoz. Megfontoltunk más példákat is, amikben a TMP dimerek vagy multimerek kapcsolódnak egy vagy több Fc láncnak mind az N-terminálisához, mind a C-terminálisához, beleértve azt az esetet, amelyben a TMP dimerek vagy multimerek két Fc láncnak mind a négy végéhez kapcsolódnak.

A jelen találmánynak ebben a második megvalósítási módjában szereplő vegyületek körülbelül 200-400 aminosavat tartalmaznak (azaz polipeptidek).

A jelen találmány szerinti vegyületek számos különböző módon előállíthatok. Mivel számos vegyület lehet peptid, vagy tartalmaz pepiidet, a peptidek szintézisének módszerei különösen relevánsak ebben az esetben. Például szilárd fázisú szintézis technikák használhatók. A megfelelő technikák jól ismertek a szakterületen, és ezeket számos publikációban jelentették meg [Merrifield: Chern. Polypeptides, 335-361, szerk.: Katsoyannis és Panayotis (1973); Merrifield: J.Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963); Davis és mtsai: Biochem. Inti. 10, 394-414 (1985); Stewart és Young: Solid Phase Peptide Synthesis (1969); 3,941,763 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Finn és mtsai: The Proteins, 3. kiadás, 2. kötet, 105-253. oldal (1976); Erickson és mtsai: The Proteins, 3. kiadás, 2. kötet, 257-527. oldal (1976)]. Az egyes peptidek előállítása során a szilárd fázisú szintézis az előnyben részesített technika, mivel a kis peptidek előállításának ez a leginkább költséghatékony előállítási módja.

A peptidek előállíthatok transzformált gazdasejtekben, rekombináns DNS technikák alkalmazásával. Ennek végrehajtásához a pepiidet kódoló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. Az ilyen DNS és/vagy RNS molekulák előállítási módszerei jól ismertek a szakterületen. Például a peptideket kódoló szekvenciák megfelelő restrikciós enzimekkel kivághatok a DNS-ből. A releváns szekvenciákat előállíthatjuk a polimeráz láncreakció (PCR) használatával, az utána kővetkező klónozás megkönnyítéséhez hasznos restrikciós hasítási helyeket építve a szekvenciába. Egy másik változat szerint a DNS/RNS molekula kémiai szintézis technikákkal is megszintetizálható, például a foszforamidit módszerrel. Emellett ezeknek a technikáknak a kombinációja is használható.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy vektor, ami a peptideket egy megfelelő gazdaszervezetben kódolja. A vektor tartalmazza a DNS molekulát, ami a peptideket kódolja, és működés szempontjából a megfelelő expressziós kontroll szekvenciához kapcsolódik. Ennek az operatív kapcsolásnak a végrehajtásához használható módszerek jól ismertek, akár azelőtt, hogy a pepiidet kódoló DNS molekulát beépítjük a vektorba, akár azután. Az expressziós kontroll szekvenciák közé tartoznak a promoterek, aktivátorok, fokozok, operátorok, riboszómális kötőhelyek, start szignálok, stop szignálok, poliadenilezési szignálok és más szignálok, amik a transzkripció vagy transzláció szabályozásában szerepet játszanak.

A kapott vektort, ami tartalmazza a pepiidet kódoló molekulát, megfelelő gazdaszervezet transzformálására használjuk. Ezt a transzformációt a szakterületen jól ismert módszerekkel hajthatjuk végre.

A nagy számban hozzáférhető, jól ismert gazdasejtek közül számos jól ismert használható a jelen találmány gyakorlatában. Egy bizonyos gazdaszervezet kiválasztása számos, a szakterületen jól ismert faktortól függ. Ezek közé a faktorok közé tartozik például a kiválasztott expressziós vektorral való kompatibilitás, a DNS molekula által kódolt peptidek toxicitása a gazdasejtre, a transzformáció gyakorisága, a peptidek kinyerésének egyszerűsége, az expresszió jellemzői, a biológiai biztonság és a költségek. Ezeknek a faktoroknak az egyensúlyát felboríthatja az a felismerés, hogy nem mindegyik gazdaszervezet egyformán hatékony egy bizonyos DNS szekvencia expresszálásában.

Ezen általános irányelveken belül a jól használható mikrobiális gazdaszervezetek közé tartoznak a baktériumok (azaz például az Escherichia coli), az élesztő (azaz például a Saccharomyces sp. és a Pichia pastoris), valamint más gombák, rovarok, növények, emlős (beleértve az emberi) sejtek tenyészetét, vagy más, a szakterületen ismert gazdaszervezetek.

Ezt követően a transzformált gazdaszervezetet hagyományos fermentációs körülmények között tenyésztjük, úgy, hogy a kívánt peptidek expresszálódjanak. Az ilyen fermentációs körülmények jól ismertek a szakterületen.

Végezetül, a peptideket megtisztítjuk a fermentációs tenyészetből, vagy a gazdasejtből, amiben expresszálódnak. Ezek a tisztítási módszerek jól ismertek a szakterületen.

Azokat a vegyületeket, amik peptid-származékokat tartalmaznak, vagy nem-peptid csoportokat tartalmaznak, jól ismert szerves kémiai módszerekkel szintetizálhatjuk meg.

A jelen találmány szerinti vegyületeknek megvan a képességük, hogy megkössék és aktiválják a c-Mpl receptort, és/vagy megvan a képességük, hogy serkentsék (mind in vivő, mind in vitro) a vérlemezkék termelődését („trombopoietikus aktivitás”) és a vérlemezke prekurzorok termelődését („megakariocitopoietikus aktivitás”). Ahhoz, hogy megmérjük ezeknek a vegyületeknek az aktivitását, standard vizsgálatokat használhatunk, például azt, amit a WO95/26746 számú szabadalmi leírásban ismertettek (címe: „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation”). Az in vitro vizsgálatokat részletesebben ismertetjük az alábbi „Példák” részben.

A jelen találmány szerinti módszerekkel és készítményekkel kezelendő állapotok általában azok, amik egy létező megakariocita/vérlemezke deficienciát tartalmaznak, vagy egy, a jövőben várt vagy előre látott megakariocita/vérlemezke deficienciát (például tervezett műtét vagy vérlemezke adás következtében). Az ilyen következmények aktív Mpl ligandum in vivo deficienciájának (ideiglenes vagy állandó) lehetnek az eredményei. A vérlemezke deficiencia generikus szakkifejezése a trombocitopénia, és így a jelen találmány szerinti módszerek és készítmények általánosan hozzáférhetők a trombocitopénia profilaktikus vagy terápiás kezelésére, ilyen kezelésre szoruló betegben.

A WHO a trombocitopénia mértékét az egyedekben keringő vérlemezkék száma alapján határozza meg [Miller és mtsai: Cancer 47, 210-211 (1981)]. Például egy olyan egyedben, aki nem mutatja a trombocitopénia tüneteit (0-ás fokozat), általában 100000 vérlemezke/mm³ van. Az enyhe trombocitopéniát (1-es fokozat) a körülbelül 79000-99000/mm³ vérlemezke szám jelenti. A közepes trombocitopénia (2-es fokozat) esetében a vérlemezke szám 50000-74000 között van, a súlyos trombocitopéniát pedig 25000-49000 vérlemezke/mm³ jelenti. A életet veszélyeztető vagy legyengítő trombocitopéniát a 25000/mm³-nél kisebb számú keringő vérlemezke koncentráció jellemzi.

A trombocitopénia (vérlemezke deficiencia) különböző okok miatt lehet jelen, beleértve a kemoterápiát és más terápiát, amit számos különböző gyógyszerrel, besugárzásos terápiával, műtéttel, véletlen vérveszteséggel és más specifikus kóros állapottal lehet előidézni. A példaként megadott specifikus állapotok, amik magukban foglalják a trombocitopéniát, és a jelen találmány szerint kezelhetők, az alábbiak: aplasztikus anémia, idiopátiás vagy immun trombocitopénia (ITP), beleértve az emlőrákhoz kapcsolódó idiopátiás trombocitopéniás purpureát, a HIV-hez kapcsolódó ITP-t és a HIV-vel rokon trombotikus trombocitopéniás purpureát, az áttétes tumorokat, amik trombocitopéniát eredményeznek, a szisztémás lupus erythematosus-t, beleértve az újszülött lupus szindróma lépmegnagyobbodást; a Fanconi szindrómát; a B12 vitamin deficienciát; a fólsav deficienciát; a MayHagglin anomáliát; a Wiskott-Aldrich szindrómát; a krónikus máj betegséget; a trombocitopéniához kapcsolódó mielodiszplasztikus szindrómát; a rohamokban fellépő éjszakai hemoglobinuriát; a C7 E3 Fab (Abciximab) terápiát követő követő akut mély trombocitopéniát; az alloimmun trombocitopéniát, beleértve az anyai alloimmun trombocitopéniát; az antifoszfolipid ellenanyagokhoz és a trombózishoz kapcsolódó trombocitopéniát; az autoimmun trombocitopéniát; a gyógyszerrel indukált immun trombocitopéniát, beleértve a carboplatinnal indukált trombocitopéniát; a heparinnal indukált trombocitopéniát; a magzati trombocitopéniát; a terhességi trombocitopéniát; a Hughes szindrómát; a lupoid trombocitopéniát; a véletlen és/vagy tömeges vérveszteséget; a mieloproliferativ rendellenességeket; a rákban megbetegedett emberekben kialakuló trombocitopéniát; a trombotikus trombocitopénia purpureát, beleértve a trombotikus mikroangiopátiát, ami rákos betegekben trombotikus trombocitopéniás purpurea/hemolitikus urémiás szindrómaként nyilvánul meg; az autoimmun hemolitikus anémiát; a rejtett éhbél üreg perforációt; a tiszta vörös vérsejtes apláziát; az autoimmun trombocitopéniát; a nephropathia epidemica-t; a rifampicinhez kapcsolódó akut vese-elégtelenséget; a Paris-Trosseau trombocitopéniát; az újszülött alloimmun trombocitopéniát; a rohamokban fellépő éjszakai hemoglobinuriát; a gyomorrák esetén fellépő hematológiai változásokat; a gyerekkori hemolitikus urémiás szindrómákat; a vírusfertőzéshez, beleértve a hepatitisz A vírushoz és a citomegalovírushoz kapcsolódó trombocitopénia hematológiai manifesztációit. Emellett bizonyos AIDS kezelések (például az AZT kezelés) is eredményeznek trombocitopéniát. Bizonyos sebgyógyulási rendellenességek is profitálhatnak a vérlemezke számok növekedéséből.

Ami a várt vérlemezke deficienciákat, azaz például egy jövőbeni műtétet illeti, a jelen találmány szerinti vegyületet a vér lemezke igény előtt több nappal vagy több órával korábban beadhatjuk. Ami az akut helyzeteket illeti, azaz a véletlen és tömeges vérvesztést illeti, a jelen találmány szerinti vegyületet vérrel vagy tisztított vérlemezkékkel együtt adhatjuk be.

A jelen találmány szerinti vegyületek jól használhatók lehetnek emellett a megakariocitáktól eltérő néhány sejttípus serkentésében, ha ezekről a sejtekről kiderül, hogy az Mpl receptort expresszálják. Az Mpl receptort expresszáló ilyen sejtekhez kötődő állapotok, amik reagálnak az Mpl ligandummal való serkentésre, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A jelen találmány szerinti vegyületek bármilyen helyzetben használhatók, amikben a vérlemezkék vagy vérlemezke prekurzorok termelődésére van szükség, vagy amikor a c-Mpl receptor serkentésére van szükség. Tehát például a jelen találmány szerinti vegyületek emlősökben bármilyen olyan állapot kezelésére használható, amiben vérlemezkékre, megakariocitákra és hasonlókra van szükség. Ezeket a körülményeket az alábbi, példaként megadott forrásokban ismertetik: WO95/26746; WO95/21919; WO95/18858; W095/21920, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk.

A jelen találmány szerinti vegyületek emellett jól használhatók lehetnek a vérlemezkék és/vagy megakariociták és rokon sejtek életképességének vagy tárolhatóság! idejének fenntartásában. Ennek megfelelően hasznos lehet, ha egy vagy több ilyen vegyület hatásos mennyiségét beletesszük ilyen sejteket tartalmazó készítményekbe.

Az „emlős” szakkifejezés alatt bármilyen emlőst értünk, beleértve az embereket, a háziállatokat, beleértve a kutyákat és macskákat; az exotikus és/vagy állatkerti állatokat, beleértve a majmokat; a laboratóriumi állatokat, beleértve az egereket, patkányokat és tengerimalacokat; a mezőgazdasági jelentőségű állatokat, beleértve a lovakat, szarvasmarhákat, birkákat, kecskéket és sertéseket; valamint a hasonlókat. Az előnyben részesített emlős az ember.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények használatának módszerei. Egy ilyen gyógyászati készítmény elkészíthető injekciós úton, vagy orálisan, nazálisán, transzdermálisan vagy más módon való beadásra; beleértve például az intravénás, intradermális, intramuszkuláris, intramammáris, intraperitoneális, intratekális, intraokuláris, retrobulbáris, intrapulmonáris (azaz például aeroszolizált gyógyszerek) vagy szubkután injekciós (beleértve a depó beadást a hosszú idejű felszabaduláshoz) beadást; vagy szublingvális, anális, vaginális vagy sebészeti úton végzett beültetéssel végzett (azaz például a lépkapszula alá, az agyba vagy a szaruhártyába való beültetést) beadást. A kezelés állhat egyetlen dózisból, vagy egy adott időtartam alatt több dózisból. Általában a találmány tárgyát képezik azok a gyógyászati készítmények, amik egy, a jelen találmány szerinti vegyűletből hatásos mennyiséget tartalmaznak, gyógyászatilag elfogadható hígítószerekkel, konzerválószerekkel, szolubilizálókkal, emulgeálókkal, adjuvánsokkal és/vagy hordozókkal. Az ilyen készítmények közé tartoznak a különböző puffertartalom (azaz például TRIS-HC1, acetát, foszfát), pH és ionerösség higitószerei; az olyan adalékanyagok, mint például a detergensek és szolubilizáló ágensek (azaz például a Tween 80, Polysorbate 80), az antioxidánsok (azaz például az aszkorbinsav, a nátrium-metabiszulfit), a konzerválószerek (azaz például a Thimersol, a benzilalkohol), és a térkitöltő anyagok (azaz például a laktóz, mannit); az anyag bejuttatása polimer vegyületek részecske készítményeibe, azaz például politejsavba, poliglikolsavba, stb., vagy liposzómákba. Hialuronsav is használható, és ennek meglehet az a hatása, hogy elősegíti a keringésben hosszabb ideig való fennmaradást. A gyógyászati készítmények adott esetben tartalmazhatnak más gyógyászatilag elfogadható folyadékot, félig szilárd vagy szilárd higítószereket, amik gyógyászati hordozókként, töltőanyagokként vagy közegként működnek, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a polioxietilén szorbitán monolaurátot, a magnézium-sztearátot, a metil- és propilhidroxibenzoátot, a keményítőket, a szacharózt, a dextrózt, a gumiarábikumot, a kalcium-foszfátot, az ásványolajat, a kakaóvajat és a kakaócserjeolajat. Az ilyen készítmények befolyásolhatják a jelen találmány szerinti fehérjék és származékok fizikai állapotát, stabilitását, az in vivo felszabadulás sebességét, valamint az in vivo kiürülés sebességét [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, 1435-1712. oldal, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 (1990)]. A készítményeket előállíthatjuk folyékony formában, vagy lehetnek szárított por formájúak, azaz például liofilezett porok. A beültethető, hosszú felszabadulási idejű készítményeket is megfontoltuk, ugyanúgy, mint a transzdermális készítményeket.

Az alábbiakban való felhasználáshoz megfontoltuk az orális szilárd dózisformákat, amiket általánosságban ismertetnek a szakirodalomban [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás 89. fejezet, Mack Publishing Co. Easton PA 18042 (1990)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A szilárd dózisformák közé tartoznak a tablettáik, kapszulák, pirulák, pasztillák, szögletes tabletták, ostyák vagy labdacsok. Emellett liposzómális vagy protenoid kapszulázást is használhatunk a jelen találmány szerinti készítmények kiszerelésére (lásd például a 4,925,673 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett protenoid mikrogömböket). A liposzómális kapszulázás is használható és a liposzómákból különböző polimerekkel származékok készíthetők (lásd például az 5,013,556 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). A lehetséges szilárd dózisformák leírását Marshall publikálta [Marshall, K. és mtsai: Modern Pharmaceutics, szerk.: G.S. Banker és C.T. Rhodes, 10. fejezet (1979)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A készítmény általában tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, valamint tartalmaz inert adalékanyagokat, amik lehetővé teszik a gyomor környezetével szembeni védelmet, és a biológiailag aktív anyag felszabadulását a bélben.

Emellett megfontoltuk az előzőkben említett találmány szerinti vegyületek dózisformáit. Ha szükséges, akkor a vegyületek kémiailag módosíthatók, oly módon, hogy az orális bejuttatás hatékony legyen. A megfontolt kémiai módosítás általában az, hogy legalább egy egységet csatolunk a vegyület molekulájához, ahol az említett egység lehetővé teszi (a) a proteolízis gátlását; és (b) a gyomorból vagy a bélből a véráramba való jutást. Kívánatos emellett a vegyület ossz-stabilitásának a növelése, és a testben való keringési idejének meghosszabbítása. Ilyen egységek lehetnek például: polietilénglikol, az etilénglikol és a propilénglikol kopolimerjei, a karboximetilcellulóz, a dextrán, a polivinil-alkohol, a polivinil-pirrolidon és a poliprolin [Abuchowski és Davis: Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, 367-383. oldal, szerk.: Hocenberg és Roberts, Wiley-Interscience, New York, NY (1981); Newmark és mtsai: J. Appl. Biochem. 4, 185189 (1982)]. Használható polimer még a poli-l,3-dioxolán és a poli-l,3,6-tioxokán. A gyógyászati felhasználáshoz előnyben részesítjük a polietilénglikol egységeket.

Az orális beadási formákhoz az is lehetséges, hogy egy módosított alifás aminosav sóját használjuk, azaz például a nátrium N-(8-[2-hidroxibenzoil]amino) kaprilátot (SNAC), ami egy olyan hordozó, ami fokozza a jelen találmány szerinti terápiás vegyületek felszívódását. Egy heparin készítmény klinikai hatékonyságát SNAC felhasználásával az Emisphere Technologies által szervezett Fázis II vizsgálatban demonstrálták (5,792,451 számú

Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, címe: „Órai drug delivery composition and methods”).

A hatóanyagot a készítménybe finom részecskék formájában juttathatjuk be, körülbelül Imm részecskeméretü granulátumok vagy labdacsok formájában. A kapszulában való beadáshoz a készítmény kiszerelési formája lehet por, gyengén összepréselt dugó, vagy éppen tabletta. A terápiás hatóanyagot préseléssel állíthatjuk elő.

Színező és ízesítő anyagokat is beadhatunk. Például a fehérjét (vagy származékát) formulázhatjuk, (azaz például liposzóma vagy mikrogömb kapszulázással), majd tovább vihetjük egy fogyasztható termékbe, azaz például hütött üdítőitalba, ami színezőanyagokat és ízesítő anyagokat tartalmaz.

A hatóanyagot hígíthatjuk, vagy térfogatát egy inert anyaggal megnövelhetjük. Ilyen higítóanyagok lehetnek a szénhidrátok, főleg a mannit, az alfa-laktóz, a vízmentes laktóz, a cellulóz, a szacharóz, a módosított dextránok és a keményítő. Bizonyos szervetlen sók is használhatók töltőanyagként, beleértve a kalcium-trifoszfátot, a magnézium-karbonátot és a nátriumkloridot. Néhány kereskedelmi forgalomban levő higítószer a Fast-Flo, az Emdex, a STA-Rx 1500, az Emcompress és az Avicell.

A hatóanyag szilárd dózisformájába dezintegráló szereket is tehetünk. A dezintegráló szerként használható anyagok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a keményítő, beleértve a kereskedelmi forgalomban levő, keményítő alapú dezintegráló szert, az Explotab-ot. A nátrium-keményítő glikolát, az Amberlit, a nátrium-karboximetilcellulóz, az ultramielopektin, a nátrium-alginát, a zselatin, a narancshéj, a savas karboximetilcellulóz, a természetes szivacs és a bentonit is mind használható. A dezintegráló szerek egy másik formája az oldhatatlan kationos ioncserélő gyanták. Porított gumik is használhatók dezintegráló szerként és kötőanyagként, ide tartozhatnak például a porított gumik, azaz például az agar, a Karaya vagy a tragantmézga. Az alginsav és nátriumsója szintén jól használható dezintegráló szer.

A kötőanyagok arra használhatók, hogy a terápiás ágenst együtt tartsuk, ezzel egy kemény tablettát alakítva ki, ami tartalmaz természetes termékeket, azaz például gumiarábikumot, tragantmézgát, keményítőt és zselatint. Más ilyen anyag például a metilcellulóz, az etilcellulóz és a karboximetilcellulóz. Mind a polivinil-pirrolidon (PVP), mind a hidroxipropilmetil-cellulóz (HPMC) használható alkoholos oldatokban, a terápiás ágens granulálásira.

Súrlódást csökkentő anyagot is tehetünk a terápiás ágens készítményébe, hogy ezzel megakadályozzuk a letapadást a kiszerelési eljárás során. Sikosító anyagok használhatók egy olyan rétegként, ami a terápiás ágens és a présszerszám fala között van, ezek az alábbiak lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: sztearinsav, beleértve a magnézium- és kalciumsóit, a politetrafluoretilén (PTFE), a folyékony paraffin, a növényi olajok és viaszok. Oldható sikosító anyagok is használhatók, azaz például a nátrium-dodecil-szulfát, a magnézium « w · · ·« t « · · · ·

». · 4 · * * M· dodecil-szulfát, a különböző molekulasúlyú polietilénglikolok, a Carbowax 4000 és 6000.

Csúsztatóanyagok is hozzáadhatok, amik javíthatják a gyógyszer áramlási tulajdonságait a gyógyszer kiszerelése közben, és segítik az átrendeződést a préselés során. A csúsztatóanyagok közé tartozik a keményítő, a talkum, a pirogén szilikát és a hidratált szilikoaluminát.

Ahhoz, hogy elősegítsük a terápiás ágens feloldódását vizes környezetben, felületaktív anyagot is adhatunk hozzá nedvesítő szerként. A felületaktív anyagok közé tartoznak az anionos detergensek, azaz például a nátrium-dodecil-szulfát, a dioktil-nátrium-szulfoszukcinát és a dioktil-nátrium-szulfonát. Kationos detergensek használhatók, ilyen lehet például a benzalkóniumklorid vagy a benzetónium-klorid. A potenciális nem-ionos detergensek listája, amiket felületaktív anyagként betehetünk a készítménybe, tartalmazza a lauromakrogol 400-at, a polioxil 400 sztearátot, a polioxietilén hidrogénezett kasztorolaj 10-et, -50-et és 60-at, a glicerin-monosztearátot, a poliszorbát 40-et, 60-at, 65-öt és 80-at, a szacharóz zsírsavésztert, a metilcellulózt és a karboximetilcellulózt. Ezek a felületaktív anyagok lehetnek jelen a fehérje vagy származéka készítményében, vagy önmagukban, vagy különböző arányú keverékekben.

A vegyület felvételét potenciálisan fokozó adalékanyag például az olaj sav, a linolsav és a linolénsav.

A szabályozott felszabadulású termékek lehetnek kívánatosak. A gyógyszert bevihetjük egy inert mátrixba, ami lehetővé te szí a felszabadulását, akár diffúzióval, akár kimosódási mechanizmusokkal, lásd például a gumikat. A lassan degenerálódó mátrixokat, azaz például alginátokat, poliszacharidokat is beépíthetünk a készítménybe. Ezen terápiás ágens szabályozott felszabadulásának egy másik formája az Oros terápiás rendszeren alapuló eljárás (Alza Corp.), azaz a gyógyszer egy félig áteresztő membránba van zárva, ami lehetővé teszi, hogy a víz belépjen, és ozmotikus hatások következtében egyetlen kis nyíláson át kinyomja a gyógyszert. Néhány bélben oldódó bevonatnak is van felszabadulást késleltető hatása.

A készítményekben más bevonatok is alkalmazhatók. Ezek lehetnek különböző cukrok, amiket a bevonatot készítő edénybe teszünk. A terápiás ágens lehet egy filmbevonatú tablettában, és az ebben az esetben használt anyagokat 2 csoportra osztjuk. Az első csoportba tartoznak a bélben nem oldódó anyagok, ilyen például a metilcellulóz, az etilcellulóz, a hidroxietil-cellulóz, a metilhidroxietil cellulóz, a hidroxipropil-metil cellulóz, a nátrium karboximetilcellulóz, a povidone és a polietilénglikolok. A második csoportba a bélben oldódó anyagok tartoznak, amik általában ftálsav-észterek.

Az optimális filmbevonathoz az anyagok keverékét használhatjuk. A filmbevonást végezhetjük egy filmbevonó edényben, fluid ágyban, vagy préseléses bevonással.

A jelen találmányban a jelen találmány szerinti fehérje (vagy annak származékai) pulmonáris bejuttatását is megfontoltuk. A fehérjét (vagy származékát) egy emlős tüdejébe juttatjuk be, inhalálás közben, és a tüdő epiteliális bevonatán keesztül jut el a véráramba [Adjei és mtsai: Pharmaceutical Research 7, 565569 (1990); Adjei és mtsai: International Journal of Pharmaceutics 63, 135-144 (1990) (leuprolid-acetát); Braquet és mtsai: Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (Suppl.), s. 143-146 (1989) (endotelin-1); Hubbard és mtsai: Annals of Internal Medicine 3, 206-212 (1989) (alfal-antitripszin); Smith és mtsai: J. Clinic. Invest. 84, 1145-1146 (alfal-proteináz); Oswein és mtsai: „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, (1990) (rekombináns humán növekedési hormon); Debs és mtsai: The Journal of Immology 140, 3482-3488 (1988) (gamma-interferon és tumor nekrózis faktor alfa); valamint Platz és mtsai: 5,284,655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás (granulocita telepserkentő faktor).

A jelen találmány gyakorlatában számos különböző mechanikai berendezést megfontoltunk, amiket arra terveztek, hogy a terápiás terméket pulmonárisan lehessen bejuttatni, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a nebulizátorokat, a mért dózisú inhalálókat és a por-inhalálókat, amik mind ismertek a szakterületen jártas szakember számára.

A jelen találmány gyakorlatában jól használható berendezésekre néhány specifikus példa az alábbi: Ultravent nebulizáló, gyártja a Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; az Acorn II nebulizáló, gyártja a Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; a Ventolin mért dózisú inhaláló, gyártja a Glaxo Inc.,

Research Triangle Park, Nort Carolina; és a Spinhaler Powder Inhaler, gyártja a Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Minden ilyen berendezéshez olyan készítményeket kell használni, amik alkalmasak a találmány szerint vegyület szétosztására. Tipikus esetben mindegyik készítmény specifikus a használt berendezésre, és magában foglalhatja egy megfelelő hajtóanyag használatát, a terápiában hasznos higitószerek, adjuvánsok és/vagy hordozók használatát.

A találmány szerinti vegyületet legelőnyösebben részecske formában lehet előállítani, aholis a részecskék átlagos mérete kisebb mint 10 pm (vagy mikron), legelőnyösebben 0,5-5 pm, hogy a lehető leghatékonyabban eljuttassuk a tüdő távolabbi részébe.

A hordozók közé tartoznak a szénhidrátok, azaz például a trehalóz, a mannit, a xilit, a szacharóz, a laktóz és a szorbit. A készítményekben használt más adalékanyag lehet például a DPPC, a DOPE, a DSPC és a DOPC. Természetes vagy szintetikus felületaktív anyagok is használhatók. Használható polietilénglikol is (eltekintve attól, hogy a fehérje, vagy annak analógja származékának elkészítésében is használható). Dextránok, mint például ciklodextrán is használható. Epesavak és más rokon fokozószerek is használhatók. Cellulóz és cellulóz-származékok is használhatók. Használhatók aminosavak is, például a puffer elkészítésében.

Emellett a liposzómák, mikrokapszulák vagy mikrogömbök, zárványkomplexek vagy más típusú hordozók használatát is megfontoltuk.

A nebulizálóban - függetlenül attól, hogy sugaras vagy ultrahangos - való használathoz alkalmas készítmény tipikus esetben tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, vízben oldva, körülbelül 0,1-25 mg biológiailag aktív fehérje per ml oldat koncentrációban. A készítmény mellett tartalmazhat egy puffért és egy egyszerű cukrot (például a fehérje stabilizálásához és az ozmotikus nyomás stabilizálásához). A nebulizáló készítmény tartalmazhat egy felületaktív anyagot, hogy csökkentse vagy megakadályozza a fehérje aggregációját, amit az oldat atomizációja okoz az aeroszol képződése közben.

A mért dózisú inhaláló berendezésben való használathoz készített készítmények általában tartalmaznak egy finoman eloszlatott port, ami tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, egy hajtóanyagban egy felületaktív anyag segítségével szuszpendálva. A hajtóanyag lehet bármilyen hagyományos, erre a célra használt anyag, azaz például klór-fluor-karbon, hidroklórfluor-karbon, hidrofluor-karbon, hidrofluor-karbon vagy hidrokarbon, beleértve a triklórfluormetánt, a diklór-difluormetánt, a diklór-tetrafluoretanolt és az 1,1,1,2-tetrafluoretánt, vagy ezek kombinációját. A megfelelő felületaktív anyagok közé tartozik a szorbitán-trioleát és a szójalecitin. Az olajsav is hasznos felületaktív anyag lehet.

Egy por-inhaláló berendezésből való szétosztáshoz való készítmény tartalmaz egy finoman eloszlatott száraz port, ami tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, és emellett tartalmazhat egy térkitöltő ágenst, azaz például laktózt, szorbitot, szacharózt, mannitot, trehalózt vagy xilitet, olyan mennyiségben, ami megkönnyíti a pornak a berendezésből való szétosztását, azaz például 50-90 tömegszázalékban, a készítmény tömegére számítva.

A találmány szerinti vegyületek nazális bejuttatását is megfontoltuk. A nazális bejuttatás lehetővé teszi a fehérjének a véráramba jutását, a terápiás terméknek közvetlenül az orrba való juttatása után, anélkül hogy szükség lenne a terméknek a tüdőben való lerakódására. A nazális bejuttatáshoz használt készítmények közé tartoznak a dextránnal vagy ciklodextránnal előállított készítmények. Más, nyálkahártyákon keresztül való átjutással való bejuttatást is megfontoltuk.

Az előzőkben említett állapotok kezelésére használt eljárásokban alkalmazott dózistartományt a kezelőorvosnak kell meghatározni, figyelembe véve különböző faktorokat, amik módosítják a gyógyszerek hatását, azaz például a beteg életkorát, állapotát, testsúlyát, nemét és étrendjét, bármilyen fertőzés súlyosságát, a beadás idejét és más klinikai faktorokat. A dózis nagysága általában 0,1 gg - 100 mg találmány szerinti vegyület per testsúlykg per nap, előnyösen 0,1-1000 μg/kg; még előnyösebben 0,1-150 gg/kg; napi dózisokban beadva, vagy ekvivalens dózisokban, rövidebb-hosszabb időtartam alatt beadva, azaz pél dául naponta, hetente kétszer, hetente vagy naponta kétszer-háromszor.

A találmány szerinti vegyületet beadhatjuk egy induló bolus-ban, ezt követi egy folyamatos infúzió, hogy fenntartsuk a gyógyszertermék állandó szintjét a keringésben. Egy másik példa szerint a találmány szerinti vegyületet egyszeri dózis formájában adhatjuk be. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember könnyen optimalizálja a hatékony dózisokat és beadási tartományokat, amit a helyes gyógyítási gyakorlat és az egyes beteg klinikai állapota határoz meg. A dózis gyakorisága függ az ágensek farmakokinetikai paramétereitől és a beadás módjától. Az optimális gyógyászati kiszereléseket a szakterületen jártas szakember határozza meg, és ez függ a beadás módjától és a kívánt dózistól [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, 1435-1712. oldal, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 (1990)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az ilyen készítmények befolyásolhatják a beadott ágensek fizikai állapotát, stabilitását, az in vivő felszabadulás sebességét és in vivő kiürülését. A beadás módjától függően a megfelelő dózis kiszámítható a testsúly, a testfelszín vagy a szerv mérete alapján. A kezeléshez szükséges megfelelő dózis meghatározásához szükséges számítások további finomítását, ami az összes előzőkben említett készítményre vonatkozik, a szakterületen jártas szakember rutinszerűen el tudja végezni, fölösleges kísérletezés nélkül, főleg az itt ismertetett dózis-információ és vizsgálatok alapján, valamint az előzőkben említett humán klinikai vizsgálatok során megfigyelt farmakokinetikai adatok alapján. A megfelelő dózisokat igazolhatjuk azokkal a bejáratott vizsgálatokkal, amikkel a vérszinteket lehet meghatározni, a megfelelő dózis-válasz adatokkal kapcsolatban. A végső dózistartományt a kezelőorvos határozza meg, figyelembe véve azokat a különböző faktorokat, amik befolyásolják a gyógyszerek hatását, azaz például a gyógyszer specifikus aktivitását, a károsítás súlyossága, valamint a beteg reagálóképessége, életkora, állapota, testsúlya, neme és étrendje alapján, bármilyen fertőzés súlyossága, a beadás ideje és más klinikai faktorok alapján. Ahogy a vizsgálatok folynak, további információk derülnek ki a különböző betegségek és állapotokra vonatkozó megfelelő dózisszintekröl és kezelési időtartamokról.

A jelen találmány szerinti terápiás eljárások, készítmények és vegyületek használhatók önmagukban, vagy más citokinekkel, oldható Mpl receptorral, hematopoietikus faktorokkal, interleukinokkal, növekedési faktorokkal vagy ellenanyagokkal kombinálva, olyan betegségek kezelésében, amiket más tünetek jellemeznek, valamint vérlemezke deficienciák. Az volt várható, hogy a találmány szerinti vegyület hasznosnak bizonyul a trombocitopénia bizonyos formáinak kezelésében, a hematopoiézis általános serkentőivel, például az interleukin-3mal, vagy a GM-CSF-fel kombinálva. Más megakariocita serkentő faktorok, azaz például a meg-CSF, az őssejt faktor (SCF), a leukémia gátló faktor (LIF), az onkosztatin M (OSM) vagy más megakariocita serkentő aktivitással rendelkező molekulák is használhatók az Mpl ligandummal. Az ilyen együtt-beadáshoz használható további citokin vagy hematopoietikus faktor lehet például az interleukin-1 alfa, az interleukin-1 béta, az interleukin-2, az interleukin-3, az interleukin-4, az interleukin-5, az interleukin-6, az interleukin-11, a telepserkentö faktor-1 (CSF-1), az M-CSF, az SCF, a GM-CSF, a granulocita telepserkentő faktor (G-CSF), az EPO, az interferon-alfa (IFN-alfa), a konszenzus interferon, az interferon-béta, az interferon-gamma, az interleukin7, interleukin-8, az interleukin-9, az interleukin-10, az interleukin-12, az interleukin-13, az interleukin-14, az interleukin-15, az interleukin-16, az interleukin-17, az interleukin-18, a trombopoietin (TPO), az angiopoietinek, például az Ang-1, az Ang2, az Ang-4, az Ang-Y, a humán angiopoietinszerü polipeptid, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), az angiogenin, a csont morfogenikus protein-1, a csont morfogenikus protein-2, a csont morfogenikus protein-3, a csont morfogenikus protein-4, a csont morfogenikus protein-5, a csont morfogenikus protein-6, a csont morfogenikus protein-7, a csont morfogenikus protein-8, a csont morfogenikus protein-9, a csont morfogenikus protein10, a csont morfogenikus protein-11, a csont morfogenikus protein-12, a csont morfogenikus protein-13, a csont morfogenikus protein-14, a csont morfogenikus protein-15, a csont morfogenikus protein receptor IA, a csont morfogenikus protein receptor IB, az agyi neurotróf faktor, a ciliáris neurotróf faktor, a ciliáris neurotróf faktor receptor alfa, a citokinnel indukált neutrofil kemotaktikus faktor 1, a citokinnel indukált neutrofil kemotaktikus faktor 2alfa, a citokinnel indukált neutrofil kemotaktikus faktor 2béta, az endoteliális sejtnövekedési faktor, az endotelin 1, az epidermális növekedési faktor, az epitélium eredetű neutrofil attraktáns, a fibroblaszt növekedési faktor 4, a fibroblaszt növekedési faktor 5, a fibroblaszt növekedési faktor 6, a fibroblaszt növekedési faktor 7, a fibroblaszt növekedési faktor 8, a fibroblaszt növekedési faktor 8b, a fibroblaszt növekedési faktor 8c, a fibroblaszt növekedési faktor 9, a fibroblaszt növekedési faktor 10, a savas fibroblaszt növekedési faktor, a bázikus fibroblaszt növekedési faktor, a glia sejtvonal eredetű neurotróf faktor receptor alfa 1, a glia sejtvonal eredetű neurotróf faktor receptor alfa 2, a növekedéssel rokon fehérje, a növekedéssel rokon fehérje alfa, a növekedéssel rokon fehérje béta, a növekedéssel rokon fehérje gamma, a heparinkötő epidermális növekedési faktor, a hepatocita növekedési faktor, a hepatocita növekedési faktor receptor, az inzulin-szerű növekedési faktor I, az inzulin-szerű növekedési faktor receptor, az inzulinszerű növekedési faktor II, az inzulin-szerű növekedési faktort kötö fehérje, a keratinocita növekedési faktor, a leukémiát gátló faktor, a leukémiát gátló faktor receptor alfa, az idegnövekedési faktor receptor, a neurotrofin-3, a neurotrofin-4, a méhlepény növekedési faktor, a méhlepény növekedési faktor 2, a vérlemezke eredetű endoteliális sejtnövekedési faktor, a vérlemezke eredetű növekedési faktor, a vérlemezke eredetű növekedési faktor A lánc, a vérlemezke eredetű növekedési faktor AA, a vérlemezke eredetű növekedési faktor AB, a vérlemezke eredetű nőve kedési faktor B lánc, a vérlemezke eredetű növekedési faktor BB, a vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor alfa, a vérlemezke eredetű növekedési faktor béta, a pre-B sejtnövekedést serkentő faktor, az őssejt faktor receptor, a tumor nekrózis faktor, beleértve a TNFO-t, a TNFl-et, a TNF2-t, a transzformáló növekedési faktor alfát, a transzformáló növekedési faktor bétát, a transzformáló növekedési faktor bétal-et, a transzformáló növekedési faktor 1.2-t, a transzformáló növekedési faktor béta2-t, a transzformáló növekedési faktor béta3-at, a transzformáló növekedési faktor béta-5-öt, a látens transzformáló növekedési faktor béta-l-et, a transzformáló növekedési faktor béta kötő fehérje Iet, a transzformáló növekedési faktor béta kötő fehérje Π-t, a transzformáló növekedési faktor béta kötő fehérje III-at, az I-es tipusű tumor nekrózis faktor receptort, a Il-es típusú tumor nekrózis faktor receptort, az urokináz típusú plazminogén aktivátor receptort, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktort, és a kiméra fehérjéket, valamint azok biológiailag és immunológiailag aktív fragmenseit. Emellett hasznos lehet ha egyszerre vagy egymás után hatásos mennyiséget adunk be egy oldható emlős Mpl receptorból, ami úgy tűnik, hogy hatással van arra, hogy a megakariociták vérlemezkékké fragmentálódjanak, ha a megakariociták elérték érett formájukat. Tehát egy találmány szerinti vegyület beadása (azzal a céllal, hogy növeljük az érett megakariociták számát) az oldható Mpl receptor beadása után (amivel inaktiváljuk a ligandumot, és lehetővé tesszük, hogy az érett megakariociták vérlemezkéket termeljenek) várhatóan külö nősen hatásos eszköz a vérlemezke termelődés serkentésére. Az idézett dózist úgy állítjuk be, hogy kompenzáljuk az ilyen addicionális komponenseket a terápiás készítményben. A kezelt paciens változásait hagyományos módszerekkel követjük.

Azokban az esetekben, amikor a találmány szerinti vegyületeket adjuk vérlemezkék és/vagy megakariocita és rokon sejtek készítményeihez, a hozzáadandó mennyiséget általában kísérletileg határozzuk meg, a szakterületen ismert technikákkal és vizsgálati módszerekkel. A mennyiségek példája a 0,1 pg - 1 mg találmány szerinti vegyület per 10⁶ sejt.

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány kitanitásainak alkalmazása egy specifikus problémára vagy helyzetre bőven a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember képességein belül van, az itt megadott kitanítások alapján. A jelen találmány szerinti termékek példáit, izolálásainak reprezentatív eljárásait, használatát és gyártását az alábbiakban adjuk meg.

Példák

I. Az alábbiakban kísérleti módszerek példáit adjuk meg az ismertetett első csoport szerinti vegyületek előállítására

A. Anyagok és módszerek

A peptid-szintézis során használt összes aminosav-származékot (mindegyik L-konfigurációjú) és gyantát a Novabiochem-től vásároljuk. A peptid-szintézis reagenseket (DCC, HOBt, stb.) oldat formában vásároljuk az Applied Biosystems, Inc.-tői. A két PEG származékot a Shearwater Polymers, Inc.-töl vásároljuk. Mindegyik oldószert (diklórmetán N-metil-pirrolidinon, metanol, acetonitril) az EM Sciences-től vásároljuk. Az analitikai HPLC-t egy Beckman rendszeren futtatjuk Vydac oszlopon (0,46 cm χ 25 cm, C18 fordított fázis, 5 mm), 1 ml/perc áramlási sebességgel, kettős UV detektálással, 220 és 280 nm-en. Lineáris gradienst használunk mindegyik HPLC művelethez, két mobil fázissal: A puffer - H2O (0,1% TFA) és B puffer - acetonitril (0,1% TFA). Az itt említett számozott peptideket, azaz például a 17b, 18, 19 és 20 számú peptideket az 1. táblázat alapján számozzuk, és közülük néhányat tovább illusztrálunk a 2. és 3. ábrán.

Peptid-szintézis

Mindegyik pepiidet a jól ismert, lépésenként! szilárd fázis szintézismódszerrel állítjuk elő. Az Fmoc kémiát használó szilárd fázisú szintézist egy ABI Peptide Synthesizer-rel hajtjuk végre. Tipikus esetben a peptid-szintézis egy előre töltött Wang gyantán kezdődik, 0,1 mmol méretben. Az Fmoc védöcsoportmentesitését standard piperidin protokoll alapján hajtjuk végre. A kapcsolást DCC/HOBt használatával hajtjuk végre. Az oldallánc védőcsoportok a következők: Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) és Cys(Trt). A pegilezéshez az első peptid prekurzort, a Dde-t használjuk az oldallánc megvédésére a linkerben Lys-en és az utolsó kapcsoláshoz a Boc-Ile-OH-t használjuk. A Dde-t vízmentes hidrazinnal (2% NMP-ben, 3><2 perc) távolítjuk el, ezt követi a brómecetsavanhidriddel való kapcsolás, amit DCC-vel hajtunk végre. A 18-as peptid esetében a linkerben levő cisztein oldalláncot egy tritilcsoporttal védjük meg. A végső védöcsoport-mentesítést és az összes peptidil gyanta lehasítását szobahőmérsékleten hajtjuk végre 4 óra hosszat, 2,5% vizet, 5% fenolt, 2,5% triizopropilszilánt és 2,5% tioanizolt tartalmazó trifluorecetsavat (TFA) használva. A TFA eltávolítása után a lehasított pepiidet hideg vízmentes éterrel csapjuk ki. A ciklikus peptid diszulfid-híd képzését közvetlenül a nyers anyagon hajtjuk végre, 15% vizes DMSO-t használva (pH=7,5). Az összes nyers pepiidet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk, majd struktúrájukat ESI-MSI-vel és amino sav-elemzéssel igazoljuk.

Egy másik változat szerint az összes, előzőkben említett peptidet t-Boc kémiával is előállíthatjuk. Ebben az esetben a kiindulási gyanta a klasszikus Merrifield vagy Pam gyanta, és az oldallánc védőcsoportok az alábbiak lehetnek: Glu(Obzl),

Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp(CHO), Cys(p-MeBzl). A hidrogénfluoridot (HF) használjuk a peptid-gyanta végső hasításához.

PEGílezés

A szintetikus peptidek pegilezésére egy új, konvergens stratégiát fejlesztettünk ki, ami abból áll, hogy egy oldatban létrehozott konjugátumon keresztül kombinálunk egy peptidet és egy PEG egységet, amelyek mind hordoznak egy speciális funkcionalitást, amik kölcsönösen reakcióképesek a másikkal. A prekurzor peptidek könnyen előállíthatok a hagyományos szilárd fázisú szintézissel, az előzőkben említett módon. Amint azt az alábbiakban ismertetjük, ezek a peptidek „előaktiválva” vannak egy megfelelő funkcionális csoporttal, egy specifikus ponton. A prekurzorokat tisztítjuk, majd teljesen jellemezzük a PEG egységgel való reagáltatás előtt. A pepiidnek PEG-gel való ligálása általában vizes fázisban játszódik le, és könnyen követhető fordított fázisú analitikai HPLC-vel. A pegilezett peptideket könnyen tisztíthatjuk preparatív HPLC-vel és analitikai HPLC-vel, majd aminosav elemzéssel és lézer deszorpciós tömegspektrometriával jellemezzük.

A 19-es pepiid előállítása

A 17b peptidet (12 mg) és 30 mg (2 ekvivalens) MeO-PEGSH 5000-et oldunk 1 ml vizes pufferben (pH=8). Az elegyet szobahőmérsékleten inkubáljuk körülbelül 30 percig, majd a reakciót analitikai HPLC-vel elemezzük, ami a reakció körülbelül >80%-os lejátszódását mutatja. A pegilezett anyagot preparativ HPLC-vel izoláljuk.

A 20-as peptid készítése mg 18-as peptidet és 25 mg MeO-PEG-maleimidet oldunk körülbelül 1,5 ml vizes pufferben (pH=8). Az elegyet szobahőmérsékleten inkubáljuk körülbelül 30 percig, akkor körülbelül 70%-os transzformációt érünk el, amit analitikai HPLC-vel ellenőrzünk, és analitikai HPLC-vel követünk, egy alikvot rész mintát vive a HPLC oszlopra. A pegilezett anyagot preparativ HPLC-vel tisztítjuk.

A biológiai aktivitás vizsgálata

A TPO in vitro biológiai esszé egy mitogén esszé, amiben a rágcsáló 32D sejtek egy IL-3 dependens kiónját használjuk, amit humán mpl receptorral transzferáltunk. Ezt az esszét részletesebben a WO 95/26746 számú szabadalmi leírásban közük. A sejteket 10% Fetal Clone II-t és 1 ng/ml mIL-3-at tartalmazó MÉM táptalajban tartjuk fenn. A minta hozzáadása előtt a sejteket kétszer öblítjük mIL-3-at nem tartalmazó növesztő táptalajjal. Egy kiterjesztett tizenkét pontos TPO standard görbét készítünk, ami 3333 pg/ml-től 39 pg/ml-ig terjed. Minden egyes mintából négy hígítást készítünk, amik a becslések szerint a standard görbe lineáris részére esnek (1000-125 pg/ml), majd 3 párhuzamosban futtatjuk. A minta vagy standard egyes hígításaiból 100 μΐ-t adunk egy 96 lukas mikrotiter lemez megfelelő lukaihoz, amik Inkánként 10000 sejtet tartalmaznak. Negyvennégy óra hosszat tartjuk 37 °C-on, majd 10% CCh-t, MTS-t (egy tetrazólium vegyület, amit a sejtek biológiailag formazánná redukálnak). Körülbelül hat órával később egy lemezleolvasóval 490 nm-en leolvassuk az optikai sűrűséget. Egy dózis-válasz görbét (log TPO koncentráció vs. OD-háttér) állítunk elő, és a standard görbe lineáris részére eső pontok lineáris regressziós elemzését hajtjuk végre. Az ismeretlen teszt-minták koncentrációját a kapott lineáris egyenlet és a higitási faktor felhasználásával határozzuk meg.

Rövidítések

HPLC: nagynyomású folyadékkromatográfia; ESI-MSI: elektronpermet ionizációs tömegspektrometria; MALDI-MS: Mátrix-asszisztált lézer deszorpciós ionizációs tömegspektrometria; PEG: polietilénglikol. Az összes aminosavat a standard hárombetűs vagy egybetüs kódokkal jelöljük. t-Boc: tercButoxikarbonil; tBu: terc-Butil; Bzl: Benzil; DCC: diciklohexilkarbodiimid; HOBt: 1-Hidroxibenztriazol; NMP: N-metil-2-pirrolidinon; Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidro-benzofurán-5-szulfonil; Trt: tritil; Dde: l-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciklohexilidén)etil.

B. Eredmények

TMP tandem dimerek poliglicin linkerekkel

A szekvenciálisán kapcsolt TMP dimerek tervezése azon a feltételezésen alapul, hogy a TMP dimer formájára van szükség a c-Mpl-lel (a TPO receptor) való hatékony kölcsönhatáshoz, és ez attól függ, hogy miképpen tekerednek egymáshoz a receptor kontextusában, és a két TMP molekula egymáshoz van kötve a C-terminális - N-terminális konfigurációban, oly módon, hogy ne zavarják a globális dimer konformációt. Világos, hogy a tandem kapcsolt dimerek aktivitása függhet a linker hosszának és összetételének helyes kiválasztásától, amely linker a két szekvenciálisán illesztett TMP monomer C-terminálisát és N-terminálisát kapcsolja össze. Mivel a c-Mpl-hez kötött TMP-ról nincs strukturális információ, egy sorozat olyan dimer peptidet szintetizáltunk, amiknek a linkerei 0-10 illetve 14 glicin csoportot tartalmaztak (1. táblázat). A glicint azért választottuk, mert egyszerű és flexibilis. Ésszerű feltételezésnek tűnt, hogy egy flexibilis poliglicin peptidlánc lehetővé teszi a két egymáshoz láncolt TMP ismétlődésnek a kívánt konformációba való szabad átalakulását, míg a szférikusán gátoltabb aminosav szekvenciák nemkívánt szekunder struktúrákat vehetnek fel, amiknek a merevsége elrontja a receptor kontextusban levő dimer peptid korrekt pakolódását.

A kapott peptidek könnyen előállíthatok a hagyományos szilárd fázisú peptid-szintézis módszerekkel [Merrifield, R.B.: Journal of the American Chemical Society 85, 2149 (1963)], Fmoc vagy t-Boc kémiát használva. A C-terminálisan kapcsolt párhuzamos dimer (2. számú szekvencia) szintézisétől eltérően, amihez egy ortogonálisán védett lizincsoportra van szükség a kiindulási elágazási ponthoz, amivel a két peptidláncot pszeudoszimmetrikus módon fel lehet építeni [Cwirla, S.E. és

mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)], a mi tandem dimerjeink szintézise egyszerű, lépésenként! összeállítása a peptidláncoknak, a C-terminálistól az N-terminálisig. Mivel a TMP dimerizációjának sokkal dramatikusabb hatása van a proliferatív aktivitásra, mint a kötési aktivitásnak, amint azt a C-terminális dimer esetében kimutatták [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)], a szintetikus peptideknek közvetlenül vizsgáljuk a biológiai aktivitását egy TPO dependens sejtszaporodási vizsgálatban, a teljes hosszúságú c-Mpl-lel transzfektált rágcsáló 32D sejteknek egy interleukin-3 dependens kiónját használva [Palacios, R. és mtsai: Cell 41, 727 (1985)]. Amint azt a vizsgálati eredmények mutatják (lásd az 1. táblázatot az alábbiakban), az összes, poliglicinnel kapcsolt tandem dimer potenciája >1000szerese a monomerének, és ebben a sejtszaporodási vizsgálatban még hatékonyabbak mint a C-terminális dimer. A mi vizsgálatunkban a C-terminális dimer abszolút aktivitása kisebb mint a természetes TPO fehérjéé, ami eltér az előzőkben említett eredményektől, amik szerint a C-terminális dimert ugyanolyan aktívnak találták mint a természetes ligandumot [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)]. Ez valószínűleg a két vizsgálat eltérő körülményeinek köszönhető. Mindazonáltal az aktivitásbeli különbség a tandem dimerek (az első monomer Cterminálisa a második monomer N-terminálisához kötve) és a párhuzamos dimerek (az első monomer C-terminálisa a második monomer C-terminálisához kötve) között ugyanabban a vizsgálatban világosan demonstrálja a tandem dimerizált termékek

felsőbbrendűségét a párhuzamosan dimerizált termékekkel szemben. Érdekes megjegyezni, hogy a linker hosszának széles tartományban való változása is tolerálva van. A kiválasztott monomerekhez (1. számú szekvencia) az optimális linker mérete 8 glicin.

Más tandem dimerek

A TMP tandem dimerek ezen első sorozata után számos más molekulát terveztünk, vagy különböző linkerekkel, vagy a monomerekben végzett módosításokkal. Ezek közül a molekulák közül az első, a 13-as peptid, GPNG linkerrel rendelkezik, amely szekvenciáról ismert, hogy erősen hajlamos béta-kanyar típusú szekunder struktúrák létrehozására. Bár még mindig körülbelül 100-szor hatékonyabb mint a monomer, erről a peptidről kiderült, hogy körülbelül >10-szer kevésbé aktív, mint a GGGG-vel kapcsolt analóg. Tehát egy viszonylag merev béta-kanyar bevitele a linker régióba az optimális agonista konformációhoz viszonyítva láthatóan egy enyhe torzulást okoz a rövid linker formában.

A TMP szekvenciában a Trp9 szekvencia egy erősen konzerválódott csoport a random peptid-könyvtárakból izolált aktív peptidek között. Van egy erősen konzerválódott Trp az EPO mimetikus peptidek konszenzus szekvenciájában, és erről a Trp szekvenciáról kiderült, hogy szerepe van a két EPO mimetikus peptid (EMP) közötti hidrofób mag kialakulásában, és hozzájárul az EPO receptorral való hidrofób kölcsönhatásokhoz [Livnah, O. és mtsai: Science 273, 464-471 (1996)]. Az analógia alapján azt gondoltuk, hogy a TMP-ben a Trp9 csoportnak hasonló funkciója lehet a peptid ligandum dimerizációjában, és egy olyan erőfeszítés során, amikor megpróbáltuk modulálni és megbecsülni a két indolgyürü által kifejtett nem-kovalens hidrofób erők hatását, számos analógot állítottunk elő, amik a Trp mutációjából származtak. így a 14-es pepiidben a Trp csoportot mindkét TMP-ben Cys csoporttal helyettesítettük, és oxidációval egy intramolekuláris diszulfid-híd keletkezett a két cisztein között, amitől azt vártuk, hogy a peptid dimerizációja során utánozza a két Trp közötti hidrofób kölcsönhatást. A 15-ös peptid a 14-es peptid redukált formája. A 16-os peptidben két Trp csoportot helyettesítünk Ala-val. Amint a vizsgálat adatai mutatják, mindhárom analóg inaktív. Ezek az adatok tovább demonstrálják, hogy a Trp fontos a TPO mimetikus peptid aktivitásához, nemcsak a dimer képződéséhez.

Mindkét következő peptid (a 17a és a 18-as peptid) tartalmaz a 8 aminosavból álló linkerében Lys vagy Cys csoportot. Ez a két vegyület prekurzora a két pegilezett pepiidnek (19-es és 20as peptid), amikben a Lys vagy a Cys oldalláncait egy polietilénglikol (PEG) egységgel módosítottuk. Elhatároztuk, hogy egy PEG egységet juttatunk be egy viszonylag hosszú linker közepébe, oly módon, hogy a nagy PEG komponens (5 kDa) elég messze van a peptid-molekulában levő fontos kötési helyektől. A PEG-ről ismert, hogy egy biológiailag kompatibilis polimer, amit egyre inkább használnak kovalens módosítóként, hogy ezzel javítsák a peptid- és fehérje-alapú terápiás szerek farmakokinetikai profilját.

Egy moduláris, oldat-alapú módszert terveztünk a szintetikus vagy rekombináns peptidek egyszerű pegilezésére. A módszer azon a ma már jól kidolgozott kemoszelektív ligálási stratégián alapul, amely a kölcsönösen reakcióképes funkcionalitások párjai közötti specifikus reakciókat használja. Tehát a pegilezett 19-es peptid esetében a lizin oldalláncot egy brómacetil csoporttal elöaktiváljuk, így kapjuk a 17b pepiidet, ami már alkalmas a polietilénglikol tiolszármazékával való reakcióra. Ennek végrehajtásához egy ortogonális védöcsoportot, a Dde-t használjuk a lizin epszilon-alkilcsoportjának megvédésére. Amikor a teljes peptidláncot már összeraktuk, akkor az N-terminális aminról t-Boc-cal eltávolítjuk a védőcsoport. Azután eltávolítjuk a Dde-t, hogy lehetővé tegyük a brómacetilezést. Ezzel a stratégiával jó minőségű nyers pepiidet kapunk, amit könnyen lehet tisztítani a hagyományos fordított fázisű HPLC-vel. A pepiidnek a tiollal módosított PEG-gel való ligálását vizes pufferben hajtjuk végre (pH=8), és a reakció 30 perc alatt teljesen lejátszódik. A tisztított, pegilezett anyag MALDI-MS elemzéséből egy jellegzetes, harang alakú spektrumot kapunk, aminek a szomszédos csúcsai között 44 kDa-os növekedés van. A PEG-20-as peptid esetében egy ciszteincsoportot helyezünk el a linker régióban, és oldalláncának tiolcsoportja szolgál kapcsolódási pontként a maleimidet tartalmazó polietilénglikolhoz. Hasonló körülményeket használunk ennek a pepiidnek a pegilezéséhez. Amint az a vizsgálati adatokból kiderült, ennek a két pe gilezett peptidnek a nem-pegilezett megfelelőikkel összehasonlítva még magasabb is az in vitro biológiai aktivitása.

A 21-es peptid a 8 aminosavból álló linkerében egy potenciális glikozilezési motívumot tartalmaz, az NGS-et. Mivel a példaként megadott tandem dimerek peptidkötésekkel összekötött természetes aminosavakból állnak, egy ilyen molekulának megfelelő eukarióta sejtrendszerben való expressziója egy olyan glikopeptidet eredményez, amiben egy szénhidrát egység kapcsolódik az Asn oldallánc karboxamidjához. A glikozilezés egy általános poszt-transzlációs módosítási eljárás, aminek számos pozitív hatása lehet egy adott fehérje biológiai aktivitására, megnövelve a vizoldhatóságát és in vivo stabilitását. Amint azt az esszé adatai mutatják, ennek a glikozilezési motívumnak a linkerbe való beépítése magas biológiai aktivitást tart fenn. A potenciális glikopeptid szintetikus prekurzorának az aktivitása összehasonlítható a -(Gly)s-kapcsolt analógéval. Ha egyszer glikozileztük, akkor ezektől a peptidektől azt várjuk, hogy ugyanazzal az aktivitási sorrenddel rendelkeznek, mint a pegilezett peptidek, egy PEG és a szénhidrát egység által mutatott hasonló kemofizikai tulajdonságok miatt.

Az utolsó peptid egy dimer dimere. Ezt úgy állítjuk elő, hogy a 18-as peptidet oxidáljuk, ami intermolekuláris diszulfid-hidat képez a linkerben található két ciszteincsoport között. Ezt a peptidet úgy terveztük meg, hogy megcélozza azt a lehetőséget, hogy a TMP tetramerként aktív. A vizsgálati adatok azt mutatják, hogy ez a peptid illesztett moláris alapon nem aktívabb, mint egy átlagos tandem dimer, ami indirekt módon alátámasztja azt az elképzelést, hogy a TMP aktív formája valójában egy dimer, másképpen egy tandem dimer dimerizációjának további hatásai lehetnének a biológiai aktivitásra.

Az alábbi 1. táblázatban összefoglaljuk az előzőkben ismertetett vegyületek biológiai aktivitásait, amiket az előzőkben ismertetett in vitro esszék alapján kiszámított EC50 értékek alapján adunk meg.

1. táblázat

	Vegyület (EC50)	Relatív
		haté-
		konyság
	TPO	4,0
	TMP monomer (1. számú szekvencia)	1,0
	TMP C-C dimer (2. számú szekvencia)	3,5
	TMP-(Gly)n-TMP:
1	n=0	4,5
2	n=l	4,0
3	n=2	4,0
4	n=3	4,0
5	n=4	4,0
6	n=5	4,0
7	n=6	4,0
8	n=7	4,0
9	n=8	4,5

10	n=9 4,0
11	n=10 4,0
12	n=ll 4,0

1. táblázat (folyt.) Vegyület (EC50) Relatív hatékonyság

TMP-GPNG-TMP3,0 (10. számú szekvencia) 140,5

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (11. számú szekvencia)

150,5

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (12. számú szekvencia)

160,5

IEGPTLRQALAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQALAARA (13. számú szekvencia)

17a TMP-GGGKGGGG-TMP4,0 (15. számú szekvencia)

17b TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMPNA

15. számú szekvencia 18 TMP-GGGCGGGG-TMP5,0 (17. számú szekvencia) 19 TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP5,0 (17. számú szekvencia) 20 TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP5,0 (18. számú szekvencia)

1. táblázat (folyt.)

Vegyület (EC50)

Relatív hatékonyság 4,0

4,0

TMP-GGGNGSGG-TMP (19. számú szekvencia) 22 TMP- GGGCGGGG-TMP

TMP-GGGCGGGG-TMP (20. számú szekvencia)

MEGJEGYZÉS: Az 1. táblázatban a számok az aktivitásnak körülbelül 1 logaritmusát jelentik, tehát az „1” és „4” közötti különbség körülbelül 1000-szeres. A 0,5-ös növekedés egy intermedier pont, így tehát az „1” és „3,5” aktivitások közötti különbség körülbelül 500-szoros. „NA” jelentése: nincs meghatározva

II. Az alábbiakban példaként olyan módszereket adunk meg, amikkel az előzőkben ismertetett második csoportba tartozó vegyületeket lehet előállítani

A. A 6C. ábrán bemutatott típusú Fc fúziós vegyület előállítása

Egy DNS szekvenciát, ami a humán IgGl Fc régióját kódolja, leolvasási fázisban fúzionáltatva a TPO-mimetikus peptid dimerjéhez (34. számú szekvencia), az alábbiak szerint a luxR promoter vezérlése alá helyezzük, a pAMG2 plazmid vektorban.

• ·· ····· • ·· *4 * ·· *4*

A fúziós gént standard polimeráz láncreakciós technikával állítjuk elő. A polimeráz láncreakció templátjai az Fc szekvenciát kódoló Fc szekvencia és egy szintetikus gén, ami a 34. számú szekvencia szerinti vegyület további részét kódolja. A szintetikus gént 4 átlapoló nukleotidból állítjuk elő, az alábbiak szerint:

1830-52 AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT (35. számú szekvencia)

1830-53 ACC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC (36. számú szekvencia)

1830-54 GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA (37. számú szekvencia)

1830-54 AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC CTC CGC CGC C (38. számú szekvencia)

A 4 oligonukleotidot egymáshoz illesztve kapjuk az alábbi duplexet:

AAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCT 1--------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ go

CCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGA KGGGGGI EGPTLRQWLAARA

GGTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCA ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 120 CCACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGT GGGGGGGGIEGPTLRQWLAA

CGCGCA --------------------------- 148 GCGCGTATTAGAGCTCTAGGAAAAAAA

RA*

39. számú szekvencia: [A 1830-52 és a 1830-54 ko-lineáris oligonukleotidok]

40. számú szekvencia: [A 1830-53 és a 1830-55 ko-lineáris oligonukleotidok] és a 41. számú szekvencia: [ a kódolt aminosav szekvencia].

Ezt a duplexet egy polimeráz láncreakcióban amplifikáljuk, a 1830-52-es és a 1830-55-ös oligonukleotidot használva értelmes és antiszensz primerként.

A molekula Fc részét egy polimeráz láncreakcióban állítjuk elő, primerként az Fc DNS-t használva.

1216-52 AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G (42. számú szekvencia)

1830-51 TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAGACAGGG

AGAGGCTCTTCTGC (43. számú szekvencia)

A 1830-51-es és a 1830-52-es oligonukleotidok 24 nukleotidból álló átfedést tartalmaznak, ami lehetővé teszi, hogy a két gén helyes leolvasási fázisban fúzionáljon, a fenti polimeráz láncreakciós termékeket egy harmadik reakcióban kombinálva, külső primereket, azaz a 1216-51-et és 1830-55-öt használva.

A végső polimeráz láncreakció génterméket (a teljes hosszúságú fúziós gén) Xbal és BarnHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pAMG21 vektorba ligáljuk (lásd alább), majd szintén Xbal és BarnHI restrikciós enzimmel emésztjük. A ligáit DNS-t Escherichia coli 2596 (GM221, lásd az alábbiakban) kompetens gazdasejtekbe transzformáljuk. A kiónoknak vizsgáljuk a képességét, hogy tudnak-e rekombináns fehérjeterméket termelni, és rendelkeznek-e a helyes nukleotid szekvenciát tartalmazó génfúzióval. A fehérje expressziós szintjét 50 ml-es rázott lombikos vizsgálatban határozzuk meg. A teljes sejtlizátumokat vizsgáljuk a fúzió expressziója szempontjából, Coomassie Blue-val festett poliakrilamid gélelektroforézis géleken.

A fúziós fehérje aminosav szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be, a megfelelő nukleotid szekvenciával együtt:

Xbal

TCTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGACAAAACTCACACATGTC 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

AGATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCTGTTTTGAGTGTGTACAG

MDKTHTCP

CACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC 61---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------- + ₁₂o

GTGGAACAGGTCGAGGCCTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTG PCPAPELLGGPSVFLFPPKP

CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA 121---------+---------+---------+---------+---------++ 180

GGTTCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTCCAGTGTACGCACCACCACCTGCACT KDTLMISRTPEVTCVVVDVS

GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG 181-240

CGGTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTAC

HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA

CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA 241---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------* 300

GGTTCTGTTTCGGCGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGT KTKPREEQYNSTYRVVSVLT

CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG 301---------+---------+---------+---------+---------++ 360

GGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTC VLHQDWLNGKEYKCKVSNKA

CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC 361---------+---------+---------+---------+---------++ 420

GGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTG LPAPIEKTISKAKGQPREPQ

AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT 421---------+---------+---------+---------+---------++ 480

TCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGA

VYTLPPSRDELTKNQVSLTC

GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC 481---------+---------+---------+---------+---------++ 540

CGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCG LVKGFYPSDIAVEWESNGQP

GGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT 54 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+600

GCCTCTTGTTGATGTTCTGGTGCGGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGA ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG 601---------+---------+---------+---------+---------+---------+660

TGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGC SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA 661---------+---------+---------+---------+---------++ 720

ACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT MHEALHNHYTQKSLSLSPGK

AAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTG 721----— —780

TTCCACCTCCACCACCATAGCTTCCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGAC GGGGGIEGPTLRQWLAARAG

GTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCAC 781---------+---------+---------+---------+---------++ 840

CACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGTG GGGGGGGIEGPTLRQWLAAR

BamHI

GCGCATAATCTCGAGGATCCG 841---------₊---------₊ _ ₈₆₁

CGCGTATTAGAGCTCCTAGGC A

44. számú szekvencia: [egyszálú lánc, leolvasása 5'-3']

45. számú szekvencia: [egyszálú lánc, leolvasása 3'-5']

46. számú szekvencia: [a kódolt aminosav szekvencia] pAMG21

A pAMG21 expressziós plazmid az ATCC-től szerezhető meg (letéti szám 98113, letétbe helyezve 1996. július 24-én).

GM221 (Amgen gazdatörzs #2596)

Az Amgen #2596 gazdatörzs egy Escherichia coli K-12 törzs, amit úgy módosítottak, hogy tartalmazza mind a hőmérséklet-érzékeny cI858s7 lambda represszort a korai ebg régióban, és a lacIQ represszort a késői ebg régióban (68 perc). Ennek a két új represszor génnek a jelenléte lehetővé teszi ennek a gazdaszervezetnek számos különböző expressziós rendszerben való használatát, bár mindkét említett represszor irreleváns a luxPR-ről való expresszió szempontjából. A nem-transzformált gazdaszervezet nem antibiotikum rezisztens.

A cI857s7 gén riboszómális kötőhelyét módosítottuk, hogy tartalmazzon egy javított RBS-t. Ezt az ebg operonba építettük be a 1170-1141-es nukleotidok közé, amely számozás a Genbank M64441Gb_Ba számozásának felel meg, a megszakító ebg gén kivágásával.

A konstrukciót egy kromoszómába juttatjuk be, egy MMebg-cI857s7 javított RBS #4-gyel, az F'tet/393-ba. A rekombináció és a felbontás után csak az előzőkben ismertetett inszert marad a sejtben. Ennek az új neve F'tet/GM 101.

Az F'tet/GM 101-et azután módosítjuk egy lacIQ konstrukciónak az ebg operonnak a 2493-2937-es nukleotidjai közé való bejuttatásával, amely számozás a Genbank M64441Gb_Ba számozásának felel meg, a megszakító ebg gén kivágásával.

A konstrukciót a kromoszómába egy AGebg-LacIQ#5 nevű rekombináns fággal juttatjuk be az F'tet/GM101-be. A rekombi náció és a felbontás után csak az előzőkben ismertetett inszert marad a sejtben. Ennek az új neve F'tet/GM221. Az F'tet episzómát LB táptalajban 25 pg/ml koncentrációjú akridin-narancssal kiirtjuk a törzsből. A tisztított törzset azon az alapon azonosítjuk, hogy tetraciklin rezisztens, és a GM221 néven tároljuk.

A pAMG21 plazmidban levő Fc fúziós konstrukciót (amit a továbbiakban pAMG21-Fc-TMP-TMP néven említünk) tartjuk, ami viszont a GM221 gazdatörzsben tartunk (ATCC letéti száma 98957, a letétbe helyezés időpontja 1998. október 22.).

Expresszió

Az Escherichia coli GM221 tenyészetben levő pAMG21-FcTMP-TMP-t, amely tenyészetet 40 pg/ml kanamicint tartalmazó Luria Broth táptalajban tenyésztünk, az indukció előtt 37 °C-on inkubálunk. Az Fc-TMP-TMP géntermék expresszióját a luxPR promoterröl az alábbi szintetikus auto-indukálószernek 20 ng/ml végkoncentrációban a tenyészközeghez való hozzáadásával érjük el: N-(3-oxohexanoil)-DL-homoszerin lakton, majd a tenyészeteket további 3 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. 3 óra elteltével a bakteriális tenyészeteket mikroszkóppal vizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e zárványtesteket, majd centrifugálással összegyűjtjük őket. A fénytörő zárványtesteket az indukált tenyészetekben figyelhetjük meg, jelezve, hogy az Fc-TMP-TMP Escherichia coZí-ban legnagyobb valószínűséggel az oldhatatlan frakcióban termelődik. A sejtüledékeket közvetlenül lizáltatjuk, Laemmli mintafelvivő pufferben reszuszpendálva, ami 10% β merkaptoetanolt tartalmaz, majd SDS-PAGE-val elemezzük. Az SDS-PAGE gélen egy Coomassie Blue-val intenzíven festődö, körülbelül 30 kDa méretű csík volt megfigyelhető. A várt géntermék 269 aminosavat tartalmaz, és a várt molekulasúlya körülbelül 29,5 kDa. A fermentációt 10 literes méretben is elvégeztük, standard sarzs-körülmények között, ekkor az Fc-TMP-TMP expressziós szintje hasonló volt a laboratóriumi szinthez.

Az Fc-TMP-TMP tisztítása

A sejteket vízben tárjuk fel (1/10) nagynyomású homogenizációval (2 átpréselés 96,5 Mpa nyomáson), majd a zárványtesteket centrifugálással nyerjük ki (4200 per perc fordulatszám, J-6B centrifugában, 1 óra hosszat). A zárványtesteket 6 mol/1 guanidin, 50 mmol/1 TRIS, 8 mmol/1 DTT pH=8,7 összetételű oldatban szolubilizáljuk, 1 óra hosszat, 1/10 arányban. A szolubilizált keveréket 20-szorosra hígítjuk, 2 mol/1 karbamid, 50 mmol/1 TRISZ, 160 mmol/1 arginin, 3 mmol/1 cisztein pH=8,5 összetételű oldattal. A keveréket éjszakán át szobahőmérsékleten hidegben kevertetjük. Az eljárásnak ebben a pontjában az FcTMP-TMP monomer alegység dimerizálódik, így jön létre a diszulfid-hiddal összekapcsolt vegyület, aminek a struktúráját a 6C. ábrán láthatjuk, majd ultraszúréssel körülbelül tízszeresre töményítjük. Ezután háromszorosra hígítjuk 10 mmol/1 TRISZ, 1,5 mol/1 karbamid pH=9 összetételű oldattal. Ennek a keveréknek a pH-ját ecetsavval 5-re állítjuk. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, majd a felülúszót SP-Sepharose Fast Flow oszlopra visszük, amit 20 mmol/1 nátrium-acetát, 100 mmol/1 nátrium klorid pH=5 összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba (10 mg/ml felvitt fehérje, szobahőmérséklet). A fehérjét 20 oszloptérfogatnyi gradienssel eluáljuk, amit az előzőkben ismertetett pufferben készítünk el, és 100-500 mmol/1 nátrium-klorid a terjedelme. Az oszlopról lejött pool-t háromszorosra hígítjuk, majd SP-Sepharose HP oszlopra visszük, 20 mmol/1 nátrium-acetát, 150 mmol/1 nátrium-klorid pH=5 összetételű oldatban (10 mg/ml fehérje, szobahőmérséklet). A fehérjét 20 oszloptérfogatnyi gradienssel eluáljuk, amit az előzőkben ismertetett pufferben készítünk el, és 150-400 mmol/1 nátrium-klorid a terjedelme. A csúcsot egyesítjük és megszűrjük.

III. Az alábbiakban a találmány szerinti különböző vegyületekkel egerekben kapott in vivo adatok összefoglalását adjuk meg

Egerek

Normális nőstény BDFI egerek, életkoruk 10-12 hét.

Vérvételi terv

Csoportonként tíz egeret kezelünk a nulladik napon, két csoport 4 nap különbséggel indul, és csoportonként összesen 20 egér van. Az egyes időpontokban öt egértől veszünk vért, és az egerektől minimum hetente háromszor veszünk vért. Az egereket isoflurane-nal érzéstelenítjük, és összesen 140-160 μΐ vért veszünk tőlük, orbitális sinus kilyukasztásával. A vért Technikon

HIE vérelemzővel mérjük meg, amin a rágcsáló vérre készített szoftver fut. A mért paraméterek: fehér vérsejtszám, vörös vérsejtszám, hematokrit, hemoglobin, vérlemezke, neutrofilek.

Kezelések

Az egereket vagy szubkután injekciózzuk plusz bólusz kezelést kapnak, vagy egy hétnapos mikro-ozmotikus pumpát építünk be a folyamatos bejuttatás céljából. A szubkután injekciókat 0,2 ml térfogatban juttatjuk be. Az ozmotikus pumpákat érzéstelenített egerek lapockái közé a bőrbe tett szubkután bevágással visszük be. A vegyületeket 0,1% BSA-t tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldattal hígítjuk. Minden kísérletben van egy kontroll csoport, ennek a jelzése „hordozó”, amiket csak ezzel a higítószerrel kezelünk. A vizsgált anyagok koncentrációját ezekben a pumpákban úgy állítjuk be, hogy a pumpákból a kalibrált áramlási sebesség a grafikonokon megadott kezelési szinteket adja.

Vegyületek

A vegyület dózis-titrálását az egereknek hétnapos mikroozmotikus pumpákkal juttatjuk be. Az egereket a különböző vegyületekkel egyetlen 100 pg/kg dózissal kezeljük, hétnapos ozmotikus pumpákkal. Ezek közül a vegyületek közül néhányat egyetlen bolus injekcióban adunk be az egereknek.

Az aktivitási teszt eredményei

Az aktivitási kísérlet eredményeit a 4. és 5. ábrán mutatjuk be. A dózis-válasz vizsgálatokban, amikhez hétnapos mikroozmotikus pumpákat használunk (nem közölt adatok), a maximális hatást a 18. számú szekvenciával rendelkező vegyülettel kaptuk, 100 pg/kg/nap dózisban, a 10 pg/kg/nap dózis körülbelül 50%-a a maximális aktivitásnak és az 1 pg/kg/nap a legalacsonyabb dózis, aminél ebben a rendszerben aktivitás egyáltalán megfigyelhető. A vegyület 10 pg/kg/nap dózisa körülbelül azonos aktivitású mint a 100 pg/kg/nap nem-pegilezett rHu-MGDF, ugyanabban a kísérletben.

IV. Megbeszélés

Az teljesen elfogadott, hogy az MGDF hasonló módon hat mint a humán növekedési hormon (hGH), azaz a fehérje ligán dumnak egy molekulája két receptor molekulát köt meg az aktiválásához [Wells, J.A.: Annu. Rév. Biochem. 65, 609-634 (1996)]. Ezt a kölcsönhatást utánozza a sokkal kisebb TMP hatása. Azonban a jelen vizsgálatok azt sugallják, hogy ehhez a mimikrihez két TMP molekula összehangolt akciójára van szükség, mivel a TMP kovalens dimerizációja akár a C-C párhuzamos, akár az N-C soros módon körülbelül tízszeresre fokozza az eredeti monomer in vitro biológiai hatását. A monomer viszonylag alacsony biológiai hatása valószínűleg a nem-kovalens dimer nem eléggé hatásos képződésének a következménye. Egy előre kialakult kovalens dimernek megvan a képessége, hogy eliminálja az entrópia korlátot egy nem-kovalens dimer képződése előtt, amit kizárólag gyenge nem-kovalens kölcsönhatások hajtanak a kis, 14 csoportból álló peptid két molekulája között.

Érdekes megjegyezni, hogy a legtöbb tandem dimer sokkal hatásosabb mind a C-terminális párhuzamos dimer. Úgy tűnik, hogy a tandem dimerizáció a molekulának egy jobban illeszkedő konformációt biztosít, mint a C-C párhuzamos dimerizáció. Egy tandem látszólag aszimmetrikus tulajdonsága közelebb viheti a természetes ligandumhoz, ami, mivel egy aszimmetrikus molekula, két különböző helyet használ a két azonos receptor molekula megkötésére.

A PEG egység beviteléről azt gondoltuk, hogy fokozza a módosított peptid in vivo aktivitását, védelmet biztosítva a proteolítikus lebomlással szemben, és lelassítva a vesén keresztül való kiürülését. Váratlan volt, hogy a pegilezés emellett tovább fokozhatja egy tandem dimerizált TMP peptid in vitro biológiai aktivitását a sejtalapú szaporodási vizsgálatban.

V. Az alábbiakban a találmány szerinti különböző vegyületekkel majmokban kapott in vivo adatok összefoglalását adjuk meg

Ahhoz, hogy kiértékeljük az AMP2 szubkután beadásával kezelt nőstény rhesus majmokkal kapott hematológiai paramétereket, az alábbi protokollt terveztük meg és alkalmaztuk. Öt darab, 3-3 majomból álló csoportot állítunk össze. Az 1-es csoport a kontroll, ez csak acetát puffért kap (20 mmol/1 nátrium acetát, 0,25 mol/1 nátrium-klorid, pH=5), ami sem AMPP2-t, sem pegilezett, rekombináns humán MGDF-et (PEG-rHuMGDF) nem tartalmaz. A 2-es csoport egy vagy több AMP2 dózist kap, az alábbiakban jelzett intervallumokban; a 3-as csoport 1000 pg/kg AMP2-t kap az alábbiakban jelzett intervallumokban; a 4-es csoport 5000 pg/kg AMP2-t kap az alábbiakban jelzett intervallumokban; és az 5-ös csoport 100 pg/kg PEG-rHuMGDFet kap az alábbiakban jelzett intervallumokban.

Azt a napot, amelyen az első egyetlen dózist beadjuk, az egyes ciklus nulladik napjának nevezzük. A kettes ciklusban a dózisokat a 21., 23., 28., 30. és 32. napon adjuk be. A 3-as ciklusban egyetlen dózist adunk be a 84. napon, és a 4-es ciklusban egyetlen dózist adunk be a 123. napon. Az állatokon az akklimatizációs periódusban naponta egyszer figyeljük a klinikai tüneteket, a dózisos napokon naponta háromszor (a dózis előtt, a dózis után közvetlenül 30 perc múlva és a dózis után 2-3 órával), valamint a dózismentes napokon naponta egyszer. A táplálékfogyasztást naponta számítjuk ki, az egyes állatoknak kiadott kiadott ételdarabok és a megmaradt ételdarabok száma alapján, a megfigyelést 7 nappal a dózisos periódus előtt kezdve, egészen a regenerálódási periódus végéig. Az egyes állatok testsúlyát a dózisos periódus előtt kétszer mérjük meg, és még kétszer megmérjük a dózisos periódusban és a regenerálódási periódusban. A hematológiához a vérmintákat a dozírozás megkezdése előtt egyszer készítjük el, majd egyszer elkészítjük az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 15., 20., 22., 24., 26., 29., 31., 33., 35., 37., 39., 41.,

43., 45., 47., 49., 55., 62., 69., 76., 83., 85., 87., 89., 91., 93., 95., 97., 99., 101., 103., 105., 11., 122., 124., 126., 128., 130., 132., 134., 136., 138., 140., 142., 144., 150. napon. A farmakokinetikai elemzéshez 0,5 ml szérummintát veszünk egyszer a dozírozás előtt, és a dozirozás után 1, 4 és 24 órával. A mintáikat a 0., 21., 32., 84. és 123. napon vesszük le, majd az elemzésig -70 °C-on tartjuk. Az ellenanyag elemzéshez 2 ml vérmintát veszünk az egyetlen dózis előtt egy héttel, majd naponta egyszer a 0. napon (a dózis előtt), majd a 6., 13., 20., 34., 41., 55., 62., 76., 83., 90., 97., 104., 111., 118., 129., 136., 143. és 150. napon. A mintákat az elemzésig -70 °C-on tároljuk.

Az eredmények azt mutatják, hogy a vérlemezke számok minden kezelt csoportban nőnek, és a legnagyobb változás a PEG-rHuMGDF csoportban és a magas dózisü AMP2 csoportban figyelhető meg. Az 1-es ciklusban a vérlemezke értékek körülbelül 3,3-szeresre nőttek, míg 3,1-szeresre nőttek a PEG-rHuMGDF csoportban (9. nap) és az 5000 pg/kg AMP2 csoportban (9. nap), a kontroll csoport átlagos vérlemezke számával összehasonlítva. Az alacsony dózisü AMP2-nél a vérlemezke számok a kontrollnak körülbelül 15-szeresére nőttek, ugyanazon a vizsgálati napon. Hasonló válaszok voltak megfigyelhetők minden más ciklusban is.

Azonban a 4-es ciklusban a PEG-rHuMGDF csoport nem mutatott ugyanolyan nagy vérlemezke szám növekedést mint az előző ciklusokban. A PEG-rHuMGDF csoportban a vérlemezke szám körülbelül kétszerese mint a kontroll csoportban kapott szám, 9 nappal az ebben a csoportban beadott dózis után. Összehasonlításként, a legmagasabb dózisú AMP2 csoportban a 4-es ciklusban az átlagos vérlemezke szám 3,3-szer magasabb mint a kontroll csoportban. Emellett a PEG-rHuMGDF-fel kezelt állatokban a 4-es ciklus kezdetén (per dózis) az átlagos vérlemezke szám 53%-kal alacsonyabb mint a kontroll állatok átlagos vérlemezke száma, és a 4-es ciklus végén* (27 nappal a dózis után) az átlagos vérlemezke szám 79%-kal alacsonyabb mint a kontroll csoportban. Mindegyik AMP2 állat esetében az átlagos vérlemezke szám a 4-es ciklus elején és végén ±15%-os eltéréssel ugyanaz, mint a kontroll csoportban.

Az 1-es és 2-es ciklusban mindegyik kezelt csoportban a vörös vérsejtek (WS) csökkenésének trendje volt megfigyelhető a kontrollal összehasonlítva. A csökkenés a 41. és 43. napon a legnyilvánvalóbb, és a WS szám legnagyobb csökkenését a PEGrHuMGDF csoportnál lehetett megfigyelni. A vörös vérsejt számok legkorábban a 47. napon kezdtek visszatérni a normális szintre (a kontrollal összehasonlítva). Az 1-es és 2-es ciklusban a 33. napon a fehér vérsejt (FVS) szintek drámaian megnőttek a kontrollal összehasonlítva. A 33. napon enyhe növekedés figyelhető meg az 5000 pg/kg AMP2 csoportnál. Az értékek a 37. napon kezdtek visszatérni a normális (kontroll) szintre. Hasonló válasz volt megfigyelhető a 3-as ciklusban, és a 4-es ciklusban nem volt megfigyelhető válasz a fehér vérsejt számban, egyetlen kezelt csoportban sem.

A 3-as ciklusban a 13. napra az összes kezelt csoportban enyhén csökkent a vörös vérsejt szám (az egyetlen 3-as ciklus dózis után), az 500 pg/kg AMP2 csoport kivételével. A vörös vérsejt értékek a normál szintre (a kontrollal összehasonlítva) a 17. napon kezdtek visszatérni.

A 4-es ciklusban a vörös vérsejt számok minden kezelt csoportban csökkentek a kontrolihoz viszonyítva, az 500 pg/kg AMP2 csoport kivételével. Más ciklusoktól eltérően egynél több mélypont volt megfigyelhető ebben a ciklusban. Ezek a csökkenések a dózis után 1-9 nappal léptek fel, és legkorábban 11 nappal később kezdtek normalizálódni.

Az eredmények azt mutatják, hogy a vérlemezke számokban a kontroll állatokkal összehasonlítva mindegyik állatban növekedés volt kimutatható a dózis után 7-9 nappal, az összes vizsgált ciklusban. Úgy tűnt, hogy az ismételt dózis fázis erősebb választ adott a vérlemezke termelésben mint az egyetlen dózisos fázisokban. A 4-es ciklusra a PEG-rHuMGDF által kiváltott vérlemezke válasz a korábbi ciklusokkal összehasonlítva alacsonyabb, és a magas dózisú AMP2 válasszal összehasonlítható. A legtöbb kezelt csoportnál vörös vérsejt számok csökkenése figyelhető meg az 1-es, 2-es, 3-as és 4-es ciklusban, a vizsgálat minden ciklusának valamelyik pontjában, azonban a dózis megszakítása után minden hematológiai paraméter visszatért a normális szintre (a kontrollal összehasonlítva).

Összegezve, ezek az eredmények azt mutatják, hogy az AMP2-vel végzett kezelést a rhesus majmok jól tolerálták, és az

AMP2 a vérlemezke számok növekedését eredményezte a kezelés különböző ciklusaiban. Kiderült, hogy a vérlemezke szám eredmények alapján nincs biológiailag szignifikáns immun-közvetített válasz az AMP2-re. Ezzel ellentétben a különböző ciklusokban PEG-rHuMGDF-fel végzett kezelés nem mutatta a vérlemezke válasz gátlását a 4-es ciklusig, sugallva, hogy PEG-rHuMGDF elleni ellenanyagok keletkeztek, és ezek az anti-MGDF ellenanyag keresztreakciót adnak az endogén rhesus TPO-val.

Az alábbiakban ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.

SZEKVENCIA LISTA <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <2U> 14 <212>Fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 1

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá <210> 2 <211> 14 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <220>

< 223> A peptid egy homodimer egy alegysége: a dimerben levő alegységek kovalens kötéssel kapcsolódnak egymáshoz az egyes C-terminálison, peptidkötésen keresztül, az

NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(CONH2)-NH-CO-CH2-CH2-NH2-vel <400> 2

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 684 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 3 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgt ccagctccgg aactcctggg gggaccgtca60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc360 aaagqgcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc420 aaqaaccagg tcaqcctgac ctgcctggtc aaaqgcttct atcccagcga catcgccgtg480 gagt-.qgqaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgccr.cc cgtgctggac540

r.ccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag660 agcctctccc tgtctccggg taaa684 <210> 4 <211> 684 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 4 tacctgtttt gagtgtgtac aggtggaaca ggtcgaggcc ttgaggaccc ccctggcagt60 cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg tgggagtact agagggcctg gggactccag120 tgtacgcacc accacctgca ctcggtgctt ctgggactcc agttcaagtt gaccatgcac180 ctgccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc240 atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttacc gttcctcatg300 ttcacqttcc agaggttgtt tcgggagggt cgggggtagc tcttttggta gaggtttcgg360 t-.ttcccgt.cg gggctcttgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggccct actcgactgg420 ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tagggtcgct gtagcggcac480 ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg540 aggctgccga ggaagaagga gatgtcgttc gagtggcacc tgttctcgtc caccgtcgtc600 cccttgcaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgcgtcttc660 tcggagaggg acagaggccc attt684 <210>5 <211> 228 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 5

Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val

3540

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

1015

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

2530

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr

70 7580

Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp LeuAsn

9095

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

100 105110 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin

115 120125

Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai

130 135140

Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie AlaVai

145 150 155160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr ThrPro

165 170175

Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185190

Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai

195 200205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu

210 215220

Ser Pro Gly Lys

225 <210> 6 <211> 8

100 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400>6

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly

5 <210> 7 <211> 8 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 7

Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly

101 <210> 8 < 211>8 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 8

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly

5 <210> 9 < 211>4 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 9

Gly Pro Asn Gly

102 <210> 10 <211> 32 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 10 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro 15 10 15

Asn Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala

25 30 <210> 11 < 211> 36 <212>fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <220>

< 223> Ciklikus peptid; a szekunder struktúrát diszulfld-híd tartja fenn a 9-es és 31-es pozícióban levő Cys csoportok között

103 <400> 11 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 12 < 211> 36 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 12 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Arg Leu Gin Cys Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 13

104 < 211> 36 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 13

ΓLe Glu Gly Pro Thr Lou Arg Gin Ala Leu Ala Ala Arg Ala GLy Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Ala Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 14 <211> 36 <212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 14 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

105

5 10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 15 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A 18-as pozícióban levő Lys csoport brómacetilezve van <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid-származék <400> 15 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 16

106 < 211> 36 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 16

Tie GLu GLy Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 17 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A 18-as pozícióban levő Lys pegilezve van <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid-származék

107 <400> 17

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 18 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A 18-as pozícióban levő Cys pegilezve van <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid-származék <400> 18 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala

108 <210> 19 < 211> 36 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 19 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Asn Gly Ser Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 20 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

109 < 223> Egy homodimer monomer alegysége; A homodimerben levő alegységeket minden egyes alegységben a 18-as pozícióban levő Cys csoportok közötti diszulfid-híd köti össze <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 20

[Le Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Alá <210> 21 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 21

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly no .··..··.·*·:.·

Gly Gly Gly Gly Gly Gly lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 22 < 211> 32 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptidből az N-terminálisán készült származék egy kova lensen kötött immunglobulin Fc régióval <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 22

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Pro

10 15

Asn Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá

25 30 <210> 23 <211> 32

Ill < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához és N-terminálisához <22O>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 23 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Pro

10 15

Asn Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá

25 30 <210> 24 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

112

·.· ·..· .*::j <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 24

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 25 < 211> 34 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 25

Gly Gly He 1	Glu Gly 5	Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá
10	15
Gly Pro Asn	Gly He	Glu Gly Pro Thr Leu	Arg Gin Trp Leu Ala Alá

113

Arg Ala <210> 26 <211> 36 <212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 26 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Alá 35 <210> 27 <211> 36 <212> fehérje

114 < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

< 223> Ciklikus peptid; a szekunder struktúrát a 9-es és 31-es pozícióban levő Cys csoportok közötti diszulfid-hid tartja fenn <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 27

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu

25 30

Ala Ala Arg Alá

115 <210> 28 <211> 36 <212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 28

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly

5 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu

25 30

Ala Ala Arg Alá <210> 29 <211> 36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

116 < 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához < 400> 29

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Ala Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly

10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Alá Leu

25 30

Ala Ala Arg Alá 35 <210> 30 <211> 36 <212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 30

117

Tie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Ala <210> 31 < 211> 36 < 212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid < 400> 31

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Alá

118 <210> 32 <211> 36 <212> fehérje < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: pepiid <220>

< 223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <400> 32

He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly 15 10 15

Gly Asn Gly Ser Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Alá <210> 33 <211> 36 <212> fehérj <213> mesterséges szekvencia

119 <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <220>

<223> A peptid egy homodimer alegysége; A homodimerben levő alegységek az egyes alegységek 18-as pozíciójában levő Cys csoportok közötti diszulfid-hidak révén kovalens kötéssel vannak összekötve <220>

<223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <400> 33 lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Ala Ala Arg Alá <210> 34 <211> 41 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

120 <223> A mesterséges szekvencia leírása: pepiid <220>

<223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <400> 34

Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Alá

1015

Ala Arg Alá Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr

2530

Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá 3540 <210> 35 <211> 60 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 35 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 <210> 36

121 <211> 48 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 36 acctccacca ccagcacgag cagccagcca ctgacgcaga gtcggacc <210> 37 <211> 66 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 37 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 60 cgcgca <210> 38 <211> 76

122 <212* DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 38 aaaaaaagga tcctcgagat tatgcgcgtg ctgcaagcca ttggcgaagg gttgggccct 60 caatacctcc gccgcc 76 <210> 39 <211> 126 <212> DNS < 213> mesterséges szekvencia <220>

< 223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid < 400> 39 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 120 cgcgca 126 <210> 40 <211> 124

123 .

. .. .: .. . , . • ········ .·>

f · · · · · · · · · <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 40 ccaggctqag acgcagtcac cgaccgacga gcacgaccac cacctccacc gccgcctcca 60

r.aactcccgq gttgggaagc qgttaccqaa cgtcgtgcgc gtatr.aqaqc tcctaqqaaa 120 aaaa 124 <210> 41 <211> 42 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 41

Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

10 15

Ala Ala Arg Alá Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro

25 30

Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Alá

124 <210> 42 <211> 22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 42 aacataaqta cctqtaqqat cq 22 <210> 43 <211> 52 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 43 ttcqatacca ccacctccac ctttacccqg agacaqqgaq aqgctcttct qc 52 <210> 44

125 <211> 861 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 44 tctagatttg ttttaactaa ttaaaggagg aataacatat ggacaaaact cacacatgtc60 caccttgtcc agctccggaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac120 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga180 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg240 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca300 ccgt-.cctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag360 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac420 aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct480 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc540 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg660 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta720 aaggtggagg tggtggtatc gaaggtccga ctctgcgtca gtggctggct gctcgtgctg780 gtggtggagg tggcggcgga ggtattgagg gcccaaccct tcgccaatgg cttgcagcac840 gcgcataatc tcgaggatcc g861 <210> 45 <211> 861 <212> DNS

126 <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <400> 45 agatctaaac aaaattgatt aatttcctcc ttattgtata cctgttttga gtgtgtacag60 gtggaacagg tcgaggcctt gaggaccccc ctggcagtca gaaggagaag gggggttttg120 ggttcctgtg ggagtactag agggcctggg gactccagtg tacgcaccac cacctgcact180 cggtgcttct gggactccag ttcaagttga ccatgcacct gccgcacctc cacgtattac240 ggtCctgttt cggcgccctc ctcgtcatgt tgtcgtgcat ggcacaccag tcgcaggagt300 ggcaggacgt ggtcctgacc gacttaccgt tcctcatgtt cacgttccag aggttgtttc360 gggagggtcg ggggtagctc ttttggtaga ggtttcggtt tcccgtcggg gctcttggtg420 tccacatgtg ggacgggggt agggccctac tcgactggtt cttggtccag tcggactgga480 cggaccagtt tccgaagata gggtcgctgt agcggcacct caccctctcg ttacccgtcg540 gcctct.tgtt gatgttctgg tgcggagggc acgacctgag gctgccgagg aagaaggaga600 tgtcgttcga gtggcacctg ttctcgtcca ccgtcgtccc cttgcagaag agtacgaggc660 actacgtact ccgagacgtg ttggtgatgt gcgtcttctc ggagagggac agaggcccat720 ttccacctcc accaccatag cttccaggct gagacgcagt caccgaccga cgagcacgac780 caccacctcc accgccgcct ccataactcc cgggttggga agcggttacc gaacgtcgtg840 cgcgtattag agctcctagg c861 <210> 46 <211> 269 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

127 <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 46

Met Asp Lys Thr 1

Gly Gly

Met lie

His Glu

Vai His

Tyr Arg

Gly Lys lie Glu

Vai Tyr

130

Ser Leu

145

Glu Trp

Pro Ser

Ser Arg 35

Asp Pro

Asn Ala

Vai Vai

Glu Tyr

100

Lys Thr 115

Thr Leu

Thr Cys

Glu Ser

His Thr

Vai Phe

Thr Pro

Glu Vai

Lys Thr

Ser Vai 85

Lys Cys

He Ser

Pro Pro

Leu Vai

150

Asn Gly 165

Cys Pro

Leu Phe

Glu Vai

Lys Phe 55

Lys Pro

Leu Thr

Lys Vai

Lys Ala

120

Ser Arg 135

Lys Gly

Gin Pro

Pro Cys

Pro Pro 25

Thr Cys

Asn Trp

Arg Glu

Vai Leu

Ser Asn 105

Lys Gly

Asp Glu

Phe Tyr

Glu Asn

170

Pro Ala

Lys Pro

Vai Vai

Tyr Vai

Glu Gin 75

His Gin

Lys Ala

Gin Pro

Leu Thr

140

Pro Ser 155

Asn Tyr

Pro Glu

Lys Asp

Vai Asp 45

Asp Gly

Tyr Asn

Asp Trp

Leu Pro

110

Arg Glu 125

Lys Asn

Asp He

Lys Thr

Leu Leu

Thr Leu

Vai Ser

Vai Glu

Ser Thr

Leu Asn

Ala Pro

Pro Gin

Gin Vai

Ala Vai

160

Thr Pro

175

Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180

185

190

Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai

195

200

205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu

210

215

220

Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Arg

225

230

235

240

Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly He

245

250

255

Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala

260

265

A találmányt az előzőkben teljes részletességgel ismertettük, és a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy számos módosítás és változtatás tehető benne, anélkül hogy eltérnénk a találmány oltalmi körétől.

Claims (34)

1. 'ÍTÉTELI ^:·.^:· ·..’· ·’.’.’· ·,.^{: :}.J

   SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és szerkezetét a

   TMPi-(Li)h-TMP₂ általános képlettel lehet leírni, amiben TMPi és TMP₂ jelentése egymástól függetlenül az alapvető vegyületek alábbi csoportjából választható struktúrának felel meg

   X₂-X3-X4-X₅-X6-X7-X₈-X9-Xio amiben

   X₂-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

   Xa-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

   X4 jelentése Pro;

   Xs-öt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

   Xó-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, He, Val, Alá és Phe;

   Χγ-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   Χβ-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

   Xo-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr és Phe;

   Xio-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, He, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

   Li egy, az alábbiakban ismertetett linker; és n értéke 0 vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amiben TMPi-et és TMP₂-t egymástól függetlenül az alábbi csoportból választhatjuk ki:

   130

   X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11;

   X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12;

   X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13;

   X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

   X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11;

   Xi- Χ₂-Χ₃-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10-Χ11-Χ1₂;

   Xi- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13;

   Xi- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

   amikben X2-X10 jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk;

   Xi-et az alábbi csoportból választjuk ki: He, Alá, Val, Leu, Ser és Arg;

   Xn-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, He, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His és Glu;

   Xi2-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, He, Val, Leu, Phe, Gly, Ser és Gin;

   Xi3-at az alábbi csoportból választjuk ki: Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Gly; és

   Xi4-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, He, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amiben az említett TMPi-nek és/vagy a TMPa-nek a származékai szerepelnek, amiket az alábbiakban megadott közül eggyel vagy többel állítjuk elő:

   a peptidil (-CO(O)NR-] kapcsolatok (kötések) közül egyet vagy többet egy nem-peptidil kötéssel helyettesítünk, azaz példá

   131 ul egy -CHa-karbamát kötéssel [-CH2-OC(O)NR-]; egy foszfonát kötéssel; egy -CH2-szulfonamid [-CH2-S(O)2NR-] kötéssel; egy karbamid [-NHC(O)NH-] kötéssel; egy -CH2- szekunder amin kötéssel; vagy egy alkilezett peptid kötéssel [-C(O)NR⁶, amiben R⁶ jelentése alkilcsoport];

   a peptidekben az N-terminálisból egy -NRR¹ csoporttal; egy -NRC(O)R csoporttal; egy -NRC(O)OR csoporttal; egy NRS(O2)R csoporttal; egy NHC(O)NHR csoporttal készítünk származékot, amikben R¹ jelentése hidrogénatom vagy alacsony szénatomszámú alkilcsoport, azzal a feltétellel, hogy R és R¹ egyszerre nem lehet hidrogénatom; egy szukcinimid csoport; egy benziloxikarbonil-NH-(CBZ-NH-) csoport; vagy egy benziloxikarbonil-NH-csoport, ami a fenilgyürün 1-3 helyettesítést tartalmaz, amely helyettesítőket az alábbi csoportból választunk ki: alacsony szénatomszám alkilcsoport, alacsony szénatomszám alkoxi csoport, klóratom és brómatom; és azok a peptidek, amikben a szabad C-terminálisból a C(O)R²-vel készítünk származékot, amiben R²-t és R4-et egymástól függetlenül az alábbi csoportból választjuk ki: hidrogénatom és alacsony szénatomszámú alkilcsoport.
4. 4. Az 1. igénypont szerint vegyület, amiben az összes Á aminosav konfigurációja D.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amiben legalább egy I amino savnak D konfigurációja van.

   s· '
6. 6. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ami ciklikus.

   132
7. 7. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amiben TMPi és TMP2 jelentése egyaránt Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (1. számú szekvencia)
8. 8. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ahol Li egy pepiidet tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti vegyület, amiben Li tartalmazza Yn-t, és Y jelentése egy természetes aminosav, vagy annak sztereoizomerje, és n értéke 1-20.
10. 10. A 8. igénypont szerinti vegyület, amiben Li tartalmazza (Gly)n-t, n értéke 1-20 között van, és ha n értéke egynél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a felét egy másik aminosawal helyettesíthetjük, amit a többi 19 természetes aminosav közül választhatunk ki, vagy lehet annak sztereoizomerje.
11. 11. A 8. igénypont szerinti vegyület, amiben Li-et az alábbi csoportból választhatjuk ki:

    (Gly)3Lys(Gly)4 (6. számú szekvencia);

    (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (7. számú szekvencia);

    (Gly)3Cys(Gly)4 (8. számú szekvencia); és

    GlyProAsnGly (9. számú szekvencia)
12. 12. A 8. igénypont szerinti vegyület, amiben Li tartalmaz egy Cys csoportot.
13. 13. A 12. igénypont szerinti vegyület dimerje.
14. 14. A 13. igénypont szerinti dimer, aminek a szerkezete

    i.

    az alábbi:

    TMPi-Gly₃-Cys-Gly4-TMP₂

    133

    TMPi-Gly₃-Cys-Gly4-TMP₂
15. 15. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amiben Li (CHaJn-t tartalmaz, és n értéke 1-20.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (9. számú szekvencia)

    IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (ciklikus) (10. számú szekvencia)

    IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineáris) (11. számú szekvencia)

    IEGPTLRQALAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQALAARA (12. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (13. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGK(BrAc)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (14. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (15. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGK(PEG)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (16. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGC(PEG)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (17. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGNGSGGG- IEGPTLRQWLAARA (18. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA

    134

    IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (19. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (20. számú szekvencia)
17. 17. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület, aminek az általános képlete:

    (Fc)_m-(L₂)_q-TMPi-( L₂)n-TMP₂-(L₃)r-(Fc)p amiben Li, L₂, és L₃ jelentése linkercsoport, amiket egymástól függetlenül az itt ismertetett linkercsoportok közül választunk ki:

    Y_n, aholis Y jelentése egy természetes aminosav, vagy annak sztereoizomerje, és n értéke 1-20;

    (Gly)n, amiben n értéke 1-20, és ha n értéke 1-nél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a fele helyettesíthető egy másik aminosawal, amit a többi természetes aminosav, vagy azok sztereoizomerei közül választunk ki;

    (Gly)₃Lys(Gly)4 (6. számú szekvencia);

    (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (7. számú szekvencia);

    (Gly)₃Cys(Gly)4 (8. számú szekvencia); és

    GlyProAsnGly (9. számú szekvencia) egy Cys csoport; és (CH₂)_n, amiben n értéke 1-20, az Fc egy immunglobulin Fc régiója; m, p, q és r értéke egymástól függetlenül 0 és 1, és m vagy p közül legalább az egyik 1, továbbá ha m egyenlő 0-val, akkor q értéke is 0, és ha'p értéke 0, akkor r értéke 0, valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

    135
18. 18. A 17. igénypont szerinti vegyület, amiben Li-et, La-t és La-at egymástól függetlenül az Y_n-t tartalmazó csoportból választhatjuk, amiben Y-t, a természetes aminosavak, vagy azok sztereoizomerjei közül választhatjuk ki, és n értéke 1-20.
19. 19. A 18. igénypont szerinti vegyület, amiben Li (Gly)_n-t tartalmaz, és n értéke 1-20 között van, és ha n értéke egynél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a felét egy másik aminosawal helyettesíthetjük, amit a többi 19 természetes aminosav közül választhatunk ki, vagy lehet annak sztereoizomerje.
20. 20. A 18. igénypont szerinti vegyület, amiben Li-et az alábbi csoportból választhatjuk ki:

    (Gly)3Lys(Gly)4 (6. számú szekvencia);

    (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (7. számú szekvencia);

    (Gly)3Cys(Gly)4 (8. számú szekvencia); és

    GlyProAsnGly (9. számú szekvencia).
21. 21. A 18. igénypont szerinti vegyület, amiben Li, L2 vagy L3 Cys csoportot tartalmaz.
22. 22. A 21. igénypont szerinti vegyület dimerje
23. 23. A 17. igénypont szerinti vegyület, amiben Li, L2 vagy L3 (CH2)n csoportot tartalmaz, és n értéke 1-20.
24. 24. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (21. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (22, számú szekvencia)

    136

    Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (23. számú szekvencia)

    Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (24. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA
25. 25. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (ciklikus) (26. szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineáris) 27. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (28. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (29. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (30. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (31. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA

    Fc-IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (32. számú szekvencia)

    Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (33. számú szekvencia)

    25. Eljárás a megakariociták vagy vérlemezkék számának növelésére egy erre szoruló betegben, azzal jellemezve, hogy az

    137 említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be az 1. igénypont szerinti vegyületből.
26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett mennyiség körülbelül 1 pg/kg és 100 mg/kg között változik.
27. 27. Gyógyászatilag elfogadható készítmény, ami az 1. igénypont szerinti vegyületet tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve.
28. 28. Polinukleotid, ami a 8. igénypont szerinti vegyületet kódolja.
29. 29. Polinukleotid, ami a 13. igénypont szerinti vegyületet kódolja.
30. 30. Polinukleotid, ami a 18. igénypont szerinti vegyületet kódolja.
31. 31. Polinukleotid, ami a 22. igénypont szerinti vegyületet kódolja.
32. 32. Vektor, ami a 28-31. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidot tartalmazza.
33. 33. Gazdasejt, ami a 32. igénypont szerinti vektort tartalmazza.

    138
34. 34. Eljárás a 8., 13., 18. vagy 22. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a 33. igénypont szerinti gazdasejtet megfelelő táptalajon szaporítjuk, majd az említett vegyületet izoláljuk az említett sejtből vagy táptalajból.

    A meghatalmazott:

    iQ. Szentpéteri Adá az S.B.G.

    U| badalmi Üg

    i Iroda

    H-106 TUefon: 461-