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ES2546484T3 - Producción de carotenoides en levadura y hongos oleaginosos - Google Patents

Producción de carotenoides en levadura y hongos oleaginosos Download PDF

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ES2546484T3
ES2546484T3 ES11167788.6T ES11167788T ES2546484T3 ES 2546484 T3 ES2546484 T3 ES 2546484T3 ES 11167788 T ES11167788 T ES 11167788T ES 2546484 T3 ES2546484 T3 ES 2546484T3
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fungus
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polypeptides
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Richard Bailey
Kevin T. Madden
Joshua Trueheart
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Abstract

Un hongo Yarrowia recombinante, caracterizado por que: a) el hongo es oleaginoso por que puede acumular lípidos hasta al menos 20 % de su peso celular seco; y b) el hongo produce al menos un carotenoide, y puede acumular el carotenoide producido hasta al menos 1 % de su peso celular seco; en el que el hongo comprende una modificación carotenogénica, la modificación confiere al hongo la capacidad de producir el al menos un carotenoide hasta un nivel de al menos 1 % de su peso celular seco, la modificación carotenogénica aumenta la expresión o actividad de los siguientes polipéptidos carotenogénicos: polipéptido de GGPP sintasa, polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa, y polipéptido de HMG CoA reductasa, en el que los polipéptidos carotenogénicos derivan de un grupo de microorganismos que consiste en: Y. lipolytica, M. circinelloides, S. cerevisiae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.

Description

Producción de carotenoides en levadura y hongos oleaginosos
Antecedentes de la invención
Los carotenoides son pigmentos orgánicos que varían en su color de amarillo a rojo que se producen de forma natural por ciertos organismos, incluyendo organismos fotosintéticos (por ejemplo plantas, algas, cianobacterias), y algunos hongos. Los carotenoides son responsables del color naranja de las zanahorias, así como del rosa en los flamencos y el salmón, y del rojo en las langostas y camarones. Los animales, sin embargo, no pueden producir carotenoides y deben recibirlos a través de su dieta.
Los pigmentos de carotenoides (por ejemplo, -caroteno y astaxantina) se usan de forma industrial como ingredientes para alimentos y piensos, tanto cumpliendo una función nutricional como potenciando la aceptación del consumidor. Por ejemplo, la astaxantina se usa ampliamente en acuicultura de salmón para proporcionar la coloración naranja característica de sus homólogos silvestres. Algunos carotenoides también son precursores de vitamina A. Además, los carotenoides tienen propiedades antioxidantes, y pueden tener diversos beneficios para la salud (véase, por ejemplo, Jyonouchi et al., Nutr. Cancer 16: 93, 1991; Giovannucci et al., J. Nati. Cancer Inst. 87: 1767, 1995; Miki, Pure Appl Chem 63: 141, 1991; Chew et al., Anticancer Res. 19: 1849, 1999; Wang et al., Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2452, 2000). Algunos carotenoides tales como  caroteno, licopeno y luteína se venden actualmente como complementos nutricionales.
En general, los sistemas biológicos que producen carotenoides son inabordables industrialmente y/o producen los compuestos a niveles tan bajos que el aislamiento a escala comercial no es practicable. Por lo tanto, la mayoría de los carotenoides usados en la industria se producen por síntesis química. Existe la necesidad de sistemas biológicos mejorados que producen carotenoides. Se han realizado algunos intentos previamente para modificar por ingeniería genética ciertas bacterias u hongos para producir niveles mayores de carotenoides (véase, por ejemplo, Misawa et al., J. Biotechnol. 59 :169, 1998; Visser et al., FEMS Yeast Research 4: 221, 2003; Creda-Olmed et al., Progress in Lipid Research, Vol. 33, Nº 1-2, pp. 185-192, 1994; Bhosale et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 55, Nº 4, pp. 423-427, 2001; Schmidt-Dannert C, Current Opinión in Biotechnology, Vol. 11, Nº 3, pp. 255-261, 2000; Lee et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 60, Nº 1-2, pp.1-11, 2002). Sin embargo, son necesarios sistemas mejorados, que permitan mayores niveles de producción y mayor facilidad de aislamiento.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un sistema mejorado para la producción biológica de carotenoides. El sistema se define por un hongo Yarrowia recombinante, caracterizado por que: a) el hongo es oleaginoso por que puede acumular lípidos hasta al menos el 20 % de su peso celular seco; y b) el hongo produce al menos un carotenoide, y puede acumular el carotenoide producido hasta al menos 1 % de su peso celular seco; en el que el hongo comprende una modificación carotenogénica, la modificación confiere al hongo la capacidad para producir el al menos un carotenoide a un nivel de al menos 1 % de su peso celular seco, la modificación carotenogénica aumenta la expresión o actividad de los siguientes polipéptidos carotenogénicos: polipéptido de GGPP sintasa, polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa, y polipéptido de HMG CoA reductasa y en el que los polipéptidos carotenogénicos derivan de un grupo de microorganismos que consiste en: Y. lipolytica, M. circinelloides, S. cerevisae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A-1D representa ciertos carotenoides comunes.
La Figura 2 representa cómo pueden acumularse niveles suficientes de acetil-CoA y NADPH en el citosol de organismos oleaginosos para permitir la producción de niveles significativos de lípidos citosólicos. Enzimas: 1, piruvato descarboxilasa; 2, malato deshidrogenasa; 3, enzima málica; 4, piruvato deshidrogenasa, 5, citrato sintasa; 6, ATP-citrato liasa; 7, citrato/malato translocasa.
Las Figuras 3A y 3B representan la ruta de biosíntesis de isoprenoide de mevalonato, que actúa típicamente en eucariotas, incluyendo hongos.
La Figura 4 representa la ruta de biosíntesis de isoprenoide independiente de mevalonato, también conocida como la ruta DXP, que típicamente actúa en bacterias y en los plástidos de plantas.
La Figura 5 representa intermedios en la ruta de biosíntesis de isoprenoides y cómo alimentan rutas biosintéticas de otras biomoléculas, incluyendo carotenoides así como compuestos no carotenoides tales como esteroles, esteroides y vitaminas, tales como vitamina E o vitamina K.
Las Figuras 6A-6D ilustran diversas rutas biosintéticas de carotenoides. La Figura 6A destaca ramas que conducen a diversas xantofilas cíclicas y acíclicas; La Figura 6B muestra ciertas rutas de X. dendrorhous que generan carotenoides dicíclicos y monocíclicos, incluyendo astaxantina; la Figura 6C muestra rutas interconectadas para convertir -caroteno en cualquiera de una diversidad de otros carotenoides, incluyendo astaxantina; la Figura 6D representa posibles vías de síntesis de carotenoides cíclicos y xantofilas vegetales y de algas habituales de neurosporeno.
Las Figuras 7A-7C muestran un alineamiento de ciertos polipéptidos de HMG-CoA reductasa fúngicos representativos. Como puede verse, estos polipéptidos muestran una identidad muy alta en toda la región catalítica, y también tienen dominios transmembrana complejos. En algunas realizaciones de la invención, estos dominios transmembrana se alteran o se retiran, de modo que, por ejemplo, puede producirse una versión hiperactiva del polipéptido.
Las Figuras 8A-8D representan representaciones esquemáticas de plásmidos generados y descritos en detalle en la ejemplificación.
Definiciones
Modificación carotenogénica: la expresión “modificación carotenogénica”, como se usa en el presente documento, se refiere a una modificación de un organismo hospedador que ajusta la producción de uno o más carotenoides, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una modificación carotenogénica puede aumentar el nivel de producción de uno o más carotenoides y/o puede alterar los niveles de producción relativos de diferentes carotenoides. En principio, una modificación carotenogénica de la invención puede ser cualquier modificación química, fisiológica, genética u otra modificación que altere de forma apropiada la producción de uno o más carotenoides en un organismo hospedador producido por ese organismo en comparación con el nivel producido en un organismo de otro modo idéntico no sujeto a la misma modificación. En la mayoría de las realizaciones, sin embargo, la modificación carotenogénica comprenderá una modificación genética, que da como resultado típicamente una producción aumentada de uno o más carotenoides seleccionados. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es uno o más de astaxantina, -caroteno, cantaxatina, luteína, licopeno, fitoeno, zeaxantina y/o modificaciones de zeaxantina o astaxantina (por ejemplo, glucósido, zeaxantina esterificada o astaxantina). En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es una o más xantofilas y/o una modificación de las mismas (por ejemplo, glucósido, xantofilas esterificadas). En ciertas realizaciones, la xantofila seleccionada se selecciona del grupo que consiste en astaxantina, luteína, zeaxantina, licopeno y modificaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es uno o más de astaxantina, -caroteno, cantaxantina, luteína, licopeno y zeaxantina y/o modificaciones de zeaxantina o astaxantina. En algunas realizaciones, el carotenoide es caroteno. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es astaxantina. En algunas realizaciones, el carotenoide seleccionado es distinto de -caroteno.
Polipéptido carotenogénico: la expresión “polipéptido carotenogénico”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido que esté implicado en el proceso de producir carotenoides en una célula, y puede incluir polipéptidos que están implicados en procesos distintos de la producción de carotenoides pero cuyas actividades afectan al alcance o nivel de la producción de uno o más carotenoides, por ejemplo eliminando un sustrato o reactivo utilizado por un polipéptido carotenoide que está implicado directamente en la producción de carotenoides. Los polipéptidos carotenogénicos incluyen polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides, polipéptidos de biosíntesis de carotenoides y polipéptidos competidores de biosíntesis de isoprenoides, como se definen en el presente documento esos términos. El término también abarca polipéptidos que pueden afectar al alcance en el que se acumulan carotenoides en cuerpos lipídicos.
Carotenoide: se entiende en la técnica que el término “carotenoide” se refiere a una clase estructuralmente diversa de pigmentos derivados de intermedios de rutas de isoprenoides. La etapa de compromiso en la biosíntesis de carotenoides es la formación de fitoeno a partir de geranilgeranilpirofosfato. Los carotenoides pueden ser acíclicos o cíclicos, y pueden contener o no oxígeno, de modo que el término carotenoides incluye tanto carotenos como xantofilas. En general, los carotenoides son compuestos de hidrocarburo que tienen un esqueleto de carbono polieno conjugado derivado formalmente del compuesto de cinco carbonos IPP, incluyendo triterpenos (diapocarotenoides C30) y tetraterpenos (carotenoides C40) así como sus derivados oxigenados y otros compuestos que son, por ejemplo, de C35, C50, C60, C70, C80 de longitud u otras longitudes. Muchos carotenoides tienen fuertes propiedades de absorción de la luz y pueden variar en su longitud en más de C200. Los diapocarotenoides C30 consisten típicamente en seis unidades isoprenoides unidas de tal manera que la disposición de las unidades isoprenoides está invertida en el centro de la molécula de modo que los dos grupos metilos centrales estén en una relación posicional 1,6 y los grupos metilo no terminales restantes estén en una relación posicional 1,5. Dichos carotenoides C30 pueden derivar formalmente de la estructura C30H42 acíclica, que tiene una cadena central larga de dobles enlaces conjugados, mediante: (i) hidrogenación, (ii) deshidrogenación, (iii) ciclación, (iv) oxidación, (v) esterificación/glucosilación, o cualquier combinación de estos procesos. Los carotenoides C40 típicamente consisten en ocho unidades de isoprenoides unidas de tal manera que la disposición de las unidades isoprenoides esté invertida en el centro de la molécula de modo que los dos grupos metilos centrales estén en una relación posicional
1,6 y los grupos metilo no terminales restantes estén en una relación posicional 1,5. Dichos carotenoides C40 pueden derivar formalmente de la estructura C40H56 acíclica, que tiene una cadena central larga de dobles enlaces conjugados, mediante: (i) hidrogenación, (ii) deshidrogenación, (iii) ciclación, (iv) oxidación, (v) esterificación/glucosilación, o cualquier combinación de estos procesos. La clase de carotenoides C40 también incluye ciertos compuestos que surgen de reordenaciones del esqueleto de carbono, o mediante la retirada (formal) de parte de esta estructura. Se han identificado en la naturaleza más de 600 carotenoides diferentes; ciertos carotenoides comunes se representan en la Figura 1. Los carotenoides incluyen pero sin limitación: anteraxantina, adonirubina, adonixantina, astaxantina, cantaxantina, capsorubrina, -criptoxantina, -caroteno, -caroteno, , caroteno, -caroteno, -caroteno, equinenona, 3-hidroxiequinenona, 3’-hidroxiequinenona, -caroteno, -caroteno, 4ceto--caroteno, -caroteno, -criptoxantina, desoxiflexixantina, diatoxantina, 7,8-dideshidroastaxantina, dideshidrolicopeno, fucoxantina, fucoxantinol, isorrenierateno, -isorrenierateno, lactucaxantina, luteína, licopeno, mixobactona, neoxantina, neurosporeno, hidroxineurosporeno, peridinina, fitoeno, rodopina, glucósido de rodopina, 4-ceto-rubixantina, sifonaxantina, esferoideno, esferoidenona, espiriloxantina, toruleno, 4-ceto-toruleno, 3-hidroxi-4ceto-toruleno, uriolida, acetato de uriolida, violaxantina, zeaxantina--diglucósido, zeaxantina y carotenoides C30. Adicionalmente, los compuestos carotenoides incluyen derivados de estas moléculas, que pueden incluir grupos funcionales hidroxi, metoxi, oxo, epoxi, carboxi o aldehídico. Además, los compuestos carotenoides incluidos incluyen derivados de éster (por ejemplo, éster de glucósido, éster de ácido graso) y sulfato (por ejemplo, xantofilas esterificadas).
Polipéptido de biosíntesis de carotenoides: la expresión “polipéptido de biosíntesis de carotenoides” se refiere a cualquier polipéptido que esté implicado en la síntesis de uno o más carotenoides. Para mencionar solamente algunos, estos polipéptidos de biosíntesis de carotenoides incluyen, por ejemplo, polipéptidos de fitoeno sintasa, fitoeno deshidrogenasa (o desaturasa), licopeno ciclasa, carotenoide cetolasa, carotenoide hidroxilasa, astaxantina sintasa, carotenoide épsilon hidroxilasa, licopeno ciclasa (subunidades beta y épsilon), carotenoide glucosiltransferasa y acil CoA:diacilglicerol aciltransferasa. Se presentan ejemplos representativos de secuencias polipéptidos de biosíntesis de carotenoides en las Tablas 11-19.
Gen: el término “gen”, como se usa en el presente documento, se refiere en general a un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que incluye opcionalmente ciertos elementos reguladores que pueden afectar a la expresión de uno o más productos génicos (es decir, ARN o proteína).
Heterólogo: el término “heterólogo”, como se usa en el presente documento para hacer referencia a genes o polipéptidos, se refiere a un gen o polipéptido que no aparece de forma natural en el organismo en el que se expresa. Se entenderá que, en general, cuando se selecciona un gen heterólogo o polipéptido para introducción en y/o expresión por una célula hospedadora, el organismo fuente particular del que puede seleccionarse el gen o polipéptido heterólogo no es esencial para la práctica de la presente invención. Las consideraciones relevantes pueden incluir, por ejemplo, lo estrechamente relacionados que están la fuente potencial y los organismos hospedadores en la evolución, o lo relacionado que está el organismo fuente con otros organismos fuente de los que se han seleccionado secuencias de otros polipéptidos relevantes.
Célula hospedadora: como se usa en el presente documento, la “célula hospedadora” es una célula fúngica de Yarrowia que se manipula de acuerdo con la presente invención.
Aislado: el término “aislado”, como se usa en el presente documento, significa que la entidad aislada se ha separado de al menos un componente con el que estaba asociado previamente. Cuando la mayoría de los otros componentes se han retirado, la entidad aislada está “purificada”. Pueden realizarse aislamiento y/o purificación usando cualquier técnica conocida en este campo incluyendo, por ejemplo, fraccionamiento, extracción, precipitación u otra separación.
Polipéptido competidor de biosíntesis de isoprenoides: la expresión “polipéptido competidor de biosíntesis de isoprenoides”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido cuya expresión en una célula reduce el nivel de geranilgeranil difosfato (GGPP) disponible para entrar en la ruta de biosíntesis de carotenoides. Por ejemplo, los polipéptidos competidores de biosíntesis de isoprenoides incluyen enzimas que actúan en intermedios de isoprenoides antes que el GGPP, de modo que se genere menos GGPP (véase, por ejemplo, Figura 5). La escualeno sintasa es solamente un polipéptido competidor de biosíntesis de isoprenoides de acuerdo con la presente invención; se presentan secuencias de escualeno sintasa representativas en la Tabla 10. Las enzimas de prenildifosfato sintasa y para-hidroxibenzoato (PHB) polipreniltransferasa son polipéptidos competidores de biosíntesis de isoprenoides adicionales de acuerdo con la presente invención; se presentan polipéptidos de enzimas de prenildifosfato sintasa y PHB polipreniltransferasa representativos en la Tabla 29 y 30, respectivamente.
Polipéptido de biosíntesis de isoprenoides: la expresión “polipéptido de biosíntesis de isoprenoides” se refiere a cualquier polipéptido que esté implicado en la síntesis de isoprenoides. Por ejemplo, como se analiza en el presente documento, acetoacetil-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa, mevalonato pirofosfato descarboxilasa, IPP isomerasa, FPP sintasa y GGPP sintasa, están todas implicadas en la ruta del mevalonato para biosíntesis de isoprenoides. Cada una de estas proteínas también es un
polipéptido de biosíntesis de isoprenoides para fines de la presente invención, y se proporcionan secuencias de ejemplos representativos de estas enzimas en las Tablas 1-9.
Ruta de isoprenoides: se entiende en la técnica que la “ruta de isoprenoides” se refiere a una ruta metabólica que produce o utiliza el metabolito de cinco carbonos isopentil pirofosfato (IPP). Como se analiza en el presente documento, dos rutas diferentes pueden producir el precursor de isoprenoide común IPP, la “ruta de mevalonato” y la “ruta no de mevalonato”. La expresión “ruta de isoprenoides” es suficientemente general para abarcar ambos de estos tipos de ruta. La biosíntesis de isoprenoides de IPP sucede por polimerización de varias subunidades de isopreno de cinco carbonos. Los metabolitos de isoprenoides derivados de IPP son de diverso tamaño y estructura química, incluyendo moléculas tanto cíclicas como acíclicas. Los metabolitos isoprenoides incluyen, pero sin limitación, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, esteroles y poliprenoles tales como carotenoides.
Oleaginoso: el término “oleaginoso”, se refiere a la capacidad de un organismo para acumular lípido hasta al menos aproximadamente el 20 % de su peso celular seco. En ciertas realizaciones de la invención, la levadura o los hongos oleaginosos acumulan lípidos hasta al menos aproximadamente el 25 % de su peso celular seco. En otras realizaciones, la levadura o los hongos oleaginosos de la invención acumulan lípidos dentro del intervalo de aproximadamente 20-45 % de su peso celular seco. En algunas realizaciones, los organismos oleaginosos pueden acumular lípidos hasta tanto como aproximadamente el 70 % de su peso celular seco. En algunas realizaciones de la invención, los organismos oleaginosos pueden acumular una fracción grande de acumulación de lípidos totales en forma de triacilglicerol. En ciertas realizaciones, la mayoría del lípido acumulado está en forma de triacilglicerol. Como alternativa o adicionalmente, el lípido puede acumularse en forma de cuerpos lipídicos intracelulares, o cuerpos oleosos. En ciertas realizaciones, la presente invención utiliza levadura u hongos que son oleaginosos de forma natural. En algunos aspectos, los organismos oleaginosos de forma natural se manipulan (por ejemplo, genéticamente, químicamente, o de otro modo) para aumentar adicionalmente el nivel de lípido acumulado en el organismo. En otras realizaciones, se manipulan levadura u hongos que no son oleaginosos de forma natural (por ejemplo de forma genética, química o de otro modo) para acumular lípidos como se describe en el presente documento.
Polipéptido: el término “polipéptido”, como se usa en el presente documento, generalmente tiene su significado reconocido en la técnica de un polímero de al menos tres aminoácidos. Sin embargo, el término también se usa para hacer referencia a clases de polipéptidos funcionales específicas, tales como, por ejemplo, polipéptidos oleaginosos, polipéptidos carotenogénicos, polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides, polipéptidos de biosíntesis de carotenoides y polipéptidos competidores de biosíntesis de isoprenoides. Para cada una de dichas clases, la presente memoria descriptiva proporciona varios ejemplos de secuencias conocidas de dichos polipéptidos. Los expertos habituales en la materia apreciarán, sin embargo, que se pretende que el término “polipéptido” sea suficientemente general para abarcar no solamente polipéptidos que tengan la secuencia completa indicada en el presente documento (o en una referencia o base de datos mencionada específicamente en el presente documento), sino que también abarca polipéptidos que representan fragmentos funcionales (es decir, fragmentos que conservan al menos una actividad) de dichos polipéptidos completos. Además, los expertos en la materia entienden que las secuencias proteicas toleran en general alguna sustitución sin destruir la actividad. Por lo tanto, cualquier polipéptido que conserve actividad y comparta al menos aproximadamente 30-40 % de la identidad de secuencia general, con frecuencia mayor de aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, y más habitualmente incluyendo al menos una región de mucha mayor identidad, con frecuencia mayor del 90 % o incluso 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % en una
o más regiones altamente conservadas (por ejemplo, polipéptidos de isocitrato deshidrogenasa comparten con frecuencia un motivo de unión a AMP conservado; polipéptidos de HMG-CoA reductasa típicamente incluyen un dominio catalítico altamente conservado (véase por ejemplo, Figura 7); acetil CoA carboxilasa típicamente tiene un dominio de carboxilo transferasa; véase, por ejemplo, Downing et al., Chem. Abs. 93: 484, 1980; Gil et al., Cell 41: 249, 1985; Jitrapakdee et al. Curr Protein Pept Sci. 4: 217, 2003; Patente de Estados Unidos Número 5.349.126), que abarca habitualmente al menos 3-4 y con frecuencia hasta 20 o más aminoácidos, con otro polipéptido de la misma clase, está abarcado dentro del término relevante “polipéptido” como se usa en el presente documento.
Organismo fuente: la expresión “organismo fuente”, como se usa en el presente documento, se refiere al organismo en el que puede encontrarse en la naturaleza una secuencia polipeptídica particular. Por lo tanto, por ejemplo, si uno
o más polipéptidos heterólogos se expresan en un organismo hospedador, el organismo en el que se expresan los polipéptidos en la naturaleza (y/o del que se clonaron originalmente sus genes) se denomina el “organismo fuente”. Cuando se expresan más de un polipéptido heterólogo en un organismo hospedador, pueden utilizarse uno o más organismos fuente para selección independiente de cada uno de los polipéptido heterólogos.
Descripción detallada de la invención
Modificación técnica de la producción de carotenoides
Los carotenoides se sintetizan a partir de precursores isoprenoides, algunos de los cuales también está implicados en la producción de esteroides y esteroles. La ruta de biosíntesis de isoprenoides más habitual, denominada en ocasiones la “ruta de mevalonato”, se representa en general en la Figura 3. Como se muestra, acetil-CoA se convierte, mediante hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA), en mevalonato. El mevalonato se fosforila después y se
convierte en el compuesto de cinco carbonos isopentenil pirofosfato (IPP). Después de la isomerización de IPP en dimetilalil pirofosfato (DMAPP), tres reacciones de condensación secuenciales con moléculas adicionales de IPP generan la molécula de diez carbonos geranil pirofosfato (GPP), seguido de la molécula de quince carbonos farnesil pirofosfato (FPP), y finalmente el compuesto de veinte carbonos geranilgeranil pirofosfato (GGPP).
Una ruta de biosíntesis de isoprenoides alternativa, que se utiliza por algunos organismos (particularmente bacterias) y se denomina en ocasiones la “ruta independiente de mevalonato”, se representa en la Figura 4. Esta ruta se inicia por la síntesis de 1-desoxi-D-xiloglucosa-5-fosfato (DOXP) a partir de piruvato y gliceraldehído-3fosfato. DOXP se convierte después, mediante una serie de reacciones mostradas en la Figura 4, en IPP, que se isomeriza en DMAPP y después se convierte, mediante GPP y FPP, en GGPP como se muestra en la Figura 3 y se ha analizado anteriormente.
Se han identificado diversas proteínas implicadas en la biosíntesis de isoprenoides y se han caracterizado en varios organismos. Además, se conservan diversos aspectos de la ruta de biosíntesis de isoprenoides a lo largo de los reinos fúngico, bacteriano, vegetal y animal. Por ejemplo, se han identificado polipéptidos correspondientes a la acetoacetil-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa, mevalonato pirofosfato descarboxilasa, IPP isomerasa, FPP sintasa y GGPP sintasa mostradas en la Figura 3 y se han aislado de una amplia diversidad de organismos y células. Se proporcionan ejemplos representativos de una amplia diversidad de dichos polipéptidos en las Tablas 1-9. Puede utilizarse o derivarse para su uso en los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención uno o más de los polipéptidos seleccionados de los proporcionados en una cualquiera de las Tablas 1-9.
De acuerdo con la presente invención, la producción de carotenoides en Yarrowia se ajusta modificando la expresión
o actividad de los polipéptidos de GGPP sintasa y/o HMG CoA reductasa implicados en la biosíntesis de isoprenoides. En algunas realizaciones, dicha modificación implica la introducción de uno o más polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides heterólogos en la célula hospedadora; como alternativa o adicionalmente, pueden realizarse modificaciones a la expresión o actividad de uno o más polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides endógenos o heterólogos. Dada la considerable conservación de componentes de los polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides, se espera que los polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides heterólogos actúen con frecuencia incluso en organismos significativamente divergentes. Además, si fuera deseable introducir más de un polipéptido de biosíntesis de isoprenoides heterólogo, en muchos casos actuarán juntos polipéptidos de diferentes organismos fuente. En algunas realizaciones de la invención, se introduce una pluralidad de diferentes polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides heterólogos en la misma célula hospedadora. En algunas realizaciones, esta pluralidad contiene solamente polipéptidos del mismo organismo fuente (por ejemplo, dos o más secuencias de, o secuencias derivadas de, el mismo organismo fuente); en otras realizaciones la pluralidad incluye polipéptidos seleccionados de forma independiente de diferentes organismos fuente (por ejemplo, dos o más secuencias de, o secuencias derivadas de, al menos dos organismos fuente independientes).
En algunas realizaciones de la presente invención que utilizan polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides heterólogos, los organismos fuente incluyen, pero sin limitación, hongos de los géneros Mucor, Yarrowia, Neurospora, Saccharomyces. En ciertas realizaciones, los organismos fuente son de una especie incluyendo, pero sin limitación, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica.
Como se ha indicado anteriormente, la ruta de biosíntesis de isoprenoides también está implicada en la producción de compuestos no carotenoides, tales como esteroles, esteroides y vitaminas, tales como vitamina E o vitamina K. Las proteínas que actúan en intermedios de la ruta de la biosíntesis de isoprenoides, y los desvía a la biosíntesis de compuestos no carotenoides son por lo tanto inhibidores indirectos de la biosíntesis de carotenoides (véase, por ejemplo, Figura 5, que ilustra puntos en los que se dirigen intermedios de isoprenoides a otras rutas de biosíntesis). Dichas proteínas se consideran por lo tanto polipéptidos competidores de la biosíntesis de isoprenoides.
La ruta de la biosíntesis de carotenoides se ramifica de la ruta de biosíntesis de isoprenoides en el punto en el que se forma el GGPP. La etapa de compromiso en la biosíntesis de carotenoides es la formación de fitoeno por la condensación de cabeza a cabeza de dos moléculas de GGPP, catalizada por la fitoeno sintasa (denominada con frecuencia crtB; véase Figura 6). Una serie de reacciones de deshidrogenación, cada una de las cuales aumenta el número de dobles enlaces conjugados por dos, convierte el fitoeno a licopeno mediante neurosporeno. La ruta se ramifica en diversos puntos, tanto antes como después de la producción de licopeno, de modo que puede generarse una amplia serie de carotenoides. Por ejemplo, la acción de una enzima ciclasa en licopeno genera -caroteno, la acción de una desaturasa en su lugar produce 3,4-dideshidrolicopeno. -caroteno se convierte en -caroteno mediante la acción de una ciclasa. -caroteno puede procesarse en cualquiera de varios productos (véase, por ejemplo, Figura 6C), incluyendo astaxantina (mediante equinona, hidroxiequinona y fenicoxantina).
De acuerdo con la presente invención, la producción de carotenoides en Yarrowia se ajusta modificando la expresión
o actividad de las siguientes proteínas implicadas en la biosíntesis de carotenoides: polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, será deseable introducir uno o más polipéptidos carotenogénicos heterólogos en Yarrowia. Como resultará evidente para los expertos en la materia, puede emplearse cualquiera de una diversidad de polipéptidos heterólogos; la selección tendrá en cuenta, por ejemplo, el carotenoide particular cuya producción va a potenciarse. La presente invención contempla no solamente la introducción de polipéptidos carotenogénicos heterólogos, sino también el ajuste de los niveles de expresión o actividad de polipéptidos carotenogénicos heterólogos o endógenos, incluyendo, por ejemplo, la alteración de patrones de expresión constitutivos o inducibles. En algunas realizaciones de la invención, los patrones de expresión se ajustan de modo que no se requiera crecimiento en condiciones de nutrientes limitantes para inducir oleaginia. Por ejemplo, pueden utilizarse modificaciones genéticas que comprenden alteración y/o adición de secuencias reguladoras (por ejemplo, elementos promotores, elementos terminadores) para conferir regulación particular de los patrones de expresión. Dichas modificaciones genéticas pueden utilizarse junto con genes endógenos (por ejemplo, para regulación de carotenogénico endógeno); como alternativa, dichas modificaciones genéticas pueden incluirse para conferir regulación de la expresión de al menos un polipéptido heterólogo (por ejemplo, polipéptido o polipéptidos carotenogénicos). Por ejemplo, pueden usarse promotores que incluyen, pero sin limitación, promotores de Tef1, Gpd1 junto con genes endógenos y/o genes heterólogos para modificación de los patrones de expresión de un polipéptido o polipéptidos carotenogénicos endógenos y/o un polipéptido o polipéptidos carotenogénicos heterólogos. De forma similar, las secuencias terminadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación, uso de secuencias terminadores de XPR2 de Y. lipolytica.
Como se indica en la Figura 6 y en la bibliografía, las proteínas implicadas en la biosíntesis de carotenoides incluyen, pero sin limitación, fitoeno sintasa, fitoeno deshidrogenasa, licopeno ciclasa, carotenoide cetolasa, carotenoide hidroxilasa, astaxantina sintasa (una única enzima multifuncional hallada en algunos organismos fuente que típicamente tiene actividades tanto cetolasa como hidroxilasa), carotenoide épsilon hidroxilasa, licopeno ciclasa (subunidades beta y épsilon), carotenoide glucosiltransferasa y acil CoA:diaciglicerol aciltransferasa. Se proporcionan secuencias ejemplares representativas para estos polipéptidos de biosíntesis de carotenoides en las Tabla 11-19.
Las xantofilas pueden distinguirse de otros carotenoides por la presencia de grupos funcionales que contienen oxígeno en sus grupos finales cíclicos. Por ejemplo, la luteína y zeaxantina contienen un único grupo hidroxilo en cada una de las estructuras de anillo terminal, mientras que la astaxantina contiene tanto un grupo ceto como un hidroxilo en cada anillo terminal. Esta propiedad hace a las xantofilas más polares que los carotenos tales como beta caroteno y licopeno, y por lo tanto reduce drásticamente su solubilidad en grasas y lípidos. Se encuentran con frecuencia xantofilas de origen natural como ésteres de los grupos hidroxilo terminales, tanto mono como diésteres de ácidos grasos. También aparecen como glucósidos en ciertas especies de bacterias. La solubilidad y capacidad de dispersión de las xantofilas puede modificarse en gran medida mediante la adición de restos de éster, y se sabe que la esterificación también puede afectar a la capacidad de absorción y/o biodisponibilidad de un carotenoide dado. Es un objetivo de la presente invención maximizar la cantidad de una xantofila particular que se acumula dentro de la fracción de triacilglicérido intracelular de levaduras oleaginosas, y un mecanismo para conseguir este objetivo es aumentar la naturaleza hidrófoba del producto de xantofila que se acumula. Un modo de conseguirlo es modificar técnicamente la producción de mono y/o diésteres de acilo graso del compuesto de xantofila diana.
Una diversidad de enzimas pueden actuar para esterificar los carotenoides. Por ejemplo, se han identificado carotenoide glucosiltransferasas en varias especies bacterianas (véase, por ejemplo, Tabla 18). Además, la acil CoA:diaciglicerol aciltransferasa (DGAT) y acil CoA:monoacilglicerol aciltransferasas (MGAT), que actúan en las etapas finales de la biosíntesis de triacilglicerol, probablemente cumplan un papel adicional en la esterificación de xantofilas. Se muestran polipéptidos de DGAT representativos en la Tabla 19. Además, otras enzimas pueden modificar específicamente carotenoides y moléculas de estructura similar (por ejemplo esteroles) y estar disponibles para modificación y producción de éster.
Se apreciará que la modificación carotenogénica particular para aplicar a una célula hospedadora de acuerdo con la presente invención se verá influida por el carotenoide o los carotenoides que se deseen producir. Por ejemplo, los polipéptidos de biosíntesis de isoprenoides son relevantes para la producción de la mayoría de carotenoides. Los polipéptidos de biosíntesis de carotenoides también son relevantes en general. La cetolasa es particularmente relevante para la producción de cantaxantina, como la hidroxilasa lo es para la producción de luteína y zeaxantina, entre otras. Tanto hidrolasa como acetolasa (o astaxantina sintasa) son particularmente útiles para la producción de astaxantina.
Producción y aislamiento de carotenoides
Como se ha analizado anteriormente, la acumulación de cuerpos lipídicos en organismos oleaginosos se induce en general cultivando el organismo relevante en presencia de fuente de carbono excesiva y nitrógeno limitante. Las condiciones específicas para inducir dicha acumulación se han establecido previamente para varios organismos oleaginosos diferentes (véase, por ejemplo, Wolf (ed.) Nonconventional yeasts in biotechnology Vol. 1, Springer-Verlag, Berlín, Alemania, pp. 313-338; Lipids 18(9): 623, 1983; Indian J. Exp. Biol. 35(3): 313, 1997; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30(1): 75, 2003; Bioresour Technol. 95(3): 287, 2004).
En general, será deseable cultivar células hospedadoras modificadas de la invención en condiciones que permitan la acumulación de al menos aproximadamente el 20 % de su peso celular seco como lípido. En otras realizaciones, las células hospedadoras modificadas de la invención se cultivan en condiciones que permiten la acumulación de al menos aproximadamente 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o incluso 80 % o más de su peso celular seco como lípidos. En ciertas realizaciones, las células hospedadoras utilizadas son células que son de forma natural oleaginosas, y se induce que produzcan lípidos a los niveles deseados.
En ciertas realizaciones de la invención, será deseable acumular carotenoides a niveles (es decir, teniendo en cuenta la cantidad total de todos los carotenoides producidos juntos) que son mayores que al menos aproximadamente el 1 % del peso seco de las células. En algunas realizaciones, la acumulación de carotenoides total en los cuerpos lipídicos será hasta un nivel de al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 3 %, al menos aproximadamente 4 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 6 %, al menos aproximadamente 7 %, al menos aproximadamente 8 %, al menos aproximadamente 9 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 11 %, al menos aproximadamente 12 %, al menos aproximadamente 13 %, al menos aproximadamente 14 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 16 %, al menos aproximadamente 17 %, al menos aproximadamente 18 %, al menos aproximadamente 19 %, al menos aproximadamente 20 % o más del peso seco total de las células. En ciertas realizaciones de la invención, será deseable conseguir niveles totales de acumulación de carotenoides en los cuerpos lipídicos (es decir, teniendo en cuenta la cantidad total de todos los carotenoides producidos juntos) que sean mayores que al menos aproximadamente 1 % del peso seco de las células. En algunas realizaciones, la acumulación de carotenoides total en los cuerpos lipídicos será hasta un nivel de al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 3 %, al menos aproximadamente 4 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 6 %, al menos aproximadamente 7 %, al menos aproximadamente 8 %, al menos aproximadamente 9 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 11 %, al menos aproximadamente 12 %, al menos aproximadamente 13 %, al menos aproximadamente 14 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 16 %, al menos aproximadamente 17 %, al menos aproximadamente 18 %, al menos aproximadamente 19 %, al menos aproximadamente 20 % o más del peso seco total de las células.
Genes carotenogénicos bacterianos ya han demostrado que son transferibles a otros organismos, y son por lo tanto particularmente útiles de acuerdo con la presente invención (véase, por ejemplo, Miura et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 1226, 1998).
En ciertas realizaciones, la fitoeno sintasa/licopeno ciclasa multifuncional de Mucor circinelloides y los genes de fitoeno deshidrogenasa de Neurospora crassa pueden expresarse en Yarrowia lipolytica. La sobreexpresión posterior del dominio catalítico de hidroximetilglutaril-CoA reductasa de N. crassa y/o el tratamiento de las cepas de
Y. lipolytica modificadas con el inhibidor de escualeno sintasa ácido zaragócico aumenta adicionalmente la producción de carotenoides. Finalmente, se expresan genes de Paracoccus marcusii que codifican enzimas carotenoide hidroxilasa y carotenoide cetolasa en cepas productoras de -caroteno de Y. lipolytica, y esta modificación da como resultado la acumulación de astaxantina. Podrían emplearse enfoques similares para potenciar la producción de carotenoides en otros organismos hospedadores oleaginosos o no oleaginosos, pudiendo llevarse a cabo usando polipéptidos carotenogénicos iguales, homólogos o funcionalmente similares.
Debería observarse que, para organismos de la invención que producen más de un carotenoide, será en ocasiones posible ajustar las cantidades relativas de carotenoides individuales producidos ajustando las condiciones de cultivo. Por ejemplo, se ha indicado que el control de la concentración de oxígeno disuelto en un cultivo durante el cultivo puede regular los niveles de producción relativos de ciertos carotenoides tales como -caroteno, equinenona, criptoxantina, 3-hidroxiequinenona, asteroidenona, cantaxantina, zeaxantina, adonirubina, adonixantina y astaxantina (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Número 6.825.002 de Tsubokura et al.).
Particularmente, para realizaciones de la presente invención dirigidas a la producción de astaxantina, será con frecuencia deseable utilizar uno o más genes de un organismo productor de astaxantina natural. Cuando vayan a expresarse múltiples polipéptidos heterólogos, puede ser deseable utilizar el mismo organismo fuente para todos, o utilizar organismos fuente estrechamente relacionado.
Una ventaja proporcionada por la presente invención es que, además de permitir la producción de altos niveles de carotenoides, la presente invención permite aislar fácilmente esos compuestos producidos debido a que se acumulan en los cuerpos lipídicos dentro de organismos oleaginosos. Se han establecido métodos y sistemas para aislar cuerpos lipídicos para una amplia diversidad de organismos oleaginosos (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos 5.164.308; 5.374.657; 5.422.247; 5.550.156; 5.583.019; 6.166.231; 6.541.049; 6.727.373; 6.750.048; y 6.812.001). Brevemente, se recuperan células típicamente de cultivo, con frecuencia por secado por pulverización, filtración o centrifugación. En algunos casos, las células se homogeneizan y después se someten a extracción de líquido supercrítico o extracción de disolvente (por ejemplo, con disolventes tales como cloroformo, hexano, cloruro de metileno, metanol, isopropanol, etil acetato, etc.), produciendo una suspensión de aceite en bruto. Esta suspensión de aceite puede refinarse opcionalmente como se conoce en la técnica. Pueden usarse
aceites refinados directamente como pienso o aditivos alimentarios. Como alternativa o adicionalmente, los carotenoides pueden aislarse del aceite usando técnicas convencionales.
Dada la sensibilidad de los carotenoides generalmente a la oxidación, muchas realizaciones de la invención emplean estabilizantes oxidativos (por ejemplo, tocoferoles, vitamina C; etoxiquina; vitamina E, BHT, BHA, TBHQ, etc., o combinaciones de los mismos) durante y/o después del aislamiento de carotenoides. Como alternativa o adicionalmente, puede emplearse microencapsulación, por ejemplo con proteínas, para añadir una barrera física a la oxidación y/o para mejorar la manipulación (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0191365).
Usos
Pueden utilizarse carotenoides producidos de acuerdo con la presente invención en cualquiera de una diversidad de aplicaciones, por ejemplo aprovechando sus propiedades biológicas o nutricionales (por ejemplo, antioxidantes, antiproliferativas, etc.) y/o sus propiedades de pigmento. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, pueden usarse carotenoides en productos farmacéuticos (véase, por ejemplo, Bertram, Nutr. Rev. 57: 182, 1999; Singh et al., Oncology 12: 1643, 1998; Rock, Pharmacol. Ther. 75: 185, 1997; Edge et al, J. Photochem Photobiol 41: 189, 1997; Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0116514; Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0259959), complementos alimentarios (véase, por ejemplo, Koyama et al, J. Photochem Photobiol 9: 265, 1991; Bauernfeind, Carotenoids as colorants and vitamin A precursors, Academic Press, NY, 1981; Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0115309; Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0234579), aplicaciones electroópticas, aditivos alimentarios animales (véase, por ejemplo, Krinski, Pure Appl. Chem. 66: 1003, 1994; Polazza et al., Meth. Enzymol. 213: 403, 1992), cosméticos (como antioxidantes y/o como cosméticos, incluyendo fragancias; véase por ejemplo Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0127554), etc. También pueden usarse carotenoides producidos de acuerdo con la presente invención como intermedios en la producción de otros compuestos (por ejemplo, esteroides, etc.).
Por ejemplo, la astaxantina y/o ésteres de la misma puede ser útil en una diversidad de aplicaciones terapéuticas y alimentos dietéticos incluyendo tratamiento de enfermedades inflamatorias, asma, dermatitis atópica, alergias, mieloma múltiple, arteriosclerosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad hepática, enfermedad cerebrovascular, trombosis, enfermedades relacionadas con la neoangiogénesis, incluyendo cáncer, reumatismo, retinopatía diabética; degeneración macular y trastorno cerebral, hiperlipidemia, isquemia renal, diabetes, hipertensión, proliferación tumoral y metástasis; y trastornos metabólicos. Adicionalmente, los carotenoides y la astaxantina pueden ser útiles en la prevención y tratamiento de fatiga, para mejorar la función renal en nefropatía de enfermedades inflamatorias, así como prevención y tratamiento de otras enfermedades relacionadas con los hábitos de vida. Además, se ha descubierto que la astaxantina desempeña un papel como inhibidores de diversos procesos biológicos, incluyendo inhibidores de interleucina, inhibidores de inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores de fosfolipasa A2, inhibidores de ciclooxigenasa 2, inhibidores de metaloproteinasa de la matriz, inhibidores de la proliferación de células del endotelio capilar, inhibidores de la lipooxigenasa. Véase, por ejemplo, Publicación Japonesa Nº 2006022121, publicada 20060126 (Solicitud JP Nº 2005-301156 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006016408, publicada 19012006 (Solicitud JP Nº 2005-301155 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006016409, publicada 19012006 (Solicitud JP Nº 2005-301157 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006016407, publicada 19012006 (Solicitud JP Nº 2005-301153 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008717, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301151 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008716, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301150 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008720, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301158 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008719, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301154 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008718, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301152 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008713, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301147 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008715, publicada 12012006( Solicitud JP Nº 2005-301149 presentada 17102005); Publicación Japonesa Nº 2006008714, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301148 presentada 17102005); y Publicación Japonesa Nº 2006008712, publicada 12012006 (Solicitud JP Nº 2005-301146 presentada 17102005).
Se apreciará que, en algunas realizaciones de la invención, se incorporan carotenoides producidos por células hospedadoras manipuladas como se describe en el presente documento en un producto final (por ejemplo, alimento
o complemento alimentario, producto farmacéutico, cosméticos, artículo que contiene colorante, etc.) en el contexto de la célula hospedadora. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden liofilizarse, criodesecarse, congelarse o inactivarse de otro modo, y después pueden incorporarse células completas en o usarse como el producto final. La célula hospedadora también puede procesarse antes de su incorporación en el producto para aumentar la biodisponibilidad (por ejemplo, mediante lisis). Como alternativa o adicionalmente, un producto final puede incorporar solamente una parte de la célula hospedadora (por ejemplo, fraccionada por tamaño, solubilidad), separada del total. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, se aíslan gotas lipídicas de las células hospedadoras y se incorporan en o se usan como el producto final. En otras realizaciones, los carotenoides en sí mismos, o compuestos carotenoides individuales se aíslan y reformulan en el producto final.
Como se ha indicado anteriormente, los ésteres de ácidos grasos y glucósidos son los ésteres de carotenoides predominantes hallados en la naturaleza, mientras que pueden sintetizarse ésteres adicionales (por ejemplo con ácidos orgánicos o fosfato inorgánico) para generar formas de productos útiles. Para suministro, también pueden formularse ésteres de carotenoides como sales de la forma de éster. Véase, por ejemplo, Publicación de Estados Unidos Nº 20050096477.
La cantidad de carotenoide incorporado en un producto dado puede variar drásticamente dependiendo del producto, y el carotenoide o los carotenoides particulares implicados. Las cantidades pueden variar, por ejemplo, de menos del 0,01 % en peso del producto, a más de 1 %, 10 %, 20 %, 30 % o más; en algunos casos el carotenoide puede comprender el 100 % del producto.
En algunas realizaciones de la invención, se incorporan uno o más carotenoides producidos en un componente de alimento o pienso (por ejemplo, un complemento alimentario). Los tipos de productos alimentarios en los que pueden incorporarse carotenoides de acuerdo con la presente invención no están particularmente limitados, e incluyen bebidas tales como tés, zumos y licores; dulces tales como gelatinas y galletas; alimentos y bebidas que contienen grasas tales como productos lácteos; productos alimentarios procesados tales como arroz y arroz blando (o gachas); fórmulas infantiles, o similares. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, puede ser útil incorporar los carotenoides dentro de cuerpos de lípidos comestibles ya que pueden facilitar la incorporación en ciertos productos alimentarios que contienen grasas.
Los ejemplos de piensos en los que pueden incorporarse carotenoides producidos de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, comidas para mascotas tales como comidas para gatos, comidas para perros y similares, piensos para peces de acuario, peces de criadero o crustáceos, etc., pienso para animales criados en granjas (incluyendo ganado e incluyendo además peces o crustáceos criados en acuicultura). El material de alimento o pienso en el que se incorporan el carotenoide o los carotenoides producidos de acuerdo con la presente invención es preferentemente apetitoso para el organismo que es el receptor pretendido. Este material de alimento o pienso puede tener cualquier propiedad física conocida actualmente para un material alimentario (por ejemplo, sólido, líquido, blando).
En algunas realizaciones de la invención, se incorporan uno o más carotenoides producidos en un producto cosmético. Los ejemplos de dichos cosméticos incluyen, por ejemplo, cosméticos cutáneos (por ejemplo, lociones, emulsiones, cremas y similares), lápiz de labios, cosméticos antiquemaduras solares, cosméticos de maquillaje, fragancias, productos para uso diario (por ejemplo, pastas de dientes, colutorios, agentes de prevención del mal aliento, jabones sólidos, jabones líquidos, champús, acondicionadores), etc.
En algunas realizaciones, se incorporan uno o más carotenoides producidos en un producto farmacéutico. Los ejemplos de dichos productos farmacéuticos incluyen, por ejemplo, diversos tipos de comprimidos, cápsulas, agentes bebibles, trociscos, gargarismos, etc. En algunas realizaciones, el producto farmacéutico es adecuado para aplicación tópica. Las formas de dosificación no están particularmente limitadas, e incluyen cápsulas, aceites, gránulos, gránulos pequeños, polvos, comprimidos, píldoras, trociscos, o similares. Los aceites y cápsulas rellenas de aceite pueden proporcionar ventajas adicionales tanto debido a su falta de descomposición de los ingredientes durante la fabricación como debido a que pueden incorporarse fácilmente gotas de lípidos que contienen carotenoides de la invención en formulaciones basadas en aceite.
Pueden prepararse composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención de acuerdo con técnicas establecidas en este campo incluyendo, por ejemplo, el procedimiento habitual como se describe en la Farmacopea de Estados Unidos, por ejemplo.
Los carotenoides producidos de acuerdo con la presente invención pueden incorporarse en cualquier producto que contenga pigmento incluyendo, por ejemplo, tela, pintura, etc. También pueden incorporarse en un producto que sea un indicador ambiental, o un instrumento tal como un biosensor para su uso como un agente de detección.
Ejemplificación
La Tabla 20 a continuación describe ciertas cepas de Yarrowia lipolytica usadas en la siguiente ejemplificación:
TABLA 20: cepas de Yarrowia lipolytica.
NRRLY-1095
Diploide de tipo silvestre
ATCC76861
MATB ura2-21 lyc1-5 LYS1-5B
ATCC76982
MATB ade1 leu2-35 lyc1-5 xpr2
ATCC201249
MATA ura3-302 leu2-270 lys8-11 PEX17-HA
NRRLY-1095
Diploide de tipo silvestre
MF346
MATA ura2-21 ATCC76861 x ATCC201249
MF350
MATB ura2-21 leu2-35 ade1 ATCC76982 x MF346
(Los genotipos en LYC1, LYS1, XPR2 y PEX17 no se determinaron en cruces ni se verificaron para cepas de ATCC).
5 Todos los procedimientos de biología molecular básicos y manipulación de ADN descritos en el presente documento se realizan en general de acuerdo con Sambrook et al. o Ausubel et al. (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nueva York; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nueva York).
Ejemplo 1: producción de plásmidos para construcción de cepas de carotenoides.
Se generaron plásmidos para la construcción de cepas productoras de carotenoides. Las siguientes subpartes describen la producción de plásmidos que codifican polipéptidos carotenogénicos. Los plásmidos usados en estos
15 estudios y detalles de su construcción se describen en la Tabla 21. Se encuentran detalles de la construcción de plásmidos adicionales y descripciones de su uso en el texto de la subsección relevante. Todas las amplificaciones por PCR usaron ADN genómico de NRRL Y-1095 como molde a no ser que se especifique otra cosa. El gen URA5 descrito posteriormente es alélico con la auxotrofia ura2-21 anterior. Los promotores de GPD1 y TEF1 son de Y. lipolytica como lo es el terminador de XPR2.
20 GGS1 es el gen que codifica el gen de Y. lipolytica que codifica la geranilgeranilpirofosfato sintasa. La secuencia codificante de ácido nucleico y proteína codificada Ggs1 de pMB4591 y pMB4683 son las siguientes:
Plásmido
Cadena principal Inserto Oligos o fuente
pMB4529
PCR2.1 Producto de PCR de ADE1 de 3,4 kb MO4475 y MO4476
PMB4534
PCR2.1 Producto de PCR de LEU2 de 2,1 kb MO4477 y MO4478
pMB4535
PCR2.1 Producto de PCR de URA5 de 1,2 kb MO4471 y MO4472
Plásmido
Cadena principal Inserto Oligos o fuente
pMB4589
pMB4535 (KpnI + Spel) Promotor de GPD1 de 1,2 kb (Kpnl + Notl); terminador de XPR2 de 0,14 kb (Notl + Spel) MO4568 y MO4591; MO4566 y MO4593
pMB4590
pMB4535 (Kpnl + Spel) Promotor de TEF1 de 0,4 kb (Kpnl + Notl); terminador de XPR2 de 0.14 kb (Notl + Spel) MO4571 y MO4592; MO4566 y MO4593
pMB4591
pMB4590 (Nhel + Mlul) ORF de GGS1 de 1,0 kb (Xbal + Mlul) MO4534 y MO4544
pMB4597
pMB4534 (Acc65l + Spel) Promotor de GPD1 y terminador de XPR2 (Acc65l + Spel) De pMB4589
pMB4603
pMB4597 (Rsrll + Mlul) Cadena principal residual y promotor de TEF1 (Rsrll + Mlul) De pMB4590
pMB4616
pMB4529 (Rsrll + Spel) Cadena principal residual y promotor de GPD1 y terminador de XPR2 (Rsrll + Spel) De pMB4589
pMB4629
pMB4616 (Rsrll + Mlul) Cadena principal residual y promotor de TEF1 (Rsrll + Mlul) De pMB4590
pMB4631
pMB4603 (Kpnl + Nhel) Promotor de GPD1 de 1,2 kb (Kpnl + Nhel); MO4568 y MO4659
pMB4628
pMB4603 Carp Véase 1A
pMB4637
pMB4629 (Nhel + Mlul) ORF de hmgltrunc de 1,5 kb (Xbal + Mlul) Véase 1D
pMB4638
pMB4629 carB(i-) Véase 1B
pMB4660
pMB4638 (+URA3) carB(i-) Véase 1C
pMB4662
pMB4631 (Spel+ Xhol) Fragmento de URA3 de 1,8 kb (Spel + Bsal) MO4684 y MO4685 Véase 1C
pMB4683
pMB4662 (Acc65l + Mlul) Fragmento de tef1p-GGS1 de 1,4 kb (Acc65l + Mlul) De pMB4591
pMB4692
pMB4662 (Acc65l + Mlul) Promotor de TEF1 de 0,4 kb (Acc65l + Nhel); ORF de crtZ de 0,55 kb (Xbal + Mlul) Véase 1E
pMB4698
pMB4629 (Nhel + MluI) ORF de crtW de 0,9 kb (Xbal + MluI) Véase 1F
pMB4599
pBluescriptSKII-(EcoRV) Gen carRP de 1,9 kb MO4525yMO4541
pMB4606
pBluescriptSKII-(EcoRV) Gen carB de 1,9 kb MO4530 y MO4542
PMB4613
pMB4599 (Acc65l + PpuMl) carRP(i-) Véase texto
pMB4619
pBluescriptSKII-(BamHI Acc65I)) + carB(i-) Véase texto
Ciertos oligonucleótidos indicados en la Tabla 21 anterior son los siguientes:
MO4471 5’-CTGGGTGACCTGGAAGCCTT MO4472 5’-AAGATCAATCCGTAGAAGTTCAG MO4475 5’-AAGCGATTACAATCTTCCTTTGG MO4476 5’-CCAGTCCATCAACTCAGTCTCA MO4477 5’-GCATTGCTTATTACGAAGACTAC MO4478 5’-CCACTGTCCTCCACTACAAACAC MO4534 5’-CACAAACGCGTTCACTGCGCATCCTCAAAGT MO4544 5’-CACAATCTAGACACAAATGGA1TATAACAGCGCGGAT MO4566 5’-CACAAACTAGTTTGCCACCTACAAGCCAGAT MO4568 5’-CACAAGGTACCAATGTGAAAGTGCGCGTGAT MO4571 5’-CACAAGGTACCAGAGACCGGGTTGGCGG MO4591 5’-CACAAGCGGCCGCGCTAGCATGGGGATCGATCTCTTATAT MO4592 5’-CACAAGCGGCCGCGCTAGCGAATGATTCTTATACTCAGAAG MO4593 5’-CACAAGCGGCCGCACGCGTGCAATTAACAGATAGTTTGCC MO4659 5’-CACAAGCTAGCTGGGGATGCGATCTCTTATATC
1 A: producción de pMB4628 (tef1p-carRP LEU2) que codifica fitoeno sintasa/licopeno ciclasa: se amplificó carRP que contenía intrones a partir de ADN genómico de M. circinelloides (ATCC 90680) usando MO4525 y MO4541:
MO4525 5’-CACAAACGCGTTTAAATGGTAT1TAGATTTCTCATT MO4541 5’-CACAATCTAGACACAAATGCTGCTCACCTACATGGA
y el fragmento de 1,9 kb resultante se fosforiló con polinucleótido quinasa T4. El fragmento resultante se ligó con extremos romos en pBluescriptSKII-escindido con EcoRV, produciendo pMB4599. El fragmento Xbal-Mlul de 1,9 kb de pMB4599 se insertó en pMB4603 escindido por Nhely MluI, produciendo pMB4628. La secuencia codificante de ácido nucleico que contenía intrones, y proteína CarRP codificada de pMB4628 son las siguientes:
Como alternativa, también se usó pMB4599 como un molde para amplificación por PCR usando MO4318, MO4643, MO4644 y MO4639 y
MO4318 5’-GTAAAACGACGGCCAGT MO4643 5’-CACACGGTCTCATGCCAAGCCTTGTATGCAGTGATTAA MO4639 5’-CCACTGTGTTTGCTGGCGG MO4644 5’-CACACGGTCTCTGGCATTTGGCGGTCCCTGGAAA
produciendo fragmentos de 0,5 y 0,95 kb, que se escindieron posteriormente con Acc65I y BsaI, y Bsaly PpuMI, respectivamente. Estos fragmentos se ligaron con pMB4599 que se había digerido con Acc65I y PpuMI, produciendo pMB4613, que alberga carRP sin intrones. El fragmento Xbal-Mlul de 1,85 kb de pMB4613 puede insertarse en pMB4603 escindido con Nhel y MluI para producir pCarRPdelI.
5 1B: producción de pMB4638 (tef1p-carB ADE1), que codifica fitoeno deshidrogenasa: se amplificó carB que contenía intrones a partir de ADN genómico de M. circinelloides (ATCC 90680) usando MO4530 y MO4542:
MO4530 5’-CACAAACGCGTTTAAATGACATTAGAGTTATGAAC MO4542 5’-CACAATCTAGACACAAATGTCCAAGAAACACATTGTC
10 y el fragmento de 1,9 kb resultante se fosforiló con polinucleótido quinasa T4 y se ligó con extremos romos en pBS-SKII escindido con EcoRV, produciendo pMB4606. pMB4606 se usó después como un molde para amplificación por PCR usando MO4318 y MO4648, y MO4646 y MO4647, y MO4343 y MO4645:
MO4318 5’-GTAAAACGACGGCCAGT MO4648 5’-CACAAGGTCTCAAGCACGCATCCCGGAACTG MO4646 5’-CACACGGTCTCAGGCATGTCGCCCTACGATGC MO4647 5’-CACACGGTCTCATGCTTGCACCCACAAAGAATAGG MO4343 5’-CAGGAAACAGCTATGAC MO4645 5’-CACACGGTCTCTTGCCCATATACATGGTCTGAAACG
15 produciendo fragmentos de 0,4 y 0,85 y 0,7 kb, que se escindieron posteriormente con Acc65I y Bsal, y Bsal, y Bsal y BamHl, respectivamente. Estos fragmentos se ligaron con pBS-SKII, que se había cortado con Acc65I y BamHl, produciendo pMB4619, que albergaba carB sin intrones. El fragmento Xbal-Mlul de 1,75 kb de pMB4619 se insertó en pMB4629 escindido con Nhely MluI, produciendo pMB4638. La secuencia codificante de ácido nucleico resultante y proteína CarB codificada de pMB4638 son las siguientes:
1C. Producción de pMB4660 (tef1p-carB URA3), que codifica fitoeno deshidrogenasa: el fragmento Xhol-Notl de 4,3 kb y el fragmento Notl-Spel de 1,8 kb de pMB4638 se ligaron con el gen URA3 escindido por Bsal y SpeI de 1,9 kb 5 generado por amplificación por PCR de ADN genómico de Y. lipolytica usando MO4684 y MO4685 para crear pMB4660:
MO4684 5’-CATTCACTAGTGGTGTGTTCTGTGGAGCATTC MO4685 5’-CACACGGTCTCATCGAGGTGTAGTGGTAGTGCAGTG
La secuencia codificante de ácido nucleico resultante y proteína CarB(i) codificada de pMB4660 son las siguientes: 10
1D. Producción de pMB4637 y pTef-HMG que codifica un HMG1 truncado. Para la producción de una variante truncada del gen de HMG-CoA reductasa, que también codifica una secuencia líder de 77 aminoácidos derivada de 5 S. cerevisiae, se sintetizan los siguientes oligonucleótidos:
CEBADOR O 5’-TTCTAGACACAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGA CEBADOR P 5’-CATTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATC CEBADOR Q 5’-GTTCTCTGGACGACCTAGAGG MO4658 5’-CACACACGCGTACACCTATGACCGTATGCAAAT
Los cebadores O y P se usan para amplificar un fragmento de 0,23 kb que codifica Met-Ala seguido de los restos 530 a 604 de la proteína Hmg1 de S. cerevisiae, usando ADN genómico como molde. Los cebadores Q y MO4658
10 se usan para amplificar un fragmento de 1,4 kb que codifica los 448 restos C terminales de la proteína Hmg1 de Y. lipolytica, usando ADN genómico como un molde. Estos fragmentos se ligan con el vector de clonación apropiado, y los plásmidos resultantes, designados pOP y pQMO4658, se verifican por secuenciación. El fragmento OP se libera con XbaI y AseI y en el fragmento QMO4658 se libera con Mael y Mlul. Estos fragmentos se ligan después con el vector de expresión de ADE1 TEF1p pMB4629 cortado con XbaI y Mlul para producir pTefHMG.
15 Como alternativa, el gen HMG1 nativo de Y. lipolytica puede modificarse sin secuencias de S. cerevisiae como se ha descrito en la tabla anterior usando los cebadores MO4658 (descrito anteriormente) y MO4657, para crear pMB4637:
MO4657 5’-CACACTCTAGACACAAAAATGACCCAGTCTGTGAAGGTGG 20 La secuencia codificante de ácido nucleico resultante y proteína Hmg1trunc codificada de pMB4637 son las siguientes:
Ejemplo 2: cuantificación técnica de Yarrowia lipolytica para producción de carotenoides aumentada.
2A. Producción de Y. lipolytica que expresa geranilgeranilpirofosfato sintasa y fitoeno deshidrogenasa: se transformó MF350 (MATB ura2-21 leu2-35 ade1) con pMB4591 (tef1p-GGS1) que se había escindido cadena arriba de URA5 con Sspl; un transformante Ura+ que porta el plásmido en el locus ura2 se identificó y se nombró MF364. Se trasformó posteriormente con pMB4638 (tef1p-carB) que se había escindido en ADE1 con SspI y se seleccionó un transformante prototrófico que albergaba el plásmido en el locus ade1. Esta cepa se denominó MF502.
2B. Producción de Y. lipolytica que expresa geranilgeranilpirofosfato sintasa, fitoeno deshidrogenasa y fitoeno sintasa/licopeno ciclasa. Se transformó MF502 con pMB4628 (tef1p-carRP) que se había tratado con Sspl. Se seleccionaron nueve colonias prototróficas que estaban descoloridas, eran naranjas o muy naranjas en la placa de transformación (agar YNB con glucosa 1 % y glutamato 0,1 % [YNBglut]) después de dos a tres días de cultivo. Dos, MF597 y MF600 (las muy naranjas), produjeron más de 4 mg de caroteno por g de peso celular seco (DCW) después de cuatro días de cultivo en YPD a 30 ºC. El análisis de Southern revela una única banda Kpnl-HindIII diferente en ADN genómico de MF597 y MF600, ninguna de las cuales sugiere que se produjo integración homóloga en leu2-270.
2C. Producción de Y. lipolytica que expresa fitoeno sintasa/licopeno ciclasa y fitoeno deshidrogenasa: ATCC201249 (MATA ura3-302 leu2-270 lys8-11) se transformó con pMB4628 escindido con Sspl. Se agruparon cientos de colonias Leu+, se volvieron a cultivar, y se transformaron con pMB4660 (tef1p-carB) que se había escindido cadena arriba de URA3 con SalI. Se seleccionó una colonia que era notablemente amarilla después de 5 días a 30 ºC con YNBglut más lisina 0,6 mM, denominada MF447, y se descubrió que producía 0,2 mg de caroteno por gramo de peso celular seco después de 4 días de cultivo en YPD.
Se expuso MF447 a ácido 5-fluoroorótico 1 g/l y se seleccionaron segregantes Ura-. Sorprendentemente, se descubrió que todos conservaban la apariencia amarilla idéntica de su precursor, lo que implica que la pérdida de un gen URA3 funcional no coincidía con la pérdida de una enzima CarB funcional. El análisis de Southern demuestra que dos fragmentos de una digestión con Kpnl-HindIII de ADN de MF447 contienen secuencias que hibridan con URA3p, solo una de las cuales se hibrida también con carB. La otra está ausente en MF578, el segmento Ura3seleccionado para manipulación adicional. El rescate de plásmidos y análisis de la secuencia de ADN que abarca el intrón carRP en las cepas MF447, MF597 (ejemplo 2c) y MF600 (ejemplo 2c) reveló que los exones 1 y 2 estaban contiguos y estaban cada uno separados por una secuencia intrónica que carecía del sitio SspI interno original (presente en pMB4628).
2D. Producción de Y. lipolytica que expresa fitoeno sintasa/licopeno ciclasa, fitoeno deshidrogenasa y geranilgeranilpirofosfato sintasa: se transformó MF578 con pMB4683 (tef1p-GGS1) que se había escindido con SalI (cadena arriba de URA3) o con StuI (dentro de la ORF de GGS1). Las colonias Ura+ Leu+ en ambos casos tenían una apariencia naranja brillante en YNBglut+Lys y en YPD, y varias produjeron más de 4 mg de caroteno por gramo de peso celular seco cuando se cultivaron como antes. Una, MF633, contenía una única copia del plásmido en el locus de GGS1, como se infiere a partir del análisis de Southern. Las otras surgieron por integraciones no homólogas o más complejas.
2E. Producción de Y. lipolytica que expresa fitoeno sintasa/licopeno ciclasa, fitoeno deshidrogenasa y geranilgeranilpirofosfato sintasa: MF364 se cruza con MF578, y se siembran esporas del diploide resultante en placas con YPD durante dos a tres días a 30 ºC. Se exploran colonias Leu+ Ade-Ura-naranjas con respecto a la
presencia de tefp-carB, tefp-carRP y tefp-GGS1 por PCR, y con respecto a alta producción de carotenoides (>4 mg/g de peso celular seco) después de cultivo en medio líquido YPD. Las colonias que cumplen estos criterios, así como que presentan resistencia a ácido 5-fluoroorótico, un indicio de que albergan el alelo ura3-302, se eligen para estudios posteriores y se denominan en lo sucesivo en el presente documento cepas GBRPua. Dicha cepa se selecciona para análisis y modificación posterior.
Ejemplo 3: extracción de carotenoides de células de Yarrowia lipolytica
Se realizaron ensayos de matraz de agitación de cepas generadas usando medio YPD (extracto de levadura 1 %, peptona 2 %, glucosa 2 %). Se dejaron crecer cultivos de 20 ml en matraces de 125 ml a 30 ºC. Se recogieron células de Y. lipolytica de cultivos de 72-96 horas, y se realizaron extracciones para determinar la forma y cantidad de los carotenoides. Se colocaron 1,8 ml de cultivo en un tubo Eppendorf. Las células se sedimentaron y se lavaron dos veces con 1 ml de H2O. Después del segundo lavado, las células resuspendidas se transfirieron a un tubo de tapón con cierre de resorte previamente pesado con un agujero realizado en la parte superior, y las células se liofilizaron durante una noche. Después de secar hasta su compleción, el tubo se pesó para calcular el peso celular seco. Se colocaron 0,25 ml del mismo cultivo de matraz de agitación en un tubo con tapón de rosca de 2 ml para extracción de carotenoides. Las células se sedimentaron y el sobrenadante se aspiró. Las células pigmentadas pueden congelarse a -80 ºC y almacenarse. Se añadió un volumen igual de perlas de circona cúbica a los sedimentos celulares, junto con 1 ml de disolvente de extracción helado (una mezcla 50/50 v/v de hexano y etil acetato que contiene butilhidroxitolueno 0,01 % (BHT)). La mezcla se agitó después (Mini-BeadBeater-8, BioSpec Products, Inc.) a velocidad máxima durante 5 minutos a 4 ºC. La mezcla se centrifugó después a máxima velocidad durante 1 minuto, y el sobrenadante se recogió y se depositó en un frasco de vidrio de 16 ml frío. Los residuos celulares restantes se volvieron a extraer al menos tres veces, sin la adición de perlas de circona; todos lo sobrenadantes se agruparon en el frasco de vidrio de 16 ml. Después de la extracción, el frasco de vidrio se centrifugó durante 5 minutos a 2000 rpm a 4 ºC en una centrífuga de sobremesa Sorvall, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo frasco de vidrio de 16 ml frío. Se usó un Speed Vac para concentrar el sobrenadante (temperatura ambiente en oscuridad), y las muestras se almacenaron a -20 ºC o -80 ºC hasta inmediatamente antes del análisis de HPLC. Antes del análisis de HPLC, las muestras se resuspendieron en 1 ml de disolvente helado y después se transfirieron a un frasco de ámbar frío. Durante todo el protocolo, se tuvo cuidado para evitar el contacto con el oxígeno, la luz, el calor y los ácidos.
Ejemplo 4: cuantificación de la producción de carotenoides por HPLC
Para análisis de carotenoides, las muestras se resuspendieron en disolvente de extracción helado (una mezcla 50/50 v/v de hexano y etil acetato que contenía butilhidroxitolueno (BHT) 0,01 %). Se usó una HPLC Alliance 2795 (Waters) equipada con una columna Waters XBridge C18 (3,5 m, 2,1 x 50 mm) y una precolumna Thermo Basic 8 (2,1 x 10 mm) para resolver el carotenoide a 25 ºC; se usaron muestras de carotenoides auténticos como patrones. Las fases móviles y los caudales se muestran a continuación (Disolvente A = Etil Acetato; Disolvente B= Agua; Disolvente C= Metanol; Disolvente D= Acetonitrilo). El volumen de inyección fue de 10 l. El detector es un detector en serie de fotodiodo Waters 996. Los tiempos de retención para moléculas lipófilas incluyen astaxantina (1,159 min), zeaxantina (1,335), -apo-8’-carotenal (2,86 min), ergosterol (3,11 min), licopeno (3,69 min), -Caroteno (4,02 min) y fitoeno (4,13 min). Se detectan astaxantina, zeaxantina, -apo-8’-carotenal, licopeno y -Caroteno a 475 nm, mientras que se detectaron ergosterol y fitoeno a 286 nm.

TABLA 22 Tiempos de retención para moléculas lipófilas
Tiempo (min)
Caudal (ml/min) %A %B %C %D Curva
0,50
0,0 20,0 0,0 80,0
3,00
1,00 20,0 0,0 0,0 80,0 6
4,50
1,00 80,0 0,0 20,0 0,0 6
5,50
1,00 0,0 0,0 60,0 40,0 6
6,50
1,00 0,0 0,0 80,0 20,0 6
7,50
1,00 0,0 0,0 100,0 0,0 6
8,50
1,00 0,0 0,0 100,0 0,0 6
9,50
1,00 0,0 20,0 0,0 80,0 6
10,50
0,50 0,0 20,0 0,0 80,0 6
Ejemplo 5: la expresión de una forma truncada de HMG-CoA reductasa da como resultado aumento de la producción de carotenoides
Para aumentar la producción de carotenoides, se potencia el flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoides 5 introduciendo una variante truncada del gen de HMG-CoA reductasa.
En un enfoque, una variante truncada del gen de HMG-CoA reductasa que también codifica una secuencia líder de 77 aminoácidos derivada de Hmg1 de S. cerevisiae se introduce en una cepa GRPBua (descrita en el Ejemplo 2E anterior). El plásmido pTefHMG puede escindirse con SnaBl, BbvCl o Bsu36I para dirigir la integración en el locus
10 ade1 o con BamHl para dirigir la integración en el locus HMG1, o con EcoRV para promover la integración aleatoria, en las cepas GRPBua, restaurándolas en prototrofia de adenina. Los transformantes de Ade+ resultantes se exploran con respecto a producción de carotenoides aumentada.
Como alternativa, el gen HMG1 nativo de Y. lipolytica puede modificarse sin secuencias de S. cerevisiae como se ha
15 descrito en el Ejemplo 1D anterior, para crear pMB4637. Este plásmido puede digerirse como se ha descrito para pTefHMG y transfomarse en cepas GRPBua, y los transformantes resultantes pueden explorarse como se ha descrito para producción de carotenoides aumentada.
En otro enfoque más, puede utilizarse una variante truncada del gen de la HMG-CoA reductasa de N. crassa e
20 introducirse en cepas de Y. lipolytica. Para generar un plásmido adecuado para expresión de la HMG-CoA reductasa heteróloga, se modifica p641P (Yeast 2001; 18 (2001): 97-113) reemplazando el promotor de ICL1 con el promotor de GPD, y mediante la adición de secuencias que confieren resistencia a fleomicina. El ADN genómico de Y. lipolytica se amplifica con dos cebadores.
25 GPDdist: 5’ CACACGGTacctgtaggttgggttgggtg GPDprox: 5’ CACACGGATCCtgtttaattcaagaatgaatatagagaagagaag,
y el fragmento resultante (0,7 kb) se escinde con BamHl y Kpnl, y se liga con p641P escindido con BamHl y Kpnl, creando el plásmido “p641Pgpd”. El gen ble bajo el control del promotor de GPD de A. nidulans se escinde
30 después de pBCphleo (Silar, Fungal Genetics Newsletter 42: 73) como un fragmento Bcll-BamHl de 3,2 kb y se inserta en el sitio de BamHl único de “p641Pgpd”, en la orientación que conserve el sitio BamHl próximo al promotor de GPD, para crear “p641Pgpdble”,
Se amplifica ADN genómico de N. crassa con dos cebadores:
35 Neuhmg dir: 5’ CACACGGATCCACATCAACAatggcatctgccacccttcccc Neuhmg inv: 5’ CACACGGATCcaagtgctgacgcggaacttg,
y el fragmento resultante se escinde con BamHl y se inserta en “p641Pgpdble” digerido con BamHI en la
40 orientación correcta. El plásmido resultante, “pZg”, contiene secuencias que codifican un dominio catalítico citosólico truncado de hidroximetilglutaril-CoA reductasa de N. crassa (referencia de Genbank: XP_324892) bajo el control del promotor de GPD constitutivo. Este plásmido puede introducirse en la cepa de Y. lipolytica creada en el Ejemplo 2E anterior, y los transformantes se seleccionan por su resistencia a fleomicina (100 g/ml). Los transformantes resultantes se ensayan con respecto a producción de -caroteno, como se ha descrito anteriormente.
45 Se hace referencia a las siguientes tablas a lo largo de la descripción:
Tabla 1. Ejemplos de polipéptidos de acetoacetil-CoA tiolasa
Tabla 2. Ejemplos de polipéptidos de HMG-CoA sintasa
Tabla 3. Ejemplos de polipéptidos de HMG-CoA reductasa
Tabla 4. Ejemplos de polipéptidos de mevalonato quinasa
Tabla 5. Ejemplos de polipéptidos de fosfomevalonato quinasa.
Tabla 6. Ejemplos de polipéptidos de mevalonato pirofosfato descarboxilasa
Tabla 7. Ejemplos de polipéptidos de IPP isomerasa
Tabla 8. Ejemplos de polipéptidos de FPP sintasa.
Tabla 9. Ejemplos de polipéptidos de GGPP sintasa.
Tabla 10. Ejemplos de polipéptidos de escualeno sintasa
Tabla 11. Ejemplos de polipéptidos de fitoeno deshidrogenasa.
Tabla 12. Ejemplos de polipéptidos de fitoeno sintasa y licopeno ciclasa.
Tabla 13. Ejemplos de polipéptidos de carotenoide cetolasa.
Tabla 14. Ejemplos de polipéptidos de carotenoide hidroxilasa.
Tabla 15. Ejemplos de polipéptidos de astaxantina sintasa y polipéptidos de astaxantina sintasa potenciales.
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
ABB52076
79155148 Caroteno de anillo épsilon hidrolasa potencial [Daucus carota subsp. sativus]
BAD94136
62319017 Proteína de tipo citocromo P450 [Arabidopsis thaliana]
ABD28565
87162770 P450 de clase E, grupo I [Medicago truncatula]
AAT28222
47498772 Citocromo P450 de tipo 97B2 potencial [Ginkgo biloba]
ABC68396
85001685 Citocromo P450 monooxigenasa CYP97A [Glycine max]
ABC59110
84514203 Citocromo P450 monooxigenasa CYP97B [Medicago truncatula]
NP_190881
42565881 LUT1 (DEFICIENTE EN LUTEINA 1); unión a oxígeno [Arabidopsis thaliana]
ABB47954
78708979 citocromo P450 monooxigenasa, potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]
NP_922604
37536604 citocromo P450 monooxigenasa potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]

Tabla 17. Ejemplos de polipéptidos de licopeno ciclasa, subunidades beta y épsilon.
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
AAK07431
12746307 licopeno épsilon-ciclasa [Adonis palaestina]
ABB52073
79154988 licopeno épsilon ciclasa potencial [Daucus carota subsp. sativus]
Q38932
27735211 Licopeno épsilon ciclasa, precursor de cloroplastos
AAB53336
1399181 licopeno épsilon ciclasa
AAG10428
9971816 épsilon ciclasa [Tagetes erecta]
AAK07434
12746313 licopeno épsilon-ciclasa [Lactuca sativa]
AAM45382
21360359 épsilon ciclasa [Tagetes erecta]
O65837
11132841 Licopeno épsilon ciclasa, precursor de cloroplastos
AAL69394
18419661 licopeno épsilon-ciclasa [Spinacia oleracea]
BAE79549
87299433 licopeno épsilon-ciclasa [Chrysanthemum x morifolium]
XP_463351
50901836 licopeno épsilon-ciclasa potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]
AAS48096
44887640 épsilon licopeno ciclasa [Citrus sinensis]
AAX92679
62638188 licopeno épsilon ciclasa [Citrus maxima]
AAL92114
19569601 licopeno épsilon-ciclasa [Citrus x paradisi]
AAK07433
12746311 licopeno épsilon-ciclasa [Solanum tuberosum]
AAL47019
17864021 licopeno épsilon-ciclasa [Citrus sinensis]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
AAT46065
48686703 precursor de licopeno épsilon-ciclasa de cloroplastos [Chlamydomonas reinhardtii]
BAD07293
40809769 licopeno épsilon-ciclasa [Citrus limon]
BAD07285
40809753 licopeno épsilon-ciclasa [Citrus sinensis]
BAD07277
40809737 licopeno épsilon-ciclasa [Citrus unshiu]
EAJ62839
44489138 desconocida [secuencia ambiental]
BAE43547
73993068 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
BAE43550
73993074 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
BAE43557
73993088 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43558
73993090 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43553
73993080 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43545
73993064 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
BAE43556
73993086 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43552
73993078 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
BAE43560
73993094 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43554
73993082 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43551
73993076 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
BAE43519
73993012 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43535
73993044 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43541
73993056 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43542
73993058 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43517
73993008 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43534
73993042 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43537
73993048 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43533
73993040 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAD02774
38603277 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAD02766
38603261 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43540
73993054 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43514
73993002 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43544
73993062 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43538
73993050 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43528
73993030 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43546
73993066 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
BAE43526
73993026 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43543
73993060 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAD02742
38603213 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAD02770
38603269 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43522
73993018 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43559
73993092 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43527
73993028 licopeno beta ciclasa potencial [Cryptomeria japonica]
BAE43548
73993070 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
AAF44700
14550425 licopeno beta-ciclasa [Citrus sinensis]
BAE43555
73993084 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. imbricarium]
BAE43549
73993072 licopeno beta ciclasa potencial [Taxodium distichum var. distichum]
AAU14144
51922063 licopeno beta-ciclasa [Citrus sinensis]
AAN86060
27261727 licopeno ciclasa [Citrus unshiu]
AAR89632
40756518 licopeno-beta-ciclasa [Citrus máxima]
AAM21152
20530862 licopeno beta-ciclasa [Citrus sinensis]
AAD38049
13959731 licopeno ciclasa [Citrus x paradisi]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
AAU05146
51511939 licopeno beta-ciclasa [Citrus sinensis]
AAU05145
51511937 licopeno beta-ciclasa [Citrus sinensis]
AAK07430
12746305 licopeno beta-ciclasa [Adonis palaestina]
ABB72443
82394885 licopeno beta-ciclasa [Citrus sinensis]
BAE79544
87299423 licopeno beta-ciclasa [Chrysanthemum x morifolium]
BAE78471
85717882 licopeno beta ciclasa [Taraxacum officinale]
Q43415
11133019 Licopeno beta ciclasa, precursor de cloroplastos
AAF23013
6665782 licopeno épsilon-ciclasa [Daucus carota]
ABB52071
79154899 licopeno beta ciclasa potencial [Daucus carota subsp. sativus]
AAW88382
59665024 licopeno beta-ciclasa [Lycium barbarum]
AAG10429
9971818 beta ciclasa [Tagetes erecta]
AAM45381
21360357 beta ciclasa [Tagetes erecta]
AAM14335
20259239 licopeno beta ciclasa potencial [Arabidopsis thaliana]
AAO18661
27728515 licopeno beta-ciclasa [Zea mays]
AAA81880
735882 licopeno ciclasa
Q43503
11133022 Licopeno beta ciclasa, precursor de cloroplastos
S66350
2129931 licopeno beta-ciclasa (EC 5.5.1.-) -tomate
XP_464409
50905841 licopeno beta-ciclasa potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]
CAD70565
45237491 licopeno ciclasa [Bixa orellana]
Q43578
11133025 Licopeno beta ciclasa, precursor de cloroplastos
AAL92175
19569782 beta-licopeno ciclasa [Sandersonia aurantiaca]
AAX54906
61742130 precursor de licopeno beta ciclasa de cloroplastos potencial [Chlamydomonas reinhardtii]
S66349
2129954 licopeno beta-ciclasa (EC 5.5.1.-) -tabaco común
AAG21133
10644119 licopeno beta-ciclasa específico de cloroplastos [Lycopersicon esculentum]
CAB92977
8247354 neoxantina sintasa [Solanum tuberosum]
CAB93342
8249885 neoxantina sintasa [Lycopersicon esculentum]
Q9SEA0
11131528 Capsantina/capsorrubina sintasa, precursor de cloroplastos
Q42435
12643508 Capsantina/capsorrubina sintasa, precursor de cloroplastos
AA064977
37730608 licopeno beta ciclasa [Haematococcus pluvialis]
Q40424
11133011 Licopeno beta ciclasa, precursor de cloroplastos
ABB52072
79154940 capsantina-capsorrubina sintasa potencial [Daucus carota subsp. sativus]
AAQ02668
33304511 licopeno ciclasa [Setaria italica]
CAA54961
840729 Óxido-reductasa cromoplástica potencial [Capsicum annuum]
EAJ62838
44489136 desconocida [secuencia ambiental]
YP_401079
81300871 Licopeno ciclasa, beta y épsilon [Synechococcus elongatus PCC 7942]
YP_172741
56752040 licopeno ciclasa [Synechococcus elongatus PCC 6301]
ZP_011...
88808972 licopeno beta ciclasa [Synechococcus sp. WH 7805]
EAK50052
44615956 desconocida [secuencia ambiental]
NP_892751
33861190 licopeno épsilon ciclasa potencial [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris cepa CCMP1986]
NP_875182
33240240 Licopeno épsilon ciclasa [Prochlorococcus marinus subsp. marinus cepa CCMP1375]
YP_382237
78213458 Licopeno ciclasa, beta y épsilon [Synechococcus sp. CC9605]
YP_397130
78779018 Licopeno ciclasa, beta y épsilon [Prochlorococcus marinus cepa MIT 9312]
NP_896821
33865262 licopeno beta ciclasa [Synechococcus sp. WH 8102]
YP_397570
78779458 Licopeno ciclasa, beta y épsilon [Prochlorococcus marinus cepa MIT
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
9312]
ZP_010...
87302144 licopeno ciclasa [Synechococcus sp. WH 5701]
EAK17149
44569190 desconocida [secuencia ambiental]
YP_291882
72382527 licopeno ciclasa, beta y épsilon [Prochlorococcus marinus cepa NATL2A]
NP_875528
33240586 deshidrogenasa relacionada con licopeno beta ciclasa [Prochlorococcus marinus subsp. marinus cepa CCMP1375]
NP_893181
33861620 licopeno beta ciclasa potencial [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris cepa CCMP1986]
NP_895600
33864040 licopeno épsilon ciclasa potencial [Prochlorococcus marinus cepa MIT 9313]
EAI47456
44325573 desconocida [secuencia ambiental]
YP_291268
72381913 licopeno ciclasa, beta y épsilon [Prochlorococcus marinus cepa NATL2]
ZP_010...
84517806 deshidrogensa relacionada con licopeno beta ciclasa [Prochlorococcus marinus cepa MIT 9211]
AAF34191
6970079 licopeno épsilon ciclasa [Daucus carota]
ZP_010...
84518202 Licopeno épsilon ciclasa [Prochlorococcus marinus cepa MIT 9211]
YP_376736
78184301 Licopeno ciclasa, beta y épsilon [Synechococcus sp. CC9902]
ZP_003...
66796756 Licopeno ciclasa, beta y épsilon [Deinococcus geothermalis DSM 11300]
NP_894954
33863394 licopeno beta ciclasa potencial [Prochlorococcus marinus cepa MIT 9313]
AAT76051
50365502 licopeno ciclasa [Citrus clementina]
EAK22047
44576122 desconocida [secuencia ambiental]
NP_294525
15805827 licopeno ciclasa [Deinococcus radiodurans R1]

Tabla 18. Ejemplos de polipéptidos de carotenoide glucosiltransferasa.
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
AAA21261
148395 CrtX [Pantoea agglomerans]
AAN85597
27228291 Zeaxantina Glucosil Transferasa [Pantoea stewartii]
BAB79601
18143446 crtX [Pantoea agglomerans pv. milletiae]
AAZ73147
72536082 zeaxantina glucosil transferasa [Enterobacteriaceae bacterium DC413]
AAZ73128
72536060 zeaxantina glucosil transferasa [Enterobacteriaceae bacterium DC260]
AAZ73140
72536074 zeaxantina glucosil transferasa [Enterobacteriaceae bacterium DC416]
Q01330
231911 Zeaxantina glucosil transferasa
ZP_006...
71674312 UDP-glucosiltransferasa, MGT [Trichodesmium erythraeum IMS101]
NP_439972
16329244 zeaxantina glucosil transferasa [Synechocystis sp. PCC 6803]
EAH29368
44130903 desconocida [secuencia ambiental]
ZP_005...
67926135 zeaxantina glucosil transferasa, proteína hipotética [Crocosphaera watsonii WH 8501]
YP_378763
78188425 proteína hipotética Cag_0447 [Chlorobium chlorochromatii CaD3]
ZP_005...
68549418 Glucosil transferasa, grupo 1 [Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1]
ZP_010...
85713606 glucosil transferasa, grupo 1 [Nitrobacter sp. Nb-311A]
YP_317171
75674750 glucosil transferasa, grupo 1 [Nitrobacter winogradskyi Nb-255]
ZP_006...
69929171 Glucosil transferasa, grupo 1 [Nitrobacter hamburgensis XI4]
ZP_009...
84500589 proteína hipotética OB2597_11541 [Oceanicola batsensis HTCC2597]
ZP_009...
83953176 proteína hipotética NAS141_12746 [Sulfitobacter sp. NAS-14.1]
ZP_009...
83942121 proteína hipotética EE36_07793 [Sulfitobacter sp. EE-36]
YP_508020
89052569 glucosil transferasa, grupo 1 [Jannaschia sp. CCS1]
ZP_010...
85704103 proteína hipotética ROS217_13931 [Roseovarius sp. 217]
ZP_009...
83370850 glucosiltransferasa probable [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
ZP_006...
69934465 Glucosil transferasa, grupo 1 [Paracoccus denitrificans PD1222)
ZP_009...
83949880 glucosiltransferasa probable [Roseovarius nubinhibens ISM]
YP_376237
78183803 glucosiltransferasa potencial [Synechococcus sp. CC9902]
YP_376129
78183695 glucosiltransferasa probable [Synechococcus sp. CC9902]
YP_374296
78186253 proteína hipotética Plut_0365 [Pelodictyon luteolum DSM 273]
ZP_010...
87301651 Glucosiltransferasa potencial [Synechococcus sp. WH 5701]
ZP_011...
88809938 Glucosiltransferasa potencial [Synechococcus sp. WH 7805]
BAE47471
78483937 carotenoide glucosiltransferasa [Paracoccus sp. N81106]
ZP_010...
87303273 glucosiltransferasa probable [Synechococcus sp. WH 5701]
YP_376127
78183693 glucosiltransferasa probable [Synechococcus sp. CC9902]
YP_501334
88196509 proteína hipotética SAOUHSC_02880 [Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325]
YP_187370
57652300 glucosil transferasa, proteína de la familia del grupo 2 [Staphylococcus aureus subsp. aureus COL]
CAA66627
1340131u producto proteico no nombrado [Staphylococcus aureus]
YP_041987
49484763 glucosil transferasa potencial [Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252]
YP_417885
82752144 proteína hipotética SAB2436c [Staphylococcus aureus RF122]
YP_252404
70725490 proteína hipotética SH0489 [Staphylococcus haemolyticus JCSC1435]
NP_693379
23099913 proteína hipotética OB2458 [Oceanobacillus iheyensis HTE831]
ZP_008...
82501285 proteína hipotética conservada [Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903]
ZP_010…
87303565 proteína hipotética WH5701_09900 [Synechococcus sp. WH 5701]

Tabla 19. Ejemplos de polipéptidos de acil CoA:diacilglicerol aciltransferasa (DGAT).
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
XP_957022
85082953 proteína hipotética [Neurospora crassa NI50]
XP_386864
46124621 proteína hipotética FG06688.1 [Gibberella zeae PH-1]
XP_755172
71000982 diacilglicerol O-aciltransferasa DGAT [Aspergillus fumigatus Af293]
XP_663763
67539978 proteína hipotética AN6159.2 [Aspergillus nidulans FGSC A4]
BAE65302
83775179 producto proteico no nombrado [Aspergillus oryzae]
XP_502557
50550169 proteína hipotética [Yarrowia lipolytica]
AAS78662
56199782 diacilglicerol aciltransferasa [Glycine max]
ABB84383
82582915 diacilglicerol aciltransferasa [Jatropha curcas]
AAV31083
54145459 1,2-diacil-sn-glicerol:acil-CoA aciltransferasa [Euonymus alatus]
AAG23696
10803053 diacilglicerol aciltransferasa [Perilla frutescens]
AAF64065
7576941 diacilglicerol aciltransferasa potencial [Brassica napus]
AAS01606
41387497 acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa 1 [Olea europaea]
AAT73629
50299542 acil CoA:diacilglicerol aciltransferasa [Glycine max]
AAM03340
67043496 diacilglicerol aciltransferasa potencial [Tropaeolum majus]
XP_645633
66824557 proteína hipotética DDB0202877 [Dictyostelium discoideum]
AAF19345
6625653 diacilglicerol acilCoA aciltransferasa [Nicotiana tabacum]
AAY40785
63376239 diacilglicerol aciltransferasa DGAT2 [Brassica juncea]
AAW47581
57231736 diacilglicerol aciltransferasa [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]
AAR11479
38146080 diacilglicerol aciltransferasa [Ricinus communis]
AAY40784
63376226 diacilglicerol aciltransferasa DGAT1 [Brassica juncea]
AAP68322
31711932 At2gl9450 [Arabidopsis thaliana]
AAW51456
57545061 diacilglicerol aciltransferasa [Lotus corniculatus var. japonicus]
AAD45536
5579408 diacilglicerol aciltransferasa potencial [Brassica napus]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
BAD53762
53791817 acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]
NP_956024
41054343 proteína hipotética LOC325875 [Danio rerio]
AAL49962
18642598 diacilglicerol aciltransferasa 1 [Bos taurus]
XP_930884
89028385 similar a Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (Diglicérido aciltransferasa) (gen relacionado con ACAT) [Homo sapiens]
NP_777118
27819636 diacilglicerol O-aciltransferasa 1 [Bos taurus]
Q9GMF1
18202926 Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (Diglicérido aciltransferasa)
NP_036211
6912332 diacilglicerol O-aciltransferasa 1 [Homo sapiens]
AAH06263
34782946 proteína DGAT1 [Homo sapiens]
XP_780515
72006039 similar a Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 [Strongylocentrotus purpuratus]
AAD40881
5225382 diacilglicerol aciltransferasa potencial [Brassica napus]
XP_539214
73974769 similar a la isoforma 1 de Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (producto génico 1 relacionado con ACAT) [Canis familiaris]
AAZ22403
71063860 diacilglicerol O-aciltransferasa 1 [Bubalus bubalis]
NP_999216
47522918 diacilglicerol aciltransferasa [Sus scrofa]
NP_001...
50539976 proteína hipotética LOC436731 [Danio rerio]
XP_849176
73974767 similar a la isoforma 2 de Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (producto génico 1 relacionado con ACAT) [Canis familiaris]
NP_505828
71997360 H19N07.4 [Caenorhabditis elegans]
AAF82410
9049538 diacilglicerol aciltransferasa [Caenorhabditis elegans]
CAE75170
39591950 Proteína hipotética CBG23107 [Caenorhabditis briggsae]
XP_626337
66358318 diacilglicerol aciltransferasa 1 [Cryptsporidium parvum Iowa II]
XP_668402
67624239 enzima relaciona con acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa 1 [Cryptosporidium hominis TU502]
AAP94208
33113253 enzima relaciona con acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa 1 [Toxoplasma gondii]
AAP94209
33113255 enzima relaciona con acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa 1 [Toxoplasma gondii]
XP_579557
62652535 PREDICHA: diacilglicerol O-aciltransferasa 1 [Rattus norvegicus]
BAC66171
29170489 diacilglicerol aciltransferasa [Mus musculus]
Q9ERM3
18202872 Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (Diglicérido aciltransferasa)
AAL78366
18698659 acil coenzima A: diacilglicerol aciltransferasa [Drosophila melanogaster]
NP_995724
45552403 CG31991-PD, isoforma D [Drosophila melanogaster]
NP_724017
24584734 CG31991-PC, isoforma C [Drosophila melanogaster]
XP_858062
73974765 similar a la isoforma 3 de Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (producto génico 1 relacionado con ACAT) [Canis familiaris]
XP_728984
82915156 proteína hipotética PY01256 [Plasmodium yoelii yoelii cepa 17XNL]
CAG11944
47225461 producto proteico no nombrado [Tetraodon nigroviridis]
BAD27526
50199438 acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa [construcción sintética eucariota]
XP_317656
31226099 ENSANGP00000002281 [Anopheles gambiae cepa PEST]
AAV59457
55733950 diacilglicerol aciltransferasa potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]
EAL33593
54644853 GA16599-PA [Drosophila pseudoobscura]
XP_678753
68073677 diacilglicerol O-aciltransferasa [Plasmodium berghei cepa ANKA]
XP_520014
55631434 PREDICHA: similar a Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (Diglicérido aciltransferasa) [Pan troglodytes]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
CAG10815
47219451 producto proteico no nombrado [Tetraodon nigroviridis]
XP_624754
66522700 PREDICHA: similar a ENSANGP00000002281 [Apis mellifera]
CAC69884
15620769 diacilglicerol aciltransferasa I [Rattus norvegicus]
XP_686181
68363630 PREDICHA: similar a Diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (Diglicérido aciltransferasa) [Danio rerio]
XP_734008
70921323 diacilglicerol O-aciltransferasa [Plasmodium chabaudi chabaudi]
XP_673128
68062248 proteína hipotética PB300300.00.0 [Plasmodium berghei cepa ANKA]
AAS72376
45642963 acil-CoA:colesterol aciltransferasa beta [Toxoplasma gondii]
AAS72375
45642961 acil-CoA:colesterol aciltransferasa alfa [Toxoplasma gondii]
NP_586145
19074639 ESTEROL O-ACILTRANSFERASA [Encephalitozoon cuniculi GB-M1]
XP_640280
66812202 proteína hipotética DDB0205259 [Dictyostelium discoideum]
AAY40783
63376221 diacilglicerol aciltransferasa [Brassica juncea]
XP_765774
71032265 diacilglicerol O-aciltransferasa [Theileria parva cepa Muguga]
Q876L2
34582301 Esterol O-aciltransferasa 2 (Esterol-éster sintasa 2)
XP_571260
58268208 esterol O-aciltransferasa [Criptococcus neoformans var. neoformans JEC21]
EAL20032
50257323 proteína hipotética CNBF3580 [Criptococcus neoformans var. neoformans B-3501A]
XP_954478
84999514 acil transferasa [Theileria annulata cepa Ankara]
XP_505086
50555355 proteína hipotética [Yarrowia lipolytica]
NP_588558
19076058 proteína hipotética SPCP1E11.05c [Schizosaccharomyces pombe 972h-]
AAC49441
1389739 acil-CoA: esterol aciltransferasa
NP_014416
6324346 Acil-CoA: esterol aciltransferasa, isozima de Are1p; Are2p [Saccharomyces cerevisiae]
XP_750354
70991010 esterol o-aciltransferasa APE2 [Aspergillus fumigatus Af293]
XP_382192
46110268 proteína hipotética FG02016.1 [Gibberella zeae PH-1]
BAE54934
83764790 producto proteico no nombrado [Aspergillus oryzae]
XP_885914
76617939 similar a la isoforma 2 de Esterol O-aciltransferasa 2 (Colesterol aciltransferasa 2) (ACAT-2) [Bos taurus]
XP_591251
76617937 similar a la isoforma 1 de Esterol O-aciltransferasa 2 (Colesterol aciltransferasa 2) (ACAT-2) [Bos Taurus]
BAC00846
21392392 AcilCoA:Colesterol Aciltransferasa 2 [Rattus norvegicus]
NP_649816
28571583 CG8112-PA [Drosophila melanogaster]
NP_666176
22122547 esterol O-aciltransferasa 2 [Mus musculus]
O88908
18202245 Esterol O-aciltransferasa 2 (Colesterol aciltransferasa 2) (ACAT-2)
XP_761502
71022545 proteína hipotética UM05355.1 [Ustilago maydis 521]
NP_714950
40254723 esterol O-aciltransferasa 2 [Rattus norvegicus]
EAQ86094
88178626 proteína hipotética CHGG_07347 [Chaetomium globosum CBS 148.51]
XP_461395
50425599 proteína hipotética DEHA0F25652g [Debaryomyces hansenii CBS767]
XP_661812
67527926 proteína hipotética AN4208.2 [Aspergillus nidulans FGSC A4]
AAH96091
64654094 Esterol O-aciltransferasa 2 [Homo sapiens]
O75908
18202149 Esterol O-aciltransferasa 2 (Colesterol aciltransferasa 2) (ACAT-2)
AAH96090
64652990 Esterol O-aciltransferasa 2 [Homo sapiens]
AAK48829
13898623 acil coenzima A: colesterol aciltransferasa-2 [Homo sapiens]
XP_543637
73996435 PREDICHA: similar a esterol O-aciltransferasa 2 [Canis familiaris]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
O77759
18202176 Esterol O-aciltransferasa 2 (Colesterol aciltransferasa 2) (ACAT-2)
AA032474
28564191 ARE2 [Saccharomyces castellii]
XP_323485
32405744 proteína hipotética [Neurospora crassa]
NP_982606
45184888 AAR065Cp [Eremothecium gossypii]
NP_593708
19114620 proteína hipotética SPAC13G7.06 [Schizosaccharomyces pombe 972h-]
AA032554
28564940 ARE2 [Saccharomyces kluyveri]
EAL28962
54639560 GA20833-PA [Drosophila pseudoobscura]
XP_449806
50294790 proteína hipotética CAGL0M10571g [Candida glabrata CBS 138]
NP_033256
84619697 esterol O-aciltransferasa 1 [Mus musculus]
061263
18202591 Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1)
BAC34925
26342537 producto proteico no nombrado[Mus musculus]
XP_452607
50305295 producto proteico no nombrado[Kluyveromyces lactis]
NP_001...
77735363 proteína hipotética LOC504287 [Bos taurus]
Q60457
18202585 Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1)
XP_320321
58393811 ENSANGP00000016512 [Anopheles gambiae cepa PEST]
XP_320320
58393809 ENSANGP00000016486 [Anopheles gambiae cepa PEST]
O70536
18202126 Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1)
XP_714776
68482533 acil-CoA colesterol aciltransferasa [Candida albicans SC5314]
P84285
56404462 Esterol O-aciltransferasa 2 (Esterol-éster sintasa) (ASAT)
AAH77916
50416229 proteína Soat1-prov [Xenopus laevis]
XP_692855
68364838 PREDICHA: similar a proteína Soat1-prov [Danio rerio]
CAI13574
55960156 esterol O-aciltransferasa (acil-Coenzima A: colesterol aciltransferasa) 1 [Homo sapiens]
AAL56227
18028942 colesterol aciltransferasa 1 [Gorilla golilla]
AAL56228
18028944 colesterol aciltransferasa 1 [Pongo pygmaeus]
AAC37532
4878022 acil-coenzima A: colesterol aciltransferasa [Homo sapiens]
2201440A
1585676 acil-CoA:colesterol aciltransferasa
Q876L3
34582302 Esterol O-aciltransferasa 1 (Esterol-éster sintasa 1)
BAE01048
67969393 producto proteico no nombrado [Macaca fascicularis]
XP_514030
55588858 PREDICHA: proteína hipotética XP_514030 [Pan troglodytes]
XP_547445
73961286 similar a Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1) [Canis familiaris]
EAQ84619
88177151 proteína hipotética CHGG_08633 [Chaetomium globosum CBS 148.51]
O77761
18202178 Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1)
XP_422267
50751122 PREDICHA: similar a Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1) [Gallus gallus]
XP_693284
68392980 PREDICHA: similar a Esterol O-aciltransferasa 1 (Colesterol aciltransferasa 1) (ACAT-1) [Danio rerio]
AAT92940
51013293 YCR048W [Saccharomyces cerevisiae]
XP_956576
85080625 proteína hipotética [Neurospora crassa N150]
XP_624691
66564061 PREDICHA: similar a ENSANGP00000016486 [Apis mellifera]
CAF96514
47222847 producto proteico no nombrado [Tetraodon nigroviridis]
XP_788209
72085563 PREDICHA: similar a esterol O-aciltransferasa 1 [Strongylocentrotus purpuratus]
XP_445307
50285757 producto proteico no nombrado [Candida glabrata]
CAE70002
39596364 Proteína hipotética CBG16409 [Caenorhabditis briggsae]
CAG07990
47225647 producto proteico no nombrado [Tetraodon nigroviridis]
NP_510623
17549960 B0395.2 [Caenorhabditis elegans]
REFERENCIA
GI DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
AAX28331
76157393 proteína SJCHGC04421 [Schistosoma japonicum]
CAI96158
66347204 Diacilglicerol O-aciltransferasa [Bubalus bubalis]
XP_390039
46136695 proteína hipotética FG09863.1 [Gibberella zeae PH-1]
XP_643169
66819019 proteína hipotética DDB0203882 [Dictyostelium discoideum]
AAO53095
28850306 proteína hipotética [Dictyostelium discoideum]
AAB06959
1515472 acil-CoA:colesterol aciltransferasa [Oryctolagus cuniculus]
NP_945619
39933343 alginato o-acetiltransferasa Algl potencial [Rhodopseudomonas palustris CGA009]
ZP_008...
77691302 O-acil transferasa unida a membrana, MBOAT [Rhodopseudomonas palustris BisB5]
XP_465546
50908115 sintasa de cera potencial [Oryza sativa (grupo de cultivar japónica)]

Tabla 23: Ejemplos de polipéptidos de prenildifosfato sintasa
29A: proteínas de bacterias que requieren una secuencia de dirección mitocondrial
REFERENCIA
GI Descripción
ZP_009...
83373595 Trans-hexapreniltranstransferasa [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029]
ZP_009...
83371280 Trans-hexapreniltranstransferasa [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025]
CAD24417
20429105 decaprenil difosfato sintasa [Paracoccus zeaxanthinifaciens]
ZP_010...
85705714 Geranilgeranil pirofosfato sintasa/poliprenil sintetasa [Roseovarius sp. 217]
ZP_010...
84515724 decaprenil difosfato sintasa [Loktanella vestfoldensis SKA53]
YP_165582
56695234 decaprenil difosfato sintasa [Silicibacter pomeroyi DSS-3]
ZP_010...
86139019 decaprenil difosfato sintasa [Roseobacter sp. MED 193]
ZP_009...
83941379 decaprenil difosfato sintasa [Sulfitobacter sp. EE-36]
ZP_009...
83854856 decaprenil difosfato sintasa [Sulfitobacter sp. NAS-14.1]
ZP_006...
69299873 Farnesiltranstransferasa [Silicibacter sp. TM1040]
ZP_010...
84683979 Geranilgeranil pirofosfato sintasa/poliprenil sintetasa [Rhodobacterales bacterium HTCC2654]
ZP_009...
84500217 decaprenil difosfato sintasa [Oceanicola batsensis HTCC2597]
ZP_009...
83952381 decaprenil difosfato sintasa [Roseovarius nubinhibens ISM]
ZP_006...
69937106 Trans-hexapreniltranstransferasa [Paracoccus denitrificans PD1222]
ZP_005...
68180845 Trans-hexapreniltranstransferasa [Jannaschia sp. CCS1]
ZP_008...
78495595 Poliprenil sintetasa [Rhodopseudomonas palustris BisB18]
AAY82368
67866738 decaprenil difosfato sintasa [Agrobacterium tumefaciens]
NP_353656
15887975 proteína hipotética AGR_C_1125 [Agrobacterium tumefaciens cepa C58]
ZP_008...
77688465 Farnesiltranstransferasa [Rhodopseudomonas palustris BisB5]
NP_531334
17934544 octaprenil-difosfato sintasa [Agrobacterium tumefaciens cepa C58]
YP_484709
86748213 Farnesiltranstransferasa [Rhodopseudomonas palustris HaA2]
AAP56240
37903500 decaprenil difosfato sintasa [Agrobacterium tumefaciens]
YP_192388
58040424 Decaprenil difosfato sintasa [Gluconobacter oxydans 621H]
23B: subunidad 1-Proteínas que contienen secuencia de dirección mitocondrial
REFERENCIA
GI Descripción
T43193
11279237 homólogo de trans-pentapreniltranstransferasa -levadura de fisión (Schizosaccharomyces pombe)
AAD28559
4732024 trans-preniltransferasa [Homo sapiens]
AAI07275
78070698 Trans-preniltransferasa [Mus musculus]
BAE48216
81157931 subunidad 1 de decaprenil difosfato sintasa [Homo sapiens]
AAH49211
29165656 proteína PDSS1 [Homo sapiens]
Q33DR2
85700953 Decaprenil-difosfato sintasa subunidad 1 (Solanesil-difosfato sintasa subunidad 1) (Trans-preniltransferasa)
XP_507706
55633583 PREDICHA: similar a la proteína TPRT [Pan troglodytes]
XP_586717
76632198 PREDICHA: similar a trans-preniltransferasa [Bos taurus]
XP_849908
73948851 PREDICHA: similar a trans-preniltransferasa [Canis familiaris]
23C: Subunidad 2-Proteínas que contienen secuencia de dirección mitocondrial
REFERENCIA
GI Descripción
O13851
60389474 Decaprenil-difosfato sintasa subunidad 2 (Decaprenil pirofosfato sintetasa subunidad 2)
BAE48218
81157935 subunidad 2 de solanesil difosfato sintasa [Mus musculus]
BAE48217
81157933 subunidad 2 de decaprenil difosfato sintasa [Homo sapiens]

Tabla 24: Ejemplos de polipéptidos de PHB-polipreniltransferasa
GI
DESCRIPCIÓN DE LA PROTEÍNA
51013645
YNR041C [Saccharomyces cerevisiae]
50285815
producto proteico no nombrado [Candida glabrata]
50311051
producto proteico no nombrado [Kluyveromyces lactis]
45200866
AGL231Wp [Eremothecium gossypii]
50555263
proteína hipotética [Yarrowia lipolytica]
68473193
para-hidroxibenzoato: poliprenil transferasa [Candida albicans SC5314]
50410039
proteína hipotética DEHA0A14212g [Debaryomyces hansenii CBS767]
83769349
producto proteico no nombrado [Aspergillus oryzae]
70994900
precursor de para-hidroxibenzoato-polipreniltransferasa [Aspergillus fumigatus Af293]
19114131
proteína hipotética SPAC56F8. 04c [Schizosaccharomyces pombe 972h-]
39973573
proteína hipotética MG01067. 4 [Magnaporthe grisea 70-15]
85078920
proteína relacionada con el precursor de para-hidroxibenzoato polipreniltransferasa [Neurospora crassa N150]
76660839
PREDICHA: similar a para-hidroxibenzoato-polipreniltransferasa, mitocondrial [Bos taurus]
52138578
para-hidroxibenzoato-polipreniltransferasa, mitocondrial [Homo sapiens]
18088424
proteína COQ2 [Homo sapiens]
47221448
producto proteico no nombrado [Tetraodon nigroviridis]
58385249
ENSANGP00000012220 [Anopheles gambiae cepa PEST]
50746583
PREDICHA: similar a la proteína hipotética CL640 [Gallus gallus]
54638587
GA21912-PA [Drosophila pseudoobscura]
21355567
CG9613-PA [Drosophila melanogaster]
71005862
proteína hipotética UM01450.1 [Ustilago maydis 521]

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un hongo Yarrowia recombinante, caracterizado por que:
    5 a) el hongo es oleaginoso por que puede acumular lípidos hasta al menos 20 % de su peso celular seco; y b) el hongo produce al menos un carotenoide, y puede acumular el carotenoide producido hasta al menos 1 % de su peso celular seco; en el que el hongo comprende una modificación carotenogénica, la modificación confiere al hongo la capacidad de producir el al menos un carotenoide hasta un nivel de al menos
    10 1 % de su peso celular seco, la modificación carotenogénica aumenta la expresión o actividad de los siguientes polipéptidos carotenogénicos: polipéptido de GGPP sintasa, polipéptido de fitoeno sintasa, polipéptido de fitoeno deshidrogenasa, polipéptido de licopeno ciclasa, y polipéptido de HMG CoA reductasa,
    15 en el que los polipéptidos carotenogénicos derivan de un grupo de microorganismos que consiste en: Y. lipolytica, M. circinelloides, S. cerevisiae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.
  2. 2. El hongo de la reivindicación 1, en el que la al menos una modificación carotenogénica confiere al hongo la
    capacidad de producir el al menos un carotenoide hasta un nivel seleccionado del grupo que consiste en al menos 2 20 %, al menos 3 %, al menos 5 % y al menos 10 % del peso celular seco del hongo.
  3. 3. El hongo de la reivindicación 1 o 2, en el que el al menos un carotenoide se selecciona del grupo que consiste en astaxantina, -caroteno, cantaxantina, zeaxantina, luteína, licopeno y combinaciones de los mismos.
    25 4. El hongo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 3 caracterizado por que el hongo acumula lípidos en forma de cuerpos citoplasmáticos.
  4. 5. El hongo de la reivindicación 4, en el que el al menos un carotenoide se acumula en los cuerpos oleosos
    citoplasmáticos. 30
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