[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

EA004685B1 - Конъюгаты гксф - Google Patents

Конъюгаты гксф Download PDF

Info

Publication number
EA004685B1
EA004685B1 EA200100838A EA200100838A EA004685B1 EA 004685 B1 EA004685 B1 EA 004685B1 EA 200100838 A EA200100838 A EA 200100838A EA 200100838 A EA200100838 A EA 200100838A EA 004685 B1 EA004685 B1 EA 004685B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
conjugate
conjugates
peg
integer
csf
Prior art date
Application number
EA200100838A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200100838A1 (ru
Inventor
Паскаль Себастьян Байон
Original Assignee
Эмджен Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эмджен Инк. filed Critical Эмджен Инк.
Publication of EA200100838A1 publication Critical patent/EA200100838A1/ru
Publication of EA004685B1 publication Critical patent/EA004685B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

Описаны физиологически активные конъюгаты ПЭГ-ГКСФ, имеющие формулу (I), а также композиции, содержащие смесь конъюгатов, где в каждом конъюгате данной композиции m и n могут представлять различные целые числа.

Description

Предпосылки создания изобретения
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ) представляет собой фармацевтически активный белок, который регулирует пролиферацию, дифференцировку и функциональную активацию нейтрофильных гранулоцитов (Ме!са1£, Β1οοά 6:257 (1986); Уай е! а1., Β1οοά 84(3): 795-799 (1994); Веикшдег е! а1., Βίοοά 81(11): 3158-3163 (1993); Ροΐ^ήκ е! а1., Ехр!'1 НетаФФду 22:1156-1163 (1994); ЫеИеи е! а1. Βίοοά 81(7): 1960-1967 (1993)). ГКСФ может стимулировать мобилизацию стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга и используется для лечения пациентов, у которых наблюдается недостаток гранулоцитов после химиотерапии, или для предварительной подготовки пациентов к трансплантации костного мозга.
В патенте США № 5214132 описан мутеин человеческого ГКСФ, который отличается от нативного чГКСФ в положениях 1, 3, 4, 5 и 17, где вместо аминокислот нативного ГКСФ этот мутеин имеет А1а, Т1п. Туг, Агд и 8ег, соответственно (см. также Кида е! а1., ΒίοΟκιη. Βίορίκκ. Рек. ^ттни. 159:103-111 (1989)). М. ОкаЬе е! а1. (Βίοοά 75(9): 1788-1793 (1 мая 1990)) описывают производное рчГКСФ, в котором осуществлена замена аминокислот в пяти положениях Ν-концевой области рчГКСФ, в результате чего это производное обнаруживало более высокую специфическую активность, чем интактный рчГКСФ, в двух анализах, проведенных на мышиных и/или человеческих клеткахпредшественниках костного мозга. В патенте США № 5218092 описан мутеин человеческого ГКСФ, который отличается от нативного чГКСФ тем, что в положениях 1, 3, 4, 5, 17, 145 и 147, вместо аминокислот нативного ГКСФ, этот мутеин имеет А1а, Тйг, Туг, Агд, 8ег, Аки и 8ег, соответственно. Содержание патентов США № 5214132 и 5218092 включено в настоящее описание посредством ссылки.
Биологическая доступность белковых терапевтических средств, таких как ГКСФ, часто ограничена коротким периодом полужизни в плазме и восприимчивостью к деградации под действием протеазы, что препятствует его максимальному клиническому использованию. Исследования других терапевтических белков показали, что эти проблемы могут быть решены путем конъюгации указанного белка с полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), обычно посредством присоединения части, ковалентно связанной как с белком, так и ПЭГ.
Было показано, что такие конъюгированные с ПЭГ биомолекулы обладают клинически полезными свойствами (Iηаάа е! а1., 1. ΒίοηΠ. ηηά СотрацЫе Ρο1уте^к, 5:343 (1990); Эе^^ е! а1., СгИ1са1 Ре\зе\\ъ ίη Тйегареийс Эгид Сатег 8ук!етк, 9:249 (1992); и Ка!ге, Аάνаηсеά Эгид ЭеИуегу 8ук!етк, 10:91 (1993)). Среди них имеются биомолекулы, которые обладают более высокой физической стабильностью и термостабильностью, невосприимчивостью к ферментативной деградации, повышенной растворимостью, более продолжительными временем полужизни ίη νίνο в кровотоке и меньшей скоростью выведения, пониженной иммуногенностью и антигенностью и меньшей токсичностью.
Конъюгаты ПЭГ-ГКСФ, имеющие структуры, отличающиеся от конъюгата настоящего изобретения, описаны в публикации европейской патентной заявки № ЕР 0335423; в публикации европейской патентной заявки ЕР № 0401384; Р.У. Ν^η е! а1., 1. Сртгоиеб Ре1еаке 32: 177-189 (1994); и 8а1аке-1кЫка^а е! а1., Се11 8!гис!ше ηηά Рипс!юп, 17:157-160 (1992)).
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новому классу ПЭГ-производных ГКСФ. Конъюгат настоящего изобретения имеет амидный линкер, как будет описано ниже.
По сравнению с немодифицированным ГКСФ (то есть, ГКСФ без присоединенного ПЭГ), этот конъгогат обладает более продолжительными временем полужизни в кровотоке и присутствия в плазме, пониженным уровнем выведения и повышенной гранулопоэтической активностью ίη νίνο. Кроме того, по сравнению с конъюгатами ПЭГ-ГКСФ, конъюгат настоящего изобретения обладает лучшими гранулопоэтическими свойствами. Другие конъюгаты ПЭГ -ГКСФ описаны в публикации европейской патентной заявки № ЕР 0335423; в публикации европейской патентной заявки № ЕР 0401384; Р.У. ΝίνΌη е! а1., там же. Однако, конъюгат настоящего изобретения имеет структуру, отличающуюся от структуры этих конъюгатов, обладает лучшими свойствами, а в частности, обнаруживают продолжительную высокую гранулопоэтическую активность ίη νίνο при низких дозах.
Предпочтительным ГКСФ настоящего изобретения является мутеин ГКСФ, который обладает свойствами, эквивалентными или превосходящими свойства нативного ГКСФ, и имеет то же самое применение, что и ГКСФ. Этот мутеин имеет ту же самую аминокислотную последовательность, что и ГКСФ, за исключением того, что в положениях 1, 3, 4, 5 и 17, вместо аминокислот нативного ГКСФ он имеет А1а, Тйг, Туг, Агд и 8ег, соответственно (мутеин ГКСФ) (см. фиг. 1). Этот мутеин описан в патенте США № 5214132, который включен в настоящее описание посредством ссылки.
Физиологически активный конъюгат ПЭГГКСФ настоящего изобретения имеет формулу о ί II 1 ,
КО(СН2СН2О)ПСН2СНГС-МЖ-----------с 1 т
Частью настоящего изобретения также являются композиции заявленных конъюгатов, где т и η могут означать различные целые числа для конъюгатов в данной композиции.
Конъюгат настоящего изобретения имеет то же самое применение, что и ГКСФ. В частности, конъюгат настоящего изобретения может быть использован для лечения пациентов, у которых наблюдается недостаток гранулоцитов после химиотерапии, или для предварительной подготовки пациентов к трансплантации костного мозга по той же схеме, которая применяется при использовании ГКСФ для лечения этих состояний. Однако конъюгат настоящего изобретения имеет улучшенные свойства, включая более высокую стабильность, лучшую растворимость, более продолжительное время полужизни в кровотоке и присутствия в плазме.
Описание графического материала
Фиг. 1 - первичная структура мутеина ГКСФ. Мутеин ГКСФ имеет структуру, отличающуюся от структуры человеческого ГКСФ дикого типа в положениях 1, 3, 4, 5 и 17, где он вместо аминокислот нативного ГКСФ имеет А1а, Т11Г. Туг, Агд и 8ег, соответственно.
Фиг. 2 - реагенты пэгилирования.
Фиг. 3 - разделение 20 кДа ПЭГ-модифицированнного и немодифицированного мутеина ГКСФ. Типичный профиль элюции ПЭГреакционной смеси. Колонка: 1-2 мл Бгае!оде1® ΕΜΌ 8О3 6508. Уравновешивающий буфер: 10 мМ ацетат аммония, рН 4,5. Буферы для элюции: 1) 0,15 М ЫаС1 в уравновешивающем буфере; 2) 0,5М ЫаС1 в уравновешивающем буфере.
Фиг. 4 - активность мутеина ПЭГ-ГКСФ на 5-й день после одной инъекции. Самкам крыс С57ВБ/61 подкожно инъецировали 25,2 мкг пэгилированных конъюгатов мутеина ГКСФ; на пятый день после введения из ретроорбитального синуса брали образцы венозной крови. Гематологический анализ и определение лейкоцитарной формулы проводили на счетчике Сои1!ет; число полученных нейтрофилов стандартизировали по отношению к наполнителю (контролю) для каждого эксперимента. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка для 4 мышей на группу.
Фиг. 5 - увеличение числа ПМН в зависимости от массы ПЭГ (кДа) в конъюгатах связанный с амидом и мочевиной мутеин ГКСФ ПЭГ. Для конъюгатов, полученных с реагентом 8РА, ПМН=0,277 Μ\ν + 3,95. Для конъюгатов, полученных с использованием реагента, содержащего мочевину, ПМН=0,152 Μν + 2,54.
Фиг. 6 - активность мутеина ПЭГ-ГКСФ на 7-й день после одной инъекции. Самкам крыс С57ВБ/61 подкожно инъецировали 25,2 мкг конъюгатов ПЭГ-мутеин ГКСФ; на пятый день после введения из ретроорбитального синуса брали образцы венозной крови. Гематологический анализ и определение лейкоцитарной формулы проводили на счетчике СоиЙет; число полученных нейтрофилов стандартизировали по отношению к наполнителю (контролю) для ка ждого эксперимента. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка для 4 мышей на группу.
Фиг. 7 - анализ на мобилизацию мышиных колоний СКПК.
Фиг. 8 - анализ на мобилизацию мышиных колоний СКПК.
Фиг. 9 - анализ на мобилизацию мышиных колоний СКПК.
Фиг. 10 - анализ на мобилизацию мышиных колоний СКПК.
Фиг. 11 - анализ на мобилизацию мышиных колоний СКПК.
Подробное описание изобретения
Заявленное изобретение относится к физиологически активному конъюгату ПЭГ ГКСФ, имеющему формулу о
Г II 1 !
НСХСНгСНаО^СНгСНг-С-ИН--С т
где О представляет гранулоцитарный колониестимулирующий фактор без тех его аминогрупп, которые участвуют в амидной связи с полиэтиленгликолевой частью, как показано в формуле 1, К. представляет низший алкил, η представляет целое число от 420 до 550, а т представляет целое число от 1 до 5.
Числа η и т выбирают так, чтобы полученный конъюгат формулы I обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного ГКСФ, причем, указанная активность может быть аналогична соответствующей активности немодифицированного ГКСФ, превышать эту активность или составлять часть этой активности, η представляет число этиленоксидных остатков в звене ПЭГ. Одна субъединица ПЭГ ОСН2СН2 имеет молекулярную массу примерно 44 Да, т представляет число звеньев ПЭГ, присоединенных к молекуле ГКСФ. Конъюгат настоящего изобретения может иметь одно, два, три, четыре, пять или шесть звеньев ПЭГ на молекулу ГКСФ. Таким образом, молекулярная масса этого конъюгата (исключая молекулярную массу ГКСФ) зависит от числа η и т. η может иметь значение от 420 до 550, что соответствует образованию конъюгата, в котором каждое звено ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 18 до 25 кДа на звено ПЭГ. Предпочтительно η имеет значение 450-490, что соответствует образованию конъюгата, в котором каждое звено ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 20 кДа. т может иметь значение 1, 2, 3, 4 или 5. Предпочтительно т равно 1-4, а особенно предпочтительно т равно 2. Молекулярная масса ПЭГ-части конъюгатов настоящего изобретения составляет в пределах приблизительно от 18 кДа (η=420, т=1) до 125 кДа (η=550, т=5). Если η равно 420-550, а т равно целому числу от 1 до 4, то молекулярная масса ПЭГ-части конъюгатов настоящего изобретения составляет приблизительно в пределах от 18 кДа (п=420, т=1) до 97 кДа (п=550; т=4). Термин приблизительно, относящийся к определенному значению молекулярной массы, означает, что величина этой массы может иметь отклонения от этого значения в приемлемом диапазоне, определенном стандартными аналитическими методами.
В предпочтительном конъюгате п равно 450-490, а т равно 1-4, причем в данном случае молекулярная масса ПЭГ-части данных конъюгатов находится в пределах приблизительно от 20 (п=450; т=1) до 86 кДа (п=490; т=4). В другом предпочтительном конъюгате, п равно 420550, а т равно 2, и в этом случае молекулярная масса ПЭГ-части данных конъюгатов находится в пределах приблизительно от 37 (п=420) до 48 кДа (п=550). В особенно предпочтительном конъюгате п равно 450-490, а т равно 2, и в этом случае молекулярная масса ПЭГ-части данных конъюгатов находится в пределах приблизительно от 40 (п=450) до 43 кДа (п=490).
В может представлять любой низший алкил, который означает алкильную группу, имеющую от одного до шести атомов углерода, такую как метил, этил, изопропил и т. п. Такими алкилами могут быть разветвленные алкилы. Предпочтительным алкилом является метил.
ГКСФ означает природный или рекомбинантный, предпочтительно человеческий белок, который получают из любых обычных источников, таких как ткань, синтезом белка и из клеточной культуры с природными или рекомбинантными клетками. В объем настоящего изобретения входят любые белки, обладающие активностью ГКСФ, такой как мутеины или другие модифицированные белки. Получение и выделение ГКСФ из природных или рекомбинантных источников хорошо известно специалистам (см. например, патент США № 4810643 и 5532341, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки). Предпочтительным конъюгатом ГКСФ является конъюгат с мутеином ГКСФ, описанным в патенте США № 5214132.
Физиологически активный конъюгат формулы I обладает активностью ГКСФ, которая означает любую одну или множество любых известных активностей ГКСФ, определенных различными аналитическими методами, известными специалистам. В частности, конъюгат настоящего изобретения обладает активностью ГКСФ, которая, как показано, заключается в его способности увеличивать число ПМН. Эта активность ГКСФ является известной. Такая активность в конъюгате может быть определена аналитическими методами, хорошо известными специалистам, например с помощью анализов, описанных ниже (см. также Акало е! а1., 1рп. Р11агтасо1. Тйет. (1991) 19:2767-2773; Уатакай е! а1., 1. Вюсйет. (1994) 115:814-819; и ЫеЬеп е! а1., В1оо6 (1993) 81:1960.
Конъюгат формулы I получают путем ковалентного связывания ГКСФ с таким реагентом, как сукцинимидилпропионовая кислота (8РА) формулы II
Реагент формулы II может быть получен стандартными методами в соответствии с известными процедурами (см. патент США № 5672662, содержание которого вводится в настоящее описание посредством ссылки). п является таким, как оно было определено выше в формуле I, и выбрано для получения конъюгата с нужной молекулярной массой. Предпочтительными являются такие реагенты, в которых п равно 450-490 (мол. масса = 20 кДа). Другие молекулярные массы могут быть получены путем варьирования п в ПЭГ-спиртовом исходном материале для реагента формулы II стандартными методами. 8РА-реагент формулы II с молекулярными массами 5, 10, 15 и 20 кДа может быть получен от 811еаг\та1ег Ро1утегк, Шс. (Нип1куШе, А1аЬата).
Реагент формулы II может быть конъюгирован с ГКСФ стандартными методами. Присоединение осуществляют через амидную связь. В частности, реагент формулы II взаимодействует, главным образом, с одной или несколькими первичными аминогруппами (например, с Νконцом и лизиновыми боковыми цепями) ГКСФ с образованием амидной связи между ГКСФ и полимерным остовом ПЭГ. Группа ΝΗ, показанная в формуле I, происходит от этой первичной аминогруппы (или аминогрупп) ГКСФ, которая реагирует с реагентом формулы II с образованием амидной связи. Таким же образом, но в меньшей степени реагент формулы II может реагировать с гидроксильной группой серина в положении 66 ГКСФ, в результате чего образуется сложноэфирная связь между ГКСФ и полимерным остовом ПЭГ. Эти реакционные условия хорошо известны специалистам и подробно описаны ниже.
Присоединение реагентов к ГКСФ может быть осуществлено известными методами. В настоящем изобретении может быть использован ПЭГ с любой выбранной молекулярной массой (п). Так, например, реакция может быть проведена в растворе с рН 5-10, при температуре от 4°С до комнатной, в течение периода времени от 30 мин до 20 ч, с использованием молярного отношения реагента к белку, составляющего от 4:1 до 30:1. Реакционные условия могут быть выбраны так, чтобы данная реакция была направлена на получение преимущественно нужной степени замещения. В основном, низкая температура, низкий рН (например, рН 5) и короткое время проведения реакции способствуют уменьшению числа присоединенных
Ί
ПЭГ (более низкое т). Высокая температура, значение рН от нейтрального до высокого (например, рН >7) и более продолжительное время реакции способствуют увеличению числа присоединенных ПЭГ (более высокое т). Так, например, если используется 5 кДа-реагент формулы II, то при рН 7,3 и молярном отношении реагента к белку, составляющем 30:1, при температуре 4°С и времени реакции 30 мин продуцируется преимущественно моно-ПЭГ -конъюгат; при температуре 4°С и времени реакции, составляющем 4 ч, продуцируется преимущественно ди-ПЭГ-конъюгат; а при комнатной температуре и времени реакции, составляющем 4 ч, продуцируется преимущественно три-ПЭГконъюгат. Реакцию прекращают путем подкисления реакционной смеси и замораживания при -20°С. В основном, предпочтительным является рН от 7 до 7,5, а предпочтительным молярным отношением реагента к белку является отношение от 4:1 до 6:1.
Для разделения конъюгатов с разными зарядами могут быть использованы такие методы очистки, как катионообменная хроматография, которая способствует эффективному разделению конъюгатов на конъюгаты с различными молекулярными массами. Так, например, катионообменная колонка может быть загружена, а затем промыта ~20 мМ ацетатом натрия, рН ~4, и проэлюирована линейным (0М-0,5М) градиентом №1С1. забуференным при рН от 3 до 5,5, а предпочтительно при рН ~4,5. Содержание фракций, полученных путем проведения катионообменной хроматографии, может быть идентифицировано по молекулярной массе стандартными методами, например с помощью масс-спектроскопии, электрофореза в ПААГ с ДСН или любыми другими известными методами разделения молекулярных частиц по молекулярной массе. Затем фракцию, соответствующим образом идентифицированную как фракцию, содержащую конъюгат формулы I, имеющий нужное число (т) присоединенных ПЭГ, отделяют в свободной форме от немодифицированного ГКСФ и от конъюгатов, имеющих другие числа присоединенных ПЭГ.
Частью настоящего изобретения является также композиция конъюгатов, где конъюгаты, имеющие различные значения т, включены в соответствующих соотношениях. Предпочтительной композицией настоящего изобретения является смесь конъюгатов, где т равно 1, 2, 3 и
4. Процентное содержание конъюгатов, где т=1, составляет 18-25%, процентное содержание конъюгатов, где т=2, составляет 50-66%, процентное содержание конъюгатов, где т=3, составляет 12-16%, а процентное содержание конъюгатов, где т=4, составляет вплоть до 5%. Такую композицию получают посредством реакции реагента пэгилирования с ГКСФ в молярном отношении от 4 до 6:1 (избыток реагента). Реакционную смесь оставляют на 20 ч при тем пературе от 4 до 8°С, при рН, близком к 7,5, для прохождения реакции. По окончании реакции добавляют уксусную кислоту. Полученный конъюгат очищают от остаточного немодифицированного белка, избытка реагента пэгилирования и других примесей и буферных компонентов, присутствующих в процессе реакции. Наряду с пэгилированным белком, в качестве побочных продуктов реакции продуцируются Ν-гидроксисукцинимид и полиэтиленгликолькарбоновая кислота.
Нижеследующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают его объема. В этих примерах используется мутеин ГКСФ. Другие виды ГКСФ могут быть также конъюгированы с ПЭГ методами, проиллюстрированными в настоящем описании.
Пример 1. Реагенты пэгилирования.
1. Амидный линкер САБА (Р-6СА-1, Р12СА-1).
Амидные линкерные реагенты САВА содержат 2 цепи ПЭГ с мол. массой либо 6, либо 12 кДа. Структуры см. на фиг. 2-А.
2. Амидный линкер (Р-5 ат-1, Р-10ат-1).
Были продуцированы амидные линкеры, имеющие мол. массу 5 и 10 кДа. Структуры см. на фиг. 2-В.
3. Амидный линкер.
Этот реагент представляет собой коммерчески доступную сукцинимидилпропионовую кислоту (8РА), полученную с использованием молекул ПЭГ с 5, 10, 15 и 20 кДа, и их общая структура проиллюстрирована на фиг. 2-С.
4. Карбамидный линкер.
Этот реагент был получен с использованием молекул ПЭГ, имеющих мол.массу 5, 10 и 25 кДа, и его типичная структура проиллюстрирована на фиг. 2-Ό.
5. Уретановый линкер.
Были продуцированы уретановые линкеры с 10 и 20 кДа и их структура показана на фиг. 2Е.
6. Уретановый линкер.
Структура этого коммерчески доступного 36 кДа-ПЭГ-реагента, проиллюстрированного на фиг. 2-С, имеет один конец ПЭГ-реагента, кэппированный трет-бутильной группой. Этот реагент имеет самую высокую молекулярную массу ПЭГ, используемую в этом примере.
7. Тио-уретановый линкер.
Структура этого реагента пэгилирования показана на фиг.2-Г. Молекулярная масса ПЭГ, используемого в этом реагенте, составляла 20 кДа.
Нижеследующие реагенты были получены от Куотеа Накко Кодуо Со., Ь1б. Токуо, 1араи: 1) мутеин Г-КСФ, называемый мутеином ГКСФ;
мутеин ГКСФ, конъюгированный с реагентом разветвленного метоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), содержащим 2 цепи м-ПЭГ, имеющего мол.массу либо 6, либо с 12 кДа (РЕС-САВА9
ΝΗ8, см. фиг. 2А); и мутеин ГКСФ, конъюгированный с линейным сложноэфирным/амидным 5- и 10 кДа-м-ПЭГ-реагентом (см. фиг. 2В). Реагенты, м-ПЭГ-сукцинимидилпропионовая кислота-ΝΗδ (ПЭГ-8РА), имеющие молекулярные массы 5, 10, 15 и 20 кДа, были закуплены у фирмы 8йеагга(ег Ро1утег§ (НипйуШе, А1аЬата, см. фиг. 2С). Нижеследующие реагенты для присоединения ПЭГ к белку были получены от Нойтапи-Ьа Роейе. 1пс: 1) м-ПЭГ-карбамидный линкер (5, 10 и 25 кДа, см. фиг. 2Ό), 2) м-ПЭГуретановый линкер (10 и 20 кДа, см. фиг. 2Е), и 3) м-ПЭГ-тиоуретановый линкер (10 и 20 кДа, см. фиг. 2Е), а трет-бутил-м-ПЭГ-уретановый линкерный реагент со средней молекулярной массой 36 кДа был получен от ΌΌΙ Рйагтасеибсай 1пс. (Моип(ату1ете, СА, см. фиг. 26).
Реакции пэгилирования
На реакции пэгилирования влияют следующие факторы: 1) рН, 2) температура, 3) время реакции, 4) молярное отношение белка к ПЭГ-реагенту и 5) концентрация белка. При определенной регуляции этих факторов можно направлять данную реакцию на продуцирование преимущественно моно-, ди-, три- и т.п. ПЭГ-конъюгатов. Так, например, реакционными условиями для реагента 8РА-ПЭГ 5000 (Νгидроксисукцинимид) 811еаг\\Шег Ро1утег§ являются: 1) рН 7,3, 2) температура 4°С для монои ди-ПЭГ, и комнатная температура для триПЭГ, 3) время реакции для моно-ПЭГ 30 мин; для ди- и три-ПЭГ 4 ч и 4) молярное отношение белка к реагенту 1:30. Для всех реагентов, оптимальные реакционные условия для продуцирования ПЭГ нужного типа определяют отдельно. Эти данные указаны в табл. Ι. Реакцию прекращают путем подкисления реакционной смеси и замораживания ее при температуре -20°С.
Выделение модифицированного и свободного мутеина ГКСФ из реакционной смеси (катионный обмен с использованием сульфопропила (СП))
Реакционную смесь, содержащую приблизительно 5 мг белка, 10-20-кратно разбавляли водой и рН доводили до 4,5 с использованием ледяной уксусной кислоты. Затем разбавленный образец наносили на колонку, предварительно загруженную 1-2 мл Егас(оде1 ΕΜΌ 8О3 - 6508 (ЕМ 8ерага(юп5, ОФЬ^о^п, Νον 1ег§еу), и уравновешенную 10 мМ ацетатом аммония, рН 4,5. Неадсорбированный реагент и побочные продукты реакции удаляли проточным методом. Модифицированный мутеин ГКСФ элюировали в ступенчатом градиенте с использованием 0,15 М №1С1 в уравновешивающем буфере. Оставшийся на колонке немодифицированный мутеин ГКСФ постадийно элюировали 0,5М №1С1 в уравновешивающем буфере. Выделенную смесь конъюгата мутеин ГКСФ-ПЭГ подвергали стерильной фильтрации на 0,2 мкм-фильтре и хранили в замороженном виде при -20°С. Характеризация конъюгатов мутеин ГКСФ-ПЭГ.
Определение белка
Концентрацию белка в очищенных конъюгатах мутеин ГКСФ-ПЭГ определяли с использованием А280=0,86 для 1 мг/мл раствора.
Анализ с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН
Этот анализ проводили с использованием 12 и 15%-ных полиакриламидных гелей или 816%-ных полиакриламидных градиентных гелей в условиях восстановления, как описано Ьаетт11, Хпиге 227:680-685, 1970.
Определение процентного состава
Процентный состав каждого вида (моно-, ди-, три- и т.п.) в различных реакционных смесях конъюгата мутеин ГКСФ-ПЭГ определяли в соответствии с денситометрическими измерениями ДСН-ПААГ-гелей, окрашенных кумасси синим (см. табл. ΙΙ).
Определение массы ПЭГ в конъюгатах мутеин ГКСФ-ПЭГ
Общую массу замещенного ПЭГ в различных препаратах определяли исходя из средней молекулярной массы ПЭГ, путем идентификации отдельных ПЭГ-конъюгатов (моно-, ди- и т. п.), исходя из электрофоретической подвижности, числа присоединенных молекул ПЭГ и процентного состава на основе денситометрических измерений ДСН-ПААГ-гелей, окрашенных кумасси синим. Общая масса ПЭГ конкретного препарата представляет собой сумму его отдельных масс ПЭГ. Отдельную массу ПЭГ вычисляли по следующему уравнению:
масса ПЭГ = мол.м.ПЭГ х # молекул ПЭГ х % состав, где мол. масса ПЭГ =5, 10, 20 кДа и т.п.
# молекул ПЭГ =1, 2, 3 для моно, ди, три, соответственно.
Для определения общей массы ПЭГ была также использована масс-спектрометрия (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ). В данном случае, масс-спектр позволял идентифицировать и определить молекулярную массу отдельных ПЭГ-конъюгатов. Молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к каждому ПЭГ-конъюгату, представляет собой общую молекулярную массу отдельных ПЭГконъюгатов минус молекулярная масса мутеина ГКСФ (18,9 кДа). Эти величины, умноженные на % состав, дают отдельные массы ПЭГ; и их сумма составляет общую массу ПЭГ.
Оба этих метода были использованы для определения масс ПЭГ различных препаратов. Результаты систематизированы в табл. ΙΙ.
Определение уровней эндотоксичности
Уровни эндотоксичности определяли методом ЬАЕ в соответствии с инструкциями производителей (А88ос1а(е8 ой Саре Соб, 1пс., Шообк
Нор1е, МаккасйшеЩ).
Биологические активности
Биологический анализ ш уйго на клетках
Μ-ΝΡ8-60 и анализ ш у1уо на самках мышей
С57ВЬ/61 осуществляли способом, описанным ранее (См. Лкаио с1 а1., 1ри. Рйаттаео1. Ткет. (1991) 19:2767-2773).
Результаты и обсуждения Реакция присоединения ПЭГ
В целом, результаты показали, что для получения нужного количества конъюгатов (см. табл. I и II), менее реакционноспособные реагенты, такие как карбамидный линкер, требуют более высоких значений рН, более высокой температуры и более высокого молярного отношения белок:реагент, а также более длительного времени проведения реакции.
Выделение модифицированного и свободного мутеина ГКСФ из реакционной смеси Типичный профиль элюции показан на фиг. 4. Для удаления следовых количеств примесей и эндотоксина и для осуществления замены буфера для хранения конечного продукта, помимо катионообменной хроматографии, может потребоваться проведение дополнительных стадий, таких как гельпроникающая хроматография. Масштаб метода разделения с использованием сильного катионообменника был увеличен до 30 мг для 20 кДа 8РЛ (амидных) и 20 кДа-уретановых конъюгатов. С использованием этой процедуры были получены почти количественные выходы.
% состав и масса ПЭГ.
Результаты определения процентного состава и массы ПЭГ систематизированы в табл.
II. В эксперименте, проведенном авторами изобретения, в случае использования ПЭГконъюгатов с высокой молекулярной массой (например, 20 кДа 8РЛ ди-ПэГ и 12 кДа САВЛ), идентификация типа ПЭГ для определения % состава реакционной смеси, исходя из электрофоретической подвижности, является не очень надежной. Для определения массы ПЭГ и идентификации высокомолекулярных и в высокой степени замещенных ПЭГ-конъюгатов, необходимо проводить комбинацию анализов, таких как электрофорез в ДСН-ПААГ, СПВЭЖХ и МС-анализ МАРШ-ТОГ. Однако, моно-ПЭГ и ПЭГ-конъюгаты, полученные с использованием низкомолекулярных ПЭГреагентов (например, 5 кДа) могут быть идентифицированы достаточно точно исходя из их ДСН-ПААГ-профилей.
Уровни эндотоксичности
С применением метода ТЛЬ (лимулюстеста), во всех ПЭГ-конъюгатах было обнаружено <1 ЭЕ/мг эндотоксина (ЭЕ - эндотоксиновая единица), за исключением одного конъюгата, происходящего от уретанового реагента. В этом ПЭГ-конъюгате эндотоксин был обнаружен только после разведения. Было подтверждено, что присутствие эндотоксина не является следствием загрязнения в процессе разведения, а поэтому ингибирование в анализе ГАГ мог вызвать некий неизвестный материал, присутствующий в данном образце при более высокой концентрации белка. После разведения образца, и вслед за этим разведения ингибирующего материала, был получен положительный результат анализа на эндотоксин.
Биологическая активность
Биологические активности ίη νίίτο и ίη νίνο всех конъюгатов мутеин ГКСФ - ПЭГ представлены в табл. II. В основном, наблюдается обратная зависимость между ίη νίίτοактивностью и степенью замещения, а также молекулярной массой (Мте) ПЭГ. В противоположность этому, с увеличением М\т замещенного ПЭГ наблюдается увеличение ίη νίνοактивности. Это наблюдение было сделано также другими авторами (ЪШако-ГйПмпуа с1 а1. Се11 81гис1 Гипс!. 17 (3) :157-60, 1992). Было высказано предположение, что химическое присоединение ПЭГ-молекул к полипептидному остову мутеина ГКСФ продуцирует некоторую форму конформационных изменений, которые негативно влияют на взаимодействия рецептор/лиганд, что приводит к снижению аффинности связывания. Кроме того, относительно короткое время инкубирования при проведении анализа ίη νίίτο, вероятно, недостаточно для достижения пика активности. С другой стороны, ίη νίνο-анализ на мышах является значительно более продолжительным (дни) и заканчивается через несколько дней после инъекции лекарственного средства. Это более длительное время инкубирования в сочетании с увеличенным временем полужизни в кровотоке конъюгата ПЭГ-мутеин ГКСФ компенсирует любую потерю аффинности благодаря пэгилированию. В результате этого достигается максимальная биологическая активность ίη νίνο. Другая гипотеза заключается в том, что конъюгат ПЭГмутеин ГКСФ при его инъекции действует как пролекарство. В этом случае, ПЭГ-часть конъюгата ПЭГ-мутеин ГКСФ каким-либо образом постоянно отщепляется, что приводит к замедленному высвобождению незначительных количеств свободного мутеина ГКСФ, который способствует поддержанию и усилению ίη νίνοактивности. Однако гипотеза относительно действия конъюгата как пролекарства, не объясняет наблюдаемого базового значения ίη νίνοактивности через 7 дней после введения начальной дозы. Механизм действия в качестве пролекарства маловероятен, поскольку амидная связь между белком и ПЭГ является стабильной и трудно расщепляемой.
Из числа 15 исследованных конъюгатов мутеин ГКСФ-ПЭГ, ίη νίνο-активности Р12СЛ-1, 20 кДа 8РЛ, 20 кДа уретана и 36 кДа уретана были значительно выше, чем активности остальных препаратов (см. фиг. 4 и табл. II).
В целом, наблюдается прямая зависимость между молекулярной массой молекулы ПЭГ и увеличением ίη νίνο-активности. Это проиллюстрировано на фиг.5, где увеличение числа
ПМН выражается как функция всей массы ПЭГ в ПЭГ-конъюгатах, связанных с амидом (8РА) и мочевиной.
Отбор и характеризация конъюгатов мутеин ГКСФ-ПЭГ
После тщательной оценки химических свойств конъюгатов, биологических свойств и создания лекарственных препаратов для 15 ПЭГ-конъюгатов, для последующей оценки были выбраны три конъюгата: 1) Р-12ОА-1, 2) 20 кДа 8РА и 3) 20 кДа уретан. Полученные из 20 кДа 8РА моно-, ди- и три-ПЭГ-конъюгаты, присутствующие в СП-очищенной смеси, оценивали путем сравнения голова к голове, в результате чего было установлено, что все три конъюгата сохраняли высокую гранулопоэтическую активность у мышей-самок С57ВЬ/61 в течение 5 дней при введении одной дозы 25,2 мкг (табл. III и фиг.4). В противоположность этому, для достижения аналогичной активности, дозы немодифицированного мутеина ГКСФ необходимо вводить ежедневно (данные не показаны). Во всех случаях, за исключением двух (20 кДа 8РА и Р-12ОА-1), ίη νίνο-активность возвращалась до нормальных уровней на 7 день после введения начальных доз мышам (фиг. 6). Как 20 кДа 8РА, так и Р-12ОА-1-конъюгаты обнаруживали повышенную активность при более низкой дозе, 8,4 мкл, и эта активность возвращалась до нормальных уровней на 7 день (см. табл. III). Данные процентного состава (табл. III) показывают, что оба препарата 20 кДа 8РА и Р-12ОА-1 приблизительно на 50% содержат димер, а оставшиеся 50% распределяются между мономером и тримером. В используемых экспериментальных условиях, 20 кДа-уретановый реагент продуцирует преимущественно моно-ПЭГ (см. табл. III). Ш νίΐτο-активность всех оцененных ПЭГконъюгатов, являющихся преимущественно мономерным производным, обнаруживала обычную картину обратной зависимости от степени замещения, а также от молекулярной массы ПЭГ. Ш νίνο биологическая активность оцененных ПЭГ-конъюгатов обнаруживала прямую зависимость от молекулярной массы ПЭГ в пределах оцененного интервала молекулярных масс (фиг. 5).
Заключение
Из оцененных 15 конъюгатов мутеин ГКСФ-ПЭГ, хорошие профили ίη νίνοактивности обнаруживали препараты Р-12ОА-1, 20 кДа 8РА и 20 кДа-уретанового линкера. В целом, наилучшие свойства, а также экономичность производства, обнаруживал конъюгат 20кДа-ПЭГ-мутеин ГКСФ.
Таблица I. Реакционные условия, используемые для получения различных ПЭГ-конъюгатов
Мн (мол ..масса, Да) Реактив Реакционные условия
рН Температура Время Отношение
5 к мочевина 10 ком.тем. 1 ч 1:100
5 к амид 7,3 ком.тем. 4 ч 1:30
10 к мочевина 10 ком.тем. 1 ч 1:100
10 к амид 7,3 ком.тем. 4 ч 1:30
10 к уретан Ю 4°С 1 ч 1:30
15 к амид 7, 3 ком. тем. 4 ч 1:30
20 к амид 7,3 ком.тем. 4 ч 1:30
20 к тиоуретан 8 ком.тем. 17 1:30
20 к уретан 10 4°С 1 ч 1:30
25 к мочевина 10 ком.тем. 1 ч 1:100
36 к уретан 8 4°С 6 ч 1:3
Таблица II. Состав, масса ПЭГ и данные биологической активности различных конъюгатов ПЭГ-мутеин ГКСФ
% состав и массу присоединенного ПЭГ вычисляли исходя из денситометирических измерений ДСН-ПААГ, окрашенного кумасси синим (*), или с помощью МСанализа МАИЯ-ТОГ (**). (а), (Ь), (с): каждый представляет собой отдельный биоанализ; приведены данные ПМН на день 5.
Таблица III. Состав, масса ПЭГ, сайты присоединения ПЭГ и данные биологической активности для трех лучших молекул
Мышам-самкам С57ВБ/61 вводили 8,4 или 25,2 мкг либо ΝΏ-28, (ежедневно), либо ПЭГконъюгата (одну дозу). На день 5 и на день 7 после начала введения доз, брали образцы венозной крови и проводили определение лейкоцитарной формулы.
* определяли исходя из денситометрических измерений окрашенного кумасси ДСН-ПААГ.
** определяли с помощью МС МАГЫ-ТОГ.
Пример 2. Получение 20 кДа ПЭГ, конъюгированного с мутеином рчГКСФ.
Модификацию мутеина ГКСФ с использованием 20 кДа метокси-ПЭГ-сукцинимидилпропионовой кислоты (8РА) осуществляли следующим образом. ПЭГ-реагент растворяли в дистиллированной воде при концентрации ~200 мг/мл и добавляли в раствор мутеина ГКСФ (~ 5 мг/мл) в молярном отношении от 4:1 до 6:1 (избыточный реагент). Реакция протекала при 48°С в течение 20 ч при рН ~7,5. В конце реакции, для ее прекращения добавляли ледяную уксусную кислоту. Пэгилированный мутеин ГКСФ (также называемый ПЭГГ) затем очищали от остаточного немодифицированного мутеина, избыточного ПЭГ -реагента и других примесей и буферных компонентов, присутствовавших во время модификации. Наряду с пэгилированным белком, в качестве побочных реакционных продуктов продуцировались Νгидроксисукцинимид и полиэтиленгликолькарбоновая кислота.
ПЭГГ очищали с использованием катионообменной хроматографии с последующей ультрафильтрацией. Катионообменную колонку загружали и промывали 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0. В результате элюирования линейным градиентом хлорида натрия, ПЭГГ отделялся от всех других компонентов реакционной смеси. Затем проводили ультрафильтрацию/диафильтрацию для концентрирования ПЭГГ до ~4,0 мг/мл и замены буфера на 50 мМ хлорида натрия, 20 мМ ацетата натрия, рН 6,0.
Продукты пяти серий пэгилирования и очистки, проведенных в вышеуказанных условиях, анализировали с использованием катионообменной хроматографии, и этот анализ продемонстрировал воспроизводимость реакции пэгилирования мутеина ГКСФ. Эта реакция пэгилирования продемонстрировала воспроизводимость при увеличении ПЭГГ до 2,5 г (конечный выход ПЭГГ) в следующих оптимальных условиях: отношение 20 кДа-8РА-ПЭГ : мутеин = 4 6:1; рН ~7,5, 4°С, 20 ч. Определяли средний процентный состав смеси ПЭГГ, который составлял 21,7% моно-ПЭГГ (% отн.станд.откл. = 16,6), 60,3% ди-ПЭГГ (% отн.станд.откл. = 6,6), 15,1% три-ПЭГГ (% отн.станд.откл. = 4,0) и 2,9% тетра-ПЭГГ (% отн.станд.откл. = 26,1), как указано в табл. IV.
Таблица IV. Катионообменный анализ относительного процентного состава моно-, ди-, три- и тетра-ПЭГГ и в пяти стадиях синтеза ПЭГГ и очистки
Номер стадии Моно-ПЭГГ (% отн.станд. откл., пять определений) Ди-ПЭГГ (% отн.станд. откл., пять определений) Три-ПЭГГ (% отн.станд. откл., пять определений) Тетра-ПЭГГ (% отн.станд. откл., пять определений)
1 21,9% (8,0) 60,3% (2,2) 15,1% (2,2) 2,7% (4,7)
2 27,5% (2,3) 54,4% (1,0) 15,7% (0,8) 2,4% (1,2)
3 18,2% (7,1) 65,5% (0,6) 14,3% (6,6) 2,0% (9,3)
4 21,7% (2,7) 60,1% (1,0) 14,8% (0,5) 3,5% (0,9)
5 19,2% (1,8) 61,3% (0,9) 15,7% (3,7) 3,8% (4,5)
Усредненный состав 21,7% (16,6) 60,3% (6,6) 15,1% (4,0) 2,9% (26,1)
Пример 3. Мобилизация стволовых клеток периферической крови.
Была разработана методика для мобилизации как первичных стволовых клеток, так и коммитированных предшественников костного мозга, и для размножения клеток-предшественников, циркулирующих в периферической крови. Эти стимулированные клетки могут оказаться способными опосредовать раннее и замедленное восстановление после летальной дозы облучения и приживление трансплантата после трансплантации костного мозга или стволовых клеток. №Ьеп 8. Магсик, К & Майей Р: Μοόίΐίζαΐίοη οί йеша(орое1гс Чет апй ргодепйог се11 киЬрори1айопк Ггот 1йе таггое ίο Иге Ь1оой οί тгсе Го11о\\йщ сус1орйокрйатгйе апй/ог дгатйосу(е со1опу-к1гти1а(гпд ГасЮг. В1оой 81:1960 (1993). Восполнение стволовых клеток периферической крови (СКПК) может способствовать сокращению времени восстановления гемопоэтических клеток у пациентов с индуцированной химиотерапией гипоплазией костного мозга, или у пациентов, прошедших курс лечения другими методами миелоабляционной терапии. ВоЬеПк Α.ν. & Ме1са1Г. Ό: Огапи1осу1е со1опук1гти1а(гпд ГасЮг шйисек ке1есйуе е1еуайопк оГ ргодепйог се11к ίη (йе репрйепса1 Ь1оой оГ тгсе. Ехрептеп(а1 Нета1о1оду 22:1156 (1994). Для стимуляции мобилизации были использованы как факторы роста, так и химиотерапевтические лекарственные средства. Войте Ό. МоЫкаНоп оГ репрйега1 Ыоой Чет се11к: \е11еге Шеге ίκ ктоке, ίκ Шеге Гйе? Ехрептеп1а1 Нета1о1оду 23:293 (1995). После стимуляции СКПК, мобилизованные клетки собирали путем лейкафереза и хранили в состоянии заморозки вплоть до их использования. Существующие клинические протоколы предусматривают повторный сбор концентратов СКПК путем лейкафереза после стандартной химиотерапии с высокими дозами (СНТ) и повторное ежедневное введение доз или непрерывную инфузию с использованием факторов роста, которая может иногда продолжаться две недели или более. Вгиддег, V. Вгокк, К, Еггксй, 1. Иет, Р. ХУеЬег, В. Мепе1ктапп, В & ΙΚηιζ, Ь: МоЫкаНоп оГ репрйега1 Ь1оой ргодепйог се11к Ьу кесщепщй айтгпгкйайоп оГ 1п1ег1еикт-3 апй дгапи1осу1етасгорйаде со1опу-Чтт1аШщ ГасЮг Гойоегпд ро1усйето1йегару \\йй е1орокгйе, йокГатгйе апй сгкр1а1ш. В1оой 79:1193 (1992). Исследования, описанные ниже, осуществляли с использованием двух мышиных моделей мобилизации СКПК, где первой моделью служили нормальные мыши, а второй моделью служили мыши, подвергнутые химиотерапии. Эти эксперименты по мобилизации стволовых клеток продемонстрировали повышенную эффективность пэгилированного мутеина ГКСФ настоящего изобретения (ПЭГГ) по сравнению с ΝΕυΡΟΟΕΝ (ГКСФ). Было также установлено явное преимущество пэгилированного мутеина с использованием значительно меньших и более эффективных доз.
Эти исследования выявили способность к размножению мобилизованных незрелых мышиных СКПК, стимулированных ίη νίίτο с использованием множества факторов роста на седьмой день, при анализе колоний на агаре. Помимо оценки способности образовывать колонии, была проведена оценка полного гематологического профиля и подсчитано абсолютное число нейтрофилов (ЛЫС) в крови всех мышей. Были также определены сывороточные уровни ГКСФ. После оптимизации анализа было осуществлено несколько экспериментов с различной продолжительностью и оценены высокие и низкие дозы ГКСФ. Были использованы экспериментальные модели для оценки мобилизации, индуцированной ГКСФ и циклофосфамидом (цитоксаном), а также для оценки комбинированной терапии с использованием СНТ и цитокина.
Материалы и методы. Во всех экспериментах использовали 6-10-недельных самок мышей С57ВБ/61, поставляемых из Т11С 1аск§оп ЬаЬогаЮгу. Мышам инъецировали В/б на день -1 либо 200 мг/кг цитоксана, либо забуференный фосфатом физиологический раствор в качестве носителя (ΡΒ8). На день 0, животных инъецировали 8.с. 0,1 мл либо ΝΕυΡΟΟΕΝ (ГКСФ), либо ПЭГГ (20 кДа 8ΡΑ присоединенный пэгилированный мутеин, партия № Р20Х3). либо РВ8носитель, содержащий 1% сыворотку здоровой мыши. Мышам, которые получили Ыеиродеп, ежедневно вводили инъекции в аналогичной дозе, а всем другим мышам вводили носитель. В день умерщвления, из ретроорбитального синуса анестезированных мышей брали периферическую кровь в пробирки, содержащие ΕΌΤΑ. Для каждой группы, небольшой объем собранной цельной крови добавляли в 35 мм2-чашки для культивирования тканей (с тремя повторами), содержащие 1000 ед/мл рекомбинантного мышиного (рек.мыш.) интерлейкина-3, 100 нг/мл фактора роста стволовых клеток и 1000 ед/мл рек.мыш. интерлейкина-6, в общем объеме 1 мл среды ΡΡΜΙ 1640, дополненной 15% фетальной бычьей сывороткой и 0,35% агара Эйсо. Культуры на твердом агаре инкубировали в течение одной недели при 37°С в 5% СО2-содержащей атмосфере с повышенной влажностью. Колонии подсчитывали с использованием стереоскопического препаративного микроскопа при темнопольном освещении.
Результаты: В первой описанной стадии исследования, нормальным мышам вводили ежедневные инъекции 25 мкг/мышь ΝΕυΡΟΟΕΝ на дни 0-5, или одну инъекцию 25 мкг/мышь ПЭГГ на день 0. Мышей умерщвляли на 3-7 день. Как показано на фиг. 7, мобилизация, продемонстрированная по образованию колоний, значительно увеличивалась для мышей, которым инъецировали ΝΕυΡΟΟΕΝ, на 3 и 4 день, но постепенно возвращалась на базовые уровни на 5 день (несмотря на инъекции ΝΕυΡΟΟΕΝ на протяжении 5 дней). С другой стороны, у мышей, которым были инъецированы ПЭГГ, обнаруживалось более высокое число колоний, которое оставалось на уровне плато на протяжении 7 дней.
Парадигма химиотерапевтической модели была аналогичной. Мыши СНТ-группы получали инъекцию цитоксана на день -1. В последующие дни мышам давали только наполнитель, а другие мыши подвергались комбинированной терапии либо ежедневными инъекциями ΝΕυΡΟΟΕΝ на день 0-5, либо одной инъекцией ПЭГГ на день 0. На фиг. 8 показан пик числа колоний у мышей, обработанных цитоксаном на день 4, причем, в последующие дни, их число постепенно возвращалось на базовый уровень. Группы, обработанные ΝΕυΡΟΟΕΝ и ПЭГГ, обнаруживали пик на 5-й день, что свидетельствовало о значительном увеличении числа колоний. Однако в течение 6- и 7-го дня, число колоний у мышей, обработанных цитоксаном + ПЭГГ, оставались на очень высоком уровне по сравнению с группой, обработанной цитоксаном + ΝΕυΡΟΟΕΝ. На фиг. 9 продемонстрирован синергический эффект комбинированной терапии по сравнению с эффектом, наблюдаемым при обработке одним цитоксаном или одним ГКСФ.
Результаты второго исследования представлены на фиг. 10 и 11. Нормальные мыши, которым ежедневно в течение 10 дней вводили инъекции более низкой дозы ΝΕυΡΟΟΕΝ, 3 мкг/мышь, обнаруживали относительно низкий уровень многофазной мобилизации в течение всего наблюдаемого периода исследования. Животные, которым вводили одну инъекцию дозы ПЭГГ 3 мкг/мышь, обнаруживали приблизительно в пять раз большее число мобилизованных предшественников в периферической крови на 4-й день, хотя этот эффект был единственной вспышкой, которая наблюдалась, главным образом, в течение 6 дней.
У мышей, обработанных цитоксаном, одна доза 3 мкг/мышь ПЭГГ индуцировала уровень мобилизации СКПК, который был приблизительно эквивалентен уровню мобилизации, наблюдавшемуся у мышей, получавших в течение 10 дней ежедневные дозы 3 мкг/день (фиг. 11). Обе группы обнаруживали пики мобилизации предшественников на 5-й день, и величина этих пиков была идентичной. Их различие заключается, очевидно, лишь в том, что ΝΕυΡΟΟΕΝ обнаруживал слегка более продолжительное действие. Число колоний у СНТ-модели в 4-10 раз превышало число колоний, наблюдаемое у нормальных мышиных моделей.
Эти эксперименты продемонстрировали, что существует два потенциальных преимущества пэгилированного мутеина по сравнению с
ΝΕυΡΟΟΕΝ. Во-первых, очевидно, что, по сравнению с ΝΕυΡΟΟΕΝ, способность ПЭГ индуцировать мобилизацию СКПК является более эффективносй как у нормальных мышей, так и мышей, подвергнутых химиотерапии. Вовторых, как было показано, у мышей пэгилированный мутеин является более эффективным, чем ΝΕυΡΟΟΕΝ, при его использовании в более низких дозах и в более эффективных режимах введения, чем те дозы и режимы, которые обычно используются с применением клинического продукта.

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Физиологически активный конъюгат, имеющий формулу о
    Г II 1 ,
    РЮ(СН2СН2О)„СН2СН2-С-ЫЖ------------3 1 т
    где О представляет гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, без тех его аминогрупп, которые образуют амидную связь с полиэтиленгликолевой частью в указанном конъюгате, Я представляет алкил с прямой или разветвленной цепью, имеющий от одного до шести атомов углерода, η представляет целое число от 420 до 550, а т представляет целое число от 1 до 5.
  2. 2. Конъюгат по п.1, где Я представляет метил.
  3. 3. Конъюгат по п.2, где η равно 450-490.
  4. 4. Конъюгат по п.2, где т равно целому числу от 1 до 4.
  5. 5. Конъюгат по п.4, где т равно 2.
  6. 6. Конъюгат по п.1, где гранулоцитарным колониестимулирующим фактором является мутеин ГКСФ, имеющий последовательность, показанную на фиг. 1.
  7. 7. Конъюгат по п.1, где η равно от 450 до 490.
  8. 8. Конъюгат по п.1, где т равно целому числу от 1 до 4.
  9. 9. Конъюгат по п.8, где т равно 2.
  10. 10. Конъюгат по п.1, который имеет более продолжительное время полужизни в кровотоке и более высокую гранулопоэтическую активность ίη νίνο, чем соответствующий неконъюгированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
  11. 11. Конъюгат по п.10, где гранулоцитарным колониестимулирующим фактором является мутеин ГКСФ, имеющий последовательность, показанную на фиг. 1.
  12. 12. Физиологически активный конъюгат, имеющий формулу о
    Г II 1 !
    НО(СН2СН2О)ПСН2СН2-С-ЦН--с т
    где Я представляет метил; η равно 450-490; т равно 2; а О представляет мутеин ГКСФ, имеющий последовательность, показанную на фиг. 1, без тех его аминогрупп, которые обра зуют амидную связь с полиэтиленгликолевой частью данного конъюгата.
  13. 13. Композиция, содержащая физиологически активные конъюгаты, имеющие формулу о
    [ II ,
    РО(СН2СН2О)„СН2СН2-С-МН--с 1 гл где О в каждом конъюгате представляет гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, без тех его аминогрупп, которые образуют амидную связь с полиэтиленгликолевой частью в данных конъюгатах; Я в каждом конъюгате независимо представляет алкил с прямой или разветвленной цепью, имеющий от одного до шести атомов углерода; η в каждом конъюгате независимо представляет целое число от 420 до 550; т в каждом конъюгате независимо представляет целое число от 1 до 4; процентное содержание конъюгатов, где т=1, составляет от 18 до 25%; процентное содержание конъюгатов, где т=2, составляет от 50 до 66%; процентное содержание конъюгатов, где т=3, составляет от 12 до 16%; а процентное содержание конъюгатов, где т=4, составляет вплоть до 5%.
  14. 14. Композиция по п.13, где в каждом конъюгате Я представляет метил.
  15. 15. Композиция по п.13, где η и Я являются одинаковыми в каждом конъюгате.
  16. 16. Композиция по п.13, где η равно от 450 до 490.
  17. 17. Композиция по п.13, где в каждом конъюгате гранулоцитарным колониестимулирующим фактором является мутеин ГКСФ, имеющий последовательность, показанную на фиг. 1.
  18. 18. Композиция, содержащая физиологически активные конъюгаты, имеющие формулу о
    Г II 1 ,
    НО(СН2СН2О)„СН2СН2-С-ЦН--с 1 т
    где Я представляет метил; η является одинаковым в каждом конъюгате и представляет целое число от 450 до 490; О представляет мутеин ГКСФ, имеющий последовательность, показанную на фиг. 1, без тех его аминогрупп, которые образуют амидную связь с полиэтиленгликолевой частью данного конъюгата, и где т в каж дом конъюгате независимо представляет целое число от 1 до 4; процентное содержание конъюгатов, где т=1, составляет от 18 до 25%; процентное содержание конъюгатов, где т=2, составляет от 50 до 66%; процентное содержание конъюгатов, где т=3, составляет от 12 до 16%; а процентное содержание конъюгатов, где т=4, составляет вплоть до 5%.
  19. 19. Способ получения конъюгата ПЭГГКСФ, имеющего более продолжительное время полужизни в кровотоке и более высокую гранулопоэтическую активность ίη νίνο, чем соответствующий неконъюгированный ГКСФ, где указанный способ заключается в ковалентном связывании реагента формулы с указанным ГКСФ с получением указанного конъюгата.
  20. 20. Способ по п.19, где указанным ГКСФ является мутеин ГКСФ, имеющий последовательность, показанную на фиг. 1
EA200100838A 1999-01-29 2000-01-19 Конъюгаты гксф EA004685B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11791799P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US2000/001264 WO2000044785A1 (en) 1999-01-29 2000-01-19 Gcsf conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200100838A1 EA200100838A1 (ru) 2002-04-25
EA004685B1 true EA004685B1 (ru) 2004-06-24

Family

ID=22375505

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400067A EA200400067A1 (ru) 1999-01-29 2000-01-19 Конъюгаты гксф
EA200100838A EA004685B1 (ru) 1999-01-29 2000-01-19 Конъюгаты гксф

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400067A EA200400067A1 (ru) 1999-01-29 2000-01-19 Конъюгаты гксф

Country Status (26)

Country Link
US (4) US20030130193A1 (ru)
EP (1) EP1157037B1 (ru)
JP (1) JP2002540065A (ru)
KR (1) KR100689212B1 (ru)
CN (1) CN1376164A (ru)
AT (1) ATE246202T1 (ru)
AU (1) AU2618500A (ru)
BG (1) BG65213B1 (ru)
BR (1) BR0007781A (ru)
CA (1) CA2361766C (ru)
CZ (1) CZ300546B6 (ru)
DE (1) DE60004172T2 (ru)
DK (1) DK1157037T3 (ru)
EA (2) EA200400067A1 (ru)
ES (1) ES2204509T3 (ru)
HK (1) HK1049673A1 (ru)
HU (1) HU228488B1 (ru)
IL (1) IL144361A0 (ru)
MX (1) MXPA01007609A (ru)
NO (1) NO331787B1 (ru)
NZ (1) NZ513113A (ru)
PT (1) PT1157037E (ru)
RS (1) RS50928B (ru)
SK (1) SK286898B6 (ru)
WO (1) WO2000044785A1 (ru)
ZA (1) ZA200105932B (ru)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU228488B1 (en) * 1999-01-29 2013-03-28 Amgen Inc Gcsf conjugates
US6831158B2 (en) 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
DE60137525D1 (de) 2000-10-16 2009-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Peg-modifiziertes erythropoietin
DE60236522D1 (de) 2001-07-11 2010-07-08 Maxygen Inc G-csf konjugate
PT2279753E (pt) * 2001-10-10 2016-01-15 Novo Nordisk As Remodelação e glicoconjugação de péptidos
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
HUP0500997A2 (en) * 2001-11-20 2007-11-28 Pharmacia Corp Chemically-modified human growth hormone conjugates
RU2318004C2 (ru) 2002-07-24 2008-02-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Добавки в виде полиалкиленгликолевой кислоты
US7695723B2 (en) 2002-12-31 2010-04-13 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7785601B2 (en) 2002-12-31 2010-08-31 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
JP4674702B2 (ja) 2003-04-09 2011-04-20 バイオジェネリクス エージー グリコペギレ−ション法およびその方法により生成されたタンパク質／ペプチド
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20070041937A1 (en) * 2003-08-22 2007-02-22 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research G-csf derivative for inducing immunological tolerance
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
EP2514757A3 (en) 2005-01-10 2014-03-05 ratiopharm GmbH Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060174362A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-03 Origen Therapeutics, Inc. Long-term culture of avian primordial germ cells (PGCs)
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7381805B2 (en) 2005-06-01 2008-06-03 Maxygen Holdings, Ltd. Compositions comprising mixtures of positional PEG isomers of PEGylated G-CSF
EP1896082B1 (en) 2005-06-16 2012-12-26 Nektar Therapeutics Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates
EP2099495A2 (en) * 2005-08-04 2009-09-16 Nektar Therapeutics AL, Corporation Conjugates of a g-csf moiety and a polymer
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
JP2007112924A (ja) * 2005-10-21 2007-05-10 National Institute For Materials Science 高分子架橋剤及びこの架橋剤を用いたリポソーム又は細胞の架橋体
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CN101002943B (zh) * 2006-01-17 2012-02-01 中国科学院过程工程研究所 支链peg-gcsf和peg-gmcsf结合物及其制备方法
US20080248959A1 (en) 2006-07-21 2008-10-09 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
ITMI20061624A1 (it) 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
US20100316631A1 (en) * 2006-10-19 2010-12-16 The Uab Research Foundation Water Soluble Curcumin-Based Compounds
KR101079993B1 (ko) * 2006-11-17 2011-11-04 동아제약주식회사 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
JP2008125952A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 National Institute For Materials Science 複合架橋体
CN101245109B (zh) * 2007-02-12 2011-12-14 杭州九源基因工程有限公司 一种聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体及其制备方法
RS52845B (en) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag TREATMENT PROCEDURES USING GLYCOPEGILATED G-CSF
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CN101352573B (zh) * 2007-07-27 2011-02-09 杭州九源基因工程有限公司 聚乙二醇单修饰的重组人集落细胞刺激因子赖氨酸缺陷体
WO2009103199A1 (zh) 2008-02-18 2009-08-27 江苏恒瑞医药股份有限公司 水溶性聚合物修饰的g-csf偶联物
EP2626079A3 (en) 2008-02-27 2014-03-05 Novo Nordisk A/S Conjungated factor VIII molecules
RU2409669C9 (ru) * 2008-08-18 2012-05-27 ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами
CN102164954B (zh) 2008-09-23 2018-04-06 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 促红细胞生成素的纯化
JP5749744B2 (ja) 2010-02-11 2015-07-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｉｇｆ−ｉポリ（エチレングリコール）コンジュゲート
RU2566267C2 (ru) 2010-09-14 2015-10-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ очистки пегилированного эритропоэтина
US8889630B2 (en) 2011-12-23 2014-11-18 Carlos Lopez Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor
CA3027143A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
MX2020003742A (es) 2017-10-11 2020-10-28 Elanco Us Inc Variantes del factor estimulador de colonias de granulocitos de porcino y sus usos.
SI3731872T1 (sl) 2017-12-29 2022-04-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin
WO2019129876A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
WO2019129878A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
JP2024500974A (ja) * 2020-12-23 2024-01-10 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 電荷遮蔽された融合タンパク質を精製する方法

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1609546A (en) * 1925-11-19 1926-12-07 Petroleum Rectifying Co Process of separating water from emulsions
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4514497B1 (en) * 1983-12-30 1998-02-24 Novagene Inc Modified live pseudorabies viruses
JPS61227526A (ja) * 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
US5532341A (en) * 1985-03-28 1996-07-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5194592A (en) * 1986-12-23 1993-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6166183A (en) * 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
DE68925966T2 (de) * 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5372808A (en) * 1990-10-17 1994-12-13 Amgen Inc. Methods and compositions for the treatment of diseases with consensus interferon while reducing side effect
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
KR0176625B1 (ko) * 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
HU228488B1 (en) * 1999-01-29 2013-03-28 Amgen Inc Gcsf conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
CN1376164A (zh) 2002-10-23
DK1157037T3 (da) 2003-11-24
HUP0203652A2 (hu) 2003-03-28
US20070219356A1 (en) 2007-09-20
HUP0203652A3 (en) 2005-01-28
EP1157037B1 (en) 2003-07-30
CA2361766C (en) 2011-12-06
HU228488B1 (en) 2013-03-28
CZ20012654A3 (cs) 2002-05-15
EA200400067A1 (ru) 2004-04-29
PL363117A1 (en) 2004-11-15
WO2000044785A1 (en) 2000-08-03
JP2002540065A (ja) 2002-11-26
YU54301A (sh) 2003-10-31
US20080287659A1 (en) 2008-11-20
KR100689212B1 (ko) 2007-03-09
KR20020007296A (ko) 2002-01-26
NO20013700L (no) 2001-09-25
PT1157037E (pt) 2003-12-31
CA2361766A1 (en) 2000-08-03
RS50928B (sr) 2010-08-31
ES2204509T3 (es) 2004-05-01
AU2618500A (en) 2000-08-18
SK10352001A3 (sk) 2002-06-04
DE60004172T2 (de) 2004-04-22
BR0007781A (pt) 2002-02-05
US20030130193A1 (en) 2003-07-10
NO331787B1 (no) 2012-04-02
DE60004172D1 (de) 2003-09-04
BG105851A (en) 2002-06-28
BG65213B1 (bg) 2007-07-31
EA200100838A1 (ru) 2002-04-25
ATE246202T1 (de) 2003-08-15
US20050196378A1 (en) 2005-09-08
IL144361A0 (en) 2002-05-23
SK286898B6 (sk) 2009-07-06
MXPA01007609A (es) 2003-06-24
HK1049673A1 (zh) 2003-05-23
NO20013700D0 (no) 2001-07-27
CZ300546B6 (cs) 2009-06-10
NZ513113A (en) 2004-03-26
EP1157037A1 (en) 2001-11-28
ZA200105932B (en) 2002-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004685B1 (ru) Конъюгаты гксф
JP2989002B2 (ja) 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US6166183A (en) Chemically-modified G-CSF
JP5334347B2 (ja) 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法
EP0442724A2 (en) Modified hIL-6
CZ292775B6 (cs) Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje
HUT75533A (en) Improved interferon polymer conjugates
US20060247422A1 (en) Chemically modified G-CSF
EP1369429A1 (en) GCSF conjugates
AU2004233543B2 (en) GCSF Conjugates
KR100888371B1 (ko) 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
CA2311684C (en) Chemically-modified g-csf
PL203462B1 (pl) Fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU