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ES2595453T3 - Método enzimático para producir L-metionina a partir de un precursor y metilmercaptano - Google Patents

Método enzimático para producir L-metionina a partir de un precursor y metilmercaptano Download PDF

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ES2595453T3
ES2595453T3 ES13178074.4T ES13178074T ES2595453T3 ES 2595453 T3 ES2595453 T3 ES 2595453T3 ES 13178074 T ES13178074 T ES 13178074T ES 2595453 T3 ES2595453 T3 ES 2595453T3
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methionine
strain
precursor
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homoserine
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Kwang-Myung Cho
Yong-Uk Shin
Hye-Won Um
Kyung-Oh Choi
Jin-Sook Chang
Young-Wook Cho
Young-Hoon Park
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CJ CheilJedang Corp
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Abstract

Un método para producir L-metionina que comprende: i) cultivar una cepa productora de precursor de L-metionina en una solución de fermentación, de tal forma que el precursor de L-metionina que es un compuesto de O-acilhomoserina de fórmula 1 se acumula en la solución de fermentación;**Fórmula** y ii) añadir una enzima convertidora y metilmercaptano o sus diferentes formas a la solución de fermentación para convertir el precursor de L-metionina en L-metionina; en donde R de la fórmula 1 es una sustancia que incluye C, H, O, N y otros compuestos con 15 átomos de carbono como máximo y en donde la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa i) se caracteriza por una expresión o actividad potenciada de homoserina O-succinil transferasa o de homoserina O-acetil transferasa.

Description

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independientemente del contenido de metionina del medio y así la adición de metionina al medio facilita la síntesis de precursor de L-metionina y el crecimiento de las células.
Para aumentar la producción de O-acetilhomoserina a partir de cepa productora de O-succinilhomoserina, se puede eliminar el gen metA que codifica homoserina O-succinil transferasa que existe en el cromosoma. Cuando se inhibe la producción de O-succinilhomoserina por eliminación del gen metA y se produce O-acetilhomoserina por introducir adicionalmente gen metX, se puede producir O-acetilhomoserina con un rendimiento superior al obtenido en el caso de introducir el gen metX en presencia del gen metA.
También es posible aumentar la producción de O-succinilhomoserina en la cepa productora de O-acetilhomoserina eliminando el gen metX que codifica homoserina O-acetil transferasa que existe en el cromosoma de la cepa. Cuando se inhibe la producción de O-acetilhomoserina por eliminación del gen metX y se produce Osuccinilhomoserina introduciendo adicionalmente gen metA, se puede producir O-succinilhomoserina con un mayor rendimiento.
La O-succinilhomoserina o la O-acetilhomoserina, precursor de L-metionina, se pueden acumular en una cepa aprovechando una parte del proceso completo de las anteriores etapas 1 a 4.
La cepa productora de precursor de L-metionina se puede preparar a partir de la cepa que produce L-lisina, Ltreonina o L-isoleucina. Preferiblemente, se puede preparar usando la cepa productora de L-treonina. Con esta cepa, la síntesis de homoserina ya es mayor y, como resultado, la producción de precursor de metionina puede aumentar. Así, se puede acumular precursor de metionina eliminando o debilitando un gen implicado en la ruta de biosíntesis de treonina y a continuación el gen metA o metY o metZ, usando cepa productora de L-treonina. Es más preferible eliminar o debilitar el gen thrB primero y a continuación el metB, metY o metZ para sintetizar el precursor de metionina. Mientras tanto, el potenciamiento de la expresión génica de metA o metX da como resultado el incremento de precursor de metionina.
La “cepa productora de L-treonina” se refiere a una cepa de microorganismo procariótico o eucariótico que es capaz de producir L-treonina in vivo. Por ejemplo, la cepa puede incluir cepas de microorganismos que producen L-treonina que pertenecen a Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. y Brevibacterium sp. Entre estos, los microorganismos Escherichia sp. son los preferidos, y más preferido es el Escherichia coli.
La cepa productora de L-treonina incluye no solo los microorganismos naturales sino también sus mutantes, representados por microorganismos que presenta un requerimiento de isoleucina y que son resistentes a análogos de L-lisina y ácido α-aminobutírico; y son mutados mediante la introducción adicional de al menos una copia extra de gen endógeno de fosfoenol piruvato carboxilasa (ppc); y son desactivados en el gen pckA implicado en el proceso de conversión de oxaloacetato (OAA) que es un intermedio de la síntesis de L-metionina en fosfoenol piruvato (PEP); y son desactivados en gen tyrR que inhibe la expresión de gen tyrB implicado en la biosíntesis de Lmetionina; y son desactivados en gen galR que inhibe la expresión de gen galP implicada en el transporte de glucosa. Los análogos de L-lisina en el presente documento pueden ser uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en S-(2-aminoetil)-L-cisteína y δ-metil-L-lisina.
En una realización preferida de la presente invención, se usó CJM002, la cepa productora de L-treonina e independiente de L-metionina mutada a partir de TF4076 (KFCC 10718, Patente Coreana Nº 92-8365), la cepa mutante de E. coli productora de L-treonina. La TF4076 tiene un requerimiento para metionina, y es resistente a análogos de metionina (por ejemplo, ácido α-amino-β-hidroxi valérico, AHV), a análogos de lisina (por ejemplo, S-(2aminoetil)-L-cisteína, AEC), y a análogos de isoleucina (por ejemplo, ácido α-aminobutírico). La TF4076 no es capaz de sintetizar metionina in vivo debido a que es la cepa que presenta un requerimiento para metionina. Para usar esta cepa como cepa productora de metionina de la invención libre de un requerimiento para metionina, los inventores de la presente prepararon la cepa productora de L-treonina de E. coli CJM002 libre del requerimiento para metionina empleando una mutación artificial usando NTG. La CJM002 de E. coli fue denominada Escherichia coli MF001 y se depositó en el KCCM (Korean Culture Center of Microorganism, Edif. Eulim, Hongje-1-Dong, Seodaemun-Ku, Seúl, 361-221, Corea), el 9 de abril de 2004 (Nº de Acceso: KCCM-10568). También se depositó la CJM-BTJ (pMetA-CL) de Escherichia coli productora de O-succinilhomoserina, preparada por el método anterior, el 21 de julio de 2006 (Nº de Acceso: KCCM-10767) y la CJM-BTJ (pCJ-MetA-CL) de Escherichia coli se depositó el 5 de julio de 2007 (Nº de Acceso: KCCM-10872). La CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) de Escherichia coli productora de O-acetilhomoserina, preparada mediante el método anterior de la invención, también se depositó el 5 de julio de 2007 (Nº de Acceso: KCCM-10873).
El cultivo de la cepa productora de precursor de L-metionina preparado anteriormente se puede llevar a cabo mediante un medio apropiado usando las condiciones conocidas por los especialistas en la técnica. Los especialistas en la técnica entienden sobradamente que el método de cultivo se puede usar ajustando fácilmente según la cepa seleccionada. Por ejemplo, el método de cultivo que incluye, aunque sin limitación, el cultivo por cargas, continuo y por cargas alimentado. En la siguiente referencia se describe una variedad de métodos de cultivo: “Biochemical Engineering” por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pág. 138-176.
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Para la reacción de conversión biológica, se clona un gen procedente de la secuencia génica obtenida, que a continuación es introducido en un vector de expresión. La enzima se expresa en forma activa a partir de una cepa recombinante. Tanto la cepa que expresa enzima como la enzima expresada pueden usarse directamente para la reacción.
5 Las enzimas expresadas a partir de los anteriores genes o las cepas microbianas que expresan dichas enzimas pueden mezclarse directamente, parcialmente o no, con el sobrenadante de fermentación o con el caldo de fermentación acumulado con precursor de L-metionina para iniciar la reacción. En una realización preferida de la invención, la O-succinil homoserina o la O-acetil homoserina acumuladas en la disolución de fermentación pueden
10 ser convertidas en metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u Osuccinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas sp., Chromobacterium sp., Leptospira sp. o Hyphomonas sp.
Más preferiblemente, la O-succinilhomoserina acumulada en la disolución de fermentación es convertida en 15 metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida o Chromobacterium violaceum.
Más preferiblemente, la O-succinil homoserina acumulada en la disolución de fermentación es convertida en metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina 20 sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida o Chromobacterium violaceum.
La O-acetilhomoserina acumulada en la disolución de fermentación es convertida en metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Leptospira meyeri, Hyphomonas neptunium o Chromobacterium violaceum.
25 Se expresaron todos los genes en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea), el vector de expresión para E. coli, y la proteína expresada se obtuvo a partir de la disolución enzimática preparada mediante lisis celular usando ultrasonidos. Se añadió la disolución enzimática a la disolución de fermentación acumulada en O-succinil homoserina u O-acetil homoserina, y también se añadió disolución de metilmercaptano para iniciar la reacción. La reacción fue confirmada
30 usando DTNB (ácido 5,5-ditiobis(2-nitro-benzonico), Sigma, EE.UU.) y el producto de reacción fue analizado mediante HPLC.
En el presente método, se pueden obtener adicionalmente subproductos tales como ácido succínico o ácido acético, sin un proceso de producción separado, mediante reacción de CH3SH con O-succinil homoserina y O-acetil 35 homoserina, respectivamente.
Breve Descripción de las Figuras
La aplicación de las realizaciones preferidas de la presente invención se entiende mejor haciendo referencia a las 40 figuras anexas, en las que:
Figura 1: es un diagrama que ilustra la manipulación genética de la cepa productora de precursor de metionina. Figura 2: es un diagrama que ilustra las estructuras químicas del proceso de 2 etapas para la producción de metionina.
45 Figura 3: es un diagrama esquemático de pMetA-CL para la expresión de gen metA. Figura 4: es un diagrama esquemático de pCJ-MetB-CL para la expresión de gen metB. Figura 5: es un gráfico que muestra las curvas de reacción que ilustran los consumos de O-succinil homoserina por varias enzimas.
50 El origen de cada disolución enzimática es como se indica a continuación. La disolución enzimática nº 21 es un extracto celular que no contiene un gen específico.
Cepa
Número de cepa (ATCC) Nombre del gen (KEGG) Especificidad de sustrato
OSH
OAH
Escherichia coli K 12
55151 MetB + +
Pseudomonas aurogenosa
17933 MetZ +++ +
MetY
++++ ++++
Pseudomonas putida
17390 MetZ ++++ +
Corynebacteria glutamicum
13032 MetB + +
MetY
+ +
Leptospira meyeri
43278 MetY + ++
Saccharomyces cerevisiae
2704 Met25 + +
Chromobacterium violaceum
12472 MetZ ++++ +++
Nocardia farcinica
3318 MetZ ++++ +
Bradyrhizobium japonicum
10324 MetZ + +
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Cepa
Número de cepa (ATCC) Nombre del gen (KEGG) Especificidad de sustrato
OSH
OAH
Hyphomonas neptunium
49408 MetZ + ++++
Methylococcus capsulatus
19069D-5 MetZ + +
Methylobacillus flagellatus
51484D MetZ + +
Nitrosomonas europaea
19718D MetZ + +
Klesiella pneumoniae
25955 MetB + +
Bacillus subtilis
10783 MetB + +
Shigella flexneri 2457T
700930D-5 MetB + +
Figura 6: es un gráfico que muestra las curvas de reacción que ilustran los consumos de O-acetil homoserina para varias enzimas. Cada número es tal como se muestra en la Figura 5.
Figura 7: es un diagrama que ilustra la secuencia de aminoácidos de cada enzima usada para la reacción de conversión dispuesta mediante megalign de DNAstar.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Construcción de una cepa productora de precursor de metionina
<1-1> Eliminación de gen metB
Para eliminar el gen metB que codifica cistationina sintasa en la cepa de E. coli, se llevó a cabo una eliminación por PCR FRT de una etapa (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645). Los cebadores de la SEQ. ID NO: 1 y NO: 2 fueron usados para PCR usando el vector pKD3 (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645) como plantilla, dando como resultado la construcción de la casete de eliminación. La PCR se llevó a cabo como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto.
El producto de PCR fue sometido a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de la purificación de ADN obtenido a partir de la banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado fue sometido a electroporación en E. coli (K12) W3110 transformado con vector pKD46 (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645). Antes de la electroporación, el W3110 transformado con pKD46 fue cultivado a 30ºC en medio LB que contenía 100 µg/l de ampicilina y 5 mM de 1arabinosa hasta alcanzar una DO600 de 0,6. A continuación, la cepa cultivada se lavó dos veces con agua esterilizada destilada y una vez más con glicerol al 10%. La electroporación se llevó a cabo a 2500 V. La cepa recuperada se llevó a una placa de medio LB que contenía 25 µg/l de cloranfenicol, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se llevó a cabo usando la cepa seleccionada como plantilla con los mismos cebadores indicados anteriormente y en las mismas condiciones. La eliminación del gen metB se identificó confirmando el gen de 1,2 kb de tamaño sobre el gel de agarosa al 1,0%. A continuación, la cepa fue transformada con vector pCP20 (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645) y se cultivó en medio LB. Se construyó una cepa final con metB bloqueado en la que el tamaño del gen metB se redujo hasta 150 pb sobre gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol había sido eliminado. La cepa construida se denominó W3-B.
<1-2> Eliminación de gen thrB
Los inventores intentaron aumentar la síntesis de O-succinil homoserina a partir de homoserina por eliminación del gen thrB que codifica homoserina quinasa. Particularmente, cuando se usa una cepa productora de treonina, la eliminación de dicho gen fue bastante necesaria debido a que la actividad de uso de homoserina fue muy fuerte. Para la eliminación del gen thrB en la cepa W3-B construida antes, se llevó a cabo una eliminación con PCR de una etapa FRT del mismo modo descrito anteriormente para la eliminación de gen metB.
Para construir la casete de eliminación de thrB, se llevó a cabo una PCR usando un vector pKD4 (PNAS (2000) vol.
97: P6640-6645) como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 3 y NO: 4 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto. El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido a partir de la banda de 1,6 kpb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3-B transformada con vector pKD46. La cepa recuperada se llevó a placa de medio LB que contenía 50 µg/l de kanamicina, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se llevó a cabo usando la cepa seleccionada como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 3 y NO: 4 en las mismas condiciones indicadas anteriormente. La eliminación del gen ThrB fue identificada seleccionando la cepa
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Otro método para sobreexpresar el gen metX se realizó llevando a cabo una PCR que usa el cromosoma de Corynebacterium como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 68 y NO: 69 como se indica a continuación; 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación de ADN. El fragmento de ADN recuperado se ligó a vector pCL1920 usando promotor CJ1 y EcoRV. Se transformó E. coli con el vector ligado, que a continuación fue cultivado en medio LB que contenía 50 µg/l de espectinomicina, seguido de selección. El vector así construido se denominó pCJ-MetXcgl-CL. La cepa W3-BTj se transformó con dicho vector. La cepa construida se denominó W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL y se observó un aumento del nivel de O-acetil homoserina.
<1-4-3> Eliminación de gen metA
Para aumentar la producción de O-acetil homoserina, se eliminó el gen metA que codifica homoserina O-succinil transferasa en la cepa W3-BTJ. En base al descubrimiento de que solo la introducción de gen metX dio como resultado la acumulación de O-succinil homoserina, se esperaba que la eliminación del gen metA diera como resultado la promoción de la acumulación de O-acetil homoserina (Tabla 3). Para eliminar el gen metA, se llevó a cabo una PCR de una etapa FRT.
Para construir la casete de eliminación de metA, se llevó a cabo una PCR con los cebadores de SEQ ID NO: 70 y NO: 71 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación de ADN aislado a partir de la banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado fue sometido a electroporación en la cepa de E. coli W3-BTJ transformada con el vector pKD46. La cepa recuperada fue llevada a placa de metido LB que contenía cloranfenicol, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
Se llevó a cabo una PCR usando la cepa seleccionada como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 70 y NO: 71 en las mismas condiciones utilizadas antes. La eliminación del gen metA se identificó confirmando un gen de 1,1 kb de tamaño sobre gel de agarosa al 1,0%. A continuación, la cepa fue transformada con vector pCP20 y cultivada en medio LB. Se construyó una cepa final con metA bloqueado en la que el tamaño del gen metA se redujo hasta 100 kb sobre gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol había sido eliminado. La cepa construida se denominó W3-BTJA. La cepa W3-BTJA fue transformada con el vector pCJ-MeTXlme-CL y la cepa resultante se denominó W3-BTJA/pCJ-MetX-CL. La cepa fue cultivada del mismo modo que se ha descrito anteriormente y como resultado no se observó acumulación de O-succinil homoserina, sino que la producción de O-acetil homoserina aumentó significativamente, aproximadamente en un 20%, en comparación con la W3-BTj.
<1-5> Conversión de cepa productora de L-treonina
Se construyeron cepas productoras de precursor de metionina del mismo modo que se describe en los Ejemplos <11> a <1-3> usando E. coli DJM002 (KCCM-10568), la cepa productora de L-treonina libre del requerimiento para metionina. Las cepas construidas fueron denominadas CJM-BTJ, CJM-BTJ/pMetA-CL y CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL, respectivamente. También se construyó la cepa con gen metA bloqueado de la misma manera descrita en <1-4-3> usando la cepa CJM-BTJ y la cepa resultante se denominó CJM-BTJA.
Ejemplo 2: Fermentación para la producción de precursor de L-metionina
<2-1> Experimento de cultivo en matraz
Para investigar la capacidad de producción de precursor de metionina de la cepa construida en el Ejemplo 1, se llevó a cabo un cultivo en matraz Erlenmeyer. Se cultivaron W3-BTJ, CJM-BTJ y W3-BTJ transformados con vector de expresión de metA y metX en medio de placa LB que contenía espectinomicina a 31ºC durante una noche. Se inoculó una única colonia en 3 mL de medio LB que contenía espectinomicina, seguido del cultivo a 31ºC durante 5 horas. La disolución del cultivo se diluyó 1:200 en un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenía 25 mL de medio de producción de precursor de metionina, seguido de cultivo a 31ºC, 200 rpm durante 64 horas. Se llevó a cabo un análisis de HPLC para comparar con la capacidad de producción de precursor de metionina (Tabla 2 y Tabla 3). Como resultado, la capacidad de producción de metionina aumentó significativamente en la cepa productora de precursor de metionina preparada a partir de la cepa productora de L-treonina libre del requerimiento para metionina.
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[Tabla 4]
Composición de medio de fermentador para la producción de precursor de metionina
Composición
Medio de siembra Medio principal Medio alimentado
Glucosa (g/l)
10,1 40 600
MgSO4·7H2O (g/l)
0,5 4,2
Extracto de levadura (g/l)
10 3,2
KH2PO4
3 3 8
Sulfato de amonio (g/l)
6,3
NH4Cl (g/l)
1
NaCl (g/l)
0,5
Na2HPO4·12H2O (g/l)
5,07
DL-Metionina (g/l)
0,5 0,5
L-Isoleucina (g/l)
0,05 0,5 0,5
L-Treonina (g/l)
0,5 0,5
[Tabla 5]
Producción de precursor de metionina en un fermentador
O-succinil homoserina (g/l)
O-acetil homoserina (g/l)
CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL
>80 0
CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL
0 >55
5 Ejemplo 3: Producción de enzima convertidora de metionina
<3-1> Cistationina gamma sintasa derivada de E. coli
Se clonó el gen metB que codifica cistationina gamma sintasa derivada de E. coli, que se usaría para la conversión 10 de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de E. coli como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 13 y NO: 14 como se indica a continuación; 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
15 El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NcoI/HindIII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ-Corea) digerido con las mismas enzimas. El vector resultante fue denominado pCJ-MetB-CL y en la Figura 4 se muestra el diagrama esquemático. Se transformó E. coli W3110 con el vector clonado y a continuación se cultivó en medio de placa LB que contenía 50 µg/l de espectinomicina, seguido de selección de colonia. La colonia seleccionada fue inoculada en
20 3 mL de medio LB que contenía 50 µg/l de espectinomicina, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. Las células de cultivo fueron recuperadas, lavadas con tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5), suspendidas en 200 µL de tampón de fosfato potásico, y lisadas con ultrasonidos 5 veces a intervalos de 30 segundos. El lisato celular se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos y se obtuvo el sobrenadante para cuantificar el nivel total de proteína usando una disolución de cuantificación de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad, EE.UU.). La expresión de proteínas se
25 identificó mediante SDS-PAGE. El sobrenadante obtenido del extracto celular se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-2> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp.
30 Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp., que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina. Como microorganismos Pseudomonas sp., se usaron la Pseudomonas aeruginosa y la Pseudomonas putida.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de cada cepa como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 15 y
35 NO: 16 para la Pseudomonas aeruginosa y los cebadores de SEQ ID NO: 17 y NO: 18 para la Pseudomonas putida como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/PacI y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las 40 mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <1-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
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5
15
25
35
45
55
65
<3-8> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Chromobacterium sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Chromobacterium violaceum, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Chromobacterium violaceum como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 29 y NO: 30 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-9> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Nocardia sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Nocardia farcinica, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Nocardia farcinica como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 31 y NO: 32 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-10> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Bradyrhizobium sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Bradyrhizobium japonicum, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Bradyrhizobium japonicum como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 33 y NO: 34 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-11> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas neptunium, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Hyphomonas neptunium como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 35 y NO: 36 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con BamHII/HindIII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-12> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Methylococcus sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Methylococcus capsulatus, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Methylococcus capstulatus como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 37 y NO: 38 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
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actividades enzimáticas. Otras enzimas también mostraron algún grado de actividad, pero sus velocidades de reacción fueron relativamente bajas. En la Tabla 6 se presentan las reactividades de cada enzima con cada sustrato. Tras completar una hora de reacción, se aplicó análisis de HPLC para confirmar las producciones finales de metionina y ácido succínico. Los resultados se muestran en la Tabla 8.
[Tabla 6]
Reacción de conversión de O-succinil homoserina y O-acetil homoserina mediante enzimas derivadas de cada cepa
Cepa
Nº de cepa (ATCC) Gen (KEGG) Especificidad de sustrato
OSH
OAH
Escherichia coli K12
55151 MetB + +
Pseudomonas aurogenosa
17933 MetZ +++ +
MetY
++++ ++++
Pseudomonas putida
17390 MetZ ++++ +
Corynebacterium glutamicum
13032 MetB + +
MetY
+ +
Leptospira meyeri
43278 MetY + ++
Saccharomyces cerevisiae
2704 Met25 + +
Chormobacterium violaceum
12472 MetZ ++++ +++
Nocardia farcinica
3318 MetZ ++++ +
Bradyrhizobium japonicum
10324 MetZ + +
Hyphomonas neptunium
49408 MetZ + ++++
Methylococcus capsulatus
19069D-5 MetZ + +
Methylobacillus flagellatus
51484D MetZ + +
Nitrosomas europaea
19718D MetZ + +
Klesiella pneumoniae
25955 MetB + +
Bacillus subtilis
10783 MetB + +
Shigella flexneri 2475T
700930D-5 MetB + +
Cowwellia psychrerythraea
BAA-618D MetB + +
Salmonella entérica serovar paratyphi A
9150D MetB + +
[Tabla 7]
Capacidad de producción de metionina y ácido succínico a partir de O-succinil homoserina para cada enzima
Enzima, gen
Cantidad de metionina (g/l) Cantidad de ácido succínico (g/l)
Corynebacterium glutamicum, metB
0,05 0,03
Escherichia coli, metB
0,14 0,1
Nocardia farcinica, metZ
0,21 0,17
Pseudomonas putida, metZ
0,22 0,17
Pseudomonas aurogenosa, metZ
0,22 0,17
Chromobacterium violaceum
0,22 0,17
Pseudomonas aurogenosa, metY
0,21 0,17
10 [Tabla 8]
Producción de metionina y ácido acético a partir de O-acetil homoserina para cada enzima
Enzima, gen
Cantidad de metionina (g/l) Cantidad de ácido acético (g/l)
Pseudomonas aurogenosa, metY
0,22 0,081
Chromobacterium violaceum, metZ
0,18 0,068
Hyphomonas neptunium, metZ
0,22 0,082
Corynebacterium glutamicum, metY
0,05 0,015
Leptospira meyeri, metY
0,15 0,05
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