EA028659B1 - Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b - Google Patents
Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b Download PDFInfo
- Publication number
- EA028659B1 EA028659B1 EA201391170A EA201391170A EA028659B1 EA 028659 B1 EA028659 B1 EA 028659B1 EA 201391170 A EA201391170 A EA 201391170A EA 201391170 A EA201391170 A EA 201391170A EA 028659 B1 EA028659 B1 EA 028659B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- positions
- antigen
- δεο
- hbv
- sequence
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 307
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 title description 7
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 845
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 671
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 671
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 466
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 372
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 372
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 312
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 200
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 58
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 25
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 254
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 248
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 60
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 23
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 17
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 claims description 13
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N tenofovir disoproxil fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N 0.000 claims description 9
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 claims description 7
- 229960004556 tenofovir Drugs 0.000 claims description 7
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229960001997 adefovir Drugs 0.000 claims description 5
- WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N adefovir depivoxil Chemical compound N1=CN=C2N(CCOCP(=O)(OCOC(=O)C(C)(C)C)OCOC(=O)C(C)(C)C)C=NC2=C1N WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims description 4
- 229960000980 entecavir Drugs 0.000 claims description 4
- YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N entecavir hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)C1=C YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 claims description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 4
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 claims description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N telbivudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005311 telbivudine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960004693 tenofovir disoproxil fumarate Drugs 0.000 claims 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 23
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 20
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 195
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 180
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 179
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 159
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 154
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 142
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 126
- 229920005994 diacetyl cellulose Polymers 0.000 description 125
- 102100023933 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 107
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 97
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 94
- 101710147152 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 Proteins 0.000 description 89
- 102100020739 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 Human genes 0.000 description 89
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 67
- 108700024845 Hepatitis B virus P Proteins 0.000 description 60
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 50
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 47
- 101000763951 Homo sapiens Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim8 A Proteins 0.000 description 42
- 102100026808 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim8 A Human genes 0.000 description 42
- 238000013461 design Methods 0.000 description 35
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 27
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 27
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 23
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 23
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 18
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 18
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 15
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 14
- 208000034608 Congenital tufting enteropathy Diseases 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 201000001416 congenital diarrhea 5 with tufting enteropathy Diseases 0.000 description 13
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 13
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 12
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 12
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 10
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 9
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 101000662009 Homo sapiens UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Proteins 0.000 description 8
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 8
- 102100037921 UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Human genes 0.000 description 8
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 8
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 102100033270 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100022823 Histone RNA hairpin-binding protein Human genes 0.000 description 6
- 108091006627 SLC12A9 Proteins 0.000 description 6
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 102100023778 Corepressor interacting with RBPJ 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 101000906759 Homo sapiens Corepressor interacting with RBPJ 1 Proteins 0.000 description 5
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 5
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 5
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 3
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 3
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- -1 multimer Proteins 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- CZPRKINNVBONSF-UHFFFAOYSA-M zinc;dioxido(oxo)phosphanium Chemical compound [Zn+2].[O-][P+]([O-])=O CZPRKINNVBONSF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 2
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 2
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 101100137821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 208000030263 desmoplastic infantile astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000033586 regulation of DNA repair Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 101150063780 spp1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011301 standard therapy Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000007419 viral reactivation Effects 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101000827463 Bos taurus Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150014361 Delta gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000285387 HBV genotype A Species 0.000 description 1
- 241000285424 HBV genotype C Species 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108010015268 Integration Host Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100163882 Mus musculus Ascl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940047712 aluminum hydroxyphosphate Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003168 generic drug Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 108700025184 hepatitis B virus X Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 208000030247 mild fever Diseases 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 241000737598 recombinant Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000005582 sexual transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 101150026756 sir1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/66—Phosphorus compounds
- A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/11—Pteridophyta or Filicophyta (ferns)
- A61K36/12—Filicopsida or Pteridopsida
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/46—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6006—Cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Описаны иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей, антигены вируса гепатита В (HBV) и слитые белки для лечения и/или профилактики инфекции HBV и ее симптомов, а также способы применения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, антигенов HBV и слитых белков для профилактического и/или терапевтического лечения инфекции HBV и/или ее симптомов.
Description
Настоящее изобретение относится, главным образом, к иммунотерапевтическим композициям и способам профилактики и/или лечения инфекции вирусом гепатита В (ИВУ).
Уровень техники, к которому относится изобретение
Вирус гепатита В (НВУ) является представителем семейства гепаднавирусов и является этиологическим фактором острого и хронического гепатита по всему миру. Эпидемии НВУ широко распространены в Азии и Африке, и инфекция НВУ является эндемичной в Китае (^бйатк, К. (2006), О1оЪа1 сПа11епдек ίη Пусг бзкеаке, Нера!о1оду (ВаШтоге, Мб.) 44(3): 521-526). Более 2 миллиардов человек были инфицированы вирусом, и согласно оценке по всему миру хронически инфицировано НВУ 350 миллионов человек (Нераббк В, \Уог1б НеаПП 0гдат/а!юп, 2009; ЕЛО ЛЪоп! Нераббк В, §!апГогб 8сПоо1 оГМебБ сше. 2008-07-10). Путями инфекции являются инфицирование через контакт с кровью или жидкостью организма, включая переливание крови и в/в употребление наркотиков, передачу половым путем, укусы и повреждения и вертикальную передачу (например, деторождение).
НВУ встречается в качестве одного из четырех основных серотипов (абг, абте, ауг, ауте), которые определяются антигенными эпитопами в белках оболочки вирусов. Существует восемь различных генотипов (А-Н), исходя из варьирования нуклеотидной последовательности в геноме. Различия в генотипах влияют на тяжесть заболевания, течение заболевания и вероятность осложнений, ответ на лечение и, возможно, ответ на вакцинацию (Кгату18 е! а1., (2005), Уассте 23 (19): 2409-2423; Мадтик апб Иогбег, (1995), 1п!егу1го1оду 38 (1-2): 24-34).
Клинический период инкубации для НВУ, как правило, составляет 2-3 месяца; приблизительно две трети индивидуумов с острой инфекцией не имеют симптомов или имеют мягкие субклинические симптомы. Остальная одна треть инфицированных индивидуумов могут испытывать желтуху, воспаление печени, рвоту, боли и/или мягкую лихорадку, однако заболевание в конечном итоге разрешается у большинства взрослых и редко приводит к печеночной недостаточности. Действительно, приблизительно 95% взрослых выздоравливают полностью от инфекции НВУ и не становятся хронически инфицированными. Однако приблизительно 90% грудных детей и 25-50% детей в возрасте 1-5 лет остаются хронически инфицированными НВУ (Сеп!егк Гог Изкеаке Сойто1 апб Ргеуейюп, на сентябрь 2010 г.). Приблизительно 25% индивидуумов, которые становятся хронически инфицированными в детском возрасте и 15% индивидуумов, которые становятся хронически инфицированными старше детского возраста, преждевременно умирают от цирроза или печеночно-клеточной карциномы, и большинство хронически инфицированных индивидуумов остаются бессимптомными до возникновения цирроза или заболевания печени конечной стадии (СИС, на сентябрь 2010 г.). Результатом хронической инфекции НВУ является 1 млн смертей в год по всему миру (приблизительно 2000-4000 смертей в год в США). Хронически инфицированные индивидуумы имеют повышенные уровни аланинаминотрансферазы (АЬТ) (маркер повреждения печени), воспаление печени и/или фиброз при биопсии печени. Для пациентов, у которых развивается цирроз, показатель выживания в течение 5 лет составляет приблизительно 50%.
Мониторинг инфекции НВУ и ее лечения, как правило, проводят путем выявления вирусных антигенов и/или антител против антигенов. При инфицировании НВУ первым поддающимся выявлению антигеном является поверхностный антиген гепатита В (НВкАд), а затем антиген е гепатита В (НВеАд). На выведение вируса указывает появление 1дО-антител в сыворотке против НВкАд и/или против корового антигена (НВсАд), также известное как сероконверсия. Многочисленные исследования указывают на то, что на репликацию вируса, уровень виремии и прогрессирование в хроническое состояние у инфицированных НВУ индивидуумов прямо или непрямо влияет НВУ-специфический клеточный иммунитет, опосредуемый СИ4+ хелперными (ТН) и СИ8+ цитотоксическими Т лимфоцитами (СТЬ). Пациенты, прогрессирующие в хроническое заболевание, имеют тенденцию к отсутствию, наличию более слабых или узко сфокусированных НВУ-специфических Т-клеточных ответов по сравнению с пациентами, у которых острая инфекция проходит. См., например, СЫкап, 1997, ί. СПп. 1пуек! 99: 1472-1477; Маш1 е! а1. , 1999, Оак!гоеп!его1оду 117:1386-1396; КеПегтапп е! а1., 2005, Иа! Кеу 1ттипо1. 2005; 5:215-229; ТЫтте с! а1., 2001, ί. Уио1. 75: 3984-3987; ИгЪат е! а1., 2002, ί. Уио1.76: 12423-12434; УШапб апб СЫкап, 2005, ί. Уио1. 79: 9369-9380; \УеЪк1ег е! а1., 2000, Нера!о1оду 32:1117-1124; Реппа е! а1., 1996, ί. СПп. 1пуек! 98: 1185-1194; §ргепдегк е! а1., 2006, ί. Нера!о1 2006; 45: 182-189.
- 1 028659
Вакцины для профилактики НВУ коммерчески доступны с ранних 1980-х годов. Современные коммерческие вакцины представляют собой неинфекционные субъединичные вирусные вакцины, содержащие очищенный рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (НВкАд), и их можно вводить, начиная с рождения. Вакцины являются эффективными в отношении снижения встречаемости инфекции в странах, где вакцину вводят в плановом порядке. Хотя разрабатывается несколько иммунотерапевтических средств, включая различные белковые и эпитопные вакцины против НВУ и цитокины, в США в настоящее время отсутствуют одобренные иммунотерапевтические средства для лечения активной инфекции НВУ.
Текущая стандартная терапия (80С) инфекции НВУ включает, главным образом, противовирусные лекарственные средства, такие как тенофовир (У1КЕАО®), ламивудин (ЕР1У1К®), адефовир (НЕР8ЕКА®), телбивудин (ΤΥΖΕΚΑ®) и энтекавир (ВАКАСЬиПЕ®), а также интерферон-а2а и пегилированный интерферон-а2а (РΕСΑ8Υ8®). Эти лекарственные средства и, в частности, противовирусные лекарственные средства, как правило, вводят в течение длительных периодов времени (например, каждые сутки или каждую неделю в течение от одного до пяти лет или более), и хотя они замедляют или останавливают репликацию вируса, они, как правило, не обеспечивают полного излечения или устранения вируса. Подходы на основе интерферона являются токсичными и имеют невысокие показатели ремиссии. Противовирусная терапия ингибирует репликацию вирусов и лучше переносится, чем интерферон, но, как упоминалось выше, эти лекарственные средства, как правило, не обеспечивают полного излечения от вируса, и в некоторых случаях длительные показатели ремиссии не достигаются. Более того, в некоторых случаях происходит развитие устойчивости к лекарственному средству. Например, ламивудин является мощным пероральным противовирусным средством, которое ингибирует обратную транскриптазу НВУ (Ро1). Поскольку ламивудин хорошо переносится и поскольку он в настоящее время является дженериковым лекарственным средством, ламивудин является вариантом противовирусной терапии НВУ в развивающихся странах. Однако 20% ежегодный уровень устойчивости к вирусу вследствие точковых мутаций в последовательности Ро1 ограничивает применимость ламивудина при НВУ. Более того, ответ на лечение текущими противовирусными препаратами и интерфероном имеет отличающуюся эффективность среди генотипов НВУ (Сао, Аог1б 1оигиа1 οί Са81гоеи1его1оду 2009;15(46) :5761-9) и у некоторых пациентов, вследствие того, что ДНК вируса гепатита В может персистировать в организме, даже после устранения инфекции с течением времени может происходить реактивация вируса.
Таким образом, хотя стандартная терапия (80С) обеспечивает наилучшее одобренное в настоящее время лечение пациентов, страдающих хроническим НВУ, продолжительность терапии и значительные неблагоприятные явления могут приводить к несоблюдению режима лечения, снижению дозы и прекращению лечения в сочетании с формированием устойчивости вируса, реактивацией вируса, и к существованию пациентов, у которых ответ все еще отсутствует или не поддерживается. Таким образом, в данной области остается потребность в усовершенствованных терапевтических способах лечения инфекции НВУ.
Сущность изобретения
Один из вариантов осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции для лечения и/или профилактики инфекции вирусом гепатита В (НВУ) и/или симптома инфекции НВУ. Иммунотерапевтическая композиция содержит: (а) дрожжевой носитель и (Ь) один или несколько антигенов НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ представлены в качестве одного или нескольких слитых белков, хотя также могут быть предоставлены отдельные антигены белка НВУ. Антигены НВУ состоят из (ί) поверхностного антигена НВУ, содержащего по меньшей мере один иммуногенный домен полноразмерного большого (Ь), среднего (М) и/или малого (8) поверхностного антигена НВУ; (ίί) антигена полимеразы НВУ, содержащего по меньшей мере один иммунногенный домен полноразмерной полимеразы НВУ или ее домена (например, домен обратной транскриптазы (КТ)); (ίίί) корового антигена НВУ или е-антигена НВУ, содержащего по меньшей мере один иммуногенный домен полноразмерного корового белка НВУ и/или полноразмерного е-антигена НВУ соответственно; и/или (ίν) Х-антигена НВУ, содержащего по меньшей мере один иммуногенный домен полноразмерного Х-антигена НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ против одного или нескольких антигенов НВУ в композиции и/или против одного или нескольких антигенов вируса гепатита В, который инфицировал или может инфицировать индивидуума.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, касающийся иммунотерапевтической композиции, антигена НВУ, слитого белка или применения такой композиции, антигена НВУ или слитого белка, в одном из аспектов аминокислотная последовательность большого поверхностного антигена НВУ (Ь) может включать, но не ограничиваться ими, аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0: 3, 8ЕЦ ГО N0: 7, 81+) ГО N0: 11, 81+) ГО N0: 15, 81+) ГО N0: 19, 81+) ГО N0: 23, 81+) ГО N0: 27 или 81+) ГО N0: 31, или соответствующую последовательность из другого штамма/изолята НВУ. Аминокислотная последовательность полимеразы НВУ может включать, но не ограничиваться ими, аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 10, 8ЕЦ ГО N0: 14, 8ЕЦ ГО
- 2 028659
N0: 18, 8Ε0 ΙΌ N0: 22, 8Ε0 ΙΌ N0: 26 или 8Ε0 ΙΌ N0: 30, домен этих последовательностей, такой как домен обратной транскриптазы (КТ), или соответствующую последовательность из другого штамма/изолята НВУ. Аминокислотная последовательность прекорового белка НВУ, которая включает как последовательность корового белка НВУ, так и последовательность е-антигена НВУ, может включать, но не ограничиваться ими, аминокислотную последовательность, соответствующую 8Ε0 ГО N0: 1, 8Ε0 ГО N0: 5, 8ΕΟ ГО N0: 9, 8ΕΟ ГО N0: 13, 8ΕΟ ГО N0: 17, 8ΕΟ ГО N0: 21, 8ΕΟ ГО N0: 25 или 8ΙΤ) ГО N0: 29, или соответствующую последовательность из другого штамма/изолята НВУ. Аминокислотная последовательность Х-антигена НВУ может включать, но не ограничиваться ими, аминокислотную последовательность, соответствующую 8Ε0 ГО N0: 4, 8Ε0 ГО N0: 8, 8Ε0 ГО N0: 12, 8Ε0 ГО N0: 16, 8Ε0 ГО N0: 20, 8Ε0 ГО N0: 24, 8Ε0 ГО N0: 28 или 8Ε0 ГО N0: 32, или соответствующую последовательность из другого штамма/изолята НВУ.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка, в одном из аспектов аминокислоты поверхностного антигена НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке, или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, 8ΕΟ ГО N0: 3, 8ΕΟ ГО N0: 7, 8ΙΤ) ГО N0: 11, положения 21-47 8ΕΟ ГО N0: 11, положения 176-400 8ΙΤ) ГО N0: 11, 8ΕΟ ГО N0: 15, 8ΙΤ) ГО N0: 19, 8ΕΟ ГО N0: 23, 8ΕΟ ГО N0: 27, 8ΕΟ ГО N0: 31, положения 9407 8Ε0 ГО N0: 34, положения 6-257 8Ε0 ГО N0: 36, положения 6-257 8Ε0 ГО N0: 41, положения 92-343 8ΕΟ ГО N0: 92, положения 90-488 8ΕΟ ГО N0: 93, 8ΕΟ ГО N0: 97, положения 90-338 8ΕΟ ГО N0: 101, положения 7-254 8Ε0 ГО N0: 102, положения 1-249 8Ε0 ГО N0: 107, положения 1-249 8Ε0 ГО N0: 108, положения 1-249 8Ε0 ГО N0: 109, положения 1-249 8Ε0 ГО N0: 110, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 112, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 114, или положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 116, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 118, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 120, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 122, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 124, положения 1-399 8Ε0 ГО N0: 126, положения 231-629 8Ε0 ГО N0: 128, положения 63-461 8Ε0 ГО N0: 130, положения 289-687 8Ε0 ГО N0: 132, положения 289-687 8Ε0 ГО N0: 134 или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка, в одном из аспектов аминокислоты антигена НВУ-полимеразы, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, положения 383-602 8Ε0 ГО N0: 2, положения 381-600 8Ε0 ГО N0: 6, положения 381-600 8Ε0 ГО N0: 10, положения 453-680 8Ε0 ГО N0: 10, положения 370-589 8Ε0 ГО N0: 14, положения 380-599 8Ε0 ГО N0: 18, положения 381-600 8Ε0 ГО N0: 22, положения 380-599 8Ε0 ГО N0: 26, положения 381-600 8Ε0 ГО N0: 30, положения 260-604 8Ε0 ГО N0: 36, положения 7-351 8Ε0 ГО N0: 38, положения 7-351 8Ε0 ГО N0: 40, 260-604 8ΕΟ ГО N0: 41, положения 346-690 8ΕΟ ГО N0: 92, положения 90-434 8ΕΟ ГО N0: 94, 8ΕΟ ГО N0: 98, положения 339-566 8Ε0 ГО N0: 101, положения 255-482 8Ε0 ГО N0: 102, положения 250-477 8Ε0 ГО N0: 107, положения 250-477 8Ε0 ГО N0: 108, положения 250-477 8Ε0 ГО N0: 109, положения 250-477 8ΕΟ ГО N0: 110, положения 582-809 8ΙΤ) ГО N0: 120, положения 582-809 8ΕΟ ГО N0: 124, положения 642-869 8Ε0 ГО N0: 126, положения 1-228 8Ε0 ГО N0: 128, положения 1-228 8Ε0 ГО N0: 132, положения 61-288 8Ε0 ГО N0: 134, или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанного в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка, в одном из аспектов аминокислоты корового антигена НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 1, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 5, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 9, положения 37-188 8Ε0 ГО N0: 9, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 13, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 17, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 21, положения 14-194 8Ε0 ГО N0: 25, положения 31-212 8Ε0 ГО N0: 29, положения 408-589 8Ε0 ГО N0: 34, положения 605-786 8Ε0 ГО N0: 36, положения 352-533 8Ε0 ГО N0: 38, положения 160-341 8Ε0 ГО N0: 39, положения 605-786 8Ε0 ГО N0: 41, положения 691-872 8Ε0 ГО N0: 92, положения 90-271 8Ε0 ГО N0: 95, 8Ε0 ГО N0: 99, положения 567-718 8Ε0 ГО N0: 101, положения 483-634 8ΕΟ ГО N0: 102, положения 2-183 8ΙΤ) ГО N0: 105, положения 184-395 8ΙΤ) ГО N0: 105, положения 396-578 8Ε0 ГО N0: 105, положения 579-761 8Ε0 ГО N0: 105, положения 2-183 8Ε0 ГО N0: 106, 338-520 8ΕΟ ГО N0: 106, положения 478-629 8ΙΤ) ГО N0: 107, положения 478-629 8ΕΟ ГО N0: 108, положения 478-629 8Ε0 ГО N0: 109, положения 478-629 8Ε0 ГО N0: 110, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 112, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 114, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 116, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 118, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 120, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 122, положения 400581 8Ε0 ГО N0: 124, положения 400-581 8Ε0 ГО N0: 126, положения 630-811 8Ε0 ГО N0: 128, положения 462-643 8ΕΟ ГО N0: 130, положения 688-869 8ΙΤ) ГО N0: 132, положения 688-869 8ΙΤ) ГО N0: 134, или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
- 3 028659
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка, в одном из аспектов аминокислоты Х-антигена НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, 8ЕО ГО N0: 4, 8ЕО ГО N0: 8, 8ЕО ГО N0: 12, положения 2-154 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 16, 8ЕО ГО N0: 20, 8ЕО ГО N0: 24, 8Е0 ГО N0: 28, 8Е0 ГО N0: 32, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 4, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 8, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 12, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 16, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 20, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 24, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 28, положения 52-68, а затем положения 84-126 8Е0 ГО N0: 32, положения 787-939 8Е0 ГО N0: 36, положения 7-159 8Е0 ГО N0: 39, положения 873-1025 8Е0 ГО N0: 92, положения 90-242 8ЕО ГО N0: 96, 8ЕО ГО N0: 100, положения 719-778 8ЕО ГО N0: 101, положения 635-694 8Е0 ГО N0: 102, положения 184-337 8Е0 ГО N0: 106, положения 521-674 8Е0 ГО N0: 106, положения 630-689 8Е0 ГО N0: 107, положения 630-689 8Е0 ГО N0: 108, положения 630-689 8Е0 ГО N0: 109, положения 630-689 8Е0 ГО N0: 110, положения 582-641 8Е0 ГО N0: 122, положения 810869 8Е0 ГО N0: 124, положения 582-641 8Е0 ГО N0: 126, положения 1-60 8Е0 ГО N0: 130, положения 229-288 8Е0 ГО N0: 132, положения 1-60 8Е0 ГО N0: 134, или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из (ί) Х-антигена НВУ, содержащего по меньшей мере один иммуногенный домен полноразмерного Х-антигена НВУ; (ίί) поверхностного антигена НВУ, содержащего по меньшей мере один иммуногенный домен полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, и (ίίί) корового антигена НВУ, содержащего по меньшей мере один иммуногенный домен полноразмерного корового белка НВУ. В одном из аспектов этого варианта осуществления иммунотерапевтическая композиция содержит: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из (ί) Х-антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична положениям 52-126 полноразмерного Х-антигена НВУ; (ίί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, и (ίίί) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ.
В одном из аспектов варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность Хантигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из: положений 1-60 8Е0 ГО N0: 130, положений 630-689 8Е0 ГО N0: 110, положений 582-641 8Е0 ГО N0: 122, положений 630-689 8Е0 ГО N0: 107, положений 630-689 8Е0 ГО N0: 108, положений 630-689 8Е0 ГО N0: 109, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 4, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 8, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 12, положении 52-68, а затем положений 84126 8Е0 ГО N0: 16, положении 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 20, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 24, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 28, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0: 32, 8Е0 ГО N0: 100, положений 719-778 8Е0 ГО N0: 101, положений 635-694 8Е0 ГО N0: 102, положений 810-869 8Е0 ГО N0: 124, положений 582-641 8Е0 ГО N0: 126, положений 229-288 8Е0 ГО N0: 132, положений 1-60 8Е0 ГО N0: 134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность Х-антигена НВУ выбрана из: положений 1-60 8Е0 ГО N0:130, положений 630-689 8Е0 ГО N0:110, положений 582-641 8Е0 ГО N0:122, положений 630-689 8Е0 ГО N0:109, положений 630-689 8Е0 ГО N0:108, положений 630-689 8Е0 ГО N0: 107, 8Е0 ГО N0: 100 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из: положений 63-461 8Е0 ГО N0: 130, положений 1-399 8Е0 ГО N0: 118, положений 1-399 8Е0 ГО N0: 122, положений 9-407 8Е0 ГО N0: 34, положений 1-399 8Е0 ГО N0: 112, положений 1-399 8Е0 ГО N0: 114, положений 1-399 8ЕО ГО N0: 116, 8ЕО ГО N0: 3, 8ЕО ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 15, 8ЕО ГО N0: 19, 8ЕО ГО N0: 23, 8ЕО ГО N0: 27, 8ЕО ГО N0: 31, положений 90-488 8ЕО ГО N0: 93, положений 1-399 8ЕО ГО N0: 120, положений 1-399 8Е0 ГО N0: 124, положений 1-399 8Е0 ГО N0: 126, положений 231-629 8Е0 ГО N0:128, положений 289-687 8Е0 ГО N0:132, положений 289-687 8Е0 ГО N0:134, или соответст- 4 028659 вующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ выбрана из положений 63-461 8ЕЦ ГО N0: 130, положений 1399 8ЕЦ ГО N0: 118, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0: 122, положений 9-407 8ЕЦ ГО N0: 34, положений 1399 8ЕЦ ГО N0: 112, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0: 114, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0: 116 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 462-643 8ЕЦ ГО N0: 130, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 118, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 122, положений 408-589 8ЕЦ ГО N0: 34, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 112, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 114, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 116, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 1, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 5, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 9, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 13, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 17, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 21, положений 14-194 8ЕЦ ГО N0: 25, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0: 29, положений 605-786 8ЕЦ ГО N0: 36, положений 352-533 8ЕЦ ГО N0: 38, положений 160-341 8ЕЦ ГО N0: 39, положений 605-786 8ЕЦ ГО N0: 41, положений 691-872 8ЕЦ ГО N0: 92, положений 90-271 8ЕЦ ГО N0: 95, положений 2-183 8ЕЦ ГО N0: 105, положений 184-395 8ЕЦ ГО N0: 105, положений 396-578 8ЕЦ ГО N0: 105, положений 579-761 8ЕЦ ГО N0: 105, положений 2-183 8ЕЦ ГО N0: 106, 338-520 8ЕЦ ГО N0: 106, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 120, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 124, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0: 126, положений 630-811 8ЕЦ ГО N0: 128, положений 688-869 8ЕЦ ГО N0: 132, положений 688869 8ЕЦ ГО N0: 134 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность корового антигена НВУ выбрана из положений 462-643 8ЕЦ ГО N0:130, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:118, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:122, положений 408-589 8ЕЦ ГО N0:34, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:116, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:112, положений 400581 8ЕЦ ГО N0:114 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов варианта осуществления изобретения антигены НВУ расположены в следующем порядке от N к С-концу в слитом белке: Х-антиген НВУ, поверхностный антиген НВУ, коровый антиген НВУ. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения антигены НВУ расположены в следующем порядке от N к С-концу в слитом белке: поверхностный антиген НВУ, коровый антиген НВУ, Х-антиген НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0:130, 8ЕЦ ГО N0:122 или 8ЕЦ ГО N0:150.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) целые инактивированные нагреванием дрожжи ЗассЬатотусек сетеу151ае и (Ь) слитый белок НВУ, экспрессируемой дрожжами, где слитый белок содержит 8ЕЦ ГО N0:130.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) целые инактивированные нагреванием дрожжи ЗассЬатотусек сетеу1К1ае и (Ь) слитый белок НВУ, экспрессируемый дрожжами, где слитый белок содержит 8ЕЦ ГО N0:150.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) целые инактивированные нагреванием дрожжи ЗассЬатотусек сетеу1К1ае и (Ь) слитый белок НВУ, экспрессируемый дрожжами, где слитый белок содержит ЗЕЦ ГО N0:122. В одном из аспектов слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими последовательностями, слитыми в рамке считывания от N к С-концу: (1) аминокислотная последовательность 8ЕЦ ГО N0:37; (2) линкерный пептид из двух аминокислот треонин-серин; (3) аминокислотная последовательность 8ЕЦ ГО N0:122 и (4) гексагистидиновый пептид.
В другом варианте осуществления изобретения иммунотерапевтическая композиция включает: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, состоящие из (ί) по меньшей мере одного иммуногенного домена большого поверхностного антигена (Ь) НВУ и (ίί) по меньшей мере одного иммуногенного домена корового белка НВУ или е-антигена НВУ. Композиция индуцирует НВУспецифический иммунный ответ, такой как иммунный ответ против большого поверхностного антигена НВУ (Ь) и/или корового белка НВУ или е-антигена НВУ.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, состоящие из (ί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, и (ίί) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления антигены НВУ состоят из аминокислотной последова- 5 028659 тельности, содержащей по меньшей мере 95% полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, слитой с аминокислотной последовательностью, содержащей по меньшей мере 95% полноразмерного корового белка НВУ или е-антигена НВУ. В одном из аспектов этого варианта осуществления антигены НВУ состоят из аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере 95% полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, слитого с Ν-концом аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере 95% полноразмерного корового белка НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ состоят из аминокислот 2-400 большого поверхностного белка (Ь) НВУ и аминокислот 31-212 прекорового белка НВУ, содержащего коровый белок НВУ и часть е-антигена НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 1-399 8ЕО ГО N0:118, положений 9-407 8Е0 ГО N0:34, положений 1-399 8Е0 ГО N0:116, положений 1-399 8Е0 ГО N0:112, положений 1-399 8Е0 ГО N0:114, 8Е0 ГО N0:3 или положений 2-400 8Е0 ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:7 или положений 2-400 8Еф ГО N0:7, 8Еф ГО N0:11 или положений 2-400 8Е0 ГО N0:11, 8Е0 ГО N0:15 или положений 2-389 8Е0 ГО N0:15, 8Е0 ГО N0:19 или положений 2-399 8Е0 ГО N0:19, 8Е0 ГО N0:23 или положений 2-400 8Е0 ГО N0:23, 8Е0 ГО N0:27 или положений 2-399 8Е0 ГО N0:27, 8Е0 ГО N0:31 или положений 2-400 8Е0 ГО N0:31, положений 90-488 8Е0 ГО N0:93, положений 1-399 8Е0 ГО N0:120, положений 1-399 8Е0 ГО N0:122, положений 1-399 8Е0 ГО N0:124, положений 1-399 8Е0 ГО N0:126, положений 231-629 8Е0 ГО N0:128, положений 63-461 8Е0 ГО N0:130, положений 289-687 8Е0 ГО N0:132, положений 289-687 8Е0 ГО N0:134 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ выбрана из положений 1-399 8Е0 ГО N0:118, положений 9-407 8Е0 ГО N0:34, положений 1-399 8Е0 ГО N0:112, положений 1-399 8Е0 ГО N0:114, положений 1-399 8Е0 ГО N0:116 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из: положений 400-581 8Е0 ГО N0:118, положений 408-589 8Е0 ГО N0:34, положений 400-581 8Е0 ГО N0:116, положений 400-581 8Е0 ГО N0:112, положений 400-581 8Е0 ГО N0:114, положений 31-212 8Е0 ГО N0:1, положений 31-212 8Е0 ГО N0:5, положений 31-212 8Е0 ГО N0:9, положений 31-212 8Е0 ГО N0:13, положений 31-212 8Е0 ГО N0:17, положений 31-212 8Е0 ГО N0:21, положений 14-194 8Е0 ГО N0:25, положений 31-212 8Е0 ГО N0:29, положений 605-786 8Е0 ГО N0:36, положений 352-533 8Е0 ГО N0:38, положений 160-341 8Е0 ГО N0:39, положений 605-786 8Е0 ГО N0:41, положений 691-872 8Е0 ГО N0:92, положений 90-271 8Е0 ГО N0:95, положений 2-183 8Е0 ГО N0:105, положений 184-395 8Е0 ГО N0:105, положений 396-578 8Е0 ГО N0:105, положений 579-761 8Е0 ГО N0:105, положений 2-183 8Е0 ГО N0:106, 338-520 8ЕО ГО N0:106, положений 400-581 8ЕО ГО N0:120, положений 400-581 8ЕО ГО N0:122, положений 400-581 8Е0 ГО N0:124, положений 400-581 8Е0 ГО N0:126, положений 630-811 8Е0 ГО N0:128, положений 462-643 8Е0 ГО N0:130, положений 688-869 8Е0 ГО N0:132, положений 688-869 8Е0 ГО N0:134 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность корового антигена НВУ выбрана из положений 400-581 8Е0 ГО N0:118, положений 408-589 8Е0 ГО N0:34, положений 400-581 8Е0 ГО N0:116, положений 400581 8Е0 ГО N0:112, положений 400-581 8Е0 ГО N0:114 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения антигены НВУ состоят из аминокислот 9-589 8Е0 ГО N0:34 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из: 8Е0 ГО N0:118, 8Е0 ГО N0:116, положений 9-589 8Е0 ГО N0:34, 8Е0 ГО N0:112, 8Е0 ГО N0:114, или соответствующей последовательности для другого штамма НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ состоят из полноразмерного или практически полноразмерного большого поверхностного антигена (Ъ) НВУ и полноразмерного или практически полноразмерного корового белка НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения любые из слитых белков могут включать ^концевую аминокислотную последовательность (присоединенную к Оконцу слитого белка) 8Е0 ГО N0:37. В другом аспекте любые из слитых белков могут включать ^концевую аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0:89 или 8Е0 ГО N0:90. В одном из аспектов слитый белок содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:151.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) целые инактивированные нагреванием дрожжи 8ассЬагошусс8 ссгсуыас и (Ь) слитый бе- 6 028659 лок ИВУ, экспрессируемый дрожжами, где слитый белок содержит 8ЕЦ ГО N0:118.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) целые инактивированные нагреванием дрожжи 8аееЬаготуее8 есгсуыас и (Ь) слитый белок НВУ, экспрессируемый дрожжами, где слитый белок содержит 8ЕЦ ГО N0:151.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) целые инактивированные нагреванием дрожжи 8аееЬаготуее8 еегсуыае и (Ь) слитый белок НВУ, экспрессируемый дрожжами, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность 81+) ГО N0:34.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ. Антигены НВУ состоят из (ί) поверхностного антигена НВУ, состоящего из по меньшей мере одного иммуногенного домена полноразмерного большого (Ъ), среднего (М) или малого (8) поверхностного антигена НВУ; (ίί) антигена полимеразы НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена полноразмерной полимеразы НВУ или домена обратной транскриптазы (КТ) НВУ-полимеразы; (ίίί) корового антигена НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена полноразмерного корового белка НВУ или полноразмерного е-антигена НВУ и (ίν) Х-антигена НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена полноразмерного Х-антигена НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления поверхностный антиген НВУ содержит по меньшей мере один иммуногенный домен распознаваемой рецептором для гепатоцитов области Рге-81 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ и по меньшей мере один иммуногенный домен малого поверхностного антигена (8) НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления антигены НВУ состоят по меньшей мере из 95% полноразмерной распознаваемой рецептором гепатоцитов области Рге-81 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, по меньшей мере 95% полноразмерного малого поверхностного антигена (8) НВУ, по меньшей мере 95% домена обратной транскриптазы полимеразы НВУ, по меньшей мере 95% полноразмерного корового белка НВУ или е-антигена НВУ и по меньшей мере 95% полноразмерного Х-антигена. В одном из аспектов антигены НВУ состоят из большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, содержащего по меньшей мере 95% из аминокислот 120-368 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ; КТдомена полимеразы НВУ, содержащего по меньшей мере 95% из аминокислот 453-680 КТ-домена полимеразы НВУ; корового белка НВУ, содержащего по меньшей мере 95% из аминокислот 37-188 корового белка НВУ; и Х-антигена НВУ, содержащего по меньшей мере 80% из аминокислот 52-127 Х-антигена НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ состоят из аминокислот 21-47 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, содержащих распознаваемый рецепторами гепатоцитов домен Рге-81; аминокислот 176400 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, содержащих малый поверхностный антиген (8) НВУ; аминокислот 247-691 полимеразы НВУ, содержащих домен обратной транскриптазы; аминокислот 31212 прекорового белка НВУ, содержащих коровый белок НВУ и часть е-антигена НВУ; и аминокислот 2154 Х-антигена НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ состоят из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотам 120-368 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ; аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотам 453-680 КТ-домена полимеразы НВУ; аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотам 37-188 корового белка НВУ; и аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотам 52-127 Х-антигена НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ модифицированы так, чтобы они включали один или несколько Т-клеточных эпитопов, указанных в табл. 5 и представленных в настоящем описании в качестве 8ЕЦ ГО N0:42-88 или 8ЕЦ ГО N0:135140. В одном из аспектов большой поверхностный антиген (Ь) НВУ содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:97 или последовательность, которая на 95% идентична 8ЕЦ ГО N0:97. В одном из аспектов КТ-домен полимеразы НВУ содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:98 или последовательность, которая на 95% идентична 8ЕЦ ГО N0:98. В одном из аспектов НВУ коровый белок содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:99 или последовательность, которая на 95% идентична 8ЕЦ ГО N0:99. В одном из аспектов Х-антиген НВУ содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:100 или последовательность, которая на 95% идентична 8ЕЦ ГО N0:100.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 1-399 8ЕЦ ГО N0:124, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0:126, положений 289-687 81+) ГО N0:132, положений 289-687 81+) ГО N0:134, 81+) ГО N0:3, 81+) ГО N0:7, 81+) ГО N0:11, 81+) ГО N0:15, 81+) ГО N0:19, 81+) ГО N0:23, 81+) ГО N0:27, 81+) ГО N0:31, положений 9-407 81+) ГО N0:34, положений 90-488 8ЕЦ ГО N0:93, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0:112, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0:114, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0:116, положений 1-399 8ЕЦ ГО N0:118, положений 1-399 8ЕЦ ГО
- 7 028659
N0:120, положений 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 231-629 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 63-461 δΕΟ ΙΌ N0:130, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ΙΌ N0:97, положений 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 21-47 δΕΟ ΙΌ N0:11, положений 176-400 δΕΟ ΙΌ N0:11, положений 6-257 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 6-257 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 92-343 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90-338 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 7-254 δΕΟ ΙΌ N0:102, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления антиген полимеразы НВУ состоит по меньшей мере из одного иммуногенного домена КТ-домена полимеразы НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность антигена полимеразы НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ΙΌ N0:98, положений 582-809 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 642-869 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 1-228 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 61-288 δΕΟ ΙΌ N0:134, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 383-602 δΕΟ ΙΌ N0:2, положений 381-600 δΕΟ ΙΌ N0:6, положений 381-600 δΕΟ ΙΌ N0:10, положений 453-680 δΕΟ ΙΌ N0:10, положений 370-589 δΕΟ ΙΌ N0:14, положений 380-599 δΕΟ ΙΌ N0:18, положений 381-600 δΕΟ ΙΌ N0:22, положений 380-599 δΕΟ ΙΌ N0:26, положений 381-600 δΕΟ ΙΌ N0:30, положений 260-604 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 7-351 δΕΟ ΙΌ N0:38, положений 7-351 δΕΟ ΙΌ N0:40, 260-604 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 346-690 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90-434 δΕΟ ΙΌ N0:94, положений 339-566 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 255-482 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 582-809 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 1-228 δΕΟ ΙΌ N0:128, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:134, положений 408-589 δΕΟ ΙΌ N0:34, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:112, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:114, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:116, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:1, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:5, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:13, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:17, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:21, положений 14-194 δΕΟ ΙΌ N0:25, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:29, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 352-533 δΕΟ ΙΌ N0:38, положений 160-341 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 691-872 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90-271 δΕΟ ΙΌ N0:95, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 184-395 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 396-578 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 579-761 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 2183 δΕΟ ΙΌ N0:106, 338-520 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 462-643 δΕΟ ΙΌ N0:130, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений δΕΟ ΙΌ N0:99, 37-188 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 567-718 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 483-634 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:110, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления Х-антиген НВУ состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична полноразмерному Х-антигену НВУ. В одном из аспектов Х-антиген НВУ по меньшей мере на 95% идентичен, или по меньшей мере на 96% идентичен, или по меньшей мере на 97% идентичен, или по меньшей мере на 98% идентичен, или по меньшей мере на 99% идентичен, или идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ΙΌ N0:4, δΕΟ ΙΌ N0:8, δΕΟ ΙΌ N0:12, положений 2-154 δΕΟ ΙΌ N0:12, δΕΟ ΙΌ N0:16, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:28, δΕΟ ΙΌ N0:32, положений 787-939 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 7159 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 873-1025 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90-242 δΕΟ ΙΌ N0:96, положений 184-337 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 521-674 δΕΟ ΙΌ N0:106, или соответствующей последовательности
- 8 028659 из другого штамма НВ V.
В одном из аспектов Х-антиген ΗΒν состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична положениям 52-126 полноразмерного Х-антигена ΗΒν. В одном из аспектов аминокислотная последовательность Х-антигена ΗΒν по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ГО N0:100, положений 810-869 δΕΟ ГО N0:124, положений 582-641 δΕΟ ГО N0:126, положений 229-288 δΕΟ ГО N0:132, положений 1-60 δΕΟ ГО N0:134, положений 630-689 δΕΟ ГО N0:107, положений 630-689 δΕΟ ГО N0:108, положений 630-689 δΕΟ ГО N0:109, положений 630-689 δΕΟ ГО N0:110, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:4, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:8, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:12, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:16, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:20, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:24, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:28, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ГО N0:32, положений 719-778 δΕΟ ГО N0:101, положений 635-694 δΕΟ ГО N0:102, положений 582-641 δΕΟ ГО N0:122, положений 1-60 δΕΟ ГО N0:130, или соответствующей последовательности из другого штамма ΗΒν.
В одном из аспектов этого варианта осуществления антигены ΗΒν имеют аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 6-939 δΕΟ ГО N0:36, положений 92-1025 δΕΟ ГО N0:92, положений 90-778 δΕΟ ГО N0:101, положений 7-694 δΕΟ ГО N0:102, или соответствующей последовательности из другого штамма ΗΒν.
В одном из аспектов этого варианта осуществления слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ГО N0:107, δΕΟ ГО N0:108, δΕΟ ГО N0:109, δΕΟ ГО N0:110, δΕΟ ГО N0:124, δΕΟ ГО N0:126, δΕΟ ГО N0:132 или δΕΟ ГО N0:134.
В одном из аспектов любой из слитых белков может содержать ^концевую последовательность, выбранную из δΕΟ ГО N0:37, δΕΟ ГО N0:89 или δΕΟ ГО N0:90.
В одном из аспектов этого варианта осуществления слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ГО N0:36, δΕΟ ГО N0:92, δΕΟ ГО N0:101 или δΕΟ ГО N0:102.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены ΗΒν, где антигены ΗΒν состоят из (ί) поверхностного антигена ΗΒν, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена распознаваемой рецептором гепатоцитов области Рге-81 большого поверхностного антигена (Ъ) ΗΒν и по меньшей мере одного иммуногенного домена малого поверхностного антигена (δ) ΗΒν; (ίί) антигена полимеразы ΗΒν, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена из домена обратной транскриптазы полимеразы ΗΒν; и (ίίί) корового антигена ΗΒν, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена корового белка ΗΒν. Композиция индуцирует ΗΒν-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов антигены ΗΒν состоят по меньшей мере из 95% полноразмерной распознаваемой рецепторами гепатоцитов области Рге-δ 1 большого поверхностного антигена (Ь) ΗΒν, по меньшей мере из 95% полноразмерного малого поверхностного антигена ΗΒν, по меньшей мере 95% полноразмерного домена обратной транскриптазы полимеразы ΗΒν и по меньшей мере 95% полноразмерного корового белка ΗΒν. В одном из аспектов антигены ΗΒν состоят по меньшей мере из 95% полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) ΗΒν, по меньшей мере 95% полноразмерного домена обратной транскриптазы полимеразы ΗΒν и по меньшей мере 95% полноразмерного корового белка ΗΒν.
В одном из аспектов этого варианта осуществления аминокислотная последовательность поверхностного антигена ΗΒν по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 231-629 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:112, положений 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:114, положений 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:116, положений 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:118, положений 6-257 δΕΟ ΙΌ N0:41, δΕΟ ΙΌ N0:3, δΕΟ ΙΌ N0:7, δΕΟ ΙΌ N0:11, положений 21-47 δΕΟ ΙΌ N0:11, положений 176-400 δΕΟ ΙΌ N0:11, δΕΟ ΙΌ N0:15, δΕΟ ΙΌ N0:19, δΕΟ ΙΌ N0:23, δΕΟ ΙΌ N0:27, δΕΟ ΙΌ N0:31, положений 9-407 δΕΟ ΙΌ N0:34, положений 6-257 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 92-343 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90-488 δΕΟ ΙΌ N0:93, δΕΟ ΙΌ N0:97, положений 90-338 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 7-254 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 1-249 δΕΟ
- 9 028659
ΙΌ N0:109, положений 1-249 8ЕЦ ΙΌ N0:110, положений 1-399 §ЕЦ ΙΌ N0:122, положений 1-399 §ЕЦ ГО N0:124, положений 1-399 §ЕЦ ГО N0:126, положений 63-461 §ЕЦ ГО N0:130, положений 289-687 8Е0 ГО N0:132, положений 289-687 §ЕЦ ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность антигена полимеразы НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 582-809 §ЕЦ ГО N0:120, положений 1-228 §ЕЦ ГО N0:128, положений 250-477 §ЕЦ ГО N0:107, положений 250-477 §ЕЦ ГО N0:108, положений 250-477 §ЕЦ ГО N0:109, положений 250-477 8ЕЦ ГО N0:110, 260-604 8ЕЦ ГО N0:41, положений 383-602 8ЕЦ ГО N0:2, положений 381-600 8ЕЦ ГО N0:6, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:10, положений 453-680 §ЕЦ ГО N0:10, положений 370-589 §ЕЦ ГО N0:14, положений 380-599 §ЕЦ ГО N0:18, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:22, положений 380-599 §ЕЦ ГО N0:26, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:30, положений 260-604 §ЕЦ ГО N0:36, положений 7-351 §ЕЦ ГО N0:38, положений 7-351 §ЕЦ ГО N0:40, положений 346-690 §ЕЦ ГО N0:92, положений 90-434 §ЕЦ ГО N0:94, 8ЕЦ ГО N0:98, положений 339-566 8ЕЦ ГО N0:101, положений 255-482 8ЕЦ ГО N0:102, положений 582-809 §ЕЦ ГО N0:124, положений 642-869 §ЕЦ ГО N0:126, положений 1-228 §ЕЦ ГО N0:132, положений 61-288 8Е0 ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:120, положений 630-811 8ЕЦ ГО N0:128, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:112, положений 400-581 §ЕЦ ГО N0:114, положений 400-581 §ЕЦ ГО N0:116, положений 400-581 §ЕЦ ГО N0:118, положений 605-786 §ЕЦ ГО N0:41, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:1, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:5, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:9, положений 37-188 §ЕЦ ГО N0:9, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:13, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:17, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:21, положений 14-194 §ЕЦ ГО N0:25, положений 31-212 §ЕЦ ГО N0:29, положений 408-589 §ЕЦ ГО N0:34, положений 605-786 §ЕЦ ГО N0:36, положений 352-533 §ЕЦ ГО N0:38, положений 160-341 §ЕЦ ГО N0:39, положений 691-872 §ЕЦ ГО N0:92, положений 90-271 §ЕЦ ГО N0:95, §ЕЦ ГО N0:99, положений 567-718 §ЕЦ ГО N0:101, положений 483-634 §ЕЦ ГО N0:102, положений 2-183 §ЕЦ ГО N0:105, положений 184-395 §ЕЦ ГО N0:105, положений 396-578 8ЕЦ ГО N0:105, положений 579-761 8ЕЦ ГО N0:105, положений 2-183 8ЕЦ ГО N0:106, 338520 §ЕЦ ГО N0:106, положений 478-629 §ЕЦ ГО N0:107, положений 478-629 §ЕЦ ГО N0:108, положений 478-629 8ЕЦ ГО N0:109, положений 478-629 8ЕЦ ГО N0:110, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:122, положений 400-581 §ЕЦ ГО N0:124, положений 400-581 §ЕЦ ГО N0:126, положений 462-643 §ЕЦ ГО N0:130, положений 688-869 §ЕЦ ГО N0:132, положений 688-869 §ЕЦ ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0:120, §ЕЦ ГО N0:128, положений 6-786 §ЕЦ ГО N0:41 или §ЕЦ ГО N0:41, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из (ί) антигена полимеразы НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена из домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ; и (ίί) корового антигена НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена корового белка НВУ. Композиция индуцирует НВУспецифический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения антигены НВУ состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична полноразмерному КТ-домену полимеразы НВУ, и аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична полноразмерному коровому белку НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность антигена полимеразы НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 7-351 §ЕЦ ГО N0:38, положений 383-602 §ЕЦ ГО N0:2, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:6, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:10, положений 453-680 §ЕЦ ГО N0:10, положений 370-589 §ЕЦ ГО N0:14, положений 380-599 §ЕЦ ГО N0:18, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:22, положений 380-599 §ЕЦ ГО N0:26, положений 381-600 §ЕЦ ГО N0:30, положений 260-604 §ЕЦ ГО N0:36, положений 7-351 §ЕЦ ГО N0:40, 260-604 8ЕЦ ГО N0:41, положений 346-690 8ЕЦ ГО N0:92, положений 90-434 8ЕЦ ГО N0:94, §ЕЦ ГО N0:98, положений 339-566 §ЕЦ ГО N0:101, положений 255-482 §ЕЦ ГО N0:102, положений 250- 10 028659
477 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 582-809 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 582-809 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 642-869 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 1-228 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 1-228 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 61-288 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 352-533 δΕΟ ΙΌ N0:38, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:1, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:5, положений 31212 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 37-188 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:13, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:17, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:21, положений 14-194 δΕΟ ΙΌ N0:25, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:29, положений 408-589 δΕΟ ΙΌ N0:34, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 160341 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 691-872 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90271 δΕΟ ΙΌ N0:95, δΕΟ ΙΌ N0:99, положений 567-718 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 483-634 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 184-395 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 396-578 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 579-761 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:106, 338-520 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:112, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:114, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:116, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 462-643 δΕΟ ΙΌ N0:130, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ N0:38, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из (ί) Х-антигена НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена Хантигена НВУ; и (ίί) корового антигена НВУ, состоящего по меньшей мере из одного иммуногенного домена корового белка НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления антигены НВУ состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична полноразмерному Х-антигену НВУ, и аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична полноразмерному коровому белку НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 160-341 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:1, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:5, положений 31212 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 37-188 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:13, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:17, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:21, положений 14-194 δΕΟ ΙΌ N0:25, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:29, положений 408-589 δΕΟ ΙΌ N0:34, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 352533 δΕΟ ΙΌ N0:38, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 691-872 δΕΟ ΙΌ N0:92, положений 90271 δΕΟ ΙΌ N0:95, δΕΟ ΙΌ N0:99, положений 567-718 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 483-634 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 184-395 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 396-578 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 579-761 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:106, 338-520 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:112, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:114, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:116, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 462-643 δΕΟ ΙΌ N0:130, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность Х-антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 7-159 δΕΟ ΙΌ N0:39, δΕΟ ΙΌ N0:4, δΕΟ ΙΌ N0:8, δΕΟ ΙΌ N0:12, положений 2-154 δΕΟ ΙΌ N0:12, δΕΟ ΙΌ N0:16, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:28, δΕΟ ΙΌ N0:32, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:4, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:8, положений 52-68, а
- 11 028659 затем положений 84-126 8ЕО ΙΌ N0:12, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0:16, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0:20, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0:24, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0:28, положений 52-68, а затем положений 84-126 8Е0 ГО N0:32, положений 787-939 8Е0 ГО N0:36, положений 873-1025 8Е0 ГО N0:92, положений 90-242 8Е0 ГО N0:96, 8Е0 ГО N0:100, положений 719-778 8Е0 ГО N0:101, положений 635-694 8ЕО ГО N0:102, положений 184-337 8ЕО ГО N0:106, положений 521-674 8ЕО ГО N0:106, положений 630-689 8Е0 ГО N0:107, положений 630-689 8Е0 ГО N0:108, положений 630-689 8Е0 ГО N0:109, положений 630-689 8Е0 ГО N0:110, положений 582-641 8Е0 ГО N0:122, положений 810-869 8Е0 ГО N0:124, положений 582-641 8Е0 ГО N0:126, положений 1-60 8Е0 ГО N0:130, положений 229288 8Е0 ГО N0:132, положений 1-60 8Е0 ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:39, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий поверхностный антиген НВУ, состоящий по меньшей мере из одного иммуногенного домена большого поверхностного антигена (Ъ) НВУ, где композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления поверхностный антиген НВУ состоит по меньшей мере из 95% полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 90-488 8ЕО ГО N0:93, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:11, положений 21-47 8ЕО ГО N0:11, положений 176-400 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:15, 8ЕО ГО N0:19, 8ЕО ГО N0:23, 8ЕО ГО N0:27, 8ЕО ГО N0:31, положений 9-407 8Е0 ГО N0:34, положений 6-257 8Е0 ГО N0:36, положений 6-257 8Е0 ГО N0:41, положений 92-343 8Е0 ГО N0:92, положений 90-488 8Е0 ГО N0:93, 8Е0 ГО N0:97, положений 90-338 8Е0 ГО N0:101, положений 7-254 8Е0 ГО N0:102, положений 1-249 8Е0 ГО N0:107, положений 1-249 8Е0 ГО N0:108, положений 1-249 8Е0 ГО N0:109, положений 1-249 8Е0 ГО N0:110, положений 1399 8Е0 ГО N0:112, положений 1-399 8Е0 ГО N0:114, положений 1-399 8Е0 ГО N0:116, положений 1399 8Е0 ГО N0:118, положений 1-399 8Е0 ГО N0:120, положений 1-399 8Е0 ГО N0:122, положений 1399 8Е0 ГО N0:124, положений 1-399 8Е0 ГО N0:126, положений 231-629 8Е0 ГО N0:128, положений
63-461 8ЕО ГО N0:130, положений 289-687 8ЕО ГО N0:132, положений 289-687 8ЕО ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:93, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антиген полимеразы НВУ, состоящий по меньшей мере из одного иммуногенного домена из домена обратной транскриптазы полимеразы НВУ, где композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения антиген полимеразы НВУ состоит по меньшей мере из 95% полноразмерного домена обратной транскриптазы полимеразы НВУ. В одном из аспектов аминокислотная последовательность антигена полимеразы НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 7-351 8Е0 ГО N0:40, положений 90-434 8Е0 ГО N0:94, положений 383-602 8Е0 ГО N0:2, положений 381-600 8Е0 ГО N0:6, положений 381-600 8Е0 ГО N0:10, положений 453-680 8Е0 ГО N0:10, положений 370-589 8Е0 ГО N0:14, положений 380-599 8Е0 ГО N0:18, положений 381-600 8Е0 ГО N0:22, положений 380-599 8Е0 ГО N0:26, положений 381-600 8Е0 ГО N0:30, положений 260-604 8Е0 ГО N0:36, положений 7-351 8ЕО ГО N0:38, 260-604 8ЕО ГО N0:41, положений 346-690 8ЕО ГО N0:92, 8Е0 ГО N0:98, положений 339-566 8Е0 ГО N0:101, положений 255-482 8Е0 ГО N0:102, положений 250477 8Е0 ГО N0:107, положений 250-477 8Е0 ГО N0:108, положений 250-477 8Е0 ГО N0:109, положений 250-477 8ЕО ГО N0:110, положений 582-809 8ЕО ГО N0:120, положений 582-809 8ЕО ГО N0:124, положений 642-869 8Е0 ГО N0:126, положений 1-228 8Е0 ГО N0:128, положений 1-228 8Е0 ГО N0:132, положений 61-288 8Е0 ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокис- 12 028659 лотной последовательности δΕΟ ГО N0:40 или δΕΟ ГО N0:94, или соответствующей последовательности из другого штамма НВ V.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий коровый антиген ΗΒν, состоящий по меньшей мере из одного иммуногенного домена корового белка ΗΒν, где композиция индуцирует ΗΒν-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения антигены ΗΒν состоят по меньшей мере из 95% полноразмерного корового белка ΗΒν. В одном из аспектов аминокислотная последовательность корового антигена ΗΒν по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 90-271 δΕΟ ΙΌ N0:95, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:1, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:5, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 37-188 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 31212 δΕΟ ΙΌ N0:13, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:17, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:21, положений 14194 δΕΟ ΙΌ N0:25, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:29, положений 408-589 δΕΟ ΙΌ N0:34, положений 605786 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 352-533 δΕΟ ΙΌ N0:38, положений 160-341 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 691-872 δΕΟ ΙΌ N0:92, δΕΟ ΙΌ N0:99, положений 567-718 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 483-634 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 184-395 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 396-578 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 579-761 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:106, 338-520 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:112, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:114, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:116, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 462-643 δΕΟ ΙΌ N0:130, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма ΗΒν. В одном из аспектов белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ N0:95, или соответствующей последовательности из другого штамма ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий Х-антиген ΗΒν, состоящий по меньшей мере из одного иммуногенного домена полноразмерного Х-антигена ΗΒν, где композиция индуцирует ΗΒν-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов антиген ΗΒν состоит по меньшей мере из 95% полноразмерного Х-антигена ΗΒν. В одном из аспектов аминокислотная последовательность Х-антигена ΗΒν по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 90-242 δΕΟ ΙΌ N0:96, δΕΟ ΙΌ N0:4, δΕΟ ΙΌ N0:8, δΕΟ ΙΌ N0:12, положений 2-154 δΕΟ ΙΌ N0:12, δΕΟ ΙΌ N0:16, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:28, δΕΟ ΙΌ N0:32, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:4, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:8, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:12, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:16, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:20, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:24, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:28, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:32, положений 787-939 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 7-159 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 873-1025 δΕΟ ΙΌ N0:92, δΕΟ ΙΌ N0:100, положений 719-778 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 635-694 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 184-337 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 521-674 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 582-641 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 810-869 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 582-641 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 1-60 δΕΟ ΙΌ N0:130, положений 229-288 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 1-60 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма ΗΒν. В одном из аспектов белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ N0:96, или соответствующей последовательности из другого штамма ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей две, три или четыре иммунотерапевтических композиции, описанных выше или в других разделах настоящего описания, и, в частности, любые две, три или четыре из иммунотерапевтических композиций, описанных выше, которые относятся к единичным белкам ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены ΗΒν, где антигены ΗΒν состоят по меньшей мере из одного иммуногенного домена из двух, трех или четырех белков поверхно- 13 028659 стного антигена НВУ, где каждый белок поверхностного антигена НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят по меньшей мере из одного иммуногенного домена из двух, трех или четырех белков полимеразы НВУ, где каждый из белков полимеразы НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят по меньшей мере из одного иммуногенного домена из двух, трех или четырех Х-антигенов НВУ, где каждый из Х-антигенов НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ.
Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят по меньшей мере из одного иммуногенного домена из двух, трех или четырех коровых белков НВУ, где каждый из коровых белков НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов каждый из коровых белков НВУ состоит по меньшей мере из 95% полноразмерного корового белка НВУ. В одном из аспектов каждый из коровых белков НВУ состоит из аминокислот 31-212 корового белка НВУ. В одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип С, и в одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип Ό, и в одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип А, и в одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип В. В одном из аспектов каждый из коровых белков НВУ состоит из аминокислот 37-188 корового белка НВУ. В одном из аспектов слитый белок содержит четыре коровых белка НВУ из генотипа А, генотипа В, генотипа С и генотипа Ό.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения аминокислотная последовательность любого одного или нескольких коровых антигенов НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 90-271 8ЕЦ ГО N0:95, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0:1, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0:5, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0:9, положений 37-188 8ЕЦ ГО N0:9, положений 31212 8ЕЦ ГО N0:13, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0:17, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0:21, положений 14194 8ЕЦ ГО N0:25, положений 31-212 8ЕЦ ГО N0:29, положений 408-589 8ЕЦ ГО N0:34, положений 605786 8ЕЦ ГО N0:36, положений 352-533 8ЕЦ ГО N0:38, положений 160-341 8ЕЦ ГО N0:39, положений 605-786 81+) ГО N0:41, положений 691-872 81+) ГО N0:92, 81+) ГО N0:99, положений 567-718 81+) ГО N0:101, положений 483-634 8ЕЦ ГО N0:102, положений 2-183 8ЕЦ ГО N0:105, положений 184-395 8ЕЦ ГО N0:105, положений 396-578 8ЕЦ ГО N0:105, положений 579-761 8ЕЦ ГО N0:105, положений 2-183 81+) ГО N0:106, 338-520 81+) ГО N0:106, положений 478-629 81+) ГО N0:107, положений 478-629 81+) ГО N0:108, положений 478-629 8ЕЦ ГО N0:109, положений 478-629 8ЕЦ ГО N0:110, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:112, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:114, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:116, положений 400-581 81+) ГО N0:118, положений 400-581 81+) ГО N0:120, положений 400-581 81+) ГО N0:122, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:124, положений 400-581 8ЕЦ ГО N0:126, положений 630-811 8ЕЦ ГО N0:128, положений 462-643 8ЕЦ ГО N0:130, положений 688-869 8ЕЦ ГО N0:132, положений 688-869 8ЕЦ ГО N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ. В одном из аспектов антигены НВУ имеют аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0:105, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, содержащей: (а) дрожжевой носитель и (Ь) слитый белок, содержащий по меньшей мере два коровых белка НВУ и по меньшей мере два Х-антигена НВУ, где каждый из коровых белков НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ и где каждый из Х-антигенов НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ. Композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ. В одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип С; в одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип Ό; в одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип А; и в одном из аспектов генотипы НВУ включают генотип В. В одном из аспектов каждый из коровых белков НВУ состоит из по меньшей мере 95% полноразмерного корового белка НВУ. В одном из аспектов каждый из коровых белков НВУ содержит аминокислоты 31212 корового белка НВУ. В одном из аспектов каждый из коровых белков НВУ содержит аминокислоты 37-188 корового белка НВУ. В одном из аспектов каждый из Х-антигенов НВУ содержит по меньшей мере 95% полноразмерного Х-антигена НВУ. В одном из аспектов каждый из Х-антигенов НВУ содержит аминокислоты 52-127 Х-антигена НВУ.
В одном из аспектов аминокислотная последовательность корового антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или
- 14 028659 по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 90-271 δΕΟ ΙΌ N0:95, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:1, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:5, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 37-188 δΕΟ ΙΌ N0:9, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:13, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:17, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:21, положений 14-194 δΕΟ ΙΌ N0:25, положений 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:29, положений 408-589 δΕΟ ΙΌ N0:34, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 352-533 δΕΟ ΙΌ N0:38, положений 160-341 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 605-786 δΕΟ ΙΌ N0:41, положений 691-872 δΕΟ ΙΌ N0:92, δΕΟ ΙΌ N0:99, положений 567-718 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 483-634 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 184-395 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 396-578 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 579-761 δΕΟ ΙΌ N0:105, положений 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:106, 338-520 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:112, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:114, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:116, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:120, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128, положений 462-643 δΕΟ ΙΌ N0:130, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 688-869 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов аминокислотная последовательность Х-антигена НВУ по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из положений 90-242 δΕΟ ΙΌ N0:96, δΕΟ ΙΌ N0:4, δΕΟ ΙΌ N0:8, δΕΟ ΙΌ N0:12, положений 2-154 δΕΟ ΙΌ N0:12, δΕΟ ΙΌ N0:16, δΕΟ ΙΌ N0:20, δΕΟ ΙΌ N0:24, δΕΟ ΙΌ N0:28, δΕΟ ΙΌ N0:32, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:4, положений 5268, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:8, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:12, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:16, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:20, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:24, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:28, положений 52-68, а затем положений 84-126 δΕΟ ΙΌ N0:32, положений 787-939 δΕΟ ΙΌ N0:36, положений 7-159 δΕΟ ΙΌ N0:39, положений 873-1025 δΕΟ ΙΌ N0:92, δΕΟ ΙΌ N0:100, положений 719-778 δΕΟ ΙΌ N0:101, положений 635-694 δΕΟ ΙΌ N0:102, положений 184-337 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 521-674 δΕΟ ΙΌ N0:106, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:107, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:108, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:109, положений 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:110, положений 582-641 δΕΟ ΙΌ N0:122, положений 810-869 δΕΟ ΙΌ N0:124, положений 582-641 δΕΟ ΙΌ N0:126, положений 1-60 δΕΟ ΙΌ N0:130, положений 229-288 δΕΟ ΙΌ N0:132, положений 1-60 δΕΟ ΙΌ N0:134, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ N0:106, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, в том числе выше и ниже, относящихся к слитому белку, антигенам НВУ или иммунотерапевтической композиции, содержащей такой слитый белок или антигены НВУ, в одном дополнительном варианте осуществления к слитому белку на его Оконце может быть присоединена дополнительная последовательность. В одном из аспектов ^концевая последовательность выбрана из аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична δΕΟ ΙΌ N0:37, аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична δΕΟ ΙΌ N0:89, или аминокислотной последовательности, которая на 95% идентична δΕΟ ΙΌ N0:90. В одном из аспектов ^концевая последовательность выбрана из δΕΟ ΙΌ N0:37, положений 1-5 δΕΟ ΙΌ N0:37, δΕΟ ΙΌ N0:89 или δΕΟ ΙΌ N0:90, или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
В одном из аспектов любого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше или в других разделах настоящего описания, слитый белок экспрессируется с помощью дрожжевого носителя. В другом аспекте любого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше или в других разделах настоящего описания, дрожжевой носитель представляет собой целые дрожжи. В одном из аспектов целые дрожжи являются убитыми. В одном из аспектов целые дрожжи инактивированы нагреванием.
В одном из аспектов любого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше или в других разделах настоящего описания, дрожжевой носитель может происходить из рода дрожжей, выбранного из δαοοΙιαίΌΐηνοα. СапШйа, Сгур1ососси8, Нап8епи1а, К1иууеготусе8, ΡίοΗία. К1юйо1оги1а. δοϊιίζοίααсЬаготусе8 и Уаггои1а. В одном из аспектов дрожжевой носитель происходит из δ;·ια1ι;·ιΐΌΐη\^8. В одном из аспектов дрожжевой носитель происходит из δассЬа^οтусе8 сегеу181ае.
В одном из аспектов любого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше или в других разделах настоящего описания, композиция составлена для введения индивидууму или пациенту. В одном из аспектов композиция составлена для введения путем инъекции индивидууму или пациенту (например, парентеральным путем, таким как подкожная или внутрибрюшинная, или внутримышечная инъекция). В одном из аспектов композицию составляют в фармацевтически приемлемом эксципиенте, ко- 15 028659 торый подходит для введения человеку. В одном из аспектов композиция содержит более 90% дрожжевого белка. В одном из аспектов композиция содержит более 90% дрожжевого белка и составлена для введения пациенту.
В одном из аспектов любого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше или в других разделах настоящего описания, слитый белок не агрегирует в дрожжах. В одном из аспектов слитый белок не образует телец включения в дрожжах. В одном из аспектов слитый белок не образует УЪР или других крупных антигенных частиц в дрожжах. В одном из аспектов слитый белок не образует УЪР или других крупных антигенных частиц в дрожжах.
В одном из аспектов любого варианта осуществления изобретения, описанного выше или в других разделах настоящего описания, в одном из аспектов последовательности НВУ происходят из генотипа А НВУ. В другом аспекте последовательности НВУ происходят из генотипа В НВУ. В другом аспекте последовательности НВУ происходят из генотипа С НВУ. В другом аспекте НВУ последовательности происходят из генотипа Ό НВУ. В другом аспекте последовательности НВУ происходят из генотипа Е НВУ. В другом аспекте последовательности НВУ происходят из генотипа Р НВУ. В другом аспекте последовательности НВУ происходят из генотипа О НВУ. В другом аспекте последовательности НВУ происходят из генотипа Н НВУ. В одном из аспектов последовательности НВУ происходят из комбинации любого из описанных выше генотипов НВУ или любого из известных генотипов или подгенотипов НВУ.
Другой вариант осуществления изобретения относится к любому из слитых белков, описанных выше в качестве части иммунотерапевтической композиции по изобретению или в других разделах настоящего описания. В одном из аспектов этого варианта осуществления слитый белок содержит антигены НВУ, причем антигены НВУ выбраны из, но не ограничиваясь ими, (а) антигенов НВУ, состоящих из большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, корового белка НВУ и Х-антигена НВУ; (Ь) антигенов НВУ, состоящих из: большого поверхностного антигена (Ь) НВУ и корового белка НВУ; (с) антигенов НВУ, состоящих из: распознаваемой рецепторами гепатоцитов области Рге-81 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, малого поверхностного антигена (8) НВУ, домена обратной транскриптазы полимеразы НВУ, корового белка НВУ или е-антигена НВУ, и Х-антигена НВУ; (б) антигенов НВУ, состоящих из: большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, домена обратной транскриптазы из полимеразы НВУ, корового белка НВУ или е-антигена НВУ, и Х-антигена НВУ; (е) антигенов НВУ, состоящих из большого поверхностого антигена (Ь) НВУ, домена обратной транскриптазы из полимеразы НВУ, и корового белка НВУ; (£) антигенов НВУ, состоящих из полимеразы НВУ (КТ-домен) и корового белка НВУ; (д) антигенов НВУ, состоящих из Х-антигена НВУ и корового белка НВУ; (й) антигенов НВУ, состоящих из распознаваемой рецептором гепатоцитов области Рге-81 большого поверхностного антигена (Ь) НВУ, малого поверхностного антигена (8) НВУ, домена обратной транскриптазы полимеразы НВУ и корового белка НВУ или е-антигена НВУ; (ί) антигенов НВУ, состоящих из большого поверхностного антигена (Ь) НВУ; (]) антигенов НВУ, состоящих из корового антигена НВУ; (к) антигенов НВУ, состоящих из полимеразы НВУ, включающей домен обратной транскриптазы; (1) антигенов НВУ, состоящих из Xантигена НВУ; (т) антигенов НВУ, состоящих из от двух до четырех поверхностных антигенов НВУ, антигенов полимеразы НВУ, коровых антигенов НВУ или Х-антигенов НВУ, где каждый из от двух до четырех антигенов НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ; и (п) антигенов НВУ, состоящих из двух коровых антигенов НВУ и двух Х-антигенов НВУ, где каждый из двух коровых антигенов НВУ и каждый из двух Х-антигенов НВУ происходит из отличающегося генотипа НВУ. Аспекты изобретения, относящиеся к каждому из антигенов НВУ, включая различные последовательности, подходящие в этих антигенах, описаны выше.
В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична, или идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0:130, 8Е0 ГО N0:150, 8Е0 ГО N0:118, 8Е0 ГО N0:151, 8Е0 ГО N0:34, 8Е0 ГО N0:120, 8Е0 ГО N0:122, 8Е0 ГО N0:124, 8Е0 ГО N0:126, 8Е0 ГО N0:128, 8Е0 ГО N0:132, 8Е0 ГО N0:134, 8Е0 ГО N0:112, 8Е0 ГО N0:114, 8Е0 ГО N0:116, 8Е0 ГО N0:36, 8Е0 ГО N0:38, 8Е0 ГО N0:39, 8Е0 ГО N0:40, 8Е0 ГО N0:41, 8Е0 ГО N0:92, 8Е0 ГО N0:93, 8Е0 ГО N0:94, 8Е0 ГО N0:95, 8Е0 ГО N0:96, 8Е0 ГО N0:97, 8Е0 ГО N0:98, 8Е0 ГО N0:99, 8Е0 ГО N0:100, 8Е0 ГО N0:101, 8Е0 ГО N0:102, 8Е0 ГО N0:105, 8Е0 ГО N0:106, 8Е0 ГО N0:107, 8Е0 ГО N0:108, 8Е0 ГО N0:109 и 8Е0 ГО N0:110.
Другой вариант осуществления изобретения относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из слитых белков, описанных в настоящем описании. В одном из аспектов рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из, но не ограничиваясь ими, 8Е0 ГО N0:33, 8Е0 ГО N0:35, 8Е0 ГО N0:91, 8Е0 ГО N0:111, 8Е0 ГО N0:113, 8Е0 ГО N0:115, 8Е0 ГО N0:117, 8Е0 ГО N0:119, 8Е0 ГО N0:121, 8Е0 ГО N0:123, 8Е0 ГО N0:125, 8Е0 ГО N0:127, 8Е0 ГО N0:129, 8Е0 ГО N0:131 или 8Е0 ГО N0:133.
Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенной клетке, трансфицированной любой из рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании. В одном из аспектов клетка представляет собой дрожжевую клетку.
- 16 028659
Другой вариант осуществления изобретения относится к композиции, содержащей любой из слитых белков, описанных в настоящем описании. Другой вариант осуществления изобретения относится к композиции, содержащей любую из рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании. Другой вариант осуществления изобретения относится к композиции, содержащей любую из выделенных клеток, описанных в настоящем описании.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения инфекции вирусом гепатита В (НВУ) или по меньшей мере одного симптома вследствие инфекции НВУ у индивидуума, включающему введение индивидууму, который инфицирован НВУ, по меньшей мере одной из любой из иммунотерапевтических композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанных в настоящем описании. Введение композиции индивидууму уменьшает инфекцию НВУ или по меньшей мере один симптом, являющийся следствием инфекции НВУ у индивидуума.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу индукции антигенспецифического клеточно-опосредуемого иммунного ответа против антигена НВУ, включающему введение индивидууму любой одной или нескольких из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок, или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанные в настоящем описании.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу профилактики инфекции НВУ у индивидуума, включающему ведение индивидууму, который не инфицирован НВУ, любой одной или нескольких из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанные в настоящем описании.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммунизации группы индивидуумов против НВУ, включающему введение группе индивидуумов любой одной или нескольких из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанных в настоящем описании.
Другой вариант осуществления изобретения относится к любой одной или нескольким из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанным в настоящем описании, для применения для лечения инфекции НВУ или ее симптома.
Другой вариант осуществления изобретения относится к любой одной или нескольким из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанным в настоящем описании, для применения для профилактики инфекции НВУ или ее симптома.
Другой вариант осуществления изобретения относится к применению любой или нескольких из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанным в настоящем описании, для получения лекарственного средства для лечения инфекции НВУ или ее симптома.
Другой вариант осуществления изобретения относится к применению любой или нескольких из композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанным в настоящем описании, для получения лекарственного средства для профилактики инфекции НВУ или ее симптома.
В одном из аспектов любого из вариантов осуществления, относящихся к способам или применениям по изобретению, описанных выше или в других разделах настоящего описания, причем способ может включать введение по меньшей мере двух, трех, четырех или более композиций, включающих любой антиген НВУ, слитый белок или иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанные в настоящем описании. В одном из аспектов можно вводить дополнительные композиции или соединения, подходящие для профилактики или лечения инфекции НВУ (например, противовирусные соединения, интерфероны, другие иммунотерапевтические композиции или их комбинации). В одном из аспектов различные композиции или соединения вводят индивидууму одновременно. В одном из аспектов различные композиции или соединения вводят индивидууму последовательно. В одном из аспектов каждую из различных композиций вводят путем инъекции в отличающуюся область у индивидуума. В одном из аспектов однократная доза иммунотерапевтической композиции НВУ на основе дрожжей по изобретению составляет от всего 40 Д.Е. до всего 80 Д.Е., которые вводят равными частями в две, три или четыре различных области у индивидуума, на дозу.
В одном из аспектов любого из вариантов осуществления, относящихся к способам или применениям по изобретению, описанным выше или в других разделах настоящего описания, введение композиции индивидууму обеспечивает сероконверсию у индивидуума или увеличивает частоту сероконверсии в группе индивидуумов. В одном из аспектов введение композиции индивидууму снижает НВкЛд в сыворотке или приводит к устранению сывороточного НВкЛд у индивидуума или повышает частоту устранения сывороточного НВкЛд в группе индивидуумов. В одном из аспектов введение композиции индивидууму снижает уровень сывороточного НВеАд или приводит к устранению сывороточного НВеАд у индивидуума или повышает частоту устранения сывороточного НВеАд в группе индивидуумов. В одном из аспектов введение композиции индивидууму снижает нагрузку вирусом НВУ у индивидуума или повы- 17 028659 шает частоту снижения нагрузки вирусом ΗΒν в группе индивидуумов. В одном из аспектов введение композиции индивидууму приводит к не поддающемуся выявлению уровню ДНК ΗΒν в инфицированных клетках у индивидуума или приводит к более высоким частотам негативности по ДНК ΗΒν в группе индивидуумов. В одном из аспектов введение композиции индивидууму снижает повреждение печени или повышает функцию печени у индивидуума или снижает частоту повреждения печени или увеличивает частоту улучшения функции печени в группе индивидуумов. В одном из аспектов введение композиции индивидууму повышает нормализацию ЛЬТ у индивидуума или в группе индивидуумов.
В любом из вариантов осуществления, относящихся к антигену ΗΒν, слитому белку, иммунотерапевтической композиции или любому способу применения антигена ΗΒν, слитого белка или иммунотерапевтической композиции, описанной в настоящем описании, в одном из аспектов композиция, кроме того, содержит или используется вместе по меньшей мере с одним модификатором биологического ответа. В одном из аспектов композиция, кроме того, содержит или используется вместе с одним или несколькими дополнительными соединениями, подходящими для лечения или смягчения симптома инфекции ΗΒν. В одном из аспектов композиция, кроме того, содержит или используется вместе по меньшей мере с одним противовирусным соединением. В одном из аспектов противовирусное соединение представляет собой ингибитор обратной транскриптазы на основе нуклеотидного аналога. Противовирусное соединение может включать, но не ограничиваться ими, тенофовир, ламивудин, адефовир, телбивудин, энтекавир и их комбинации. В одном из аспектов противовирусным соединением является тенофовир. В одном из аспектов противовирусным соединением является энтекавир. В одном из аспектов композиция дополнительно содержит или используется вместе по меньшей мере с одним интерфероном. В одном из аспектов интерферон представляет собой интерферон-α. В одном из аспектов интерферон представляет собой пегилированный интерферон-а2а. В одном из аспектов интерферон представляет собой интерферон-λ.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено схематическое изображение организации генома вируса гепатита В.
На фиг. 2 представлено схематическое изображение, на котором показана основная структура рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок поверхностный антиген/коровый антиген ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 3 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок поверхностный антиген/полимераза/коровый антиген/Х ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 4 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок полимераза/коровый антиген ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 5 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок Х/коровый антиген ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 6 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок полимеразы ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 7 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок поверхностный антиген/полимераза/коровый антиген ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 8 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок поверхностный антиген/коровый антиген/полимераза ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 9 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок поверхностный антиген/коровый антиген/Х ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 10 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей поверхностный антиген/коровый антиген/полимераза/Х ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 11 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок поверхностный антиген/коровый антиген/Х/полимераза ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 12 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок полимераза/поверхностный антиген/коровый антиген ΗΒν, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
- 18 028659
На фиг. 13 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок Х/поверхностный антиген/коровый антиген НВУ, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 14 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок полимераза/Х/поверхностный антиген/коровый антиген НВУ, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 15 представлено схематическое изображение основной структуры рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок Х/полимераза/поверхностный антиген/коровый антиген НВУ, пригодный в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению.
На фиг. 16 представлено цифровое изображение вестерн-блота, на котором показана экспрессия нескольких иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих слитый белок поверхностный антиген/коровый антиген НВУ (убитые нагреванием целые дрожжи).
На фиг. 17 представлено цифровое изображение вестерн-блота, на котором показана экспрессия нескольких иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих слитый белок поверхностный антиген/коровый антиген НВУ (живые целые дрожжи).
На фиг. 18 представлено цифровое изображение вестерн-блота, на котором показана экспрессия нескольких иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих слитый белок поверхностный антиген/полимераза/коровый белок/Х НВУ.
На фиг. 19 представлено цифровое изображение вестерн-блота, на котором показана экспрессия нескольких иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих слитый белок поверхностный антиген/полимераза/коровый антиген/Х НВУ.
На фиг. 20 представлено цифровое изображение вестерн-блота, на котором показана экспрессия нескольких иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих антигены НВУ, содержащих слитые белки поверхностный антиген-коровый антиген (Зс) или слитые белки поверхностный антиген-полимераза-коровый антиген-Х (Зр).
На фиг. 21 представлено цифровое изображение вестерн-блота, на котором показана экспрессия антигенов НВУ из нескольких иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей, культивируемых в среде ИЬ2.
На фиг. 22 представлена столбиковая диаграмма, на которой показана средняя экспрессия антигенов НВУ из нескольких иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей, культивированных в среде ИЬ2 или среде И2 (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 23 представлен график, на котором показана пролиферация СЭ4' Т-клеток селезенки мышей, иммунизированных иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (ЗС0КЕ) НВУ, в ответ на смесь антигенов З/коровый антиген или на миметопный пептид ЗАд МНС класса II (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 24 представлен график, на котором показана пролиферация Т-клеток лимфатических узлов мышей, иммунизированных иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (ЗС0КЕ) НВУ, в ответ на смесь антигенов З/коровый антиген или на миметопный пептид ЗАд МНС класса II (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 25 представлен график, на котором показан ответ Т-клеток лимфатических узлов мышей, иммунизированных иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (ЗС0КЕ) НВУ, на смесь антигенов З/коровый антиген или на миметопный пептид ЗАд МНС класса II, в ЕЫЗро! для интерферона-γ (ГРН-у).
На фиг. 26 представлен график, на котором показана пролиферация СЭ4' Т-клеток селезенки мышей, иммунизированных иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-Ро1-коровый антиген-Х (обозначаемый а-Зрех) в ответ на смесь антигенов З/Соге или на миметопный пептид ЗАд МНС класса II (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 27 представлен график, на котором показана продукция [Ц-1 β в спленоцитах мышей, иммунизированных: (а) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим поверхностный антиген-Ро1-Е/коровый антиген-Х (обозначаемый Зр) НВУ, левые столбцы; или (Ь) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (обозначаемый Зс) НВУ (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 28 представлен график, на котором показана продукция [Ц-12р70 в спленоцитах мышей, иммунизированных: (а) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-Ро1-коровый антиген-Х (обозначаемый Зр) НВУ, левые столбцы; или (Ь) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (обозначаемый Зс) НВУ (планки погрешностей представляют собой стандартное
- 19 028659 отклонение).
На фиг. 29А и 29В представлены графики, на которых показана продукция интерферона-γ (1Г№у) в спленоцитах мышей, иммунизированных (фиг. 29А) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (обозначаемый 8с) НВУ, или (фиг. 29В) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-Ро1-коровый антиген-Х (обозначаемый 8р) НВУ (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 30А-Э представлены графики, на которых показана продукция ΣΗ-1β (фиг. 30А), 1Ь-6 (фиг. 30В), 1Ь-13 (фиг. 30С) и 1Ь-12р70 (фиг. 30Ό) в спленоцитах мышей, иммунизированных (а) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-Ро1коровый антиген-Х (обозначаемый 8р) НВУ, левые столбцы; или (Ь) иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, экспрессирующим антиген поверхностный антиген-коровый антиген (обозначаемый 8с) НВУ.
На фиг. 31 представлена столбиковая диаграмма, на которой показано, что у мышей, иммунизированных 01-13002 или 01-13002 + антитело против ΟΌ40, но не УУЕС индуцировалась сравнимая защита от нагрузки опухолями ЕЬ4, экспрессирующими целевой антиген НВУ (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 32 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны результаты анализа ЕЬ18ро1 для ΣΕΚ-γ, в которых сравниваются Т-клеточные ответы мышей, иммунизированных 01-13008 (8С0КЕС) и 01-13013 (8РЕХу2), по сравнению с УУЕС с использованием различных пептидов и антигенов НВУ (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 33 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны ответы в ЕЬ18ро1 для ΣΤΉ-γ на стимуляцию 01-13002, у человека до и после иммунизации и после вспомогательной иммунизации профилактической вакциной НВУ.
На фиг. 34 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны специфичные к антигенам НВУ ответы клеток лимфатических узлов, выделенных из трансгенных по НЬЛ-Л2 мышей, иммунизированных 01-13009 (8С0КЕ-Э) или 01-13020 (Х-8С0КЕ) по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными дрожжами (УУЕС), в ЕЬ18ро1 для ΣΡΚ-γ (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 35 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны специфичные к антигенам НВУ ответы клеток селезенки, выделенных из трансгенных по НЬЛ-Л2 мышей, иммунизированных 0113009 (8С0КЕ-Э), по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными дрожжами (УУЕС), в ЕЬ18ро1 для 1Т№у (планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку).
На фиг. 36 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны специфичные к антигенам НВУ ответы клеток лимфатических узлов, выделенных из мышей С57ВЬ/6, иммунизированных 0Σ-13009 (8С0КЕ-Э) или 0Σ-13020 (Х-8С0КЕ), по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными дрожжами (УУЕС), или наивными мышами в ЕЬ18ро1 для ΣΡΗ-γ (планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение).
На фиг. 37 представлен линейный график, на котором показаны специфичные к антигенам НВУ ответы 008+ Т-клеток на ограниченный по МНС класса I пептид НВУ у мышей С57ВЬ/6, иммунизированных 01-13009 (8С0КЕ-Э) или 01-13020 (Х-8С0КЕ), по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными дрожжами (УУЕС) или иммунотерапевтическим средством на основе дрожжей, экспрессирующим овальбумин (0УАХ).
На фиг. 38 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны специфичные к антигенам НВУ ответы СИ4+ Т-клеток на ограниченный по МНС класса II пептид НВУ у мышей С57ВЬ/6, иммунизированных 01-13009 (8С0КЕ-Э) или 01-13020 (Х-8С0КЕ), по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными дрожжами (УУЕС) или иммунотерапевтическим средством на основе дрожжей, экспрессирующим овальбумин (0УАХ).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится, главным образом, к композициям и способам для профилактики и/или лечения инфекции вирусом гепатита В (НВУ). Изобретение относится к иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей (также называемой иммунотерапевтическим средством против НВУ на основе дрожжей), содержащей дрожжевой носитель и антиген(ы) НВУ, которая предназначена для индукции профилактического и/или терапевтического иммунного ответа против инфекции НВУ у индивидуума, и к применению таких композиций для профилактики и/или лечения инфекции НВУ и связанных с ней симптомов. Также изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, используемых в композициях на основе дрожжей, а также к белкам и слитым белкам, кодируемых ими, для применения в любой иммунотерапевтической композиции и/или любом терапевтическом или профилактическом протоколе лечения инфекции НВУ, включая любой терапевтический или профилактический протокол, который сочетает в себе специфичные к НВУ композиции на основе дрожжей по изобретению с любой одной или несколькими другими терапевтическими или профилактическими композициями,
- 20 028659 средствами, лекарственными средствами, соединениями и/или протоколами лечения инфекции НВУ.
Специфичные к НВУ иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей являются уникальными среди различных типов иммунотерапии в том, что эти композиции по изобретению индуцируют врожденные иммунные ответы, а также адаптивные иммунные ответы, которые специфично нацелены на НВУ, включая СО4-зависимые ТН17 и ТН1 Т-клеточные ответы и антигенспецифические СЭ8' Тклеточные ответы. Объем иммунного ответа, индуцируемого специфичной к НВУ иммунотерапией на основе дрожжей, является хорошо подходящим для нацеливания на НВУ. Во-первых, полагают, что НВУ ускользает от врожденного иммунного ответа на раннем этапе инфекции путем скрывания от врожденного ответа и, тем самым, не индуцирования его, а не путем прямого противодействия врожденному иммунитету (\\Эе1;1пс1 аиб СЫзап, 2005, 1. Упо1. 15:9369-9380; А|е1апб. е! а1., 2004, Ρ^δ υδΑ 101:6669-66 74). Таким образом, можно ожидать, что НВУ будет чувствительным к врожденным иммунным ответам, если они будут активироваться другим механизмом, т.е. иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей по изобретению. Во-вторых, НВУ вызывает экспрессию антигенов на высоком уровне в инфицированных клетках-хозяевах, которые, как считается, являются заметными для адаптивного иммунного ответа (Ошбо!б, е! а1., 1999, δ<^π<χ 284:825-829; ТЫтте е! а1., 2003, 1. Упо1. 77:68-76), и освобождение от острой инфекции связано с устойчивыми СЭ4' и СЭ8+ Т-клеточными ответами (Μοίηί е! а1., 1999, Оа8!тоеп!ето1. 117:1386-1396; КеЬеттапп е! а1., 1995, 1. Εχρ. Меб. 181:1047-1058; ТЫтте е! а1., 2003, 1. Уио1. 77:68-76; \У1е1апб апб СЫзап, 2005, 1. Упо1. 15:9369-9380). Таким образом, ожидается, что иммунотерапиям НВУ на основе дрожжей путем активации адаптивного иммунного ответа будет эффективно нацеливаться на инфицированные НВУ клетки для их разрушения и/или, ожидается, что она эффективно усилит клиренс вируса. Более того, полагают, что иммунный ответ, индуцированный иммунотерапией на основе дрожжей, является интерферон-независимым и интерферон-зависимым (ТатЬштт е! а1., 2012, ί. Пптипобюг. 35 (1): 14-22); таким образом, полагают, что способность, или ее отсутствие, индивидуума отвечать на терапию на основе интерферонов, которая является стандартным способом лечения НВУ, не влияет прямо на способность индивидуума отвечать на иммунотерапию на основе дрожжей по изобретению. Кроме того, иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей, описанные в настоящем описании, предназначены для нацеливания на иммуногенные и консервативные области НВУ, множественные эпитопы СТЬ, и включают области НВУ, на которых можно осуществлять нацеливание против ускользания (позволяют модификации композиций при необходимости для нацеливания на такие мутации, обеспечивающие ускользание), что делает их высоко приемлемой терапией НВУ, которая оптимизирует возможность эффективных иммунных ответов против этого вируса.
Кроме того, и без связи с теорией, полагают, что иммунотерапия против НВУ на основе дрожжей индуцирует иммунный ответ, который не только направлен специфично против антигена-мишени, который содержится в иммунотерапевтическом продукте на основе дрожжей, но который также развивается так, что он направлен против других иммунологических эпитопов на вирусе (т. е. отличных от эпитопов, которые содержатся в антигенной композиции дрожжей). Иными словами, первичный клеточный иммунный ответ на антиген(ы) и/или эпитоп(ы), содержащиеся в иммунотерапевтическом средстве не основе дрожжей, может приводить к вторичным клеточным иммунным ответам на антиген(ы) и/или эпитоп(ы), который присутствует в инфицированных клетках у подвергаемого лечению индивидуума, но которые не присутствуют в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, что, тем самым, приводит к развитию комплексных и непредсказуемых профилей иммунного ответа, которые являются уникальными для каждого подвергаемого лечению индивидуума. Эти вторичные иммунные ответы являются специфичными к молекулярному профилю инфекции НВУ у каждого подвергаемого лечению индивидуума, и иммунотераппвтическое средство на основе дрожжей может запускать эти последующие эффекты уникальным образом по сравнению с другими способами лечения, включая другие платформы иммунотерапии. Это явление можно в общем назвать распространением эпитопа и оно отражает преимущество использования иммунотерапии НВУ на основе дрожжей, поскольку ожидается, что индукция иммунного ответа против конкретного антигена НВУ или даже против конкретного генотипа НВУ (например, путем предоставления этого антигена в контексте иммунотерапевтического средства на основе дрожжей), приведет к каскаду, нацеливающему иммунную систему против различных дополнительных антигенов НВУ, что может приводить к эффективным иммунным ответам против антигенов из генотипов или штаммов НВУ, отличающихся от тех, которые находятся в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей.
Как рассмотрено выше, пациенты, ставшие хронически инфицированными НВУ, имеют тенденцию к наличию более слабого (или отсутствующего) и более узкого специфичного к НВУ, опосредуемого Тклетками иммунитета. Таким образом, иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей по изобретению направлены на потребность в терапевтических композициях для лечения пациентов, которые активно инфицированы НВУ, включая хронически инфицированных пациентов, и, кроме того, обеспечивают дополнительную вакцину для профилактики инфекции НВУ, которая может иметь преимущества в отношении формирования длительных иммунных ответов памяти. Действительно, ожидается, что иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей по изобретению будут стимулировать длительные Т-клеточные ответы памяти против НВУ, которые могут предупреждать ин- 21 028659 фекцию, а также обеспечивать долговременную пользу, состоящую в возможности защиты хронически инфицированного пациента от реактивации вируса. Ожидается, что иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей в качестве монотерапии или в комбинации с другими терапевтическими подходами для лечения НВУ (например, в комбинации с противовирусными соединениями) увеличат процент хронически инфицированных пациентов, которые достигают клиренса НВкЛд и НВеЛд, которые достигают полной сероконверсии и/или которые достигают непрерывного клиренса вируса в течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии.
Таким образом, иммунотерапию НВУ на основе дрожжей можно комбинировать с противовирусными лекарственными средствами и/или терапией интерфероном, и/или с другими способами терапии НВУ, для снижения вирусной нагрузки у индивидуума до уровня, с которым иммунная система может справиться более эффективно. Титры вируса НВУ, как правило, являются очень высокими (может быть инфицировано вплоть до 1011 гепатоцитов) и, таким образом, они могут подавлять способность индивидуума к индукции эффективного ответа СТЬ; таким образом, ожидается, что снижение вирусной нагрузки с использованием противовирусных лекарственных средств в комбинации с индукцией специфичной к НВУ активности СТЬ с использованием иммунотерапии на основе дрожжей будет полезным для инфицированного индивидуума. Кроме того, снижение вирусной нагрузки с использованием противовирусных средств также может снижать негативные эффекты, при их наличии, активации иммунной системы в контексте высокого количества инфицированных гепатоцитов, нацеленных на разрушение. Также ожидается, что иммунотерапия НВУ на основе дрожжей будет играть роль в снижении и/или устранении областей латентной вирусной инфекции. Например, с помощью ПЦР показано, что многие ткани являются положительными по НВУ, и они считаются потенциальными источниками для реактивации НВУ. ДНК НВУ может встраиваться в геном хозяина, что обеспечивает пассивную персистенцию НВУ, и кзкДНК является сверхспиральной покоящейся формой генома НВУ, которая также приводит к латентности. Без связи с теорией, авторы изобретения полагают, что иммунотерапия НВУ на основе дрожжей, описанная в настоящем описании, будет играть роль в устранении всех из этих типов источников НВУ, которые, вероятно, вносят вклад в низкую частоту излечения от заболевания, наблюдаемую в случае современных противовирусных подходов.
В другом сценарии после применения иммунотерапевтического средства на основе НВУ по изобретению, отдельно или в комбинации с противовирусным средством или другим терапевтическим средством против НВУ, если оно является достаточным для достижения полного клиренса НВкЛд, но не достаточно для продуцирования антитела против НВ, могут следовать существующие профилактические субъединичные вакцины, или дополнительно его можно комбинировать с ними, для достижения полной сероконверсии. Альтернативно, любые из слитых белков, описанных в настоящем описании, также можно использовать в качестве субъединичных вакцин для достижения полной сероконверсии или для защиты индивидуума от инфекции НВУ, отдельно или в комбинации с иммунотерапевтическим средством против НВУ на основе дрожжей по изобретению. Наконец, иммунотерапевтическая композиция по изобретению хорошо подходит для модификации дополнительными иммунотерапевтическими композициями и/или комбинирования с ними, включая любые иммунотерапевтические композиции, описанные в настоящем описании, для лечения НВУ с обеспечивающими ускользание мутациями, которые индуцируются лечением противовирусными лекарственными средствами.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей вводят в качестве биологических препаратов или фармацевтически приемлемых композиций. Таким образом, вместо использования дрожжей в качестве системы для продуцирования антигена с последующей очисткой антигена из дрожжей, весь дрожжевой носитель, как описано в настоящем описании, должен быть пригоден и составлен для введения пациенту. Напротив, существующие коммерческие вакцины против НВУ, а также многие разрабатываемые вакцины содержат рекомбинантные белки НВУ (например, белки НВкЛд), которые продуцируются в 8ассБаготусс8 ссгсуыас. но впоследствии их высвобождают из дрожжей путем разрушения и очищают от дрожжей так, чтобы конечная вакцина, комбинированная с адъювантом (например, алюминия гидроксифосфат сульфат или гидроксид алюминия), не содержала поддающейся выявлению ДНК дрожжей и содержала не более 1-5% дрожжевого белка. Иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей по изобретению, напротив, содержат легко выявляемую ДНК дрожжей и содержат существенно больше 5% дрожжевого белка; как правило, иммунотерапевтические средства на основе дрожжей по изобретению содержат более 70%, более 80% или, как правило, более 90% дрожжевого белка.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей вводят пациенту для иммунизации пациента для терапевтических и/или профилактических целей. В одном из вариантов осуществления изобретения композиции на основе дрожжей составляют для введения в фармацевтически приемлемом эксципиенте или составе. В одном из аспектов композиция должна быть составлена так, чтобы она была пригодна для введения человеку (например, условия получения должны подходить для применения у человека, и любые эксципиенты или составы, используемые для получения композиции и/или приготовления дозы иммунотерапевтического средства для введения, должны быть пригодны для применения у человека). В одном из аспектов изобретения иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей состав- 22 028659 ляют для введения путем инъекции пациенту или индивидууму, например парентеральным путем (например, подкожная, внутрибрюшинная, внутримышечная или внутрикожная инъекция или другой подходящий парентеральный путь).
В одном из вариантов осуществления дрожжи экспрессируют антиген (например, выявляемый вестерн-блоттингом), и антиген не агрегирует в дрожжах, антиген не образует тельца включения в дрожжах и/или не образует очень крупных частиц (УЬР) или других крупных антигенных частиц в дрожжах. В одном из вариантов осуществления антиген продуцируется в качестве растворимого белка в дрожжах и/или не секретируется из дрожжей, или по существу или преимущественно не секретируется из дрожжей. В другом варианте осуществления без связи с теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что конкретные комбинации и, возможно, расположение антигенов в слитом белке НВУ, включая поверхностный антиген и коровый антиген, подробно описанные в настоящем описании, могут образовывать УЬР или агрегировать до некоторой степени в дрожжах, экспрессирующих антигены. В результате антиген, экспрессируемый дрожжами, имеет иммуногенные свойства, которые, по-видимому, являются связанными с его структурой и формой в целом, в качестве отдельной характеристики от иммуногенных свойств иммунных эпитопов (например, Т-клеточных эпитопов), содержащихся в антигене. Когда дрожжи, экспрессирующие такие слитые белки, предоставляют в иммунотерапевтическом средстве против НВУ на основе дрожжей по изобретению, иммунотерапевтическая композиция приобретает свойства, которые активируют врожденную иммунную систему, не только из дрожжевого носителя, как рассмотрено выше (как в случае полностью основанных на дрожжах иммунотерапевтических средств, описанных в настоящем описании), но также частично из антигенной структуры слитого белка (например, слитый белок поверхностный антиген-коровый антиген, экспрессируемый в дрожжах, также имеет свойства, подобные адъюванту); кроме того, благодаря слитому белку иммунотерапевтическая композиция приобретает свойства, которые активируют адаптивную иммунную систему антигенспецифическим образом (путем предоставления различных Т-клеточных эпитопов), также как и для всех иммунотерапевтических средств на основе дрожжей, описанных в настоящем описании. Эта конкретная комбинация свойств, повидимому, является уникальной для иммунотерапевтических средств на основе дрожжей, экспрессирующих конкретные слитые белки поверхностный антиген-коровый антиген из НВУ, описанные в настоящем описании. Однако во всех вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, иммунотерапевтические средства на основе дрожжей должны легко фагоцитироваться дендритными клетками иммунной системы, и дрожжи и антигены должны легко процессироваться такими дендритными клетками для индукции эффективного иммунного ответа против НВУ.
Композиции по изобретению
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, которую можно использовать для профилактики и/или лечения инфекции НВУ и/или для смягчения по меньшей мере одного симптома, являющегося результатом инфекции НВУ. Композиция содержит: (а) дрожжевой носитель и (Ъ) один или несколько антигенов, содержащих белок(и) НВУ и/или его иммунногенный домен(ы). Что касается дрожжевого носителя, белки НВУ наиболее часто экспрессируются в качестве рекомбинантных белков дрожжевым носителем (например, целыми дрожжами или дрожжевым сферопластом, который необязательно может далее процессироваться в дрожжевой цитопласт, дрожжевую оболочку или дрожжевой мембранный экстракт или его фракцию), хотя существует вариант осуществления, когда одним или несколькими такими белками НВУ нагружают дрожжевой носитель или их иным образом собирают в комплекс, связывают, смешивают или вводят с дрожжевым носителем, как описано в настоящем описании, с образованием композиции по настоящему изобретению. В соответствии с настоящим изобретением, указание на гетерологичный белок или гетерологичный антиген, включая гетерологичный слитый белок, применительно к дрожжевому носителю по изобретению, означает, что белок или антиген не являются белком или антигеном, которые естественным образом экспрессируются дрожжами, хотя слитый белок, который включает гетерологичный антиген или гетерологичный белок, также может включать последовательности или белки дрожжей или их части, которые естественным образом экспрессируются дрожжами (например, препропоследовательность α-фактора, как описано в настоящем описании).
Один из вариантов осуществления изобретения относится к различным слитым белкам НВУ. В одном из аспектов такие слитые белки НВУ пригодны в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению. Такие слитые белки и/или рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки, также можно использовать в, в комбинации с или для продуцирования неиммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, которая может включать, но не ограничиваться ими, вакцину ДНК, белковую субъединичную вакцину, иммунотерапевтическую композицию на основе рекомбинантного вируса, вакцину на основе убитого или инактивированного патогена и/или вакцину на основе дендритных клеток. В другом варианте осуществления такие слитые белки можно использовать в диагностическом анализе для НВУ и/или для получения антител против НВУ. В настоящем описании описаны иллюстративные слитые белки НВУ, обеспечивающие отдельные части антигенов НВУ, включая, например, отдельные части полимеразы и/или модифицированную полимеразу; отдельные части и/или модифицированный поверхностный антиген; отдельные части и/или модифицированный коровой
- 23 028659 антиген (включая по меньшей мере части или большую часть е-антигена); отдельные части и/или модифицированный Х-антиген; а также отдельные части и/или расположения любых одного, двух, трех или всех четырех антигенов (поверхностный антиген, коровый антиген, X и полимераза), такие как, но не ограничиваясь ими, отдельные части и/или расположения поверхностного антигена и корового антигена (включая по меньшей мере части или большую часть е-антигена); отдельные части и/или расположения поверхностного антигена, корового антигена (включая по меньшей мере части или большую часть еантигена), полимеразы и Х-антигена; отдельные части и/или расположения поверхностного антигена, корового антигена (включая по меньшей мере части или большую часть е-антигена) и полимеразы; и отдельные части и/или расположения поверхностного антигена, корового антигена (включая по меньшей мере части или большую часть е-антигена) и Х-антигена.
В одном из вариантов осуществления антигены ΗΒν, включая иммуногенные домены полноразмерных белков, как описано в настоящем описании, слиты с белками хозяина, которые сверхэкспрессируются в инфицированных ΗΒν, но не в неинфицированных, клетках хозяина. В одном из вариантов осуществления антигены ΗΒν, включая иммуногенные домены полноразмерных белков, как описано в настоящем описании, слиты с белком К2, фактором хозяина, требуемым для репликации ΗΒν, который в одном из вариантов осуществления экспрессируется в гепатоцитах. К2 представляет собой белковый компонент рибонуклеотидредуктазы (КНК) и является критичным для жизненного цикла ΗΒν (см., например, СоНеп с1 а1., 2010, ΗοραΙοΙ. 51(5):1538-1546). Другие варианты осуществления изобретения будут очевидными ввиду описания, представленного в настоящем описании.
Вирус гепатита В, гены и белки. Вирус гепатита В (ΗΒν) является представителем семейства вирусов Ηοραύηανίπύαο (гепаднавирусы) и вызывает временные и хронические инфекции печени у человека и человекообразных приматов. Гепаднавирусы, которые инфицируют млекопитающих, имеют сходные последовательности ДНК и организацию генома и сгруппированы в род 0пЬоЬерайпауци5. Вирусная частица гепатита В имеет наружную оболочку, содержащую липид и частицы поверхностного антигена, известные как ΗΒκΆ§. Коровый белок, содержащий нуклеокапсидный кор (ΗΒοΆ§), окружает вирусную ДНК и полимеразу ДНК с активностью обратной транскриптазы. Как рассмотрено в δееде^ апй Макоп, 2000, МюгоЬю1. Мо1. Βίο1. Кеу. 64(1):51-68, ΗΒν имеет геном из частично двухцепочечной релаксированной кольцевой ДНК (ркДНК) размером 3,2 т.п.н., которая преобразуется в ковалентно замкнутую двухцепочечную молекулу ДНК (кзкДНК) при доставке вирусного геном в ядро инфицированного гепатоцита. РНК-полимераза ΙΙ клетки-хозяина транскрибирует четыре вирусных РНК с кзкДНК-матрицы, которые транспортируются в цитоплазму клетки-хозяина. Вирусные РНК включают мРНК, которые транскрибируются с образованием вирусных коровых и оболочечных структурных белков и прекорового, полимеразного и X неструктурных вирусных белков. РНК, которая транслируется с образованием корового белка и полимеразы, также служит в качестве прегеномной РНК (пгРНК), которая является матрицей для обратной транскрипции. пгРНК и полимераза инкапсулируются коровым белком, продуцирующим вирусный нуклеокапсид, где пгРНК обратно транскрибируется в ркДНК. Затем эти ркДНКсодержащие нуклеокапсиды заключаются в оболочечные белки и секретируются из клетки-хозяина в качестве зрелых вирионов или транспортируются в ядро для амплификации вирусной кзкДНК.
Структурные и неструктурные белки, продуцируемые геномом ΗΒν, представлены в табл. 1. Частично двухцепочечный геном ΗΒν содержит четыре гена, известных как С, X, Р и δ (см. также фиг. 1).
- 24 028659
Таблица 1
Гены НВУ и продукты генов
Ген | Белок | Функция(и) |
С | коровый белок (НВсАд) | Образует вирусный капсид, окружающий вирусную пгРНК и полимеразу |
е-антиген (НВеАд) | Функция неизвестна; может представлять собой НВУ-специфический иммунодепрессивный фактор для адаптивного иммунного ответа | |
Р | полимераза | Полимераза для репликации вирусной ДНК - Домен 1: домен концевого белка (ТР) упаковывает пгДНК и служит затравкой минус-цепи ДНК - Домен 2: домен обратной транскриптазы (КТ), РНК-аза Н; деградирует пгРНК |
5 | 3 НВзАд (поверхностный антиген; малый) | Белок оболочки и образует частицы поверхностного антигена; может подавлять иммунную функцию |
М НВзАд (поверхностный антиген; средний = Рге- 32 + 3) | Белок оболочки и образует частицы поверхностного антигена вместе с 8; может подавлять иммунную функцию | |
Ь НВзАд (поверхностный антиген; большой = Рге- 31 + рге-32 + 3) | Белок оболочки и образует частицы поверхностного антигена вместе с 8; домен рге-31 обеспечивает лиганд для коровых частиц в ходе сборки вирусной оболочки; рецептор для гепатоцитов; может подавлять иммунную функцию |
X | Х-антиген (НВх) | Трансактивация транскрипции; регуляция каскадов репарации ДНК; повышение цитозольных уровней кальция; модулирование каскадов деградации белка; модулирование прогрессирования клеточного цикла и каскадов пролиферации клеток в клетке-хозяине; стимуляция репликации НВУ |
Ген С кодирует два близкородственных антигена: белок массой 21 кДа, называемый коровым белком или коровым антигеном (НВсАд), который образует вирусный капсид, и белок массой 17 кДа, называемый е-антигеном (НВеАд), который образует димеры, но не собирается в капсид. Полноразмерный коровый белок представляет собой белок приблизительно из 183 аминокислот, содержащий все, кроме Ы-концевых 10 аминокислот е-антигена и содержащий приблизительно 34 дополнительных аминокислоты на С-конце, которые протеолитически расщепляются при образовании е-антигена. Иными словами, коровый белок и е-антиген имеют 149 общих аминокислотных остатков (этот фрагмент иногда называют коровым антигеном гепатита), но различаются И-концевыми и С-концевыми областями. Прекоровый белок представляет собой белок-предшественник, содержащий аминокислотную последовательность, которая включает последовательность как из корового антигена, так и из е-антигена, из которой образуется е-антиген путем протеолитического процессинга. Внутриклеточный НВеАд включает остатки прекорового белка от -29 до -1 (нумерация остатков в этом конкретном описании представлена так, что первый аминокислотный остаток корового белка в прекоровом белке, обозначается как положение 1), который содержит сигнальную последовательность, которая направляет белок в эндоплазматическую сеть, где отщепляются аминокислоты с -29 по -11; другое протеолитическое расщепление между аминокислотами 149 и 150 удаляет С-концевую часть прекорового белка (которая присутствует в полноразмерном коровом белке), а затем оставшийся НВеАд (состоящий из аминокислот с -10 по -1 прекорового белка вместе с аминокислотами 1-149 НВсАд или корового белка) секретируется в качестве еантигена (8!апЫпд е! а1., 1988, РНА8 И8А 85: 8405-8409; 0и е! а1., 1986, РНА8 И8А 83:1578-1582; Вгазз апй ОетИсй, 1988, У1го1оду 163:268-275; ТакайазЫ е! а1., 1983, I. 1ттипо1. 130:2903-2907). НВеАд, состоящий из полной прекоровой области, также встречается в сыворотке человека (ТакайазЫ е! а1., 1992, I.
- 25 028659
1ттипо1. 147:3156-3160). Как упоминалось, НВсАд (коровый белок) образует димеры, которые собираются в вирусный капсид и содержат полимеразу и вирусную ДНК или пгРНК. Функция НВеАд (еантигена) неизвестна, однако он не требуется для репликации НВV или инфекции, и полагают, что он является иммунодепрессивным фактором, который защищает ΗΒν от атаки иммунной системы (МШсб е! а1., 1990, ΡΝΑδ υδΑ 87:6599-66 03; Сбе е! а1., 2004, ΡΝΑδ υδΑ 101:14913-14918; \\!е1аиб апб СЫзаб,
2005, 1. νίτοί. 79:9369-9380). Для ясности, в последовательностях ΗΒν, описанных в настоящем описании (например, см. табл. 3), предусмотрена последовательность прекорового белка из типичных генотипов ΗΒν, и положения корового белка и е-антигена обозначены в прекоровой последовательности так, что первая аминокислота прекорового белка обозначена как положение 1.
Ген Р кодирует ДНК-полимеразу (Ρο1) ΗΒν, которая состоит из двух основных доменов, связанных спейсером. Ν-концевой домен полимеразы (также называемый концевым белком или ТР) вовлечен в упаковывание пгРНК и в осуществление затравки несмысловой цепи ДНК. С-концевой домен представляет собой обратную транскриптазу (КТ), которая обладает активностью РНК-азы Н (КН).
Ген δ имеет множество инициирующих кодонов и кодирует три оболочечных белка (также называемых в настоящем описании, главным образом, поверхностным белком или поверхностным антигеном), обозначаемых как δ, М и Ь, все из которых являются компонентами инфекционных вирусных частиц, также известных как частицы Папе. δ, сам по себе, и вместе с М и Ь, также образует частицы поверхностного агнитена (НВзАд), которые могут секретироваться из инфицированных клеток в больших количествах Пеедег апб Мазоп, 2000, МюгоЪю1. Мо1. Βίο1. Кеу. 64(1):51-68; Веск, (2007), Нераббз В νίгиз гербсабоп, \Уог1б 1оигпа1 о£ Оазбоеп!его1оду: БЮ 13(1): 48-64). Кодоны для М и Ь расположены приблизительно на 165 (М) и 489 (Ь) нуклеотидов, соответственно, выше инициирующего кодона для δ. δ или малый поверхностный антиген является наименьшим и наиболее распространенным из поверхностных антигенов. Антитела, продуцируемые против этого антигена, отражают сероконверсию у инфицированных индивидуумов. М или средний поверхностный антиген имеет дополнительный белковый домен по сравнению с δ, известный как ρΐΌ-δ2. и белковый домен, который является уникальным для Ь или большого поверхностного антигена, известен как рге-δ! (таким образом, Ь также содержит рге-δΣ и дополнительную последовательность, принадлежащую М и δ). Бге-δ 1 содержит домен вирусного рецептора для гепатоцитов (участок связывания для рецептора гепатоцитов), который расположен приблизительно между положениями аминокислот 21 и 47 рге-δΤ Эпитопы в рге-δ 1 могут индуцировать нейтрализующие вирус антитела. Кроме того, ρΐΌ-δ1 домен обеспечивает лиганд для коровых частиц в ходе сборки вирусной оболочки. Частицы поверхностного антигена (НЕзАд) также могут подавлять элиминацию иммунной системой инфицированных клеток путем функционирования в качестве толерогена в высокой дозе (Кеьдпа! е! а1., 2002, 1. Ехр. Меб. 195:1089-1101; \УеЪз1ег е! а1., 2004, 1. νΐΐΌ1. 78:5707-5719).
Ген X кодирует Х-антиген (НВх) (который также называют Х-белком), который вовлечен в транскрипционную трансактивацию, регуляцию каскадов репарации ДНК, повышение уровней кальция в цитозоле, модулирование каскадов деградации белков, и модулирование прогрессирования клеточного цикла и каскадов пролиферации клеток в клетке-хозяине (Оеагбаб е! а1., 2010, 1. У|го1.), которые усиливают стимуляцию репликации ΗΒV. НВх также связан с развитием рака печени (Ктт е! а1., №!иге 1991, 351:317-320; ТетгабШоз е! а1., Опсодепе 1997, 14:395-404).
ΗΒV встречается в качестве одного из четырех основных серотипов (абг, абте, ауг, ауте), которые определяются, исходя из антигенных эпитопов в их белках оболочки. Существует восемь различных генотипов ΗΒV (А-Н), исходя из вариаций нуклеотидной последовательности в геноме. Географическое распределение генотипов представлено в табл. 2 (Кгапитз е! а1., 2005, Уассбю 23(19): 2409-2423; Мадишз апб Жгбег, 1995, 1п!еМго1оду 38 (1-2):24-34; δакатο!ο е! а1., 2006, 1. Оеп. νΐΐΌ1. 87:1873-1882; Пт е! а1.,
2006, 1п!. 1. Меб. 8ск 3:14-20).
- 26 028659
Таблица 2
Генотип НВУ | Преобладающее географическое распределение |
ΗΒν/Α | Америка, Европа, Африка, Юго-восточная Азия |
НВУ/В | Азия (Китай, Япония, Юго-восточная Азия), США |
ΗΒν/с | Азия (Китай, Япония, Юго-восточная Азия), США |
ΗΒν/ϋ | США, Средиземноморье, Средний Восток и Индия |
НВУ/Ε | Африка к югу от Сахары и Западная Африка |
ΗΒν/Γ | Центральная и Южная Америка |
НВУ/С | Франция, Германия, США |
НВУ/Η | Центральная Америка, США (Калифорния) |
Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для генов НВУ и белков, кодируемых ими, известны в данной области для каждого из известных генотипов. В табл. 3 представлена отсылка на идентификаторы последовательностей для иллюстративных (репрезентативных) аминокислотных последовательностей всех из структурных и неструктурных белков НВУ в каждом из восьми известных генотипов НВУ, и, кроме того, указано положение определенных структурных доменов. Следует отметить, что между различными изолятами вирусов могут встречаться небольшие отклонения в аминокислотной последовательности одного и того же белка или домена из одного и того же генотипа НВУ. Однако, как рассмотрено выше, штаммы и серотипы НВУ и генотипы НВУ проявляют высокую аминокислотную идентичность даже между серотипами и генотипами (например, см. табл. 4). Таким образом, с использованием руководства, представленного в настоящем описании, и указания иллюстративных последовательностей НВУ, специалист в данной области будет способен легко получить различные белки на основе НВУ, включая слитые белки, из любого штамма (изолята) НВУ, серотипа или генотипа, для применения в композициях и способах по настоящему изобретению, и, по существу, изобретение не ограничивается конкретными последовательностями, описанными в настоящем описании. Указание на белок НВУ или антиген НВУ где-либо в настоящем описании или на их любой функциональный, структурный или иммуногенный домен может быть соответствующим образом осуществлено путем отсылки на конкретную последовательность из одной или нескольких из последовательностей, представленных в настоящем описании, или путем отсылки на ту же самую, сходную или соответствующую последовательность из другого изолята (штамма) НВУ.
Таблица 3
Организм, Генотип, Ген | Белок | Идентификатор последовательности <№ доступа в базе данных) | ||
Прекоровый белок | 8Εζ) Ю N0:1 (Ν· доступа ААХ83988.1) | |||
НВУ | Генотип | А, | - Коровый | *Положения 30/31-212 |
С | белок(НВсАд) | 8Е0 Ю N0:1 | ||
- е-антиген | *Положения 20-178 3Εζ) | |||
(НВеАд) | Ю N0:1 | |||
НВУ | Генотип | А, | Полимераза | 8Е0 Ю N0:2 (Ν· доступа ΒΑΙ81985) |
Р | - обратная | *Положения 383-602 5Εζ) | ||
транскриптаза | Ю N0:2 | |||
Поверхностный | 8Е0 Ю N0:3 | |||
НВУ | Генотип | А, | НВзАд (Ь) | (Ν· доступа ВАБ91280.1) |
5 | Поверхностный | *Положения 120-400 5Εζ) | ||
НВзАд (М) | Ю N0:3 |
- 27 028659
Поверхностный НВзАд (5) | ‘Положения 175-400 8Е0 Ю N0:3 | |
НВУ, Генотип А, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:4 {№ доступа ААК97189.1) |
НВУ, Генотип В, С | Прекоровый белок | ЗЕО Ю N0:5 (Ν’ доступа ΒΑΩ90067) |
- Коровый белок(НВсАд) | ‘Положения 30/31-212 ЗЕО Ю N0:5 | |
- е-антиген (НВеАд) | *Положения 20-173 ЗЕО Ю N0:5 | |
НВУ, Генотип В, Р | Полимераза | ЗЕО Ю N0:6 (Ν’ доступа ΒΑΩ90068.1) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 381-600 ЗЕО Ю N0:6 | |
НВУ, Генотип В, 3 | Поверхностный НВзАд (Ь) | ЗЕО Ю N0:7 (Ν’ доступа ВАП06634.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 120-400 ЗЕО Ю N0:7 | |
Поверхностный НВзАд (8) | ‘Положения 175-400 ЗЕО Ю N0:7 | |
НВУ, Генотип В, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:8 (Ν’ доступа ВАЭ90066.1) |
НВУ, Генотип С, С | Прекоровый белок | ЗЕО Ю N0:9 (№ доступа ΥΡ_355335) |
- Коровый белок(НВеАд) | ‘Положения 30/31-212 ЗЕО Ю N0:9 | |
- е-антиген (НВеАд) | ‘Положения 20-178 ЗЕО Ю N0:9 | |
НВУ, Генотип С, Р | Полимераза | ЗЕО Ю N0:10 (Ν’ доступа АСН57822) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 381-600 ЗЕО Ю N0:10 |
НВУ, Генотип С, 5 | Поверхностный НВзАд (Ь) | 5ЕС Ю N0:11 (№ доступа ВАД06646.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 120-400 ЗЕО Ю N0:11 | |
Поверхностный НВзАд (3) | ‘Положения 175-400 ЗЕО Ю N0:11 | |
НВУ, Генотип С, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:12 (№ доступа ВАО06639.1) |
НВУ, Генотип ϋ, С | Прекоровый белок | ЗЕО Ю N0:13 {№ доступа АОЕ29260.1) |
- Коровый белок(НВеАд) | ‘Положения 30/31-212 ЗЕО Ю ΝΟ:13 | |
- е-антиген (НВеАд) | ‘Положения 20-178 ЗЕО Ю ΝΟ:13 | |
НВУ, Генотип ϋ, Р | Полимераза | ЗЕО Ю N0:14 {№ доступа АОО12642.1) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 370-589 ЗЕО Ю N0:14 | |
НВУ, Генотип ϋ, 3 | Поверхностный НВзАд (Ь) | ЗЕО Ю N0:15 {№ доступа АСР20363.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 109-389 ЗЕО Ю N0:15 | |
Поверхностный НВзАд (3) | ‘Положения 164-389 ЗЕО Ю N0:15 | |
НВУ, Генотип ϋ, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:16 {№ доступа ВАЕ47226.1) |
НВУ, Генотип Ε, С | Прекоровый белок | ЗЕО Ю N0:17 (№ доступа АСи25047.1) |
- Коровый белок(НВсАд) | ‘Положения 30/31-212 ЗЕО Ю N0:17 | |
- е-антиген (НВеАд) | ‘Положения 20-178 ЗЕО Ю N0:17 |
- 28 028659
ΗΒν, Генотип Е, Р | Полимераза | 5Е0 Ю N0:18 (№ доступа АСО89764.1) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 380-599 ЗЕО Ю N0:18 | |
ΗΒν, Генотип Е, 5 | Поверхностный НВзАд (ί,) | ЗЕО Ю N0:19 {№ доступа ΒΑΩ91274.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 119-399 ЗЕО Ю N0:19 | |
Поверхностный НВзАд (3) | ‘Положения 174-399 ЗЕО Ю N0:19 | |
ΗΒν, Генотип Е, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:20 (№ доступа АСи24370.1) |
ΗΒν, Генотип Г, С | Прекоровый белок | ЗЕО Ю N0:21 (№ доступа ВАВ17946.1) |
- Коровый белок(НВеАд) | ‘Положения 30/31-212 ЗЕО Ю N0:21 | |
- е-антиген (НВеАд) | ‘Положения 20-178 ЗЕО Ю N0:21 | |
ΗΒν, Генотип Г, Р | Полимераза | ЗЕО Ю N0:22 (№ доступа АСО03788.2) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 381-600 ЗЕО Ю N0:22 | |
ΗΒν, Генотип Г, 5 | Поверхностный НВзАд (Ь) | ЗЕО Ю N0:23 (№ доступа ΒΑΌ98933.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 120-400 ЗЕО Ю N0:23 | |
Поверхностный НВзАд (3) | ‘Положения 175-400 ЗЕО Ю N0:23 | |
ΗΒν, Генотип Г, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:24 (№ доступа ААМ09054.1) |
ΗΒν, Генотип С, С | Прекоровый белок | ЗЕО Ю N0:25 (№ доступа ΑΩΩ62622.1) |
- Коровый белок(НВсАд) | ‘Положения 14-194 ЗЕО Ю N0:25 | |
- е-антиген (НВеАд) | ‘Положения 4-161 ЗЕО Ю N0:25 | |
ΗΒν, Генотип С, Р | Полимераза | ЗЕО Ю N0:26 (№ доступа ΑΌΌ62619.1) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 380-599 ЗЕО Ю N0:26 | |
ΗΒν, Генотип 0, 3 | Поверхностный НВзАд <Ь) | ЗЕО Ю N0:27 {№ доступа ΑΌΌ62620.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 119-399 ЗЕО Ю N0:27 | |
Поверхностный НВзАд (3) | ‘Положения 174-399 ЗЕО Ю N0:27 | |
ΗΒν, Генотип 0, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:28 {№ доступа ВАВ82400.1) |
ΗΒν, Генотип Н, С | Прекоровый белок | ЗЕО ТП МП;29 (№ доступа ΒΑΩ91265.1) |
- Коровый белок(НВсАд) | ‘Положения 30/31-212 ЗЕО Ю N0:29 | |
- е-антиген (НВеАд) | ‘Положения 20-178 ЗЕО Ю N0:29 | |
ΗΒν, Генотип Н, Р | Полимераза | ЗЕО Ю N0:30 (№ доступа ВАЕ49208.1) |
- обратная транскриптаза | ‘Положения 381-600 ЗЕО Ю N0:30 | |
ΗΒν, Генотип Н, 5 | Поверхностный НВзАд (Щ | ЗЕО Ю N0:31 (№ доступа ВАЕ20065.1) |
Поверхностный НВзАд (М) | ‘Положения 120-400 ЗЕО Ю N0:31 | |
Поверхностный НВзАд (3) | ‘Положения 175-400 ЗЕО Ю N0:31 | |
ΗΒν, Генотип Н, X | X (НВх) | ЗЕО Ю N0:32 (Ν· доступа ВАЕ49206.1) |
* Нумерация положений является приблизительной и может включать дополнительные аминокислоты, фланкирующие указанное положение с любой стороны
- 29 028659
Антигены вируса гепатита В и конструкции.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к новым антигенам НВУ и слитым белкам и рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим эти антигены и белки. В настоящем описании описано несколько различных новых антигенов НВУ для применения в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей или другой композиции (например, другой иммунотерапевтической или диагностической композиции), которая предоставляет один или несколько (два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более) антигенов и/или иммуногенных доменов из одного или нескольких белков, все из которых содержатся в одном и том же слитом белке и кодируются одной и той же рекомбинантной конструкцией нуклеиновой кислоты (рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты). Антигены, используемые в композициях по изобретению, включают по меньшей мере один белок НВУ или его иммуногенный домен для иммунизации животного (профилактически или терапевтически). Композиция может включать один, два, три, четыре, немного, несколько или множество антигенов НВУ, включая один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более иммуногенных доменов из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более иммуногенных доменов одного, двух, трех, четырех или более белков НВУ. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой слитый белок. В одном из аспектов изобретения слитый белок может включать два или более белков. В одном из аспектов слитый белок может включать два или более иммуногенных доменов и/или два или более эпитопов одного или нескольких белков. Иммунотерапевтическая композиция, содержащая такие антигены, может обеспечить антигенспецифическую иммунизацию у широкого диапазона пациентов. Например, антиген или слитый белок, охватываемые изобретением, могут включать по меньшей мере часть или полную длину любого одного или нескольких белков НВУ, выбранных из поверхностного белка НВУ (также называемого поверхностным антигеном или белком оболочки или НВкАд), включающего большую (Ь), среднюю (М) и/или малую (8) формы поверхностного белка, и/или его домены рге-81 и/или рге-82; прекорового белка НВУ; корового белка НВУ (также называемого коровым антигеном или НВсАд); е-антигена НВУ (также называемого НВеАд); полимеразы НВУ (включая один или оба домена полимеразы, называемые КТ-доменом и ТР-доменом); Х-антигена НВУ (также называемого Х, Х-антигеном или НВх); и/или любого одного или нескольких иммуногенных доменов любого одного или нескольких из этих белков НВУ. В одном из вариантов осуществления антиген, подходящий в иммунотерапевтической композиции по изобретению, происходит из одного белка НВУ (полноразмерный, практически полноразмерный или его часть, содержащая по меньшей мере один, два, три, четыре или более иммуногенных доменов полноразмерного белка). В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапевтическая композиция включает один, два, три, четыре, пять или более отдельных дрожжевых носителей, каждый из которых экспрессирует или содержит отличающийся антиген(ы) НВУ.
Комбинации антигенов НВУ, подходящие для настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими (в любом порядке в слитом белке):
(1) поверхностный белок (Ь, М и/или 8 и/или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов, включая, но не ограничиваясь ими, рге-81 и/или рге-82 и/или распознаваемый рецепторами гепатоцитов домен рге-81) в комбинации с любым одним или несколькими из (а) прекоровый/коровый/е (прекоровый антиген, коровый антиген, е-антиген и/или любой один или комбинация их функциональных и/или иммунологических доменов); (Ь) полимераза (полноразмерная, КТдомен, ТР-домен и/или любой один или комбинация ее функциональных и/или иммунологических доменов); и/или (с) Х-антиген (или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов);
(2) прекоровый/коровый/е (прекоровый антиген, коровый антиген, е-антиген и/или любой один или комбинация их функциональных и/или иммунологических доменов) в комбинации с любым одним или несколькими из (а) поверхностный белок (Ъ, М и/или 8, и/или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов, включая, но не ограничиваясь ими, рге-81 и/или рге-82, и/или распознаваемый рецепторами гепатоцитов домен рге-81); (Ь) полимераза (полноразмерная, КТдомен, ТР-домен и/или любой один или комбинация ее функциональных и/или иммунологических доменов); и/или (с) Х-антиген (или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов);
(3) полимераза (полноразмерная, КТ-домен, ТР-домен и/или любой один или комбинация ее функциональных и/или иммунологических доменов) в комбинации с любым одним или несколькими из (а) поверхностный белок (Ь, М и/или 8 и/или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов, включая, но не ограничиваясь ими, рге-81 и/или рге-82 и/или распознаваемый рецептором гепатоцитов домен рге-81); (Ь) прекоровый/коровый/е (прекоровый антиген, коровый антиген, е-антиген и/или любой один или комбинация их функциональных и/или иммунологических доменов); и/или (с) Х-антиген (или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов); или (4) Х-антиген (или любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов) в комбинации с любым одним или несколькими из (а) поверхностный белок (Ь, М и/или 8 и/или
- 30 028659 любой один или комбинация его функциональных и/или иммунологических доменов, включая, но не ограничиваясь ими, рге-81 и/или рге-82 и/или распознаваемый рецептором гепатоцитов домен рге-81); (Ъ) полимераза (полноразмерная, КТ-домен, ТР-домен и/или любой один или комбинация ее функциональных и/или иммунологических доменов); и/или (с) прекоровый/коровый/е (прекоровый антиген, коровый антиген, е-антиген и/или любой один или комбинация их функциональных и/или иммунологических доменов).
Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот и белки, кодируемые ими, включая слитые белки, в качестве одного варианта осуществления изобретения можно использовать в иммунотерапевтических композициях на основе дрожжей или для любого другого подходящего назначения для антигена(ов) НВУ, в том числе в анализе ш уйго, для продуцирования антител или в другой иммунотерапевтической композиции, включающей другую вакцину, которая не основана на иммунотерапии на основе дрожжей, описанной в настоящем описании. Экспрессия белков дрожжами является одним из предпочтительных вариантов осуществления, хотя можно использовать другие экспрессирующие системы для получения белков для применений, отличных от иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей.
В соответствии с настоящим изобретением общее использование в настоящем описании термина антиген относится: к любой части белка (пептида, неполного белка, полноразмерного белка), где белок является природным или полученным синтетическим путем, к клеточной композиции (целая клетка, клеточный лизат или разрушенные клетки), к организму (целый организм, лизат или разрушенные клетки) или к углеводу, или другой молекуле, или ее части. Антиген может индуцировать антигенспецифический иммунный ответ (например, гуморальный и/или клеточно-опосредуемый иммунный ответ) против него самого или сходных антигенов, которые обнаруживаются элементом иммунной системы (например, Тклетками, антителами).
Антиген может представлять собой только единичный эпитоп, единичный иммуногенный домен или он может быть больше, и он может включать несколько эпитопов или иммуногенных доменов. По существу, размер антигена может составлять только 8-12 аминокислот (т.е. пептид) и вплоть до полноразмерного белка, мультимера, слитого белка, химерного белка, целой клетки, целого микроорганизма или любых его частей (например, лизаты целых клеток или экстракты микроорганизмов). Кроме того, антигены могут включать углеводы, которые могут быть добавлены к дрожжевому носителю или в композицию по изобретению. Будет понятно, что в некоторых вариантах осуществления (например, когда антиген экспрессируется дрожжевым носителем из рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты), антиген представляет собой слитый белок, химерный белок или их фрагмент, а не целую клетку или микроорганизм.
Когда антиген экспрессируют в дрожжах, антиген имеет минимальный размер, при котором он может рекомбинантно экспрессироваться в дрожжах, и, как правило, он имеет длину по меньшей мере или более 25 аминокислот, или по меньшей мере или более 26, по меньшей мере или более 27, по меньшей мере или более 28, по меньшей мере или более 29, по меньшей мере или более 30, по меньшей мере или более 31, по меньшей мере или более 32, по меньшей мере или более 33, по меньшей мере или более 34, по меньшей мере или более 35, по меньшей мере или более 36, по меньшей мере или более 37, по меньшей мере или более 38, по меньшей мере или более 39, по меньшей мере или более 40, по меньшей мере или более 41, по меньшей мере или более 42, по меньшей мере или более 43, по меньшей мере или более 44, по меньшей мере или более 45, по меньшей мере или более 46, по меньшей мере или более 47, по меньшей мере или более 48, по меньшей мере или более 49, или по меньшей мере или более 50 аминокислот, или его длина составляет по меньшей мере 25-50 аминокислот, по меньшей мере 30-50 аминокислот, или по меньшей мере 35-50 аминокислот, или по меньшей мере 40-50 аминокислот, или по меньшей мере 45-50 аминокислот. Могут быть экспрессированы белки меньших размеров и могут быть экспрессированы значительно более крупные белки (например, длиной сотни аминокислот или даже несколько тысяч аминокислот). В одном из аспектов может экспрессироваться полноразмерный белок, или его структурный или функциональный домен, или его иммуногенный домен, который лишен одной или нескольких аминокислот с Ν- и/или С-конца (например, лишенный от приблизительно 1 до приблизительно 20 аминокислот с Ν- и/или С-конца). Слитые белки и химерные белки также представляют собой антигены, которые могут экспрессироваться в рамках настоящего изобретения. Антиген-мишень, представляет собой антиген, на который специфически нацелена иммунотерапевтическая композиция по изобретению (т.е. антиген, против которого является желательной индукция иммунного ответа). Антиген НВ представляет собой антиген, происходящий, сконструированный или полученный из одного или нескольких белков НВУ, так что нацеливание на антиген также нацелено на вирус гепатита В.
При указании на стимуляцию иммунного ответа термин иммуноген является разновидностью термина антиген, и, таким образом, в некоторых случаях его можно использовать взаимозаменяемо с термином антиген. Иммуноген, как используют в рамках изобретения, описывает антиген, который индуцирует гуморальный и/или клеточно-опосредуемый иммунный ответ (т.е. является иммуногенным), так что введение иммуногена индивидууму индуцирует антигенспецифический иммунный ответ против того же или сходных антигенов, которые встречает иммунная система индивидуума. В одном из вариантов осуществления иммуноген индуцирует клеточно-опосредуемый иммунный ответ, включая СЭ4' Т- 31 028659 клеточный ответ (например, ТН1, ТН2 и/или ТН17) и/или СЭ8' Т-клеточный ответ (например, СТЬответ).
Иммуногенный домен данного антигена может представлять собой любую часть, фрагмент или эпитоп антигена (например, пептид фрагмент или субъединца, или эпитоп антитела, или другой конформационный эпитоп), которые содержат по меньшей мере один эпитоп, который действует в качестве иммуногена при введении животному. Таким образом, иммуногенный домен больше, чем единичная аминокислота, и обладает размером, по меньшей мере, достаточным для того, чтобы он содержал по меньшей мере один эпитоп, который может действовать в качестве иммуногена. Например, единичный белок может содержать множество различных иммуногенных доменов. Иммуногенные домены не обязательно должны представлять собой линейные последовательности в белке, как, например, в случае гуморального иммунного ответа, где предусматриваются конформационные домены.
Функциональный домен данного белка представляет собой часть или функциональный элемент белка, который включает последовательность или структуру, которые прямо или непрямо ответственны за по меньшей мере одну биологическую или химическую функцию, связанную с белком, приписываемую ему или выполняемую им. Например, функциональный домен может включать активный центр для ферментативной активности, участок связывания лиганда, участок связывания рецептора, участок связывания для молекулы или части, такой как кальций, участок фосфорилирования или домен трансактивации. Примеры функциональных доменов НВУ включают, но не ограничиваются ими, вирусный распознаваемый рецепторами гепатоцитов домен рге-З1, или домен обратной транскриптазы, или домен РНКазы Н в полимеразе.
Структурный домен данного белка является частью белка или элементом общей структуры белка, который имеет поддающуюся идентификации структуру (например, это может быть первичная или третичная структура, принадлежащая и указывающая на несколько белков в классе или семействе белков), является самостабилизирующимся и/или может сворачиваться независимо от остальной части белка. Структурный домен связан с или определяет в значительной степени биологическую функцию белка, которому он принадлежит.
Эпитоп определяют в настоящем описании как единичный иммуногенный участок в данном антигене, который является достаточным для индукции иммунного ответа, когда он предоставляется иммунной системе в контексте соответствующих костимуляторных сигналов и/или активированных клеток иммунной системы. Иными словами, эпитоп является частью антигена, которая в действительности распознается компонентами иммунной системы, и также он может называться антигенной детерминантой. Специалистам в данной области будет понятно, что Т-клеточные эпитопы отличаются по размеру и составу от В-клеточных или антительных эпитопов, и что эпитопы, представляемые через каскад МНС класса I, отличаются по размеру и структурным признакам от эпитопов, представляемых через каскад МНС класса II. Например, Т-клеточные эпитопы, представляемые молекулами МНС класса I, как правило, имеют длину 8-11 аминокислот, в то время как эпитопы, представляемые молекулами МНС класса II, менее ограничены по длине и могут иметь длину от 8 аминокислот вплоть до 25 аминокислот или более. Кроме того, Т-клеточные эпитопы имеют предсказанные структурные характеристики, зависящие от конкретных молекул МНС, связываемых эпитопом. Множество различных Т-клеточных эпитопов идентифицировано в различных штаммах НВУ и для многих типов НЬА человека, некоторые из которых представлены в табл. 5. Кроме того, в рамках настоящего изобретения были вновь открыты эпитопы для определенных гаплотипов МНС мыши, и они также представлены в табл. 5 или в разделе Примеры. Эпитопы могут представлять собой эпитопы с линейной последовательностью или конформационные эпитопы (консервативные связывающие области). Большинство антител распознают конформационные эпитопы.
Один иллюстративный вариант осуществления изобретения относится к слитому белку, содержащему антиген НВУ, который представляет собой мультибелковый антиген НВУ, и в этом примере слитую конструкцию, состоящую из большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, включающего все гидрофобные трансмембранные домены, и корового антигена (НВсАд), подробно описанного ниже. Поверхностный антиген и коровый антиген в большом количестве экспрессируются в инфицированных клетках, требуются для репликации вируса и содержат множество СЭ4' и СЭ8' Т-клеточных эпитопов. Кроме того, эти антигены, в частности поверхностный антиген, содержат известные участки мутации, которые могут индуцироваться противовирусной терапией; эти области, таким образом, можно модифицировать, при необходимости, для обеспечения дополнительных иммунотерапевтических композиций для нацеливания на мутации, обеспечивающие ускользание. Дополнительным преимуществом нацеливания на эти белки, и, в частности, на оба белка в одной иммунотерапевтической композиции, является высокая степень консервативности на уровне аминокислот среди различных генотипов НВУ. Как коровый, так и поверхностный (Ь) белки являются в высокой степени консервативными, например, между генотипами А и С НВУ или между А и Н (см. табл. 4) , которые представляют собой генотипы, преобладающие в Америке и Азии (табл. 2). Коровый белок проявляет 95% идентичность аминокислот между генотипами А и С и между генотипами А и Н. Большой (Ь) поверхностный белок также в высокой степени консервативен среди различных генотипов НВУ; 90% идентичность аминокислот существует между генотипами А и С,
- 32 028659 и 82% идентичность аминокислот существует между генотипами А и Н.
Таблица 4 | ||||
Сравнение | Коровый антиген | Поверхностный (Ь) антиген | X | Полимераза |
генотип А НВУ против генотипа С НВУ | 95 | 90 | 89 | 90 |
генотип А НВУ против генотипа Н НВУ | 95 | 82 | 79 | 82 |
Таким образом, можно ожидать, что одна иммунотерапевтическая композиция, созданная с использованием одного генотипа НВУ, будет индуцировать эффективный иммунный ответ против высокосходного генотипа НВУ, либо путем прямого нацеливания на консервативные эпитопы, либо путем распространения эпитопа в результате первоначального нацеливания на эпитопы, которые являются консервативными между генотипами. Альтернативно, вследствие простоты получения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей по изобретению, их последовательность можно без труда модифицировать, чтобы они кодировали белок, домен или эпитоп из отличающего генотипа, или чтобы они включали в той же конструкции другие Т-клеточные эпитопы или целые домены и/или белки из двух или более различных генотипов НВУ, для увеличения широкой применимости иммунотерапии. Примеры таких антигенов НВУ подробно описаны и проиллюстрированы ниже. Хотя одна иммунотерапевтическая композиция по настоящему изобретению сконструирована для нацеливания на два антигена НВУ - поверхностный и коровый белок, в одном продукте, этот подход можно легко расширить путем включения белковых последовательностей других необходимых, консервативных и иммуногенных белков вируса НВУ, чтобы достигнуть еще более широких клеточных иммунных ответов. Такие дополнительные слитые белки и иммунотерапевтические композиции описаны и проиллюстрированы в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению выбраны из антигенов НВУ, которые сконструированы так, чтобы оптимизировать или усилить их полезность в качестве клинических продуктов, в том числе в контексте иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. Такие антигены НВУ сконструированы для получения иммунотерапевтического продукта против НВУ на основе дрожжей, который достигает одной или нескольких из следующих целей: (1) соответствие рекомендациям КссотЬшап! ^NΑ Абу18огу Сотт1йсс (КАС) в №-1копа1 1п8Ши1с8 о£ НсаПЬ (N14), по которым не более двух третей (2/3) инфекционного агента можно использовать в рекомбинантном терапевтическом средстве или вакцине; (2) включение максимального количества известных Т-клеточных эпитопов, связанных с иммунным ответом на острые/самоограничивающиеся инфекции НВУ и/или хронические инфекции НВУ (в одном из аспектов с приоритетом репертуара эпитопов острой/самоограничивающейся инфекции, как рассмотрено ниже); (3) максимизация или приоритет включения иммуногенных доменов и, более конкретно, Т-клеточных эпитопов (ί'.Ό4' и/или СЭ8' эпитопов, и доминантных и/или субдоминантных эпитопов), которые наиболее консервативны среди генотипов и/или подгенотипов НВУ, или которые можно легко модифицировать в консенсусную последовательность или включать в двух или более формах, чтобы охватить наиболее важные различия последовательностей среди генотипов-мишеней; и/или (4) минимизация количества неприродных участков соединения в последовательности антигена НВУ в продукте.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение включает модификацию антигенов НВУ от их природных последовательностей или последовательностей дикого типа в данном штамме так, чтобы они удовлетворяли одному или нескольким из критериев, рассмотренных выше, а также чтобы они включали элементы конструкции и/или критерии конструирования антигена, описанные в других разделах настоящего описания. Такие критерии и рекомендации по конструированию антигена применимы к иммунотерапевтическим средствам на основе дрожжей, содержащим антигены НВУ, которые представляют собой индивидуальные белки или домены НВУ, а также антигены НВУ, которые включают комбинации белков или доменов НВУ, и, в частности, мультибелковые антигены/слитые белки (например, антигены НВУ из двух или более различных белков НВУ и/или их доменов, такие как комбинации антигенов поверхностного белка, полимеразы, корового белка, е-антигена и/или Х-антигена НВУ). Будет понятно, что по мере увеличения комплексности антигена НВУ, при конструировании антигена используется большее количество этих критериев.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения антиген НВУ, пригодный в настоящем изобретении в качестве белка или слитого белка, предназначенного для экспрессии дрожжами, включает последовательности НВУ, кодируемые нуклеотидными последовательностями, соответствующими менее чем двум третям (2/3) генома НВУ (т.е. антигены кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, которые в целом составляют менее двух третей (2/3) генома НВУ или удовлетворяют требованиям КАС для рекомбинантных терапевтических и профилактических средств). В одном из ас- 33 028659 пектов этот вариант осуществления может быть достигнут путем выбора антигенов НВУ для экспрессии в иммунотерапевтических средствах на основе дрожжей, которые удовлетворяют требованиям КАС в отношении их полноразмерной или практически полноразмерной формы (например, Х-антиген является небольшим и при использовании отдельно удовлетворяет требованиям КАС). В другом аспекте этот вариант осуществления достигается путем модификации структуры белка(ов) и/или домена(ов), подлежащих включению в антиген НВУ, как, например, путем делеции последовательности для укорочения белков и удаления внутренних последовательностей из белков, путем включения только выбранных функциональных, структурных или иммуногенных доменов белка, или путем выбора полной отмены включения конкретного белка в антигенную конструкцию. Кроме того, иммунотерапевтические средства против НВУ на основе дрожжей в одном из вариантов осуществления можно получать в качестве отдельных антигенных конструкций, а затем использовать в комбинации так, чтобы это не противоречило какимлибо ограничениям, связанным с вирусным геномом.
В другом варианте осуществления изобретения, как рассмотрено выше, включение Т-клеточных эпитопов в антигенную конструкцию НВУ (белок или слитый белок) максимизируют, например, если антиген НВУ, включенный в иммунотерапевтическое средство, модифицирован так, чтобы он удовлетворял другим принципам конструирования, таким как требования КАС, рассмотренные выше. В этом варианте осуществления антигены НВУ, подходящие в иммунотерапевтических средствах на основе дрожжей, модифицируют с целью максимизации количества иммуногенных доменов, и в одном из аспектов количества Т-клеточных эпитопов, которые сохраняются в антигене НВУ. В одном из аспектов включения Т-клеточных эпитопов в антиген НВУ имеет следующий приоритет.
Эпитопы, идентифицированные при иммунных ответах как на острые/самоограничивающиеся инфекции НВУ, так и на хронические инфекции НВУ > эпитопы, идентифицированные при иммунном ответе на острые/самоограничивающиеся инфекции НВУ > эпитопы, идентифицированные при иммунном ответе на хронические инфекции НВУ.
В этом варианте осуществления без связи с теорией, авторы изобретения полагают, что иммунные ответы индивидуумов, которые имели острые или самоограничивающиеся инфекции НВУ, могут быть более продуктивными в отношении устранения вирусных инфекций, чем иммунные ответы индивидуумов, которые имеют хронические инфекции НВУ. Таким образом, включение Т-клеточных эпитопов, которые, по-видимому, связаны с клиренсом вируса при этих острых или самоограничвающихся инфекциях (как доминантных, так и субдоминантных) является приоритетным, поскольку они с большей вероятностью вызовут благоприятный иммунный ответ у иммунизированного индивидуума. Кроме того, и вновь без связи с теорией, авторы изобретения полагают, что индуцирование иммунного ответа против одного или нескольких антигенов-мишеней НВУ с использованием иммунотерапии на основе дрожжей может обеспечить иммунный ответ у иммунизированного индивидуума не только против эпитопов, включенных в иммунотерапевтические средства на основе дрожжей, но также против других эпитопов НВУ, присутствующих у индивидуума. Это явление, называемое распространением эпитопов, позволяет конструировать антигены НВУ, которые сфокусированы на эпитопах, которые, по-видимому, в наибольшей степени связаны с терапевтической пользой, а затем механизм действия иммунотерапевтического продукта на основе дрожжей позволяет иммунной системе расширить иммунный ответ для охвата дополнительных эпитопов-мишеней, тем самым усиливая терапевтически продуктивный или благоприятный иммунный ответ против НВУ.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления антиген НВУ содержит один или несколько эпитопов СТЬ (например, эпитопы, которые распознаются Т-клеточным рецептором цитотоксического Т-лимфоцита (СТЬ), когда они представляются в контексте соответствующей молекулы МНС класса I). В одном из аспектов антиген НВУ содержит один или несколько эпитопов СЭ4' Т-клеток (например, эпитопы, которые распознаются Т-клеточным рецептором СЭ4' Т-клетки в контексте соответствующей молекулы МНС класса ΙΙ). В одном из аспектов антиген НВУ содержит один или несколько эпитопов СТЬ и один или несколько эпитопов СЭ4' Т-клеток. В одном из аспектов антиген НВУ, пригодный в иммунотерапевтической композиции по изобретению, содержит один или несколько из иллюстративных эпитопов СТЬ из НВУ, описанных в табл. 5. Специалист в данной области будет способен легко идентифицировать положение соответствующей последовательности для каждого эпитопа в табл. 5 в данной последовательности НВУ любого генотипа, подгенотипа, или штамма/изолята, с учетом рекомендаций, приведенных ниже, даже несмотря на то, что некоторые аминокислоты могут отличаться от аминокислот в табл. 5. Примеры таких отличий проиллюстрированы в табл. 5. Изобретение не ограничивается антигенами, содержащими эти эпитопы, поскольку другие эпитопы станут известны в данной области и предполагается, что они применимы в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления эпитоп может быть модифицирован так, чтобы он соответствовал последовательности эпитопа в данном генотипе, подгенотипе или штамме/изоляте НВУ, поскольку может существовать одно или несколько аминокислотных отличий в этих эпитопах среди генотипов, подгенотипов или штаммов/изолятов.
- 34 028659
Таблица 5
Эпитоп | Идентификатор последовательности | Антиген НВУ | Предпочтение НЬА |
ЕЬЬТКТЬИ1'2'3 | ЗЕО Ю N0:42 | Поверхностный антиген (например, положения 20-28 3; например, соответствующие положениям 194-202 ЗЕО Ю N0:11, положениям 201-209 ЗЕО Ю N0:34, или положениям 51-59 ЗЕО 1Е> N0:36) | А*0201 |
СЬЗРТУИЬЗУ5 | ЗЕО Ю N0:43 | Поверхностный антиген (например, положения 185-194 3; например, соответствующие положениям 359-368 ЗЕО ΙΌ N0:11, положениям 366-375 ЗЕО 1Е> N0:34, или положениям 216-225** ЗЕО Ю N0:36) | А*0201 |
ЕЬРЗОЕЕР312'3'4 | ЗЕО Ю N0:44 | Коровый антиген (например, положения 47-56 прекорового антигена; например, соответствующие положениям 47-56 ЗЕО Ю N0:9, положениям 424-433 ЗЕО 1Е> N0:34, или положениям 621-630 ЗЕО Ю N0:36) | А*0201 |
Εί,ί,Βί,ΟΙΗί,1 | ЗЕО Ю N0:45 | Полимераза (например, положения 575-583 Ро1; например, соответствующие положениям 573-581 ЗЕО Ю N0:10, или положениям 486-494 ЗЕО Ю N0:36) | А*0201 |
ИЬЗЬЬУРГУ1'3'5 | ЗЕО Ю N0:46 | Поверхностный антиген (например, положения 172-180 3; например, соответствующие положениям 346-354 ЗЕО Ю N0:11, положениям 353-361* ЗЕО Ю N0:34, или положениям 203-211 ЗЕО Ю N0:36) | А*0201 |
ΚΥΤ3ΓΡΜΣΣ | ЗЕО Ю N0:47 | Полимераза (например, положения 756-764 Ро1; например, соответствующие положениям 756-764 ЗЕО Ю N0:10) | А*2402 |
ΥνΝνΝΜΟί,Κ4 | ЗЕО Ю N0:48 | Коровый антиген (например, положения 117-125 прекорового белка; например, соответствующие положениям 117-125 ЗЕО 1Е> N0:9, положениям 494-502 ЗЕО Ю N0:34, или положениям 691-699 ЗЕО Ю N0:36) | А*1101 |
- 35 028659
ЕУЬУЗЕОУИ | ЗЕО Ю N0:49 | Коровый антиген (например, положения 146-154 прекорового белка; например, соответствующие положениям 146-154 ЗЕО Ю N0:9, положения 523-531 ЗЕО ΙΕ N0:34, или положения 720-728 ЗЕО Ιϋ N0:36) | А*2402 |
СЬЗКУУАКЬ3 | ЗЕО Ю N0:50 | Полимераза (например, положения 455-463 Ро1; например, соответствующие положениям 453-461* ЗЕО Ю N0:10, или положениям 366-374 ЗЕО Ю N0:36) | А*0201 |
СЪГКОМЕЕ!? | ЗЕО Ю N0:51 | X (например, положения 115-123 X; например, соответствующие положениям 115-123§ ЗЕО Ю N0:12, или положениям 900-9085 ЗЕО Ю N0:36) | А*02 |
ΡΣΟΡΕΡΩΗ5 | ЗЕО Ю N0:52 | Поверхностный антиген (например, положения 21-28 рге-31; например, соответствующие положениям 2128 ЗЕО Ю N0:11, положениям 28-35 ЗЕО Ю N0:34;, или положениям 6-13 ЗЕО Ю N0:36) | А*11 |
Поверхностный антиген (например, положения 44-53 рге-32; например, ***соответствующие положениям 163-172 ЗЕО Ю N0:3)
ЗТЬЗКТСЭРУ3
ЗЕО ю N0:57 νί,ΟΑΟΕΕί,ίΠ
ЗЕО Ю N0:58
Поверхностный антиген (например, положения 14-22 3; например, ♦♦♦соответствующие положениям 188-196
ЗЕО Ю N0:3)
Εί,ί,ΤΚΙί,ΤΓ
ЗЕО Ю N0:59
Поверхностный антиген (например, положения 20-28 3; например, ♦♦♦соответствующие положениям 194-202
ЗЕО Ю N0:3)
Εί,ΟΟΤΡνΟίΠ
ЗЕО Ю N0:60
Поверхностный антиген (например, положения 41-49 3; например, ♦♦♦соответствующие положениям 215-223
ЗЕО Ю N0:3)
1ШС]11ГЕ1А/ЗЕО Ю N0:61
Поверхностный антиген (например, положения 88-96 3; например, ♦♦♦соответствующие положениям 262-270
ЗЕО Ю N0:3)
- 36 028659
ί,νΐ_,ί,ΟΥζ)ΟΜί,5 | ЗЕО ΙΌ N0:62 | Поверхностный антиген (например, положения 95-104 3; например, * *Соответствующие положениям 269-278 ЗЕО Ю N0:3) | А*2 |
ЬЬЭУОСМЬРУ5 | δΕΟ ΙΌ N0:63 | Поверхностный антиген (например, положения 97-106 3; например, * *Соответствующие положениям 271-280 ЗЕО Ю N0:3) | А*2 |
δίνδΡΓΙΡΕΕ5 | δΕΟ ΙΡ N0:64 | Поверхностный антиген (например, положения 207-216 3; например, ^Соответствующие положениям 381-390 5Е0 ΙΡ N0:3) | А*2 |
1ЬЗРГЬРЬЬ5 | 5Ε0 ΙΌ N0:65 | Поверхностный антиген (например, положения 208-216 3; например, *** соответствующие положениям 382-390 5Е0 Ιϋ N0:3) | А*2 |
ТРАРУТССУЕ5 | 5Ε0 ΙΌ N0:66 | Полимераза (например, положения 367-376 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 367-376 ЗЕО Ю N0:2) | В*7 |
ьуубгзогзк5 | ЗЕО Ю N0:67 | Полимераза (например, положения 390-399 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 390-399 ЗЕО Ιϋ N0:2) | А*3 |
ЗАЮЗУУРР5 | ЗЕО Ю N0:68 | Полимераза (например, положения 533-541 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 533-541 ЗЕО Ιϋ N0:2) | А*3 |
УМЭЭУУЕСА5 | ЗЕО Ιϋ N0:69 | Полимераза (например, положения 551-559 Ро1; например, * * Соответствующие положениям 551-559 ЗЕО Ю N0:2) | А*2 |
Αί,ΜΡί,ΥΑΟΙ5 | ЗЕО Ιϋ N0:70 | Полимераза (например, положения 655-663 Ро1; например, * * Соответствующие положениям 655-663 ЗЕО Ю N0:2) | А*2 |
0ΑΕΤΕ3ΡΤΥΚ5 | ЗЕО Ιϋ N0:71 | Полимераза (например, положения 667-676 Ро1; например, * * Соответствующие положениям 667-676 ЗЕО Ю N0:2) | А*3 |
АТУЕЫЗЕЕРЗОЕЕРЗУ5 ЕРЗЭГЕРЗУ5 СЕТРСКЕТУ5 | ЗЕО Ю N0:72 ЗЕО Ю N0:73 ЗЕО Ю N0:74 | Коровый антиген (например, положения 40-56 прекорового белка; например, ***соответствующие положениям 40-56 ЗЕО 1Е> N0:1) Коровый антиген (например, положения 48-56 прекорового белка; например **Соответствующие положениям 48-56 ЗЕО 1Е> N0:1) Коровый антиген (например, положения 136-144 прекорового белка; например **Соответствующие положениям 136-144 ЗЕО 1Е> N0:1) | А*2 В*51 А*2 |
УЕЕУГУЗЕСУ5 | ЗЕО Ю N0:75 | Коровый антиген (например, положения 144-153 прекорового белка; например, ***соответствующие положениям 144-153 ЗЕО 1Е> N0:1) | А*2 |
НиЗПиРЕТТУ5 | ЗЕО Ю N0:76 | Коровый антиген (например, положения 168-177 прекорового белка; например, ***соответствующие положениям 168-177 ЗЕО ΙΡ N0:1) | А*2 |
- 37 028659
ЗТЬРЕТТУУКК5 | ЗЕО Ю N0:77 | Коровый антиген (например, положения 170-180 прекорового белка; например, * Соответствующие положениям 170-180 ЗЕО Ю N0:1) | А*3 | ||
ньзьксьгу5 | ЗЕО Ю N0:78 | X (например, положения 52-60 X; например, * * Соответствующие положениям 52-60 ЗЕО 10 N0:4) | А*2 | ||
УЬНКПТЬСЬ5 | ЗЕО Ю N0:79 | X (например, положения 92-100 X; например, * * Соответствующие положениям 92-100 ЗЕО Ю N0:4) | А*2 | ||
СЬЗАМЗТТОЬ5 | ЗЕО Ю N0:80 | X (например, положения 99-108 X; например, * * Соответствующие положениям 99-108 ЗЕО Ю N0:4) | А*2 | ||
УЬСССРНКЬ5 | ЗЕО Ю N0:81 | X (например, положения 133-141 X; например, ^Соответствующие положениям 133-141 ЗЕО Ю N0:4) | А*2 | ||
ΝνδΙΝΤΗΚ5 | ЗЕО Ю N0:82 | Полимераза (например, положения 49-57 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 49-57 ЗЕО Ю N0:2) | А*3 | ||
КУСЫГТСЬУ5 | ЗЕО Ю N0:83 | Полимераза (например, положения 57-65 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 57-65 ЗЕО Ю N0:2) | А*3 | ||
СЬУЗЗТУРУ5 | ЗЕО Ю N0:84 | Полимераза (например, положения 63-71 Ро1; например, **Соответствующие положениям 63-71 ЗЕО Ю N0:2) | А*2 | ||
ТЬИКАСИ-УК5 | ЗЕО Ю N0:85 | Полимераза (например, положения 152-161 Ро1; например, **Соответствующие положениям ЗЕО 10 N0:2) | А*3 | ||
КУТЗЕРИЬЬ5 | ЗЕО Ю N0:86 | Полимераза (например, положения 756-764 Ро1; например, **Соответствующие положениям 758-766 ЗЕО Ю N0:2) | А*24 | ||
НиКСТЗГУУУ5 ЗЪУАЭЗРЗУ5 КЬНЬУЗНР1б | ЗЕО Ю N0:87 ЗЕО Ю N0:88 ЗЕО Ю N0:135 | Полимераза (например, положения 773-782 Ро1; например, * * Соответствующие положениям 773-782 ЗЕО Ю N0:2) Полимераза (например, положения 816-824 Ро1; например, * * Соответствующие положениям 816-824 ЗЕО Ю N0:2) Полимераза (например, положения 502-510 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 502-510 ЗЕО Ю N0:2) | А*2 А*2 А*2 | ||
ЬЬУРРУОИРУ6'7 | ЗЕО Ю N0:136 | Поверхностный антиген (например, положения 349-358 3; например, ^Соответствующие положениям 349-358 ЗЕО Ю N0:3) | А*2 | ||
НЬУЗНРИЬ8 | ЗЕО Ю N0:137 | Полимераза (например, положения 504-512 Ро1; например, ^Соответствующие положениям 504-512 ЗЕО Ю N0:2) | А*2 |
- 38 028659
ТСЗРОАОСИ? | ЗЕО Ю | N0:138 | Поверхностный антиген (например, положения 77-34 3; например, * *^соответствующие положениям 77-84 ЗЕО Ю N0:3) | Н-2ОЬ |
УЫЮУОСМ10 | ЗЕО Ю | N0:139 | Поверхностный антиген (например, положения 270-277 3; например, * *^соответствующие положениям 270-277 ЗЕО Ю N0:3) | Н-2КЬ |
АЗУРЕ ЗИЬ10 | ЗЕО Ю | N0:140 | Поверхностный антиген (например, положения 340-347 3; например, * *^соответствующие положениям 340-347 ЗЕО Ю N0:3) | Н-2КЬ |
** Замена Уа1 на А1а в положении 9 δΕ^ ГО N0:43; в положении 225 δΕ^ ГО N0:36.
□ Замена Ьеи-Уа1 на От-А1а в положениях 5 и 6 δΕ^ ГО N0:46; в положениях 357 и 358 в δΕ^ ГО N0:34.
□ Замена δе^ на Рго в положении 3 δΕ^ ГО N0:50; в положении 455 δΕ^ ГО N0:10.
§ Замена Ьеи на Уа1 в положении 2 δΕ^ ГО N0:51; в положении 116 δΕ^ ГО N0:12 и в положении 901 δΕς ГО N0:36.
|| Замена Уа1 на Не в положении 9 δΕ^ ГО N0:54; в положении 56 δΕ^ ГО N0:9, в положении 433 δΕ^ ГО N0:34, и в положении 630 δΕ^ ГО N0:36.
*** Может существовать одно или несколько аминокислотных отличий между последовательностью эпитопа и истинной последовательностью соответствующего более крупного белка или домена вследствие различий генотипов, подгенотипов или штаммов, хотя положение эпитопа в более крупном белке или домене может быть без труда определено.
1 /Напд е! а1., 1оитпа1 о£ Нера!о1оду 50:1163-1173 (2009).
2 Ьорез е! а1., I. С1т. Ьуез!. 118:1835-1845 (2008).
3 Вое!!1ег е! а1., I УиЫ 80 ( 7) : 3532-3540 (2006).
4 Репд е! а1., Мо1. Iттиηо1. 45:963-970 (2008).
5 Оезтопб 2008; ^УЛУ.а11е1е1гециепс1ез.пе1 или Оезтопб е! а1., Ап!1У1га1 ТНег. 13:16-175 (2008).
6 УеЬзку е! а1., 2004, I. Уио1. 78(11)5707-5719.
7У1!1е11о, 1997, Инг. I. Тттипо1. 27(3): 671-678 8 δе!!е е! а1., 1994, I. Тттипо1. 153(12): 5586-5592.
9 Эпитоп Н-2ОЬ мыши, ранее не описанный.
10 Эпитоп Н-2КЬ мыши, ранее не описанный.
В одном из вариантов осуществления изобретения подходящие антигены НВУ могут включать в одной или нескольких иммунотерапевтических композициях на основе дрожжей антиген, содержащий один или несколько Т-клеточных эпитопов, которые описаны или определены как доминантный эпитоп (т.е. Т-клеточный эпитоп, который приводит к развитию Т-клеточного ответа против целого белка и/или который находится среди относительно небольшого количества Т-клеточных эпитопов в большой группе возможных эпитопов, которые с большей вероятностью или легче будут индуцировать ответы СО4+ и СО8+ Т-клеток, также называемый иммунодоминантным эпитопом). В другом варианте осуществления антигены НВУ, подходящие в рамках настоящего изобретения, могут включать в той же самой или отличающейся или дополнительной композиции на основе дрожжей антиген НВУ, содержащий один или несколько Т-клеточных эпитопов, которые описаны или определены как субдоминантный эпитоп (т. е. Т-клеточный эпитоп, который является иммуногенным, но в меньшей степени, чем иммунодоминантный эпитоп; иммунный ответ, индуцированный субдоминантным эпитопом, может подавляться или вытесняться иммунным ответом на иммунодоминантный эпитоп). Для примера этого эффекта с ответами СТЬ на Т-клеточные эпитопы НВУ у мышей см. δοΗΪΜ^οΡ К., е! а1., I. 1ттипо1о§у 168: 6253-6262, 2010; или δе!!е е! а1., I. Iттиηо1о§у 166:1389-1397, 2001. В одном из аспектов изобретения различные композиции, содержащие иммунодоминантные или субдоминантные эпитопы, можно вводить в одну ту же область у индивидуума, или в одном из вариантов осуществления в различные области индивидуума (т. е. композицию, содержащую доминантные эпитопы, вводят в одну область, и композицию, содержащую субдоминантные эпитопы, вводят в другую область). В некоторых случаях субдоминантный эпитоп может индуцировать более благоприятный с терапевтической точки зрения иммунный ответ, чем доминантный эпитоп. Таким образом, при введении в отдельные области может снижаться вероятность того, что иммунный ответ на доминантный эпитоп подавит или вытеснит иммунный ответ на субдоминантный эпитоп, тем самым, максимизируя иммунный ответ в целом и максимизируя защитную или терапевтическую пользу у индивидуума. Этот подход предоставления различных антигенов в различных композициях, вводимых в различные области индивидуума, также можно использовать, даже если все эпитопы являются доминантными или субдоминантными. Является общепризнанным, что иммунодоминантные эпитопы и субдоминантные эпитопы играют роль в инфекции НВУ и иммунных ответах на НВУ (см.,
- 39 028659 например, 8ейе е! а1., 2001, выше, и 8сЫгшЬеск е! а1., 2002, выше).
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген НВУ, пригодный в иммунотерапевтических средствах на основе дрожжей, обеспечивает максимальное включение иммуногенных доменов, и, в частности, Т-клеточных эпитопов, которые являются консервативными среди генотипов и/или подгенотипов, и/или включает иммуногенные домены из нескольких отличающихся генотипов и/или подгенотипов, и/или включает иммуногенные домены, которые можно без труда модифицировать с получением множества иммунотерапевтических продуктов на основе дрожжей, которые отличаются незначительно, но адаптированы для лечения различных индивидуумов или групп индивидуумов на основе генотипа(ов) или подгенотипа(ов) НВУ, которыми инфицированы такие индивидуумы или группы индивидуумов. Например, антиген НВУ можно получать на основе генотипа или подгенотипа, который является наиболее распространенным среди индивидуумов или групп индивидуумов, подлежащих защите или лечению, и антиген НВУ включает наиболее консервативные иммуногенные домены из этих генотипов. Альтернативно или дополнительно, иммуногенные домены можно модифицировать так, чтобы они соответствовали консенсусной последовательности для этого домена или эпитопа, или в конструкцию может быть включено более одного варианта эпитопа.
В любом варианте осуществления изобретения, относящемся к конструированию антигена НВУ для иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, в одном из аспектов минимизируются искусственные участки соединения между сегментами слитого белка, содержащими антигены НВУ (т.е. включение неприродных последовательностей ограничено или минимизировано настолько, насколько это возможно). Без связи с теорией, полагают, что естественная эволюция привела к ί) непрерывным последовательностям в вирусе, которые с наибольшей вероятностью будут хорошо экспрессироваться в другой клетке, такой как дрожжи; и ίί) иммунопротеасомам в антигенпредставляющих клетках, которые могут надлежащим образом расщеплять и представлять эти последовательности иммунной системе. Иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей по изобретению позволяет иммунной системе хозяина процессировать и представлять антигены-мишени; таким образом, слитый белок с множеством неприродных участков соединения может быть менее подходящим в иммунотерапевтических средствах на основе дрожжей по сравнению со средствами, в которых в большей степени сохранены природные последовательности белка НВУ.
В любом из антигенов НВУ, описанных в настоящем описании, включая любой из слитых белков, могут применяться следующие дополнительные варианты осуществления. Во-первых, ^концевая последовательность для экспрессии и С-концевая метка, включенные в некоторые из слитых белков, являются необязательными, и, если их используют, могут быть выбраны из нескольких различных последовательностей, описанных в других разделах настоящего описания, для повышения экспрессии, стабильности и/или для обеспечения идентификации и/или очистки белка. Альтернативно одна или обе из N или С-концевых последовательностей полностью исключены. Кроме того, в данной области известно множество различных промоторов, пригодных в дрожжах, и они охватываются для применения для экспрессии антигенов НВУ в соответствии с настоящим изобретением. Более того, короткие промежуточные линкерные последовательности (например, пептиды из 1, 2, 3, 4, или 5, или более аминокислот) можно встраивать между частями слитого белка для различных целей, включая встраивание участков ферментов рестрикции для облегчения клонирования и последующего манипулирования конструкциями. Наконец, как подробно рассмотрено в других разделах настоящего описания, последовательности, описанные в настоящем описании, являются иллюстративными, и их можно модифицировать, как подробно описано в других разделах настоящего описания, для замены, добавления или делеции последовательностей в целях адаптации к предпочтениям в отношении генотипа НВУ, подгенотипа НВУ, штамма или изолята НВУ, или консенсусных последовательностей, и включения предпочтительных Т-клеточных эпитопов, включения доминантных и/или субдоминантных Т-клеточных эпитопов. Описание нескольких иллюстративных антигенов НВУ, пригодных для изобретения, предоставлено ниже.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включающих любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка в одном из аспектов аминокислоты поверхностного антигена НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, 81+) ГО N0:3, 81+) ГО N0:7, 81+) ГО N0:11, положения 21-47 81+) ГО N0:11, положения 176-400 81+) ГО N0:11, 81+) ГО N0:15, 81+) ГО N0:19, 81+) ГО N0:23, 81+) ГО N0:27, 81+) ГО N0:31, положения 9-407 8ЕЦ ГО N0:34, положения 6-257 8ЕЦ ГО N0:36, положения 6-257 8ЕЦ ГО N0:41, положения 92343 81+) ГО N0:92, положения 90-488 81+) ГО N0:93, 81+) ГО N0:97, положения 90-338 81+) ГО N0:101, положения 7-254 8ЕЦ ГО N0:102, положения 1-249 8ЕЦ ГО N0:107, положения 1-249 8ЕЦ ГО N0:108, положения 1-249 8ЕЦ ГО N0:109, положения 1-249 8ЕЦ ГО N0:110, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:112, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:114, или положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:116, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:118, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:120, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:122, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:124, положения 1-399 8ЕЦ ГО N0:126, положения 231-629 8ЕЦ ГО N0:128, положения 63-461 8ЕЦ ГО N0:130, положения 289-687 8ЕЦ ГО N0:132, положения 289-687 8ЕЦ ГО N0:134, или соответствующую
- 40 028659 последовательность из другого штамма НВУ.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка в одном из аспектов аминокислоты антигена полимеразы НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, положения 383-602 8ЕЦ ΙΌ N0:2, положения 381-600 8ЕЦ ΙΌ N0:6, положения 381-600 8ЕЦ ΙΌ N0:10, положения 453-680 8ЕЦ ΙΌ N0:10, положения 370-589 8ЕЦ ΙΌ N0:14, положения 380-599 8ЕЦ ΙΌ N0:18, положения 381-600 8ЕЦ ΙΌ N0:22, положения 380-599 8ЕЦ ΙΌ N0:26, положения 381-600 8ЕЦ ΙΌ N0:30, положения 260-604 8ЕЦ ΙΌ N0:36, положения 7-351 8ЕЦ ΙΌ N0:38, положения 7-351 8ЕЦ ΙΌ N0:40, 260-604 81+) ΙΌ N0:41, положения 346-690 81+) ΙΌ N0:92, положения 90-434 81+) ΙΌ N0:94, 81+) ΙΌ N0:98, положения 339-566 8ЕЦ ΙΌ N0:101, положения 255-482 8ЕЦ ΙΌ N0:102, положения 250-477 8ЕЦ ΙΌ N0:107, положения 250-477 8ЕЦ ΙΌ N0:108, положения 250-477 8ЕЦ ΙΌ N0:109, положения 250-477 8ЕЦ ΙΌ N0:110, положения 582-809 8ЕЦ ΙΌ N0:120, положения 582-809 8ЕЦ ΙΌ N0:124, положения 642869 8ЕЦ ΙΌ N0:126, положения 1-228 8ЕЦ ΙΌ N0:128, положения 1-228 8ЕЦ ΙΌ N0:132, положения 61288 8ЕЦ ΙΌ N0:134, или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции антигена НВУ или слитого белка в одном из аспектов аминокислоты корового антигена НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, положения 31-212 8ЕЦ ΙΌ N0:1, положения 31-212 8ЕЦ ΙΌ N0:5, положения 31-212 8ЕЦ ΙΌ N0:9, положения 37-188 8ЕЦ ΙΌ N0:9, положения 31-212 8ЕЦ ΙΌ N0:13, положения 31-212 8ЕЦ ΙΌ N0:17, положения 31212 8ЕЦ ΙΌ N0:21, положения 14-194 8ЕЦ ΙΌ N0:25, положения 31-212 8ЕЦ ΙΌ N0:29, положения 408589 8ЕЦ ΙΌ N0:34, положения 605-786 8ЕЦ ΙΌ N0:36, положения 352-533 8ЕЦ ΙΌ N0:38, положения 160-341 8ЕЦ ΙΌ N0:39, положения 605-786 8ЕЦ ΙΌ N0:41, положения 691-872 8ЕЦ ΙΌ N0:92, положения 90-271 81+) ΙΌ N0:95, 81+) ΙΌ N0:99, положения 567-718 81+) ΙΌ N0:101, положения 483-634 81+) ΙΌ N0:102, положения 2-183 8ЕЦ ΙΌ N0:105, положения 184-395 8ЕЦ ΙΌ N0:105, положения 396-578 8ЕЦ ΙΌ N0:105, положения 579-761 81+) ΙΌ N0:105, положения 2-183 81+) ΙΌ N0:106, 338-520 81+) ΙΌ N0:106, положения 478-629 8ЕЦ ΙΌ N0:107, положения 478-629 8ЕЦ ΙΌ N0:108, положения 478-629 8ЕЦ ΙΌ N0:109, положения 478-629 8ЕЦ ΙΌ N0:110, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:112, положения 400581 8ЕЦ ΙΌ N0:114, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:116, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:118, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:120, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:122, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:124, положения 400-581 8ЕЦ ΙΌ N0:126, положения 630-811 8ЕЦ ΙΌ N0:128, положения 462-643 8ЕЦ ΙΌ N0:130, положения 688-869 8ЕЦ ΙΌ N0:132, положения 688-869 8ЕЦ ΙΌ N0:134, или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании, включая любой вариант осуществления, относящийся к иммунотерапевтической композиции, антигену НВУ, слитому белку или применению такой композиции, антигена НВУ или слитого белка в одном из аспектов аминокислоты антигена X НВУ, подходящие в качестве антигена НВУ или в слитом белке или иммунотерапевтической композиции по изобретению, могут включать, но не ограничиваться ими, 8ЕЦ ΙΌ N0:4, 81+) ΙΌ N0:8, 81+) ΙΌ N0:12, положения 2-154 81+) ΙΌ N0:12, 81+) ΙΌ N0:16, 81+) ΙΌ N0:20, 81+) ΙΌ N0:24, 8ЕЦ ΙΌ N0:28, 8ЕЦ ΙΌ N0:32, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:4, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:8, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:12, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:16, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:20, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:24, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:28, положения 52-68, а затем положения 84-126 8ЕЦ ΙΌ N0:32, положения 787-939 8ЕЦ ΙΌ N0:36, положения 7-159 8ЕЦ ΙΌ N0:39, положения 873-1025 8ЕЦ ΙΌ N0:92, положения 90-242 8ЕЦ ΙΌ N0:96, 8ЕЦ ΙΌ N0:100, положения 719-778 8ЕЦ ΙΌ N0:101, положения 635694 8ЕЦ ΙΌ N0:102, положения 184-337 8ЕЦ ΙΌ N0:106, положения 521-674 8ЕЦ ΙΌ N0:106, положения 630-689 8ЕЦ ΙΌ N0:107, положения 630-689 8ЕЦ ΙΌ N0:108, положения 630-689 8ЕЦ ΙΌ N0:109, положения 630-689 8ЕЦ ΙΌ N0:110, положения 582-641 8ЕЦ ΙΌ N0:122, положения 810-869 8ЕЦ ΙΌ N0:124, положения 582-641 8ЕЦ ΙΌ N0:126, положения 1-60 8ЕЦ ΙΌ N0:130, положения 229-288 8ЕЦ ΙΌ N0:132, положения 1-60 8ЕЦ ΙΌ N0:134, или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ.
Антигены НВУ, содержащие поверхностный антиген и коровый белок.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, или по меньшей мере одного его иммуногенного домена и корового белка НВУ (НВеАд), или по меньшей мере одного его иммуногенного домена. В одном из аспектов большой (Ь) поверхностный антиген НВУ и/или коровый белок НВУ являются полноразмерными или практически полноразмерными. В соответствии с любым вариантом осуществления настоящего изобретения указание на полноразмерный белок (или полнораз- 41 028659 мерный функциональный домен или полноразмерный иммунологический домен) включает полноразмерную аминокислотную последовательность белка или функционального домена или иммунологического домена, как описано в настоящем описании или в ином случае как известно или описано для общедоступной последовательности. Белок или домен, которые являются практически полноразмерными, которые также являются типом гомолога белка, отличаются от полноразмерного белка или домена, путем вставки или делеции или пропуска 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот с N и/или С-конца такого полноразмерного белка или полноразмерного домена. Общее указание на белок или домен может включать как полноразмерные, так и практические полноразмерные белки, а также другие их гомологи.
В одном из аспектов большой (Ь) поверхностный антиген НВУ или коровый белок НВУ содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного большого (Ь) поверхностного антигена НВУ или корового белка НВУ соответственно, или линейной последовательности части большого поверхностного антигена НВУ, которая содержит связываемую рецепторами гепатоцитов часть рге-81 и весь или часть малого (8) поверхностного антигена НВУ, с линейными аминокислотными последовательностями, представленными в 8ΕΟ ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ, описанный ниже), 8Ε0 ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок, описанный ниже), или соответствующей последовательностью из другого штамма НВУ, если это применимо. Различные другие последовательности для пригодных поверхностных антигенов НВУ и коровых антигенов НВУ, пригодных для изобретения, описаны в настоящем описании. В одном из аспектов большой (Ь) поверхностный антиген НВУ или коровый белок НВУ по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны полноразмерному большому (Ь) поверхностному антигену НВУ или коровому белку НВУ соответственно, или другому поверхностному антигену НВУ или коровому антигену НВУ, описанным в настоящем описании, включая аминокислотную последовательность, соответствующую 8Ε0 ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ, описанный ниже), 8Ε0 ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок, описанный ниже), или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ, если это применимо.
Такой слитый белок схематично представлен на фиг. 2. Один пример композиции, содержащей такой слитый белок, описан в примере 1. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 8ассйаготусез сегеу131ае) модифицировали способами инженерии так, чтобы они экспрессировали различные слитые белки поверхностный антиген-коровый антиген НВУ, как показано на фиг. 2, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок НВУ представлял собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 8Ε0 ГО N0:34: (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (например, положения 1-6 8Ε0 ГО N0:34); 2) спейсер из двух аминокислот для внесения участка фермента рестрикции 8ре1; 3) аминокислотная последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа С (например, положения 9-407 8Ε0 ГО N0:34 или положения 2-400 8Ε0 ГО N0:11 (которые отличаются от 8Ε0 ГО N0:34 в положениях 350-351 8Ε0 ГО N0:11, где последовательность Ьеи-Уа1 в 8Ε0 ГО N0:11 заменена последовательностью Ош-А1а в положениях 357-358 8Ε0 ГО N0:34)); 4) аминокислотная последовательность корового антигена НВУ (например, положения 31-212 8Ε0 ГО N0:9 или положения 408-589 8Ε0 ГО N0:34); и 5) гексагистидиновая метка (например, положения 590595 8Ε0 ГО N0:34). Положения 28-54 8Ε0 ГО N0:34 содержат часть рецептора для гепатоцитов большого (Ь) поверхностного белка. 8Ε0 ГО N0:34 содержит множество эпитопов или доменов, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Например, положения 209-220, положения 389-397, положения 360-367 и положения 499-506 по отношению к 8Ε0 ГО N0:34 содержат известные эпитопы, связываемые МНС класса I и/или эпитопы СТЬ. Положения 305-328 8Ε0 ГО N0:34 содержат эпитоп антитела. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8Ε0 ГО N0:34 (кодон-оптимизированный для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 8Ε0 ГО N0:33. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 01-13002.
Аминокислотные сегменты, используемые в любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, можно модифицировать с использованием дополнительных аминокислот, фланкирующих любой конец любого домена; описания, представленные в настоящем описании, являются иллюстративными. Например, слитый белок согласно этому варианту осуществления может включать: 1) аминокислотная последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа С (например, положения 2-400 8Ε0 ГО N0:11 или положения 9-407 8Ε0 ГО N0:34); и 2) аминокислотная последовательность корового антигена НВУ (например, положения 31-212 8Ε0 ГО N0:9 или положения 408-589 8Ε0 ГО N0:34) и не включать N или С-концевых последовательностей или включать отличающиеся М- или С-концевые последовательности и/или включать линкеры или не включать линкеры между последовательностями НВУ. В одном из вариантов осуществления вместо ^концевого пептида, соответствующего положениям 1-6 8Ε0 ГО N0:34, используется ^концевой пептид, соответствующий 8Ε0 ГО N0:89 или 8Ε0 ГО N0:90, за которым следует остальная часть слитого белка, включающая или не включающая гексагистидиновую С-концевую метку. Слитый белок также
- 42 028659 может включать одну, две, три, четыре, пять, шесть или более линкерных (спейсерных) аминокислот между белками или доменами НВУ. Те же альтернативные варианты осуществления применимы к любому слитому белку или антигенной конструкции НВУ, используемым в рамках изобретения, как описано в настоящем описании.
Последовательности НВУ, используемые для конструирования этого слитого белка и многих других, описанных и/или проиллюстрированных в настоящем описании, основаны на изолятах конкретного генотипа НВУ (например, генотип А, В, С или Ό). Однако вариантом осуществления изобретения является вставка или замена в любой части антигена НВУ, описанного в настоящем описании, которые основаны или происходят из одного конкретного генотипа, подгенотипа или штамма, соответствующей последовательностью, или замена, инсерция или делеция даже одной аминокислоты или небольшая аминокислотная замена, инсерция или делеция, которые встречаются в соответствующей последовательности, из любого другого генотипа(ов), подгенотипа(ов) или штамма(ов) НВУ. В одном из вариантов осуществления антиген НВУ можно получать путем замены целой последовательности(ей) антигена НВУ, описанного в настоящем описании, соответствующей последовательностью(ями) из одного или нескольких других генотипов, подгенотипов или штаммов/изолятов НВУ. Добавление или замена последовательности из одного генотипа или подгенотипа НВУ другой последовательностью, например, позволяет индивидуальную адаптацию иммунотерапевтической композиции для конкретного индивидуума или группы индивидуумов (например, группы индивидуумов в данной стране или области страны, для нацеливания на генотип(ы) НВУ, который наиболее распространен в этой стране или области страны). Аналогично, также вариантом осуществления изобретения является применение всей или части консенсусной последовательности, происходящей из, или опубликованной для данного штамма, генотипа или подтипа НВУ для внесения изменений в последовательность данного антигена НВУ, чтобы она более близко и точно соответствовала консенсусной последовательности. В соответствии с настоящим изобретением и как в общем понимают в данной области, консенсусная последовательность, как правило, представляет собой последовательность, основанную на большинстве распространенных нуклеотидов или аминокислот в конкретном положении данной последовательности после выравнивания множества последовательностей.
В качестве конкретного примера упомянутых выше типов модификаций антиген НВУ можно модифицировать так, чтобы изменить Т-клеточный эпитоп в данной последовательности из одного изолята так, чтобы он соответствовал в большей степени или точно Т-клеточному эпитопу из другого изолята или соответствовал в большей степени или точно консенсусной последовательности Т-клеточного эпитопа. Такие Т-клеточные эпитопы могут включать доминантные эпитопы и/или субдоминантные эпитопы. Действительно, в соответствии с изобретением антигены НВУ можно конструировать так, чтобы они включали консенсусные последовательности из различных генотипов и/или подтипов НВУ, или смеси последовательностей из различных генотипов и/или подтипов НВУ. Выравнивание основных белков НВУ среди иллюстративных последовательностей каждого из основных известных генотипов можно легко проводить с использованием общедоступного программного обеспечения, которое информирует, например, о получении консенсусных последовательностей. Более того, консенсусные последовательности для многих белков НВУ были опубликованы. Поскольку существует высокая степень консервативности на уровне аминокислот среди различных генотипов, подгенотипов и штаммов НВУ, можно прямо использовать соответствующие части белков НВУ из генотипов, подгенотипов или штаммов, отличных от генотипов, подгенотипов или штаммов, проиллюстрированных в настоящем описании, для получения антигенов НВУ, имеющих сходную или аналогичную общую структуру, относительно структур, описанных в настоящем описании. Примеры таких модификаций проиллюстрированы и пояснены в настоящем описании.
В качестве примера могут существовать небольшие различия среди последовательностей одного и того же белка, даже в одном и том же серотипе и генотипе (т. е. вследствие варьирования штаммов или изолятов), хотя такие различия в идентичности последовательностей, как правило, могут составлять менее 20% на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей (т. е. последовательности могут быть по меньшей мере на 80% идентичными) и, более конкретно, последовательности являются по меньшей мере на 85% идентичными, на 90% идентичными, на 91% идентичными, на 92% идентичными, на 93% идентичными, на 94% идентичными, на 95% идентичными, на 96% идентичными, на 97% идентичными, на 98% идентичными, на 99% идентичными или на 100% идентичными на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Например, в слитом белке, описанном выше (5>ЕО ГО N0:34), последовательность большого (Ь) поверхностного антигена, используемого в слитой конструкции (положения 9-407 5>Е0 ГО N0:34) происходит из изолята НВУ генотипа С, и приблизительно на 99% идентична положениям 2-400 5>Е0 ГО N0:11, которые также происходят из большого (Ь) поверхностного антигена из изолята НВУ генотипа С (т.е. существует две различных аминокислоты, в положениях 350-351 5>Е0 ГО N0:11 (Ош-Л1а) по сравнению с положениями 357-358 5>Е0 ГО N0:34 (Ьеи-Уа1). Однако любая последовательность пригодна для применения в слитом белке, описанном в настоящем описании, как и последовательности из других штаммов НВУ. Таким образом, в одном из вариантов осуществления последовательности, используемые в любом из антигенов НВУ, описанных в настоящем описании, вклю- 43 028659 чая любые из слитых белков, описанных в настоящем описании, могут включать соответствующие последовательности из одного или нескольких различных генотипов, подгенотипов или штаммов НВУ.
Описанное выше использование консенсусных последовательностей и индивидуальных генотипов НВУ применимо для различных антигенов НВУ, описанных в настоящем описании. Например, конструкция с консенсусной последовательностью применима для слитого белка, описанного выше применительно к ЗЕО ГО N0:34, который содержит поверхностные белки НВУ и коровью белки НВУ. В примере 7 описаны дополнительные слитые белки, которые сходны по конструкции со слитым белком, соответствующим ЗЕО ГО N0:34, но которые основаны на консенсусной последовательности для генотипов А, В, С и Ό, соответственно, НВУ. Слитый белок, содержащий поверхностный и коровый белки НВУ, который основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа А, который также проиллюстрирован на фиг. 2, представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:112 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность ЗЕО ГО N0:112, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:37, который может быть заменен Ν-концевым пептидом, соответствующим ЗЕЦ ГО N0:89, ЗЕЦ ГО N0:90, или другим Ν-концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг-Зег; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа А, соответствующая положениям 1-399 ЗЕЦ ГО N0:112; (4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа А, соответствующая положениям 400581 ЗЕО ГО N0:112; и (5) необязательно, гексагистидиновая метка. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок ЗЕЦ ГО N0:112 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как ЗЕЦ ГО N0:111. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ΟΣ-13006.
В примере 7 также описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим ЗЕЦ ГО N0:34, но который основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа В. Этот слитый белок, который также схематично проиллюстрирован на фиг. 2, представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Με С-концу, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:114 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность ЗЕЦ ГО N0:114, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:37, который может быть заменен Ν-концевым пептидом, соответствующим ЗЕО ГО N0:89, ЗЕЦ ГО N0:90, или другим Ν-концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг-Зег; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа В, соответствующая положениям 1-399 ЗЕЦ ГО N0:114; (4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа В, соответствующая положениям 400-581 ЗЕЦ ГО N0:114; и (5) необязательно, гексагистидиновая метка. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок ЗЕО ГО N0:114 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как ЗЕЦ ГО N0:113. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 0Ы3007.
В примере 7 описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим ЗЕО ГО N0:34, но который основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа С. Этот слитый белок, который также схематично проиллюстрирован на фиг. 2, представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к Сконцу, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:116 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность ЗЕЦ ГО N0:116, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:37, который может быть заменен Ν-концевым пептидом, соответствую- 44 028659 щим 8Е0 ΙΌ N0:89, 8Еф ΙΌ N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг-8сг; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа С, соответствующая положениям 1-399 8Еф ГО N0:116; (4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа С, соответствующая положениям 400-581 8Еф ГО N0:116; и (5) необязательно, гексагистидиновая метка. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8Е0 ГО N0:116 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 8Еф ГО N0:115. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 01-13008.
В примере 7 описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим 8Е0 ГО N0:34, но который основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό. Этот слитый белок, который также схематично проиллюстрирован на фиг. 2, представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к Сконцу, соответствующий 8Еф ГО N0:118 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 8Еф ГО N0:118, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Еф ГО N0:37, который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим 8Е0 ГО N0:89, 8Еф ГО N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг-8сг; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-399 8Еф ГО N0:118; (4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400581 8Е0 ГО N0:118; и (5) необязательно, гексагистидиновая метка. Аминокислотная последовательность полного слитого белка, описанного в примере 7, содержащая 8Еф ГО N0:118 и включающая N и С-концевой пептиды и линкеры, представлена в настоящем описании как 8Еф ГО N0:151. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8Еф ГО N0:118 или 8Еф ГО N0:151 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 8Е0 ГО N0:117. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 0Ι-13009.
Антигены НВУ, содержащие поверхностный антиген, коровый белок, полимеразу и Х-антиген.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из поверхностного антигена НВУ (большой (Ь), средний (М) или малый (8)) или по меньшей мере одного его структурного, функционального или иммуногенного домена), полимеразы НВУ или по меньшей мере одного ее структурного, функционального или иммуногенного домена, корового белка НВУ (НВсАд) или е-антигена НВУ (НВсАд) или по меньшей мере одного их структурного, функционального или иммуногенного домена, и Х-антигена НВУ (НВх) или по меньшей мере одного его структурного, функционального или иммуногенного домена. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, полимеразы НВУ, корового белка НВУ, еантигена НВУ, Х-антигена НВУ или их домена является полноразмерным или практически полноразмерным. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, полимеразы НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, Х-антигена НВУ или их домена содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного поверхностного антигена НВУ, полимеразы НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, Х-антигена НВУ или их домена соответственно, или линейной аминокислоной последовательности, соответствующей 8Еф ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ, описанный ниже), 8Еф ГО N0:98 (оптимизированная полимераза НВУ, описанная ниже), 8Еф ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок, описанный ниже), 8Е0 ГО N0:100 (оптимизированный Х-антиген, описанный ниже) или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, полимеразы НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, Хантигена НВУ или их домена по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен полноразмерному поверхностному антигену НВУ, полимеразе НВУ, коровому белку НВУ, еантигену НВУ, Х-антигену НВУ или их домену соответственно, или аминокислотным последовательностям, соответствующим 8Еф ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ, описанный
- 45 028659 ниже), 3ЕЦ ΙΌ N0:98 (оптимизированная полимераза НВУ, описанная ниже), 3ЕЦ ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок, описанный ниже) или 3ЕЦ ГО N0:100 (оптимизированный Х-антиген, описанный ниже) или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. Различные подходящие и иллюстративные последовательности для поверхностных антигенов НВУ, антигенов полимеразы НВУ, коровых антигенов НВУ и Х-антигенов НВУ, описаны в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из распознаваемой рецепторами гепатоцитов части рге-31 большого (Ь) поверхностного антигена НВУ или по меньшей мере одного ее иммуногенного домена, малого (3) поверхностного антигена НВУ (НВкАд) или по меньшей мере одного его иммуногенного домена, домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ или по меньшей мере одного его иммуногенного домена, корового белка НВУ (НВсАд) или по меньшей мере одного его иммуногенного домена, и Х-антигена НВУ (НВх) или по меньшей мере одного его иммуногенного домена. В одном из аспектов любой один или несколько из распознаваемой рецепторами гепатоцитов части рге-31 большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, малого (3) поверхностного антигена НВУ, КТ-домена полимеразы НВУ, корового белка НВУ, Х-антигена или их домена являются полноразмерными или практически полноразмерными. В одном из аспектов любой один или несколько из распознаваемой рецепторами гепатоцитов части рге-31 большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, малого (3) поверхностного антигена НВУ, КТ-домена полимеразы НВУ, корового белка НВУ, Х-антигена или их домена, содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного рге-31 из большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, малого (3) поверхностного антигена НВУ, КТ-домена полимеразы НВУ, корового белка НВУ, Х-антигена или их домена соответственно. В одном из аспектов любой один или несколько из распознаваемой рецепторами гепатоцитов части рге-31 большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, малого (3) поверхностного антигена НВУ, КТ-домена полимеразы НВУ, корового белка НВУ, Х-антигена или их домена по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны полноразмерной распознаваемой рецепторами гепатоцитов части рге-31 большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, малого (3) поверхностного антигена НВУ, КТ-домена полимеразы НВУ, корового белка НВУ, Х-антигена или их домена соответственно.
Такой слитый белок схематично представлен на фиг. 3. Пример композиции, содержащей этот слитый белок, описан в примере 2. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 3ассйаготусе5 сегеУ151ае) конструировали так, чтобы они экспрессировали различные слитые белки НВУ, как схематично показано на фиг. 3, под контролем индуцируемого медью промотора, СИР1 или промотора ТЕР2. В одном случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 3ЕЦ ГО N0:36: (1) N концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (например, положения 1-5 3ЕЦ ГО N0:36); 2) аминокислотная последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена из части рге-31 большого (Ь) поверхностного белка НВУ (уникальная Ь) из НВУ генотипа С (например, положения 21-47 3ЕЦ ГО N0:11 или положения 6-32 3ЕЦ ГО N0:36); 3) аминокислотная последовательность полноразмерного малого (3) поверхностного антигена НВУ генотипа С (например, положения 176-400 3ЕЦ ГО N0:11 или положения 33-257 3ЕЦ ГО N0:36); 4) спейсер/линкер из двух аминокислот, облегчающий клонирование и манипулирование последовательностями (например, положения 258 и 259 3ЕЦ ГО N0:36); 5) аминокислотная последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающей домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 3ЕЦ ГО N0:10 или положения 260-604 3ЕЦ ГО N0:36); 6) коровый белок НВУ генотипа С (например, положения 31-212 3Е0 ГО N0:9 или положения 605-786 3ЕЦ ГО N0:36); 7) аминокислотная последовательность Х-антигена НВУ генотипа С (например, положения 2-154 3ЕЦ ГО N0:12 или положения 787-939 3Е0 ГО N0:36); и 8) гексагистидиновая метка (например, положения 940-945 3ЕЦ ГО N0:36). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 3ЕЦ ГО N0:36 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 3ЕЦ ГО N0:35. Иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, экспрессирующую этот слитый белок, обозначают в настоящем описании как 01-13005.
В одном альтернативном примере этого варианта осуществления слитый белок согласно варианту осуществления, описанному выше или ниже, может включать 1) аминокислотную последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена из части рге-31 большого (Ь) поверхностного белка НВУ (уникальную для Ь) НВУ генотипа С (например, положения 21-47 3ЕЦ ГО N0:11 или положения 632 3Е0 ГО N0:36); 2) аминокислотную последовательность полноразмерного малого (3) поверхностного антигена НВУ генотипа С (например, положения 176-400 3ЕЦ ГО N0:11 или положения 33-257 3ЕЦ ГО N0:36); 3) аминокислотную последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающей домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 3ЕЦ ГО N0:10 или положения 260-604 3ЕЦ ГО N0:36); 4) коровый белок НВУ генотипа С (например, положения 31-212 3ЕЦ ГО N0:9 или положения 605-786 3Е0 ГО N0:36); и 5) аминокислотную последовательность Х-антигена НВУ генотипа С (например, положения 2-154 3ЕЦ ГО N0:12 или положения 787-939 3ЕЦ ГО N0:36), и не включает N или С- 46 028659 концевых последовательностей или включает отличающиеся Ν- или С-концевые последовательности, и/или включает линкеры или не включает линкеры между последовательностями ΗΒV.
В одном из вариантов осуществления вместо Ν-концевого пептида, соответствующего положениям 1-5 δΕφ ΙΌ N0:36, используют Ν-концевой пептид, соответствующий δΕφ ΙΌ N0:89 или δΕφ ΙΌ N0:90 (или его гомолог), за которым следует остальная часть слитого белка, как описано. В примере 2 описан такой слитый белок, который также проиллюстрирован с помощью схематического изображения конструкции на фиг. 3. В этом варианте осуществления дрожжи (например, δассЬа^οтусез сеге\тз1ае) вновь модифицировали способами инженерии так, чтобы они экспрессировали различные слитые белки ΗΒV, как схематично представлено на фиг. 3, под контролем индуцируемого медью промотора, СυΡ1 или промотора ТЕР2. В этом втором случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:92: (1) Ν-концевой пептид для обеспечения устойчивости к расщеплению протеасомами и стабилизации или усиления экспрессии (δΕφ ΙΌ Ν0:89, положения 1-89 δΕφ ΙΌ Ν0:92); 2) спейсер/линкер из двух аминокислот (ТЬгбег) для облегчения клонирования и манипулирования последовательностями (положения 90-91 δΕφ ΙΌ Ν0:92); 3) аминокислотная последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена рге^1 части большого (Ъ) поверхностного белка ΗΒV (уникальная для Ь) ΗΒV генотипа С (например, положения 21-47 δΕφ ΙΌ Ν0:11 или положения 92-118 δΕφ ΙΌ Ν0:92); 4) аминокислотная последовательность полноразмерного малого (δ) поверхностного антигена №7 генотипа С (например, положения 176-400 δΕφ ГО Ν0:11 или положения 119-343 δΕφ ГО Ν0:92); 5) спейсер/линкер из двух аминокислот (Ьеи-01и), облегчающий клонирование и манипулирование последовательностями (например, положения 344-345 δΕφ ГО Ν0:92); 6) аминокислотная последовательность части полимеразы ΗΒV генотипа С, включающей домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 δΕφ ГО Ν0:10 или положения 346-690 δΕφ ГО Ν0:92); 7) коровый белок ТОУ генотипа С (например, положения 31-212 δΕφ ГО Ν0:9 или положения 691-872 δΕφ ГО Ν0:92); 8) аминокислотная последовательность Х-антигена ΗΒV генотипа С (например, положения 2154 δΕφ ГО Ν0:12 или положения 873-1025 δΕφ ГО Ν0:92); и 9) гексагистидиновая метка (например, положения 1026-1031 δΕφ ГО Ν0:92). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок δΕφ ГО Ν0:92 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕφ ГО Ν0:91. Иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, экспрессирующую этот слитый белок, обозначают в настоящем описании как 0Ι-13004.
δΕφ ГО Ν0:36 и δΕφ ГО Ν0:92 содержат множество эпитопов или доменов, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка, включая несколько эпитопов или доменов, описанных выше для δΕφ ГО Ν0:34. Кроме того, домен обратной транскриптазы, используемый в этом слитом белке, содержит несколько аминокислотных положений, которые известны тем, что они становятся мутантными в качестве ответа в виде устойчивости к лекарственным средствам на лечение различными противовирусными средствами, и, таким образом, в любой один или несколько из них можно вносить мутации в этом слитом белке для обеспечения терапевтического или профилактического иммунотерапевтического средства, которое нацелено на конкретные мутации, обеспечивающие устойчивость к лекарственным средствам (ускользание). Эти положения аминокислот находятся в отношении δΕφ ГО Ν0:36 в положениях аминокислот 432 (Уй, известный тем, что он мутирует в Ьеи после терапии ламивудином); положение 439 (Ьеи, известный тем, что он мутирует в Ме!, после терапии ламивудином); положение 453 (А1а, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии тенофовиром); положение 463 (Ме!, известный тем, что он мутирует в Не или Vа1, после терапии ламивудином); и положение 495 (Азп, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии адефовиром). Эти положения аминокислот находятся в отношении δΕφ ГО Ν0:92 в положении аминокислот 518 Хаб известный тем, что он мутирует в Ьеи после терапии ламивудином); положении 525 (Ьеи, известный тем, что он мутирует в Ме! после терапии ламивудином); положении 539 (А1а, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии тенофовиром); положении 549 (Ме!, известный тем, что он мутирует в Не или Vа1 после терапии ламивудином) и положении 581 (Азп, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии адефовиром). Дополнительные мутации, обеспечивающие устойчивость к лекарственным средствам, которые идентифицируют или которые были идентифицированы, можно добавлять, если желательно, для получения дополнительных иммунотерапевтических средств, нацеленных на такие мутации, с использованием рекомендаций, представленных в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления изобретения валин в положении 901 δΕφ ГО Ν0:36 или валин в положении 987 δΕφ ГО Ν0:92 (или валин в положении 116 δΕφ ΙΌ Ν0:12 или в любом Х-антигене или его домене, содержащих это соответствующее положение) заменяют на лейцин для получения Тклеточного эпитопа, идентифицированного как δΕφ ГО Ν0:51 (см. табл. 5).
Как рассмотрено выше, изобретение включает модификацию антигенов ΗΒV из их природных последовательностей или последовательностей дикого типа для включения в иммунотерапевтические средства на основе дрожжей, которые увеличивают клиническую применимость или удовлетворяют требуемым критериям для терапевтических или профилактических средств, имеющих отношение к инфекционным агентам. В качестве примера в обсуждении и примерах 5-8 ниже описано моделирование и конст- 47 028659 руирование иммунотерапевтических средств на основе дрожжей, в которых учитывается один или несколько критериев требований КАС, максимизация количества иммуногенных доменов, связанных с наиболее благоприятными иммунными ответами, максимизация консервативных Т-клеточных эпитопов, использование консенсусных последовательностей для конкретного генотипа НВУ и/или минимизация искусственных участков соединения в антигена НВУ. Например, в следующей иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей проиллюстрирован слитый белок НВУ, удовлетворяющий требованиям для описанных выше целей, и содержащий части каждого из основных белков НВУ: поверхностный антиген, полимераза, коровый антиген и Х-антиген НВУ. Для конструирования этого слитого белка отдельные антигены НВУ в слитой конструкции оптимизировали и модифицировали для уменьшения размера сегментов в белке (например, для обеспечения того, чтобы белок соответствовал менее 2/3 генома НВУ), а также для максимизации включения Т-клеточных эпитопов, которые связаны с иммунном ответом при острой/самоограничивающейся инфекции НВУ и/или хронической инфекции НВУ, для максимизации консервативных эпитопов и для минимизации неприродных последовательностей. Специалист в данной области с использованием этого руководства может получить оптимизированные белки НВУ для применения в антигене НВУ по изобретению.
Как более подробно описано в примере 5, для конструирования сегмента поверхностного антигена НВУ, полноразмерный большой (Ь) поверхностный белок НВУ генотипа С уменьшали путем укорочения N и С-концевых последовательностей, при максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов МНС, с использованием приоритета включения Т-клеточных эпитопов, связанных с острыми/самоограничивающимися инфекциями.
Полученный сегмент поверхностного антигена соответствует 8Еф ГО N0:97.
Для конструирования сегмента слитого белка, содержащего полимеразу НВУ (см. пример 5), значительные части полноразмерной полимеразы из НВУ генотипа С устраняли при фокусировании на включении домена активного центра (из КТ-домена), который является наиболее консервативной областью белка среди генотипов и изолятов НВУ, и который включает несколько участков, известных тем, что в них происходят мутации, обеспечивающие устойчивость к лекарственным средствам. Сегмент полимеразы НВУ конструировали так, чтобы максимизировать известные Т-клеточные эпитопы с использованием стратегии приоритета, описанной выше, и модифицировать один из Т-клеточных эпитопов, чтобы он соответствовал в точности известному Т-клеточному эпитопу, отличающемуся на одну аминокислоту. Полученный сегмент антигена полимеразы НВУ соответствует 8Еф ГО N0:98.
Для конструирования сегмента слитого белка, содержащего коровый антиген НВУ (см. пример 5), полноразмерный коровый белок из НВУ генотипа С модифицировали для уменьшения размера белка при максимизации количества Т-клеточных эпитопов путем включения и путем модификации последовательности для достижения абсолютного соответствия определенным известным Т-клеточным эпитопам. Кроме того, удаляли исключительно последовательность, которая содержала положительно заряженный С-конец, которая может быть токсичной для дрожжей вследствие конкурентного препятствования природным связывающим РНК белкам, которые часто обогащены аргинином (положительно заряжены). Полученный сегмент корового антигена НВУ соответствует 8Еф ГО N0:99.
Для конструирования сегмента слитого белка, содержащего Х-антиген НВУ (см. пример 5), полноразмерный Х-антиген из НВУ генотипа С укорачивали для уменьшения размера белка при максимизации сохранения большинства известных Т-клеточных эпитопов. Также вносили единичные изменения аминокислот для соответствия опубликованным последовательностям Т-клеточного эпитопа, и последовательность, фланкирующую Т-клеточные эпитопы на концах сегмента, сохраняли, чтобы она способствовала эффективному процессингу и представлению правильных эпитопов антигенпредставляющей клеткой. Полученный сегмент Х-антигена НВУ соответствует 8Еф ГО N0:100.
Наконец, как описано в примере 5, полный слитый белок конструировали путем связывания четырех сегментов НВУ, описанных выше, с образованием единого белка, оптимизированного для клинического применения. Создавали два различных иллюстративных слитых белка, каждый из которых имел отличающийся Юконцевой пептид, присоединенный для усиления и/или стабилизации экспрессии слитого белка в дрожжах. Как описано в настоящем описании выше в отношении всех других белков, используемых в иммунотерапевтических композициях на основе дрожжей, описанных в настоящем описании, Юконцевой пептид можно заменять отличающимся синтетическим или природным Юконцевым пептидом или его гомологом, или Юконцевой пептид может отсутствовать вовсе и в первое положение может быть включен метионин. Кроме того, если желательно, между сегментами слитого белка могут быть добавлены линкерные последовательности из одной, двух, трех или более аминокислот. Например, линкерную последовательность из двух аминокислот, такую как ТЬг-8ег, можно встраивать между N концевым пептидом и первым антигеном НВУ в слитом белке и/или между двумя антигенами НВУ в слитом белке. Также, хотя эти конструкции конструировали с использованием белков НВУ из генотипа С в качестве каркаса, для конструирования сегментов белков можно использовать любой другой генотип, подгенотип НВУ, или белки НВУ из других штаммов или изолятов. В одном из аспектов консенсусные последовательности из данного генотипа НВУ можно использовать для конструирования или образования сегментов белков, как описано для дополнительных слитых белков ниже. Наконец, если один или
- 48 028659 несколько сегментов исключены из слитого белка, как описано в настоящем описании, тогда длина последовательности остальных сегментов может быть расширена, если желательно, для включения дополнительных Т-клеточных эпитопов и/или фланкирующих областей остальных белков.
В примере 5 описан слитый белок НВУ, который также проиллюстрирован путем схематического изображения конструкции на фиг. 3, который представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 8Е0 ГО N0:101: (1) ^концевой пептид, который представляет собой препропоследовательность а-фактора, обеспечивающую устойчивость к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Е0 ГО N0:89 (положения 1-89 8Е0 ГО N0:101); (2) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая 8Е0 ГО N0:97 (положения 90-338 8Е0 ГО N0:101, например соответствующие положениям 120-368 8Е0 ГО N0:11 плюс оптимизация эпитопов); (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая 8Е0 ГО N0:98 (положения 339-566 8Е0 ГО N0:101, например соответствующие положениям 453-680 8Е0 ГО N0:10 плюс оптимизация эпитопов); (4) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая 8Е0 ГО N0:99 (положения 567-718 8Е0 ГО N0:101, например соответствующие положениям 37-188 8Е0 ГО N0:9 вместе с оптимизацией эпитопов); (5) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая 8Е0 ГО N0:100 (положения 719-778 8Е0 ГО N0:101, например соответствующие положениям 52-127 8Е0 ГО N0:12 вместе с оптимизацией эпитопов); и (6) гексагистидиновая метка (например, положения 779-784 8Е0 ГО N0:101). В одном из вариантов осуществления линкерную последовательность треонин (Тйг или Т)-серин (8ег или 8) используют между N-концевым пептидом 8Е0 ГО N0:89 и первым белком НВУ (оптимизированная часть большого поверхностного антигена НВУ), тем самым, увеличивая общую длину 8Е0 ГО N0:101 на две аминокислоты.
В примере 5 также описан слитый белок, который также иллюстрируется схематичным изображением конструкции на фиг. 3, который представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 8Е0 ГО N0:102: (1) ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Е0 ГО N0:37 (положения 1-6 8Е0 ГО N0:102); (2) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 2-248 8Е0 ГО N0:97 (положения 7-254 8Е0 ГО N0:102, например соответствующие положениям 120-368 8Е0 ГО N0:11 вместе с оптимизацией эпитопов); (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая 8Е0 ГО N0:98 (положения 255-482 8Е0 ГО N0:102, например соответствующие положениям 453-680 8Е0 ГО N0:10 вместе с оптимизацией эпитопов); (4) оптимизированная часть корового белка, соответствующая 8Е0 ГО N0:99 (положения 483-634 8Е0 ГО N0:102, например соответствующая положениям 37-188 8Е0 ГО N0:9 вместе с оптимизацией эпитопов); (5) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая 8Е0 ГО N0:100 (положения 635-694 8Е0 ГО N0:102, например, соответствующие положениям 52-127 8Е0 ГО N0:12 вместе с оптимизацией эпитопов); и (6) гексагистидиновая метка (например, положения 695-700 8Е0 ГО N0:102). В одном из вариантов осуществления линкерную последовательность треонина (Тйг или Т)-серии (8ег или 8) используют между N-концевым пептидом 8Е0 ГО N0:37 и первым белком НВУ (оптимизированная часть большого поверхностного антигена НВУ), тем самым, увеличивая общую длину 8Е0 ГО N0:102 на две аминокислоты. В одном из вариантов осуществления оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, используемая в слитом белке, описанном выше, соответствует положениям 1-248 8Е0 ГО N0:97 (тем самым, увеличивая общую длину 8Е0 ГО N0:102 на одну аминокислоту). В одном из вариантов осуществления как линкер Т-8, так и положения 1-248 8Е0 ГО N0:97 используют в 8Е0 ГО N0:102.
Как рассмотрено выше, изобретение включает модификацию антигенов НВУ от их природных последовательностей или последовательностей дикого типа для включения в иммунотерапевтическое средство на основе дрожжей, которая повышает клиническую применимость или удовлетворяет требуемым критериям для терапевтических или профилактических средств, имеющих отношение к инфекционным агентам, с использованием консенсусных последовательностей из данного генотипа НВУ для конструирования или получения белковых сегментов. В качестве примера для иллюстрации этого типа модификации конструировали дополнительные антигены НВУ для применения в иммунотерапевтических средствах на основе дрожжей по изобретению. Как и при конструировании слитых белков НВУ, соответствующих белкам, описанным выше, для получения этих дополнительных слитых белков отдельные антигены НВУ в слитой конструкции оптимизировали или модифицировали для уменьшения размера сегментов в белке (например, для обеспечения того, чтобы белок соответствовал менее чем 2/3 генома НВУ), а также для максимизации включения Т-клеточных эпитопов, связанных с иммунным ответом при острой/самоограничивающейся инфекции НВУ и/или хронической инфекции НВУ, для максимизации консервативных эпитопов, для минимизиации неприродных последовательностей, а также для использования консенсусных последовательностей для каждого из генотипов А-Ό, сконструированных из множества источников последовательностей НВУ (например, Уи апб Уиап е1 а1., 2010, для 8, корового антигена и X, где консенсусные последовательности были получены из 322 последовательностей НВУ, или для Ро1
- 49 028659 (КТ), из δΙαηΙοΓύ ИтуегкИу ΗΙν Эгид Ке5151апсе Эа1аЬа5е. ΗΒV5е^ апб ΗΒν δίΐΌ Ке1еа§е №1е5). При конструировании следующих четырех иллюстративных слитых белков, содержащих антигены ΗΒν, использовали консенсусную последовательность для данного генотипа ΗΒν, если только консенсусная последовательность не изменяла один из известных Т-клеточных эпитопов острой/самоограничивающейся инфекции, или один из известных участков мутации полимеразы, обеспечивающих ускользание, и в этом случае эти положения соответствовали опубликованной последовательности для этих эпитопов или участком мутации. Можно конструировать дополнительные антигены, исходя только из консенсусных последовательностей или с использованием других опубликованных эпитопов, по мере того, как они станут известными.
В примере 7 описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:101 или δΕΟ ΙΌ N0:102 (схематично проиллюстрирован на фиг. 3), но который основан на консенсусной последовательности для ΗΒν генотипа А. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:107 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями ΗΒν, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:107, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37, который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:89, δΕΟ ΙΌ N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг^ег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒν, соответствующая положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа
A, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы ΗΒν, соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа А, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (5) оптимизированная часть корового белка ΗΒν, соответствующая положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа А, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена ΗΒν, соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа А, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; и (7) необязательно, гексагистидиновая метка.
Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 0Ι-13010.
В примере 7 также описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:101 или δΕΟ ΙΌ N0:102 (схематично представлен на фиг. 3), но который основан на консенсусной последовательности для ΗΒν генотипа В. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:108 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями ΗΒν, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:108, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37, который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:89, δΕΟ ΙΌ N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг^ег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒν, соответствующая положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа
B, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы ΗΒν, соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа В, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (5) оптимизированная часть корового белка ΗΒν, соответствующая положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа В, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена ΗΒν, соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для ΗΒν генотипа В, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; и (7)
- 50 028659 необязательно, гексагистидиновая метка. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ΟΙ-13011.
В примере 7 также описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:101 или δΕΟ ΙΌ N0:102 (схематично проиллюстрирован на фиг. 3), но который основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа С. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:109 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:109, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37, который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:89, δΕΟ ΙΌ N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬгАег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (5) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (6) оптимизированная часть для Х-антигена НВУ, соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; и (7) необязательно, гексагистидиновая метка. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ΟΙ-13012.
Также в примере 7 описан слитый белок, который сходен по конструкции со слитым белком, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:101 или δΕΟ ΙΌ N0:102 (схематично проиллюстрирован на фиг. 3), но который основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:110 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:110, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 7): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37, который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:89, δΕΟ ΙΌ N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислотных линкерных последовательностей из одной, двух, трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬгАег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (5) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, для которой использовалась стратегия конструирования, рассмотренная выше; и (7) необязательно, гексагистидиновая метка. Иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, экспрессирующую этот слитый белок, которая содержит ^концевую последовательность, соответствующую δΕΟ ΙΌ N0:37, обозначают в настоящем описании как ΟΙ-13013. Иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, которая содержит ^концевую последовательность, соответствующую δΕΟ ΙΌ N0:89, обозначают в настоящем описании как ΟΙ-13014.
Как рассмотрено выше, одним вариантом осуществления изобретения является изменение порядка белковых сегментов НВУ в слитом белке, описанном в настоящем описании. Таким образом, хотя конструкции, в которых используются четыре белка НВУ, как описано выше, предусмотрены в порядке по- 51 028659 верхностный антиген, слитый с антигеном полимеразы, слитый с коровым антигеном, слитый с Хантигеном, изобретение не ограничивается этим конкретным порядком белков в конструкции, и, в действительности, можно использовать другие расположения слитых сегментов и в некоторых аспектах они могут улучшать полученные иммунотерапевтические композиции. Например, расположение сегментов в слитом белке может повышать или модифицировать экспрессию антигена НВУ в дрожжах или может повышать или модифицировать иммуногенность или другой функциональный признак антигена НВУ. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретение предусматривает начало с одного антигена НВУ, который хорошо экспрессируется в дрожжах и/или обеспечивает положительные функциональные данные (например, является иммуногенным), и добавление дополнительных белков или доменов НВУ к этому антигену НВУ для расширения потенциальных антигенов или эпитопов, которые содержатся в антигене НВУ. В примере 8 предоставлен пример дополнительных расположений четырех белков НВУ, описанных выше.
В примере 8 описан слитый белок, который содержит последовательности из поверхностного антигена НВУ, корового белка, полимеразы и Х-антигена, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих 5>Е0 ГО N0:110 и 5>Е0 ГО N0:118, и где в слитом белке используется отличающийся порядок слитых сегментов по сравнению с 5>Е0 ГО N0:110. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 5>Е0 ГО N0:107 или 5>Е0 ГО N0:112 (генотип А), 5>Е0 ГО N0:108 или 5>Е0 ГО N0:114 (генотип В), 5>Е0 ГО N0:109 или 5>Е0 ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из другого генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, 8ассЬаготусек сегеу151ае) конструировали для экспрессии этого слитого белка под контролем индуцируемого медью промотора СИР1, и полученная иммунотерапевтическая композицая против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как 01-13017, схематично проиллюстрированная на фиг. 10. Слитый белок, соответствующий 5>Е0 ГО N0:124, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового антигена, полимеразы и Х-антигена, в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующего 5>Е0 ГО N0:124 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 5>Е0 ГО N0:124, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 5>Е0 ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим 5>Е0 ГО N0:89, 5>Е0 ГО N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг§ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό большого (Ь) поверхностного антигена, соответствующая положениям 1-399 5>Е0 ГО N0:124 (соответствующая положениям 1-399 5>Е0 ГО N0:118); 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 5>Е0 ГО N0:124 (соответствующая положениям 400-581 5>Е0 ГО N0:118); (5) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-809 5>Е0 ГО N0:124 (соответствующая положениям 250-477 5>Е0 ГО N0:110); (6) оптимизированная часть Х-антигена НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 810-869 5>Е0 ГО N0:124 (соответствующая положениям 630-689 5>Е0 ГО N0:110); и (7) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8) . 5>Е0 ГО N0:124 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 5>Е0 ГО N0:124 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 5>Е0 ГО N0:123.
В примере 8 также описан другой слитый белок, который содержит последовательности из поверхностного антигена НВУ, корового белка, Х-антигена и полимеразы, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих 5>Е0 ГО N0:110 и 5>Е0 ГО N0:118, но где в слитом белке используется отличающийся порядок слитых сегментов по сравнению с 5>Е0 ГО N0:110. Этот антиген также основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 5>Е0 ГО N0:107 или 5>Е0 ГО N0:112 (генотип А), 5>Е0 ГО N0:108 или 5>Е0 ГО N0:114 (генотип В), 5>Е0 ГО N0:109 или 5>Е0 ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, 8ассЬаготусек
- 52 028659 сеге\т51ае) модифицировали способами инженерии так, чтобы они экспрессировали этот слитый белок под контролем индуцируемого медью промотора, СИР1 и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как С1-13018, схематично проиллюстрированная на фиг. 11. Слитый белок, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:126, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового антигена, Х-антигена и полимеразы, в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующего 8ЕЦ ГО N0:126 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 8ЕЦ ГО N0:126, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический N концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен N-концевым пептидом, соответствующим 8ЕЦ ГО N0:89, 8ЕЦ ГО N0:90, или другим N-концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот Тйг-8ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-399 8ЕЦ ГО N0:126 (соответствующая положениям 1-399 8ЕЦ ГО N0:118); 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 8ЕЦ ГО N0:126 (соответствующая положениям 400-581 8ЕЦ ГО N0:118); (5) оптимизированная часть Х-антигена НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-641 8ЕЦ ГО N0:126 (соответствующая положениям 630-689 8ЕЦ ГО N0:110); (5) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 642-869 8ЕЦ ГО N0:126 (соответствующая положениям 250-477 8ЕЦ ГО N0:110); и (7) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8). 8ЕЦ ГО N0:126 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8ЕЦ ГО N0:126 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 8ЕЦ ГО N0:125.
В примере 8 описан другой слитый белок, который содержит последовательности из полимеразы, Х-антигена, поверхностного антигена, корового белка НВУ, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих 8ЕЦ ГО N0:110 и 8ЕЦ ГО N0:118, но где в слитом белке используется отличающийся порядок слитых сегментов по сравнению с 8ЕЦ ГО N0:110. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 8ЕЦ ГО N0:107 или 8ЕЦ ГО N0:112 (генотип А), 8ЕЦ ГО N0:108 или 8ЕЦ ГО N0:114 (генотип В), 8ЕЦ ГО N0:109 или 8ЕЦ ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере конструировали дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сеге\351ае) для экспрессии этого слитого белка под контролем индуцируемого медью промотора СИР1, и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как С1-13021, схематично проиллюстрированная на фиг. 14. Слитый белок, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:132, содержит по порядку полимеразу, Х-антиген, поверхностный антиген и коровый антиген в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующего 8ЕЦ ГО N0:132 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 8ЕЦ ГО N0:132, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен N-концевым пептидом, соответствующим 8ЕЦ ГО N0:89, 8ЕЦ ГО N0:90, или другим N-концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот Тйг8ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-228 8ЕЦ ГО N0:132 (соответствующая положениям 250-477 8ЕЦ ГО N0:110); (4) оптимизированная часть Х-антигена НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 229-288 8ЕЦ ГО N0:132 (соответствующая положениям 630-689 8ЕЦ ГО N0:110); (5) аминокислотная последовательность практически полнораз- 53 028659 мерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 289-687 8Ε0 ГО N0:132 (соответствующая положениям 1-399 8Ε0 ГО N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 688-869 8Ε0 ГО NΟ:132(соответствующая положениям 400-581 8Ε0 ГО N0:118); и (7) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8). 8Ε0 ГО N0:132 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8Ε0 ГО N0:132 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 8Ε0 ГО N0:131.
В примере 8 также описан слитый белок, который содержит последовательности из Х-антигена, полимеразы, поверхностного антигена и корового белка НВУ, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих 8Ε0 ГО N0:110 и 8Ε0 ГО N0:118, но где в слитом белке используется отличающийся порядок слитых сегментов по сравнению с 8Ε0 ГО N0:110. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 8Ε0 ГО N0:107 или 8Ε0 ГО N0:112 (генотип А), 8Ε0 ГО N0:108 или 8Ε0 ГО N0:114 (генотип В), 8Ε0 ГО N0:109 или 8Ε0 ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, 8ассйаготусез сеге\аз1ае) модифицировали способами инженерии так, чтобы они экспрессировали этот слитый белок под контролем индуцируемого медью промотора СИР1, и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как 01-13022, схематично проиллюстрированная на фиг. 15. Слитый белок, соответствующий 8Ε0 ГО N0:134, содержит по порядку Х-антиген, полимеразу, поверхностный антиген и коровый белок, в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующего 8Ε0 ГО N0:134 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 8Ε0 ГО N0:134, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Ε0 ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим 8Ε0 ГО N0:89, 8Ε0 ГО N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот Тйг-8ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) оптимизированная часть Хантигена НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-60 8Ε0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 630-689 8Ε0 ГО N0:110); (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 61-288 8Ε0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 250-477 8Ε0 ГО N0:110); (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 289-687 8Ε0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 1-399 8Ε0 ГО N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 688-869 8Ε0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 400-581 8Ε0 ГО N0:118); и (7) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8), 8Ε0 ГО N0:134 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8Ε0 ГО N0:134 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 8Ε0 ГО N0:133.
Антигены НВУ, содержащие поверхностный антиген, коровый белок и Х-антиген.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из поверхностного антигена НВУ (большой (Ь), средний (М) или малый (8)) или по меньшей мере один из структурный, функциональный или иммуногенный домен), корового белка НВУ (НВсАд) или е-антигена НВУ (НВеАд) или по меньшей мере одного их структурного, функционального или иммуногенного домена, и Х-антигена НВУ (НВх) или по меньшей мере одного его структурного, функционального или иммуногенного домена. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, Х-антигена НВУ или их домена является полноразмерным или практически полноразмерным. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, Х-антигена НВУ или их домена содержит по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена
- 54 028659
НВУ, Х-антигена НВУ или их домена соответственно, или аминокислотной последовательности, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ), 8Е0 ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), 8Е0 ГО N0:100 (оптимизированный Х-антиген), или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, Х-антигена НВУ или их домена по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен полноразмерному поверхностному антигену НВУ, коровому белку НВУ, е-антигену НВУ, Х-антигену НВУ или их домену, соответственно, или аминокислотным последовательностям, соответствующим 8Е0 ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ), 8Е0 ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), 8Е0 ГО N0:100 (оптимизированный Х-антиген) или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. Различные подходящие и иллюстративные последовательности для дополнительных поверхностных антигенов НВУ, коровых антигенов НВУ и Х-антигенов НВУ, подходящие в этой конструкции, описаны в настоящем описании.
В примере 8 описан слитый белок, который содержит последовательности из поверхностного антигена, корового белка и Х-антигена НВУ, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих 8Е0 ГО N0:110 и 8Е0 ГО N0:118. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 8Е0 ГО N0:107 или 8Е0 ГО N0:112 (генотип А), 8Е0 ГО N0:108 или 8Е0 ГО N0:114 (генотип В), 8Е0 ГО N0:109 или 8Е0 ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из другого генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, 8ассЬаготусе8 сегеуыае) модифицировали способами инженерии для экспрессии этого слитого белка под контролем индуцируемого медью промотора СИР1, и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как ΟΙ-13016, как схематично представлено на фиг. 9. Слитый белок, соответствующий 8Е0 ГО N0:122, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового антигена и Х-антигена в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующего 8Е0 ГО N0:122 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 8Е0 ГО N0:122, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, Юконцевой пептид, который представляет собой синтетический Юконцевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Е0 ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен Юконцевым пептидом, соответствующим 8Е0 ГО N0:89, 8Е0 ГО N0:90, или другим Юконцевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг-8ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного аннтигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-399 8Е0 ГО N0:122 (соответствующая положениям 1399 8Е0 ГО N0:118); 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 8Е0 ГО N0:122 (соответствующая положениям 400-581 8Е0 ГО N0:118); (5) оптимизированная часть Х-антигена НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-641 8Е0 ГО N0:122 (соответствующая положениям 630-689 8Е0 ГО N0:110); и (6) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8) . 8Е0 ГО N0:122 содержит множество Тклеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 8Е0 ГО N0:122 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 8Е0 ГО N0:121.
В примере 8 также описан слитый белок, который содержит последовательности из поверхностного антигена, корового белка и Х-антигена НВУ, где, как и в слитом белке, содержащем 8Е0 ГО N0:122, последовательности происходили из семгентов слитых белков, соответствующих 8Е0 ГО N0:110 и 8Е0 ГО N0:118. Однако этот слитый белок отличается от слитого белка, содержащего 8Е0 ГО N0:122 расположением слитых сегментов в слитом белке. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 8ЕО ГО N0:107 или 8ЕО ГО N0:112 (генотип А), 8ЕО ГО N0:108 или 8ЕО ГО N0:114 (генотип В), 8ЕО ГО N0:109 или 8Е0 ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, 8ассЬаготусе§ сегеуыае) модифицировали способами инженерии для экспрессии этого слитого белка под контролем индуцируемого медью промотора СИР1, и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоя- 55 028659 щем описании как 0Ы3020, как схематично представлено на фиг. 13. Слитый белок, соответствующий ЗЕО ГО N0:130, содержит по порядку последовательности Х-антигена, поверхностного антигена и корового антигена в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующего ЗЕЦ ГО N0:130 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность ЗЕО ГО N0:130, за исключением линкера Ьеи-О1и между сегментом Х-антигена и сегментом поверхностного антигена в конструкции, проиллюстрированной в настоящем описании, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий ЗЕО ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен Νконцевым пептидом, соответствующим ЗЕЦ ГО N0:89, ЗЕЦ ГО N0:90, или другим Ν-концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг-Зег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) оптимизированная часть Х-антигена НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-60 ЗЕЦ ГО N0:130 (соответствующая положениям 630-689 ЗЕО ГО N0:110); (4) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот Ьеи-01и (в конструкции, описанной в примере 8), соответствующей положениям 61-62 ЗЕЦ ГО N0:130; (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 63-461 ЗЕЦ ГО N0:130 (соответствующая положениям 1-399 ЗЕЦ ГО N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 462-643 ЗЕЦ ГО N0:130 (соответствующая положениям 400-581 ЗЕЦ ГО N0:118); и (7) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8). ЗЕЦ ГО N0:130 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Аминокислотная последовательность полного слитого белка, описанного в примере 8, содержащая ЗЕЦ ГО N0:130 и включающая Ν- и С-концевой пептиды и все линкеры, представлена в настоящем описании как ЗЕЦ ГО N0:150. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок ЗЕЦ ГО N0:130 или ЗЕЦ ГО N0:150 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как ЗЕЦ ГО N0:129.
Антигены НВУ, содержащие поверхностный антиген, коровый белок и полимеразу.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из поверхностного антигена НВУ (большой (Ь), средний (М) или малый (З)) или по меньшей мере один их структурный, функциональный или иммуногенный домен), корового белка НВУ (НВсАд) или е-антигена НВУ (НВеАд) или по меньшей мере одного их структурного, функционального или иммуногенного домена, и полимеразы НВУ или по меньшей мере одного ее структурного, функционального или иммуногенного домена (например, домен обратной транскриптазы (КТ)). В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, еантигена НВУ, полимеразы НВУ или их домена, является полноразмерным или практически полноразмерным. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, полимеразы НВУ или их домена содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, полимеразы НВУ или их домена, соответственно, или аминокислотных последовательностей, соответствующих ЗЕЦ ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ), ЗЕЦ ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), ЗЕЦ ГО N0:98 (оптимизированная полимераза) или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. В одном из аспектов любой один или несколько из поверхностного антигена НВУ, корового белка НВУ, е-антигена НВУ, полимеразы НВУ или их домена по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны полноразмерному поверхностному антигену НВУ, коровому белку НВУ, е-антигену НВУ, полимеразе НВУ или их домену соответственно, или аминокислотным последовательностям, соответствующим ЗЕЦ ГО N0:97 (оптимизированный поверхностный антиген НВУ), ЗЕЦ ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), ЗЕЦ ГО N0:98 (оптимизированная полимераза), или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. Различные подходящие и иллюстративные последовательности для поверхностных антигенов НВУ, антигенов полимеразы НВУ и коровых антигенов НВУ описаны в настоящем описании.
Один пример такого слитого белка схематично представлен на фиг. 7. Пример композиции, содержащей этот слитый белок, описан в примере 3. В этом варианте осуществления дрожжи (например, ЗассЬаготусек сегеу151ае) конструируют для экспрессии различных слитых белков поверхностный антигенполимераза-коровый антиген НВУ под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промото- 56 028659 ра ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 8Еф ГО N0:41: (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (например, положения 1-5 8Еф ГО N0:41); 2) аминокислотная последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена части ргс-81 большого (Ь) поверхностного белка НВУ (уникальная для Ь) (например, положения 21-47 8Еф ГО N0:11 или положения 6-32 8Еф ГО N0:41); 3) аминокислотная последовательность малого (8) поверхностного белка НВУ (например, положения 176-400 8Е0 ГО N0:11 или положения 33-257 8Еф ГО N0:41); 4) спейсер/линкер из двух аминокислот для облегчения клонирования и модулирования последовательностей (например, положения 258 и 259 8Еф ГО N0:41); 5) аминокислотная последовательность полимеразы НВУ, содержащая домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 8Еф ГО N0:10 или положения 260-604 8Еф ГО N0:41); 6) аминокислотная последовательность корового белка НВУ (например, положения 31-212 8Еф ГО N0:9 или положения 605-786 8Еф ГО N0:41); и 7) гексагистидиновая метка (например, положения 787-792 8Еф ГО N0:41). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Кроме того, в одном из вариантов осуществления последовательность этой конструкции можно модифицировать внесением одной или нескольких или всех из следующих мутаций, направленных против устойчивости вирусов: Г1М2041, г1Ь180М, Г1М204У, йУ173Ь, гШ236Т, Г1А194Т (положения приведены в отношении полноразмерной аминокислотной последовательности для полимеразы НВУ). В одном из вариантов осуществления создают шесть различных иммунотерапевтических композиций, каждая из которых содержит одну из этих мутаций. В других вариантах осуществления все или некоторые из мутаций включены в единый слитый белок. В одном из вариантов осуществления эта конструкция также содержит одну или несколько мутаций, направленных против устойчивости вируса, в поверхностном антигене. Аминокислотные сегменты, используемые в любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, можно модифицировать с использованием дополнительных аминокислот, фланкирующих любой конец любого домена; примеры, представленные в настоящем описании, являются иллюстративными. Например, слитый белок согласно этому варианту осуществления может включать: 1) аминокислотную последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена части ргс-81 большого (Ь) поверхностного белка НВУ (уникальная для Ь) (например, положения 21-47 8Еф ГО N0:11 или положения 6-32 8Еф ГО N0:41); 2) аминокислотную последовательность малого (8) поверхностного белка НВУ (например, положения 176-400 8Еф ГО N0:11 или положения 33-257 8Е0 ГО N0:41); 3) аминокислотную последовательность полимеразы НВУ, содержащую домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 8Еф ГО N0:10 или положения 260-604 8Еф ГО N0:41); и 4) аминокислотную последовательность корового белка НВУ (например, положения 31-212 8Е0 ГО N0:9 или положения 605-786 8Еф ГО N0:41), и может не включать N или С-концевых последовательностей, или может включать отличающиеся N или С-концевые последовательности, и/или может включать линкеры или не включать линкеры между последовательностями НВУ. В одном из вариантов осуществления вместо ^концевого пептида, соответствующего положениям 1-5 8Еф ГО N0:41, используется ^концевой пептид, соответствующий 8Еф ГО N0:89 или 8Еф ГО N0:90, за которым следует остальная часть слитого белка, как описано.
Другой пример такого слитого белка описан в примере 8. В примере 8 проиллюстрирован слитый белок, который содержит последовательности из поверхностного антигена, корового белка и полимеразы НВУ, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих 8Еф ГО N0:110 и 8Е0 ГО N0:118. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 8Еф ГО N0:107 или 8ЕЕ) ГО N0:112 (генотип А), 8ЕЕ) ГО N0:108 или 8ЕЕ) ГО N0:114 (генотип В), 8ЕЕ) ГО N0:109 или 8ЕЕ) ГО N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, 8ассйаготусс5 ссгсу151ас) модифицировали способами инженерии для экспрессии этого слитого белка под контролем индуцируемого медью промотора СИР1, и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как 0Ι13015, схематично проиллюстрированная на фиг. 8. Слитый белок, соответствующий 8Еф ГО N0:120, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового белка и полимеразы, в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующего 8Еф ГО N0:120 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность 8Еф ГО N0:120, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Еф ГО N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим 8Еф ГО N0:89, 8Еф ГО N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в
- 57 028659 настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТЬг^ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:120 (соответствующая положениям 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:118); (4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:120 (соответствующая положениям 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118); (5) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-809 δΕΟ ΙΌ N0:120 (соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110); и (6) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8). δΕΟ ΙΌ N0:120 содержит множество Тклеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок δΕΟ ΙΌ N0:120 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ N0:119.
Другой пример такого слитого белка описан в примере 8. В примере 8 проиллюстрирован слитый белок, который содержит последовательности из полимеразы, поверхностного антигена и корового белка НВУ, где последовательности происходили из сегментов слитых белков, соответствующих δΕΟ ΙΌ N0:110 и δΕΟ ΙΌ N0:118. Этот слитый белок отличается от слитого белка, содержащего δΕΟ ΙΌ N0:120 расположением слитых сегментов слитого белка. Этот антиген основан на консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό; однако можно прямо продуцировать слитый белок, имеющий сходную общую структуру с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих δΕΟ ΙΌ N0:107 или δΕΟ ΙΌ N0:112 (генотип Α), δΕΟ ΙΌ N0:108 или δΕΟ ΙΌ N0:114 (генотип В), δΕΟ ΙΌ N0:109 или δΕΟ ΙΌ N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ. В этом примере дрожжи (например, δ;·ι^1ι;·ιΐΌΐη\^3 сетеу131ае) модифицировали способами инженерии для экспрессии этого слитого белка под контролем индуцируемого медью промотора СиР1, и полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как ΟΙ-13019, схематично представленная на фиг. 12. Слитый белок, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:128 содержит по порядку последовательности полимеразы, поверхностного антигена и корового антигена, в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими δΕΟ Ш N0:128 (необязательные последовательности, которые не являются последовательностями НВУ, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:128, за исключением линкера Ьеи-01и между сегментом полимеразы и сегментом поверхностного антигена в конструкции, проиллюстрированной в настоящем описании, но могут быть добавлены к этой последовательности, как в случае конструкции, описанной в примере 8): (1) необязательно, ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37 (в конструкции, описанной в примере 8), который может быть заменен ^концевым пептидом, соответствующим δΕΟ ΙΌ N0:89, δΕΟ ΙΌ N0:90, или другим ^концевым пептидом, подходящим для применения в иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, как описано в настоящем описании; (2) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех или более аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот ТНг^ег (в конструкции, описанной в примере 8); (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-228 δΕΟ ΙΌ N0:128 (соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110); (4) необязательно, линкерный пептид из от одной до трех аминокислот, такой как аминокислотный линкер из двух аминокислот Ьеи-01и (в конструкции, описанной в примере 8), соответствующий положениям 229-230 δΕΟ ΙΌ N0:128; (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 231-629 δΕΟ ΙΌ N0:128 (соответствующая положениям 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128 (соответствующая положениям 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118); и (7) необязательно, гексагистидиновая метка (в конструкции, описанной в примере 8) . δΕΟ ΙΌ N0:128 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок δΕΟ Ш N0:128 (кодоноптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ N0:127.
Антигены НВУ, содержащие полимеразу и коровый белок.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из полимеразы НВУ (КТ-домен) или по меньшей мере одного ее иммуногенного домена и корового белка НВУ (НВсАд) или по меньшей мере одного его иммуногенного домена. В одном из аспектов один или оба из КТ-домена полимеразы НВУ или корового белка НВУ являются
- 58 028659 полноразмерными или практически полноразмерными. В одном из аспектов один или оба из КТ-домена полимеразы НВУ или корового белка НВУ или их домена содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного КТ-домена полимеразы НВУ или корового белка НВУ или их домена соответственно, или аминокислотные последовательности, соответствующие 3ЕО ГО N0:98 (оптимизированная полимераза НВУ), 3ЕЦ ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), или соответствующую последовательность из другого штамма НВУ, когда это применимо. В одном из аспектов один или оба из КТ-домена полимеразы НВУ или корового белка НВУ или их домена по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны полноразмерному КТ-домену полимеразы НВУ или корового белка НВУ или их домена, соответственно, или аминокислотным последовательностям, соответствующим 3Е0 ГО N0:98 (оптимизированная полимераза НВУ), 3ЕЦ ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. Различные подходящие и иллюстративные последовательности для антигенов полимеразы НВУ и коровых антигенов НВУ описаны в настоящем описании.
Один пример этого антигена схематично представлен на фиг. 4. Один пример композиции, содержащей этот слитый белок, описан в примере 3. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 3ассйаготусек сегеу151ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных слитых белков полимераза-коровый антиген НВУ, как схематично представлено на фиг. 4 под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 3Е0 ГО N0:38: (1) №концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (например, 3Е0 ГО N0:37 или положения 1-6 3Е0 ГО N0:38); 2) аминокислотная последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающая домен обратной транскриптазы (например, положения 347-691 3Е0 ГО N0:10 или положения 7-351 3Е0 ГО N0:38); 3) коровый белок НВУ генотипа С (например, положения 31-212 3Е0 ГО N0:9 или положения 352-533 3Е0 ГО N0:38); и 4) гексагистидиновая метка (например, положения 534-539 3Е0 ГО N0:38). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Аминокислотные сегменты, используемые в любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, можно модифицировать с использованием дополнительных аминокислот, фланкирующих любой конец любого домена; примеры, представленные в настоящем описании, являются иллюстративными. Например, слитый белок согласно этому варианту осуществления может включать: 1) аминокислотную последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающую домен обратной транскриптазы (например, положения 347-691 3Е0 ГО N0:10 или положения 7-351 3Е0 ГО N0:38); и 2) коровый белок НВУ генотипа С (например, положения 31-212 3Е0 ГО N0:9 или положения 352-533 3Е0 ГО N0:38), и не включает N или С-концевых последовательностей, или включает отличающиеся N или С-концевые последовательности, и/или включает линкеры или не включает линкеры между последовательностями НВУ. В одном из вариантов осуществления вместо ^концевого пептида, соответствующего 3Е0 ГО N0:37, используют №концевой пептид, соответствующий 3Е0 ГО N0:89 или 3Е0 ГО N0:90, за которым следует остальная часть слитого белка.
Антигены НВУ, содержащие Х-антиген и коровый белок.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) НВУ для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ содержат или состоят из Х-антигена НВУ или по меньшей мере одного его иммуногенного домена и корового белка НВУ (НВсАд) или по меньшей мере одного его иммуногенного домена. В одном из аспектов один или оба из Х-антигена НВУ или корового белка НВУ являются полноразмерными или практически полноразмерными. В одном из аспектов один или оба из Х-антигена НВУ или корового белка НВУ или их домена содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного Х-антигена НВУ или корового белка НВУ, или их домена, соответственно, или аминокислотных последовательностей, соответствующих 3Е0 ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), 3Е0 ГО N0:100 (оптимизированный Х-антиген), или соответствующих последовательностей из другого штамма НВУ, когда это применимо. В одном из аспектов один или оба из Хантигена НВУ или корового белка НВУ, или их домена по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны полноразмерному Х-антигену НВУ или коровому белку НВУ или их домену, соответственно, или аминокислотным последовательностям, соответствующим 3Е0 ГО N0:99 (оптимизированный коровый белок), 3Е0 ГО N0:100 (оптимизированный Х-антиген), или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ, когда это применимо. Различные подходящие и иллюстративные последовательности для коровых антигенов НВУ и Х-антигенов НВУ описаны в настоящем описании.
Этот слитый белок схематично представлен на фиг. 5. Пример композиции, содержащей этот слитый белок, описан в примере 3. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 3ассйаготусе5 сегеУ151ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных слитых белков Х-коровый антиген НВУ, как схематично представлено на фиг. 5 под контролем индуцируемого медью промотора СИР1
- 59 028659 или промотора ΤΕΡ2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:39 (1) Ν-концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (например, δΕφ ΙΌ Ν0:37 или положения 1-6 δΕφ ΙΌ Ν0:39); 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) Х-антигена ΗΒV генотипа С (например, положения 2-154 δΕφ ΙΌ Ν0:12 или положения 7-159 δΕφ ΙΌ Ν0:39); 3) коровый белок ΗΒV генотипа С (например, положения 31-212 δΕφ ΙΌ Ν0:9 или положения 160-341 δΕφ ΙΌ Ν0:39); и 4) гексагистидиновая метка (например, положения 342-347 δΕφ ΙΌ Ν0:39). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Аминокислотные сегменты, используемые в любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, можно модифицировать с использованием дополнительных аминокислот, фланкирующих любой конец любого домена; примеры, представленные в настоящем описании, являются иллюстративными. Например, слитый белок согласно этому варианту осуществления может включать 1) аминокислотную последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) Х-антигена ΗΒV генотипа С (например, положения 2-154 δΕφ ΙΌ Ν0:12 или положения 7-159 δΕφ ΙΌ Ν0:39); и 2) коровый белок ЖУ генотипа С (например, положения 31-212 δΕφ ΙΌ Ν0:9 или положения 160-341 δΕφ ΙΌ Ν0:39), и не включает Ν- или С-концевые последовательности, или включает отличающиеся Ν- или С-концевые последовательности, и/или включает линкеры или не включает линкеры между последовательностями ΗΒV. В одном из вариантов осуществления вместо Ν-концевого пептида, соответствующего δΕφ ΙΌ Ν0:37, используют Ν-концевой пептид, соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:89 или δΕφ ΙΌ Ν0:90, за которым следует остальная часть слитого белка, как описано.
Антигены ΗΒV, содержащие единичные белки ΗΒV. одном из вариантов осуществления изобретения антиген ΗΒV содержит единичный белок ΗΒV (например, один белок ΗΒV, выбранный из поверхностного антигена, корового антигена, е-антигена, полимеразы или Х-антигена) или один или несколько доменов (структурные, функциональные и/или иммунологические) из единичного белка ΗΒV. Этот вариант осуществления изобретения особенно пригоден для создания иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, которую можно использовать, например, в комбинации с одной или несколькими другими иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей для лечения или профилактики ΗΒV, или последовательно с одной или несколькими другими иммунотерапевтическим композициями на основе дрожжей для лечения или профилактики ΗΒV, или для продолжения профилактического подхода терапевтическим подходом, если пациент становится инфицированным. Например, иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, включающую поверхностный антиген ΗΒV согласно этому варианту осуществления, можно комбинировать со второй иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, включающей другой белок/антиген ΗΒV, такой как Х-антиген ΗΒV (описанный ниже), и, кроме того, с дополнительными иммунотерапевтическими средствами на основе дрожжей с единичным белком ΗΒV, если желательно (например, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, включающая прекоровый антиген, коровый антиген или е-антиген ΗΒV и/или иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, включающая антиген полимеразы ΗΒV или его домен). Эти иммунотерапевтические средства на основе дрожжей с единичным белком ΗΒV можно использовать в комбинации или последовательно друг с другом и/или в комбинации или последовательно с другими иммунотерапевтическими средствами на основе дрожжей с множеством белков ΗΒV, такими как средства, описанные в примерах или в других разделах настоящего описания. Альтернативно или дополнительно, иммунотерапевтическое средство на основе дрожжей с единичным белком ΗΒV, такое как это иммунотерапевтическое средство на основе дрожжей с поверхностным антигеном ΗΒV, можно получать с использованием последовательности ΗΒV для любого данного генотипа или подгенотипа, и дополнительные иммунотерапевтические средства на основе дрожжей с поверхностным антигеном ΗΒV можно получать с использованием последовательностей ΗΒV для любого одного или нескольких дополнительных генотипов или подгенотипов. Эта стратегия эффективно обеспечивает набор специй из различных антигенов и генотипов и/или подгенотипов ΗΒV, где каждый предусмотрен в контексте иммунотерапевтического средства на основе дрожжей по изобретению, или в стратегии, которая включает по меньшей мере одно иммунотерапевтическое средство на основе дрожжей по изобретению. Таким образом, любую комбинацию одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более из этих иммунотерапевтических средств на основе дрожжей можно выбирать для применения для лечения конкретного пациента или группы пациентов, инфицированных ΗΒV, что иллюстрирует гибкость настоящего изобретения для индивидуализации или адаптации в соответствии с потребностями конкретного пациента, группы пациентов, демографических групп или других групп пациентов.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) ΗΒV для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой антиген ΗΒV, содержащий или состоящий из (а) белка поверхностного антигена ΗΒV и/или одного или нескольких его доменов (структурных, функциональных или иммуногенных), которые могут включать распознаваемую рецепторами гепатоцитов часть ргеδ1 большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒV, большой (Ь) поверхностный антиген ΗΒV, средний (М) поверхностный антиген ΗΒV, малый (δ) поверхностный антиген ΗΒV (ΗΒзΑд), или любой домен или их
- 60 028659 комбинацию; (Ь) антигена полимеразы НВУ, который может включать один или несколько доменов (структурных, функциональных или иммуногенных) полимеразы НВУ, таких как домен обратной транскриптазы (КТ) (функциональный домен) полимеразы НВУ; (с) прекорового белка НВУ, корового антигена НВУ и/или е-антигена НВУ, или одного или нескольких их доменов (структурных, функциональных или иммуногенных), которые могут включать один или несколько доменов или частей прекорового белка НВУ, содержащих последовательности как из корового антигена НВУ, так и из е-антигена НВУ, или один или другой из этих белков; или (б) Х-антиген НВУ, который может включать один или несколько доменов (структурных, функциональных или иммуногенных) Х-антигена НВУ. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков или доменов являются полноразмерными или практически полноразмерными. В одном из аспектов один или несколько из этих белков или доменов содержат или состоят из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, или более иммуногенных доменов. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности соответствующей полноразмерной последовательности или ее домена. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков или доменов по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны соответствующей полноразмерной последовательности или ее домену. Различные подходящие и иллюстративные последовательности для поверхностных антигенов НВУ, антигенов полимеразы НВУ, коровых антигенов НВУ и Х-антигенов НВУ описаны в настоящем описании.
Пример композиции, содержащей белок поверхностного антигена, описан в примере 5. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 8ассйаготусе§ сегеу181ае) конструируют для экспрессии поверхностных белков НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий практически полноразмерный большой (Ь) поверхностный антиген НВУ (для обеспечения присутствия N концевой последовательности, выбранной для усиления или стабилизации экспрессии антигена), соответствующий 8ЕО ГО N0:93: (1) ^концевой пептид 8Е0 ГО N0:89 (положения 1-89 8Е0 ГО N0:93); 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа С (например, положения 2-400 8Е0 ГО N0:11 или положения 90-488 8Е0 ГО N0:93); и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 489-494 8Е0 ГО N0:93). Альтернативно ^концевой пептид можно заменять 8Е0 ГО N0:37 или ее гомологом или другим N концевом пептидом, описанным в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления эта конструкция также содержит одну или несколько мутаций, направленных против устойчивости вируса, в поверхностном антигене. В то время как в этом примере используется большой (Ь) поверхностный антиген в качестве антигена НВУ, который может максимизировать предоставление иммуногенных эпитопов, сформированных иммунной системой, небольшие части поверхностного антигена, включая любые домены или комбинации доменов поверхностного антигена, можно получать с использованием рекомендаций, представленных в настоящем описании. Кроме того, хотя иллюстративное иммунотерапевтическое средство представлено с использованием последовательности генотипа С, вместо этого можно использовать последовательности из других генотипов, подгенотипов и/или штаммов, или изолятов НВУ.
Пример композиции, содержащей антиген полимеразы НВУ, описан в примере 3, а также в примере 5. Антиген НВУ, описанный в примере 5, схематично представлен на фиг. 6. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегеуыае) конструируют так, чтобы они экспрессировали различные белки полимеразы НВУ под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 8Е0 ГО N0:40: (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (8Е0 ГО N0:37, или положения 1-6 8Е0 ГО N0:40; 2) аминокислотная последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающая домен обратной транскриптазы (например, положения 347-691 8Е0 ГО N0:10 или положения 7-351 8Е0 ГО N0:40); и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 352-357 8Е0 ГО N0:40). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Кроме того, в одном из вариантов осуществления последовательность этой конструкции можно модифицировать внесением одной или нескольких или всех из следующих мутаций, направленных против устойчивости вируса: Г1М2041, гГО180М, Г1М204У, г!У173Ь, гда236Т, ЦА194Т (положения приведены в отношении полноразмерной аминокислотной последовательности полимеразы НВУ). В одном из вариантов осуществления создают шесть различных иммунотерапевтических композиций, каждая из которых содержит одну из этих мутаций. В других вариантах осуществления все или некоторые из мутаций включены в единый слитый белок. Аминокислотные сегменты, используемые в любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, можно модифицировать с использованием дополнительных аминокислот, фланкирующих любой конец любого домена; примеры, представленные в настоящем описании, являются иллюстративными. Например, слитый белок согласно этому варианту осуществления может включать аминокислотную последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включая домен обратной транскриптазы (например, положения 347-691 8Е0 ГО N0:10 или положения 7-351 8Е0 ГО N0:40), и не включают N или С- 61 028659 концевые последовательности, или включают отличающиеся N или С-концевые последовательности, и/или включают линкеры или не включают линкеры между последовательностями НВУ. В одном из вариантов осуществления вместо ^концевого пептида, соответствующего 8ЕЦ ГО N0:37, используют N концевой пептид, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:89 или 8ЕЦ ГО N0:90, за которым следует остальная часть слитого белка, как описано.
В варианте осуществления, представленном в примере 5, дрожжи (например, 8ассЬаготусе8 сеге\!51ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии белков полимеразы НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий домен обратной транскриптазы (КТ) полимеразы (Ро1) НВУ, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:94: (1) ^концевой пептид 8ЕЦ ГО N0:89 (положения 1-89 8ЕЦ ГО N0:94); 2) аминокислотная последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающая домен обратной транскриптазы домен (например, положения 347-691 8ЕЦ ГО N0:10 или положения 90-434 8ЕЦ ГО N0:94); и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 435-440 8ЕЦ ГО N0:94). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Кроме того, в одном из вариантов осуществления последовательность этой конструкции можно модифицировать внесением одной или нескольких или всех из следующих мутаций, направленных против устойчивости вируса: Г1М2041, Г1Б180М, Г1М204У, йУ173Ь, гШ236Т, Г1А194Т (положения приведены в отношении полноразмерной аминокислотной последовательности для полимеразы НВУ). Альтернативно ^концевой пептид можно заменять 8ЕЦ ГО N0:37 или ее гомологом или другим ^концевым пептидом, описанным в настоящем описании.
Пример композиции, содержащей прекоровый антиген, коровый антиген или е-антиген НВУ, описан в примере 5. Дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегсхтае) модифицируют способами инженерии для экспрессии коровых белков НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий практически полноразмерный коровый белок НВУ, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:95: (1) ^концевой пептид 8ЕЦ ГО N0:89 (положения 1-89 8ЕЦ ГО N0:95); 2) аминокислотная последовательность части корового белка НВУ генотипа С (например, положения 31-212 8ЕЦ ГО N0:9 или положения 90-271 8ЕЦ ГО N0:95); и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 272-277 8ЕЦ ГО N0:95). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Альтернативно ^концевой пептид можно заменять 8ЕЦ ГО N0:37 или ее гомологом или другим ^концевым пептидом, описанным в настоящем описании.
Пример иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, содержащей Х-антиген НВУ, описан в примере 5. Дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегсхтае) модифицируют способами инженерии для экспрессии Х-антигенов НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий практически полноразмерный Х-антиген НВУ, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:96: (1) ^концевой пептид 8ЕЦ ГО N0:89 (положения 1-89 8ЕЦ ГО N0:96); 2) аминокислотная последовательность части Хантигена НВУ генотипа С (например, положения 2-154 8ЕЦ ГО N0:12 или положения 90-242 8ЕЦ ГО N0:96); и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 243-248 8ЕЦ ГО N0:96). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Альтернативно ^концевой пептид можно заменять 8ЕЦ ГО N0:37 или ее гомологом или другим ^концевым пептидом, описанным в настоящем описании.
Антигены НВУ, содержащие белки НВУ из двух или более генотипов. Другой вариант осуществления изобретения относится к антигенам НВУ для применения в иммунотерапевтической композиции по изобретению, которые максимизируют нацеливание на генотипы и/или подгенотипы НВУ, для предоставления композиций с потенциалом к лечению большого количества индивидуумов или групп индивидуумов с использованием одной композиции. Такие композиции, как правило, можно более эффективно получать (т.е. они имеют преимущество при получении вследствие включения множества антигенов и/или консенсусного подхода для нацеливания на генотипы) и можно использовать более эффективно в широком диапазоне клинических условий (например, одна композиция может служить для многих различных типов групп пациентов во многих различных географических условиях). Как рассмотрено выше, для получения таких антигенов НВУ можно выбирать консервативные антигены и/или консервативные домены (среди генотипов НВУ), и антигены можно конструировать для максимизации включения консервативных иммунологических доменов.
В одном из аспектов этого варианта осуществления предусмотрен антиген НВУ, который включает в единой иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей единичный белок НВУ или его домен (например, поверхностный антиген, полимераза, коровый антиген/е или X) , который повторяется два, три, четыре, пять или более раз в антигенной конструкции, каждый раз с использованием последовательности из отличающегося генотипа или подгенотипа НВУ. В этом аспекте можно осуществлять нацеливание на множество доминантных или преобладающих генотипов в одном иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, увеличивая клиническую эффективность и эффективность производства. Эти антигены можно модифицировать, если желательно, для максимизации включения консенсусных последо- 62 028659 вательностей, включая консенсусные Т-клеточные эпитопы в антигенах, которые в ином случае могут содержать небольшие различия вследствие различий между подгенотипами, штаммами или изолятами.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) ΗΒν для применения в композиции или способе по изобретению представляет собой антиген ΗΒν, содержащий или состоящий из двух или более повторяющихся антигенов ΗΒν одного и того же белка или домена, но отличающихся генотипов ΗΒν (например, два или более коровых антигенов или е-антигенов ΗΒν, которые могут включать один или несколько доменов (структурных, функциональных или иммуногенных) корового антигена или е-антигена ΗΒν, где антигены включают тот же или сходный антиген из каждого из ΗΒν генотипа С и ΗΒν генотипа Ό, с образованием слитого белка коровый антиген-коровый антиген, где каждый коровый белок представляет собой белок отличающегося генотипа). В одном из аспектов белок ΗΒν, используемый в таких конструкциях, является полноразмерным или практически полноразмерным белком или доменом. В одном из аспектов антиген ΗΒν содержит или состоит из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более иммуногенных доменов. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков или доменов содержат по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности из соответствующей полноразмерной последовательности. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков или доменов по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны последовательности из соответствующей полноразмерной последовательности.
Такой антиген проиллюстрирован в примере 6. В этом варианте осуществления дрожжи (например, δα^1ιαΐΌΐη\^5 сегеу151ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии слитого белка ΗΒν под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ΊΈΡ2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий четыре коровых антигена, каждый из которых происходит из отличающегося генотипа (генотипы А, В, С и Ό ΗΒν), соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:105: 1) ^концевой метионин в положении 1 δΕΟ ΙΌ N0:105; 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из ΗΒν генотипа А (например, положения 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:1 или положения 2-183 δΕΟ ΙΌ N0:105); 3) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из ΗΒν генотипа В (например, положения 30-212 δΕΟ ΙΌ N0:5 или положения 184-395 δΕΟ ΙΌ N0:105); 4) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из ΗΒν генотипа С (например, положения 30-212 δΕΟ ΙΌ N0:9 или положения 396-578 δΕΟ ΙΌ N0:105); 5) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из ΗΒν генотипа Ό (например, положения 30-212 δΕΟ ΙΌ N0:13 или положения 579-761 δΕΟ ΙΌ N0:105); и 5) гексагистидиновая метка (например, положения 762-767 δΕΟ ΙΌ N0:105). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. ^концевой метионин в положении 1 можно заменять δΕΟ ΙΌ N0:37 или ее гомологом, или α-препропоследовательностью δΕΟ ΙΌ N0:89 или δΕΟ ΙΌ N0:90, или ее гомологом, или любой другой подходящей ^концевой последовательностью, если желательно. Кроме того, между белками ΗΒν могут быть встроены линкерные последовательности для облегчения клонирования и манипулирования конструкцией, если желательно. Эта конструкция представляет собой иллюстративную конструкцию, поскольку в эту конструкцию может быть внесена любая другая комбинация генотипов и/или подгенотипов ΗΒν путем замены, если желательно, для конструирования иммунотерапевтического продукта против ΗΒν на основе дрожжей с единым антигеном с широкой клинической применимостью и эффективной конструкцией для производства. Аминокислотная последовательность δΕΟ ΙΌ N0:105 также содержит несколько известных Т-клеточных эпитопов, и определенные эпитопы модифицируют так, чтобы они соответствовали опубликованной последовательности для данного эпитопа (см. табл. 5).
В другом аспекте этого варианта осуществления более одного белка или домена из одного генотипа ΗΒν включено в антиген ΗΒν, пригодный для изобретения, который может быть выбран для максимизации наиболее консервативных белковых последовательностей, кодируемых геномом ΗΒν, или максимизации включения терапевтически или профилактически пригодных иммуногенных доменов в антиген. Затем эти антигены повторяют в одном и том же слитом белке, но с использованием тех же или сходных последовательностей из отличающегося генотипа или подгенотипа ΗΒν. В этом аспекте также можно осуществлять нацеливание на множество доминантных и преобладающих генотипов в одном иммунотерапевтическом средстве на основе дрожжей, вновь увеличивая клиническую эффективность и эффективность производства. Эти антигены также можно модифицировать, если желательно, для максимизации включения консенсусных Т-клеточных эпитопов в антигены, которые в ином случае могут содержать тонкие отличия вследствие различий в субгенотипах, штаммах или изолятах.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения антиген(ы) ΗΒν для применения в композиции или способе по изобретению представляют собой антиген ΗΒν, содержащий или состоящий по меньшей мере из двух различных белков ΗΒν или их доменов, каждый из которых повторяется два или более раз, но где повторяющиеся последовательности происходят из отличающихся генотипов ΗΒν (например, два или более коровых антигенов и два или более Х-антигенов ΗΒν, или их домены, где антигены включают тот же или сходный антиген из каждого из ΗΒν генотипа С и ΗΒν генотипа Ό, с образованием слитой конструкции коровый антиген-Х-коровый антиген-Х (или с любым другим поряд- 63 028659 ком сегментов в слитой конструкции), где каждый коровый белок представляет собой отличающийся генотип и каждый Х-антиген представляет собой отличающийся генотип). В одном из аспектов белок НВУ, используемый в таких конструкциях, является полноразмерным или практически полноразмерным белком или доменом. В одном из аспектов антиген НВУ содержит или состоит из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более иммуногенных доменов. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков или доменов содержит по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности соответствующей полноразмерной последовательности. В одном из аспектов любой один или несколько из этих белков или доменов по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен последовательности соответствующей полноразмерной последовательности.
Такой антиген проиллюстрирован в примере 6. В этом варианте осуществления дрожжи (например, 8ассйаготусе§ сегеу151ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии слитого белка НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий два коровых антигена и два Хантигена, причем каждый из пары происходит из отличающегося генотипа (генотипы А и С НВУ), соответствующий 8ЕО ГО N0:106: 1) ^концевой метионин в положении 1 8Е0 ГО N0:106; 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа А (например, положения 31-212 8Е0 ГО N0:1 или положения 2-183 8Е0 ГО N0:106); 3) аминокислотная последовательность полноразмерного X антигена из НВУ генотипа А (например, положения 8Е0 ГО N0:4 или положения 184-337 8Е0 ГО N0:106); 4) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа С (например, положения 30-212 8Е0 ГО N0:9 или положения 338-520 8Е0 ГО N0:106); 5) аминокислотная последовательность полноразмерного Х-антигена из НВУ генотипа С (например, 8Е0 ГО N0:8 или положения 521-674 8Е0 ГО N0:106); и 5) гексагистидиновая метка (например, положения 675-680 8Е0 ГО N0:106). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. ^концевой метионин в положении 1 можно заменять 8Е0 ГО N0:37 или ее гомологом, или а-препропоследовательностью 8Е0 ГО N0:89, или 8Е0 ГО N0:90, или ее гомологом. Аминокислотная последовательность 8Е0 ГО N0:106 также содержит несколько известных Т-клеточных эпитопов и определенные эпитопы модифицируют так, чтобы они соответствовали опубликованной последовательности для данного эпитопа (см. табл. 5).
Дополнительные варианты осуществления, касающиеся антигенов НВУ.
В некоторых аспектах изобретения вставки, делеции и/или замены аминокислот можно вносить для одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более аминокислот белка дикого типа или эталонного белка НВУ, при условии, что полученный белок НВУ, когда его используют в качестве антигена в иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей по изобретению, индуцирует иммунный ответ против мишени или белка НВУ дикого типа или эталонного белка НВУ, который может включать усиленный иммунный ответ, сниженный иммунный ответ, или по существу сходный иммунный ответ. Например, изобретение включает применение агонистов антигенов НВУ, которые могут включать один или несколько Т-клеточных эпитопов, в которые внесены мутации для усиления Т-клеточного ответа против агониста НВУ, как, например, путем повышения авидности или аффинности эпитопа в отношении молекулы МНС или в отношении Т-клеточного рецептора, который распознает эпитоп в контексте представления МНС. Агонисты белков НВУ, таким образом, могут повышать силу или эффективность Т-клеточного ответа против нативных белков НВУ, которые инфицируют хозяина.
Что касается любого из описанных выше антигенов НВУ, включая слитые белки, которые обладают аминокислотными последовательностями, включающими или соответствующими 8Е0 ГО N0:34, 8Е0 ГО N0:36, 8ЕО ГО N0:38, 8ЕО ГО N0:39, 8ЕО ГО N0:40, 8ЕО ГО N0:41, 8ЕО ГО N0:92, 8ЕО ГО N0:101, 8ЕО ГО N0:102, 8ЕО ГО N0:107, 8ЕО ГО N0:108, 8ЕО ГО N0:109, 8ЕО ГО N0:110, 8ЕО ГО N0:112, 8ЕО ГО N0:114, 8ЕО ГО N0:116, 8ЕО ГО N0:118, 8ЕО ГО N0:120, 8ЕО ГО N0:122, 8ЕО ГО N0:124, 8ЕО ГО N0:126, 8ЕО ГО N0:128, 8ЕО ГО N0:130, 8ЕО ГО N0:132, 8ЕО ГО N0:134, 8ЕО ГО N0:150 или 8ЕО ГО N0:151, аспектом изобретения является применение одного или нескольких антигенов НВУ из индивидуальных белков НВУ в слитом белке (например, из поверхностного антигена НВУ, полимеразы НВУ, корового антигена/е-антигена НВУ и/или Х-антигена НВУ) для конструирования антигенов в виде единого белка (например, антигенов только из одного из этих белков НВУ), или для конструирования слитых белков с использованием только двух или трех белковых сегментов НВУ, если это применимо для данного эталонного слитого белка. Также аспектом изобретения является изменение порядка белковых сегментов НВУ в слитом белке. В качестве другой альтернативной модели, генотипы и/или консенсусные последовательности НВУ можно комбинировать, где для конструирования слитого белка используют два, три, четыре или более генотипов и/или консенсусных последовательностей.
Также изобретение включает гомологи любого из описанных выше слитых белков, а также применение гомологов, вариантов или мутантов отдельных белков НВУ или их частей (включая любые функциональные и/или иммуногенные домены), которые являются частью таких слитых белков или иным образом описаны в настоящем описании. В одном из аспектов изобретение включает применение слитых белков или индивидуальных (отдельных) белков НВУ или антигенов НВУ, имеющих аминокислотные
- 64 028659 последовательности, которые по меньшей мере на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны аминокислотной последовательности любого из слитых белков или индивидуальных белков ΗΒν или антигенов ΗΒν соответственно, описанных в настоящем описании, включая любые из белков ΗΒν, антигенов ΗΒν и слитых белков, упоминаемых с помощью конкретного идентификатора последовательности в настоящем описании на протяжении всей длины слитого белка или в отношении определенного сегмента в слитом белке или определенном белке или его домене (иммуногенный домен или функциональный домен (т.е. домен по меньшей мере с одним видом биологической активности)), который образует часть слитого белка. Многие эпитопы СТЬ (эпитопы, которые распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами из пациентов, инфицированных ΗΒν) и обеспечивающие ускользание мутации (мутации, которые появляются в белке ΗΒν вследствие селективного давления противовирусного лекарственного средства) известны в данной области, и эту информацию также можно использовать для внесения замен или создания вариантов или гомологов антигенов ΗΒν, описанных в настоящем описании, для обеспечения конкретной последовательности в антигене ΗΒν по изобретению.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей. В различных вариантах осуществления изобретения изобретение включает применение по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей (это выражение может использоваться взаимозаменяемо с иммунотерапевтическим продуктом на основе дрожжей, иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, композицией на основе дрожжей, иммунотерапевтическим средством на основе дрожжей, вакциной на основе дрожжей или производными этих выражений). Иммунотерапевтическая композиция представляет собой композицию, которая индуцирует иммунный ответ, достаточный для достижения по меньшей мере одной терапевтической пользы у индивидуума. Как используют в рамках изобретения иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей относится к композиции, которая включает компонент в виде дрожжевого носителя и которая индуцирует иммунный ответ, достаточный для достижения по меньшей мере одной терапевтической пользы у индивидуума. Более конкретно, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей представляет собой композицию, которая включает компонент в виде дрожжевого носителя и может вызывать или индуцировать иммунный ответ, такой как клеточный иммунный ответ, включая, но не ограничиваясь этим, опосредуемый Т-клетками иммунный ответ. В одном из аспектов иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, пригодная для изобретения, способна индуцировать опосредуемый СЭ8' и/или СЭ4' Т-клетками иммунный ответ и в одном из аспектов опосредуемый СЭ8' и а СЭ4' Т-клетками иммунный ответ. Необязательно, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей способна индуцировать гуморальный иммунный ответ. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, пригодная для настоящего изобретения, может, например, индуцировать иммунный ответ у индивидуума, так чтобы индивидуум был защищен от инфекции ΗΒν и/или осуществлялось лечение инфекции ΗΒν или симптомов инфекции ΗΒν.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей по изобретению могут быть либо профилактическими, либо терапевтическими. Когда их предоставляют профилактически, композиции по настоящему изобретению предоставляют до возникновения какого-либо симптома инфекции ΗΒν. Такую композицию можно вводить при рождении, в раннем детском возрасте или взрослым. Профилактическое введение иммунотерапевтических композиций служит для профилактики последующей инфекции ΗΒν, для более быстрого или более полного разрешения инфекции, если инфекция ΗΒν возникает впоследствии, и/или для смягчения симптомов инфекции ΗΒν, если инфекция возникает впоследствии. При предоставлении терапевтически, иммунотерапевтические композиции предоставляют при или после возникновения инфекции ΗΒν с целью смягчения по меньшей мере одного симптома инфекции и, предпочтительно, с целью устранения инфекции, обеспечения длительной ремиссии инфекции и/или обеспечения длительного иммунитета против последующих инфекций или реактиваций вируса. В одном из аспектов целью лечения является устранение поддающейся выявлению вирусной нагрузки ΗΒν или снижение вирусной нагрузки ΗΒν (например, ниже поддающихся выявлению с помощью ПЦР уровней или <2000 МЕ/мл). В одном из аспектов целью лечения является непрерывный клиренс вируса в течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии. В одном из аспектов целью лечения является устранение подающихся выявлению сывороточных белков ΗΒеΑ§ и/или ΗΒκΑ§. В одном из аспектов целью лечения является развитие антител против поверхностного антигена вируса гепатита В (анти-ΗΒκ) и/или антител против ΗΒеΑ§. В одном из аспектов целью лечения является сероконверсия, которая может быть определена как: (а) 10 или более единиц соотношения в образцах (δΚυ) при определении радиоиммунным анализом; (Ь) положительный результат при определении с помощью ферментного иммуноанализа; или (с) выявление концентрации антитела >10 мМЕ/мл (10 δΚυ сравнимы с 10 мМЕ/мл антитела). В одном из аспектов целью лечения является нормализация сывороточных уровней аланинаминотрансферазы (АЬТ), смягчение воспаления печени и/или смягчение фиброза печени.
Как правило, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей включает дрожжевой носитель и по меньшей мере один антиген или его иммунногенный домен, экспрессируемые дрожжевым носителем, связанные или смешанные с ним, где антиген является гетерологичным для дрожжей, и где антиген содержит один или несколько антигенов ΗΒν или их иммуногенных доменов. В некоторых вариантах осуществления антиген или его иммуногенный домен предоставляют в качестве слитого белка.
- 65 028659
Несколько слитых белков НВУ, пригодных для применения в композициях и способах по изобретению, описаны выше. В одном из аспектов изобретения слитый белок может включать два или более антигенов. В одном из аспектов слитый белок может включать два или более иммуногенных домена одного или нескольких антигенов, или два или более эпитопа одного или нескольких антигенов.
В любой из иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, используемых в рамках настоящего изобретения, следующие аспекты, относящиеся к дрожжевому носителю, включены в изобретение. В соответствии с настоящим изобретением, дрожжевой носитель представляет собой любую дрожжевую клетку (например, целую или интактную клетку) или ее производное (см. ниже), которую можно использовать совместно с одним или несколькими антигенами, их иммуногенными доменами или их эпитопами в терапевтической композиции по изобретению, или в одном из аспектов дрожжевой носитель можно использовать отдельно или в качестве адъюванта. Таким образом, дрожжевой носитель может включать, но не ограничиваться ими, живой интактный (целый) дрожжевой микроорганизм (т.е. дрожжевую клетку, имеющую все ее компоненты, включая клеточную стенку), убитый (погибший) или инактивированный дрожжевой микроорганизм, или производные интактных/целых дрожжей, включающие: сферопласт дрожжей (т.е. дрожжевая клетка, лишенная клеточной стенки), цитопласт дрожжей (т.е. дрожжевая клетка, лишенная клеточной стенки и ядра), дрожжевую оболочку (т.е. дрожжевая клетка, лишенная клеточной стенки, ядра и цитоплазмы), субклеточный дрожжевой мембранный экстракт или его фракцию (также называемые дрожжевыми мембранными частицами и ранее субклеточной дрожжевой частицей), любую другую дрожжевую частицу или препарат клеточной стенки дрожжей.
Сферопласты дрожжей, как правило, получают ферментативным расщеплением клеточной стенки дрожжей. Такой способ описан, например, в ЕгагмноГГ е1 а1., 1991, Ме1Ь. Εηζутο1. 194, 662-674., включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Цитопласты дрожжей, как правило, получают энуклеацией клеток дрожжей. Такой способ описан, например, в Сооп, 1978, №·ιΐ1. Сапсег Ιη8ΐ. Моподг. 48, 45-55, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Дрожжевые оболочки, как правило, получают повторным уплотнением клетки, в которой увеличили проницаемость, или лизированной клетки, и они могут, но не должны, содержать по меньшей мере некоторые органеллы этой клетки. Такой способ описан, например, в ЕгагмноГГе1 а1., 1983, 1. Вю1. СЬет. 258, 3608-3614 и Ви88еу е1 а1., 1979, ВюсЫт. ВюрЬу8. Ас!а 553, 185-196, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Дрожжевая мембранная частица (субклеточный дрожжевой мембранный экстракт или его фракция) относится к дрожжевой мембране, которая лишена природного ядра или цитоплазмы. Частица может иметь любой размер, включая размеры в диапазоне от размера природной дрожжевой мембраны до микрочастиц, получаемых обработкой ультразвуком или другими способами разрушения мембран, известными специалистам в данной области, с последующим повторным уплотнение. Способ получения экстрактов субклеточных дрожжевых мембран описан, например, в ЕгагмноГГ е1 а1., 1991, Ме1Ь. Εηζутο1. 194, 662-674. Также можно использовать фракции мембранных частиц дрожжей, которые содержат части дрожжевых мембран и, когда антиген или другой белок экспрессировался рекомбинантно дрожжами перед получением дрожжевых мембранных частиц, антиген или другой представляющий интерес белок. Антигены или другие представляющие интерес белки могут содержаться внутри мембраны, на любой поверхности мембраны или их комбинациях (т. е. белок может быть как внутри, так и снаружи мембраны и/или он может проходить через мембрану дрожжевой мембранной частицы). В одном из вариантов осуществления дрожжевая мембранная частица представляет собой рекомбинантную дрожжевую мембранную частицу, которая может быть неизмененной, разрушенной или разрушенной и повторно уплотненной дрожжевой мембраной, которая включает по меньшей мере один желаемый антиген или другой представляющий интерес белок на поверхности мембраны или по меньшей мере частично погруженный в мембрану.
Примером препарата клеточной стенки дрожжей является препарат выделенных клеточных стенок дрожжей, содержащих антиген на их поверхности или по меньшей мере частично погруженных в клеточную стенку, так что препарат клеточной стенки дрожжей при введении животному стимулирует желаемый иммунный ответ против целевого заболевания.
Для получения дрожжевого носителя по настоящему изобретению можно использовать любой штамм дрожжей. Дрожжи представляют собой одноклеточные микроорганизмы, которые принадлежат одному из трех классов: А8сотусе!е8, Ва81Йютусе1е8 и Рипд1 ЬпрегГесЬ. Одним из факторов, учитываемых при выборе типа дрожжей для применения в качестве иммунного модулятора, является патогенность дрожжей. В одном из вариантов осуществления дрожжи представляют собой непатогенный штамм, такой как δассЬа^οтусе8 сегеу181ае. Выбор непатогенного штамма дрожжей минимизирует какиелибо неблагоприятные эффекты у индивидуума, которому вводят дрожжевой носитель. Однако можно использовать патогенные дрожжи, если патогенность дрожжей можно нейтрализовать любыми способами, известными специалисту в данной области (например, мутантные штаммы).
Роды штаммов дрожжей, которые можно использовать в рамках изобретения, включают, но не ограничиваются ими, δассЬа^οтусе8, СапйЫа, Сгур1ососси8, Нап8епи1а, К1иууеготусе8, РюЫа, КЬойо1оги1а,
- 66 028659
8сЫ/о8асскаготусе8 и ΥаπΌ\γ^а. В одном из аспектов роды дрожжей выбирают из 8асскаготусе8, СапФба, Нап8епи1а, РюЫа или 8сЫ/о5ассНаготусе5. и в одном из аспектов роды дрожжей выбирают из 8ассйаготусек, Нап8епи1а и РюЫа, и в одном из аспектов используют 8асскаготусе8. Виды штаммов дрожжей, которые можно использовать в рамках изобретения, включают, но не ограничиваются ими, 8ассйаготусек се1^181ае, 8асскаготусе8 саг18Ьегдеп818, СапбШа а1Ысап8, СапШба кеГуг, СапШба 1горюа118, Сгур!ососси8 1аигепШ, Сгур1ососси8 пеоГогтапк, Нап8епи1а апота1а, Нап8епи1а, Ро1утогрка, К1иу\'еготусе8 ГгадШ8, Κ1иуνе^οтусе8 1асЙ8, К1иу\'еготусе8 татапиз вариант 1асЙ8, РюЫа ра81ог18, Ккобо!оги1а гиЬга, 8сЫ/о5асскаготусе5 ротЬе и Υа^^ο\γ^а Нро1уйса. Должно быть понятно, что ряд этих видов включают различные подвиды, типы, подтипы и т.д., которые, как подразумевается, включены в упомянутые выше виды. В одном из аспектов виды дрожжей, используемые в изобретении, включают 8. се1^181ае, С. а1Ысапз, Н. ро1утогрка, Р. ра81оп8 и 8. ротЬе. 8. сеге\а81ае пригодны, поскольку ими относительно легко манипулировать и они являются общепризнанными безопасными или СКА8 для применения в качестве пищевых добавок (СКА8, предложенное РЭА Правило 62РК18938, 17 апреля 1997 года). Одним вариантом осуществления настоящего изобретения являются штамм дрожжей, который способен реплицировать плазмиды до особенно высокого количества копий, такой как штамм 8. сеге\а81ае си. Этот штамм 8. сеге\а81ае является одним из таких штаммов, которые способны поддерживать векторы экспрессии, которые позволяют экспрессию одного или нескольких антигена(ов)-мишени и/или антигенного слитого белка(ов), и/или других белков, подлежащих экспрессии на высоких уровнях. Кроме того, в рамках настоящего изобретения можно использовать любые мутантные штаммы дрожжей, включая штаммы дрожжей, которые проявляют сниженные посттрансляционные модификации экспрессируемых антигенов-мишеней или других белков, такие как мутации в ферментах, которые увеличивают ^связанное гликозилирование.
В большинстве вариантов осуществления изобретения иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей включает по меньшей мере один антиген, его иммуногенный домен или его эпитоп. Антигены, предусматриваемые для применения в рамках настоящего изобретения, включают любой антиген НВУ или его иммуногенный домен, включая мутанты, варианты и агонисты белков НВУ или их доменов, против которых желательно индуцировать иммунный ответ для профилактической или терапевтической иммунизации хозяина против инфекции НВУ. Антигены НВУ, которые пригодны в различных вариантах осуществления изобретения, подробно описаны выше.
Необязательно, белки, включая слитые белки, которые используют в качестве компонента иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по изобретению, получают с использованием конструкций, которые особенно пригодны для повышения или усиления экспресии или стабильности экспрессии рекомбинантных антигенов в дрожжах. Как правило, желаемый антигенный белок(белки) или пептид(ы) слиты на их Оконце с: (а) конкретным синтетическим пептидом, который стабилизирует экспрессию слитого белка в дрожжевом носителе или препятствует посттрансляционной модификации слитого белка (такие пептиды подробно описаны, например, в публикации патента США № 2004-0156858 А1, опубликованной 12 августа 2004, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме); (Ь) по меньшей мере частью эндогенного дрожжевого белка, включая, но не ограничиваясь ими, α-фактор, где партнер по слиянию обеспечивает увеличенную стабильность экспрессии белка в дрожжах и/или препятствует посттрансляционной модификации белков дрожжевыми клетками (такие белки также подробно описаны, например, в публикации патента США № 2004-0156858 А1, выше); и/или (с) по меньшей мере частью дрожжевого белка, которая вызывает экспрессию слитого белка на поверхности дрожжей (например, белок Ада, более подробно описанный в настоящем описании). Кроме того, настоящее изобретение необязательно относится к применению пептидов, которые слиты с С-концом кодирующей антиген конструкции, в частности для применения в выборе и идентификации белка. Такие пептиды включают, но не ограничиваются ими, любой синтетический или природный пептид, такой как пептидная метка (например, гексагистидин) или любая другая короткая эпитопная метка. Пептиды, связанные с С-концом антигена согласно изобретению, можно использовать с ^концевыми пептидами, рассмотренными выше, или без них.
В одном из вариантов осуществления синтетический пептид, пригодный в слитом белке, связан с N концом антигена, причем пептид состоит по меньшей мере из двух аминокислотных остатков, которые являются гетерологичными для антигена, где пептид стабилизирует экспрессию слитого белка в дрожжевом носителе или препятствует посттрансляционной модификации экспрессированного слитого белка. Синтетический пептид и ^концевая часть антигена вместе образуют слитый белок, который удовлетворяет следующим требованиям: (1) аминокислотный остаток в первом положении слитого белка представляет собой метионин (т.е. первая аминокислота в синтетическом пептиде представляет собой метионин); (2) аминокислотный остаток во втором положении слитого белка не является глицином или пролином (т.е. вторая аминокислота в синтетическом пептиде не является глицином или пролином); (3) ни один из аминокислотных остатков в положениях 2-6 слитого белка не является метионином (т.е. аминокислоты в положениях 2-6, являющиеся частью синтетического пептида или белка, если синтетический пептид короче 6 аминокислот, не включают метионин); и (4) ни одна из аминокислот в положениях 2-6 слитого белка не является лизином или аргинином (т.е. аминокислоты в положениях 2-6, являющиеся
- 67 028659 частью синтетического пептида или белка, если синтетический пептид короче 5 аминокислот, не включают лизин или аргинин). Синтетический пептид может иметь длину только две аминокислоты, однако в одном из аспектов он составляет 2-6 аминокислот (включая 3, 4, 5 аминокислот) и он может быть длинней 6 аминокислот, в целых числах, вплоть до приблизительно 200 аминокислот, 300 аминокислот, 400 аминокислот, 500 аминокислот или более.
В одном из вариантов осуществления слитый белок содержит аминокислотную последовательность М-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6, где М представляет собой метионин; где Х2 представляет собой любую аминокислоту, за исключением глицина, пролина, лизина или аргинина; где Х3 представляет собой любую аминокислоту, за исключением метионина, лизина или аргинина; где Х4 представляет собой любую аминокислоту, за исключением метионина, лизина или аргинина; где Х5 представляет собой любую аминокислоту, за исключением метионина, лизина или аргинина; и где Х6 представляет собой любую аминокислоту, за исключением метионина, лизина или аргинина. В одном из вариантов осуществления остаток Х6 представляет собой пролин. Иллюстративная синтетическая последовательность, которая повышает стабильность экспрессии антигена в дрожжевой клетке и/или препятствует посттрансляционной модификации белка в дрожжах, включает последовательность М-А-Э-Е-А-Р (ЗЕЦ ГО N0:37). Другой иллюстративной синтетической последовательностью с теми же свойствами является М-У. В дополнение к увеличенной стабильности продукта экспрессии, эти партнеры по слиянию, по-видимому, не оказывают отрицательного влияния на иммунный ответ против иммунизирующего антигена в конструкции. Кроме того, синтетические слитые пептиды можно конструировать для обеспечения эпитопа, который может распознаваться селектирующим агентом, таким как антитело.
В одном из вариантов осуществления антиген НВУ связан на Ν-конце с дрожжевым белком, таким как препропоследовательность α-фактора (также обозначаемая как сигнальная лидерная последовательность α-фактора, аминокислотная последовательность которой проиллюстрирована в настоящем описании посредством ЗЕЦ ГО N0:89 или ЗЕЦ ГО N0:90. Другие последовательности для препропоследовательности α-фактора дрожжей известны в данной области, и их применение охватывается настоящим изобретением.
В одном из аспектов изобретения дрожжевой носитель подвергают обработке так, чтобы антиген экспрессировался или обеспечивался путем доставки или перемещения экспрессированного белкового продукта, частично или полностью, на поверхности дрожжевого носителя (внеклеточная экспрессия). Одним способом осуществления этого аспекта изобретения является применение спейсера для помещения одного или нескольких белка(ов) на поверхности дрожжевого носителя. Например, можно использовать спейсер для создания слитого белка из антигена(ов) или другого представляющего интерес белка, который нацеливает антиген(ы) или другой представляющий интерес белок на клеточную стенку дрожжей. Например, одним таким белком, который можно использовать для нацеливания на другие белки, является дрожжевой белок (например, белок клеточной стенки 2 (сетр2), белок Ада2, Ри4 или Р1о1), который обеспечивает нацеливание антигена(ов) или другого белка к клеточной стенке дрожжей, чтобы антиген или другой белок были расположены на поверхности дрожжей. Для спейсера можно использовать белки, отличные от дрожжевых белков; однако для любого спейсера наиболее желательным является наличие иммуногенного ответа, направленного против антигена-мишени, а не против спейсерного белка. По существу, если для спейсера использовать другие белки, тогда спейсерный белок, который используют, не должен генерировать такой значительный иммунный ответ на сам спейсерный белок, так чтобы преобладал иммунный ответ на антиген(ы)-мишень. Специалист в данной области должен стремиться к незначительному иммунному ответу на спейсерный белок относительно иммунного ответа на антиген(ы)-мишень. Спейсер можно конструировать так, чтобы он имел участки расщепления (например, участки расщепления протеазой), которые позволяют легкое удаление или процессинг антигена из дрожжей, если желательно. Можно использовать любой известный способ определения величины иммунного ответа (например, продукция антител, литические анализы и т. д.), и они хорошо известны специалисту в данной области.
Другим способом помещения антигена(ов)-мишени или других белков на поверхность дрожжей является использование сигнальных последовательностей, таких как гликозилфосфатидилинозитол (ОР^, для заякоривания мишени на клеточной стенке дрожжей. Альтернативно помещение можно проводить путем присоединения сигнальных последовательностей, которые направляют антиген(ы) или другие представляющие интерес белки на секреторный путь через перемещение в эндоплазматическую сеть (ЕК), так чтобы антиген связывался с белком, который связан с клеточной стенкой (например, стер).
В одном из аспектов спейсерный белок представляет собой белок дрожжей. Белок дрожжей может состоять из от приблизительно двух до приблизительно 800 аминокислот дрожжевого белка. В одном из вариантов осуществления дрожжевой белок составляет приблизительно от 10 до 700 аминокислот. В другом варианте осуществления дрожжевой белок составляет приблизительно от 40 до 600 аминокислот. Другие варианты осуществления изобретения включают дрожжевой белок, составляющий по меньшей мере 250 аминокислот, по меньшей мере 300 аминокислот, по меньшей мере 350 аминокислот, по меньшей мере 400 аминокислот, по меньшей мере 450 аминокислот, по меньшей мере 500 аминокислот, по
- 68 028659 меньшей мере 550 аминокислот, по меньшей мере 600 аминокислот или по меньшей мере 650 аминокислот. В одном из вариантов осуществления дрожжевой белок имеет длину по меньшей мере 450 аминокислот. Другим фактором, учитываемым для оптимизации экспрессии антигена на поверхности, если она является желательной, является то, должна ли комбинация антигена и спейсера экспресироваться в качестве мономера или в качестве димера или в качестве тримера, или еще большего количества элементов, связанных вместе. Это применение мономеров, димеров, тримеров и т. д. обеспечивает надлежащее расположение в пространстве и сворачивание антигена, так чтобы некоторая часть антигена, или весь антиген, экспонировалась на поверхности дрожжевого носителя так, чтобы он был более иммуногенным.
Применение дрожжевых белков может стабилизировать экспрессию слитых белок в дрожжевом носителе, препятствует посттрансляционной модификации экспрессированного слитого белка и/или нацеливает слитый белок в конкретный компартмент у дрожжей (например, для экспрессии на клеточной поверхности дрожжей). Для доставки на секреторный путь дрожжей иллюстративные белки для применения включают, но не ограничиваются ими: Ада (включая, но не ограничиваясь ими, Ада1 и/или Ада2); 8иС2 (инвертаза дрожжей); сигнальную лидерную последовательность α-фактора; СРУ; С\\р2р вследствие его локализации и удержания на клеточной стенке; гены ВиЭ вследствие локализации на почке дрожжевой клетки в ходе первоначальной фазы образования дочерней клетки; Р1о1р; Р1г2р и Р1г4р.
Можно использовать другие последовательности для нацеливания, удержания и/или стабилизации белка в других частях дрожжевого носителя, например в цитозоле или митохондриях или эндоплазматической сети или ядре. Примеры подходящего дрожжевого белка, который можно использовать для любого из описанных выше вариантов осуществления, включают, но не ограничиваются ими, продукты генов ТК, АР, 8ЕС7; фосфоенолпируваткарбоксикиназу РСК1, фосфоглицерокиназу РОК и триозофосфатизомеразы ТР1 вследствие репрессии их экспрессии при наличии глюкозы и локализации в цитозоле; белки теплового шока 88А1, 88А3, 88А4, 88С1, экспрессия которых индуцируется и которые являются более термостабильными при воздействии на клетки тепловой обработки; митохондриальный белок СУС1 для импорта в митохондрии; АСТ1.
Способы получения дрожжевых носителей и экспрессии, комбинирования и/или связывания дрожжевых носителей с антигенами и/или другими представляющими интерес белками и/или агентами для получения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, охватываются изобретением.
В соответствии с настоящим изобретением, термин комплекс дрожжевой носитель-антиген комплекс или комплекс дрожжи-антиген используют, главным образом, для описания любой связи дрожжевого носителя с антигеном и его можно использовать взаимозаменяемо с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, когда такую композицию используют для индукции иммунного ответа, как описано выше. Такая связь включает экспрессию антигена дрожжами (рекомбинантные дрожжи), введение антигена в дрожжи, физическое связывание антигена с дрожжами и смешение дрожжей и антигена вместе, как, например, в буфере или другом растворе или составе. Эти типы комплексов подробно описаны ниже.
В одном из вариантов осуществления клетку дрожжей, используемую для получения дрожжевого носителя, трансфицируют гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок (например, антиген) так чтобы белок экспрессировался клеткой дрожжей. Такие дрожжи также обозначаются в настоящем описании как рекомбинантные дрожжи или рекомбинантный дрожжевой носитель. Затем клеткой дрожжей можно нагружать дендритную клетку в качестве интактной клетки или дрожжевую клетку можно убивать, или ее можно преобразовать, например, путем образования дрожжевых сферопластов, цитопластов, оболочек или субклеточных частиц, после чего в любом случае следует нагрузка производным дендритной клетки. Сферопласты дрожжей также можно прямо трансфицировать рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты (например, сферопласт получают из целых дрожжей, а затем трансфицируют) для получения рекомбинантного сферопласта, который экспрессирует антиген или другой белок.
Как правило, дрожжевой носитель и антиген(ы) и/или другие агенты можно связать любым способом, описанным в настоящем описании. В одном из аспектов дрожжевой носитель нагружен внутриклеточно антигеном(ами) и/или агентом(ами). В другом аспекте антиген(ы) и/или агент(ы) ковалентно или нековалентно связан с дрожжевым носителем. В другом аспекте дрожжевой носитель и антиген(ы) и/или агент(ы) связаны путем смешения. В другом аспекте и в одном из вариантов осуществления антиген(ы) и/или агент(ы) экспрессируются рекомбинантно дрожжевым носителем или дрожжевой клеткой или дрожжевым сферопластом, из которых происходит дрожжевой носитель.
Количество антигенов и/или других белков, подлежащих продуцированию дрожжевым носителем по настоящему изобретению, представляет собой любое количество антигенов и/или других белков, которые могут в разумных пределах продуцироваться дрожжевым носителем, и, как правило, оно находится в диапазоне от по меньшей мере одного до по меньшей мере приблизительно 6 или более, включая от приблизительно 2 до приблизительно 6 гетерологичных антигенов и/или других белков.
Экспрессию антигена или другого белка в дрожжевом носителе по настоящему изобретению проводят с использованием способов, известных специалистам в данной области. В кратком изложении, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один желаемый антиген или другой белок,
- 69 028659 встраивают в вектор экспрессии так, чтобы молекула нуклеиновой кислоты была функционально связана с последовательностью контроля транскрипции для того, чтобы она была способна осуществлять либо конститутивную, либо регулируемую экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты после трансформации в дрожжевую клетку хозяина. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие один или несколько антигенов и/или других белков, могут представлять собой один или несколько векторов экспрессии, функционально связанных с одной или несколькими последовательностями контроля экспрессии. Особенно важными последовательностями контроля экспрессии являются последовательности, которые контролируют инициацию экспрессии, такие как промоторы и вышележащие активирующие последовательности. В рамках настоящего изобретения можно использовать любой подходящий дрожжевой промотор и множество таких промоторов известно специалистам в данной области. Промоторы для экспрессии в 3ассйаготусек сегеу151ае включают, но не ограничиваются ими, промоторы генов, кодирующих следующие дрожжевые белки: алкогольдегидрогеназа I (АЭН1) или II (АЭН2), СИР1, фосфоглицераткиназа (РОК), триозофосфатизомераза (ТР) трансляционный фактор элонгации ЕР-1а (ТЕР2), глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа (ОАРИН; также обозначаемая как ТИН3 по триозофосфатдегидрогеназе), галактокиназа (ОАЬ1), галактоза-1-фосфатуридилтрансфераза (ОАЬ7), иИР-галактозоэпимираза (ОАЬ10), цитохром с1 (СУС1), белок 3ес7 (3ЕС7) и кислая фосфатаза (РН05), включая гибридные промоторы, такие как промоторы АИЮ/ОАРИН и СУС1/ОАЫ0, и включая промотор АОН2/ОАРОН. который индуцируется, когда концентрации глюкозы в клетке являются низкими (например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,2 процента), а также промотор СИР1 и промотор ТЕР2. Аналогично, известен ряд вышележащих активирующих последовательностей (ИА3), также называемых энхансерами. Вышележащие активирующие последовательности для экспрессии в 3ассйаготусек сегеу151ае включают, но не ограничиваются ими, ИА3 генов, кодирующих следующие белки: РСК1, ТРЕ ТИН3, СУС1, АЭН1, АЭН2, 3ИС2, ОАЬ1, ОАЬ7 и ОАЬ10, а также другие ИА3, активируемые продуктом гена ОАЬ4, причем в одном из аспектов используют ИА3 АЭН2. Поскольку ИА3 АЭН2 активируется продуктом гена АЭК1, может быть предпочтительной сверхэкспрессия гена АЭК1, когда гетерологичный ген функционально связан с ИА3 АЭН2. Последовательности терминации транскрипции для экспрессии в 3ассйаготусек сегеу151ае включают последовательности терминации генов афактора, ОАРИН и СУС1.
Последовательности контроля транскрипции для экспрессии генов в метилотрофных дрожжах включают области контроля транскрипции генов, кодирующих алкогольоксидазу и формиатдегидрогеназу.
Трансфекцию молекулы нуклеиновой кислоты в дрожжевую клетку в соответствии с настоящим изобретением можно проводить любым способом, посредством которого молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в клетку, и он включает, но не ограничивается ими, диффузию, активный транспорт, обработку ультразвуком в ванне, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию и слияние протопластов. Трансфицированные молекулы нуклеиновых кислот могут встраиваться в хромосомы дрожжей или оставаться на внехромосомных векторах с использованием способов, известных специалистам в данной области. Примеры дрожжевых носителей, несущих такие молекулы нуклеиновых кислот, подробно описаны в настоящем описании. Как рассмотрено выше, дрожжевой цитопласт, дрожжевую оболочку и дрожжевые мембранные частицы или препараты клеточной стенки также можно получать рекомбинантными способами путем трансфекции неизмененных дрожжевых микроорганизмов или дрожжевых сферопластов желаемыми молекулами нуклеиновых кислот, продуцирования в них антигена, а затем дальнейшего манипулирования микроорганизмам и/или сферопластами с использованием способов, известных специалистам в данной области, с получением цитопласта, оболочки или субклеточной дрожжевой мембраны или их фракций, содержащих желаемые антигены или другие белки.
Эффективные условия для получения рекомбинантных дрожжевых носителей и экспрессии антигена и/или другого белка дрожжевым носителем включают эффективную среду, в которой можно культивировать штамм дрожжей. Эффективная среда, как правило, представляет собой водную среду, содержащую источники усвояемых углеводов, азота и фосфора, а также соответствующие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины и факторы роста. Среда может содержать комплексные питательные вещества или она может представлять собой минимальную среду с определенным составом. Штаммы дрожжей по настоящему изобретению можно культивировать в различных контейнерах, включая, но не ограничиваясь ими, биореакторы, колбы Эрленмейера, пробирки, микротитровальные чашки, и чашки Петри. Культивирование проводят при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для дрожжевого штамма. Такие условия культивирования находятся в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, ОшНпе е1 а1. (ебк.), 1991, Мебюбк ίη Еп/уто1оду, уо1. 194, Асабетю Ргекк, 3ап И1едо).
В некоторых вариантах осуществления изобретения дрожжи выращивают в условиях нейтральных значений рН. Как используют в рамках изобретения, общее применение термина нейтральные значения рН относится к диапазону рН от приблизительно рН 5,5 до приблизительно рН 8, и в одном из аспектов
- 70 028659 от приблизительно рН 6 до приблизительно 8. Специалисту в данной области будет понятно, что могут возникать небольшие отклонения (например, на десятые или сотые доли) при измерении с помощью рНметра. По существу, применение нейтральных значений рН для выращивания клеток дрожжей означает, что клетки дрожжей выращивают в нейтральных значениях рН в течение наибольшего периода времени, когда они находятся в культуре. В одном из вариантов осуществления дрожжи выращивают в среде, поддерживаемой при уровне рН по меньшей мере 5,5 (т.е. рН культуральной среды не позволяют снижаться ниже рН 5,5). В другом аспекте дрожжи выращивают при уровне рН приблизительно 6, 6,5, 7, 7,5 или 8. Применение нейтральных значений рН при культивировании дрожжей обеспечивает несколько биологических эффектов, которые являются желательными характеристиками для применения дрожжей в качестве носителей для иммунизации. Например, культивирование дрожжей в нейтральных значениях рН обеспечивает хороший рост дрожжей без отрицательного эффекта на время образования клеток (например, замедление времени удвоения). Дрожжи могут продолжать расти до высоких плотностей без потери их пластичности клеточной стенки. Применение нейтральных значений рН позволяет получение дрожжей с пластичными клеточными стенками и/или дрожжей, которые являются более чувствительными к ферментам, расщепляющим клеточную стенку (например, глюканазам) при всех плотностях сбора. Этот признак является желательным, поскольку дрожжи с пластичными клеточными стенками могут индуцировать отличающиеся и улучшенные иммунные ответы по сравнению с дрожжами, выращиваемыми в более кислотных условиях, например, путем обеспечения секреции цитокинов антигенпредставляющими клетками, которые фагоцитировали дрожжи (например, цитокины ТН1-типа, включающие, но не ограничивающиеся ими, ΙΡΝ-γ, интерлейкин-12 (ΙΠ-12) и ΙΡ-2, а также провоспалительные цитокины, такие как ГЬ-6). Кроме того, такие способы культивирования обеспечивают более высокую доступность антигенов, расположенных на клеточной стенке. В другом аспекте использование нейтральных значений рН для некоторых антигенов позволяет высвобождение связанного дисульфидной связью антигена путем обработки дитиотреитолом (ΌΤΤ), которая невозможна, когда такие экспрессирующие антиген дрожжи культивируют в среде с более низким значением рН (например, рН 5).
В одном из вариантов осуществления контроль уровня гликозилирования у дрожжей используют для контроля экспрессии антигена дрожжами, в частности, на поверхности. Уровень гликозилирования у дрожжей может влиять на иммуногенность и антигенность антигена, экспрессируемого на поверхности, поскольку части сахаров имеют тенденцию к тому, чтобы быть объемными. По существу, существование частей сахаров на поверхности дрожжей и их влияние на трехмерное пространство вокруг антигена(ов)мишени следует учитывать при модулировании дрожжей согласно изобретению. Любой способ можно использовать для уменьшения уровня гликозилирования у дрожжей (или увеличения его, если желательно). Например, можно использовать мутантный штамм дрожжей, который отобран так, чтобы он имел низкий уровень гликозилирования (например, мутанты тпШ, осЬ1 и тпГО), или можно путем мутации устранять акцепторные последовательности гликозилирования на антигене-мишени.
Альтернативно, можно использовать дрожжи с уменьшенными профилями гликозилирования, например ΡΛ1ιί;·ι. Также можно обрабатывать дрожжи с использованием способов, которые снижают или изменяют гликозилирование.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве альтернативы рекомбенантной экспрессии антигена или другого белка в дрожжевом носителе, дрожжевой носитель внутриклеточно нагружают белком, или пептидом, или углеводами или другими молекулами, которые служат в качестве антигена и/или пригодны в качестве иммуномодулирующих средств или модификаторов биологического ответа согласно изобретению. Затем дрожжевой носитель, который содержит антиген и/или другие белки внутриклеточно, можно вводить индивидууму, или им можно нагружать носитель, такой как дендритная клетка. Пептиды и белки можно прямо вводить в дрожжевые носители по настоящему изобретению способами, известными специалистам в данной области, такими как диффузия, активный транспорт, слияние липосом, электропорация, фагоцитоз, циклы замораживания-размораживания и обработка ультразвуком в ванне. Дрожжевые носители, которые можно прямо нагружать пептидами, белками, углеводами или другими молекулами, включают неизмененные дрожжи, а также сферопласты, оболочки или цитопласты, которые можно нагружать антигенами и другими агентами после их продуцирования. Альтернативно неизмененные дрожжи можно нагружать антигеном и/или агентом, а затем сферопластами, оболочками, цитопластами, или из них можно получать субклеточные частицы. В этом варианте осуществления дрожжевой носитель можно нагружать любым количеством антигенов и/или других средств, от по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или любого целого числа вплоть до сотен или тысяч антигенов и/или других агентов, например, как может быть обеспечено нагрузкой микроорганизма или его частей.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антиген и/или другой агент физически связывают с дрожжевым носителем. Физическое связывание антигена и/или другого агента с дрожжевым носителем можно проводить любым способом, подходящим в данной области, включая способы ковалентного и нековалентного связывания, которые включают, но не ограничиваются ими, химическое сшивание антигена и/или другого агента с наружной поверхностью дрожжевого носителя или биологическое связывание антигена и/или другого агента с наружной поверхностью дрожжевого носителя, как, например, с использованием антитела или другого партнера по связыванию. Химического сшивания можно
- 71 028659 достигать, например, способами, включающими связывание через глутаральдегидную связь, фотоаффинное мечение, обработку карбодиимидами, обработку химическими веществами, способными образовывать дисульфидные связи, и обработку другими сшивающими химическими веществами, являющимися стандартными в данной области. Альтернативно, химическое вещество можно приводить в контакт с дрожжевым носителем, который изменяет заряд липидного бислоя дрожжевой мембраны или композицию клеточной стенки так, чтобы наружная поверхность дрожжей с большей вероятностью подвергалась слиянию или связывалась с антигенами и/или другим средством, имеющим конкретные зарядовые характеристики. Нацеливающие агенты, такие как антитела, связывающие пептиды, растворимые рецепторы и другие лиганды, также можно включать в антиген в качестве слитого белка или иным образом связанными с антигеном, для связывания антигена с дрожжевым носителем.
Когда антиген или другой белок экспрессируют или физически связывают с поверхностью дрожжей, в одном из аспектов спейсер можно тщательно выбирать так, чтобы оптимизировать экспрессию антигена или другого белка, или содержимое на поверхности. Размер спейсера(ов) может влиять на то, сколько антигена или другого белка будет экспонировано для связывания на поверхности дрожжей. Таким образом, в зависимости от того, какой антиген(ы) или другой белок(белки) используют, специалист в данной области будет выбирать спейсер, который обеспечивает соответствующее расположение в пространстве антигена или другого белка на поверхности дрожжей. В одном из вариантов осуществления спейсер представляет собой дрожжевой белок по меньшей мере из 450 аминокислот. Спейсеры подробно рассмотрены выше.
В другом варианте осуществления дрожжевой носитель и антиген или другой белок связаны друг с другом с помощью более пассивного, неспецифического или нековалентного механизма связывания, как например, путем осторожного смешения дрожжевого носителя и антигена или другого белка вместе в буфере или другом подходящем составе (например, смеси).
В одном из вариантов осуществления изобретения обоими из дрожжевого носителя и антигена или другого белка нагружают внутриклеточно носитель, такой как дендритная клетка или макрофаг, с получением терапевтической композиции или вакцины по настоящему изобретению. Альтернативно, антигеном или другим белком можно нагружать дендритную клетку в отсутствие дрожжевого носителя.
В одном из вариантов осуществления интактные дрожжи (с экспрессией гетерологичных антигенов или других белков или без нее) можно группировать или обрабатывать так, чтобы получать препараты клеточной стенки дрожжей, дрожжевые мембранные частицы или дрожжевые фрагменты (т. е. не являющиеся неизмененными) и в некоторых вариантах осуществления фрагменты дрожжей могут быть предоставлены или могут вводиться с другими композициями, которые включают антигены (например, ДНК-вакцины, белковые субъединичные вакцины, убитые или инактивированные патогены) для усиления иммунных ответов. Например, можно использовать ферментативную обработку, химическую обработку или физическую силу (например, механическое усилие сдвига или обработку ультразвуком) для разрушения дрожжей на части, которые используют в качестве адъюванта.
В одном из вариантов осуществления изобретения дрожжевые носители, подходящие в рамках настоящего изобретения, включают дрожжевые носители, которые являются убитыми или инактивированными. Обеспечение гибели или инактивацию дрожжей можно проводить любым из различных подходящих способов, известных в данной области. Например, инактивация дрожжей нагреванием является стандартным путем инактивации дрожжей, и специалист в данной области может осуществлять мониторинг структурных изменений антигена-мишени, если желательно, стандартными способами, известными в данной области. Альтернативно, можно использовать другие способы инактивации дрожжей, такие как химические, электрические, радиоактивные или УФ-способы. См., например, методологию, описанную в стандартных справочниках по культивированию, таких как Ме!йобк оГ Еп7уто1оду, Уо1. 194, Со1б 8ргш§ НагЪог РиЪйкЫпд (1990). При любой используемой стратегии инактивации следует учитывать вторичную, третичную или четвертичную структуру антигена-мишени и сохранять такую структуру, чтобы оптимизировать ее иммуногенность.
Дрожжевые носители можно составлять в иммунотерапевтические композиции или продукты на основе дрожжей по настоящему изобретению, включая препараты для введения индивидууму прямо или для первоначальной нагрузки ими носителя, такого как дендритная клетка, с использованием ряда способов, известных специалистам в данной области. Например, дрожжевые носители можно сушить лиофилизацией. Составы, содержащие дрожжевые носители, также можно получать путем упаковывания дрожжей в выпечку или таблетку, как, например, проводят для дрожжей, используемых в выпекании или пивоварении. Кроме того, дрожжевые носители можно смешивать с фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как изотонический буфер, который является переносимым для хозяина или клеткихозяина. Примеры таких эксципиентов включают воду, солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы. Также можно использовать неводные носители, такие как жирные масла, кунжутное масло, этилолеат или триглицериды. Другие подходящие составы включают суспензии, содержащие увеличивающие вязкость средства, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит, глицерин или декстран. Эксципиенты также могут содержать небольшие количества добавок, таких как вещества, которые увеличивают изото- 72 028659 ничность и химическую стабильность. Примеры буферов включают фосфатный буфер, бикарбонатный буфер и Тпз-буфер, в то время как примеры консервантов включают тимеросал, м- или о-крезол, формалин и бензиловый спирт. Стандартные составы могут представлять собой либо жидкие инъецируемые составы, либо твердые вещества, которые могут быть добавлены в подходящую жидкость, такую как суспензия или раствор для инъекции. Таким образом, в нежидком составе, эксципиент может содержать, например декстрозу, сывороточный альбумин человека и/или консерванты, к которым можно добавлять стерильную воду или солевой раствор перед введением.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция может включать дополнительные средства, которые также могут называться соединениями, модифицирующими биологический ответ, или способна продуцировать такие средства/модификторы. Например, дрожжевой носитель можно трансфицировать или нагружать по меньшей мере одним антигеном и по меньшей мере одним средством/соединением, модифицирующим биологический ответ, или композицию по изобретению можно вводить вместе по меньшей мере с одним средством/модификатором биологического ответа. Модификаторы биологического ответа включают адъюванты и другие соединения, которые могут модулировать иммунные ответы, которые могут называться иммуномодулирующими соединениями, а также соединения, которые модифицируют биологическую активность другого соединения или средства, такие как иммунотерапевтические средства на основе дрожжей, причем такая биологическая активность не ограничивается эффектами на иммунную систему. Определенные иммуномодулирующие соединения могут стимулировать защитный иммунный ответ, в то время как другие могут подавлять вредоносный иммунный ответ, и то, пригодно ли иммуномодулирующее средство в комбинации с данным иммунотерапевтическим средством на основе дрожжей, может зависеть, по меньшей мере частично, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, или профилактики, и/или от индивидуума, подлежащего лечению. Определенные модификаторы биологического ответа предпочтительно усиливают клеточноопосредуемый иммунный ответ, в то время как другие предпочтительно усиливают гуморальный иммунный ответ (т.е. могут стимулировать иммунный ответ, в котором имеется увеличенный уровень клеточно-опосредуемого иммунитета по сравнению с гуморальным, или наоборот). Определенные модификаторы биологического ответа имеют одно или несколько общих свойств с биологическими свойствами иммунотерапевтических средств на основе дрожжей или усиливают или дополняют биологические свойства иммунотерапевтических средств на основе дрожжей. Существует ряд способов, известных специалистам в данной области, для измерения стимуляции или подавления иммунных ответов, а также для отличия клеточно-опосредуемых иммунных ответов от гуморальных иммунных ответов, и для отличия одного типа клеточно-опосредуемого ответа от другого (например, ответ ТН17 против ответа ТН1).
Средства/модификаторы биологического ответа, подходящие в рамках изобретения, могут включать, но не ограничиваться ими, цитокины, хемокины, гормоны, липидные производные, пептиды, белки, полисахариды, низкомолекулярные лекарственные средства, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты (включая, но не ограничиваясь ими, антитела против цитокинов, антитела против рецепторов цитокинов, антитела против хемокинов), витамины, полинуклеотиды, связывающиеся части нуклеиновых кислот, аптамеры и модуляторы роста. Некоторые подходящие средства включают, но не ограничиваются ими, ГЬ-1 или агонисты ГЬ-1 или ГЬ-1К, антитела против ГЬ-1 или другие антагонисты ГЬ-1; ГЬ-6 или агонисты ГЬ-6 или ГЬ-6К, антитела против ГЬ-6 или другие антагонисты ГЬ-6; ГЬ-12 или агонисты ГЬ-12 или ГЬ-12К, антитела против Ι6-12 или другие антагонисты ГЬ-12; Ι6-17 или агонисты Ι6-17 или ГЬ-17К, антитела Ι6-17 или другие антагонисты ГЬ-17; ГЬ-21 или агонисты ГЬ-21 или ГЬ-21К, антитела против ГЬ21 или другие антагонисты ГЬ-21; ГЬ-22 или агонисты ГЬ-22 или ГЬ-22К, антитела против ГЬ-22 или другие антагонисты ГЬ-22; ГЬ-23 или агонисты ГЬ-23 или ГЬ-23К, антитела против ГЬ-23 или другие антагонисты ГЬ-23; ГЬ-25 или агонисты ГЬ-25 или ГЬ-25К, антитела против ГЬ-25 или другие антагонисты Ι6-25; ГЬ-27 или агонисты Ι6-27 или ГЬ-27К, антитела против Ι6-27 или другие антагонисты ГЬ-27; интерферон типа Ι (включая ШИ-а) или агонисты или антагонисты интерферона типа Ι или его рецептора; интерферон типа ΙΙ (включая ШИ-у) или агонисты или антагонисты интерферона типа ΙΙ или его рецептора; антитело против ί'Ό40. СО40Б. антитело против СТЬА-4 (например, для высвобождения анергических Тклеток); костимуляторы Т-клеток (например, антитело против СЭ137, антитело против СЭ28, антитело против ί'Ό40); алемтузумаб (например, Сатра!Н®), денилейкин дифтитокс (например, 0ЭТАК®); антитело против СЭ4; антитело против СЭ25; антитело против ΡΌ-1, антитело против ΡΌ-Ы, антитело против ΡΌ-Ε2; средства, которые блокируют Р0ХР3 (например, устраняют активность/уничтожают ί'Ό4'/ί'Ό25' Т-регуляторные клетки); Р1!3-лиганд, имиквимод (А1бага™), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С'ЪР); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Ο^δΡ), сарграмостим (Ьеикте®); гормоны, включающие, но не ограничивающиеся ими, пролактин и гормон роста; агониситы То11-подобного рецептора (ТЬК), включая, но не ограничиваясь ими, агонисты ТЬК-2, агонисты ТЬК-4, агонисты ТЬК-7 и агонисты ТЬК-9; антагонисты ТЬК, включая, но не ограничиваясь ими, антагонисты ТЬК-2, антагонисты ТЬК-4, антагонисты ТЬК-7 и антагонисты ТЬК-9; противовоспалительные средства и иммуномодуляторы, включая, но не ограничиваясь ими, ингибиторы СОХ-2 (например, целекоксиб, NδΑI^δ), глюкокортикоиды, статины, и талидомид и его аналоги, вклю- 73 028659 чая ΙΜίΌ™δ (которые являются структурными и функциональными аналогами талидомида (например, КЕУЫМГО® (леналидомид), АСТ1МГО® (помалидомид)); провоспалительные средства, такие как грибковые или бактериальные компоненты или любой провоспалительный цитокин или хемокин; иммунотерапевтические вакцины, включая, но не ограничиваясь ими, вирусные вакцины, бактериальные вакцины или антительные вакцины; и любые другие иммуномодуляторы, усилители иммунной системы, противовоспалительные средства и/или провоспалительные средства. Изобретение предусматривает любую комбинацию таких средств, и любое из таких средств, комбинированное или вводимое в протоколе (например, одновременно, последовательно или в других форматах) с иммунотерапевтическим средством на основе дрожжей, является композицией, охватываемой изобретением. Такие средства хорошо известны в данной области. Эти средства можно использовать отдельно или в комбинации с другими средствами, описанными в настоящем описании.
Средства могут включать агонисты и антагонисты данного белка или пептида или их домена. Как используют в рамках изобретения, агонист представляет собой любое соединение или средство, включая, но не ограничиваясь ими, низкомолекулярные соединения, белки, пептиды, антитела, средства, связывающие нуклеиновые кислоты и т.д., которые связываются с рецептором или лигандом и обеспечивают или запускают ответ, которое может включать средства, которые имитируют действие природного вещества, которое связывается с рецептором или лигандом. Антагонист представляет собой любое соединение или средство, включая, но не ограничиваясь ими, низкомолекулярные соединения, белки, пептиды, антитела, средства, связывающие нуклеиновые кислоты, и т.д., которые блокируют или ингибируют или снижают действие агониста.
Композиции по изобретению, кроме того, могут включать или их можно вводить с (одновременно, последовательно или поочередно) любыми другими соединениями или композициями, которые пригодны для профилактики или лечения инфекции НВУ, или с любыми соединениями, которые могут лечить или смягчать любой симптом инфекции НВУ. Известны различные средства, подходящие для профилактики и/или лечения или смягчения инфекции НВУ. Такие средства включают, но не ограничиваются ими, противовирусные соединения, включая, но не ограничиваясь ими, ингибитор обратной транскриптазы на основе нуклеотидного аналога (пКТ1). В одном из аспектов изобретения, подходящие противовирусные соединения включают, но не ограничиваются ими: тенофовир (УЖЕЛИ®), ламивудин (ЕР1У1К®), адефовир (НЕР8ЕКА®), телбивудин (ТУ2ЕКА®), энтекавир (ВАКАСЬиИЕ®) и их комбинации, и/или интерфероны, такие как интерферон-а2а или пегилированный интерферон-а2а (РЕОА8Υ8®) или интерферон-Х. Эти средства, как правило, вводят в течение длительных периодов времени (например, раз в сутки или раз в неделю в течение вплоть до от одного до пяти лет или более). Кроме того, композиции по изобретению можно использовать вместе с другими иммунотерапевтическими композициями, включая профилактическую и/или терапевтическую иммунотерапию. Например, профилактические вакцины от НВУ коммерчески доступны с ранних 1980 годов. Эти коммерческие вакцины представляют собой неинфекционные субъединичные вирусные вакцины, предоставляющие очищенный рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (НВзАд), и их можно вводить, начиная с рождения. Хотя в США отсутствуют терапевтические иммунотерапевтические композиции для лечения НВУ, такие композиции могут включать белковые или эпитопные субъединичные вакцины против НВУ, вакцины против НВУ на основе вирусного вектора, цитокины и/или другие иммуномодулирующие средства (например, агонисты ТЬК, иммуномодулирующие лекарственные средства).
Также изобретение относится к набору, содержащему любую из композиций, описанных в настоящем описании, и любой из индивидуальных компонентов композиций, описанных в настоящем описании.
Способы введения или применения композиций по изобретению Композиции по изобретению, которые могут включать любую одну или несколько (например, комбинации из двух, трех, четырех, пяти или более) иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, описанных в настоящем описании, антигены НВУ, включая белки и слитые белки НВУ, и/или рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки или слитые белки НВУ, описанные выше, и другие композиции, содержащие такие композиции на основе дрожжей, антигены, белки, слитые белки или рекомбинантные молекулы, описанные в настоящем описании, можно использовать в различных способах ίη νίνο и ίη νίίτο, включая, но не ограничиваясь ими, лечение и/или профилактику инфекции НВУ и ее осложнений, в диагностических анализах для НВУ, или для продуцирования антител против НВУ.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу лечения хронической инфекции вирусом гепатита В (НВУ), и/или профилактики, смягчения или лечения по меньшей мере одного симптома хронической инфекции НВУ, у индивидуума или в группе индивидуумов. Способ включает стадию введения индивидууму или группе индивидуумов, которые хронически инфицированы НВУ, одной или нескольких иммунотерапевтических композиций по изобретению. В одном из аспектов композиция представляет собой иммунотерапевтическую композицию, содержащую один или несколько антигенов НВУ, как описано в настоящем описании, которая может включать иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей. В одном из аспектов композиция включает белок или слитый белок, со- 74 028659 держащий антигены ΗΒν, как описано в настоящем описании, и/или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой белок или слитый белок. В одном из вариантов осуществления индивидуум или группа индивидуумов имеют хроническую инфекцию ΗΒν. В одном из аспектов индивидуума или группу индивидуумов, кроме того, лечат по меньшей мере одним другим терапевтическим соединением, подходящим для лечения инфекции ΗΒν. Такие терапевтические соединения включают, но не ограничиваются ими, противовирусные лекарственные средства прямого действия (например, лекарственные средства, описанные выше или в других разделах настоящего описания) и/или интерфероны и/или другие иммунотерапевтические или иммуномодулирующие средства. В одном из аспектов такие терапевтические соединения включают нацеленные на хозяина лекарственные средства (например, ингибиторы циклофилина, которые могут препятствовать репликации вируса, или ингибиторы повторного вхождения, которые могут препятствовать жизненному циклу вируса (повторная инфекция)).
Стандарт лечения или δ0Ο', главным образом, относится к текущему одобренному стандарту лечения конкретного заболевания. При хронической инфекции ΗΒν, δ0С может представлять собой один из нескольких различных одобренных терапевтических протоколов, и включает, но не ограничивается ими, терапию интерфероном и/или противовирусную терапию. Одобренные в настоящее время противовирусные лекарственные средства для лечения инфекции ΗΒν включают тенофовир (νΊΚΕΑΌ®), ламивудин (ΕΡΙνΙΚ®), адефовир (ΗΕΡδΕΚΑ®), телбивудин ^ΥΖΕΚΑ®) и энтекавир (ΒΑΚΑ^υΌΕ®). В настоящее время наиболее часто назначаемыми противовирусными лекарственными средствами от хронической инфекции ΗΒν являются тенофовир и энтекавир. Интерферон, пригодный для лечения хронической инфекции ΗΒν, включая интерферон типа Ι, такой как интерферон-α, включая, но не ограничиваясь ими, интерферон-а2 или пегилироваанный интерферон-а2 (например, ΡΕΟΑδΥδ®). В одном из вариантов осуществления интерферон представляет собой интерферон типа ΙΙΙ, включая, но не ограничиваясь ими, интерферон-λ 1, интерферонА2 и/или интерферонА3. Иммунотерапевтическую композицию по изобретению можно вводить до, одновременно, поочередно и/или после одного или нескольких противовирусного средства(средств) и/или интерферона и/или других Иммунотерапевтических или иммуномодулирующих средств. Другие терапевтические соединения также можно вводить до или после лечения иммунотерапевтическими композициями по изобретению.
Инфекцию ΗΒν, как правило, диагностируют у индивидуума путем выявления ΗΒδΑ§ (поверхностный антиген вируса гепатита В) и/или ΗΒеΑ§ (е-антиген) в крови инфицированного индивидуума.
Выявление ΗΒеЛд в сыворотке отражает активную репликацию вируса и клинический исход инфекции может коррелировать со статусом е-антигена, хотя долговременная ремиссия (или излечение) лучше прогнозируются с использованием сероконверсии ΗΒδΑ§ при использовании современных способов лечения (см. ниже). Выявление I§Μ-антитела против корового антигена также можно использовать для выявления острой инфекции ΗΒν в течение первых 6-12 месяцев инфекции. Персистенция ΗΒδΑ§ в крови в течение более чем 6 месяцев, как правило, идентифицирует хроническую инфекцию ΗΒν. Кроме того, хроническую инфекцию ΗΒν можно диагностировать путем идентификации ДНК ΗΒν (>2000 МЕ/мл), которую можно комбинировать с выявлением или идентификацией повышенных уровней аланинаминотрансферазы (ЛЬТ) и/или аспартатаминотрансферазы (ΑδΕ) (например, более чем в два раза относительно верхней границы нормы).
Выздоровление от вирусной инфекции (полный ответ или результат лечения ΗΒν) определяют по сероконверсии ΗΒеΑ§/ΗΒ5Α§, которая представляет собой потерю ΗΒеΑ§ и ΗΒδΑ§, соответственно, и развитие антител против поверхностного антигена гепатита В (анти-ΗΒδ) и/или антител против ΗΒеЛд. Клинические испытания определили сероконверсию или уровень защитных антител (анти-ΗΒδ) как: (а) 10 или более единиц соотношения в образцах (δΚυ) при определении радиоиммунным анализом; (Ь) положительный результат при определении иммуноферментным анализом; или (с) выявление концентрации антител > 10 мМЕ/мл (10 δΚυ сопоставимо с 10 мМЕ/мл антитела) . Развитие сероконверсии у хронически инфицированного пациента занимает годы при современном стандартном лечении (т.е. противовирусные лекарственные средства или интерферон). Также можно проводить мониторинг пациентов в отношении утраты или значительного снижения ДНК вируса (ниже поддающихся выявлению уровней посредством ПЦР или <2000 МК/мл), нормализации уровней аланинаминотрансферазы (ΑΣΈ) в сыворотке и улучшения в отношении воспаления и фиброза печени. Л^Т является хорошо проверенную меру повреждения печени, и она служит в качестве идентификатора воспаления печени. В предшествующих крупных испытаниях по гепатиту было показано, что снижение и/или нормализация уровней Л^Т (нормализация ΑΕ^ коррелирует с улучшением функции печени и снижением фиброза печени, определяемого путем серийной биопсии.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммунизации индивидуума или группы индивидуумов против ΗΒν для профилактики инфекции ΗΒν, профилактики хронической инфекции ΗΒν и/или снижения тяжести инфекции ΗΒν у индивидуума или группы индивидуумов. Способ включает стадию введения индивидууму или группе индивидуумов, которые не инфицированы ΗΒν (или предположительно не инфицированы ΗΒν) композиции по изобретению. В одном из аспектов ком- 75 028659 позиция представляет собой иммунотерапевтическую композицию, содержащую один или несколько антигенов ΗΒν, как описано в настоящем описании, включая одну или несколько иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей. В одном из аспектов композиция включает слитый белок, содержащий антигены ΗΒν, как описано в настоящем описании, или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой слитый белок.
Как используют в рамках изобретения, выражение лечить инфекцию ΗΒν, или любое его производное (например, подвергаемый лечению от инфекции ΗΒν и т.д.), главным образом, относится к применению или введению композиции по изобретению после возникновения инфекции (острой или хронической), с целью снижения или устранения поддающегося выявлению титра вируса (например, снижение ДНК вируса (ниже поддающихся выявлению уровней способом ПЦР или <2000 МЕ/мл)), достижения сероконверсии (развития антител против ΗΒκΑ§ и/или ΗΒеΑ§ и одновременная устранение или снижение этих белков из сыворотке), снижения по меньшей мере одного симптома, являющегося результатом инфекции у индивидуума, замедления или профилактики возникновения и/или тяжести симптомов и/или последующих осложнений, вызываемых инфекцией, снижения повреждения органа или физиологической системы (например, цирроза) вследствие инфекции (например, снижение аномальных уровней АЬТ, снижение воспаления печени, уменьшение фиброза печени), профилактики и/или снижения частоты или встречаемости печеночно-клеточной карциномы (НСС), улучшения функции органа или системы, на которые отрицательно повлияла инфекция (нормализация уровней АЬТ в сыворотке, улучшение при воспалении печени, улучшение при фиброзе легких), улучшения иммунных ответов против инфекции, улучшения длительных иммунных ответов памяти против инфекции, снижения реактивации вируса ΗΒν, и/или улучшения общего состояния здоровья индивидуума или группы индивидуумов.
В одном из аспектов целью лечения является непрерывный клиренс вируса в течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии. В одном из аспектов целью лечения является снижение уровня поддающихся выявлению белков ΗΒеΑ§ и/или ΗΒκΑ§ в сыворотке. В одном из аспектов целью лечения является развитие антител против поверхностного антигена гепатита В (анти-ΗΒκ) и/или антител против ΗΒеΑ§. В одном из аспектов целью лечения является сероконверсия, которая может быть определена как: (а) 10 или более единиц соотношения в образцах (δΚυ) при определении радиоиммунным анализом; (Ь) положительный результат при определении с помощью ферментного иммуноанализа; или (с) выявление концентрации антитела >10 мМЕ/мл (10 δΚυ сравнимы с 10 мМЕ/мл антитела).
Предупреждать инфекцию ΗΒν или любое его производное (например, профилактика инфекции ΗΒν, и т.д.), главным образом, относится к применению или введению композиции по изобретению до возникновения инфекции ΗΒν с целью профилактики инфекции ΗΒν, профилактики хронической инфекции ΗΒν (т.е. обеспечения клиренса у индивидуума острой инфекции ΗΒν без дальнейшего вмешательства), или, если инфекция возникнет впоследствии, по меньшей мере снижение тяжести и/или длительности инфекции и/или физиологического повреждения, вызванного хронической инфекцией, включая профилактику или снижение тяжести или встречаемости по меньшей мере одного симптома вследствие инфекции у индивидуума и/или замедление или профилактику возникновения и/или тяжести симптомов и/или последующих осложнений, вызываемых инфекцией, у индивидуума или в группе индивидуумов. В одном из аспектов настоящее изобретение можно использовать для профилактики хронической инфекции ΗΒν, такого как обеспечение у индивидуума, который стал инфицированным острой инфекцией ΗΒν уже после введения композиции по изобретению, клиренса инфекции и того, чтобы он не стал хронически инфицированным.
Настоящее изобретение включает доставку (введение, иммунизацию) одной или нескольких иммунотерапевтических композиций по изобретению, включая иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, индивидууму. Процесс введения можно осуществлять ех угуо или ίη У1уо, однако, как правило, его проводят ίη У1уо. Введение ех угуо относится к выполнению части требуемой стадии вне пациента, такой как введение композиции по настоящему изобретению в группу клеток (дендритные клетки), извлеченных из пациента, в условиях, обеспечивающих нагрузку клетки дрожжевым носителем, антигеном(ами) и любыми другими средствами или композициями, и возвращение клеток пациенту. Терапевтическую композицию по настоящему изобретению можно возвращать пациенту или вводить пациенту любым подходящим способом введения.
Введение композиции может быть системным, через слизистую оболочку и/или вблизи расположения мишеневой области (например, вблизи области инфекции). Подходящие пути введения будут очевидными специалистам в данной области, в зависимости от типа состояния, подлежащего профилактике или лечению, используемого антигена и/или мишеневой популяции клеток или ткани. Различные приемлемые способы введения включают, но не ограничиваются ими, внутривенное введение, внутрибрюшинные введение, внутримышечное введение, внутриузловое введение, внутрикоронарное введение, внутриартериальное введение (например, в сонную артерию), подкожное введение, чрескожную доставку, внутритрахеальное введение, внутрисуставное введение, внутрижелудочковое введение, ингаляцию (например, аэрозоль), внутричерепное, внутрипозвоночное, внутриглазное, ушное, интраназальное, пероральное, легочное введение, установку катетера и прямую инъекцию в ткань. В одном из аспектов пути введения включают внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, внутрикожный, внутриузловой,
- 76 028659 внутримышечный, чрескожный, ингаляционный, интраназальный, пероральный, внутриглазной, внутрисуставной, внутричерепной и внутрипозвоночный. Парентеральная доставка может включать внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутриплевральный, внутрилегочный, внутривенный, подкожный пути, путь через предсердный катетер и венозный катетер. Ушная доставка может включать ушные капли, интраназальная доставка может включать назальные капли или интраназальную инъекцию, и внутриглазная доставка может включать глазные капли. Также можно осуществлять доставку с помощью аэрозоля (ингаляционную) с использованием способов, стандартных в данной области (см., например, 81пЬ1ш§ с! а1., Ргос. №11. Асаб. 8а. И8А 189:11277-11281, 1992). Для лечения вирусных инфекций могут быть пригодны другие пути введения, которые модулируют иммунитет слизистых оболочек. Такие пути включают бронхиальный, внутрикожный, внутримышечный, интраназальный, другой ингаляционный, ректальный, подкожный, местный, чрескожный, вагинальный и уретральный пути. В одном из аспектов иммунотерапевтическую композицию по изобретению вводят подкожно.
Что касается иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей по изобретению, как правило, подходящая единичная доза представляет собой дозу, которая способна эффективно предоставлять дрожжевой носитель и антиген (если он включен) данному типу клетки, ткани или области организма пациента в количестве, эффективном для индукции антигенспецифического иммунного ответа против одного или нескольких антигенов или эпитопов НВУ при введении один или несколько раз на протяжении подходящего периода времени. Например, в одном из вариантов осуществления единичная доза дрожжевого носителя по настоящему изобретению составляет от приблизительно 1х105 до приблизительно 5х107 экв. дрожжевых клеток на 1 кг массы организма, в который вводят композицию. В одном из аспектов единичная доза дрожжевого носителя по настоящему изобретению составляет от приблизительно 0,1 Д.Е. (1х106 клеток) до приблизительно 100 Д.Е. (1х109 клеток) на дозу (т.е. на организм), включая любую промежуточную дозу с приращением 0,1х106 клеток (т.е. 1,1х106, 1,2х106, 1,3х106, ...). В одном из вариантов осуществления дозы включают дозы от 1 Д.Е. до 40 Д.Е., дозы от 1 Д.Е. до 50 Д.Е., дозы от 1 Д.Е. до 60 Д.Е., дозы от 1 Д.Е. до 70 Д.Е. или дозы от 1 Д.Е. до 80 Д.Е. и в одном из аспектов от 10 Д.Е. до 40 Д.Е., 50 Д.Е., 60 Д.Е., 70 Д.Е. или 80 Д.Е. В одном из вариантов осуществления дозы вводят в различные области индивидуума, но в ходе одного и того же периода дозирования. Например, дозу 40 Д.Е. можно вводить путем инъекции доз 10 Д.Е. в четыре различных области индивидуума в ходе одного периода дозирования, или дозу 20 Д.Е. можно вводить путем инъекции доз 5 Д.Е. в четыре различных области индивидуума или путем инъекции доз 10 Д.Е. в две различных области индивидуума в ходе одного и того же периода дозирования. Изобретение относится к введению количества иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Д.Е. или более) в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более различных областей индивидуума, достигая единичной дозы.
Вспомогательные средства или усиливающие средства для терапевтической композиции вводят, например, когда иммунный ответ против антигена снижается или если необходимо обеспечить иммунный ответ или индуцировать память против конкретного антигена антигена или антигена(ов). Усиливающие средства можно вводить с интервалом от приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель до интервала раз в месяц, раз в два месяца, раз в четыре месяца, раз в год, раз в несколько лет после первоначального введения. В одном из вариантов осуществления схема введения представляет собой схему, по которой от приблизительно 1х105 до приблизительно 5х107 экв. дрожжевых клеток композиции на 1 кг массы тела организма вводят по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз на протяжении периода времени от недель до месяцев и лет. В одном из вариантов осуществления дозы вводят каждую неделю для 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз, а затем дозы вводят раз в месяц при необходимости для достижения желаемого ингибирования или устранения вируса НВУ. Например, дозы можно вводить до достижения индивидуумом сероконверсии, до тех пор, пока титры ДНК НВУ не снижаются ниже 2000 МЕ/мл, и/или до тех пор, пока уровни АЬТ не нормализуются. В одном из вариантов осуществления дозы вводят по 4-недельному протоколу (каждые 4 недели или на 1 сутки, 4 неделе, 8 неделе, 12 неделе и т.д. на протяжении от 2 до 10 доз или более, как определяет врач). Дополнительные дозы можно вводить даже после достижения индивидуумом сероконверсии, если желательно, хотя такое дозирование может не быть необходимым.
Что касается введения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, описанных в настоящем описании, одну композицию можно вводить индивидууму или группе индивидуумов или можно вводить комбинацию таких композиций. Например, изобретение относится к нескольким композициям с единичным белком или композициям, направленным против конкретного генотипа, а также к мультибелковым композициям и композициям, которые нацелены против множества генотипов или подгенотипов. Таким образом, две или более композиции можно отбирать в подходе набора приправ для наиболее эффективной профилактики или лечения инфекции НВУ у данного индивидуума или группы индивидуумов.
В одном из аспектов изобретения одно или несколько дополнительных лекарственных средств вводят последовательно с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей. В другом варианте
- 77 028659 осуществления одно или несколько дополнительных лекарственных средств вводят до введения иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. В другом варианте осуществления одно или несколько дополнительных лекарственных средств вводят после введения иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. В одном из вариантов осуществления одно или несколько дополнительных лекарственных средств вводят в качестве чередующихся доз с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей или в протоколе, в котором композицию на основе дрожжей вводят с назначенными интервалами между или с одной или несколькими последовательными дозами дополнительных средств или наоборот. В одном из вариантов осуществления иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей вводят в одной или нескольких дозах на протяжении периода времени перед началом введения дополнительных средств. Иными словами, иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей вводят в качестве монотерапии в течение периода времени, а затем добавляют введение средства, либо одновременно с новыми дозами иммунотерапии на основе дрожжей, либо путем чередования с иммунотерапией на основе дрожжей. Альтернативно средство можно вводить в течение периода времени перед началом введения иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. В одном из аспектов дрожжи создают способами инженерии, чтобы они экспрессировали или содержали средство, или конструируют или получают другие дрожжи, чтобы они экспрессировали или содержали средство.
В одном из аспектов изобретения когда начинают курс лечения интерфероном или противовирусным соединением, вводят дополнительные дозы иммунотерапевтической композиции на протяжении периода времени или в течение по меньшей мере части этого времени, и их можно продолжать вводить один раз после окончания курса интерферона или противовирусного соединения. Однако схема дозирования для иммунотерапии в течение всего периода времени может, и, как ожидают, будет отличаться от схемы дозирования интерферона или противовирусного соединения. Например, иммунотерапевтическую композицию можно вводить в тот же день или по меньшей мере через 3-4 суток после последней вводимой (самой поздней) дозы интерферона или противовирусного средства (или через любое подходящее количество суток после последней дозы), и ее можно вводить раз в сутки, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца или раз в 3-6 месяцев или с более длительными интервалами, как определит врач. В ходе первоначального периода введения иммунотерапевтической композиции в качестве монотерапии, если ее используют, иммунотерапевтическую композицию предпочтительно вводят каждую неделю в течение от 4 до 12 недель, а затем вводят раз в месяц (независимо от того, когда дополнительный интерферон или противовирусную терапию добавляют в протокол). В одном из аспектов иммунотерапевтическую композицию вводят раз в неделю в течение четырех или пяти недель, а затем введение проводят раз в месяц, до завершения полного протокола лечения.
В аспектах изобретения иммунотерапевтическую композицию и другие средства можно вводить вместе (одновременно). Как используют в рамках изобретения, одновременное применение доз не обязательно означает, что все дозы всех соединений вводят в один и тот же день в одно и то же время. Скорее, одновременное применение означает, что каждый из компонентов терапии (например, иммунотерапия и терапия интерферонами, или иммунотерапия и противовирусная терапия) начинают приблизительно в один и тот же период (в пределах часов или вплоть до 1-7 суток друг от друга) и вводят на протяжении одного и того же общего периода времени, учитывая, что каждый компонент может иметь отличающуюся схему дозирования (например, интерферон раз в неделю, иммунотерапия раз в месяц, противовирусная терапия раз в сутки или раз в неделю). Кроме того, до или после периода одновременного введения одно из средств или иммунотерапевтических композиций можно вводить без другого средства(средств).
Настоящее изобретение предусматривает, что применение иммунотерапевтической композиции по изобретению с противовирусным средством, таким как тенофовир или энтекавир, обеспечит более короткую длительность применения противовирусного лекарственного средства. Сходные результаты ожидаются при комбинировании иммунотерапевтического средства по изобретению с интерфероном. Требования к дозированию для противовирусного средства или интерферона также могут снижаться или модифицироваться в результате комбинации с иммунотерапевтическим средством по изобретению, чтобы в общем повысить толерантность пациента к лекарственному средству. Кроме того, предусматривается, что иммунотерапевтическая композиция по изобретению может обеспечивать сероконверсию или непрерывные вирусные ответы для пациентов, у которых противовирусная терапия отдельно не достигает этих результатов. Иными словами, большее количество пациентов будут достигать сероконверсии, когда иммунотерапевтическую композицию по изобретению комбинируют с противовирусным средством или интерфероном, чем при использовании противовирусных средств или интерферона отдельно. При текущем 80С для инфекции НВУ противовирусные средства можно вводить в течение от 6 месяцев до одного года, двух лет, трех лет, четырех лет, пяти лет или более (например, на неопределенный срок). Путем комбинирования такой терапии с иммунотерапевтической композицией по изобретению время для введения противовирусного средства может быть снижено на несколько месяцев или лет. Предусматривается, что применение иммунотерапевтических композиций по настоящему изобретению, в качестве монотерапии или в комбинации с противовирусными и/или иммуномодулирующими подходами будет эффективным для достижения устранения НВкАд и/или НВеАд; сероконверсии НВеАд, сероконверсии НВкАд или полной сероконверсии; и у многих индивидуумов, непрерывного клиренса вируса в
- 78 028659 течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии. У некоторых пациентов иммунотерапия в соответствии с настоящим изобретением, когда ее используют в качестве монотерапии или в комбинации с противовирусным и/или иммуномодулирующим подходами, может достигать устранения НВ8Ад и/или НВеАд, но не достигает сероконверсии (развития антител против НВ8 или антител против НВеАд). В этом сценарии, кроме того, вариантом осуществления изобретения является применение, отдельно или в комбинации с иммунотерапией на основе дрожжей по изобретению и/или противовирусными средствами или другими иммуномодулирующими средствами, средства, такого как текущая профилактическая рекомбинантная субъединичная вакцина против НВУ, для достижения полного ответа у пациента.
Как используют в рамках изобретения, термин противовирусное средство относится к любому соединению или лекарственному средству, как правило, низкомолекулярному ингибитору или антителу, которые нацелены на одну или несколько стадий жизненного цикла вируса с прямыми противовирусными терапевтическими эффектами. В одном из вариантов осуществления изобретения противовирусное соединение или лекарственное средство, подлежащие введению в одном терапевтическом протоколе с иммунотерапевтической композицией по изобретению, выбирают из тенофовира (УЕКБАО®), ламивудина (БРГЩК®), адефовира (НΕΡδΕКА®), телбивудина (ΊΎΖΕΚΑ®) и энтекавира (ВАРАСЕ-υΌΕ®) или их любого аналога или производного или любой композиции, содержащей или вмещающей такое соединение, лекарственное средство, аналог или производное.
Тенофовир (тенофовир дизопроксил фумарат или ТОР), или ({[(2К)-1-(6-амино-9Н-пурин-9ил)пропан-2-ил]окси}метил)фосфоновая кислота, представляет собой ингибитор обратной транскриптазы на основе нуклеотидных аналогов (пКТТ). Для лечения инфекции НВУ тенофовир, как правило, вводят взрослым в качестве пилюль, принимаемых в дозе 300 мг (тенофовир дизопроксил фумарат) один раз в сутки. Дозировка для педиатрических пациентов основана на массе тела пациента (8 мг на 1 кг массы тела, плоть до 300 мг один раз в сутки) и она может быть предоставлена в качестве таблетки или перорального порошка.
Ламивудин, или 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин, обычно обозначаемый как 3ТС, является мощным ингибитором обратной транскриптазы на основе нуклеозидных аналогов (пКТТ). Для лечения инфекции НВУ ламивудин вводят в качестве пилюли или перорального раствора, принимаемого в дозе 100 мг один раз в сутки (1,4-2 мг/фунт (3,1-4,4 мг/кг) два раза в сутки для детей от 3 месяцев до 12 лет).
Адефовир (адефовир дипивоксил) или 9-[2-[[бис[(пивалоилокси)метокси]фосфинил]метокси]этил] аденин представляет собой перорально вводимый ингибитор обратной транскриптазы на основе нуклеотидных аналогов (п1КТТ). Для лечения инфекции НВУ адефовир вводят в качестве пилюли, принимаемой в дозе 10 мг один раз в сутки.
Телбувидин или 1-(2-дезокси-3-Ь-эритропентофуранозил)-5-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-дион представляет собой синтетический нуклеозидный аналог тимидина (Ъ-изомер тимидина). Для лечения инфекции НВУ телбивудин вводят в качестве пилюли или перорального раствора, принимаемого в дозе 600 мг один раз в сутки.
Энтекавир или 2-амино-9-[(Ш,3К^)-4-гидрокси-3-(гидроксиметил)-2-метилиденциклопентил]-6,9дигидро-3Н-пурин-6-он представляет собой нуклеозидный аналог (аналог гуанина), который ингибирует обратную транскрипцию, репликацию ДНК и транскрипцию вируса. Для лечения инфекции НВУ, энтекавир вводят в качестве пилюли или перорального раствора, принимаемых в дозе 0,5 мг один раз в сутки (1 мг раз в сутки в случае обеспечивающих рефрактерность к ламивудину или устойчивость к телбивудину мутаций).
В одном из вариантов осуществления изобретения интерферон, подлежащий введению в терапевтическом протоколе с иммунотерапевтической композицией по изобретению, представляет собой интерферон, и в одном из аспектов интерферон-α, и в одном из аспектов интерферон-а2Ь (вводимый путем подкожной инъекции 3 раза в неделю); или пегилированный интерферон-а2а (например ΡΕΟΑδΥδ®). Как используют в рамках изобретения, термин интерферон относится к цитокину, который, как правило, продуцируется клетками иммунной системы и широким множеством клеток в ответ на присутствие двухцепочечной РНК. Интерфероны способствуют иммунному ответу путем ингибирования репликации вируса в клетках-хозяевах, активации естественных киллерных клеток и макрофагов, увеличения представления антигена лимфоцитам, и индукции устойчивости клеток-хозяев к вирусной инфекции. Интерфероны типа Ι включают интерферон-α. Интерфероны типа ΙΙΙ включают интерферон-λ. Интерфероны, подходящие в способах по настоящему изобретению, включают любой интерферон типа Ι или типа ΙΙΙ, включая интерферон-α, интерферон-а2, и в одном из аспектов формы интерферона длительного действия, включая, но не ограничиваясь ими, пегилированные интерфероны, слитые белки интерферонов (интерферон, слитый с альбумином), и составы с контролируемым высвобождением, содержащие интерферон (например, интерферон в микросферах или интерферон с наночастицами полиаминокислоты). Один интерферон, ΡΕΟΑδΥδ®, пегилированный интерферон-а2а, представляет собой ковалентный конъюгат рекомбинантного интерферона-а2а (приблизительная молекулярная масса [ММ] 20000 дальтон) с одной разветвленной цепью бис-монометоксиполиэтиленгликоля (ΡΕΟ) (приблизительная ММ 40000 Да). Часть ΡΕΟ связана в одном участке с частью интерферона-α через стабильную амидную связь с лизином.
- 79 028659
Пегилированный интерферон-а2а имеет приблизительную молекулярную массу 60000 Да.
Интерферон, как правило, вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции и его можно вводить в дозе 3-10 млн единиц, причем в одном из вариантов 3 млн единиц являются предпочтительными. Дозы интерферона вводят с регулярным расписанием, которое может варьировать от 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в неделю до введения раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели или раз в месяц. Типичную дозу интерферона, которая доступна в настоящее время, предоставляют раз в неделю, и это является предпочтительной схемой дозирования для интерферона в соответствии с настоящим изобретением. Для лечения НВУ пегилированный интерферон-а2а в настоящее время вводят подкожно один раз в неделю в дозе 180 мг (предварительно заполненный шприц с 1,0 мл или 0,5 мл для лечения вируса), в течение всего 48 недель. Величина дозы и расписание могут варьировать в зависимости от предпочтений и рекомендаций врача, а также от рекомендаций для конкретного используемого интерферона, и специалисты в данной области способны определить надлежащую дозу. Предусматривается, что с использованием терапии интерфероном вместе с иммунотерапевтической композицией по изобретению величина дозы и/или количество доз интерферона (период времени на интерфероне и/или интервалы между дозами интерферона) могут быть снижены.
В способе по настоящему изобретению композиции и терапевтические композиции можно вводить животному, включая любое позвоночное, и, в частности, любому представителю позвоночных класса млекопитающие, включая, но не ограничиваясь, приматов, грызунов, домашний скот и домашних животных. Домашний скот включает млекопитающих, подлежащих употреблению в пищу или которые продуцируют полезные продукты (например, овцы для получения шерсти). Млекопитающие, подлежащие лечению или защите, включают человека, собак, кошек, мышей, крыс, коз, овец, крупный рогатый скот, лошадей и свиней.
Индивидуумом является позвоночное, такое как млекопитающее, включая, но не ограничиваясь этим, человека. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, мышей и крыс. Термин индивидуум можно использовать взаимозаменяемо с термином животное, субъект или пациент.
Общие способы, подходящие для изобретения
Для применения настоящего изобретения на практике могут быть использованы, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, химии нуклеиновых кислот и иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие способы полностью проиллюстрированы в литературе, такой как Ме!йобк оГ Еп/уто1оду, Уо1. 194, Оибте е! а1., ебк., Со1б 8рппд НагЬог йаЬогаЮгу Ргекк (1990); Вю1оду апб асйуШек оГ уеак!к, 8к1ппег, е! а1., ебк., Асабетю Ргекк (1980); Мебюбк ш уеак1 депейск: а 1аЬога!огу соигке тапиа1, Коке е! а1. , Со1б 8рйпд НагЬог йаЬогаЮгу Ргекк (1990); Тйе Уеак1 8ассйаготусек: Се11 Сус1е и Се11 Вю1оду, Рйпд1е е! а1. , ебк., Со1б 8рйпд НагЬог йаЬогаЮгу Ргекк (1997); Тйе Уеак1 8ассйаготусек: Оепе Ехргеккюп, 1опек е! а1., ебк., Со1б 8рйпд НагЬог йаЬогаЮгу Ргекк (1993); Тйе Уеак1 8ассйаготусек: Оепоте Иупатюк, РгоШп 8уййек1к, апб Епегдейск, Вгоасй е! а1., ебк., Со1б 8рйпд НагЬог йаЬогаЮгу Ргекк (1992); Мо1еси1аг С1отпд: А йаЬогаЮгу Мапиа1, кесопб ебйюп (8атЬгоок е! а1., 1989) и Мо1еси1аг С1отпд: А йаЬогаЮгу Мапиа1, бйгб ебйюп (8атЬгоок апб Кикке1, 2001), (вместе обозначаемые в настоящем описании как 8атЬгоок); СиггеШ Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Р.М. АикиЬе1 е! а1., ебк., 1987, включая дополнения по 2001 год); ПЦР: Тйе Ро1утегаке Сйат геасйоп, (Ми1йк е! а1., ебк., 1994); Наг1о\у апб Ьапе (1988), АпйЬоб1ек, А йаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рйпд НагЬог РиЬйсайопк, №\у Уогк; Наг1о\у апб Ьапе (1999) Икшд АпйЬоб1ек: А йаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рйпд НагЬог йаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8рйпд НагЬог, ИУ (вместе обозначаемые в настоящем описании как Наг1о\у апб Ьапе), Веаисаде е! а1. ебк., СиггеШ РгоЮсо1к ш №ю1ею Лаб Сйетюйу, 1ойп \УНеу & 8опк, 1пс., №у Уогк, 2000); Сакагей апб Иои11'к Тохюо1оду Тйе Вакю 8с1епсе оГ Роюопк, С. К1ааккеп, еб., 61й ебйюп (2001), и Уассшек, 8. Р1о1к1п апб ^. 0гепШеш, ебк., 3гб ебйюп (1999).
Общие определения.
ТЛКМΟОЕN® (О1оЬе1ттипе, 1пс., ЬошкуШе, Со1огабо), главным образом, относится к дрожжевому носителю, экспрессирующему один или несколько гетерологичных антигенов внеклеточно (на его поверхности), внутриклеточно (внутри или в цитозоле) или как внеклеточно, так и внутриклеточно. Продукты ТЛКМΟОЕN®, в основном, описаны (см., например, патент США № 5830463). Определенные композиции для иммунотерапии на основе дрожжей и способы получения и, главным образом, их применения также подробно описаны, например, в патенте США № 5830463, патенте США № 7083787, патенте США № 7736642, 8ШЬЬк е! а1., Ыа1. Меб. 7:625-629 (2001), Ьи е! а1., Сапсег Кекеагсй 64:5084-5088 (2004), и ВегпкШп е! а1., Уассше 2008 1ап 24; 26(4): 509-21, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Как используют в рамках изобретения, термин аналог относится к химическому соединению, которое является структурно сходным с другим соединением, но немного отличается по составу (как в случае замены одного атома атомом другого элемента или в присутствии конкретной функциональной группы, или в случае замены одной функциональной группы другой функциональной группой). Таким
- 80 028659 образом, аналог представляет собой соединение, которое является сходным или сравнимым по функции и внешнему виду, но которое имеет отличающуюся структуру или происхождение относительно эталонного соединения.
Термины замещенный, замещенное производное и производное, когда их используют для описания соединения, означают, что по меньшей мере одна водородная связь незамещенного соединения заменена отличающимся атомом или химической группой.
Хотя производное имеет сходную физическую структуру с исходным соединением, производное может иметь отличающиеся химические и/или биологические свойства от исходного соединения. Такие свойства могут включать, но не ограничиваются ими, увеличенную или сниженную активность исходного соединения, новую активность по сравнению с исходным соединением, усиленную или сниженную биодоступность, усиленную или сниженную эффективность, усиленную или сниженную стабильность ίη νΐΐΐΌ и/или ίη νίνΌ, и/или свойства усиленного или сниженного всасывания.
Как правило, термин биологически активный указывает на то, что соединение (включая белок или пептид) имеет по меньшей мере один поддающийся выявлению вид активности, который имеет эффект на метаболические или другие процессы в клетке или организме, при измерении или наблюдении ίη νί\Ό (т.е. в нейтральных физиологических условиях) или ίη νίΐΐΌ (т.е. в лабораторных условиях).
В соответствии с настоящим изобретением термин модулировать может использоваться взаимозаменяемо с регулировать и относится, главным образом, к активации или подавлению конкретной активности. Как используют в рамках изобретения, термин активировать может использоваться, главным образом, для описания любого из: индукции, инициации, увеличения, усиления, форсирования, улучшения, повышения, умножения, стимуляции или обеспечения, в отношении конкретной активности. Аналогично, термин подавлять можно использовать для описания любого из уменьшения, снижения, ингибирования, смягчения, сокращения, убавления, блокирования или предупреждения в отношении конкретной активности.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения любую из аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем описании, можно получать по меньшей мере с одной и вплоть до приблизительно 20 дополнительных гетерологичных аминокислот, фланкирующих каждый из С- и/или ^концов указанной аминокислотной последовательности. Полученный белок или полипептид может быть обозначен как по существу, состоящий из указанной аминокислотной последовательности. В соответствии с настоящим изобретением гетерологичные аминокислоты представляют собой последовательность аминокислот, которые не встречаются природным образом (т.е. не встречаются в природе, ίη γίνΌ), фланкирующие конкретную аминокислотную последовательность, или которые не связаны с функцией указанной аминокислотной последовательности, или которые не кодируются нуклеотидами, которые фланкируют природную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанную аминокислотную последовательность, как она встречается в гене, если бы такие нуклеотиды в природной последовательности транслировались с использованием стандартного использования кодонов для организма, из которого данная аминокислотная последовательность происходит. Аналогично, выражение по существу состоящий из, когда его используют в рамках настоящего изобретения в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аминокислотную последовательность, которая фланкируется посредством от одного и вплоть до 60 дополнительных гетерологичных нуклеотидов на каждом из 5'- и/или 3'-конца последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аминокислотную последовательность. Гетерологиченые нуклеотиды представляют собой не встречающиеся природным образом (т. е. не встречаются в природе, ίη νί\Ό) нуклеотиды, фланкирующие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую определенную аминокислотную последовательность, как она встречается в природном гене, или не кодируют белок, который сообщает любую дополнительную функцию белку или изменяет функцию белка, имеющего определенную аминокислотную последовательность.
В соответствии с настоящим изобретением выражение селективно связывается с относится к способности антитела, антигенсвязывающего фрагмента или связывающего партнера по настоящему изобретению предпочтительно связываться с определенными белками. Более конкретно, выражение селективно связывает относится к специфичному связыванию одного белка с другим (например, антитела, его фрагмента или связывающего партнера с антигеном), где уровень связывания при измерении в любом стандартном анализе (например, иммуноанализе), является статистически значимо более высоким, чем фоновый контроль для анализа. Например, при выполнении иммуноанализа контроли, как правило, включают реакционную лунку/пробирку, которая содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент отдельно (т. е. в отсутствие антигена), где величина реактивности (например, неспецифического связывания с лункой) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в отсутствие антигена считается фоновым уровнем. Связывание можно измерять с использованием различных способов, стандартных в данной области, включая иммуноферментные анализы (например, ЕЫ8А, анализы с использованием иммуноблоттинга и т.д.).
Указание на белок или полипептид, используемое в рамках настоящего изобретения, включает полноразмерные белки, слитые белки или любой фрагмент, домен, конформационный эпитоп или гомолог
- 81 028659 таких белков, включая функциональные домены и иммунологические домены белков. Более конкретно, выделенный белок в соответствии с настоящим изобретением представляет собой белок (включающий полипептид или пептид), который извлечен из его природной среды (т. е. который подвергнут обработки человеком) и может включать, очищенные белки, частично очищенные белки, рекомбинантно продуцированные белки и синтетически продуцированные белки. По существу, выделенный не отражает степени, с которой белок очищен. Предпочтительно выделенный белок по настоящему изобретению продуцируют рекомбинантным путем. В соответствии с настоящим изобретением термины модификация и мутация могут быть использованы взаимозаменяемо, в частности, в отношении модификаций/мутаций аминокислотной последовательности белков или их частей (или последовательностей нуклеиновых кислот), описанных в настоящем описании.
Как используют в рамках изобретения, термин гомолог используют для обозначения белка или пептида, которые отличаются от природного белка или пептида (т.е. прототипного белка или белка дикого типа) незначительными модификациями природного белка или пептида, но который сохраняет основную структуру белка и боковой цепи природной формы. Такие изменения включают, но не ограничиваются ими, изменения одной или нескольких боковых цепей аминокислот; изменения одной или нескольких аминокислот, включая делеции (например, укороченный вариант белка или пептида), инсерции и/или замены; изменения стереохимии одного или нескольких атомов; и/или незначительные преобразования, включая, но не ограничиваясь ими, метилирование, гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование, миристоилирование, пренилирование, пальмитирование, амидацию и/или присоединение гликозилфосфатидилинозитола. Гомолог может иметь усиленные, сниженные или, по существу, сходные свойства по сравнению с природным белком или пептидом. Гомолог может включать агонист белка или антагонист белка. Гомологи можно получать с использованием способов получения белков, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, прямые модификации выделенного, природного белка, прямой синтез белка или модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, с использованием, например, классических технологий или технологий рекомбинантных ДНК для обеспечения случайного или направленного мутагенеза.
Гомолог данного белка может содержать, по существу, состоять или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере приблизительно на 45%, или по меньшей мере приблизительно на 50%, или по меньшей мере приблизительно на 55%, или по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере приблизительно на 65%, или по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 91% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 92% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 93% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 94% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 95% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 96% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 97% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 98% идентична, или по меньшей мере приблизительно на 99% идентична (или любая процентная идентичность между 45 и 99%, с шагом, составляющим целые числа) аминокислотной последовательности эталонного белка. В одном из вариантов осуществления гомолог содержит, по существу, состоит или состоит из аминокислотной последовательности, которая менее чем на 100% идентична, менее чем приблизительно на 99% идентична, менее чем приблизительно на 98% идентична, менее чем приблизительно на 97% идентична, менее чем приблизительно на 96% идентична, менее чем приблизительно на 95% идентична и т.д., с шагом 1% до менее чем приблизительно 70% идентичности природной аминокислотной последовательности эталонного белка.
Гомолог может включать белки или домены белков, которые являются практически полноразмерными, что означает, что такой гомолог отличается от полноразмерного белка, функционального домена или иммунологического домена (в том качестве, в котором такой белок, функциональный домен или иммунологический домен описан в настоящем описании или в ином случае известен или описан в общедоступной последовательности) путем добавления или делеции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на N и/или С-конце такого полноразмерного белка или полноразмерного функционального домена или полноразмерного иммунологического домена.
Как используют в рамках изобретения, если нет иных указаний, указание на процентную (%) идентичность относится к оценке гомологии, которую проводят с использованием: (1) поиска гомологии в ВЬА8Т 2.0 Вазю ВЬА8Т с использованием Ыаз1р для поиска по аминокислотам и Ыаз!п для поиска по нуклеиновым кислотам со стандартными параметрами по умолчанию, где последовательность запроса фильтруют по областям низкой комплексности по умолчанию (описано А1!зсйи1, 8.Р., Маббеп, Т.Ь., 8сйаайег, А.А., 2йапд, 1., 2йапд, Ζ., МШег, №. & Ыртап, Ό.Ι (1997) Оарреб ВЬА8Т апб Р81-ВБА8Т: а пей депегабоп ок рго!еш ба!аЬазе зеагсй ргодгатз, №.1с1ею Аабз Кез. 25:3389-3402, включенная в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме); (2) выравнивания ВЬА8Т 2 (с использованием параметров, описанных ниже); (3) и/или Р81-ВЙА8Т со стандартными параметрами по умолчанию (Роз1йоп-8реайс 1!ега!еб ВЬА8Т). Следует отметить, что вследствие некоторых отличий в стандартных параметрах между ВЬА8Т 2.0 Вазю ВЬА8Т и ВЬА8Т 2, две конкретные последовательности могут быть рас- 82 028659 познаны как имеющие значительную гомологию с использованием программы ВЬАЗТ 2, в то время как поиск, проведенный в ВЬАЗТ 2.0 Ваыс ВЬАЗТ с использованием одной из последовательностей в качестве последовательности запроса, может не идентифицировать вторую последовательность среди наилучших совпадений. Кроме того, РЗЬВЬАЗТ обеспечивает автоматизированную простую в использовании версию профильного поиска, которая является чувствительным способом для поиска гомологов последовательностей. Сначала программа выполняет поиск в базе данных Оарреб ВЬАЗТ. Программа РЗЬВЬАЗТ использует информацию от любых значительных выданных выравниваниях для конструирования специфической к положению оценочной матрицы, которая заменяет последовательность запроса для следующего раунда поиска в базе данных. Таким образом, следует понимать, что процентную идентичность можно определять с использованием любой из этих программ.
Две конкретные последовательности можно выравнивать друг с другом с использованием ВЬАЗТ 2 кесщепсе. как описано в ТаШкоуа апб Маббеп, (1999), В1ак1 2 кесщепсек - а пе\у Юо1 £ог сотраппд рго!еш апб пис1еоббе кециепсек, РЕМЗ М1сгоЫо1 Ьей. 174:247-250, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Выравнивание последовательностей ВЬАЗТ 2 проводят в Ь1ак1р или Ь1ак1п с использованием алгоритма ВЬАЗТ 2.0 алгоритм для выполнения поиска в Оарреб ВЬАЗТ (ВЬАЗТ 2.0) между двумя последовательностями, допуская внесение пропусков (делеций и инсерций) в результат выравнивания. Для целей ясности в рамках настоящего описания выравнивание последовательностей в ВЬАЗТ 2 проводят с использованием следующих стандартных параметров.
Для Ь1ак!и использование матрицы 0 ВЬ0ЗИМ62: награда за совпадение = 1 штраф за несовпадение = -2 штрафы за внесение пропуска (5) и продолжение пропуска (2) дар х_бгоро££ (50) ожидание (10) размер слова (11) фильтр (оп).
Для Ь1ак1р использование матрицы 0 ВЬ0ЗИМ62:
штраф за внесение пропуска (11) и продолжение пропуска (1) дар х_бгоро££ (50) ожидание_(10) размер слова (3) фильтр (оп).
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая извлечена из ее природной среды (т.е. которая подвергнута обработке человеком), причем ее природная среда представляет собой геном или хромосому, в которых молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе. По существу, выделенный необязательно отражает степень, с которой молекула нуклеиновой кислоты очищена, а указывает на то, что молекула не включает целый геном или целую хромосому, в которых молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может включать ген. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает ген, не является фрагментом хромосомы, который включает такой ген, а вместо этого включает кодирующую область и регуляторные области, связанные с геном, но не включает дополнительные гены, которые встречаются в природе на той же хромосоме. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты также может включать указанную последовательность нуклеиновой кислоты, фланкированную (т.е. на 5'- и/или 3'-конце последовательности) дополнительными нуклеиновыми кислотами, которые обычно не фланкируют указанную последовательность нуклеиновой кислоты в природе (т.е. гетерологичные последовательности). Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может включать ДНК, РНК (например, мРНК) или производные либо ДНК, либо РНК (например, кДНК). Хотя выражение молекула нуклеиновой кислоты, главным образом, относится к физической молекуле нуклеиновой кислоты и выражение последовательность нуклеиновой кислоты, главным образом, относится к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, эти два выражения могут использоваться взаимозаменяемо, особенно в отношении молекулы нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок или домен белка.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая может включать по меньшей мере одну из любой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей любой один или несколько белков, описанных в настоящем описании, функционально связанных по меньшей мере с одной из любых последовательностей контроля транскрипции, способных эффективно регулировать экспрессию молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты в клетке, подлежащей трансфекции. Хотя выражение молекула нуклеиновой кислоты, главным образом, относится к физической молекуле нуклеиновой кислоты и выражение последовательность нуклеиновой кислоты, главным образом, относится к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, эти два выражения могут использоваться взаимозаменяемо, особенно в отношении молекулы нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок. Кроме того, выражение рекомбинантная молекула, главным образом, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, функционально связанной с последовательностью контроля транскрипции, однако его можно использовать взаимозаменяемо с выражением молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят животному.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты включает рекомбинантный вектор, который представляет собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, как правило, гетерологичную последовательность, которая функционально связана с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирую- 83 028659 щей слитый белок по настоящему изобретению, который способен обеспечивать рекомбинантную продукцию слитого белка, и который способен доставлять молекулу нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин в соответствии с настоящим изобретением. Такой вектор может содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые не встречаются в природе рядом с выделенными молекулами нуклеиновых кислот, подлежащих встраиванию в вектор. Вектор может представлять собой вектор на основе РНК или ДНК, может быть прокариотическим или эукариотическим, и предпочтительно в рамках настоящего изобретения вектор представляет собой вирус или плазмиду. Рекомбинантные векторы можно использовать в клонировании, секвенировании и/или ином манипулировании молекулами нуклеиновых кислот, и его можно использовать для доставки таких молекул (например, как в композиции ДНК или композиции на основе вирусного вектора). Рекомбинантные векторы предпочтительно используют при экспрессии молекул нуклеиновых кислот, и также они могут называться векторами экспрессии. Предпочтительные рекомбинантные векторы могут экспрессироваться в трансфицированной клетке-хозяине.
В рекомбинантной молекуле по настоящему изобретению молекулы нуклеиновых кислот функционально связаны с векторами экспрессии, содержащими регуляторные последовательности, такие как последовательности контроля транскрипции, последовательности контроля трансляции, ориджины репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с клеткой-хозяином и которые контролируют экспрессию молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. В частности, рекомбинантные молекулы по настоящему изобретению включают молекулы нуклеиновых кислот, которые функционально связаны с одной или несколькими последовательностями контроля экспрессии. Выражение функционально связанный относится к связыванию молекулы нуклеиновой кислоты с последовательностью контроля экспрессии так, чтобы молекула экспрессировалась после трансфекции (т.е. трансформации, трансдукции или трансфекции) клетки-хозяина.
В соответствии с настоящим изобретением термин трансфекция используют для обозначения любого способа, посредством которого экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты) можно вводить в клетку. Термин трансформация может использоваться взаимозаменяемо с термином трансфекция, когда такой термин используют для обозначения введения молекул нуклеиновых кислот в микробные клетки, такие как водоросли, бактерии и дрожжи. В микробных системах термин трансформация используют для описания приобретенного изменения вследствие введения экзогенных нуклеиновых кислот микроорганизмом, и он является, по существу, синонимичным с термином трансфекция. Таким образом, способы трансфекции включают, но не ограничиваются ими, трансформацию, химическую обработку клеток, бомбардировку частицами, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию, инфекцию и слияние протопластов.
Следующие экспериментальные результаты предоставлены для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Пример 1.
В представленном ниже примере описано получение иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей для лечения или профилактики инфекции вирусом гепатита В (НВУ).
В этом эксперименте дрожжи (например, 8ассЬаготусек сегеу151ае) модифицировали способами инженерии для экспрессии различных слитых белков поверхностный антиген-коровый антиген НВУ, каждый из которых имеет основную структуру, представленную на фиг. 2, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕЕ2. В каждом случае слитый белок НВУ представлял собой единый полипептид приблизительно из 595 аминокислот со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 5>Е0 ГО N0:34 (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (положения 1-6 5>Е0 ГО N0:34); 2) спейсер из двух аминокислот (ТЬг-§ег) для внесения участка фермента рестрикции 8ре1; 3) аминокислотная последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа С (например, положения 9-407 5>Е0 ГО N0:34, соответствующие положениям 2-400 5>Е0 ГО N0:11, которые отличаются от 5>Е0 ГО N0:34 в положениях 350351 5>Е0 ГО N0:11, где последовательность Ьеи-Уа1 в 5>Е0 ГО N0:11 заменена последовательностью ОшА1а в положениях 357-358 5>Е0 ГО N0:34); 4) аминокислотная последовательность корового антигена НВУ (например, положения 408-589 5>Е0 ГО N0:34 или положения 31-212 5>Е0 ГО N0:9); и 5) гексагистидиновая метка (положения 590-595 5>Е0 ГО N0:34). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 5>Е0 ГО N0:34 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 5>Е0 ГО N0:33. Положения 28-54 5>Е0 ГО N0:34 содержат часть рецептора для гепатоцитов большого (Ь) поверхностного белка. 5>Е0 ГО N0:34 содержит множество эпитопов или доменов, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Например, положения 209-220, положения 389-397, положения 360-367 и положения 499-506 относительно 5>Е0 ГО N0:34 содержатся известные связывающие МНС класса I эпитопы и/или эпитопы СТЬ. Положения 305328 5>Е0 ГО N0:34 содержат эпитоп антитела. Этот слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, содержащая этот белок, могут быть в общем обозначены в настоящем описании как §соге, МАОЕАР-§соге, М-§соге или 01-13002.
- 84 028659
В кратком изложении ДНК, кодирующую практически полноразмерный большой поверхностный антиген (Ь), слитый с полноразмерным коровом антигеном, подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в дрожжах, а затем расщепляли Ε^ΚΙ и и встраивали после промотора СОТ1 (рОР100) или промотора ΤΕΡ2 (рТК57-1), в 2-мкм векторах экспрессии дрожжей. Слитый белок, кодируемый этими конструкциями, представлен в настоящем описании как δΕφ ΙΌ Ν0:34 (кодируемый нуклеотидной последовательностью δΕφ ΙΌ Ν0:33) и имеет ожидаемую приблизительную молекулярную массу 66 кДа. Полученные плазмиды вводили в дрожжи δассЬа^οтусез сеге\зз1ае Б303а путем трансфекции с ацетатом лития/полиэтиленгликолем и первичные трансфектанты отбирали на чашках с твердой минимальной средой, лишенной урацила (иОМ; среда с отсутствием уридина). Колонии повторно наносили штрихами на иОМ или иЬОМ (среда с отсутствием уридина и лейцина) и позволяли расти в течение 3 суток при 30°С. Жидкие культуры, лишенные уридина (среда и2:20 г/л глюкозы; 6,7 г/л азотистых оснований для дрожжей, содержащих сульфат аммония; 0,04 мг/мл каждого из гистидина, лейцина, триптофана и аденина) или лишенные уридина и лейцина (среда иЬ2:20 г/л глюкозы; 6,7 г/л азотистых оснований для дрожжей, содержащих сульфат аммония; и 0,04 мг/мл каждого из гистидина, триптофана и аденина) инокулировали из чашек и стартовые культуры выращивали в течение 20 ч при 30°С, 250 об/мин. Также инокулировали рН-буферную среду, содержавшую 4,2 г/л Б1з-Тпз (ΒΤ-Ш; БТ-иЕ2) для оценки роста дрожжей в условиях нейтральных значений рН. Первичные культуры использовали для инокуляции конечных культур с тем же составом, и рост продолжали до достижения плотности от 1,1 до 4,0 Д.Е./мл.
Для штаммов ΤΕΡ2 (конститутивная экспрессия) клетки собирали, промывали и обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в ΡΒδ. Живые клетки также обрабатывали для сравнения. Для штаммов СОТ1 (индуцибельная экспрессия), экспрессию индуцировали в той же среде 0,5 мМ сульфатом меди в течение 5 ч при 30°С, 250 об/мин. Клетки собирали, промывали и обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в ΡΒδ. Живые клетки также обрабатывали для сравнения.
После обеспечения гибели нагреванием культур ΤΕΡ2 и СОТ1 клетки промывали три раза в ΡΒδ. Общую экспрессию белка измеряли с помощью преципитации с ТСА/анализа связывания с нитроцеллюлозой и экспрессию антигена измеряли вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела против Ыз-метки. Антиген количественно определяли путем интерполяции из стандартной кривой для рекомбинантного, меченного гексагистидином белка Νδ3, который обрабатывали на том же вестернблоте. Результаты представлены на фиг. 16 (убитые нагреванием) и фиг. 17 (живые дрожжи). На этих фигурах показано, что иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей по изобретению хорошо экспрессирует слитый белок поверхностный антиген-коровый антиген ΗΒV с использованием обоих промоторов, и его можно идентифицировать вестерн-блоттингом как в убитых нагреванием, так и живых клетках. Вычисленная экспрессия антигена этой иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей составила ~5000 нг белок на Д.Е. (дрожжевая единица; одна дрожжевая единица (Д.Е.) представляет собой 1х107 клеток дрожжей или эквивалентов клеток дрожжей) или 76 пмоль белка на Д.Е.
Пример 2.
В представленном ниже примере описано получение другой иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей для лечения или профилактики инфекции вирусом гепатита В (НБУ).
Дрожжи (например, δассЬа^οтусез сеге\тз1ае) модифицировали способами инженерии для экспрессии различных слитых белков ΗΒV, каждый из которых имеет структуру, схематично представленную на фиг. 3, под контролем индуцируемого медью промотора СОТ1 или промотора ΤΕΡ2. В каждом случае слитый белок представлял собой единый полипептид приблизительно из 945 аминокислот со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующими δΕφ ΙΌ Ν0:36: (1) Ν-концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (положения 1-5 δΕφ ΙΌ Ν0:36); 2) аминокислотная последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена части рге^1 большого (Ь) поверхностного белка ΗΒV генотипа С (уникальная для Ь) (например, положения 21-47 δΕφ ΙΌ Ν0:11 или положения 6-32 δΕφ ΙΌ Ν0:36); 3) аминокислотная последовательность полноразмерного малого (δ) поверхностного антигена ΗΒV генотипа С (например, положения 176-400 δΕφ ΙΌ Ν0:11 или положения 33-257 δΕφ ΙΌ Ν0:36); 4) спейсер/линкер из двух аминокислот (Ьеи-О1и) для облегчения клонирования и манипулирования последовательностями (положения 258 и 259 δΕφ ΙΌ Ν0:36); 5) аминокислотная последовательность части полимеразы ΗΒV генотипа С, включающая домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 δΕφ ΙΌ Ν0:10 или положения 260-604 δΕφ ΙΌ Ν0:36); 6) коровый белок ЖУ генотипа С (например, положения 31-212 δΕφ ΙΌ Ν0:9 или положения 605-786 δΕφ ΙΌ Ν0:36); 7) аминокислотная последовательность Х-антигена ΗΒУ генотипа С (например, положения 2-154 δΕφ ΙΌ Ν0:12 или положения 787939 δΕφ ΙΌ Ν0:36) и 8) гексагистидиновая метка (положения 940-945 δΕφ ΙΌ Ν0:36). Этот слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, содержащая этот белок, могут быть в общем обозначены в настоящем описании как МΑ^ΕΑΡ-δреx, М^рех или 0Ι-13005.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок δΕφ ΙΌ Ν0:36 (кодоноптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕφ ΙΌ Ν0:35. δΕφ ΙΌ Ν0:36 имеет ожидаемую приблизительную молекулярную массу 106-107 кДа. δΕφ ΙΌ Ν0:36
- 85 028659 содержит множество эпитопов или доменов, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка, включая несколько эпитопов, описанных выше для δΕΟ ΙΌ N0:34. Кроме того, домен обратной транскриптазы, используемый в этом слитом белке, содержит несколько положений аминокислот, которые известны тем, что они мутируют в качестве ответа, состоящего в устойчивости к лекарственному средству, на лечение противовирусными лекарственными средствами, и, таким образом, могут быть мутантными в этом слитом белке для обеспечения терапевтического или профилактического иммунотерапевтического средства, которое нацелено на конкретные мутации, обеспечивающие устойчивость к лекарственному средству (ускользание). Эти положения аминокислот представляют собой, относительно δΕΟ ΙΌ N0:36, положение аминокислоты: 432 ^а1, известный тем, что он мутирует в Ьеи после терапии ламивудином); положение 439 (Ьеи, известный тем, что он мутирует в Ме1 после терапии ламивудином); положение 453 (А1а, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии тенофовиром); положение 463 (Ме1, известный тем, что он мутирует в Не или Vа1 после терапии ламивудином) и положение 495 (Акп, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии адефовиром).
Для получения второго иммунотерапевтического средства на основе дрожжей с использованием отличающегося Ц-концевого пептида в антигене дрожжи (например, δассЬа^οтусек сегеуШае) модифицировали способами инженерии для экспрессии различных слитых белков ΗΒν, также имеющих основную структуру, схематично представленную на фиг. 3, под контролем индуцируемого медью промотора СОТ1 или промотора ΊΈΡ2. В этом втором случае препропоследовательность α-фактора (соответствующая δΕΟ ΙΌ N0:89) использовали вместо синтетического ^концевого пептида, описанного выше, в слитой конструкции, соответствующей δΕΟ ΙΌ N0:36. В кратком изложении, новый слитый белок представлял собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:92: (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к расщеплению протеасомами и стабилизации или усиления экспрессии (δΕΟ ΙΌ N0:89, положения 1-89 δΕΟ ΙΌ N0:92); 2) спейсер/линкер из двух аминокислот (ТЬг^ег), облегчающий клонирование и манипулирование последовательностями (положения 90-91 δΕΟ ΙΌ N0:92); 3) аминокислотная последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена части рге-δ 1 большого (Ь) поверхностного белка ΗΒν генотипа С (уникальная для Ь) (например, положения 21-47 δΕΟ ΙΌ N0:11 или положения 92-118 δΕΟ ΙΌ N0:92); 4) аминокислотная последовательность полноразмерного малого (δ) поверхностного антигена ΗΒν генотипа С (например, положения 176-400 δΕΟ ΙΌ N0:11 или положения 119-343 δΕΟ ΙΌ N0:92); 5) спейсер/линкер из двух аминокислот (Ьеи-01и), облегчающий клонирование и манипулирование последовательностями (например, положения 344-345 δΕΟ ΙΌ N0:92); 6) аминокислотная последовательность части полимеразы ΗΒν генотипа С, включающая домен обратной транскриптазы (например, положения 247-691 δΕΟ ΙΌ N0:10 или положения 346-690 δΕΟ ΙΌ N0:92); 7) коровый белок ΗΒν генотипа С (например, положения 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:9 или положения 691-872 δΕΟ ΙΌ N0:92); 8) аминокислотная последовательность Х-антигена ΗΒν генотипа С (например, положения 2154 δΕΟ ΙΌ N0:12 или положения 873-1025 δΕΟ ΙΌ N0:92); и 9) гексагистидиновая метка (например, положения 1026-1031 δΕΟ ΙΌ N0:92). Этот слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, содержащая этот белок, могут быть в общем обозначены в настоящем описании как а1рЬа^рех, а^рех или 0Ι-13004.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок δΕΟ ΙΌ N0:92 (кодоноптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ N0:91. δΕΟ ΙΌ N0:92 имеет ожидаемую приблизительную молекулярную массу 123 кДа. δΕΟ ΙΌ N0:92 содержит множество эпитопов или доменов, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка, включая несколько эпитопов, описанных выше для δΕΟ ΙΌ N0:34 и δΕΟ ΙΌ N0:36. Кроме того, домен обратной транскриптазы, используемый в этом слитом белке, содержит несколько положений аминокислот, которые известны тем, что они мутируют в качестве ответа, состоящего в устойчивости к лекарственному средству, на лечение противовирусными лекарственными средствами, и, таким образом, могут быть мутантными в этом слитом белке для обеспечения терапевтического или профилактического иммунотерапевтического средства, которое нацелено на конкретные мутации, обеспечивающие устойчивость к лекарственному средству (ускользание). Эти положения аминокислот представляют собой, в отношении δΕΟ ΙΌ N0:92, положения аминокислот: 518 ^а1, известный тем, что он мутирует в Ьеи после терапии ламивудином); положение 525 (Ьеи, известный тем, что он мутирует в Ме! после терапии ламивудином); положение 539 (А1а, известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии тенофовиром); положение 549 (Ме1, известный тем, что он мутирует в Не или Vа1 после терапии ламивудином) и положение 581 (Акп. известный тем, что он мутирует в ТЬг после терапии адефовиром).
Для создания этих иммунотерапевтических композиций, содержащих аминокислотные последовательности, соответствующие δΕΟ ΙΌ N0:36 и δΕΟ ΙΌ N0:92, ДНК, кодирующую описанные выше консервативные области поверхностного антигена (распознаваемая рецептором гепатоцитов область рге^1 или большого поверхностного антигена и полноразмерного малого поверхностного антигена) и область обратной транскриптазы из полимеразы подвергали слиянию с полноразмерным коровым антигеном и полноразмерным Х-антигеном. ДНК подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в дрожжах, а затем расщепляли Ε^ΚΙ и и встраивали после промотора СОТ1 (р0Р100) или промотора ТΕΡ2
- 86 028659 (рТК57-1) в 2-мкм векторах экспрессии дрожжей. Полученные плазмиды вводили в дрожжи 8ассЬаготусез сегеу!31ае \У303а путем трансфекции с ацетатом лития/полиэтиленгликолем, и первичные трансфектанты отбирали на чашках с твердой минимальной средой, лишенной урацила (ИИМ; среда с отсутствием уридина). Колонии повторно наносили штрихами на ИИМ или иЬИМ (среда с отсутствием уридина и лейцина) и позволяли расти в течение 3 суток при 30°С.
Жидкие культуры, лишенные уридина (И2) или лишенные уридина и лейцина (ИЬ2) инокулировали из чашек и стартовые культуры выращивали в течение 20 ч при 30°С, 250 об/мин. Также инокулировали рН-буферную среду, содержавшую 4,2 г/л В1з-Тпз (ВТ-И2; ВТ-ИЬ2) для оценки роста дрожжей в условиях нейтральных значений рН (данные не представлены). Первичные культуры использовали для инокуляции конечных культур с тем же составом и рост продолжали до достижения плотности от 1,1 до 4,0 Д.Е./мл. Для штаммов ТЕР2 (конститутивная экспрессия), клетки собирали, промывали и обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в РВ8. Для штаммов СИР1 (индуцибельная экспрессия), экспрессию индуцировали в той же среде 0,5 мМ сульфатом меди в течение 5 ч при 30°С, 250 об./мин. Клетки собирали, промывали и обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в РВ8. Живые клетки также обрабатывали для сравнения (данные не представлены).
После обеспечения гибели нагреванием культур ТЕР2 и СИР1, клетки промывали три раза в РВ8. Общую экспрессию белка измеряли с помощью преципитации с ТСА/анализа связывания с нитроцеллюлозой и экспрессию антигена измеряли вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела против Ыз-метки. Антиген количественно определяли путем интерполяции из стандартной кривой для рекомбинантного, меченного гексагистидином белка N83, который обрабатывали на том же вестерн-блоте.
Для иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, экспрессирующей слитый белок, соответствующий 8ЕО ГО N0:36 (01-13005), результаты представлены на фиг. 18. На фиг. 18 показано, что иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей по изобретению хорошо экспрессирует слитый белок поверхностный антиген-коровый антиген НВУ с использованием обоих промоторов, и его можно идентифицировать с использования вестерн-блоттинга убитых нагреванием клеток (экспрессии также достигали в живых клетках дрожжей, данные не представлены). Вычисленная экспрессия антигена этой иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей составляла ~1200 нг белка на Д.Е. или 11 пмоль белка на Д.Е., для роста в ИЬ2.
Для иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, экспрессирующей слитый белок, соответствующий 8ЕО ГО N0:92 (01-13004), результаты представлены на фиг. 19. На фиг. 19 показана экспрессия этой иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей под контролем промотора СИР1 (обозначена на фиг. 19 как а1рЬа-8РЕХ) по сравнению с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, которая экспрессирует неродственный антиген (контрольные дрожжи) и с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, экспрессирующей слитый белок НВУ, соответствующий 8Е0 ГО N0:36 (8РЕХ). На фиг. 19 показано, что иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей хорошо экспрессируют соответствующие слитые белки и также могут быть идентифицированы вестернблоттингом в убитых нагреванием клетках дрожжей. Вычисленная экспрессия антигена этой иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей (а1рЬа-8рех) составила ~5000 нг белка на Д.Е. или 41 пмоль белка на
Д.Е. для роста в ИЬ2.
Пример 3.
В представленном ниже примере описано получение дополнительной иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей для лечения или профилактики инфекции вирусом гепатита В (НВУ).
В этом эксперименте дрожжи (например, 8ассЬаготусез сеге\зз1ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных слитых белков полимераза-коровый антиген НВУ, как схематично представлено на фиг. 4, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид приблизительно из 527 аминокислот со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 8Е0 ГО N0:38: (1) Юконцевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (8Е0 ГО N0:37; положения 1-6 8Е0 ГО N0:38); 2) аминокислотная последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включающей домен обратной транскриптазы домен (например, положения 347-691 8Е0 ГО N0:10 или положения 7-351 8Е0 ГО N0:38); 3) коровый белок НВУ генотипа С (например, положения 31-212 8Е0 ГО N0:9 или положения 352-533 8Е0 ГО N0:38) и 4) гексагистидиновая метка (например, положения 534-539 8Е0 ГО N0:38). 8Е0 ГО N0:38 имеет предсказанную молекулярную массу приблизительно 58 кДа. Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. В дополнительных конструкциях Юконцевой пептид 8Е0 ГО N0:37 заменен отличающимся синтетическим Юконцевым пептидом, соответствующим гомологу 8Е0 ГО N0:37, который удовлетворяет тем же основным структурным требованиям, что и для 8Е0 ГО N0:37, как подробно описано в описании, или N концевой пептид 8Е0 ГО N0:37 заменен Юконцевым пептидом 8Е0 ГО N0:89 или 8Е0 ГО N0:90, и в
- 87 028659 другой конструкции ^концевой пептид отсутствует и метионин включен в первое положение.
В другом эксперименте дрожжи (например, 8ассЬаготусс5 ссгсу151ас) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных слитых белков Х-коровый антиген НВУ, как схематично представлено на фиг. 5, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид приблизительно из 337 аминокислот со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 8Е0 ГО N0:39 (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (8Еф ГО N0:37; положения 1-6 8Еф ГО N0:39); 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного (минус положение 1) Х-антигена НВУ генотипа С (например, положения 2-154 8Еф ГО N0:12 или положения 7-159 8Еф ГО N0:39); 3) коровый белок НВУ генотипа С (например, положения 31-212 8Еф ГО N0:9 или положения 160-341 8Еф ГО N0:39); и 4) гексагистидиновая метка (положения 342-347 8Еф ГО N0:39). 8Еф ГО N0:39 имеет предсказанную приблизительную молекулярную массу 37 кДа. Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. В дополнительных конструкциях N концевой пептид 8Еф ГО N0:37 заменен отличающимся синтетическим ^концевом пептидом, соответствующим гомологу 8Е0 ГО N0:37, который удовлетворяет тем же основным структурным требованиям, что и для 8Е0 ГО N0:37, как подробно описано в описании, или ^концевой пептид 8Еф ГО N0:37 заменен N-концевым пептидом 8Еф ГО N0:89 или 8Еф ГО N0:90, и в другой конструкции ^концевой пептид отсутствует и метионин включен в первое положение.
В другом эксперименте дрожжи (например, 8ассйаготусс5 ссгсу151ас) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных белков полимеразы НВУ, как схематично представлено на фиг. 6 под контролем индуцируемого медью промотора СНР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 8Еф ГО N0:40: (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (8Еф ГО N0:37 или положения 1-6 8Е0 ГО N0:40); 2) аминокислотная последовательность части полимеразы НВУ генотипа С, включая домен обратной транскриптазы (например, положения 347-691 8Еф ГО N0:10 или положения 7351 8Е0 ГО N0:40); и 3) гексагистидиновая метка (положения 352-357 8Еф ГО N0:40). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Кроме того, в одном из вариантов осуществления последовательность этой конструкций можно модифицировать для внесения одной или нескольких из следующих мутаций, обеспечивающих устойчивость к противовирусным средствам: Г1М2041, гГО180М, Г1М204У, г1У173Ь, гШ236Т, Г1А194Т (положения приведены в отношении полноразмерной аминокислотной последовательности для полимеразы НВУ). В одном из вариантов осуществления создают шесть различных иммунотерапевтических композиций, каждая из которых содержит одну из этих мутаций. В других вариантах осуществления все или некоторые из мутаций включены в единый слитый белок. В дополнительных конструкциях ^концевой пептид 8Еф ГО N0:37 заменен отличающимся синтетическим ^концевым пептидом, соответствующим гомологу 8Е0 ГО N0:37, который удовлетворяет тем же основным структурным требованиям, что и для 8Е0 ГО N0:37, как подробно описано в описании, или ^концевой пептид 8Еф ГО N0:37 заменен ^концевым пептидом 8Еф ГО N0:89 или 8Еф ГО N0:90, и в другой конструкции ^концевой пептид отсутствует и метионин включен в первое положение.
В другом эксперименте дрожжи (например, 8ассйаготусс5 ссгсу151ас) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных слитых белков полимераза-поверхностный антиген-коровый антиген НВУ, как схематично показано на фиг. 7, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 8Е0 ГО N0:41: (1) ^концевой пептид для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабильной экспрессии (например, положения 1-5 8Еф ГО N0:41); 2) аминокислотная последовательность распознаваемого рецепторами гепатоцитов домена части ргс-81 большого (Ь) поверхностного белка НВУ (уникальная для Ь) (например, положения 21-47 8Еф ГО N0:11 или положения 6-32 8Еф ГО N0:41); 3) аминокислотная последовательность малого (8) поверхностного белка НВУ (например, положения 176400 8Е0 ГО N0:11 или положения 33-257 8Еф ГО N0:41); 4) спейсер/линкер из двух аминокислот, облегчающий клонирование и манипулирование последовательностями (например, положения 258 и 259 8Еф ГО N0:41); 5) аминокислотная последовательность полимеразы НВУ, содержащая домен обратной транскриптазы домен (например, положения 247-691 8Еф ГО N0:10 или положения 260-604 8Еф ГО N0:41); 6) аминокислотная последовательность корового белка НВУ (например, положения 31-212 8Еф ГО N0:9 или положения 605-786 8Еф ГО N0:41) и 7) гексагистидиновая метка (например, положения 787-792 8Еф ГО N0:41). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. Кроме того, в одном из вариантов осуществления последовательность этой конструкции можно модифицировать для внесения одной или нескольких или всех из следующих мутаций, обеспечивающих устойчивость к противовирусным средствам: Г1М2041, гГО180М, Г1М204У, г1У173Ь, гШ236Т, Г1А194Т (положения приведены в отношении полноразмерной аминокислот- 88 028659 ной последовательности для полимеразы НВУ). В одном из вариантов осуществления создают шесть различных композиций для иммунотерапии, каждая из которых содержит одну из этих мутаций. В других вариантах осуществления все или некоторые из мутаций включены в единый слитый белок. В одном из вариантов осуществления эта конструкция также содержит одну или несколько мутаций, обеспечивающих устойчивость к противовирусным средствам, в поверхностном антигене. В дополнительных конструкциях ^концевой пептид, соответствующий положениям 1-5 8ЕО ГО N0:41, заменен отличающимся синтетическим ^концевым пептидом, соответствующим гомологу положений 1-5 8Е0 ГО N0:41, который удовлетворяет тем же основным структурным требованиям, что и для положений 1-5 8Е0 ГО N0:41 (или 8Е0 ГО N0:37), как подробно описано в описании, или ^концевой пептид положений 1-5 8Е0 ГО N0:41 заменен ^концевым пептидом 8Е0 ГО N0:89 или 8Е0 ГО N0:90, и в другой конструкции ^концевой пептид отсутствует, и в первое положение включен метионин.
Для получения описанных выше слитых белков и иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих такие белки, в кратком изложении, ДНК, кодирующую слитый белок, подвергают оптимизации кодонов для экспрессии в дрожжах, а затем расщепляют ЕсоК1 и НоН и встраивают после промотора СИР1 (р01-100) или промотора ТЕР2 (рТК57-1) в 2-мкм векторах экспрессии дрожжей. Полученные плазмиды вводят в дрожжи 8ассЬаготусе8 сегеуыае \У303 а путем трансфекции с ацетатом лития/полиэтиленгликолем, и первичные трансфектанты отбирают на чашках с твердой минимальной средой, лишенной урацила ШЭМ; среда с отсутствием уридина). Колонии повторно наносят штрихами на υΌΜ или иБЭМ (среда с отсутствием уридина и лейцина) и позволяют им расти в течение 3 суток при 30°С.
Жидкие культуры, лишенные уридина (υ2) или лишенные уридина и лейцина (иЬ2), инокулируют из чашек и стартовые культуры выращивают в течение 20 ч при 30°С, 250 об/мин. Также инокулируют рН-буферную среду, содержащую 4,2 г/л В18-Тг18 (ВТ-и2; ВТ-иЬ2) для оценки роста дрожжей в условиях нейтральных значений рН. Первичные культуры используют для инокуляции конечных культур с тем же составом и рост продолжают до достижения плотности от 1,1 до 4,0 Д.Е./мл. Для штаммов ТЕР2 (конститутивная экспрессия), клетки собирали, промывали и обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в РВ8. Для штаммов СиР1 (индуцибельная экспрессия), экспрессию индуцировали в той же среде 0,5 мМ сульфатом меди в течение 5 ч при 30°С, 250 об/мин. Клетки собирают, промывают и обеспечивают их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в РВ8. Живые клетки также обрабатывали для сравнения.
После обеспечения гибели нагреванием культур ТЕР2 и СиР1, клетки промывают три раза в РВ8. Общую экспрессию белка измеряют с помощью преципитации с ТСА/анализа связывания с нитроцеллюлозой и экспрессию белка измеряют вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела против Ык-метки. Слитый белок количественно определяют путем интерполяции из стандартной кривой для рекомбинантного, меченного гексагистидином белка N83, который обрабатывали на том же вестернблоте.
Пример 4.
В представленном ниже примере описано получение дополнительных иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей для лечения или профилактики инфекции вирусом гепатита В (НВУ).
В этом примере описано получение четырех различных иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, каждая из которых предназначена для экспрессии одного белка НВУ. Эти иммунотерапевтические средства на основе дрожжей с одним белком НВУ можно использовать в комбинации или последовательно друг с другом и/или в комбинации или последовательно с другими иммунотерапевтическими средствами на основе дрожжей, такими как средства, описанные в любом из примеров 1-3 и 5-8, включая иммунотерапевтические средства на основе дрожжей с множеством белков НВУ, описанные в настоящем описании. Кроме того, иммунотерапевтические средства на основе дрожжей с одним белком НВУ, такие как средства, описанные в этом примере, можно получать с использованием последовательности НВУ для любого данного генотипа или подгенотипа, и дополнительные иммунотерапевтические средства на основе дрожжей с поверхностным антигеном НВУ можно получать с использованием последовательностей НВУ для любого одного или нескольких дополнительных генотипов или подгенотипов для обеспечения набора приправ из различных антигенов и генотипов и/или подгенотипов НВУ, каждый из которых предоставляют в контексте иммунотерапевтического средства на основе дрожжей по изобретению, или в стратегии иммунизации/введения, которая может включать по меньшей мере одно иммунотерапевтическое средство на основе дрожжей по изобретению.
В этом примере получают следующие четыре иммунотерапевтических продукта на основе дрожжей.
Поверхностный антиген НВУ. 8ассЬаготусе8 сегеуыае модифицируют способами инженерии для экспрессии поверхностного белка НВУ под контролем индуцируемого медью промотора СиР1 или промотора ТЕР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 8Е0 ГО N0:93: 1) ^концевой пептид 8Е0 ГО N0:89 (положения 1-89 8Е0 ГО N0:93); 2) аминокислотная по- 89 028659 следовательность практически полноразмерного (минус положение 1) большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒν генотипа С (например, положения 2-400 δΕΟ ΙΌ N0:11 или положения 90-488 δΕΟ ΙΌ N0:93) и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 489-494 δΕΟ ΙΌ N0:93). Альтернативно N концевой пептид может быть заменен δΕΟ ΙΌ N0:37 или ее гомологом или другим ^концевом пептидом, описанным в настоящем описании.
Антиген полимеразы ΗΒν. δассЬа^οтусе8 сегеу181ае модифицируют способами инженерии для экспрессии следующего белка полимеразы ΗΒν под контролем индуцируемого медью промотора СиР1 или промотора ТРР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:94: 1) ^концевой пептид δΕΟ ΙΌ N0:89 (положения 1-89 δΕΟ ΙΌ N0:94); 2) аминокислотная последовательность части полимеразы ΗΒν генотипа С, включающей домен обратной транскриптазы (например, положения 347-691 δΕΟ ΙΌ N0:10 или положения 90-434 δΕΟ ΙΌ N0:94) и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 435-440 δΕΟ ΙΌ N0:94). Альтернативно ^концевой пептид можно заменять δΕΟ ΙΌ N0:37 или ее гомологом или другим ^концевым пептидом, описанным в настоящем описании.
Коровый антиген ΗΒν. δη^1κΗΌΐη\^5 сегеу151ае модифицируют способами инженерии для экспрессии следующего корового белка ΗΒν под контролем индуцируемого медью промотора СиР1 или промотора ТРР2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:95: 1) ^концевой пептид δΕΟ ΙΌ N0:89 (положения 1-89 δΕΟ ΙΌ N0:95); 2) аминокислотная последовательность части корового белка ΗΒν генотипа С (например, положения 31-212 δΕΟ ΙΌ N0:9 или положения 90-271 δΕΟ ΙΌ N0:95) и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 272-277 δΕΟ ΙΌ N0:95). Альтернативно ^концевой пептид можно заменять δΕΟ ΙΌ N0:37 или ее гомологом или другим ^концевым пептидом, описанным в настоящем описании.
Х-антиген ΗΒν. δассЬа^οтусе5 сегеу151ае модифицируют способами инженерии для экспрессии следующего Х-антигена ΗΒν под контролем индуцируемого медью промотора СиР1 или промотора ТΕΡ2. В каждом случае слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:96: 1) ^концевой пептид δΕΟ ΙΌ N0:89 (положения 1-89 δΕΟ ΙΌ N0:96); 2) аминокислотная последовательность части Х-антигена ΗΒν генотипа С (например, положения 2-154 δΕΟ ΙΌ N0:12 или положения 90-242 δΕΟ ΙΌ N0:96) и 3) гексагистидиновая метка (например, положения 243-248 δΕΟ ΙΌ N0:96). Альтернативно ^концевой пептид можно заменять δΕΟ ΙΌ N0:37 или ее гомологом или другим N концевым пептидом, описанным в настоящем описании.
Для получения описанных выше иммунотерапевтических композиций, в кратком изложении, ДНК, кодирующую слитый белок, подвергают оптимизации кодонов для экспрессии в дрожжах, а затем расщепляют Ε^ΚΙ и и встраивают после промотора СиР1 (ρΟΙ-100) или промотора ТΕΡ2 (рТК57-1) в 2-мкм векторах экспрессии дрожжей. Полученные плазмиды вводят в дрожжи δассЬа^οтусе5 сегеу151ае \ν303α путем трансфекции с ацетатом лития/полиэтиленгликолем, и первичные трансфектанты отбирают на чашках с твердой минимальной средой, лишенной урацила (υΌΜ; среда с отсутствием уридина). Колонии повторно наносят штрихами на υΌΜ или υΌΌΜ (среда с отсутствием уридина и лейцина) и позволяют им расти в течение 3 суток при 30°С.
Жидкие культуры, лишенные уридина (υ2) или лишенные уридина и лейцина (υΌ2), инокулируют из чашек и стартовые культуры выращивают в течение 20 ч при 30°С, 250 об/мин. Также инокулируют рН-буферную среду, содержащую 4,2 г/л Βίδ-Έίδ ^Т-Ш; ΒТ-υ^2) для оценки роста дрожжей в условиях нейтральных значений рН. Первичные культуры используют для инокуляции конечных культур с тем же составом и рост продолжают до достижения плотности от 1,1 до 4,0 Д.Е./мл. Для штаммов ТΕΡ2 (конститутивная экспрессия), клетки собирают, промывают и обеспечивают их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в ΡΒδ. Для штаммов СЦР1 (индуцибельная экспрессия), экспрессию индуцируют в той же среде 0,5 мМ сульфатом меди в течение 5 ч при 30°С, 250 об/мин. Клетки собирают, промывают и обеспечивают их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч в ΡΒδ. Живые клетки также обрабатывают для сравнения.
После обеспечения гибели нагреванием культур ТΕΡ2 и СЦР1, клетки промывают три раза в ΡΒδ. Общую экспрессию белка измеряют с помощью преципитации с ТСА/анализа связывания с нитроцеллюлозой и экспрессию белка измеряют вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела против Ык-метки. Слитый белок количественно определяют путем интерполяции из стандартной кривой для рекомбинантного, меченного гексагистидином белка №3, который обрабатывали на том же вестернблоте.
Пример 5.
В представленном ниже примере описано получение нескольких различных иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей для лечения или профилактики инфекции вирусом гепатита В (ΗΒν).
- 90 028659
В этом примере описано получение иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, экспрессирующих белки, которые сконструированы для достижения одной или нескольких из следующих целей: (1) получение конструкции НВУ с несколькими антигенами, которая содержит менее чем приблизительно 690 аминокислот (соответствующих менее чем двум третям генома НВУ), для получения иммунотерапевтического клинического продукта на основе дрожжей, который соответствует рекомендациям КесотЬшап! ЭНА АбОкогу СоттШее (КАС), если это необходимо; (2) получение конструкции НВУ с множеством антигенов, содержащей максимальное количество известных Т-клеточных эпитопов, связанных с иммунными ответами на острые/самоограничивающиеся инфекции НВУ и/или хронические инфекции НВУ; (3) получение конструкции НВУ с множеством антигенов, содержащей Т-клеточные эпитопы, которые являются наиболее консервативными среди генотипов; и/или (4) получение конструкции НВУ с множеством антигенов, модифицированной так, чтобы она в большей степени соответствовала одной или нескольким консенсусным последовательностям, консенсусным эпитопам и/или эпитопу(пи) из конкретных генотипов. Модификации, продемонстрированные в этом примере, можно использовать по отдельности или вместе с любыми другими иммунотерапевтическими средствами на основе дрожжей, описанными или рассматриваемыми в настоящем описании.
В одном эксперименте конструировали иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, которая содержит дрожжи, экспрессирующие слитый белок, удовлетворяющий требованиям для описанных выше целей, и содержащие части каждого из основных белков НВУ: поверхностный антиген НВУ, полимераза, коровый антиген и Х-антиген. Для конструирования этого слитого белка отдельные антигены НВУ в слитой конструкции были уменьшенными в размере (по сравнению с полноразмерными), и слитые сегменты по отдельности модифицировали для максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов, соответствующих эпитопам, идентифицированным в табл. 5. Включение Т-клеточных эпитопов в этот слитый белок имело следующий приоритет.
Эпитопы, идентифицированные при иммунных ответах как на острые/самоограничивающиеся инфекции НВУ, так и на хронические инфекции НВУ > эпитопы, идентифицированные при иммунном ответе на острые/самоограничивающиеся инфекции НВУ > эпитопы, идентифицированные при иммунном ответе на хронические инфекции НВУ.
При конструировании каждого сегмента этого слитого белка также минимизировали искусственные области соединения, поскольку без связи с теорией полагают, что естественная эволюция привела к ί) непрерывным последовательностям в вирусе, которые хорошо экспрессируются; и ίί) иммунопротеасомам в антигенпредставляющих клетках, которые могут надлежащим образом расщеплять и представлять эти последовательности иммунной системе. Таким образом, слитый белок со многими неприродными областями соединения может быть менее полезен в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей по сравнению со слитым белком, в котором больше сохранены природные последовательности белков НВУ.
Для конструирования сегмента, содержащего поверхностный антиген НВУ, для применения в слитом белке полноразмерный большой (Ь) поверхностный антигенный белок из НВУ генотипа С уменьшали в размере путем укорочения N и С-концевых последовательностей (положения 1-119 и положения 369-400 большого антигена удаляли по сравнению с полноразмерным поверхностным антигенным белком Ь, таким как поверхностный антигенный белок, соответствующий 3ЕЦ ГО N0:11). Остальную часть выбирали, частично, для максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов МНС класса I, соответствующих эпитопам, идентифицированным в табл. 5, с использованием приоритета для включения Т-клеточных эпитопов, описанных выше. Полученный сегмент поверхностного антигена соответствует 31 А) ГО N0:97.
Для конструирования сегмента, содержащего полимеразу НВУ, для применения в слитом белке существенные части полноразмерной полимеразы из НВУ генотипа С, которая представляет собой очень крупный белок размером приблизительно 842 аминокислот, устраняли путем сосредоточения на включении домена активного центра (из КТ-домена), который представляет собой наиболее консервативную область белка среди генотипов и изолятов НВУ. КТ-домен также включает несколько областей, в которых, как известно, возникают мутации, обеспечивающие устойчивость к лекарственным средствам; таким образом, эту часть конструкции можно далее модифицировать в других версиях, при необходимости, для нацеливания на обеспечивающие ускользание мутации в целевой терапии. В слитых белках, включающих меньше белков НВУ, размер сегмента полимеразы может быть увеличен, если желательно. Выбранную часть полимеразы НВУ включали для максимизации известных Т-клеточных эпитопов с использованием стратегии приоритета, описанной выше.
Последовательность полноразмерной полимеразы, которую устраняли таким путем, включала последовательность вне КТ-домена и последовательности в КТ-домене, которые не содержали известных Т-клеточных эпитопов, или которые включали два эпитопа, идентифицированных у менее чем 17% или 5% соответственно, пациентов с генотипа А, у которых были идентифицированы эти эпитопы (см. Эектопб е1 а1., 2008 и табл. 5). Все, кроме одного из остальных Т-клеточных эпитопов в сегменте полимеразы НВУ генотипа С, абсолютно соответствовали опубликованным эпитопам из анализа генотипа А, и один эпитоп с несоответствием одной аминокислоты был модифицирован, чтобы он соответствовал
- 91 028659 опубликованному эпитопу. Полученный сегмент полимеразы НВУ соответствует 8ЕЦ ГО N0:98.
Для конструирования сегмента, содержащего коровый антиген НВУ, для применения в слитом белке полноразмерный коровый белок (например, сходный с положениями 31-212 8ЕЦ ГО N0:9) из НВУ генотипа С модифицировали следующим образом: ί) одну аминокислоту в Т-клеточном эпитопе белка, происходящего из генотипа С, модифицировали для обеспечения абсолютного соответствия известному Т-клеточному эпитопу, описанному в табл. 5; ίί) семь аминокислот на Оконце, которые не содержали Тклеточный эпитоп, удаляли, сохраняя несколько фланкирующих аминокислот на Оконце первого известного Т-клеточного эпитопа в белке; и ίίί) 24 С-концевых аминокислоты корового антигена удаляли, что не приводило к удалению известных эпитопов, но удаляло исключительно положительно заряженный С-конце. Положительно заряженный С-конец является подходящим кандидатом для удаления из антигена, подлежащего в дрожжах, поскольку в некоторых конструкциях такие последовательности могут быть токсичными для дрожжей вследствие конкурентного препятствования природным связывающим РНК белкам дрожжей, которые часто обогащены аргинином (положительно заряжены). Таким образом, удаление этой части корового антигена является приемлемым. Полученный сегмент корового антигена НВУ представлен в 8ЕЦ ГО N0:99.
Для конструирования сегмента, содержащего Х-антиген НВУ, для применения в слитом белке, полноразмерный Х-антиген из НВУ генотипа С (например, сходный с 8ЕЦ ГО N0:12) укорачивали на N и С-конце с получением сегмента Х-антигена, который включает большинство из известных Т-клеточных эпитопов из табл. 5, которые кластеризуются в Х-антигене. Два эпитопа модифицировали одной аминокислотной заменой, чтобы они соответствовали опубликованным последовательностям Т-клеточных эпитопов, и последовательность, фланкирующую Т-клеточные эпитопы на концах сегмента, оставляли для облегчения эффективного процессинга и презентации правильных эпитопов антигенпредставляющими клетками. Полученный сегмент Х-антигена НВУ соответствует 8ЕЦ ГО N0:100.
Для конструирования полного слитого белка, содержащего все четыре сегмента белка НВУ, связывали четыре сегмента НВУ, описанных выше (поверхностный антиген-ро1-коровый антиген-Х) с получением единого белка, который оптимизирует включение Т-клеточных эпитопов, охватывающих все белки, кодируемые геномом НВУ, и которые, как ожидается, удовлетворяют критериям для вирусных белков для предполагаемого клинического применения.
В конечном итоге создавали два различных слитых белка, каждый с отличающимся N-концевым пептидом, добавленным для усиления и/или стабилизации слитого белка в дрожжах. Кроме того, на Сконце включали гексагистидиновый пептид для облегчения идентификации белка. Как и для всех других белков, используемых в иммунотерапевтических композициях на основе дрожжей, описанных в настоящем описании, в дополнительных конструкциях ^концевой пептид 8ЕЦ ГО N0:37 или 8ЕЦ ГО N0:89, используемый в этом примере, может быть заменен отличающимся синтетическим N-концевым пептидом (например, гомолог 8ЕЦ ГО N0:37, который удовлетворяет основным структурным требованиям для 8ЕЦ ГО N0:37, как подробно описано в описании), или гомологом ^концевого пептида 8ЕЦ ГО N0:89 или 8ЕЦ ГО N0:90, и в другой конструкции ^концевой пептид отсутствует и метионин включен в первое положение. Кроме того, если желательно, между сегментами слитого белка могут быть добавлены линкерные последовательности из одной, двух, трех или более аминокислот. Также, хотя эти конструкции конструировали с использованием белков НВУ из генотипа С в качестве остова, для конструирования этих белковых сегментов можно использовать любой другой генотип, подгенотип НВУ или белки НВУ из других штаммов или изолятов, как проиллюстрировано в примере 7. Наконец, если один или несколько исключены из слитого белка, как описано в настоящем описании, тогда последовательность из остальных сегментов можно расширять для включения дополнительных Т-клеточных эпитопов и фланкирующих областей белков (например, см. пример 8).
Для получения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, содержащих слитый белок, сконструированный из сегментов НВУ, описанных выше, дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сеге\351ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии различных слитых белков поверхностный антиген-полимераза-коровый антиген-Х НВУ, оптимизированных, как рассмотрено выше, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1 или промотора ТЕР2.
В одной конструкции слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 8ЕЦ ГО N0:101: (1) ^концевой пептид, который представляет собой препропоследовательность α-фактора, для сообщения устойчивости к деградации протеосомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:89 (положения 1-89 8ЕЦ ГО N0:101); (2) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:97 (положения 90-338 8ЕЦ ГО N0:101); (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:98 (положения 339-566 8ЕЦ ГО N0:101); (4) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:99 (положения 567-718 8ЕЦ ГО N0:101); (5) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:100 (положения 719-778 8ЕЦ ГО N0:101); и (6) гексагистидиновая метка (например, положения 779-784 8ЕЦ ГО N0:101).
Во второй конструкции слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими эле- 92 028659 ментами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующими 8ЕЦ ГО N0:102: (1) ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:37 (положения 1-6 8ЕЦ ГО N0:102); (2) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 2-248 8ЕЦ ГО N0:97 (положения 7-254 8ЕЦ ГО N0:102); (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:98 (положения 255-482 8ЕЦ ГО N0:102); (4) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:99 (положения 483-634 8ЕЦ ГО N0:102); (5) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая 8ЕЦ ГО N0:100 (положения 635-694 8ЕЦ ГО N0:102); и (6) гексагистидиновая метка (например, положения 695-700 8ЕЦ ГО N0:102).
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей, экспрессирующие эти слитые белки, продуцируют с использованием протокола, подробно описанного в примере 1-4.
Пример 6.
В представленном ниже примере описано получение дополнительных иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей, которые максимизируют нацеливание на генотипы и/или подгенотипы НВУ вместе с включением консервативного антигена и/или эпитопа в единой композиции для обеспечения единых композиций с потенциалом к лечению большого количества индивидуумов или групп индивидуумов.
Для получения конструкции, содержащей множество различных генотипов в одной и той же иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, дрожжи (например, 8ассЬаготусе8 сеге\381ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии слитого белка НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий четыре коровых антигена, каждый из отличающегося генотипа (генотипы А, В, С и Ό НВУ), соответствующий 8ЕЦ ГО N0:105: 1) ^концевой метионин в положении 1 8ЕЦ ГО N0:105; 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа А (например, положения 31-212 8ЕЦ ГО N0:1 или положения 2-183 8ЕЦ ГО N0:105); 3) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа В (например, положения 30-212 8ЕЦ ГО N0:5 или положения 184-395 8ЕЦ ГО N0:105); 4) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа С (например, положения 30-212 8ЕЦ ГО N0:9 или положения 396-578 8ЕЦ ГО N0:105); 5) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа Ό (например, положения 30-212 8ЕЦ ГО N0:13 или положения 579-761 8ЕЦ ГО N0:105); и 5) гексагистидиновая метка (например, положения 762-767 8ЕЦ ГО N0:105). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. ^концевой метионин в положении 1 может быть заменен 8ЕЦ ГО N0:37 или ее гомологом, или α-препропоследовательностью 8ЕЦ ГО N0:89 или 8ЕЦ ГО N0:90 или их гомологом, или любой другой подходящей ^концевой последовательностью, если желательно. Кроме того, можно встраивать линкерные последовательности между белками НВУ для облегчения клонирования и манипулирования конструкцией, если желательно. Эта конструкция является иллюстративной, поскольку любую другую комбинацию генотипов и/или подгенотипов НВУ можно вносить в эту конструкцию при желании для конструирования иммунотерапевтического продукта с единым антигеном НВУ с широкой клинической применимостью и эффективной конструкцией для получения. Аминокислотная последовательность 8ЕЦ ГО N0:105 также содержит несколько известных Т-клеточных эпитопов, и определенные эпитопы модифицированы, чтобы они соответствовали опубликованной последовательности для данного эпитопа, которая может быть идентифицирована путем сравнения последовательности с эпитопами, представленными, например, в табл. 5.
Для получения конструкции, содержащей более одного антигена НВУ и более одного генотипа в одной и той же иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, дрожжи (например, 8ассНаготусе8 сеге\а81ае) модифицируют способами инженерии для экспрессии слитого белка НВУ под контролем подходящего промотора, такого как индуцируемый медью промотор СИР1 или промотор ТЕР2. Белок представляет собой единый полипептид, содержащий два коровых антигена и два Х-антигена, причем каждый из пары происходит из отличающегося генотипа (генотипы А и С НВУ), соответствующий 8ЕЦ ГО N0:106: 1) ^концевой метионин в положении 1 8ЕЦ ГО N0:106; 2) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа А (например, положения 31212 8ЕЦ ГО N0:1 или положения 2-183 8ЕЦ ГО N0:106); 3) аминокислотная последовательность полноразмерного Х-антигена из НВУ генотипа А (например, положения 8ЕЦ ГО N0:4 или положения 184-337 8ЕЦ ГО N0:106); 4) аминокислотная последовательность практически полноразмерного корового белка из НВУ генотипа С (например, положения 30-212 8ЕЦ ГО N0:9 или положения 338-520 8ЕЦ ГО N0:106); 5) аминокислотная последовательность полноразмерного Х-антигена из НВУ генотипа С (например, 8ЕЦ ГО N0:8 или положения 521-674 8ЕЦ ГО N0:106); и 5) гексагистидиновая метка (например, положения 675-680 8ЕЦ ГО N0:106). Последовательность также содержит эпитопы или домены, которые предположительно будут усиливать иммуногенность слитого белка. ^концевой метионин в положении 1 можно
- 93 028659 заменять 8Ε0 ΙΌ N0:37 или ее гомологом, или α-препропоследовательностью 8Ε0 ГО N0:89 или 8Ε0 ГО N0:90 или ее гомологом. Аминокислотная последовательность 8Ε0 ГО N0:106 также содержит несколько известных Т-клеточных эпитопов, и определенные эпитопы модифицированы, чтобы соответствовать опубликованной последовательности для данного эпитопа, которую можно идентифицировать путем сравнения последовательности, например, с эпитопами, представленными в табл. 5.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей, экспрессирующие эти слитые белки, получают с использованием протокола, подробно описанного в примерах 1-4.
Пример 7.
В представленном ниже примере описано получение дополнительных иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей, в которых используются консенсусные последовательности для генотипов НВУ, дополнительно максимизируя нацеливание на генотипы и/или подгенотипы НВУ вместе с включением консервативного антигена и/или эпитопа для предоставления композиций с потенциалом к лечению большого количества индивидуумов или групп индивидуумов с использованием одной композиции.
Для конструирования нескольких конструкций, которые включают сегменты НВУ из каждого из поверхностного белка, корового антигена, полимеразы и Х-антигена, в качестве матрицы использовали структуру слитого белка, описанную в примере 5 для 8Ε0 ГО N0:101 и 8Ε0 ГО N0:102 (и таким образом подчасти этих слитых белков, соответствующие 8Ε0 ГО N0:97 (поверхностный антиген), 8Ε0 ГО N0:98 (полимераза), 8Ε0 ГО N0:99 (коровый антиген) и 8Ε0 ГО N0:100 (Х-антиген)). Что касается консенсусных последовательностей для каждого из НВУ генотипа А, В, С и Ό, которые были сконструированы из множества источников последовательностей НВУ (например, Уи апб Уиап е! а1., 2010, для 8, корового антигена и X, где консенсусные последовательности получали из 322 последовательностей НВУ, или для Ро1 (КТ) из 8(апГогб Ишуегзйу Н1У Эгид Кез1з!апсе Эа1аЬазе. НВУзес.] апб НВУ 8йе Ке1еазе №!ез), последовательности в матричной структуре матрицы заменяли консенсусными последовательностями, соответствующими тем же положениям, если использование консенсусной последовательности не изменяло один из известных Т-клеточных эпитопов острой или самоограничивающейся инфекции или один из известных участков мутации в полимеразе, обеспечивающих ускользание, в случае которых эти положения соответствовали опубликованной последовательности для этих эпитопов или участков мутации. Дополнительные антигены можно конструировать, исходя только из консенсусных последовательностей или с использованием других опубликованных эпитопов, когда они станут известными.
Первую конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа А конструировали следующим образом. С использованием 8Ε0 ГО N0:97, 8Ε0 ГО N0:98, 8Ε0 ГО N0:99 и 8Ε0 ГО N0:100, которые были сконструированы для уменьшения размеров подвергаемых слиянию сегментов (по сравнению с полноразмерными), для максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов, соответствующих эпитопам, идентифицированным в табл. 5 (приоритет, как описано выше), и для минимизации искусственных областей соединения, создавали новые сегменты для слияния на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа А. Новый сегмент поверхностного антигена соответствует положениям 1-249 8Ε0 ГО N0:107. Новый сегмент полимеразы (КТ) соответствует положениям 250-477 8Ε0 ГО N0:107. Новый коровый сегмент соответствует положениям 478-629 8Ε0 ГО N0:107. Новый сегмент Х-антигена соответствует положениям 630-689 8Ε0 ГО N0:107. Этот полный слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, где последовательности НВУ соответствуют 8Ε0 ГО N0:107 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность 8Ε0 ГО N0:107, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Ε0 ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид Тйг-8ег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 1-249 8Ε0 ГО N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа А, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая положениям 250-477 8Ε0 ГО N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа А, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (5) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая положениям 478-629 8Ε0 ГО N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа А, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая положениям 630-689 8Ε0 ГО N0:107, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа А, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; и (7) необязательная гексагистидиновая метка (шесть остатков гистидина после положения 689 8Ε0 ГО N0:107). Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая полный слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 0Ι13010. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как 8РЕХу2-А или 8рех-А.
- 94 028659
Вторую конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа В конструировали следующим образом. С использованием δΕΟ ΙΌ N0:97, δΕΟ ΙΌ N0:98, δΕΟ ΙΌ N0:99 и δΕΟ ΙΌ N0:100, которые были сконструированы для уменьшения размеров подвергаемых слиянию сегментов (по сравнению с полноразмерным), для максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов, соответствующих эпитопам, идентифицированным в табл. 5 (приоритет, как описано выше), и для минимизации искусственных областей соединения, создавали новые сегменты для слияния на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа В. Новый сегмент поверхностного антигена соответствует положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:108. Новый сегмент полимеразы (КТ) соответствует положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:108. Новый коровый сегмент соответствует положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108. Новый сегмент Х-антигена соответствует положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:108. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:108 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:108, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬгАег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа В, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа В, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (5) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа В, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:108, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа В, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; и (7) необязательная гексагистидиновая метка. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая полный слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ΟΙ13011. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как δΡΕΧν2-β или ’^рех-В.
Третью конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа С конструировали следующим образом. С использованием δΕΟ ΙΌ N0:97, δΕΟ ΙΌ N0:98, δΕΟ ΙΌ N0:99 и δΕΟ ΙΌ N0:100, которые были сконструированы для уменьшения размеров подвергаемых слиянию сегментов (по сравнению с полноразмерным), для максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов, соответствующих эпитопам, идентифицированным в табл. 5 (приоритет, как описано выше), и для минимизации искусственных областей соединения создавали новые сегменты для слияния на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа С. Новый сегмент поверхностного антигена соответствует положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:109. Новый сегмент полимеразы (КТ) соответствует положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:109. Новый коровый сегмент соответствует положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109. Новый сегмент Х-антигена соответствует положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:109. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:109 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:109, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬгАег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 1-249 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (5) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая положениям 478-629 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:109, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа С, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; и (7) необязательная гексагистидиновая метка. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая полный слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ΟΙ13012. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как δΡΕΧν2-ί'.' или Арех-С.
- 95 028659
Четвертую конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό конструировали следующим образом.
С использованием ЗЕЦ ГО N0:97, ЗЕЦ ГО N0:98, ЗЕЦ ГО N0:99 и ЗЕЦ ГО N0:100, которые были сконструированы для уменьшения размеров подвергаемых слиянию сегментов (по сравнению с полноразмерный), для максимизации включения известных Т-клеточных эпитопов, соответствующих эпитопам, идентифицированным в табл. 5 (приоритет, как описано выше), и для минимизации искусственных областей соединения, создавали новые сегменты для слияния на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό. Новый сегмент поверхностного антигена соответствует положениям 1-249 ЗЕЦ ГО N0:110. Новый сегмент полимеразы (КТ) соответствует положениям 250-477 ЗЕЦ ГО N0:110. Новый коровый сегмент соответствует положениям 478-629 ЗЕЦ ГО N0:110. Новый сегмент Х-антигена соответствует положениям 630-689 ЗЕЦ ГО N0:110. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующий ЗЕО ГО N0:110 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность ЗЕЦ ГО N0:110, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг-Зег; (3) оптимизированная часть большого (Ь) поверхностного антигена НВУ, соответствующая положениям 1-249 ЗЕЦ ГО N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, соответствующая положениям 250-477 ЗЕЦ ГО N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (5) оптимизированная часть корового белка НВУ, соответствующая положениям 478-629 ЗЕЦ ГО N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; (6) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, соответствующая положениям 630-689 ЗЕЦ ГО N0:110, которая представляет собой консенсусную последовательность для НВУ генотипа Ό, в которой используется стратегия конструирования, описанная выше; и (7) необязательная гексагистидиновая метка. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая полный слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ОЫ3013.
Иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, экспрессирующую сходный слитый белок (содержащий ЗЕЦ ГО N0:110), за исключением того, что Ν-концевой пептид ЗЕЦ ГО N0:37 заменен последовательностью α-фактора ЗЕЦ ГО N0:89, обозначают в настоящем описании как ОЫ3014. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как ЗРЕХу2ГО, Зрех-Ό, или М-ЗРЕХу2ГО (для ОЫ3013), или а-ЗРЕХу2ГО (для ОЫ3014).
Дополнительные слитые белки НВУ для применения в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей конструировали с использованием консенсусных последовательностей для четырех генотипов НВУ, чтобы продемонстрировать, каким образом изменения, сходные с изменениями, внесенными в слитые белки, описанные выше (ЗЕЦ ГО N0:107-110), можно вносить в отличающийся слитый белок НВУ, такой как белок, описанный в ЗЕЦ ГО N0:34, который содержит поверхностный белки НВУ и коровые белки НВУ. Для конструирования этих дополнительных антигенов НВУ и соответствующих иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей в качестве матрицы использовали структуру слитого белка, описанную выше для ЗЕЦ ГО N0:34 (и, таким образом, подчасти этих слитых белков (поверхностный антиген и коровый антиген). Как в случае конструкций, описанных выше, конструировали консенсусные последовательности для каждого из генотипов А, В, С и Ό НВУ из множества источников последовательностей НВУ (например, Уи апб Уиап е1 а1., 2010, для З и корового антигена) и последовательности в матричной структуре заменяли консенсусными последовательностями, соответствующими тем же положениям, если использование консенсусной последовательности не изменяла один из известных Т-клеточных эпитопов при острой/самоограничивающейся инфекции или один из известных участков мутации полимеразы, обеспечивающих ускользание, в этом случае, эти положения соответствовали опубликованной последовательности для этих эпитопов или участков мутации.
Первую конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа А конструировали следующим образом.
С использованием ЗЕЦ ГО N0:34 в качестве матрицы создавали новый слитый белок на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа А, соответствующий в настоящем описании ЗЕЦ ГО N0:112. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу, соответствующий ЗЕЦ ГО N0:112 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность ЗЕО ГО N0:112, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии,
- 96 028659 соответствующий 5>ЕО ΙΌ N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг-§ег; (3) консенсусная последовательность большого (Ь) поверхностного антигена для НВУ генотипа А, соответствующая положениям 1-399 5>Е0 ГО N0:112; 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа А, соответствующая положениям 400-581 5>Е0 ГО N0:112; и (5) необязательная гексагистидиновая метка. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий 5>Е0 ГО N0:112 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 5>Е0 ГО N0:111. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 01-13006. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как §соге-А.
Вторую конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа В конструировали следующим образом.
С использованием 5>Е0 ГО N0:34 в качестве матрицы создавали новый слитый белок на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа В, соответствующий в настоящем описании 5>Е0 ГО N0:114. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 5>Е0 ГО N0:114 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность 5>Е0 ГО N0:114, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 5>Е0 ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг-§ег; (3) консенсусная последовательность для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа В, соответствующая положениям 1-399 5>Е0 ГО N0:114; 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа В, соответствующая положениям 400-581 5>Е0 ГО N0:114; и (5) необязательная гексагистидиновая метка. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий 5>Е0 ГО N0:114 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 5>Е0 ГО N0:113. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 01-13007. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как §соге-В.
Третью конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа С конструировали следующим образом.
С использованием 5>Е0 ГО N0:34 в качестве матрицы создавали новый слитый белок на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа С, соответствующий в настоящем описании 5>Е0 ГО N0:116. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 5>Е0 ГО N0:116 (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность 5>Е0 ГО N0:116, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 5>Е0 ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг-§ег; (3) консенсусная последовательность для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа С, соответствующая положениям 1-399 5>Е0 ГО N0:116; 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа С, соответствующая положениям 400-581 5>Е0 ГО N0:116; и (5) необязательная гексагистидиновая метка. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий 5>Е0 ГО N0:116 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 5>Е0 ГО N0:115.
Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как 01-13008. Слитый белок и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как 8соге-С.
Четвертую конструкцию на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό конструировали следующим образом. С использованием 5>Е0 ГО N0:34 в качестве матрицы создавали новый слитый белок на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующий в настоящем описании 5>Е0 ГО N0:118. Этот слитый белок представляет собой единый полипептид со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу, соответствующий 5>Е0 ГО N0:118 (последовательности не НВУ, называемые необязательными не включены в основную последовательность 5>Е0 ГО N0:118, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 5>Е0 ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг-§ег; (3) консенсусная последовательность для НВУ генотипа Ό большого поверхностного
- 97 028659 антигена (Ь), соответствующая положениям 1-399 δΕΟ ГО N0:118; 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 δΕΟ ГО N0:118; и (5) необязательная гексагистидиновая метка. Аминокислотная последовательность полного слитого белка, содержащая δΕΟ ГО N0:118, и N и С-концевой пептиды, и линкерный пептид представлена в настоящем описании как δΕΟ ГО N0:151. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий δΕΟ ГО N0:118 или δΕΟ ГО N0:151 (кодоноптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕΟ ГО N0:117. Иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая этот слитый белок, также обозначается в настоящем описании как ΟΙ-13009. Слитые белки и соответствующая иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей также могут быть обозначены в настоящем описании как 8согеΌ.
Иммунотерапевтические композиции ΟΙ-13010 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:107), ΟΙ-13011 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:108), ΟΙ-13012 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:109), ΟΙ-13013 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:110), ΟΙ-13006 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:112), ΟΙ-13007 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:114), ΟΙ-13008 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:116) и ΟΙ-13009 (содержащая δΕΟ ΙΌ N0:118) получали, как описано для других композиций выше. В кратком изложении, ДНК, кодирующую слитый белок, подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в дрожжах, а затем встраивали после промотора СиР1 (ρΟΙ-100) в 2-мкм экспрессирующих векторах дрожжей. Полученные плазмиды вводили в дрожжи δассЬа^отусез сеге\зз1ае \У303« путем трансфекции с ацетатом лития/полиэтиленгликолем. Трансформанты дрожжей для каждой плазмиды выделяли на чашках с твердой минимальной средой, лишенной урацила (υΌΜ; среда с отсутствием уридина). Колонии повторно наносили штрихами на υΌΌΜ (среда с отсутствием уридина и лейцина) и позволяли расти в течение 3 суток при 30°С. Жидкие стартовые культуры, лишенные уридина и лейцина (иЬ2; состав представлен в примере 1) инокулировали из чашек и стартовые культуры выращивали в течение 18 ч при 30°С, 250 об/мин. Первичные культуры использовали для инокуляции конечных культур иЬ2 и рост продолжали до тех пор, пока не достигали плотности 2 Д.Е./мл. Культуры индуцировали 0,5 мМ сульфатом меди в течение 3 ч, а затем клетки промывали в ΡВδ, обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч, и промывали три раза в ΡВδ. Общее содержание белка измеряли с помощью преципитации с ТСА/анализа связывания с нитроцеллюлозой и экспрессию антигена НВУ измеряли вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела против Ыз-метки.
Результаты представлены на фиг. 20. Дорожки на блоте, представленном на фиг. 20, содержат белок из следующих иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей: дорожка 1 (ν1.0; δ^ΐΌ) = ΟΙ13002 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:34); дорожка 2 (ν2.0; δсΑ) = ΟΙ-13006 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:112); дорожка 3 (ν2.0; δсВ) = ΟΙ-13007 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:114); дорожка 4 (ν2.0; δсС) = ΟΙ-13008 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:116); дорожка 5 (ν2,0; δс^) = ΟΙ-13009 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:118); дорожка 6 (ν1.0; δρ) = ΟΙ-13005 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:36); дорожка 7 (ν1.0; а-δρ) = ΟΙ-13004 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:92); дорожка 8 (ν2.0; δρΑ) = ΟΙ-13010 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:107); дорожка 9 (ν2.0; δρВ) = ΟΙ-13011 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:108); дорожка 10 (ν2.0; δρΟ) = ΟΙ-13012 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:109); дорожка 11 (ν2,0; δρΌ) = ΟΙ-13013 (экспрессирующая δΕΟ ΙΌ N0:110).
Результаты показывают, что каждый из антигенов НВУ, содержащих комбинацию поверхностного антигена и корового антигена (антигены ’^соге), т.е. ΟΙ-13002 ^соге), ΟΙ-13006 (8сА; δ^κ^), ΟΙ13007 ^сВ; 8соге-В), ΟΙ-13008 (8сС; 8соге-С) и ΟΙ-13009 (ЪсО; 8соге-О) устойчиво экспрессировался в дрожжах. Типичные уровни экспрессии 8соге ν2.0 в этих и сходных экспериментах находились в диапзаоне приблизительно от 90 до 140 пмоль/Д.Е. (т.е. от 5940 до 9240 нг/Д.Е.). Уровни экспрессии антигенов НВУ, содержащих все четыре белка НВУ (поверхностный белок, полимераза, коровый антиген и Х или δρеx) варьировали. В частности, экспрессия антигенов из ΟΙ-13010 ^]эА; δρеx-Α), ΟΙ-13011 (δρβ; δρеx-В), ΟΙ-13012 (δρ^ δρеx-^) и ΟΙ-13013 (δρΌ; δρеx-^) была существенно более низкой, чем экспрессия антигенов ’^соге, а также антигенов из ΟΙ-13005 (δρ; δρеx) и ΟΙ-13004 (а-δρ; а^ех). Экспрессия антигена в ΟΙ-13012 (δρ^ δρеx-С) с трудом поддавалась выявлению. Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что, в целом, антигены НВУ, содержащие поверхностный антиген и коровый антиген, очень хорошо экспрессируются в дрожжах, в то время как антигены НВУ, содержащие все из поверхностного антигена, полимеразы, корового антигена и Х, имеют вариабельную экспрессию в дрожжах, и, как правило, экспрессируются хуже, чем антигены 'Ъсоге.
Пример 8.
В представленном ниже примере описано получение дополнительных иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей против НВУ, в которых используются консенсусные последовательности для генотипов НВУ, и, кроме того, продемонстрировано применение альтернативных конфигураций/расположений сегментов белка НВУ в слитом белке для модификации или повышения экспрессии антигена НВУ в дрожжах и/или повышения или модификации иммуногенности или другого функционального признака антигена НВУ.
В этом примере конструировали новые слитые белки, в которых на N или С-конце комбинации по- 98 028659 верхностного антигена, слитого с коровым антигеном, добавлены Х-антиген и/или антигены полимеразы. Эти конструкции конструировали, отчасти основываясь на соображениях, что поскольку слитые организованные в конфигурации, в общем обозначаемой в настоящем описании как 3соге (например, 3ЕЦ ГО N0:34, 3ЕО ГО N0:112, 3ЕО ГО N0:114, 3ЕО ГО N0:116 и 3ЕО ГО N0:118) хорошо экспрессируются в дрожжах, может быть преимущественным использование этой базовой конфигурации (т.е. поверхностный антиген, слитый с коровым белком), для получения антигенов НВУ, содержащих дополнительные белковые компоненты НВУ. Такие стратегии могут повышать экспрессию полибелковых антигенов и/или повышать или модифицировать функциональность таких антигенов в контексте иммунотерапии. Например, без связи с теорией, авторы изобретения предположили, что экспрессия антигена НВУ с использованием трех или всех четырех белков НВУ может быть улучшена путем конструирования слитого белка с использованием поверхностного антигена-корового антигена (в данном порядке) в качестве основы, а затем присоединения других антигенов к этой конструкции.
Таким образом, чтобы проиллюстрировать этот вариант осуществления изобретения моделировали и конструировали восемь новых слитых белков и получали иммунотерапевтические продукты на основе дрожжей, экспрессирующие эти белки. В каждом случае, в слитом белке использовали слитый белок поверхностный антиген-коровый белок в качестве основы, который происходил из сегментов слитого белка, соответствующего 3ЕЦ ГО N0:118, который представляет собой слитый белок поверхностный антиген-коровый антиген, описанный в примере 7, в котором использовалась консенсусная последовательность для НВУ генотипа Ό и который оптимизирован для максимизации использования консесрвативных иммунологических эпитопов. Все возможные расположения сегмента полимеразы и/или сегмента Хантигена присоединяли к этой основной конфигурации с использованием сегментов, происходящих из слитого белка, соответствующего 3ЕЦ ГО N0:110, который представляет собой слитый белок из множества белков НВУ, описанный в примере 7, который конструировали для уменьшения размера белковых сегментов, максимизации применения консервативных иммунологических эпитопов и использования консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό. Хотя эти восемь полученных антигенов представляют собой антигены на основе консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, можно без труда получить слитый белок, имеющий сходную общую структуру, с использованием соответствующих слитых сегментов из слитых белков, соответствующих 3ЕЦ ГО N0:107 и/или 3ЕЦ ГО N0:112 (генотип А), 3ЕС) ГО N0:108 и/или 3ЕО 10 N0:114 (генотип В), 3ЕО 10 N0:109 и/или 3ЕО 10 N0:116 (генотип С), или с использованием соответствующих последовательностей из отличающегося генотипа, подгенотипа, консенсусной последовательности или штамма НВУ.
Для получения первой композиции дрожжи (например, 3ассйаготусек сегеуШае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка НВУ, схематично проиллюстрированного на фиг. 8, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1. Полученная иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей может быть обозначена в настоящем описании как 00 13015. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как 3соге-Ро1 и соответствующий 3Е0 ГО N0:120, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового белка и полимеразы в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность 3ЕЦ ГО N0:120, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный №концевой пептид, который представляет собой синтетический №концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 3ЕЦ ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид Тйг-3ег; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-399 3ЕЦ ГО N0:120 (соответствующая положениям 1-399 3ЕЦ ГО N0:118); (4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 3ЕЦ ГО N0:120 (соответствующая положениям 400-581 3ЕЦ ГО N0:118); (5) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-809 3ЕЦ ГО N0:120 (соответствующая положениям 250-477 3ЕЦ ГО N0:110); и (6) необязательная гексагистидиновая метка. 3ЕЦ ГО N0:120 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок 3ЕЦ ГО N0:120 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 3ЕЦ ГО N0:119.
Для получения второй композиции дрожжи (например, 3ассйаготусек сегеуШае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка НВУ, схематично проиллюстрированного на фиг. 9, под контролем индуцируемого медью промотора СИР1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против НВУ может быть обозначена в настоящем описании как 00 13016. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как 3соге-Х и соответствующий 3Е0 ГО N0:122, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового антигена и Х-антигена в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми
- 99 028659 в рамке считывания от Ν-к С-концу (последовательности не ΗΒУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕφ ΙΌ Ν0:122, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг^ег; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-399 δΕφ ΙΌ Ν0:122 (соответствующая положениям 1-399 δΕφ ΙΌ Ν0:118); 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 δΕφ ΙΌ Ν0:122 (соответствующая положениям 400-581 δΕφ ΙΌ Ν0:118); (5) оптимизированная часть Х-антигена ЖУ с использованием консенсусной последовательности для ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-641 δΕφ ΙΌ Ν0:122 (соответствующая положениям 630-689 δΕφ ΙΌ Ν0:110); и (6) необязательная гексагистидиновая метка. δΕφ ΙΌ Ν0:122 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий δΕφ ΙΌ Ν0:122 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как δΕφ ΙΌ Ν0:121.
Для получения третьей композиции дрожжи (например, δассЬа^οтусез сеге\тз1ае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка ΗΒУ, схематично проиллюстрированного на фиг. 10, под контролем индуцируемого медью промотора ί'.ΌΡ1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против ΗΒУ может быть обозначена в настоящем описании как 0Ι13017. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как δсο^е-Ρο1-X и соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:124, содержит по порядку последовательности поверхностного антигена, корового антигена, полимеразы и Х-антигена в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу (последовательности не ΗΒУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕφ ΙΌ Ν0:124, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬгбег; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒУ генотипа Ό, соответствующего положениям 1-399 δΕφ ΙΌ Ν0:124 (соответствующая положениям 1-399 δΕφ ΙΌ Ν0:118); 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 δΕφ ΙΌ Ν0:124 (соответствующая положениям 400-581 δΕφ ΙΌ Ν0:118); (5) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы ΗΒУ с использованием консенсусной последовательности для ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 582-809 δΕφ ΙΌ Ν0:124 (соответствующая положениям 250-477 δΕφ ΙΌ Ν0:110); (6) оптимизированная часть Х-антигена ЖУ с использованием консенсусной последовательности для ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 810-869 δΕφ ΙΌ Ν0:124 (соответствующая положениям 630-689 δΕφ ΙΌ Ν0:110); и (7) необязательная гексагистидиновая метка. δΕφ ΙΌ Ν0:124 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий δΕφ ΙΌ Ν0:124 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ Ν0:123.
Для получения четвертой композиции дрожжи (например, δассЬа^οтусез сеге\тз1ае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка ΗΒУ, схематично проиллюстрированного на фиг. 11, под контролем индуцируемого медью промотора ί'.ΌΡ1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против ΗΒУ может быть обозначена в настоящем описании как 0Ι-13018. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как δсο^е-X-Ρο1 и соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:126, содержит по порядку поверхностный антиген, коровый антиген, Х-антиген и последовательности полимеразы, в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от Ν- к С-концу (последовательности не ΗΒУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕφ ΙΌ Ν0:126, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный Ν-концевой пептид, который представляет собой синтетический Ν-концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕφ ΙΌ Ν0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬгбег; (3) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒУ генотипа Ό, соответствующего положениям 1-399 δΕφ ΙΌ Ν0:126 (соответствующая положениям 1-399 δΕφ ΙΌ Ν0:118); 4) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена ΗΒУ генотипа Ό, соответствующая положениям 400-581 δΕφ ΙΌ Ν0:126 (соответствующая положениям 400-581 δΕφ ΙΌ Ν0:118); (5) оптимизированная часть Х-антигена
- 100 028659
ΗΒν с использованием консенсусной последовательности для ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 582-641 δΕΟ ΙΌ N0:126 (соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:110); (5) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы ΗΒν с использованием консенсусной последовательности для ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 642-869 δΕΟ ΙΌ N0:126 (соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110); и (7) необязательная гексагистидиновая метка. δΕΟ ΙΌ N0:126 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий δΕΟ ΙΌ N0:126 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ N0:125.
Для получения пятой композиции, дрожжи (например, δассЬа^οтусек сегеуШае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка ΗΒν, схематично проиллюстрированного на фиг. 12, под контролем индуцируемого медью промотора СЦР1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против ΗΒν может быть обозначена в настоящем описании как 0Ι13019. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как Ро1^соге и соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:128, содержит по порядку последовательности полимеразы, поверхностного антигена и корового антигнена в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от И- к С-концу (последовательности не ΗΒν, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:128, за исключением линкера Ьеи-01и между сегментом полимеразы и сегментом поверхностного антигена в конструкции, проиллюстрированной в настоящем описании, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический N концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг^ег; (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы ΗΒν с использованием консенсусной последовательности для ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 1-228 δΕΟ ΙΌ N0:120 (соответствующая положениям 250-477 δΕΟ ΙΌ N0:110); (4) линкерный пептид (необязательный) Ьеи-01и, соответствующий положениям 229-230 δΕΟ ΙΌ N0:128; (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 231-629 δΕΟ ΙΌ N0:128 (соответствующая положениям 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 630-811 δΕΟ ΙΌ N0:128 (соответствующая положениям 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118); и (7) необязательная гексагистидиновая метка. δΕΟ ΙΌ N0:128 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), каждый из которых может быть найден в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий δΕΟ ΙΌ N0:128 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ N0:127.
Для получения шестой композиции дрожжи (например, δ3^1κ·ιΐΌΐη\^κ сегеуШае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка ΗΒν, схематично проиллюстрированного на фиг. 13, под контролем индуцируемого медью промотора СЦР1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против ΗΒν может быть обозначена в настоящем описании как 0Ι13020. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как Х^соге и соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:130, содержит по порядку последовательности Х-антигена, поверхностного антигена и корового антигена в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу (последовательности не ΗΒν, называемые необязательными, не включены в основную последовательность δΕΟ ΙΌ N0:130 за исключением линкера Ьеи-01и между сегментом X и сегментом поверхностного антигена в конструкции, проиллюстрированной в настоящем описании, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:37; (2) необязательный линкерный пептид ТЬг^ег; (3) оптимизированная часть Х-антигена ΗΒν, в который используется консенсусная последовательность для ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 1-60 δΕΟ ΙΌ N0:130 (соответствующая положениям 630-689 δΕΟ ΙΌ N0:110); (4) линкерный пептид (необязательный) Ьеи-01и, соответствующий положениям 61-62 δΕΟ ΙΌ N0:130; (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 63-461 δΕΟ ΙΌ N0:130 (соответствующая положениям 1-399 δΕΟ ΙΌ N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена ΗΒν генотипа Ό, соответствующая положениям 462-643 δΕΟ ΙΌ N0:130 (соответствующая положениям 400-581 δΕΟ ΙΌ N0:118); и (7) необязательная гексагистидиновая метка. δΕΟ ΙΌ N0:130 содержит множество Тклеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Аминокислотная последовательность полного слитого белка, содержащего δΕΟ ΙΌ N0:130 и N и С-концевой пептиды и линкеры, представлена в настоящем описании как δΕΟ ΙΌ N0:150. Последовательность нуклеиновой кислоты,
- 101 028659 кодирующая слитый белок, содержащий 8Е0 ГО N0:130 или 8Е0 ГО N0:150 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 8Е0 ГО N0:129.
Для получения седьмой композиции дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегеуыае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка НВУ, схематично проиллюстрированного на фиг. 14, под контролем индуцируемого медью промотора СиР1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против НВУ может быть обозначена в настоящем описании как 0113021. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как Ро1-Х-8соге и соответствующий 8Е0 ГО N0:132, содержит по порядку полимеразу, Х-антиген, поверхностный антиген и коровый антиген в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность 8Е0 ГО N0:132, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Е0 ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид Тйг-8ег; (3) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ с использованием консенсусной последовательности для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-228 8Е0 ГО N0:132 (соответствующая положениям 250-477 8Е0 ГО N0:110); (4) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, в которой используется консенсусная последовательность для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 229-288 8Е0 ГО N0:132 (соответствующая положениям 630689 8Е0 ГО N0:110); (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 289-687 8Е0 ГО N0:132 (соответствующая положениям 1-399 8Е0 ГО N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 688-869 8Е0 ГО N0:132 (соответствующая положениям 400-581 8Е0 ГО N0:118); и (7) необязательная гексагистидиновая метка. 8Е0 ГО N0:132 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которые могут быть найдены в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий 8Е0 ГО N0:132 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах), представлена в настоящем описании как 8Е0 ГО N0:131.
Для получения восьмой композиции дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегеуыае) модифицировали способами инженерии для экспрессии нового слитого белка НВУ, схематично проиллюстрированного на фиг. 15, под контролем индуцируемого медью промотора СиР1. Полученная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей против НВУ может быть обозначена в настоящем описании как 0113022. Этот слитый белок, также обозначаемый в настоящем описании как Х-Ро1-8соге и соответствующий 8Е0 ГО N0:134, содержит по порядку Х-антиген, полимеразу, поверхностный антиген и коровый белок в качестве единого полипептида со следующими элементами последовательности, слитыми в рамке считывания от N к С-концу (последовательности не НВУ, называемые необязательными, не включены в основную последовательность 8Е0 ГО N0:134, но в действительности были добавлены к слитому белку, описанному в этом примере): (1) необязательный ^концевой пептид, который представляет собой синтетический ^концевой пептид, предназначенный для обеспечения устойчивости к деградации протеасомами и стабилизации экспрессии, соответствующий 8Е0 ГО N0:37; (2) необязательный линкерный пептид Тйг-8ег; (3) оптимизированная часть Х-антигена НВУ, в которой используется консенсусная последовательность для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 1-60 8Е0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 630-689 8Е0 ГО N0:110); (4) оптимизированная часть домена обратной транскриптазы (КТ) полимеразы НВУ, в которой используется консенсусная последовательность для НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 61-288 8Е0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 250-477 8Е0 ГО N0:110); (5) аминокислотная последовательность практически полноразмерной (минус положение 1) консенсусной последовательности для большого (Ь) поверхностного антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 289-687 8Е0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 1-399 8Е0 ГО N0:118); (6) аминокислотная последовательность консенсусной последовательности для корового антигена НВУ генотипа Ό, соответствующая положениям 688-869 8Е0 ГО N0:134 (соответствующая положениям 400-581 8Е0 ГО N0:118); и (7) необязательная гексагистидиновая метка. 8Е0 ГО N0:134 содержит множество Т-клеточных эпитопов (человека и мыши), которая может быть найдена в табл. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, содержащий 8Е0 ГО N0:134 (кодон-оптимизированная для экспрессии в дрожжах) представлена в настоящем описании как 8Е0 ГО N0:133.
Для получения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, описанных выше, трансформанты дрожжей для каждой плазмиды выделяли на чашках с твердой минимальной средой, лишенной урацила (υΌΜ; среда с отсутствием уридина). Колонии повторно наносили штрихами на υΌΜ или ЕЕ1)М (среда с отсутствием уридина и лейцина) и позволяли расти в течение 3 суток при 30°С. Жидкие стартовые культуры, лишенные уридина и лейцина (ЦЕ2) или лишенные уридина (υ2) инокулировали из
- 102 028659 чашек и стартовые культуры выращивали в течение 18 ч при 30°С, 250 об/мин. Первичные культуры использовали для инокуляции промежуточных культур И2 или ИЬ2 и рост продолжали до тех пор, пока не достигали плотности 2 Д. Е./мл. Промежуточные культуры использовали для инокуляции конечных культур до плотности 0,05 Д.Е./мл и их инкубировали до достижения плотности клеток 1-3 Д.Е./мл. Затем конечные культуры индуцировали 0,5 мМ сульфатом меди в течение 3 ч, а затем клетки промывали в РВ8, обеспечивали их гибель нагреванием при 56°С в течение 1 ч и промывали три раза в РВ8. Общее содержание белка измеряли с помощью преципитации с ТСА/анализа связывания с нитроцеллюлозой и экспрессию антигена измеряли вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела против Ыз-метки. Лизаты двух иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, описанных в примере 7 в качестве 01-13008 (8ЕО ГО N0:116; 8соге-С) или 01-13009 (8Е0 ГО N0:118; 8соге-И), использовали в качестве основы для сравнения с дрожжами, экспрессирующими основной продукт поверхностный антиген-коровый антиген.
На фиг. 21 представлен блот, на котором показана экспрессия всех восьми конструкций в дрожжах, культивируемых в среде ИЬ2 (нагруженных 1 мкг белка) по сравнению с экспрессией конструкцией в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, описанной в примере 7 в качестве 01-13009 (8Е0 ГО N0:118; 8соге-И). Ссылаясь на фиг. 21 дорожки 1 и 2 содержат маркеры молекулярной массы, и дорожки 4-6 содержат рекомбинантный меченный гексагистидином белок N83, который обрабатывали на том же блоте, для количественного определения антигена путем интерполяции из стандартной кривой, полученной для этих дорожек. Дорожки 7-14 содержат лизаты из каждой иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, обозначаемые номером (например, 0Ι-13015), выращенные в среде ИЬ2, и дорожка 15 содержит лизат 01-13009 для сравнения. Дополнительные вестерн-блоты для дрожжей, культивированных в среде И2, а также дополнительные блоты, оценивающие различные количества белка, нагружающего гель, не представлены в настоящем описании, но, в целом, результаты показали, что все восемь антигенов экспрессировались на поддающихся выявлению уровнях по меньшей мере в одной среде для роста.
Общие результаты экспрессии обобщенно представлены на фиг. 22 в качестве столбикового графика для культур, которые имели поддающуюся выявлению экспрессию антигена-мишени в среде И2 или ИЬ2 по сравнению с экспрессией антигенов в 01-13008 (8соге-С) и 01-13009 (8соге-И). Ссылаясь на фиг. 22 антигены НВУ обозначены ниже каждого столбика с использованием указания на расположение антигенов в слитом белке, как описано для каждой конструкции выше, вместе со средой, использованной для культивирования соответствующих дрожжей, которые экспрессировали антиген (т.е. Ро1-8соге-И2 относится к антигену НВУ, который представляет собой слитый белок полимераза-поверхностный антиген-коровый антиген, соответствующий 8Е0 ГО N0:128 и экспрессированный 0Ι-13019 в среде И2). Результаты показали, что экспрессия антигена, обозначаемого как Х-8соге (экспрессированного 0Ι13020; 8Е0 ГО N0:130) была особенно устойчивой, на уровне ~122 пмоль/Д.Е., что составляло приблизительно 79-80% от уровня экспрессии, полученного для 8соге-С (0Ι-13008) или 8соге-И (0Ι-13009) в расчете на количество моль (любая среда). Экспрессия антигенов, экспрессированных 0Ι-13015 (8согеРо1; 8ЕО ГО N0:120), 0Ι-13016 (8соге-Х; 8ЕО ГО N0:122), 0Ι-13017 (8соге-Ро1-Х; 8ЕО ГО N0:124) и 0Ι13018 (8соге-Х-Ро1; 8Е0 ГО N0:126) в среде И2 была ниже уровня количественного определения в этом эксперименте, хотя каждый из этих антигенов экспрессировались, когда ту же иммунотерапевтическую комппозицию на основе дрожжей выращивали в среде ИЬ2 (см. фиг. 2). Как правило, конфигурации антигенов, содержавшие домен обратной транскриптазы (КТ) полимеразы, накапливались до более низких уровней, чем конфигурации антигенов, содержавшие только 8-коровый антиген с добавлением или без добавления Х-антигена. Учитывая данные, представленные в этих и предшествующих примерах в целом, конфигурации антигенов поверхностный антиген-коровый антиген (8соге или 8С0КЕ; все сходные конструкции) и Х-поверхностный антиген-коровый антиген (Х-8соге или Х-8С0КЕ; 0Ι-13020) представляли собой наиболее высокоэкспрессирующиеся конфигурации антигенов среди всех исследованных иммунотерапевтических комозиций на основе дрожжей.
Пример 9.
В следующем примере описаны доклинические испытания у мышей для демонстрации безопасности, иммуногенности и эффективности ίη νί\Ό иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей по изобретению.
Для оценки иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей в доклинических испытаниях использовали различные анализы ίη νίίΐΌ и ίη νί\Ό. которые выявляют индукцию антигенспецифических лимфоцитов иммунотерапевтическими композициями против НВУ на основе дрожжей по изобретению, включая пролиферацию лимфоцитов, клеточно-опосредуемую цитотоксичность, секрецию цитокинов и защиту от опухолевой нагрузки (например, уничтожение опухолей, модифицированных способами инженерии для экспрессии белков НВУ ίη νί\Ό).
Для обеспечения этих испытаний сначала использовали иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей, описанные в примерах 1 и 2, а затем проводили дополнительные испытания с использованием иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей, описанных
- 103 028659 в примерах 7 и 8 или в других разделах настоящего описания. Однако эти исследования можно без труда использовать к любой иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей по изобретению, и результаты, представленные в настоящем описании, можно экстраполировать на другие композиции НВУ, содержащие ту же антигенную основу или сходные антигенные конструкции. Результаты этих первоначальных экспериментов описаны ниже.
В качестве общего протокола, который можно адаптировать для любой иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей, мышам (например, самкам мышей ВАБВ/с и/или С57ВБ/6) инъецируют подходящее количество иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей, например 4-5 Д.Е. (вводимые подкожно инъекциями по 2-2,5 Д.Е. в 2 различных области инъекции). Необязательно, на следующие сутки после введения дрожжевых композиций вводят антитело против СГО40. Мышей иммунизируют раз в неделю или раз в две недели 1, 2 или 3 дозами, и необязательно через 3-4 недели после последней дозы, вводимой раз в неделю или раз в две недели, вводят конечную вспомогательную дозу. Мышей умерщвляют через 7-9 суток после последней инъекции. Получают суспензии клеток селезенки и/или суспензии клеток лимфатических узлов, объединенные для каждой группы и подвергают их условиям стимуляции ίη νίΐΐΌ ^У8) с использованием НВУ-специфических стимулов в форме пептидов НВУ и/или антигенов НВУ, которые могут включать дрожжи, экспрессирующие антигены НВУ. Контрольные культуры стимулируют пептидами, не принадлежащими НВУ, которые могут включать пептид овальбумина или посторонний вирусный пептид (например, пептид из ВИЧ). Для оценки иммунных ответов, индуцируемых введением иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей, используют стандартные анализы, и они включают пролиферацию лимфоцитов, оцениваемую по включению 3Н-тимидина, анализы клеточно-опосредуемой цитотоксичности (анализы СТЬ) с использованием меченных 51Сг клеток-мишеней (или других мешеней, меченных в течение ночи, для СТЬ), количественное определение секреции цитокинов с помощью анализа цитокинов или ЕЫ8Р0Т (например, ГОН-у, ГБ-12, ТМР-а, ГБ-6 и/или ГБ-2 и т.д.), и защиту от опухолевой нагрузки (например, нагрузка ίη νί\Ό опухолевыми клетками, модифицированными рекомбинантными способами для экспрессии антигенов НВУ).
Ожидается, что иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей будут иммунногенными, на что указывает их способность индуцировать специфичные к антигенам НВУ Тклеточные ответы, измеренной в анализах, описанных выше.
В первоначальных экспериментах два из иммунотерапевтических продуктов против НВУ на основе дрожжей, описанных в примерах 1 и 2, исследовали в анализах пролиферации лимфоцитов (БРА) для определения того, индуцирует ли иммунизация этими продуктами пролиферацию антигенспецифических СЭ4' Т-клеток. Более конкретно, каждый из иммунотерапевтического продукта на основе дрожжей (ΟΙ13002), экспрессирующего слитый белок, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:34, под контролем промотора СИР1, также известный как 8С0КЕ и более конкретно описанный в примере 1, и иммунотерапевтического продукта на основе дрожжей (0Ι-13004), экспрессирующего слитый белок, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:92, под контролем промотора СИР1 и также известный как а-8РЕХ и более конкретно описанный в примере 2, использовали для иммунизации мышей и оценки СГО4' Т-клеток, специфичных для поверхностного и/или корового антигенов, на которые нацелены оба продукта, с использованием анализа пролиферации лимфоцитов (БРА).
Самок мышей ВАБВ/с иммунизировали три раза в неделю 5 Д.Е. 8С0КЕ или а-8РЕХ подкожно в 2 различные области мыши (2,5 Е.Д./бок). Контрольных мышей вакцинировали пустым дрожжевым вектором (обозначаемые УУЕС) или не вакцинировали ничем (обозначаемые наивными). Через одну неделю после третьей иммунизации мышей гуманным образом умерщвляли и селезенки и периаортальные и паховые дренирующие лимфатические узлы (Щ) извлекали и перерабатывали в суспензии отдельных клеток. Клетки БУ из двух типов узлов объединяли и стимулировали ίη νίίΐΌ ^У8) смесью рекомбинантного корового и поверхностного антигенов (смесь 8/коровый антиген) или ограниченным по ΙΙ миметопным пептидом (СУНС88БУ, 8ЕЦ ГО N0:103, обозначаемый как миметопный пептид класса ΙΙ 8Ад), ранее описанный как индуцирующий пролиферацию Т-клеток у иммунизированных 8ад мышей ВАБВ/с (Ка.)ааЬуак5Ьа е1 а1. (1995). РНА8 92: 1575-1579).
Клетки селезенки подвергали обогащению СГО4' Т-клетками путем магнитной активированной сортировки клеток (МАС8) и инкубировали с теми же антигенами, которые описаны для БИ. После инкубации в течение 4 суток культуры ΙΥ8 обрабатывали тритированным (3Н) тимидином в течение 18 ч и ДНК клеток собирали на микрофильтрах со стекловолокном. Уровень включенного 3Н-тимидина измеряли путем сцинтилляционного подсчета. Параллельно анализировали дублирующие культуры БУ из иммунизированных 8С0КЕ мышей. В качестве дополнительного средства для оценки активации Т-клеток использовали продукцию интерферона-гамма (ШЫ-у) в способе ЕБКроБ
Как показано на фиг. 23, 24 и 26, СГО4' Т-клетки из мышей, иммунизированных 8С0КЕ или а8РЕХ, пролиферировали в ответ на смесь рекомбинантных антигена 8 и корового антигена. Т-клетки селезенки из иммунизированных 8С0КЕ мышей (фиг. 23) продемонстрировали уровень пролиферации, в >5 раз превышающий уровень пролиферации Т-клеток из иммунизированных УУЕС (контроль в виде
- 104 028659 пустого вектора) или наивных мышей, что указывает на то, что эффект является специфическим для слитого белка поверхностный антиген-коровый антиген (т.е. антигенспецифический Т-клеточный ответ). Тклетки из мышей, иммунизированных δС0ΚΕ, инкубированные с миметопным пептидом ΗΒν, также пролиферировали до более высоких уровней, чем обработанные пептидом контроли ΥνΈΕ или наивные контроли, обеспечивая дальнейшее доказательство антигенной специфичности ответа на иммунотерапевтический продукта на основе дрожжей. Эти эффекты также зависят от количества антигена, добавленного к Ινδ, причем оптимальная активность была при 3 мкг/мл (рекомбинантный антиген) или 30 мкг/мл (пептид).
Как показано на фиг. 24, клетки РХ из мышей, иммунизированных δС0ΚΕ, также пролиферировали в ответ на Ινδ с теми же самыми антигенами, хотя отличие в пролиферации между животными, иммунизированными δС0ΚΕ, против наивных или иммунизированных ΥνΈΕ животных были меньшими, чем для выделенных ΟΌ4' Т-клеток селезенки.
Данные ΕΜδροΙ (фиг. 25) указывают на то, что препараты ЬХ из иммунизированных δС0ΚΕ мышей, повторно стимулированных смесью δ+С, содержат количество секретирующих ΙΡΝ-γ клеток, > 10 раз большее, чем для ЬХ из наивных животных. Ινδ с пептидом ΗΒν (δΕΟ ΙΌ N0:103) также индуцировала ответ ΣΤΉ-γ. В частности, препараты ЬХ δС0ΚΕ содержали количество клеток, продуцирующих ΙΡ^γ > 3,5 раз больше чем для препаратов наивных ЬХ (фиг. 25). Эти данные в совокупности показывают, что δС0ΚΕ (иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая слитый белок, содержащий поверхностный антиген и коровый антиген) индуцирует специфические к антигенам ΗΒν Т-клеточные ответы как в селезенке, так и в ЬК, и что эти ответы могут быть усилены Ινδ с очищенными антигенами дозозависимым образом.
Сходные анализы с а-δΡΕX (фиг. 26) показали, что этот иммунотерапевтический продукт против ΗΒν на основе дрожжей также индуцирует пролиферативные ответы Т-клеток. а-δΡΕX индуцировал приблизительно 30% увеличение по сравнению с ΥνΈΕ в Ινδ, проводимым со смесью рекомбинантных антигенов. В целом, ответы, наблюдаемые для а-δΡΕX, были более низкими, чем ответы, наблюдаемые для δС0ΚΕ. Отличие в величине ответа может отражать тот факт, что экспрессия антигена в случае аδΡΕX является меньшей, чем половина экспрессии в случае δС0ΚΕ в расчете на количество моль. Альтернативно, без связи с теорией, эти результаты могут указывать на то, что конфигурация антигенов, экспрессируемых дрожжами, влияет на уровень экспрессии, эффективность процессинга через эндосому/протеасому или другие параметры иммунного ответа. Пролиферация Т-клеток из мышей а-δΡΕX с использованием 100 мкг/мл пептида была по меньшей мере в 2 раза большей, чем пролиферация у мышей, вакцинированных ΥνΈΕ (фиг. 26, три колонки справа).
Пример 10.
В следующем примере описана иммунологическая оценка двух иммунотерапевтических композиций против ΗΒν на основе дрожжей по изобретению с использованием профилей цитокинов.
Одним способом охарактеризации клеточного иммунного ответа, индуцируемого в результате иммунизации иммунотерапевтическими композициями против ΗΒν на основе дрожжей по изобретению, является оценка профилей цитокинов, продуцируемых при стимуляции ех νίνο препаратов селезенки из иммунизированных животных.
В этих экспериментах, самок мышей С57В1/6 иммунизировали 0Ι-13002 (δС0ΚΕ, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая слитый белок поверхностный антигенкоровый антиген ΗΒν, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:34, пример 1) и 0Ι-13005 (Μ-δΡΕX, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, экспрессирующая слитый белок поверхностный антигенροΐ-коровый антиген-Х ΗΒν, соответствующий δΕΟ ΙΌ N0:36, под контролем промотора СОТ1, пример 2), ΥνΈΕ (контрольные дрожжи с пустым вектором), или не иммунизировали ничем (наивные) следующим образом: 2 Д.Е. иммунотерапевтического средства на основе дрожжей или контрольных дрожжей инъецировали подкожно в 2 различных области животного на 0, 7 и 28 сутки. Для обеспечения дополнительной активации дендритных клеток (ОС), помимо уровня активации, обеспечиваемого терапевтическим средством на основе дрожжей, вводили антитело против СО40 путем внутрибрюшинной (в/б) инъекции на 1 сутки. Лечение антителом против СО40 является необязательным, однако антитело может увеличивать уровень антигенспецифических СО8+ Т-клеток при попытке выявить эти клетки путем прямого окрашивания пентамером (эти данные не представлены в этом эксперименте). Через девять суток после последней иммунизации, селезенки извлекали и перерабатывали в суспензии отдельных клеток. Клетки помещали в культуры для стимуляции ίη νίΐΓο (Ινδ) на 48 ч с объединенной смесью 2 пептидов ΗΒν (обозначаемой как Р на фиг. 27 и фиг. 28 и ΗΒνΓ на фиг. 29А и 29В), или обработанными митомицином С наивными сингенными спленоцитами, обработанными 2 пептидами (обозначаемыми как РР8 на фиг. 27 и 28 и ΗΡΡδ на фиг. 29А и 29В). Пептиды ограничены по Н-2КЬ и имеют следующие последовательности: ЕБРРк-РкЕ (δΕΟ ГО N0:65, см. табл. 5) и МОЬКРКОЬ (δΕΟ ГО N0:104). Культуры подвергали повторному анализу Ьиштех на ΙΌ1β, ΙΌ-12 и ΣΤΉ-γ.
Эти цитокины оценивали, поскольку они связаны с типами иммунных ответов, которые предположительно связаны с продуктивным или эффективным иммунным ответом против ΗΒν. ΙΌ-1β представ- 105 028659 ляет собой провоспалительный цитокин, продуцируемый антигенпредставляющими клетками, и он представляет собой цитокин, известный тем, что он будет индуцироваться при иммунизации иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей. 1Ь-12 также продуцируется антигенпредставляющими клетками и стимулирует активность СИ8' цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ). ΙΡΜ-γ продуцируется СЭ8+ цитотоксическими Т-лимфоцитами при развитии адаптивного иммунного ответа и также стимулирует дифференцировку Тй1 СИ4' Т-клеток.
Результаты, представленные на фиг. 27 (1Ь-1 β), 28 (1Ь-12), 29А (ШН-γ; иммунизированные 8С0КЕ), и 29В (ΣΤΉ-γ; иммунизированные М-8РЕХ), указывают на то, что все три цитокина продуцируются спленоцитами из иммунизированных 8соге мышей (обозначаемых 8с на фиг. 27, 28 и 29А) в ответ на прямую 1У8 объединенными пептидами отдельно, и что ответ является более высоким для иммунизированных 8С0КЕ, чем УУЕС (обозначаемые Υ на фиг. 27, 28, 29А и 29В) или наивных (обозначаемые 'Ή на фиг. 27, 28, 29А и 29В) мышей, демонстрируя, что иммунизация 8С0КЕ индуцирует антигенспецифический иммунный ответ, приводящий к продуцированию этих трех цитокинов. 1У8 с обработанными пептидом сингенными спленоцитами также индуцировала антигенспецифический ответ, хотя и меньшей величины. Спленоциты из мышей, вакцинированных М-8РЕХ (обозначаемые 8р на фиг. 27, 28 и 29В) продуцировали в целом более низкий уровень цитокинов, чем спленоциты из мышей, вакцинированных 8С0КЕ. Тем не менее, количество 1Ь12р70, продуцированного в ответ на М-8РЕХ, является более высоким, чем количество, продуцированное в случае ΥУЕС или наивных мышей, указывая на антигенспецифический иммунный ответ, индуцируемый этой иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей. Ожидается, что а-8РЕХ (01-13004; пример 2), которая экспрессировала более высокие уровни антигена и индуцировала СГО4' пролиферативный ответ в анализах, описанных в примерах 9, будет индуцировать более высокие уровни продукции цитокинов.
Дополнительные анализы цитокинов проводили с использованием самок мышей ВАЬВ/с, иммунизированных одним из тех же самых двух иммунотерапевтических продуктов на основе дрожжей. В этих экспериментах самок мышей ВАЬВ/с иммунизировали 8С0КЕ (01-13002; обозначаемые 8с на фиг. 30А-30И), М-8РЕХ (01-13005; обозначаемые 8р на фиг. 30А-30И), ΥУЕС (обозначаемые Υ на фиг. 30А-30И), или не иммунизировали ничем (наивные, обозначаемые 'Ή на фиг. 30А-30И) следующим образом: 2 Д.Е, дрожжевого продукта вводили в 2 области на 0, 11, 39, 46, 60 и 67 сутки. Как и в описанном выше эксперименте, вводили антитело против СИ40 в/б. Через девять суток после последней иммунизации (76 сутки) селезенки извлекали, перерабатывали в суспензии отдельных клеток и подвергали 1У8 в течение 48 ч со смесью рекомбинантных поверхностного и корового белков НВУ (обозначаемой НВУ 8ад+коровый Ад на фиг. 30А-30И). Супернатанты собирали и оценивали с помощью Ьиттех на продукцию ΙΕ1β, 1Ь-6, 1Ь-13 и 1Ь12р70. 1Ь-6 представляет собой провоспалительный цитокин, продуцируемый антигенпредставляющими клетками и Т-клетками и, как полагают, он является важным цитокином в механизме действия иммунотерапевтических продуктов на основе дрожжей. 1Ь-13 также является провоспалительным цитокином, продуцируемым Т-клетками, и он высоко сходен с 1Ь-4 и стимулирует Тй2 СИ4+ иммунный ответ.
Результаты, представленные на фиг. 30А (1Ь-1 β), 30В (1Ь-6), 30С (1Ь-13) и 30Ό (1Ь-12) показывают, что спленоциты из иммунизированных 8С0КЕ мышей продуцировали ΙΕ-1β, 1Ь-6, 1Ь12р70 и ЕЬ-13 в ответ на смесь поверхностного и корового антигена, и что величина ответа была более высокой, чем для спленоцитов из иммунизированных ΥУЕС или наивных мышей. Эта антигенная специфичность согласуется с результатами, полученными для ЬРА у мышей ВАЬВ/с (см. пример 9) и для анализа высвобождения цитокинов у мышей С57В1/6 (см. выше).
Спленоциты из мышей, иммунизированных М-8РЕХ, продуцировали антигенспецифические сигналы для 1Ь-1 β (фиг. 30А), но не для других цитокинов. Как в случае результатов для С57В1/6, это заметное отличие в эффективности между 8С0КЕ и М-8РЕХ может быть объяснено более низким содержанием антигена в последнем случае. Ожидается, что а-8РЕХ (экспрессирующая слитый белок, соответствующий 8ЕО ГО N0:92, описанный в примере 2), которая экспрессирует более высокие уровни антигена, будет индуцировать увеличенную продукцию антигенспецифческих цитокинов, и, кроме того, ожидается, что анализы 1У8 с участием дополнительных антигенов, экспрессируемых этим продуктом или другими продуктами, которые включают другие антигены НВУ (антигены Х и полимеразы НВУ) выявят дополнительную иммуногенность.
Пример 11.
В следующем примере описано исследование иммуногенности ш У1уо для иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей.
В этом эксперименте иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей (01-13002), экспрессирующий слитый белок, соответствующий 8ЕЦ ГО N0:34, под контролем промотора СИР1, также известный 8С0КЕ и более конкретно описанный в примере 1, использовали в способе адоптивного переноса, в котором Т-клетки из иммунизированных 8С0КЕ мышей переносили реципиентным мышам с тяжелым комбинированным иммунным дефицитом (8СГО) перед имплантацией опухоли мышам 8СГО.
В кратком изложении, самок мышей С57ВЬ/6 (в возрасте 4-6 недель) подкожно иммунизировали
- 106 028659
01-13002 (8С0КЕ), УУЕС (дрожжи, содержащие пустой вектор) или не иммунизировали ничем (наивные) в 2 области (2,5 Д.Е. в бок, 2,5 Д.Е. в заднюю часть шеи) на 0, 7 и 14 сутки. В одной группе иммунизированных 8С0КЕ мышей дополнительно внутрибрюшинно (в/б) инъецировали 50 мкг антитела против СГО40 на следующие сутки после каждой иммунизации. На 24 сутки мышей умерщвляли и тотальные спленоциты получали и подсчитывали. Двадцать пять миллионов спленоцитов в 200 мкл РВ8 в/б инъецировали наивным реципиентным самкам мышей 8СГО в возрасте 4-6 недель. Через двадцать четыре часа после переноса реципиентов нагружали подкожно (п/к) в области грудной клетки 300000 опухолевых клеток ЕЬ4, экспрессирующих антиген 8С0КЕ (обозначаемые ЕЬ-4-8согс), или опухолевых клеток, экспрессирующих посторонний антиген овальбумина. Мониторинг роста опухоли проводили путем измерения с помощью цифрового толщиномера с интервалами 1-2 суток, начиная на 10 сутки после нагрузки опухолью.
Результаты через 10 суток после нагрузки опухоли, представленные на фиг. 31, продемонстрировали, что спленоциты из мышей, иммунизированных 01-13002 (8С0КЕ) или 01-13002 + антитело против СЭ40, но не из иммунизированных УУЕС мышей или наивных мышей, индуцировали сравнимую защиту от нагрузки опухолями ЕЬ4, экспрессирующими антиген 8С0КЕ (фиг. 31, первый и второй столбики слева). Количество мышей с опухолями через 10 суток после нагрузки указаны выше каждого столбика на фиг. 31. Т-клетки из мышей, иммунизированных 01-13002, не имели эффекта на рост опухолей ЕЬ4, экспрессирующих посторонний антиген (не показано). Спленоциты из мышей, иммунизированных УУЕС (фиг. 31, средний столбик) не влияли на рост опухоли, поскольку размер и количество опухолей в этой группе были сравнимыми с размером и количеством опухолей у мышей, которым не вводили спленоциты (фиг. 31, дальний правый столбик) или с размером и количеством опухолей у мышей, которым вводили спленоциты от наивных мышей (фиг. 31, второй столбик справа). Эти результаты указывают на то, что иммунизация иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, экспрессирующей слитый белок поверхностный антиген-коровый белок, генерирует антигенспецифический иммунный ответ, который защищает мышей 8СГО от нагрузки опухолью. Совместное введение активирующего дендритные клетки ГОС) антитела против СЭ40 не влияло на степень защиты.
Пример 12.
В следующем примере описано исследование иммуногенности двух иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей с использованием анализов ЕЬ18ро1 на интерферон-γ (ГРН-у).
Этот эксперимент был предназначен для оценки двух оптимизированных иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, описанных в примере 7, в отношении способности индуцировать специфичные к антигену НВУ Т-клетки у мышей, иммунизированных этими композициями. В эксперименте также исследовали, можно ли новые пептидные последовательности НВУ, смоделированные с помощью компьютерных алгоритмов, и последовательности, полученные из опубликованной литературы, использовать для повторной стимуляции Т-клеточных ответов, которые были сгенирированы этими иммунотерапевтическими композициями.
В этом эксперименте иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанную в примере 7 в качестве 01-13008 (8согс-С, содержащая 8Еф ГО N0:116) и иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, описанную в примере 7 в качестве 01-13013 (8рсхГО, содержащая 8Еф ГО N0:110) оценивали в отношении иммуногенности. Пептидные последовательности, использованные в этом эксперименте, представлены в табл. 7. Последовательности, обозначаемые Ζ0Γ-5 и 20Р-7, взяты из опубликованной литературы, в то время как остальные пептиды были идентифицированы с помощью компьютерных предсказывающих алгоритмов В1МА8 или 8УРРЕ1ТН1. Приставки ГОЬ или КЬ относятся к гаплотипу мышей С57ВЬ/6: Н-2ЭЬ| и Н2-КЬ соответственно.
Таблица 7
Название | Аминокислотная | Идентификатор | Класс | Антиген |
пептида | последовательность | последовательности | МНС | НВУ |
ПЪЗ-84 | И5Р0А0С1Ь | $Εξ) ΙΌ N0:138 | I | Зад |
ОЬ9-94 | ТУРАЫРРРА | ЗЕО Ιϋ N0:141 | I | Зад |
ОЪЭ-283 | ОМЪРУСРЬЬ | 5Е0 ΙΌ N0:142 | I | Зад |
ЭЬ9-499 | МСЬК1Р0ЬЬ | 5Е0 ΙΌ N0:143 | I | Коровый |
КЬ8-24Э | ЮРСУЕТЯМ | 5Е0 ΙΌ N0:144 | I | Зад |
КЬ8-262 | игьпьь | ЗЕО ΙΌ N0:145 | I | Зад |
КЬ8-277 | уьъпуоем | ΞΕ2 ΙΌ N0:139 | I | Зад |
КЬ8-347 | АЗУРГЗИЬ | 5Ε0 ΙΌ N0:140 | I | Зад |
КР8-360 | ЕУОТЯЕУСЬ | 5Ε0 ΙΌ N0:146 | I | Зад |
КЬ8-396 | ььпггсь | 3Ε0 ΙΌ N0:147 | I | Зад |
Ζ0Ρ-5 | УЗ ЕСУИ1ЕТРРΑΥΕΡ ΡΝΑΡIЬ | 5Εζ) ΙΌ N0:148 | II | Коровый |
Ζ0Ρ-7 | 1ЬЗРГЬРЬ | 5Έϋ ΙΌ N0:149 | I | Зад |
- 107 028659
Самок мышей С57ВЬ/6 (возраст 4-6 недель) подкожно иммунизировали ΟΙ-13008 ^соге-С), ΟΙ13013 (Зрех-Ό), Υ'ΫΕΟ (контроль в виде дрожжей с пустым вектором) или не иммунизировали ничем (наивные) в 2 области (2,5 Д.Е. в бок, 2,5 Д.Е. в заднюю часть шеи) на 0, 7 и 14 сутки. На 20 сутки мышей умерщвляли и тотальные спленоциты получали, удаляли из них эритроциты, подсчитывали и инкубировали в количестве 200000 клеток/лунка в течение четырех суток в полной ΡΡΜΙ, содержащей 5% эмбриональную телячью сыворотку вместе с пептидными стимуляторами, приведенными в табл. 7 (10 мкм для пептидов Ό1’ и КЬ; 30 мкг/мл для пептидов ΖΟΡ) или смесью рекомбинантного δΑд и корового антигена НВУ (всего 3 мкг/мл). Добавляли конканавалин А в качестве положительного контрольного стимулятора.
Результаты (фиг. 32) показывают, что иммунизация мышей С57ВЬ/6 ΟΙ-13008 Асоге-С) индуцирует ответы в ЕБАро! на ШЫ-у, направленные против поверхностного (δ) и корового антигенов НВУ с конкретной специфичностью в отношении следующих пептидов: ОЬ9-84, КЬ8-277 и/или КЬ8-347, ΖΟΡ-5 и ΖΟΡ-7. Эти пептиды индуцировали ответы ΙΡΗγ, превышающие ответы для лунок, содержащих среду отдельно, или для лунок, содержащих спленоциты из иммунизированных ΟΙ-13013 ^рех-О), иммунизированных ΥVΕС или наивных мышей. Смесь рекомбинантных антигенов δ+коровый антиген также индуцировала ответ ΙΡΗγ, хотя контрольные клетки ΥVΕС в этой конкретной группе стимуляторов генерировали фоновый сигнал, который исключал оценку антигенспецифического вклада для смеси антигенов δ+коровый антиген. Эти данные указывают на то, что ΟΙ-13008 ^соге-С), которая экспрессирует слитый белок поверхностный антиген-коровый антиген, индуцирует специфичные к антигенам НВУ иммунные ответы, которые можно повторно стимулировать отдельными пептидами ех νίνΌ, и что эти ответы в большей степени поддаются выявлению, чем ответы, индуцируемые ΟΙ-13013 ^рех-О).
Пример 13.
В следующем примере описан эксперимент, в котором иммунотерапевтическую композицию против НВУ на основе дрожжей исследовали в отношении способности стимулировать продукцию ΙΕΗγ из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от индивидуума, вакцинированного коммерческой профилактической вакциной против НВУ.
В этом эксперименте иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей, известный как ΟΙ-13002 (8соге, содержащий δΕΟ ΙΌ N0:34, пример 1) исследовали в отношении его способности стимулировать продукцию ШЛу из РВМС, выделенных из индивидуума, которого вакцинировали коммерческой профилактической вакциной против НВУ (ΕNΟΕКIX-В®,
С1аxοδт^ιЬΚ1^ηе), которая представляет собой профилактическую вакцину, содержащую рекомбинантный очищенный поверхностный антиген вируса гепатита В (НВ8Ад), адсорбированный на адъюванте на основе алюминия.
В кратком изложении, проводили взятие крови и РВМС выделяли от здоровых не наивных по НВУ людей, у которых экспрессировался аллель НЬА-А*0201. РВМС замораживали для последующего анализа. Затем индивидуума вакцинировали ΕNΟΕКIX-В® (инъекция 1), проводили взятие крови на 12 и 29 сутки после инъекции и РВМС выделяли и замораживали. Индивидуума вакцинировали второй раз ΕNΟΕКIX-В® (инъекция 2, вспомогательная инъекция) и проводили взятие крови на 10, 21 и 32 сутки после вспомогательной инъекции. Для каждого момента времени РВМС выделяли и замораживали.
После получения и замораживания серии образцов РВМС клетки для всех моментов времени размораживали, промывали и инкубировали с контролем в виде дрожжей с пустым вектором (ΥΥΕΟ) или с ΟΙ-13002 в соотношении дрожжи:РВМС 5:1 в течение 3 суток в инкубаторе при 37°С/5% СО2. Затем клетки переносили в планшет для ЕБАро! на ΙΡΗγ, инкубировали в течение 18 ч и обрабатывали для проявления ЕБАро! согласно стандартным методикам.
Как показано на фиг. 33 (столбики обозначают периоды времени до и после примирующей иммунизации или после вспомогательной иммунизации), для обработанных ΟΙ-13002 РВМС наблюдали значительный ответ в ЕБАро!, который превышал ответ РВМС, обработанных ΥΥΕΟ, в момент времени 21 сутки после вспомогательной иммунизации (ЕБАро! для ΟΙ-13002 минус ЕБАро! дл ΥVΕС ~230 точек на один миллион РВМС). Уровень ЕБАро! для δ^ΐΌ с вычетом ΥVΕС был выше количества, наблюдаемого для других моментов времени, и в 2,8 раза превышал сигнал, полученный для образца до вакцинации. Единственным существенным структурным отличием между композициями на основе дрожжей ΟΙ13002 и ΥVΕС является присутствие слитого белка поверхностный антиген-коровый антиген (антиген НВУ) в векторе, который содержится в ΟΙ-13002 (т.е. ΥУΕС имеют пустой вектор). Таким образом, результат указывает на то, что ΟΙ-13002 индуцировала антигенспецифическую стимуляцию Т-клеток в РВМС индивидуума. Поскольку вакцина ΕNΟΕКГX-В® содержит рекомбинантный поверхностный антиген, но не коровый антиген, и поскольку индивидуум был негативным по вирусу НВУ (не были инфицированы НВУ), этот результат также указывает на то, что наблюдаемая продукция ШЛу происходила из специфичных к НВ8Ад (специфичных к поверхностному антигену), а не из специфичных к коровому антигену, Т-клеток.
Пример 14.
В следующем примере описана оценка иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе
- 108 028659 дрожжей ш У1уо в моделях иммунизации на мышах.
В этом эксперименте иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей, известный как 01-13009 (8С0КЕГО, содержащий 8ЕЦ ГО N0:118, пример 7), и иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей, известный как 01-13020 (Х-8С0КЕ, содержащий 8ЕЦ ГО N0:130, пример 8) вводили мышам С57ВЬ/6, мышам ВАЬВ/с и трансгенным мышам по НЬА-А2 (В6.Сд-Тд(НЬА-А/Н2-Э)2Епде/1; Тйе 1аскзоп ЬаЬога!огу, предоставляемые по лицензии от Ишуегзйу оГ Уйд1ша Ра!еп! Роипбайоп). Трансгенные мыши по НЬА-А2, использованные в этих экспериментах, экспрессируют межвидовой гибридный ген МНС класса I, ААЭ, который содержит домены а-1 и а-2 гена НЬА-А2.1 человека и а-3 трансмембранный и цитоплазматический домены гена Н-2Э'1 мыши, под контролем промотора НЬА-А2.1 человека. Химерная молекула МНС класса I НЬА-А2.1/Н2ГОб опосредует эффективную положительную селекцию Т-клеток мыши для обеспечения более полного репертуара Т-клеток, способных распознавать пептиды, представляемые молекулами класса I НЬА-А2.1. Пептидные эпитопы, представляемые и распознаваемые Т-клетками мыши в контексте молекулы класса I НЬА-А2.1/Н2ГОб, являются такими же, как эпитопы, представляемые у людей НЬА-А2.1+. Таким образом, эта трансгенная линия обеспечивает моделирование Т-клеточных иммунных ответов человека на представляемые НЬА-А2 антигены.
Целью этих экспериментов была оценка широты и величины антигенспецифических иммунных ответов против НВУ, которые генерируются путем иммунизации иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей у мышей с различными аллелями МНС, включая мышей, экспрессирующих молекулу МНС (НЬА) человека. Исследование иммуногенности проводили после иммунизации путем стимуляции ех У1уо селезенки или лимфатических узлов соответствующими антигенами НВУ с последующей оценкой Т-клеточных ответов посредством двухцветного ЕЫ8ро! на ^N-7^-2, анализа пролиферации лимфоцитов (ЬРА), анализа множества цитокинов Ьитшех и/или внутриклеточного окрашивания цитокинов ^СС8). ЮС8 использовали для определения вклада СГО4' и СГО8' Т-клеток в антигенспецифическую продукцию ΣΡΗ-γ и ТЯР-а.
В каждом из экспериментов, описанных ниже, мышей подкожно вакцинировали иммунотерапевтическими композициями против НВУ на основе дрожжей или контролем на основе дрожжей (описанным ниже) в соответствии с тем же режимом: инъекция в 2 области (бок, задняя часть шеи) 2,5 Д.Е. дрожжевой композиции на область, один раз в неделю в течение 3 недель. Контроли включали УУЕС (контрольные дрожжи, содержащие пустой вектор, т.е. не содержащие антиген), 0УАХ2010 (контрольная иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, которая экспрессирует антиген не из НВУ, овальбумин), и комбинация УУЕС с растворимыми рекомбинантными антигенами (антигены овальбумина или НВУ) и антитело против СГО40. Конкретные эксперименты и группы введения представлены в табл. 8 и 9 ниже. Мышей умерщвляли через 8 суток (трансгенные по НЬА-А2, эксперимент 1) или 14 суток (С57ВЬ/6 и ВАЬВ/с, эксперимент 2) после третьей иммунизации, и селезенку и паховые лимфатические узлы вырезали и инкубировали с различными антигенными стимулами (ограниченные по МНС класса I и класса II пептиды НВУ, рекомбинантный белки и экспрессирующие антиген НВУ опухолевые клеточные линии) в течение 5 суток, как указано ниже. Для анализа Ьитшех культуральные супернатанты собирали и оценивали в отношении продуцирования 10 различных цитокинов (тип Тй1 и Тй2) через 48 ч после добавления антигена. Для анализов ЕЫ8ро! клетки инкубировали на планшетах, покрытых антителом против ΣΡΗ-γ, в течение последних 24 ч стимуляции ш уйго ^У8) в течение 5 суток, с последующей стандартизованной детекцией и подсчетом точек. Для ЬРА клетки обрабатывали 3Н-тимидином в течение последних 18 ч, Ш8 в течение 5 суток, а затем измеряли количество изотопа, включенного во вновь синтезированную ДНК, путем сцинтилляционного подсчета. ЮС8 после стимуляции в течение полных 7 суток подвергали градиентному центрифугированию в Рюо11 для устранения погибших клеток, а затем 1 миллион жизнеспособных клеток на лунку (96-луночные планшеты с И-образным дном) инкубировали в течение 5 ч с теми же самыми антигенными стимулами в диапазоне концентраций (титрование), а затем обеспечивали их проницаемость и подвергали окрашиванию связанными с флуорохромом антителами, распознающими внутриклеточный ΣΤΉ-γ и ТИР-а вместе с маркерами клеточной поверхности СГО4 и СГО8. Процент СГО4' или СГО8' Т-клеток, экспрессирующих цитокины, определяли проточной цитометрией.
В табл. 8 описаны экспериментальные группы и протокол эксперимента 1. В этом эксперименте группы мышей с НЬА-А2 иммунизировали с использованием протокола, описанного выше, и мышей умерщвляли для иммунного анализа через 8 суток после третьей иммунизации. В группе А (УУЕС) вводили контрольные дрожжи УУЕС в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше; в группе В (8С0КЕГО (ОМ3009-ЬЕ2)) вводили 0Ы3009, выращенные в среде ИЬ2 (см. пример 7) в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше; и в группе С (Х-8С0КЕ (0Ы3020-и2)) вводили ОЬ 13020, выращенные в среде И2 (см. пример 8) в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше.
- 109 028659
Таблица 8
Группа | Мыши с НЬА-А2 проводимое введение) |
А | 3, УУЕС |
в | 3, ЗСОЕЕ-О/С1-13009-иЬ2 |
с | 3, Х-ЗСОКЕ/С1-13020-и2 |
Результаты анализа ЕЫ8ро! на ГРМ-у из клеток лимфатических узлов, собранных из мышей в эксперименте 1, представлены на фиг. 34. На этой фигуре представлены результаты повторной стимуляции клеток лимфатических узлов из иммунизированных мышей различными пептидами НВУ по сравнению с контролем в виде среды (следует отметить, что пептид, обозначаемый как ТКО20, представляет собой пептид из Х-антигена (Х52-60), который содержится в иммунотерапевтической композиции Х-8С0КЕ, но не присутствует в 8С0КЕ-Э). Результаты показали, что клетки лимфатических узлов как из мышей, иммунизированных 8С0КЕ-Э (С1-13009), так из мышей, иммунизированных Х-8С0КЕ (С1-13020), содержат Т-клетки, которые продуцируют ШЫ-у в ответ на стимуляцию ш νίΙΐΌ смесью 3 мкг/мл каждого из рекомбинантного поверхностного и корового антигенов НВУ (фиг. 34; обозначаемые как 8&С3). Этот ответ ЕЫ8ро! превышал ответ, который наблюдался для иммунизированных УУЕС мышей (дрожжевые контроли), которых лечили тем же стимулятором, что указывает на то, что поверхностный и/или коровый антигены НВУ в иммунотерапевтических композициях на основе дрожжей (8С0КЕ-Э и Х-8С0КЕ) требуются для индукции ответа ГРМ-у. Более того, результаты указывают на то, что повторная стимуляция с использованием антигена НВУ в 1У8 приводит к эффективной продукции ГРМ-у, поскольку лунки, содержавшие среду отдельно, продемонстрировали значительно более низкий ответ ЕЫ8роЕ
На фиг. 34 также показано, что отдельный ограниченный по НЬА-А2 эпитоп из корового антигена НВУ (ТКР16; Соге:115-124 УЪЕУЪУ8РСУ; 8ЕЦ ГО N0:75), известный в данной области тем, что он является важным у пациентов с острой инфекцией и клиренсом НВУ, индуцирует ответ у иммунизированных у мышей, иммунизированных Х-8С0КЕ, который превышает ответ, наблюдаемый для всех лунок, в которых была только среда. Ожидается, что дальнейшее уточнение концентрации пептида и времени инкубации для анализа ЕЫ8ро1, увеличит величину и снизит вариабельность наблюдаемого ответа для этих антигенов.
На фиг. 35 показаны результаты анализа ЕЫ8ро1 на ГРМ-у для клеток селезенки, полученных от мышей, иммунизированных 8С0КЕГО, в эксперименте 1. Коровый пептид НВУ, обозначаемый как Соге11-27 (АТУЕЬЬ8РЬР8ПРРР8У (8ЕЦ ГО N0:72)) содержится в антигене, экспрессируемом 8С0КЕΌ, в то время как Х-пептид НВУ, обозначаемый как Х92-100 не содержится в антигене, экспрессируемом 8С0КЕГО, и, таким образом, он является контрольным пептидом в этом эксперименте. Как показано на фиг. 35, клетки селезенки из трансгенных по НЬА-А2 мышей, имунизированных 8С0КЕГО, вызывали ответ в ЕЫ8ро! на ГРМ-у при стимуляции ш νίΙΐΌ известным ограниченным по НЬА-А2 эпитопом корового антигена НВУ, обозначаемым как Соге11-27. Этот ответ превышал ответ, наблюдаемый для клеток селезенки, которые стимулировали ш νίΙΐΌ посторонним пептидом (обозначаемым как Х92-100), средой отдельно, или для спленоцитов из мышей, иммунизированных УУЕС в любых лунках с обработкой 1У8.
Таким образом, первоначальные результаты из эксперимента 1 показывают, что как 8С0КЕГО, так и Х-8С0КЕ, индуцируют специфичные к антигену НВУ Т-клеточные ответы у трансгенных по НЬА-А2 мышей, иммунизированных этими иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей.
В табл. 9 описаны экспериментальные группы и протокол для эксперимента 2. В этом эксперименте группы мышей С57ВЬ/6 и ВАЬВ/с иммунизировали с использованием протокола, описанного выше, и мышей умерщвляли для иммунного анализа через две недели после третьей иммунизации. В группе А (наивные) не проводили лечения; в группе В (УУЕС) вводили контрольные дрожжи УУЕС в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше; в группе С (Х-8С0КЕ (С1-13020-И2)) вводили С113020, выращенные в среде И2 (см. пример 8) в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше; в группе Ό (8С0КЕГО (С1-13009-ИЬ2)) вводили С1-13009, выращенные в среде ИЬ2 (см. пример 7) в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше; и в группе Е (0УАХ2010) вводили контрольные дрожжи, экспрессирующие овальбумин, в соответствии со схемой иммунизации, описанной выше.
- 110 028659
Таблица 9
Группа | Мыши С57ВЬ/6 проводимое введение) | Мыши ВАЬВ/с (#, проводимое введение) |
А | 8, наивные | 8, наивные |
В | 8, УУЕС | 8, УУЕС |
С | 8, Х-ЗСОКЕ {С1-13020-и2) | 8, Х-8СОКЕ (С1-13020-и2) |
ϋ | 8, ЗСОКЕ-ϋ (С1-13009-иЬ2) | 8, ЗСОВЕ-Ό (С1-13009- иь2) |
Е | 8, ОУАХ20Ю | 7, ОУАХ2010 |
На фиг. 36 показаны результаты анализов ЕЫЗро! для клеток лимфатических узлов, выделенных из мышей С57ВЬ/6, иммунизированных, как указано в эксперименте 2 (табл. 9). Эти результаты продемонстрировали, что как Х-ЗС0КЕ, так и ЗС0КЕ-Э, индуцировали ответы ΕΡΝ-γ у мышей С57ВЬ/6 дикого типа. Клетки лимфатических узлов мышей, иммунизированных Х-ЗС0КЕ, стимулированные ш уйго очищенными экспрессируемыми РюЫа ракЮпк поверхностным и коровым антигенами (обозначаемыми уЗ&С; ЩЗ со смесью 1:1 экспрессируемых РюЫа поверхностного и корового антигенов, по 3 мкг/мл каждого), вызывали значительный иммунный ответ ΣΡΝ-γ. Те же препараты клеток лимфатических узлов из мышей, иммунизированных как Х-ЗС0КЕ, так и ЗС0КЕ-Э, когда их стимулировали экспрессируемыми Е. соН поверхностным и коровым антигенами (обозначаемыми сЗ&С; !УЗ со смесью 1:1 экспрессируемых Е. сой поверхностного и корового антигенов, по 3 мкг/мл каждого), продуцировали более высокие общие ответы в ЕЫЗро!, чем ответы, наблюдаемые для экспрессируемых РюЫа рекомбинантных антигенов. В столбце, обозначенном без стимуляции на фиг. 36 обозначены условия РУЗ, где предоставляли среду сКРМI отдельно (без антигена). Как правило, иммунизация Х-ЗС0КЕ индуцировала больший эффект, чем ЗС0КЕ-Э, и обе иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей индуцировали более высокий ответ, чем наблюдалось для иммунизированных УУЕС (контрольные дрожжи) или наивных мышей. Эти данные указывают на то, что как ЗС0КЕ-Э, так и Х-ЗС0КЕ индуцируют специфичные к антигену НВУ иммунные ответы, которые поддаются выявлению в клеточных препаратах лимфатических узлов ех νί\Ό из мышей С57ВЬ/6.
На фиг. 37 показаны результаты анализа внутриклеточного окрашивания цитокинов ^ССЗ) для мышей С57ВЬ/6, проведенного в эксперименте 2 (табл. 9). Результаты показали, что иммунизация мышей С57ВЬ/6 либо Х-ЗС0КЕ, либо ЗС0КЕ-Э, индуцирует IΡN-γ-продуцирующие СЭ8' Т-клетки, которые являются специфичными ограниченного по Н-2КЬ МНС класса I пептида из поверхностного антигена, обозначаемого У^Ь (У^ЬЗУТ^М; ЗЕЦ ГО N0:152). Этот эффект зависел от концентрации пептида, добавленного к клеткам, в ходе инкубации в течение 5 ч в процессе ЮСЗ; более высокие концентрации пептида приводили к увеличению отличия в уровне ΡΡΝ-γ-продуцирующих СГО8+ Т-клеток для иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей (ЗС0КЕГО и Х-ЗС0КЕ) относительно посторонних контрольных дрожжей (0уах и Ууес), с максимальным различием при 10 мкг/мл пептида.
Анализы ЮСЗ эксперимента 2 также показали, что иммунизация мышей С57ВЬ/6 Х-ЗС0КЕ и ЗС0КЕГО индуцировала ΡΡΝ-γ-продуцирующие СГО4' Т-клетки, специфичные к ограниченному по МНС класса II пептиду НВУ из корового белка, обозначаемого как 2ОР-5 (УЗΡОУ^IКТРРАΥКРРNАРI^; ЗЕО ГО N0:148) с добавлением 0,5 мкг/мл пептида в ходе периода инкубации в течение 5 ч в процессе ЮСЗ (фиг. 38).
Взятые вместе с результатами ЕЫЗрор описанными выше, эти данные указывают на то, что иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей как ЗС0КЕГО, так и Х-ЗС0КЕ, индуцируют специфичные к антигену НВУ эффекторные СГО4' и СГО8' Т-клетки, которые выявляются путем стимуляции ех У1уо клеток лимфатических узлов и селезенки рекомбинантными антигенами НВУ и пептидами НВУ. Тклеточные ответы появляются как у мышей С57ВЬ/6 дикого типа (Н2-КЬ), так и у трансгенных по НЬАА2 мышей, указывая на потенциал этих вакцин в отношении индукции иммунных ответов в контексте разнообразных типов главного комплекса гистосовместимости.
Исходя из результатов, описанных в этом примере выше для мышей НЬА-А2 и мышей С57ВЬ/6, а также результатов экспериментов, описанных в примерах 9, 10, 11 и 12, ожидается, что результаты для мышей ВАЬВ/с, иммунизированных либо ЗС0КЕГО, либо Х-ЗС0КЕ, также продемонстрируют, что иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей индуцируют антигенспецифические эффекторные СГО4' и СГО8' Т-клетки у этих мышей. Действительно, первоначальные результаты для групп ВЛЬВ/с были положительными по СГО8' Т-клеточным ответам (данные не представлены). Кроме того, ожидается, что анализы пролиферации лимфоцитов и анализы высвобождения цитокинов Ьитшех покажут, что как ЗС0КЕГО, так и Х-ЗС0КЕ, индуцируют иммунные ответы, специфично нацеленные на последовательности антигена НВУ, присутствующие в иммунотерапевтических композициях на основе
- 111 028659 дрожжей, и что эти ответы будут наблюдаться во всех трех линиях мышей (трансгенные по НЬА-А2, С57ВЬ/6 и ВАЬВ/с).
Пример 15.
В следующем примере описан эксперимент, в котором иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей оценивают в отношении способности стимулировать продукцию ГРИу из РВМС, выделенных из доноров с различным воздействием антигенов НВУ.
В этом эксперименте иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей, известный как ΟΙ-13009 (Зсоге-Ό, содержащий δΕΟ ΙΌ N0:118, пример 7), и иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей, известный как ΟΙ-13020 (Х^соге, содержащий δΕΟ ΙΌ N0:130, пример 8) исследуют в отношении их способности стимулировать продукцию ГР^у из РВМС, выделенных из доноров с различным воздействием антигенов НВУ. В этом эксперименте одну группу доноров ранее вакцинировали ΕNΟΕКIX-В® (Ο1аxоδт^!ЬК1^ηе) или КΕС0ΜВIУΑX НВ® (Мегск & Со., Шс.), одна группа доноров является наивной в отношении антигена НВУ (нормальная), и одна группа доноров представляет собой пациента с хроническим НВУ (индивидуум, хронически инфицированный НВУ). ΕNΟΕКIX-В® представляет собой профилактическую рекомбинантную субъединичную вакцину, содержащую рекомбинантный очищенный поверхностный антиген вируса гепатита В (НВзАд), продуцируемый в клетках дрожжей, очищенный, а затем адсорбированный на адъюванте на основе алюминия. КΕС0ΜВIУΑX НВ® представляет собой профилактическую рекомбинантную субъединичную вакцину, происходящую из поверхностного антигена НВУ (НВзАд), продуцируемую в клетках дрожжей и очищенную так, чтобы она содержала менее 1% дрожжевых белков. У всех доноров экспрессируется аллель НЬА-А*0201.
РВМС доноров инкубируют в чашках с 6 ячейками с плоским дном для культивирования тканей (107 РВМС на ячейку) в течение 3 ч в инкубаторе с 5% СО2 в полной среде РРМР содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку. Неприкрепляющиеся клетки удаляют и отбрасывают, а прикрепляющиеся клетки обрабатывают рекомбинантным интерлейкином-4 человека (Ш-4) и рекомбинантные гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором человека (ΟΜ-Γ'δΡ) (20 и 50 нг/мл соответственно) в течение 5 суток для получения незрелых дендритных клеток (ГОС). Затем ГОС инкубируют с антителом против СО40 (1 мкг/мл), УУЬС (контрольные дрожжи, содержащие пустой вектор), или продуктами на основе дрожжей ΟΙ-13020 или ΟΙ-13009, в течение 48 ч в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С, с получением зрелых ОС. Для обработанных антителом против СО40 ОС, клетки дополнительно обрабатывают ограниченными по НЬА-А*0201 пептидами НВУ с использованием стандартных способов. Все группы ОС промывают ΡВδ, а затем извлекают из чашек с помощью харвестера в ΡВδ. Клетки облучают (30 Гр) и используют для стимуляции аутологичных донорских РВМС в соотношении ОС:РВМС 1:10. Стимуляцию проводят в течение 7 суток (раунд 1), из которых последние 4 суток проводят в среде, содержащей рекомбинантный ΙΌ-2 человека. Затем стимулированные РВМС повергают градиентному центрифугированию в Рюо11, и выделенные жизнеспособные клетки подвергают второму раунду ^δ с обработанными дрожжами или обработанными пептидом ОС, полученными, как описано выше. Затем стимулированные РВМС инкубируют с пептидом(ами) НВУ или контролями в присутствии 20 Е/мл гЫЬ-2 в 96-луночных планшетах, покрытых антителом, специфичным к ШН-у, и проводят выявление в с использованием стандартных методик изготовителя. Ожидается, что РВМС, стимулированные аутологичными ОС, подпитываемыми δΓ0ΡΕ-Ό или Х^С0КЬ, или ОС, обработанными пептидом НВУ, будут отвечать на экзогенные пептиды НВУ в большей степени, чем РВМС, стимулированные подпитываемыми УУЬС или необработанными ОС, и что этот эффект будет более выраженным для реципиентов вакцин НВУ ΕNΟΕКIX® или КΕС0ΜВIУΑX НВ®, чем для доноров, которые являются наивными в отношении воздействия антигена НВУ.
Пример 16.
В следующем примере описаны доклинические эксперименты с использованием РВМС человека для демонстрации иммуногенности иммунотерапевтических композиций против НВУ на основе дрожжей по изобретению у человека.
В частности, эти эксперименты предназначены для определения того, можно ли специфичные к поверхностному антигену НВУ и/или специфичные к коровому антигену НВУ СО8+ Т-клетки выявлять в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) носителей НВУ после 2 раундов стимуляции Ш νί!ΐΌ (Ι^7δ) иммунотерапевтическими композициями против НВУ на основе дрожжей, содержащими поверхностный антиген НВУ и коровый антиген НВУ.
РВМС получают из доноров человека, для которых подтверждено, что они являются положительными по НВУ (исходя из статуса НВзАд в сыворотке). Тотальную ДНК выделяют из 0,5 мл цельной крови и типируют на НЬА для идентификации правильного пентамера НВУ для исследования (см. таблицу ниже).
- 112 028659
Таблица 10
Тип НЬА | Пептидная последовательность пентамера | Антиген |
А*0201 | ГЬЬТК1ЬТ1 (5Е<2 Ю N0:42) | Поверхностный антиген |
А*0201 | СЬЗРТУНЬЗУ (5Е<2 Ю N0:43) | Поверхностный антиген |
А*0201 | РЬР30РЕР31 <5Е(2 Ю N0:44) | Коровый антиген |
А*1101 | УУЫУИМСЬК (ЗЕО Ю N0:48) | Коровый антиген |
А*2402 | ЕУЪУЗРСУМ (ЗЕО Ю N0:49) | Коровый антиген |
Дендритные клетки (ИС) получают из РВМС, выделенных из доноров, описанных выше, путем культивирования РВМС в течение 5 суток в присутствии ОМ-С3Р и №-4. Затем ИС инкубируют с иммунотерапевтическими композициями против НВУ на основе дрожжей (например, иммунотерапевтическими композициями, описанными в любом из примеров 1-8 или в других разделах настоящего описания) или контрольными дрожжами (например, УУЕС, которые представляют собой дрожжи 3ассйаготусек сегеуШае, которые трансформированы пустым вектором или вектором, который не содержит кодирующую антиген вставку), в соотношении 1:1 (дрожжиГОС). Контрольные культуры ИС также включают ИС, инкубированные с пептидами НВУ, контрольными пептидами (пептидами не из НВУ) или ни с чем.
После сокультивирования в течение 48 ИС используют в качестве антигенпредставляющих клеток (АРС) для стимуляции аутологичных Т-клеток (т.е. Т-клеток из доноров). Каждый цикл стимуляции, обозначаемый как !У3 (стимуляция ίη У11го), состоит из культивирования в течение 3 суток в отсутствие ГЕ-2, а затем в течение 4 дополнительных суток в присутствии рекомбинантного ГЕ-2 (20 Е/мл). В конце !У3 2, Т-клетки окрашивают контрольным тетрамером или пентамером, или тетрамером или пентамером, специфичным к пептидному эпитопу НВУ, идентифицированному выше. Процент СЭ8' Т-клеток, которые окрашиваются положительно тетрамером или пентамером, количественно определяют проточной цитометрией.
Ожидается, что стимуляция донорных Т-клеток из НВУ-положительных доноров иммунотерапевтической композицией против НВУ на основе дрожжей по изобретению, увеличит процент положительных по тетрамеру/пентамеру СЭ8' Т-клеток по меньшей мере у некоторых или у большинства доноров, по сравнению с контролями, указывая на то, что Т-клетки человека из инфицированных НВУ индивидуумов способны распознавать белки НВУ, которые содержит иммунотерапевтическое средство на основе дрожжей в качестве иммуногенов.
Дополнительные эксперименты, сходные с экспериментами, описанными выше, проводят с использованием донорских РВМС из нормальных (не инфицированных НВУ) индивидуумов. Ожидается, что стимуляция донорских Т-клеток из нормальных доноров иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей НВУ по изобретению увеличивает процент положительных по тетрамеру/пентамеру СЭ8' Тклеток по меньшей мере у некоторых или у большинства доноров, по сравнению с контролями, указывая на то, что Т-клетки человека из неинфицированных индивидуумов также обладают способностью распознавать белки НВУ, содержащиеся в иммуноттерапевтическом средстве на основе дрожжей в качестве иммуногенов.
В дополнительном эксперименте, НВУ-специфические Т-клетки из трех доноров из экспериментах, описанных выше, увеличивают в количестве ίη νίίΐΌ с использованием ИС, инкубированных с иммунотерапевтическими композициями против НВУ на основе дрожжей (например, композициями, описанными в любом из примеров 1-8 или в других разделах настоящего описания) в течение 2 циклов !У3 (как описано выше). Третью !У3 проводят с помощью ИС, созревших в присутствии СИ40Ь и обработанных пептидом(ами) НВУ. На 5 сутки СЭ8' Т-клетки выделяют и используют в анализе цитотоксических Тлимфоцитов (СТЬ) в течение ночи против мишеней в виде опухолевых клеток, экспрессирующих антигены НВУ, при различных соотношениях эффектор:мишень (ЕТ). Измеряют процент СЭ8' Т-клеток, которые положительно окрашиваются контрольным тетрамером/пентамером против НВУ-специфического тетрамера/пентамера.
Ожидается, что Т-клетки из некоторых или всех из доноров будут способны генерировать СЭ8' СТЬ, которые могут уничтожать мишени, экспрессирующие антигены НВУ. Эти данные продемонстрируют, что иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей могут генерировать специфичные к НВУ СТЬ, которые способны уничтожить экспрессирующую антигены НВУ опухолевую клетку.
Пример 17.
В следующем примере описано клиническое испытание фазы 1 у здоровых добровольцев.
12-Недельное открытое клиническое испытание фазы 1 с увеличением дозы проводят с использова- 113 028659 нием иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей, описанной в настоящем описании как 01-13009 (§С0КЕГО, содержащая 5>ЕЦ ГО N0:118, пример 7), или альтернативно используют иммунотерапевтическую композицию против НВУ на основе дрожжей, описанной в настоящем описании как 01-13020 (Х-8С0КЕ, содержащей 5>ЕЦ ГО N0:130, пример 8). Можно использовать другие иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей, описанные в настоящем описании (например, любые из композиций, описанных в примерах 1-8) в сходных клинических испытаниях фазы 1. Иммунотерапевтический продукт против НВУ на основе дрожжей для клинического испытания фазы 1 выбирают на основе доклинических испытаний (например, доклинических испытаний, описанных в любом из примеров 9-17), исходя из факторов, включающих наиболее сильный суммарный профиль иммунного ответа (например, амплитуда ответа для Т-клеточных эпитопов, которая в наибольшей степени предсказывают положительный исход, и/или широта иммунного ответа среди диапазона эпитопов).
Индивидуумы представляют собой добровольцев с активной и здоровой иммунной системой без предшествующих или текущих признаков или сведений об инфекции НВУ.
Приблизительно 48 индивидуумам (6 групп, 8 индивидуумов на группу), удовлетворяющим этим критериям, вводят иммунотерапевтическую композицию против НВУ на основе дрожжей в протоколе для групп с последовательным увеличением дозы с использованием одного или двух из следующих протоколов дозирования.
Протокол А: дозирование для примирования-вспомогательной иммунизации (4 дозы раз в неделю, начиная с 1 суток, а затем 2 дозы раз в месяц на 4 неделе и 8 неделе).
Группа 1А: 20 Д.Е. (вводимые дозами 10 Д.Е. в 2 различных области); группа 2А: 40 Д.Е. (вводимые дозами 10 Д.Е. в 4 различных области); группа 3А: 80 Д.Е. (вводимые в дозах 20 Д.Е. в 4 различных области);
дозирования раз в неделю (три общих дозы, вводимых на 1 сутки, 4 неделе и 8 неделе).
Группа 1В: 20 Д.Е. (вводимые в дозах 10 Д.Е. в 2 различные области); группа 2В: 40 Д.Е. (вводимые в дозах 10 Д.Е. в 4 различные области); группа 3В: 80 Д.Е. (вводимые в дозах 2 0 Д.Е. в 4 различных области).
Все дозы вводят подкожно и дозу разделяют на две или четыре области организма (каждое посещение), как указано выше. Оценивают безопасность и иммуногенность (например, ответы антигенспецифических Т-клеток, измеряемые с помощью ЕЫ§ро1 и пролиферации Т-клеток). В частности, разрабатывают алгоритм на основе ЕЫ§ро1 для безусловно отвечающих пациентов. Также проводят анализы ЕЫ§ро1, количественно определяющие регуляторные Т-клетки (Тгед) и пролиферацию СЭ4' Т-клеток в ответ на антигены НВУ оценивают и сопоставляют с развитием антител против §ассйаготусек сегеу151ае (А8СА).
Ожидается, что иммунотерапевтическая композиция против НВУ на основе дрожжей будет хорошо переноситься и покажет иммуногенность при измерении в одном или нескольких из анализа ЕЫ§ро1, анализа пролиферации лимфоцитов (ЬРА), стимуляции Т-клеток антигенами НВУ ех У1уо, и/или А8СА.
Пример 18.
В следующем примере описано клиническое испытание фазы 1Ъ/2а у индивидуумов, хронически инфицированных вирусом гепатита В.
Вследствие тенденции у инфицированных НВУ пациентов к появлению дестабилизирующих обострений гепатита в качестве части естественного анамнеза заболевания, после некоторого периода частичного или полного вирологического контроля начинают иммунотерапию против НВУ на основе дрожжей с использованием терапии, основанной на противовирусном средстве, с первичной целью эффективности, состоящей в улучшении частоты сероконверсии. В этом первом подходе закрепления иммунотерапию против НВУ на основе дрожжей используют у пациентов после достижения ими отрицательности по ДНК НВУ в анализе ПЦР для определения того, может ли быть увеличена частота сероконверсии в комбинации с продолжающейся противовирусной терапией.
Открытое клиническое испытание фазы 1Ъ/2а с увеличением дозы проводят с использованием иммунотерапевтической композиции против НВУ на основе дрожжей, описанной в настоящем описании в качестве 01-13009 (§С0КЕГО, содержащая 5>ЕЦ ГО N0:118, пример 7), или альтернативно используют иммунотерапевтическую композицию против НВУ на основе дрожжей, описанную в настоящем описании в качестве 01-13020 (Х-8С0КЕ, содержащая 5>ЕЦ ГО N0:130, пример 8). Можно использовать другие иммунотерапевтические композиции против НВУ на основе дрожжей, описанные в настоящем описании (например, любая из иммунотерапевтических композиций, описанных в примерах 1-8) в сходном клиническом испытании фазы 1. Индивидуумы представляют собой индивидуумов, имеющих активную иммунную систему и хронически инфицированных вирусом гепатита В (НВУ), которые хорошо контролируются противовирусной терапией (т.е. тенофовира дизопроксил фумарат, или ТИР (У1КЕАИ®)) при измерении по уровням ДНК НВУ. Индивидуумы являются негативными в отношении ДНК НВУ (ниже поддающихся выявлению уровней способом ПЦР или <2000 МЕ/мл), но для соответствия требованиям этого испытания индивидуумы должны быть положительными по НВеАд и должны не иметь признаков цирроза или декомпенсации.
- 114 028659
На первой стадии этого испытания приблизительно 40 индивидуумам (~5 индивидуумов на группу), удовлетворяющим этим критериям, вводят иммунотерапевтическую композицию против ΗΒν на основе дрожжей в протоколе для групп с последовательным увеличением дозы, с использованием диапазонов доз от 0,05 до 80 Д.Е. (например, 0,05 Д.Е., 10 Д.Е., 20 Д.Е. и 40-80 Д.Е.). В одном протоколе будут вводить 5 доз раз в неделю подкожно (дозирование раз в неделю в течение 4 недель), а затем также будут подкожно вводить 2-4 дозы раз в месяц, с продолжающейся противовирусной терапией в ходе лечения иммунотерапией против ΗΒν на основе дрожжей (протокол примирование-вспомогательная иммунизация). Во втором протоколе следуют протоколу дозирования раз в 4 недели, где индивидууму вводят всего три дозы, вводимые на 1 сутки, 4 неделе и 8 неделе, с использованием стратегии увеличения дозы, указанной выше. Необязательно, в одном испытании в одной группе пациентов (5-6 пациентов) будут проводить подкожные инъекции плацебо (ΡΒδ) по той же схеме, что и для иммунотерапии плюс продолжающаяся противовирусная терапия. Существуют консервативные правила прекращения для резкого возрастания уровня АЬТ и признаков декомпенсации.
На второй стадии этого испытания пациентов (п=60) случайным образом распределяют по 30 на группу для продолжения противовирусной терапии (ТОР) отдельно или протокола противовирусной терапии вместе с иммунотерапевтическим средством на основе ΗΒν (доза 1 и доза 2) вплоть до 48 недель.
Оценивают безопасность, кинетику антигена ΗΒν, сероконверсию ΗΒеΑ§ и ΗΒκΛ§ и иммуногенность (например, антигенспецифические Т-клеточные ответы, измеренные с помощью Ε^Iδрοΐ) . Кроме того, проводят мониторинг дозозависимой биохимической (АЬТ) и вирусной нагрузки. В частности, проводят измерение снижения ΗΒ^§ в сыворотке в ходе лечения между 3 группами введения на 12, 24, 48 неделях, и устранение ΗΒкΑ§/сероконверсию измеряют на 48 неделе.
Увеличение частоты устранения ΗΒ^§ и/или сероконверсии на >20% через 48 недель у индивидуумов, которым проводят иммунотерапию на основе дрожжей и ТЭР. по сравнению с индивидуумами, которым вводят ТОР отдельно, считается клинически значимым достижением. Ожидается, что иммунотерапевтическая композиция против ΗΒν на основе дрожжей обеспечит терапевтическую пользу пациентам, хронически инфицированным ΗΒν. Ожидается, что иммунотерапия будет безопасной и хорошо переносимой во всех доставляемых дозах. Ожидают, что пациенты, которым вводят, по меньшей мере, наиболее высокую дозу иммунотерапии против ΗΒν на основе дрожжей, продемонстрируют обусловленные лечением специфичные к ΗΒν Т-клеточные ответы при определении с помощью Ε^IδΡ0Т, и ожидается, что пациенты с предшествующими специфичными к ΗΒν Т-клеточными ответами исходного уровня продемонстрируют улучшенные специфичные к ΗΒν Т-клеточные ответы во время лечения. Ожидается, что пациенты, которым проводят иммунотерапию ΗΒν на основе дрожжей, покажут увеличение частоты сероконверсии по сравнению с группой противовирусного средства и/или по сравнению с контрольной группой плацебо, если ее используют. Увеличение нормализации АЬТ ожидается у пациентов, которым проводили иммунотерапию ΗΒν на основе дрожжей.
В альтернативным испытании пациентов, негативных по ΗΒеΛд. удовлетворяющих другим критериям (активная иммунная система, хронически инфицированы ΗΒν, хорошо контролируются противовирусными средствами, без признаков декомпенсации) лечат в сходном испытании с увеличением дозы, как описано выше (или при максимально переносимой дозе или наилучшей дозе, идентифицированной в испытании, описанном выше). Проводят мониторинг пациентов в отношении безопасности, иммуногенности и сероконверсии ЖкАд.
Пример 19.
В следующем примере описано клиническое испытание фазы 1Ь/2а у индивидуумов, хронически инфицированных вирусом гепатита В.
Открытое клиническое испытание фазы 1Ь/2а с увеличением дозы проводят с использованием иммунотерапевтической композиции против ΗΒν на основе дрожжей, описанной в настоящем описании в качестве 0Ι-13009 (δί-ΌΡΕ-Ό, содержащая δΕΟ ΙΌ N0:118, пример 7), или альтернативно используют иммунотерапевтическую композицию против ΗΒν на основе дрожжей, описанную в настоящем описании как 0Ι-13020 ('Υ-δίΏΚΕ, содержащая δΕΟ ΙΌ N0:130, пример 8). Другие иммунотерапевтические композиции против ΗΒν на основе дрожжей, описанные в настоящем описании (например, любая из композиций, описанных в примерах 1-8), можно использовать в сходном клиническом испытании фазы 1Ь/2а. Индивидуумы имеют активную иммунную систему и являются хронически инфицированными вирусом гепатита В (ΗΒν), который контролируется противовирусной терапией (например, тенофовир (VIΚΕΑ^®)) в течение по меньшей мере 3 месяцев. Для включения в испытание не требуется, чтобы индивидуумы имели полный клиренс вируса, т.е. пациенты могут быть позитивными или негативными по ДНК ΗΒν (негативность определяется как уровни ниже поддающихся выявлению с помощью ПЦР или <2000 МЕ/мл); однако для соответствия требованиям для этого испытания индивидуумы не должны иметь признаков цирроза или декомпенсации. Пациенты могут быть позитивными по ΗΒеΛд. хотя в испытание могут быть включены негативные по ΗΒеΛд пациенты.
30-40 индивидуумам (6-10 пациентов на группу), удовлетворяющим этим критериям, вводят иммунотерапевтическую композицию против ΗΒν на основе дрожжей в протоколе для групп с последовательным увеличением дозы, с использованием диапазонов доз от 0,05 до 40 Д.Е. (например, 0,05 Д.Е., 0,5
- 115 028659
Д.Е., 4 Д.Е., 40 Д.Е.) или с использованием диапазонов доз от 0,05 до 80 Д.Е. (например, 0,05 Д.Е., 10 Д.Е., 20 Д.Е., 40/80 Д.Е.). В одном протоколе будут вводить 5 доз раз в неделю подкожно (дозирование раз в неделю в течение 4 недель), а затем также будут подкожно вводить 2-4 дозы раз в месяц, с продолжающейся противовирусной терапией в ходе лечения иммунотерапией против ΗΒУ на основе дрожжей (протокол примирование-вспомогательная иммунизация). Во втором протоколе следуют протоколу дозирования раз в 4 недели, где индивидууму вводят всего три дозы, вводимых на 1 сутки, 4 неделе и 8 неделе, с использованием стратегии увеличения дозы, указанной выше. В одном испытании в одной группе пациентов (5-6 пациентов) будут проводить подкожные инъекции плацебо (ΡΒδ) по той же схеме, что и для иммунотерапии плюс продолжающаяся противовирусная терапия. Существуют консервативные правила прекращения для резкого возрастания уровня АЬТ и признаков декомпенсации.
Оценивают безопасность, сероконверсию ΗΒеΑд и ΗΒзΑд, вирусный контроль (например, развитие негативности по вирусу или тенденция к негативности по вирусу), и иммуногенность (например, ответы антигенспецифических Т-клеток, измеренные с помощью Ε^Iδрο!). Кроме того, проводят мониторинг дозозависимой биохимической (АЬТ) и вирусной нагрузки.
Снижение Ж^ад, составляющее >11од10, на 24 неделе, или снижение НВ-еАд >11од10 на 12 неделе считаются конечными результатами для фазы 2а. Для сероконверсии ΗΒУ, критериями успеха являются сероконверсия δΑд на 10% на 24 неделе и на 15% на 48 неделе, и/или частота сероконверсии еАд, составляющая 25% на 24 неделе или 50% на 48 неделе.
Ожидается, что иммунотерапевтическая композиция против ΗΒУ на основе дрожжей обеспечит терапевтическую пользу у хронически инфицированных пациентов с ΗΒУ. Ожидается, что иммунотерапия будет безопасной и хорошо переносимой во всех доставляемых дозах. Ожидают, что пациенты, которым вводят, по меньшей мере, наиболее высокую дозу иммунотерапии против ΗΒУ на основе дрожжей, продемонстрируют обусловленные лечением специфичные к ΗΒУ Т-клеточные ответы при определении с помощью ΕΠδΡ0Τ, и ожидается, что пациенты с предшествующими специфичными к ΗΒУ Тклеточными ответами исходного уровня продемонстрируют улучшенные специфичные к ΗΒУ Тклеточные ответы во время лечения. Ожидается, что пациенты, которым проводят иммунотерапию ΗΒУ на основе дрожжей, покажут увеличение частоты сероконверсии по сравнению с доступными сравнительными данными для данного противовирусного средства и/или по сравнению с контрольной группой плацебо. Пациенты, которым проводят иммунотерапию ΗΒУ на основе дрожжей, покажут улучшение устранения вируса (например, негативность по вирусу при измерении способом ПЦР). Ожидается улучшение нормализации АЬТ у пациентов, которым проводят иммунотерапию ΗΒУ на основе дрожжей.
Пример 20.
В следующем примере описано клиническое испытание фазы 2 у индивидуумов, хронически инфицированных вирусом гепатита В.
В рандомизированном клиническом испытании фазы 2 у пациентов, хронически инфицированных ΗΒУ, проводят лечение наивных по лечению, позитивных по ΗΒеΑд (и, возможно, негативных по ΗΒеΑд) индивидуумов с АЬТ>2х иЬ-Ν и вирусной нагрузкой > 1 миллиона копий. У индивидуумов (~60 индивидуумов на группу, с коррекцией в зависимости от результата испытания фазы 1) должны пройти по меньшей мере 6 месяцев после предшествующей противовирусной терапии, и они должны быть негативными по вирусу в течение 2 последовательных визитов с интервалом по меньшей мере один месяц. Индивидуумов случайным образом распределяют на две группы. Пациентам группы 1 проводят иммунотерапию ΗΒУ на основе дрожжей в течение 24-48 недель (например, иммунотерапевтическая композиция против ΗΒУ на основе дрожжей, описанная в настоящем описании в качестве 0Ι-13009 (δί-ΌΡΕ-Ό, содержащая δΕΟ ΙΌ Ν0:118, пример 7), или альтернативно иммунотерапевтическая композиция против ЖУ на основе дрожжей, описанная в настоящем описании как 0Ι-13020 (Χ-δ^ΚΕ, содержащая δΕΟ ΙΌ Ν0:130, пример 8). Все пациенты, которым проводят иммунотерапию, продолжают противовирусную терапию (например, тенофовир (УIΚΕΑ^®)). В группе 2 пациентам вводят плацебо (инъекция контроля в виде ΡΒδ) с продолжающейся противовирусной терапией. Первичным результатом является сероконверсия и негативность по вирусу. Также в испытании фазы 2 можно использовать дополнительные иммунотерапевтические композиции против ΗΒУ на основе дрожжей, описанные в настоящем описании (например, любые из иммунотерапевтических композиций, описанных в примере 1-8) по сходной схеме.
Пациентам, которые достигают сероконверсии, проводят закрепляющую терапию в течение 6-12 месяцев посредством либо иммунотерапии на основе дрожжей и противовирусной терапии (группа 1), либо противовирусной терапии отдельно (группа 2), с последующим отдыхом от лечения в течение 6 месяцев. Количество пациентов, оставшихся в ремиссии после завершения отдыха в течение 6 месяцев, представляет собой вторичный результат испытания. Дополнительные результаты включают безопасность, иммуногенность и нормализацию АЬТ, как рассмотрено в примерах выше, в которых описаны клинические испытания у человека.
Ожидается, что иммунотерапевтическая композиция против ΗΒУ на основе дрожжей обеспечит терапевтическую пользу у хронически инфицированных пациентов с ΗΒУ. Ожидается, что иммунотерапия будет безопасной и хорошо переносимой. Ожидают, что пациенты, которым проводят иммунотерапию против ΗΒУ на основе дрожжей, продемонстрируют обусловленные лечением специфичные к ΗΒУ Т- 116 028659 клеточные ответы при определении с помощью ЕЫ8Р0Т, и ожидается, что пациенты с предшествующими специфичными к НВУ Т-клеточными ответами исходного уровня продемонстрируют улучшенные специфичные к НВУ Т-клеточные ответы во время лечения. Ожидается, что пациенты, которым проводят иммунотерапию НВУ на основе дрожжей, покажут увеличение частоты сероконверсии по сравнению с доступными сравнительными данными для данного противовирусного средства и/или по сравнению с контрольной группой плацебо. Пациенты, которым проводят иммунотерапию НВУ на основе дрожжей, покажут улучшение устранения вируса (например, негативность по вирусу при измерении способом ПЦР). Ожидается улучшение нормализации АЬТ у пациентов, которым проводят иммунотерапию НВУ на основе дрожжей.
Хотя различные варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны, очевидно, что модификации и адаптации этих вариантов осуществления будут приходить на ум специалистам в данной области. Однако следует понимать, что такие модификации и адаптации входят в объем настоящего изобретения, как указано в следующей формуле изобретения.
Claims (58)
1. Иммунотерапевтическая композиция, содержащая:
a) дрожжевой носитель и
b) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из ί) Х-антигена НВУ;
ίί) поверхностного антигена НВУ и ίίί) корового антигена НВУ.
2. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, содержащая:
a) дрожжевой носитель и
b) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из
ί) Х-антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична положениям 1-60 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма;
ίί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична положениям 63-461 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма; и
ш) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична положениям 462-643 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма.
3. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, содержащая:
a) дрожжевой носитель и
b) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из
ί) Х-антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична положениям 1-60 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма;
ίί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична положениям 63-461 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма; и
ш) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична положениям 462-643 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма.
4. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, содержащая:
a) дрожжевой носитель и
b) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из
ί) Х-антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична положениям 1-60 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма;
ίί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична положениям 63-461 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма; и
ш) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична положениям 462-643 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 130 или соответствующей последовательности НВУ другого штамма.
5. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, содержащая:
a) дрожжевой носитель и
b) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из
ί) Х-антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность от положения 1 до 60 последо- 117 028659 вательности 8ЕО ΙΌ N0: 130 или соответствующую последовательность НВУ другого штамма;
ίί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность от положения
63 до 461 последовательности 8Е0 ГО N0: 130 или соответствующую последовательность НВУ другого штамма; и ίίί) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность от положения 462 до 643 последовательности 8Е0 ГО N0: 130 или соответствующую последовательность НВУ другого штамма.
6. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, где:
ί) Х-антиген НВУ имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична положениям 52-126 полноразмерного Х-антигена НВУ;
ίί) поверхностный антиген НВУ имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного большого поверхностного антигена (Ь) НВУ; и ίίί) коровый антиген НВУ имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка НВУ;
где композиция индуцирует НВУ-специфический иммунный ответ.
7. Иммунотерапевтическая композиция по п.1 или 6, где аминокислотная последовательность Хантигена НВУ выбрана из положений 1-60 последовательности 8Е0 ГО N0: 130, положений 630-689 последовательности 8Е0 ГО N0: 110, положений 582-641 последовательности 8Е0 ГО N0: 122, положений 630-689 последовательности 8Е0 ГО N0: 109, положений 630-689 последовательности 8Е0 ГО N0: 108, положений 630-689 последовательности 8Е0 ГО N0: 107, 8Е0 ГО N0: 100 или соответствующей последовательности другого штамма НВУ.
8. Иммунотерапевтическая композиция по п.1 или 6, где аминокислотная последовательность поверхностного антигена НВУ выбрана из положений 63-461 последовательности 8Е0 ГО N0: 130, положений 1-399 последовательности 8Е0 ГО N0: 118, положений 1-399 последовательности 8Е0 ГО N0: 122, положений 9-407 последовательности 8Е0 ГО N0: 34, положений 1-399 последовательности 8Е0 ГО N0: 112, положений 1-399 последовательности 8Е0 ГО N0: 114, положений 1-399 последовательности 8Е0 ГО N0: 116 или соответствующей последовательности другого штамма НВУ.
9. Иммунотерапевтическая композиция по п.1 или 6, где аминокислотная последовательность корового антигена НВУ выбрана из положений 462-643 последовательности 8Е0 ГО N0: 130, положений 400-581 последовательности 8Е0 ГО N0: 118, положений 400-581 последовательности 8Е0 ГО N0: 122, положений 408-589 последовательности 8Е0 ГО N0: 34, положений 400-581 последовательности 8Е0 ГО N0: 116, положений 400-581 последовательности 8Е0 ГО N0: 112, положений 400-581 последовательности 8Е0 ГО N0: 114 или соответствующей последовательности из другого штамма НВУ.
10. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-9, содержащая:
a) дрожжевой носитель и
b) слитый белок, содержащий антигены НВУ, где антигены НВУ состоят из:
ί) Х-антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность от положения 1 до 60 последовательности 8Е0 ГО N0: 130;
ίί) поверхностного антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность от положения 63 до 461 последовательности 8Е0 ГО N0: 130; и ίίί) корового антигена НВУ, имеющего аминокислотную последовательность от положения 462 до 643 последовательности 8Е0 ГО N0: 130.
11. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-10, где слитый белок содержит N концевую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 37.
12. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-11, где антигены НВУ расположены в следующем порядке от N к С-концу в слитом белке: Х-антиген НВУ, поверхностный антиген НВУ, коровый антиген НВУ.
13. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-11, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ГО N0: 130, 8Е0 ГО N0: 150 или 8Е0 ГО N0: 122.
- 118 028659
14. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп. 1-11, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ΙΌ N0: 130, δΕΟ ΙΟ N0: 150 или δΕΟ ГО N0: 122.
15. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-11, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ГО N0: 130, δΕΟ ГО N0: 150 или δΕΟ ГО N0: 122.
16. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-11, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из δΕΟ ГО N0: 130, δΕΟ ГО N0: 150 или δΕΟ ГО N0: 122.
17. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-11, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из δΕΟ ГО N0: 130, δΕΟ ГО N0: 150 или δΕΟ ГО N0: 122.
18. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-17, где слитый белок экспрессируется дрожжевым носителем.
19. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-18, где дрожжевой носитель представляет собой целые дрожжи.
20. Иммунотерапевтическая композиция по п.19, где целые дрожжи являются убитыми.
21. Иммунотерапевтическая композиция по п.19, где целые дрожжи инактивированы нагреванием.
22. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-21, где дрожжевой носитель происходит из δассЬа^οтусе8 сегегыае.
23. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-22, где композиция содержит более 90% дрожжевого белка и составлена для введения путем инъекции пациенту.
24. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, содержащая:
a) целые инактивированные нагреванием дрожжи δассЬа^οтусе8 сегегыае и
b) слитый белок ΗΒν, экспрессируемый дрожжами, где слитый белок содержит δΕΟ ГО N0: 130 или δΕΟ ГО N0: 150.
25. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-4 и 6, где по меньшей мере один антиген ΗΒν содержит эпитоп Т-клетки.
26. Слитый белок, содержащий антигены ΗΒν, как определено в п.1, где антигены ΗΒν состоят из ί) Х-антигена ΗΒν;
ίί) поверхностного антигена ΗΒν и ίίί) корового антигена ΗΒν;
и где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ГО N0: 130 или δΕΟ ГО N0: 150.
27. Слитый белок по п.26, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ГО N0: 130 или δΕΟ ГО N0: 150.
28. Слитый белок по п.26, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ГО N0: 130 или δΕΟ ГО N0: 150.
29. Слитый белок по п.26, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности: δΕΟ ΙΌ N0: 130 или δΕΟ ГО N0: 150.
30. Слитый белок по п.26, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность δΕΟ ГО N0: 130 или δΕΟ ГО N0: 150.
31. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по п.29 или 30, имеющая последовательность δΕΟ ГО N0: 129.
32. Выделенная клетка, трансфицированная рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты по
п.31.
33. Выделенная клетка, трансфицированная рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок по любому из пп.26-30, где клетка представляет собой дрожжевую клетку.
34. Композиция, содержащая слитый белок по любому из пп.26-30.
35. Композиция, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п.31.
36. Композиция, содержащая выделенную клетку по п.32 или 33.
37. Применение композиции по любому из пп.1-24 или 34-36 для получения лекарственного средства для лечения инфекции ΗΒν или его симптома.
38. Применение по п.37, где композицию вводят индивиду в дозе от 0,1 до 100 Д.Е.
39. Применение по п.37, где композицию вводят индивиду в дозе от 2 до 80 Д. Е.
40. Применение по п.37, где композицию вводят индивиду в дозе от 2, 10, 40 или 80 Д.Е.
41. Применение по любому из пп.37-40, где композицию вводят индивиду еженедельно.
42. Применение по любому из пп.37-40, где композицию вводят индивиду два раза в неделю.
43. Применение по любому из пп.37-40, где композицию вводят индивиду три раза в неделю.
44. Применение по любому из пп.37-40, где композицию вводят индивиду ежемесячно.
- 119 028659
45. Применение по любому из пп.37-40, где композицию вводят индивиду больше чем в две области индивидуума в ходе одного периода дозирования.
46. Применение по любому из пп.37-45, где введение композиции индивидууму приводит к сероконверсии у индивидуума.
47. Применение по любому из пп.37-43, где введение композиции индивидууму снижает вирусную нагрузку НВУ у индивидуума.
48. Применение по п.37, где введение композиции индивидууму снижает повреждение печени у индивидуума.
49. Применение композиции по любому из пп.1-24 или 34-36 для получения лекарственного средства для профилактики инфекции НВУ или ее симптома.
50. Применение композиции по любому из пп.1-24, 34-36 для получения лекарственного средства для иммунизации группы индивидуумов против НВУ.
51. Применение по пп.37-48, дополнительно включающее введение индивидууму одного или нескольких дополнительных соединений, подходящих для лечения или смягчения симптома инфекции НВУ.
52. Применение по п.51, где одно или несколько соединений представляет собой противовирусное соединение.
53. Применение по п.52, где противовирусное соединение представляет собой ингибитор обратной транскриптазы на основе нуклеотидного аналога.
54. Применение по п.52, где противовирусное соединение выбрано из группы, состоящей из тенофовира, ламивудина, адефовира, телбивудина, энтекавира и их комбинаций.
55. Применение по п.52, где противовирусное соединение включает тенофовир.
56. Применение по п.52, где противовирусное соединение представляет собой тенофовир дизопроксил фумарат (ТОР).
57. Применение иммунотерапевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения хронической инфекции, вызванной вирусом гепатита В (НВУ), где композиция содержит:
a) целые инактивированные нагревом дрожжи 8ассйатотусе8 сегеу!81ае и
b) слитый белок, который экспрессируется дрожжами, где слитый белок содержит антигены, как определено в п.1, причем антигены НВУ состоят из:
ί) Х-антигена НВУ;
ίί) поверхностного антигена НВУ и ίίί) корового антигена НВУ;
и где слитый белок содержит последовательность 8ЕР ГО N0: 130.
58. Применение по п.57, где слитый белок содержит 8ЕР ГО N0: 150.
1374 1 623 1 838 2452
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161442204P | 2011-02-12 | 2011-02-12 | |
US61/442,204 | 2011-02-12 | ||
US201161496945P | 2011-06-14 | 2011-06-14 | |
US61/496,945 | 2011-06-14 | ||
US201161507361P | 2011-07-13 | 2011-07-13 | |
US61/507,361 | 2011-07-13 | ||
PCT/US2012/024409 WO2012109404A1 (en) | 2011-02-12 | 2012-02-09 | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201391170A1 EA201391170A1 (ru) | 2014-02-28 |
EA028659B1 true EA028659B1 (ru) | 2017-12-29 |
Family
ID=46638950
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201391170A EA028659B1 (ru) | 2011-02-12 | 2012-02-09 | Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US8877205B2 (ru) |
EP (2) | EP3266464A3 (ru) |
JP (4) | JP5745102B2 (ru) |
KR (1) | KR102026840B1 (ru) |
CN (1) | CN103476426B (ru) |
AP (1) | AP2013007110A0 (ru) |
AU (2) | AU2012214394B2 (ru) |
BR (1) | BR112013020425A2 (ru) |
CA (1) | CA2827150C (ru) |
CL (1) | CL2013002334A1 (ru) |
CO (1) | CO6791572A2 (ru) |
CR (1) | CR20130424A (ru) |
EA (1) | EA028659B1 (ru) |
EC (1) | ECSP13012862A (ru) |
ES (1) | ES2643389T3 (ru) |
HK (1) | HK1248120A1 (ru) |
IL (1) | IL227900B (ru) |
MA (1) | MA34956B1 (ru) |
PE (1) | PE20140844A1 (ru) |
PH (1) | PH12013501683A1 (ru) |
SG (1) | SG192285A1 (ru) |
TW (1) | TWI504608B (ru) |
UA (1) | UA112859C2 (ru) |
WO (1) | WO2012109404A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201306481B (ru) |
Families Citing this family (84)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2696551T3 (es) | 2010-12-17 | 2019-01-16 | Globeimmune Inc | Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano |
US9238679B2 (en) | 2011-02-11 | 2016-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennslyvania | Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same |
WO2012109668A1 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecule encoding hepatitis b virus core protein and vaccine comprising the same |
PH12013501683A1 (en) | 2011-02-12 | 2019-07-17 | Globeimmune Inc | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection |
PL2685995T3 (pl) | 2011-03-17 | 2017-10-31 | Globeimmune Inc | Kompozycje immunoterapeutyczne drożdże-Brachyury |
AU2012271625B2 (en) | 2011-06-14 | 2017-05-18 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection |
KR102049928B1 (ko) | 2011-08-17 | 2019-11-28 | 글로브이뮨 | 효모-muc1 면역요법 조성물 및 그 용도 |
EP2864792A1 (en) | 2012-06-26 | 2015-04-29 | Biodesix, Inc. | Mass-spectral method for selection, and de-selection, of cancer patients for treatment with immune response generating therapies |
US10507235B2 (en) | 2013-03-19 | 2019-12-17 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based immunotherapy for Chordoma |
WO2014160747A2 (en) | 2013-03-26 | 2014-10-02 | Globeimmune, Inc. | Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection |
TWI654200B (zh) | 2013-08-30 | 2019-03-21 | 環球免疫公司 | 治療或預防結核病的組合物及方法 |
KR102409372B1 (ko) * | 2014-04-11 | 2022-06-16 | 글로브이뮨 | 효모 면역 요법 및 타입 i 인터페론 감도 |
EP3225628A4 (en) * | 2014-11-28 | 2018-03-14 | Celltrion Inc. | Epitope of hepatitis b virus surface antigen and binding molecule specifically binding to same for neutralizing hepatitis b virus |
WO2016112188A1 (en) | 2015-01-09 | 2016-07-14 | Etubics Corporation | Methods and compositions for ebola virus vaccination |
MD3097102T2 (ro) | 2015-03-04 | 2018-02-28 | Gilead Sciences Inc | Compuşi de 4,6-diamino-pirido[3,2-D]pirimidină modulatori ai receptorilor de tip Toll |
EP3331552B1 (en) | 2015-08-03 | 2021-01-27 | Globeimmune, Inc. | Modified yeast-brachyury immunotherapeutic compositions |
US20210292327A1 (en) | 2015-08-26 | 2021-09-23 | Gilead Sciences, Inc. | Deuterated toll-like receptor modulators |
EP3371316B1 (en) * | 2015-11-04 | 2022-10-19 | Hookipa Biotech GmbH | Vaccines against hepatitis b virus |
DK3402888T3 (da) * | 2016-01-12 | 2020-11-30 | Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh | Middel og fremgangsmåder til behandling af hbv |
BR102017010009A2 (pt) | 2016-05-27 | 2017-12-12 | Gilead Sciences, Inc. | Compounds for the treatment of hepatitis b virus infection |
EP3276006A1 (en) * | 2016-07-27 | 2018-01-31 | Theravectys | Lentiviral vectors for expression of hepatitis b virus (hbv) antigens |
WO2018045150A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Gilead Sciences, Inc. | 4,6-diamino-pyrido[3,2-d]pyrimidine derivaties as toll like receptor modulators |
KR102268448B1 (ko) | 2016-09-02 | 2021-06-22 | 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 | 톨 유사 수용체 조정제 화합물 |
CN106421774B (zh) * | 2016-09-08 | 2019-05-28 | 中国科学院生物物理研究所 | PreS1用于制备乙肝疫苗以及治疗慢性乙型肝炎的用途 |
MA46535A (fr) | 2016-10-14 | 2019-08-21 | Prec Biosciences Inc | Méganucléases modifiées spécifiques de séquences de reconnaissance dans le génome du virus de l'hépatite b |
TWI820984B (zh) | 2017-01-31 | 2023-11-01 | 美商基利科學股份有限公司 | 替諾福韋埃拉酚胺(tenofovir alafenamide)之晶型 |
JOP20180008A1 (ar) | 2017-02-02 | 2019-01-30 | Gilead Sciences Inc | مركبات لعلاج إصابة بعدوى فيروس الالتهاب الكبدي b |
GB201705765D0 (en) * | 2017-04-10 | 2017-05-24 | Univ Oxford Innovation Ltd | HBV vaccine |
JOP20180040A1 (ar) | 2017-04-20 | 2019-01-30 | Gilead Sciences Inc | مثبطات pd-1/pd-l1 |
US11471527B2 (en) | 2017-06-05 | 2022-10-18 | Beacle Inc. | Virus-like particles including HBs-L antigen protein for causing immune response against HBV |
CA3073376C (en) | 2017-08-22 | 2022-07-12 | Gilead Sciences, Inc. | Therapeutic heterocyclic compounds |
EP4272833A3 (en) * | 2017-12-19 | 2024-01-10 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis b virus (hbv) vaccines and uses thereof |
US11020476B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-06-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV) |
MA51292A (fr) * | 2017-12-19 | 2020-10-28 | Ichor Medical Systems Inc | Méthodes et appareil pour l'administration de vaccins contre le virus de l'hépatite b (vhb) |
EA202091517A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-11-03 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv) |
US11021692B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-06-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof |
CA3084569A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. | 3'3' cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein |
JP7098748B2 (ja) | 2017-12-20 | 2022-07-11 | インスティチュート オブ オーガニック ケミストリー アンド バイオケミストリー エーエスシーアール,ヴイ.ヴイ.アイ. | Stingアダプタータンパク質を活性化するホスホン酸結合を有する2’3’環状ジヌクレオチド |
IL300572A (en) | 2018-02-13 | 2023-04-01 | Gilead Sciences Inc | PD–1/PD–L1 inhibitors |
WO2019165374A1 (en) | 2018-02-26 | 2019-08-29 | Gilead Sciences, Inc. | Substituted pyrrolizine compounds as hbv replication inhibitors |
EP3762010A4 (en) * | 2018-03-06 | 2022-04-06 | Precigen, Inc. | HEPATITIS B VACCINES AND USES THEREOF |
US10870691B2 (en) | 2018-04-05 | 2020-12-22 | Gilead Sciences, Inc. | Antibodies and fragments thereof that bind hepatitis B virus protein X |
TWI833744B (zh) | 2018-04-06 | 2024-03-01 | 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 | 3'3'-環二核苷酸 |
TW202005654A (zh) | 2018-04-06 | 2020-02-01 | 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 | 2,2,─環二核苷酸 |
TWI818007B (zh) | 2018-04-06 | 2023-10-11 | 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 | 2'3'-環二核苷酸 |
US11142750B2 (en) | 2018-04-12 | 2021-10-12 | Precision Biosciences, Inc. | Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the Hepatitis B virus genome |
WO2019204609A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Gilead Sciences, Inc. | Pd-1/pd-l1 inhibitors |
TW202014193A (zh) | 2018-05-03 | 2020-04-16 | 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 | 包含碳環核苷酸之2’3’-環二核苷酸 |
US12128078B2 (en) | 2018-05-15 | 2024-10-29 | Globeimmune, Inc. | Lysates of recombinant yeast for inducing cellular immune responses |
US11186579B2 (en) | 2018-07-06 | 2021-11-30 | Gilead Sciences, Inc. | Therapeutic heterocyclic compounds |
US11098027B2 (en) | 2018-07-06 | 2021-08-24 | Gilead Sciences, Inc. | Therapeutic heterocyclic compounds |
SI3820572T1 (sl) | 2018-07-13 | 2023-12-29 | Gilead Sciences, Inc. | Inhibitorji pd-1/pd-l1 |
WO2020028097A1 (en) | 2018-08-01 | 2020-02-06 | Gilead Sciences, Inc. | Solid forms of (r)-11-(methoxymethyl)-12-(3-methoxypropoxy)-3,3-dimethyl-8-0x0-2,3,8,13b-tetrahydro-1h-pyrido[2,1-a]pyrrolo[1,2-c] phthalazine-7-c arboxylic acid |
WO2020086556A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-30 | Gilead Sciences, Inc. | Pd-1/pd-l1 inhibitors |
CA3116347A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Gilead Sciences, Inc. | Substituted 6-azabenzimidazole compounds having hpk1 inhibitory activity |
IL282535B2 (en) | 2018-10-31 | 2024-05-01 | Gilead Sciences Inc | Transformed 6-azabanzimidazole compounds as HPK1 inhibitors |
WO2020178768A1 (en) | 2019-03-07 | 2020-09-10 | Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. | 3'3'-cyclic dinucleotide analogue comprising a cyclopentanyl modified nucleotide as sting modulator |
CA3129011C (en) | 2019-03-07 | 2023-12-19 | Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. | 3'3'-cyclic dinucleotides and prodrugs thereof |
DK3934757T3 (da) | 2019-03-07 | 2023-04-17 | Inst Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr V V I | 2'3'-cykliske dinukleotider og prodrugs deraf |
TW202210480A (zh) | 2019-04-17 | 2022-03-16 | 美商基利科學股份有限公司 | 類鐸受體調節劑之固體形式 |
TWI751517B (zh) | 2019-04-17 | 2022-01-01 | 美商基利科學股份有限公司 | 類鐸受體調節劑之固體形式 |
US11453681B2 (en) | 2019-05-23 | 2022-09-27 | Gilead Sciences, Inc. | Substituted eneoxindoles and uses thereof |
WO2020254876A1 (en) * | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Virus-like particle delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines |
US20220305115A1 (en) | 2019-06-18 | 2022-09-29 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pyridopyrimidine derivatives |
EP3990476A1 (en) | 2019-06-25 | 2022-05-04 | Gilead Sciences, Inc. | Flt3l-fc fusion proteins and methods of use |
WO2021011891A1 (en) | 2019-07-18 | 2021-01-21 | Gilead Sciences, Inc. | Long-acting formulations of tenofovir alafenamide |
US20220296619A1 (en) | 2019-08-19 | 2022-09-22 | Gilead Sciences, Inc. | Pharmaceutical formulations of tenofovir alafenamide |
JP7494199B2 (ja) * | 2019-09-27 | 2024-06-03 | 富士レビオ株式会社 | B型肝炎ウイルスコア関連抗原のイムノアッセイ及びそのためのキット |
PL4037708T3 (pl) | 2019-09-30 | 2025-02-03 | Gilead Sciences, Inc. | Szczepionki przeciwko hbv i sposoby leczenia hbv |
WO2021113765A1 (en) | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Precision Biosciences, Inc. | Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hepatitis b virus genome |
EP4087605A1 (en) * | 2020-01-09 | 2022-11-16 | Virion Therapeutics, LLC | Adenoviral vectors encoding hepatitis b viral antigens fused to herpes virus glycoprotein d and methods of using the same |
US20210284716A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Immunitybio, Inc. | ACE2-Fc Trap |
US11857620B2 (en) | 2020-03-11 | 2024-01-02 | Immunitybio, Inc. | Method of inducing immunity against SARS-CoV-2 using spike (s) and nucleocapsid (N)-ETSD immunogens delivered by a replication-defective adenovirus |
KR20220156884A (ko) | 2020-03-20 | 2022-11-28 | 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 | 4'-c-치환된-2-할로-2'-데옥시아데노신 뉴클레오시드의 프로드러그 및 이의 제조 및 사용 방법 |
WO2022006146A1 (en) * | 2020-06-29 | 2022-01-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Yeast-based vaccines |
CR20230071A (es) | 2020-08-07 | 2023-04-11 | Gilead Sciences Inc | Profármacos de análogos de nucleótidos de fosfonamida y su uso farmacéutico |
TW202406932A (zh) | 2020-10-22 | 2024-02-16 | 美商基利科學股份有限公司 | 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法 |
JP2024518558A (ja) | 2021-05-13 | 2024-05-01 | ギリアード サイエンシーズ, インコーポレイテッド | TLR8調節化合物と抗HBV siRNA治療薬との組合せ |
WO2022271650A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Gilead Sciences, Inc. | Diacylglyercol kinase modulating compounds |
CA3222439A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Gilead Sciences, Inc. | Diacylglyercol kinase modulating compounds |
CA3220923A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Gilead Sciences, Inc. | Diacylglyercol kinase modulating compounds |
EP4359415A1 (en) | 2021-06-23 | 2024-05-01 | Gilead Sciences, Inc. | Diacylglyercol kinase modulating compounds |
WO2023085956A1 (en) * | 2021-11-09 | 2023-05-19 | Avalia Immunotherapies Limited | Novel therapeutic vaccines |
WO2024220982A1 (en) * | 2023-04-21 | 2024-10-24 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Compositions comprising aptamers and methods of modulating the immune response using the same |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5164485A (en) * | 1985-08-20 | 1992-11-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof |
EP1054689B1 (en) * | 1998-02-12 | 2003-09-10 | Immune Complex, Corporation | Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives |
US20070054262A1 (en) * | 2003-03-28 | 2007-03-08 | Baker Denise M | Methods of identifying optimal variants of peptide epitopes |
WO2008093976A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Dobeel Co., Ltd. | An hbv vaccine and a process of preparing the same |
AU2004269882B2 (en) * | 2003-08-29 | 2010-02-18 | Rhein Biotech Gesellschaft Fur Neue Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh | Composition for the prophylaxis/treatment of HBV infections and HBV-mediated diseases |
US7744898B2 (en) * | 1991-08-26 | 2010-06-29 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
WO2011115914A1 (en) * | 2010-03-14 | 2011-09-22 | Globeimmune, Inc. | Pharmacogenomic and response-guided treatment of infectious disease using yeast-based immunotherapy |
Family Cites Families (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2486400B1 (fr) | 1980-07-09 | 1986-05-30 | Univablot | Medicaments a base de levures ou de leurs extraits insolubles |
NZ199722A (en) | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
US4775622A (en) | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
US5310654A (en) | 1985-07-31 | 1994-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for determining virulence of Yersinia |
US5234830A (en) | 1988-02-03 | 1993-08-10 | Suntory Limited | DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region |
US6306625B1 (en) * | 1988-12-30 | 2001-10-23 | Smithkline Beecham Biologicals, Sa | Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast |
IL95019A0 (en) | 1989-08-09 | 1991-06-10 | Mycogen Corp | Process for encapsulation of biologicals |
AU5679394A (en) * | 1992-11-25 | 1994-06-22 | International Biotechnology Laboratories, Inc. | Hepatitis b virus vaccines |
US5830463A (en) | 1993-07-07 | 1998-11-03 | University Technology Corporation | Yeast-based delivery vehicles |
US5413914A (en) | 1993-07-07 | 1995-05-09 | The Regents Of The University Of Colorado | Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases |
US5858378A (en) | 1996-05-02 | 1999-01-12 | Galagen, Inc. | Pharmaceutical composition comprising cryptosporidium parvum oocysts antigen and whole cell candida species antigen |
JP3713900B2 (ja) | 1996-07-19 | 2005-11-09 | ソニー株式会社 | 負極材料及びこれを用いた非水電解液二次電池 |
AU2358201A (en) * | 1999-12-03 | 2001-06-12 | Innogenetics N.V. | New hbv sequences |
GB0216074D0 (en) * | 2002-07-11 | 2002-08-21 | Weatherford Lamb | Improving collapse resistance of tubing |
US20020044948A1 (en) | 2000-03-15 | 2002-04-18 | Samir Khleif | Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens |
US8153414B2 (en) | 2000-04-06 | 2012-04-10 | Allertein Therapeutics, Llc | Microbial delivery system |
WO2002039951A2 (en) | 2000-11-15 | 2002-05-23 | Globe Immune, Inc. | Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof |
CN1171636C (zh) * | 2001-06-06 | 2004-10-20 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种乙型肝炎dna疫苗 |
US8029803B2 (en) * | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8343502B2 (en) | 2002-12-16 | 2013-01-01 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based vaccines as immunotherapy |
US7439042B2 (en) | 2002-12-16 | 2008-10-21 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection |
KR101164509B1 (ko) | 2002-12-16 | 2012-07-10 | 글로브이뮨 | 면역 요법으로서의 효모계 백신 |
CA2584562A1 (en) | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis c infection |
WO2007008780A2 (en) | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Globeimmune, Inc. | Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies |
US20070172503A1 (en) | 2005-12-13 | 2007-07-26 | Mycologics,Inc. | Compositions and Methods to Elicit Immune Responses Against Pathogenic Organisms Using Yeast Based Vaccines |
CN104826102A (zh) | 2006-02-02 | 2015-08-12 | 全球免疫股份有限公司 | 用于诱导免疫应答的基于酵母的疫苗 |
CN101448848B (zh) | 2006-03-27 | 2013-12-04 | 全球免疫股份有限公司 | Ras突变及其相关组合物和方法 |
BRPI0807828B8 (pt) | 2007-02-02 | 2021-05-25 | Globeimmune Inc | composição compreendendo leveduras e usos das mesmas, bem como método para o crescimento de leveduras e kit para o cultivo de leveduras |
CN101036784B (zh) | 2007-03-09 | 2010-11-10 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种乙型肝炎治疗性细胞毒性t细胞表位疫苗及其制备方法 |
CN101730542A (zh) | 2007-03-19 | 2010-06-09 | 环球免疫公司 | 用于靶向消除癌症靶向疗法的突变逃逸的组合物和方法 |
EP2331125A4 (en) | 2008-09-19 | 2013-03-27 | Globeimmune Inc | IMMUNOTHERAPY FOR CHRONIC HEPATITIS C-VIRUS INFECTIONS |
WO2010065626A1 (en) | 2008-12-02 | 2010-06-10 | Globeimmune, Inc. | Genotyping tools, methods and kits |
AU2010236206B2 (en) | 2009-04-17 | 2016-10-20 | Globeimmune, Inc. | Combination immunotherapy compositions against cancer and methods |
CA2774326C (en) | 2009-09-14 | 2023-11-07 | Donald Bellgrau | Modulation of yeast-based immunotherapy products and responses |
WO2012019127A2 (en) | 2010-08-05 | 2012-02-09 | The Regents Of The University Of Colorado | Combination yeast-based immunotherapy and arginine therapy for the treatment of myeloid-derived supressor cell-associated diseases |
ES2696551T3 (es) | 2010-12-17 | 2019-01-16 | Globeimmune Inc | Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano |
PH12013501683A1 (en) | 2011-02-12 | 2019-07-17 | Globeimmune Inc | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection |
PL2685995T3 (pl) | 2011-03-17 | 2017-10-31 | Globeimmune Inc | Kompozycje immunoterapeutyczne drożdże-Brachyury |
AU2012271625B2 (en) | 2011-06-14 | 2017-05-18 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection |
KR102049928B1 (ko) | 2011-08-17 | 2019-11-28 | 글로브이뮨 | 효모-muc1 면역요법 조성물 및 그 용도 |
-
2012
- 2012-02-09 PH PH1/2013/501683A patent/PH12013501683A1/en unknown
- 2012-02-09 KR KR1020137024018A patent/KR102026840B1/ko active IP Right Grant
- 2012-02-09 WO PCT/US2012/024409 patent/WO2012109404A1/en active Application Filing
- 2012-02-09 PE PE2013001865A patent/PE20140844A1/es not_active Application Discontinuation
- 2012-02-09 EP EP17175311.4A patent/EP3266464A3/en not_active Withdrawn
- 2012-02-09 EA EA201391170A patent/EA028659B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-02-09 CN CN201280018222.5A patent/CN103476426B/zh active Active
- 2012-02-09 ES ES12744328.1T patent/ES2643389T3/es active Active
- 2012-02-09 SG SG2013060777A patent/SG192285A1/en unknown
- 2012-02-09 JP JP2013553534A patent/JP5745102B2/ja active Active
- 2012-02-09 BR BR112013020425A patent/BR112013020425A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-02-09 AU AU2012214394A patent/AU2012214394B2/en active Active
- 2012-02-09 CA CA2827150A patent/CA2827150C/en active Active
- 2012-02-09 US US13/984,888 patent/US8877205B2/en active Active
- 2012-02-09 MA MA36222A patent/MA34956B1/fr unknown
- 2012-02-09 EP EP12744328.1A patent/EP2672991B1/en active Active
- 2012-02-09 AP AP2013007110A patent/AP2013007110A0/xx unknown
- 2012-02-10 TW TW101104436A patent/TWI504608B/zh active
- 2012-09-02 UA UAA201310911A patent/UA112859C2/uk unknown
-
2013
- 2013-03-13 US US13/798,837 patent/US8722054B2/en active Active
- 2013-08-12 CL CL2013002334A patent/CL2013002334A1/es unknown
- 2013-08-28 ZA ZA2013/06481A patent/ZA201306481B/en unknown
- 2013-08-30 EC ECSP13012862 patent/ECSP13012862A/es unknown
- 2013-08-31 CR CR20130424A patent/CR20130424A/es unknown
- 2013-09-12 CO CO13216900A patent/CO6791572A2/es unknown
- 2013-09-29 IL IL227900A patent/IL227900B/en active IP Right Grant
-
2014
- 2014-02-19 US US14/184,481 patent/US8961988B2/en active Active
- 2014-09-23 US US14/494,235 patent/US9290547B2/en active Active
-
2015
- 2015-01-07 US US14/591,592 patent/US9428556B2/en active Active
- 2015-02-12 JP JP2015025534A patent/JP5911983B2/ja active Active
-
2016
- 2016-03-30 JP JP2016068623A patent/JP6109989B2/ja active Active
- 2016-07-18 US US15/212,930 patent/US9943591B2/en active Active
- 2016-11-10 AU AU2016256751A patent/AU2016256751B2/en active Active
-
2017
- 2017-03-08 JP JP2017043689A patent/JP2017105834A/ja active Pending
-
2018
- 2018-03-01 US US15/909,112 patent/US10441650B2/en active Active
- 2018-06-13 HK HK18107680.0A patent/HK1248120A1/zh unknown
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5164485A (en) * | 1985-08-20 | 1992-11-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof |
US7744898B2 (en) * | 1991-08-26 | 2010-06-29 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
EP1054689B1 (en) * | 1998-02-12 | 2003-09-10 | Immune Complex, Corporation | Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives |
US20070054262A1 (en) * | 2003-03-28 | 2007-03-08 | Baker Denise M | Methods of identifying optimal variants of peptide epitopes |
AU2004269882B2 (en) * | 2003-08-29 | 2010-02-18 | Rhein Biotech Gesellschaft Fur Neue Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh | Composition for the prophylaxis/treatment of HBV infections and HBV-mediated diseases |
WO2008093976A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Dobeel Co., Ltd. | An hbv vaccine and a process of preparing the same |
WO2011115914A1 (en) * | 2010-03-14 | 2011-09-22 | Globeimmune, Inc. | Pharmacogenomic and response-guided treatment of infectious disease using yeast-based immunotherapy |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BIAN, G. et al., "Whole recombinant Hansenula polymorpha expressing hepatitis B virus surface antigen (yeast-HBsAg) induces potent HBsAg-specific Th1 and Th2 immune responses". Vaccine. 2010. 28: 187-194. See pages 187-192 * |
GENBANK Accession No. ACN64477 12 January 2009. Sequence shares 95.52% identity with SEQ ID NO: 40 * |
SCHREUDER, M.P. et al., "Yeast expressing hepatitis B virus surface antigen determinants on its surface: implications for a possible oral vaccine". Vaccine 1996. 14(5):383-8. See pages 384-385, 387 * |
SHIOSAKI, K. et al., "Production of hepatitis B virion-like particles in yeast". Gene. 1991. 106: 143-149. See abstract, page 144 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA028659B1 (ru) | Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b | |
US9987352B2 (en) | Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection | |
NZ614733B2 (en) | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection | |
OA16792A (en) | Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection. | |
NZ619761B2 (en) | Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |