DE69229768T2 - Anti-Tumor Impfstoffe, die Interleukin-6 transfizierte Zellen enthalten - Google Patents
Anti-Tumor Impfstoffe, die Interleukin-6 transfizierte Zellen enthaltenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft zelluläre Impfstoffe für immuntherapeutische Impfstoffe zur Immuntherapie von Metastasen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Interleukin-6-transfizierten Tumorzellen nach Inaktivierung als Impfstoff zur Verhinderung und zur Hemmung der Entwicklung von Krebs- Metastasen.
- Interleukin-6 (IL-6) ist ein multifunktionales Cytokin, das bei der Regulation von Immunantworten eine wichtige Rolle spielt, z. B. bei der Stimulation von differenzierten Funktionen der B- und T-Lymphocyten, der Steigerung der Hämatopoese und der Produktion von reifen Myeloidzellen und Megakaryocyten sowie der Induktion von Akute- Phase-Proteinen der Leber (Übersichtsartikel vgl. Ref. 1-3). Es wurde gezeigt, daß IL-6 alleine oder in Kombination mit anderen Cytokinen auch als ein Differenzierunginduzierender Faktor und als ein Wachstumshemmstoff von bestimmten, bösartigen Zelltypen wirkt. Die Verwendung von Cytokinen im allgemeinen für die Behandlung von Krebserkrankungen wurde z. B. in den folgenden PCT-Anmeldungen beschrieben:
- Die frühere Anmeldung WO92/05262 beschreibt Tumorzellinien, die zwei exogene Gene enthalten, wobei das erste ein Immunität-verstärkendes Polypeptid und das zweite exogene Gen ein "Letal"- oder "Suizid"-Polypeptid codiert; und
- die frühere Anmeldung WO93/06867 beschreibt ein Verfahren zur Regulation der Immunantwort eines Individuums auf ein Ziel-Antigen durch die gemeinsame Verabreichung eines Gemisches des Ziel-Antigens und eines Cytokins oder Cytokinen, eines Bindemittels oder Hilfsstoffs.
- In vitro-Experimente zeigten, daß das Wachstum der menschlichen Mammakarzinomzellinien MCF-7, SK-BR3, T47D und ZR-75.1 durch menschliches rekombinantes IL-6 (rIL-6) gehemmt wurde. In murinen und menschlichen myeloischen Leukämielinien induzierte menschliches rIL-6 die terminale Differenzierung und einen Wachstumsstillstand, und in frischen Leukämiezellen, die aus Patienten mit akuter myeloischer Leu kämie (AML) isoliert worden waren, erhöhte die Behandlung mit menschlichem rIL-6 den Anteil der Zellen mit einem differenzierten Phänotyp. In vivo-Experimente unter Verwendung von FBL-3-Erythroleukämie zeigten, daß die Verabreichung von hohen Dosen von menschlichem rIL-6 eine starke Anti-Tumor-CTL-Aktivität induzierte, wodurch die Tumor-enthaltenden Mäuse geheilt wurden. Experimente mit mehreren mäßig immunogenen metastatischen murinen Sarkomzellinien (MCA 105, 106, 203) und der Kolonkarzinomlinie MC-38 zeigten, daß die systemische Verabreichung von menschlichem rIL-6 die Zahl der metastatischen Läsionen wesentlich reduzierte.
- Der Lewis-Lungenkarzinom (3LL)-Clon D122 ist in syngenen C57BL/6-Mäusen gering-immunogen und hoch-metastasierend. Diese Zellen exprimieren niedrige Spiegel von H-sKb-Transfektanten, während ihre Immunogenität steigt (5). Experimente der Erfinder haben gezeigt, daß die Verabreichung von menschlichem rIL-6 nach verschiedenen Vorschriften an Mäuse, denen D122-Zellen intravenös oder in die Pfote injiziert worden waren, die Malignität der Tumorzellen nicht beeinflußte (unveröffentlichte Ergebnisse). Diese Beobachtungen lassen sich entweder durch eine Unempfindlichkeit der D122-Zellen gegenüber einer direkten oder einer indirekten Wirkung (über das Immunsystem) von IL-6 oder durch Probleme erklären, die mit dem Verabreichungsverfahren in vivo zusammenhängen, z. B. eine kurze Halbwertszeit und unzureichende lokale Spiegel des systemisch injizierten Cytokins am Ort des Tumors. Es wäre außerordentlich wünschenswert, IL-6 in vivo konstitutiv zu produzieren und auf diese Weise die Probleme der systemischen Verabreichung von IL-6 zu umgehen.
- Die vorliegende Erfindung stellt einen Anti-Tumor-Impfstoff bereit, insbesondere für die Verhinderung und Hemmung von Metastasen, umfassend inaktivierte bösartige Krebszellen, in welche ein Gen insertiert wurde, welches das menschliche IL-6 codiert. Die Zellen sind vorzugsweise Tumorzellen aus dem Patienten, der geimpft werden soll, und werden vor der Verabreichung inaktiviert.
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- Fig. 1 zeigt die gleichbleibenden Spiegel von IL-6- (a) und β-Actin-mRNA- Transkripten (b) in IL-6-Transfektanten.
- Fig. 2 erläutert die Sekretion von IL-6 durch D122-Zellen und IL-6- Transfektanten unter Verwendung eines ELISA- und eines Biotest-Verfahrens.
- Fig. 2(a) zeigt das Ausmaß der IL-6-Sekretion ins Medium, gemessen durch ELISA-Tests.
- Fig. 2(b) zeigt die Wachstumshemmung bei IL-6-Transfektanten im Vergleich zu D122-Elterzellen und zu der negativen Transfektante DIL6-4.
- Fig. 2(c) zeigt eine direkte RIA-Analyse der Zelloberflächenexpression von H-2kb- und H-2Db-Antigenen.
- Fig. 3 zeigt das Wachstum von D122-Elterzellen, die mit exogenem menschlichem rIL-6 (2 bis 750 IU/ml) behandelt wurden, im Vergleich zu nicht-behandelten D122-Zellen.
- Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines clonogenen Tests von D122-Elterzellen und IL-6-Transfektanten.
- Fig. 5 zeigt den prozentualen Anteil von Makrophagen an den Zellen des Peritonealexsudats von Mäusen, denen 10&sup7; bestrahlte DIL6-7- und D122-Zellen verabreicht worden waren.
- Fig. 6 zeigt die Überlebenszeit-Kurven von C57BL/6-Mäusen, die zuvor mit bestrahlten und Mitogen-C-behandelten Tumorzellen immunisiert worden waren und denen 5 · 10&sup5; lebende hoch-metastatische D122-Zellen i. v. verabreicht worden waren.
- Fig. 7 zeigt Mittel- und Medianwert des Ausmaßes der Metastasen bei männlichen C57bl/6-Mäusen, denen D122-Zellen verabreicht und die anschließend mit D122- oder DIL6-7-Zellen immunisiert worden waren.
- Fig. 8 zeigt einen Vergleich der Sekretion der F10.9-IL-6-Transfektante mit der Sekretion von IL-6-transduzierten F10.9-Zellen.
- [0009] Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß bösartige Krebszellen, die genetisch manipuliert worden waren, so daß sie IL-6 konstitutiv produzieren, als ein wirksamer Anti-Tumor-Impfstoff eingesetzt werden können, insbesondere um die Entwicklung von Metastasen zu verhindern oder zu hemmen. Auf diese Weise wurden Lewis-Lungenkarzinom-D122-Zellen mit menschlicher IL-6-cDNA transfiziert, die an einen konstitutiven Promotor gekoppelt war, und die positiven Transfektanten zeigten eine verminderte Malignität und eine erhöhte Immunogenität. Die Herabsetzung der Malignität schien durch die Wachstumshemmung der transfizierten Zellen und die Stimulation der Immunantworten des Wirtes bewirkt zu werden.
- [0010] Bei der anti-metastatischen Immunisierung gemäß der Erfindung ist die Fähigkeit der Krebszellen, IL-6 zu produzieren, entscheidend für ihre Wirksamkeit zur Verhinderung von Metastasen, und es wurde gezeigt, daß die Überlebenszeit von krebskranken Tieren in Folge solcher Immunisierungsbehandlungen deutlich verlängert wurde.
- [0011] Außerdem wird in der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß die Behandlung mit IL-6-produzierenden Zellen in Tieren begonnen werden kann, die bereits einen Tumor von tastbarer Größe haben, und daß Metastasen dadurch verhindert werden können.
- [0012] Die Anti-Tumor-Impfstoffe gemäß der Erfindung umfassen inaktivierte bösartige Krebszellen, in welche ein Gen insertiert wurde, das menschliches IL-6 codiert, so daß eine konstitutive Produktion von menschlichem IL-6 in vivo erfolgt. Die Zellen sind Tu morzellen, die eine Fähigkeit zur Metastasenbildung oder die im wesentlichen keine Fähigkeit zur Metastasenbildung aufweisen, oder sie sind Nicht-Tumorzellen, wie primäre Fibroblasten oder Fibroblastenzellinien. Sie können von dem Patienten, der geimpft werden soll, oder von einem anderen Individuum erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Zellen Tumorzellen, die von einem soliden Tumor des Patienten, der geimpft werden soll, entnommen wurden.
- [0013] Das in die Zellen insertierte menschliche IL-6-Gen ist z. B. die IL-6-cDNA, deren Sequenz in der Europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0220574 offenbart wird. Die IL- 6-DNA kann in geeignete Vektoren eingefügt werden, z. B. eukaryotische Experssionsvektoren oder Retrovirusvektoren. Ein geeigneter eukaryotischer Vektor ist das in der Europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0326120 beschriebene Plasmid pSVß229, das die menschliche IL-6-cDNA unter der Kontrolle des SV40-frühen-Gen-Promotors enthält. Retrovirusvektoren, die eingesetzt werden können, sind die Vektoren, die auf den Molony-murinen Leukämievirus zurückzuführen sind, z. B. N2, Zip oder pZ1. Nachdem der Vektor, der das Konstrukt enthält, für die Expression präpariert wurde, kann das DNA-Konstrukt in den Wirt, z. B. in Tumorzellen, durch eine Vielzahl von geeigneten Verfahren eingeführt werden, z. B. durch Calciumphosphatfällung. Die Zellen werden üblicherweise mit dem geeigneten Vektor und einem Vektor, der ein Gen enthält, das ein Antibiotikum als selektierbaren Marker codiert, co-transfiziert, oder das Gen des selektierbaren Markers kann direkt mit der IL-6-DNA-Sequenz gekoppelt werden. Ein selektierbarer Marker, der in der Erfindung eingesetzt werden kann, ist das Gen, das die Gentamicin-Resistenz codiert, welches in dem Vektor pSV&sub2;-neo enthalten ist.
- [0014] Die gegen das Antibiotikum resistenten Clone werden auf die Expression von IL- 6-mRNA durchgemustert. Positive Clone werden gezüchtet und positive Transfektanten, d. h. transfizierte Zellen, die IL-6 produzieren und ins Medium sezernieren, werden selektiert und gezüchtet. Jedoch ist auch die Verwendung von Gemischen aus positiven und negativen oder geringe Mengen produzierenden Transfektanten in der Erfindung enthalten. Die IL-6-Transfektion von Tumorzellen des hoch-metastatischen, gering-immunogenen D122-Clons ergab Zellen, die in syngenen C57BL/6-Mäusen eine signifikant geringere Fähigkeit zur Metastasenbildung zeigten, wobei sowohl die experimentelle als auch die spontane Metastasierung betroffen war (Tabelle 2). Zwei der drei IL-6-Transfektanten, d. h. diejenigen, die große und mittlere Mengen IL-6 produzieren, zeigten außerdem eine signifikant niedrigere Karzinogenität (d. h. lokales Wachstum) im Vergleich zu den D122-Elterzellen und zu der negativen IL-6-Transfektante (Tabelle 2).
- [0015] Das Phänomen der verminderten Karzinogenität nach der Insertion des Cytokin- Gens in die Tumorzellen wurde durch andere Forscher für die Cytokine Gamma-IFN (7, 8) < IL-2 (9-11) und IL-4 (12) demonstriert. Jedoch wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, daß durch die Übertragung des IL-6-Gens auf Tumorzellen eine Anti-Tumor-Wirkung erreicht wird. Außerdem ist dies der einzige Beweis, daß die Insertion eines Cytokin-Gens zu einer signifikanten Suppression des metastatischen Wachstums führt. Es wurde gezeigt, daß bei den verschiedenen Cytokin- Transfektanten unterschiedliche Mechanismen wirken: Gamma-IFN- und IL-2- Transfektanten induzierten hauptsächlich eine spezifische cytotoxische T-Lymphocyten (CTL)-Aktivität, während IL-4 eine nicht-spezifische Anti-Tumor-Wirkung und Granulocyten-Infiltration induzierte. Bei der Übertragung des IL-6-Gens auf D122-Zellen scheint an der Reduktion der Karzinogenität und der Fähigkeit zur Metastasenbildung mehr als ein Mechanismus beteiligt zu sein.
- [0016] Die drei IL-6-produzierenden Transfektanten zeigten in vitro eine Wachstumshemmung, die mit der Menge des produzierten IL-6 in einem direkten Zusammenhang stand (Fig. 2). Jedoch schien die Wachstumshemmung nicht durch einen autokrinen Effekt über die Sekretion von IL-6 ins Medium bewirkt zu werden, da Antikörper, die die IL-6-Aktivität neutralisierten; die Wachstumshemmung der positiven IL-6-Transfektanten nicht aufhoben (Tabelle 1). Außerdem bewirkte die Gabe von exogenem menschlichem rIL-6 in einem großen Konzentrationsbereich keine Wachstumshemmung von D122-Zellen aus (Fig. 3). Somit scheint das Vorliegen von intrazellulärem IL-6 in D122- Zellen ein wachstumshemmendes Signal zu induzieren, entweder über eine eigene autokrine Schleife oder durch die endogene Induktion eines zweiten wachstumshemmenden Faktors in den Tumorzellen, der sezerniert wird und durch einen klassischen Weg über die Bindung an einen Membranrezeptor wirkt. DIL6-7 und DIL6-9 zeigten eine erhöhte Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle (Fig. 2c). Jedoch hatte auch hier, in Übereinstimmung mit der Wachstumshemmung der Transfektanten, exogen appliziertes rIL-6 keine Wirkung auf die Klasse-I-Expression von D122-Zellen.
- [0017] Die Hemmung der Karzinogenität und Metastasierung kann die Folge einer Hemmung der Proliferation von IL-6-Transfektanten sein, oder es können auch andere Mechanismen beteiligt sein. Die Beobachtung, daß die Reduktion der Karzinogenität bei immunkompetenten Mäusen stärker ausgeprägt ist als bei nackten Mäusen und daß die Suppression der Metastasierung und die Verlängerung der Überlebenszeit nach der Amputation nur in immunkompetenten Mäusen beobachtet wurde (Tabelle 3), zeigen, daß reife T-Zellen bei der Verminderung der Malignität eine signifikante Rolle spielen. Tatsächlich induzierten II-6-positive Transfektanten höhere Spiegel von Anti-Tumor-CTL als die D122-Elterzellen (Tabelle 4). Diese CTL-lnduktion könnte auf die direkte Wirkung des sezernierten IL-6 auf die Reifung von T-Zellen zurückzuführen sein, oder sie könnte auch der gesteigerten Immunogenität der Tumorzellen zuzuschreiben sein, die durch die Erhöhung der Expression von MHC-Klasse-1-Molekülen auf den hochpositiven IL-6-Transfektanten verursacht wird oder darauf zurückzuführen ist (Fig. 2c).
- [0018] Eine weitere Bestätigung für die Beteiligung von Gedächtnis-abhängigen Immunmechanismen an der verminderten Malignität von IL-6-Transfektanten kommt aus den Schutz-Experimenten. Fig. 6 zeigt, daß Mäuse, die mit dem inaktivierten, stark IL-6- produzierenden Stamm DIL6-7 immunisiert worden waren, einen Schutz gegen das metastatische Wachstum eines späteren Transplantats von Elterzellen aufwiesen. Es ist möglich, daß auch andere unspezifische und Gedächtnis-unabhängige Immunmechanismen an der Antwort auf IL-6-produzierende Tumorzellen beteiligt sind. Fig. 5 zeigt, daß die Zahl der peritonealen Makrophagen als Antwort auf eine i.p.-Injektion inaktivierter Tumorzellen signifikant höher war, wenn positive IL-6-Transfektanten injiziert wurden als wenn D122-Zellen injiziert wurden. Diese Makrophagen könnten an der Antigenpräsentation und der Induktion von T-Helferzellen beteiligt sein, oder sie könnten eine Tumorzellen-abtötende Aktivität darstellen.
- [0019] Angesichts der Immunantworten auf IL-6-produzierende Tumorzellen wurde getestet, ob diese Zellen zur Immuntherapie-Behandlung gegen die metastatische Verbreitung eines bereits etablierten elterlichen D122-Tumors eingesetzt werden können. Fig. 7 zeigt, daß die Immunisierung mit inaktivierten DIL6-7-Zellen, der hochpositiven IL-6-Transfektante, tatsächlich das metastatische Wachstum von D122-Zellen in Tumor-enthaltenden Mäusen signifikant reduzierte. Es war gezeigt worden, daß die Tumorzellen, auf die die Cytokine Gamma-IFN, IL-2 oder IL-4 übertragen worden waren, einen Schutz gegen die anschließende Infektion mit Elterzellen oder gegen gleichzeitig injizierte Elterzellen induzierten (7-12), wobei jedoch die immuntherapeutischen Effekte auf etablierte elterliche Tumoren für keine der bisher beschriebenen Cytokin-Gen- Insertionen in Tumorzellen gezeigt wurden.
- [0020] Jetzt kann eine anti-metastatische Immuntherapie durch zelluläre Impfstoffe aus Tumorzellen, die manipuliert sind, so daß sie IL-6 exprimieren, entweder alleine oder in Kombination mit Genen von MHC oder anderen Cytokinen, gemäß der Erfindung bereitgestellt werden. Durch die Insertion des Gens können im Unterschied zu einer systemischen Verabreichung von IL-6 optimale funktionelle Spiegel von IL-6 hauptsächlich am Ort der gewünschten Tumor-Immunzellen-Wechselwirkung erhalten werden.
- [0021] Die vorliegende Erfindung stellt erstmalig in der Krebstherapie einen erfolgreichen immunologischen Schutz bereit. Alle Arten von soliden Tumoren können behandelt werden, einschließlich Lungen-, Colon-, Brust-, Ovar-, Pankreas-, Leber-, Magen-, Nieren- oder Prostatakrebserkrankungen, Melanome und Lymphome.
- [0022] Die menschlichen IL-6-transfizierten Zellen, die in einem Anti-Tumor-Impfstoffpräparat eingesetzt werden sollen, werden vorzugsweise durch Gamma- oder Röntgenbestrahlung und/oder durch eine Behandlung mit Mitomycin-C durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, inaktiviert oder abgeschwächt.
- [0023] Die vorliegende Erfindung stellt Anti-Tumor-Impfstoffe bereit, die die IL-6- transfizierten Zellen, welche IL-6 konstitutiv produzieren, und gegebenenfalls einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Die Impfstoffe gemäß der Erfindung können durch verschiedene Verfahren und Applikationswege verabreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann die Verabreichung durch eine subkutane, intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion oder Infusion erfolgen. Die verabreichte Dosis ist vom Zustand des Patienten und der Schwere der Erkrankung abhängig. Einem Krebspatienten werden gemäß der Erfindung Anti-Tumor-Impfstoffe verabreicht, die 10&sup6; bis 10&sup9; Zellen, vorzugsweise 10&sup7; bis 10&sup8; Zellen, am stärksten bevorzugt 10&sup7; Zellen pro Dosis enthalten. Die Behandlung umfaßt gegebenenfalls mehrere Dosen in Abständen von jeweils 5 bis 7 Tagen.
- [0024] Die menschlichen IL-6-transfizierten Zellen gemäß der Erfindung werden in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an Krebs, z. B. an einem bösartigen soliden Tumor, leidet, zur Verhinderung und/oder Hemmung der Entwicklung von Metastasen eingesetzt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Entnahme von Tumorzellen aus dem Patienten durch Biopsie oder chirurgischen Eingriff; b) Dispergieren der Zellen in einem Medium; c) Insertieren eines Vektors, der das menschliche IL-6-Gen umfaßt, in die Zellen; d) gegebenenfalls Selektieren der positiven Transfektanten, die IL-6 ins Medium sezernieren; e) Inaktivieren der Transfektanten durch Gamma- oder Röntgenbestrahlung und/oder Behandlung mit Mitomycin-C; und f) Verabreichung einer wirksamen Menge der inaktivierten menschlichen IL-6-transfizierten produzierenden Zellen an den Patienten, wodurch eine Anti-Tumor-Immunantwort in dem Patienten induziert wird, so daß Tumormetastasen verhindert und/oder gehemmt werden.
- [0025] Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert. In den Beispielen wurden die folgenden experimentellen Methoden eingesetzt.
- [0026]
- a. Mäuse: Acht bis zwölf Wochen alte C57BL/6-Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine); CD1-Nu/Nu-Mäuse, gezüchtet im Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel.
- b. Tumorzellen: Zellen von hoch-metastatischen, gering-immunogenen D122- Clonen der 3LL-Karzinoms bzw. des B-16-Melanoms, die von C57BL/6 (H-2b) abstammen.
- c. Zellkulturen: Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gehalten, das angereichert war mit 10% hitzeinaktivertem fetalem Kälberserum (FCS) (Biological Industries, Beth Haemek, Israel, Chargen-Nr. 488908), 2 mM Glutamin, 1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,4% kombinierten Antibiotika. Die FNO.9-, D122- und IL-6-Gen-transfizierten Zellen waren frei von Mykoplasmen, dies wurde durch einen Mycotrim TC-Test (Hana Biologicals, Inc., Alameda, California) getestet.
- d. Plasmide: Der Vektor pSVβ&sub2;29, der ein 1,2 Kilobasen (kb)-großes menschliches IL-6-cDNA-Fragment mit der gesamten codierenden Sequenz, cloniert in das Plasmid pSVE3, stromabwärts des SV40-frühen-Gen-Promotors enthielt, wurde für die Transfektion verwendet. Die Herstellung des Vektors pSVβ&sub2;29 wird in der Europäischen Patentanmeldung beschrieben, die unter der Nr. EP 326 120 veröffentlicht ist. Der Vektor pSV&sub2;neo, der das Geneticin-Resistenz codierende Gen enthielt (6), wurde mit dem IL-6-Plasmid co-transfiziert.
- e. DNA-Transfektion: 20 ug des IL-6-Plasmids und 2 ug des neo-Plasmids wurden durch die Calciumphosphat-Technik in 5 · 10&sup5; D122- oder F10.9-Zellen transfiziert. Die Selektion erfolgte in einem Medium, das 400 ug/ml des Geneticin-Analogons G418 (Gibco) enthielt. Die transfizierten Clone wurden in einem Medium gehalten, das 130 ug/ml G418 enthielt.
- f. pZL: Retrovirus-Expressionsvektor für die Übertragung des Cytokin-Gens: pZL (*r1*) wurde freundlicherweise von Dr. Eta Livneh, Weizmann Institute, zur Verfügung gestellt. Der Vektor stammt von dem Molony-murinen Leukämievirus (Mo-MLV) und enthält nicht-codierende Mo-MLV-Sequenzen, d. h. die LTRs, Ψ-Verpackungssignale und andere regulatorischen Mo-MLV-Sequenzen, ein bakterielles Neomycin-Resistenz-. Gen (neo-Gen) und PBR-Sequenzen, umfassend den Replikationsursprung. pZL enthält auch den SV40-frühen-Gen-Promotor stromaufwärts des neo-Gens, und somit wird das neo-Gen durch diesen Promotor transkribiert. Ein 1,2 kbp-großes ClaI-gespaltenes DNA-Fragment, das die gesamte codierende Region der menschlichen IL-6-cDNA und außerdem einen Teil der 3'-untranslatierten Region, umfassend das Poly(A)- Additionssignal, codiert, wurde aus dem Vektor pSVβ&sub2;29 erhalten und in die einmalige XhoI-Stelle des pZL stromabwärts der 5'-LTR cloniert. In diesem Vektor (pZL-IL6) wird die IL-6-cDNA durch die 5'-LTR transkribiert, und das neo-Gen wird durch den SV40- Promotor transkribiert.
- g. Herstellung von Virus-Ansätzen: Die Retrovirus-Konstrukte wurden unter Verwendung von Helferfreien Verpackungszellinien durch das "trans-Infektions"-Verfahren (*r2*) in das entsprechend Virus umgewandelt, wobei die Vektor-DNA in die ecotrope Verpackungszellinie E86 (*r3*) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. A. Bank, Columbia University, New York) transfiziert wurde und zwei Tage später ein Virus-enthaltender 24-Stunden-Überstand der transient transfizierten E86-Zellen geerntet und für die Transduktion von AM12-Zellen (*r4*) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Arthur Bank) eingesetzt. Kolonien von transduzierten AM12-Zellen wurden durch G418-Selektion isoliert und zu Zellinien expandiert, und die zellfreien Überstände wurden auf das Vorliegen des Virus getestet. Überstände von Zellinien, die hohe Virustiter sezernierten, wurden für die Infektion von Tumorzellen verwendet.
- h. Retrovirus-Transduktion von Tumorzellen: 5 · 10&sup4; F10.9-Zellen wurden in 60- mm-Platten ausgesät. Zwölf Stunden später wurde das Medium entfernt und 3 ml der unverdünnten Virus-enthaltenden Überstände oder von Verdünnungen von 1/10 bis 1110 der Überstände zu den Platten in Gegenwart von 8 ug/ml Polybrene (Sigma) zugegeben. Vier bis sechs Stunden später wurden die Überstände entfernt und Standardmedium zu den Platten zugefügt, das 24 Stunden später durch Selektionsmedium ersetzt wurde, welches 800 ug/ml des Geneticin-Analogons G418 (Gibco) enthielt. Neoresistente Kolonien wurden isoliert und auf die Expression des übertragenen Gens durchgemustert. Transduzierte F10.9-Zellen wurden in Erhaltungsmedium gezüchtet, das 260 ug/ml G418 enthielt.
- i. RNA-Blot-Analyse: Die Gesamt-RNAs wurden isoliert, wie von Chirgwin et al. (13) beschrieben, und die RNAs wurden einer Elektrophorese auf 1% Agarose/2,2 M Formaldehyd-Gelen unterworfen, auf Nitrocellulose geblottet und in 50% (VoLNol.) Formamid/10% (Gew./Vol.) Dextransulfat bei 42ºC hybridisiert. Die IL-6-cDNA-Insertion und das β-Actin-Plasmid wurden durch Nick-Translation markiert.
- j. IL-6-Nachweis in Überständen von Zeilen mit dem übertragenen IL-6-Gen: Zellen mit dem übertragenen IL-6-Gen und elterliche Tumorzellen wurden in 100-mm- Platten mit Standardmedium (ohne Geneticin) mit 0,4 bis 0,8 · 10&sup6; Zellen pro Platte plattiert. Drei Tage später wurden die Überstände gewonnen. ELISA-Test: Der IL-6- Gehalt der Proben wurde durch einen nicht-kompetitiven ELISA-Test bestimmt, wobei der an eine feste Phase immobilisierte monoclonale Antikörper 34.1 verwendet wurde. Die Herstellung des monoclonalen Antikörpers 34.1 wird in der Europäischen Patentanmeldung Nr. EP 326120 beschrieben. Das Hybridom 34.1 wurde bei der "Collection Nationale des Cultures de Microorganismes" - CNCM, Institut Pasteur, Paris, am 14.11.88 unter der Nr. I-813 hinterlegt. Ein mg IL-6 entspricht 10&sup7; Bezugseinheiten (IU), bestimmt im Vergleich zum Standard 88/514 (National Institute of Biological Standards and Controls, Potters Bar, UK). Biologischer Test: Die IL-6-abhängige murine Hybridomzellinie B9 wurde zur Titration der IL-6-Spiegel verwendet. Die Proliferation der B9-Zellen in Gegenwart von IL-6-enthaltenden Überständen wurde durch die Aufname von ³H-Thymidin gemessen.
- k. In vitro-Wachstum und clonogene Tests; koloriometrische Wachstumstests: D122-IL-6-Transfektanten wurden vor dem Test einer einmaligen Passage in Standardmedium ohne Geneticin unterworfen und anschließend in Costar-Platten mit 24 Vertiefungen mit 5000 oder 10000 Zellen pro Vertiefung in Standardmedium plattiert. Vier bis fünf Tage nach der Plattierung wurden die Zellen mit 12,5% Glutaraldehyd fi xiert, mit 0,1% Kristallviolett gefärbt und in H&sub2;O gewaschen. Die Farbe wurde in 10% Essigsäure extrahiert und die optische Dichte (570 nm) gemessen. Wachstumstests mit einem Anti-IL-6-Antikörper wurden durchgeführt, indem 100 neutralisierende Einheiten/Vertiefung von 34.1, einem monoclonalen Antikörper, der die IL-6-Aktivität neutralisiert, an den Tagen 1 und 3 zu den Vertiefungen des Wachstumstests zugegeben wurden. Wachstumstests mit D122-Zellen, wobei menschliches rIL-6 (hergestellt in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters, Interpharm Laboratories Ltd., Nes Ziona, Israel) exogen zugesetzt wurde, wurden nach der gleichen Vorschrift mit Mengen von IL-6 im Bereich von 2 bis 750 IU/ml durchgeführt. Clonogene Tests: IL-6-Transfektanten und D122-Elterzellen wurden mit 100, 200 und 400 Zellen pro Costar-Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät. 12 bis 14 Tage später wurden die Zellen wie in den Wachstumstests fixiert und gefärbt und die Kolonien gezählt. Die clonogenen Tests von D122 mit exogen zugesetztem menschlichem rIL-6 erfolgten durch das gleiche Verfahren mit Mengen von IL-6 im Bereich von 1 bis 1500 IU/ml.
- l. Nachweis von Zelloberflächenantigenen: Die monoclonalen Antikörper 20-8-4 (Anti-H-2Kb) und 28-14-8 (Anti-2Db) wurden aus Aszitesflüssigkeiten auf Protein A- Sepharose gereinigt. Für direkte Radioimmuntests wurden die gereinigten Antikörper mit Ha ¹²&sup5;I durch Chloramin T markiert. Die Zellsuspensionen (4 · 10&sup5; Zellen in 0,1 ml PBS pro Röhrchen) wurden mit 0,5 ug markierten Antikörpern in dreifacher Ausführung in mit Rinderserumalbumin vorbeschichteten Röhrchen zwei Stunden bei 0ºC inkubiert. Die Zellen wurden viermal mit PBS/0,02% Natriumazid gewaschen und in einem Gamma-Szintillationszähler gezählt.
- m. Tumorwachstum und spontane Metastasierung: Den Mäusen, 7 bis 10 in jeder Versuchsgruppe, wurden in die Pfote (i.f.p.) 2 · 10&sup5; Zellen pro Maus injiziert. Das lokale Tumorwachstum wurde bestimmt, indem der Durchmesser der Pfote mit einem Tastzirkel gemessen wurde. Zur Messung der Lungenmetastasen wurde das Tumor- enthaltende Bein amputiert (unter dem Knie), wenn der Tumor einen Durchmesser von 8 bis 9 mm erreicht hatte, und die Mäuse 26 bis 29 Tage nach der Amputation getötet oder die Überlebenszeit registriert. Das Ausmaß der Metastasen wurde durch Wiegen der Beine bestimmt.
- n. Experimentelle Metastasierung: Den Mäusen in jeder Versuchsgruppe wurden 5 · 10&sup5; D122- oder 5 · 10&sup4; F10.9-Tumorzellen intravenös (i.v.) injiziert. Die Mäuse wurden 30 bis 35 Tage nach der Injektion getötet oder die Überlebenszeit registriert. Das Ausmaß der Metastasen wurde durch Wiegen der Lungen bestimmt.
- o. Immunisierungen: Mäuse wurden dreimal jeweils im Abstand von sieben Tagen intraperitoneal (i.p.) immunisiert mit 2 · 10&sup6; Zellen, die bestrahlt (5000 Rad) und mit Mitomycin-C behandelt worden waren (80 mg/5 bis 10 · 10&sup6; Zellen/ml für eine Stunde bei 37ºC). Zehn Tage nach der dritten Booster-Injektion erhielten die Mäuse i.v.- Injektionen mit D122-Zellen (5 · 10&sup5;), oder die Milzen wurden für In vitro-Cytotoxizitätstests entnommen.
- p. In vitro-Cytotoxizitätstest: Milzzellen wurden aus den immunisierten Mäusen zehn Tage nach der dritten Boosterung entnommen und in vitro auf einschichtige Zellrasen von bestrahlten Tumorzellen (5000 Rad), die zuvor mit Mitomycin-C behandelt worden waren (80 mg/ml), in RPMI-Medium, angereichert mit 10% FCS, 2 mM Glutamin und 2 · 10&supmin;&sup5; M β-Mercaptoethanol, fünf Tage inkubiert. Lebensfähige Lymphocyten wurden durch "Lymphoprep"-Zentrifugation (Cedarlane, Ontario, Kanada) abgetrennt und in unterschiedlichen Verhältnissen mit 5000 [³&sup5;S]-L-Methionin- markierten Zielzellen in U-förmigen Mikrotitervertiefungen gemischt. Die Platten wurden 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Züchtung wurde durch eine zehnminütige Zentrifugation bei 300 · g und 4ºC beendet und 100 ul der Überstände in einem Gamma- Szintillationszähler gezählt. Die prozentuale spezifische Lyse wurde wie folgt berechnet:
- Freisetzung von [³&sup5;S] im Experiment - Spontane Freisetzung · 100
- Die maximale Freisetzung wurde durch Solubilisierung der Zielzellen in 0,05 M NaOH bestimmt.
- q. Intraperitoneale Anreicherung von Makrophagen nach der Injektion von Tumorzellen: 10&sup7; bestrahlte (10000 Rad) D122- oder DIL6-7-Zellen wurden in C57BL/6- Mäuse i.p. injiziert. An den Tagen 1, 3 und 5 nach der Injektion wurden die Peritonealexsudate entnommen. Um das Ausmaß der Makrophagen-Anreicherung in der Bauchhöhle festzustellen, wurde eine cytochemische Analyse auf unspezifische Esterasen mit α-Naphthylbutyrat nach dem Verfahren von Kosky durchgeführt. Mit dem Verfahren können die gefärbten Makrophagen in fixierten Ausstrichen identifiziert werden, wohingegen Lymphoidpopulationen und Erythrocyten ungefärbt bleiben. Die vorliegenden Tumorzellen konnten durch ihre große Größe und ihren glatten Kern identifiziert werden und wurden von der Zählung ausgenommen.
- r. Immuntherapie: Die Mäuse erhielten i.f.p.-Injektionen 2 · 10&sup5; D122-Zellen. Beginnend am Tag 11 nach der Injektion, wenn tastbare Tumoren nachgewiesen werden konnten, wurden die Mäuse wöchentlich sechsmal mit 2 · 10&sup6; inaktivierten Tumorzellen (mit Mitomycin-C behandelt, wie beschrieben) i.p. immunisiert oder mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung behandelt (Kontrollgruppe). Während der Immunisierungen wurden die Primärtumoren in der Pfote amputiert, wenn sie einen Durchmesser von 8 bis 9 mm erreicht hatten. Die Mäuse wurden 26 Tage nach der Amputation getötet und die Lungen gewogen.
- D122-Zellen wurden mit dem Plasmid pSVβ29, welches eine menschliche IL-6- cDNA unter der Kontrolle des SV40-frühen-Gen-Promotors enthält, und mit dem Plasmid pSV2-neo co-transfiziert, wie in der vorstehenden Methode (e) beschrieben. 20 neo-resistente Clone wurden auf die Expression von IL-6-mRNA durchgemustert. Die RNAs wurden durch das Verfahren von Chirgwin hergestellt und einer Elektrophorese unterworfen, wie in der vorstehenden Methode (f) beschrieben. In Fig. 1a ist die Expression des Transkripts in den verschiedenen Transfektanten dargestellt, nachdem der Blot mit einem markierten IL-6-cDNA-Insert hybridisiert, in 0,1 · SSC (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0) bei 50ºC gewaschen und zwei Tage einer Autoradiographie unterworfen wurde. In Fig. 1b wurde der Blot mit einem markierten β-Actin- Plasmid hybridisiert, in 0,5 · SSC bei 65ºC gewaschen und einen Tag exponiert.
- [0028] Drei positive Clone (DIL6-9, DIL6-7 und DIL6-2) und ein negativer Clon (DIL6-4) wurden ausgewählt. Fig. 1 zeigt die Expression des 1,2 kb-IL-6-Transkripts der negativen und positiven IL-6-Transfektanten. Unter den positiven Transfektanten zeigt DIL6-7 die höchsten gleichbleibenden Spiegel von IL-6-mRNA, DIL6-9 exprimiert mittlere Spiegel und DIL6-2 zeigt die niedrigsten Spiegel von IL-6-mRNA. DIL6-4, die negative Transfektante, exprimiert keine IL-6-mRNA. In den Bahnen DIL6-2, -7, -9 kann außerdem ein nicht-prozessiertes Transkript (ca. 3,2 kb) festgestellt werden.
- [0029] Die Sekretion von IL-6 wurde getestet, wobei sowohl ein ELISA als auch ein biologischer Test verwendet wurden, wie in der vorstehenden Methode (g) beschrieben. Fig. 2(a) zeigt das Ausmaß der IL-6-Sekretion, gemessen in den Überständen durch ELISA-Tests. Zur Gewinnung der Überstände wurden die Zellen mit 0,8 · 10&sup6; Zellen pro 100-mm-Platte angesät und der Überstand drei Tage später gewonnen. Die Sekretion von DIL6-2, 9 wurde aus den Überständen berechnet, die unter Verwendung eines Amicon 8400 mit einem 10 KD-Filter eingeengt wurden. Das Ausmaß der Sekretion entsprach den Spiegeln des IL-6-mRNA-Transkripts und lag in den Überständen von positiven Transfektanten im Bereich von 0,5 bis 3,1 IU/ml. Die negative Transfektante DIL6-4 und die D122-Elterzellen sezernierten kein IL-6 ins Medium. Biologische Tests bestätigten diese Ergebnisse, wobei jedoch die IL-6-Spiegel in den Überständen der stark- bis mittel-positiven IL-6-Transfektanten (DILB-7 bzw. DIL6-9) signifikant höher lagen als in den Überständen der schwach-positiven IL-6-Transfektante DIL6-2 (nicht gezeigt).
- [0030] Wachstumshemmung - Um zu testen, ob die IL-6-Produktion das Wachstum der positiven Transfektanten in vitro beeinflußt, wurden Wachstumstests durchgeführt, wobei eine Zellzählung in einem Hämozytometer und außerdem ein kolorimetrischer Test unter Einsatz von Kristallviolett erfolgten. Fig. 2(b) zeigt die Wachstumshemmung von IL-6-Transfektanten im Vergleich zu der negativen Transfektante DIL6-4 und zu den D122-Elterzellen, wobei der Versuch wie in der vorstehenden Methode (h) durchgeführt wurde. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt aus vier verschiedenen kolorimetrischen Tests dar. Eine Wachstumshemmung von 43%, 32% und 17% wurde für DIL6- 7, DIL6-9 bzw. DIL6-2 im Vergleich zu der negativen Transfektante DIL6-4 beobachtet, die genauso wie die D122-Elterzellen wuchs (alle Clone waren frei von Mykoplasmen, vgl. Methoden). Diese Wachstumsunterschiede waren statistisch signifikant, wie im repräsentativen Experiment gezeigt, und sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1 In vitro-Wachstum und clonogene Eigenschaften von D122-Zellen und IL-6- Transfektanten
- [0031] Wachstumstest von D122-Zellen und IL-6-Transfektanten in Abwesenheit und in Gegenwart von 34.1, einem monoclonalen Antikörper, der menschliches IL-6 neutralisiert
- Die Tests wurden durchgeführt, wie in der vorstehenden Methode (h) beschrieben. Der T-Test erfolgte mit den arithmetischen Mittelwerten der optischen Dichten von D122-Zellen und IL-6-Transfektanten, die in Abwesenheit des Antikörpers wuchsen. Die clonogenen Tests mit D122-Zellen und IL-6-Transfektanten wurden durchgeführt, wie in der vorstehenden Methode (b) beschrieben. Interessanterweise hatte die Zugabe von exogenem menschlichem rIL-6 in Spiegeln von 2 bis 750 IU/ml keinen Einfluß auf das in vitro-Wachstum von D122-Elterzellen im Vergleich zu unbehandelten D122-Zellen. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Zusammenfassung von vier Wachstumstests. Um festzustellen, ob die Wachstumshemmung der positiven IL-6-Transfektanten auf IL-6 im Medium zurückzuführen ist, wurden Wachstumstests in Gegenwart des monoclonalen Anti-IL-6-Antikörpers 34.1 durchgeführt.
- [0032] Tabelle 1 zeigt ein repräsentatives Experiment. Im Muster der Wachstumshemmung der Transfektanten, die in Gegenwart oder in Abwesenheit des Antikörpers wuchsen, waren keine Unterschiede festzustellen. Um zu testen, ob die beobachtete Wachstumshemmung der Transfektanten bei einer geringeren Zelldichte stärker ausgeprägt war, wurde die Koloniebildung wie in der vorstehenden Methode (h) untersucht, indem 200 Zellen pro Vertiefung in Costar-Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät und die Kolonien zwölf Tage später nach Fixierung und Färbung der Zellen gezählt wurden. Die Zahl der wachsenden Kolonien war bei den negativen und positiven Transfektanten und den D122-Elterzellen ähnlich (Tabelle 1), jedoch zeigten die IL-6-produzierenden Transfektanten DIL6-7 und DIL6-9 kleinere Kolonien als die D122-Elterzellen, wie in der Fig. 4 dargestellt, wo für jeden Clon zwei repräsentative Vertiefungen wiedergegeben sind. Die Größe der einzelnen Zellen, die durch ein Lichtmikroskop und durch Messung der Vorwärtsstreuung in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) festgestellt wurde, war bei allen Clonen ähnlich. Somit ist der Unterschied in der Koloniegröße den unterschiedlichen Zellzahlen zuzuschreiben, die jeweils eine Kolonie bilden. Clonogene Tests mit D122-Zellen, die mit exogenem rIL-6 mit 1 bis 1500 IU/ml behandelt wurden, zeigten keine Beeinflussung der Zahl oder Größe der Kolonien (nicht gezeigt).
- [0033] D122-Zellen exprimieren niedrige Spiegel des H-2Kb-MHC-Klasse-I-Antigens und mittlere Spiegel des H-2Db-Antigens (4). Um festzustellen, ob die IL-6-Produktion die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen beeinflußt, wurden Radioimmuntests (RIA) durchgeführt, wie in der vorstehenden Methode (i) beschrieben, wobei die monoclonalen Antikörper Anti-H-2Kb (20-8-4) und Anti-H-2Db (28-14-8) verwendet wurden (14). Fig. 2c zeigt, daß der mäßig IL-6-exprimierende DIL6-9 die Antigene H-2Kb und -Db 2,5- bis 3-mal stärker exprimiert und daß der stark IL-6-exprimierende DIL6-7 die zwei Antigene 4,5-mal stärker exprimiert. Die Verabreichung von menschlichem rIL-6 im Bereich von 100 bis 5000 IU/ml an D122-Zellen bewirkte keine Änderung der Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen (nicht gezeigt).
- [0034] Das Wachstum und die Fähigkeit zur Metastasenbildung von IL-6-Transfektanten in syngenen C57BL/6-Mäusen wurden untersucht, wie in den vorstehenden Methoden (j) und (k) beschrieben. Tabelle 2 zeigt eines von drei ähnlichen Experimenten. Primärtumoren der mäßig und der stark IL-6-produzierenden Zellen DIL6-2, DIL6-9 und DIL6-7 wuchsen langsamer als die negative Transfektante DIL6-4 und die D122- Elterzellen, dies wird durch die Anzahl der Tage bis zur Amputation von 8- bis 9-mm- Tumoren verdeutlicht. In einem anderen Experiment wuchsen die Pfoten von Mäusen, denen DIL6-7 injiziert worden war, innerhalb von 47 ± 2,8 Tagen auf einen Durchmesser von 8 bis 9 mm, während die Pfoten von Mäusen, denen DIL6-4 injiziert worden war, bereits nach 27,6 ± 1,6 Tagen auf 8 bis 9 mm gewachsen waren. Die schwach IL- 6-produzierenden Zellen DIL6-2 wuchsen ähnlich oder sogar etwas schneller als die negativen Kontrollen (DIL604 und D122). Die Unterschiede in der Wachstumsgeschwindigkeit waren statistisch signifikant (p < 10&supmin;³ für DIL607, -9 im Vergleich zu DIL6- 4, wie für die Ergebnisse in Tabelle 2 errechnet, wobei ein Wilcoxon-Test ("Wilcoxon rank sum test") verwendet wurde).
- [0035] Die spontane Metastasierung wurde 26 bis 28 Tage nach der Amputation der Tumor-enthaltenden Pfoten untersucht, zu diesem Zeitpunkt verendeten die Kontrollgruppen (DIL604 und D122) mit einem schweren Befall an Lungenmetastasen. DIL6-2 zeigten einen gering-metastatischen Phänotyp, während DIL7-8, -9 zu diesem Zeitpunkt nicht-metastatisch waren. Die experimentelle Metastasierung wurde 30 bis 35 Tage nach der i.v.-Injektion untersucht und zeigte ähnliche Ergebnisse, d. h. die Kontrollgruppen verendeten hoch-metastatisch, DIL6-2 war gering-metastatisch und DIL6-7, -9 waren nicht-metastatisch.
- [0036] Experimente zur Überlebenszeit zeigten, daß die Mäuse, denen DIL6-7-, 9- Zellen i. v. injiziert worden waren, 70 bis 90 Tage nach der Injektion verendeten, während die Kontrollgruppen 30 bis 35 Tage nach der Injektion verendeten. Die Überlebenszeit von Mäusen, denen DIL6-7, -9 in die Pfoten injiziert worden waren, lag im Bereich von 95 bis 120 Tagen nach der Injektion (8 von 27 Mäusen, denen DIL6-7 injiziert worden war, waren nach 120 Tagen nicht-metastatisch), im Vergleich zu einer Überlebenszeit von 53 bis 57 Tagen in den Kontrollgruppen (nicht gezeigt). Tabelle 2 Bösartige Phänotypen von D122 und IL-6-Transfektanten in syngenen C57BL/6-Mäusen
- [0037] Acht Mäuse in jeder Versuchsgruppe erhielten i.f.p.-Injektionen mit 2 · 10&sup5; Zellen (spontane Metastasierung) oder i.v.-Injektionen mit 5 · 10&sup5; Zellen (spontane Metastasierung). Zur Bestimmung der spontanen Metastasierung wurden die Tumor- enthaltenden Pfoten amputiert, wenn der Tumor einen Durchmesser von 8 bis 9 mm erreicht hatte, und die Mäuse 26 Tage nach der Amputation getötet. Zur Bestimmung der experimentellen Metastasierung wurden die Mäuse 35 Tage nach der Injektion getötet.
- [0038] Um zu untersuchen, ob die Hemmung des Wachstums und der metastatischen Ausbreitung nur auf der Hemmung der Zellproliferation beruht oder ob auch Mechanismen beteiligt sind, die mit dem Immunsystem zusammenhängen, wurden DIL6-4- und DIL6-9-Zellen in syngene C57BL/6-Mäuse und in Thymus-, reife T-Zellenfreie CD1- Nu/Nu-Mäuse injiziert. Tabelle 3 zeigt, daß das Primärtumorwachstum vvn DIL6-9 im Vergleich zu DIL6-4 vermindert ist, sowohl in C57BL/6- als auch in CD1-Nu/Nu- Mäusen, wobei jedoch der Effekt in den immunkompetenten Mäusen stärker ausgeprägt ist. Die Überlebenszeit nach der Amputation der DIL6-4-injizierten Mäuse bei den CD1-Nu/Nu-Mäusen ...,
- während der Unterschied bei den immunkompetenten Mäusen signifikant war. Somit kann postuliert werden, daß reife T-Zellen bei der Reduktion der Malignität in IL-6- sezernierenden Zellen eine Rolle spielen. Tabelle 3 Bösartiger Phänotyp von D122-IL-6-Transfektanten in CD1-Nu/Nu- und syngenen C57BL/6-Mäusen
- [0039] Zehn Mäuse in jeder C57BL/6-Versuchsgruppe und sieben Mäuse in jeder Nu/Nu-Gruppe erhielten i.f.p.-Injektionen mit 2 · 10&sup5; DIL6-4- oder DIL6-9-Zellen. Die Tumor-enthaltenden Pfoten wurden amputiert, wenn der Tumor einen Durchmesser von 8 bis 9 mm erreicht hatte. Die Tage bis zur Amputation und die Überlebenszeit nach der Amputation wurden festgestellt. Die Unterschiede im Wachstum oder in der Überlebenszeit von DIL6-9 im Vergleich zu DIL6-4 in C57BL/6- oder Nu/Nu-Mäusen wurden durch einen Wilcoxon-Test ("Wilcoxon rank sum test") statistisch analysiert.
- IL-6-produzierende transfizierte Zellen, die durch Bestrahlung und Mitomycin-C inaktiviert wurden, aktivieren mehr cytotoxische Lymphocyten (CTL) und bewirken die Anreicherung von mehr Makrophagen als die nicht-produzierenden Zellen. Um die Beteiligung von cytotoxischen T-Zellen an der verminderten Malignität von IL-6- Transfektanten zu testen, wurden in vitro-Cytotoxizititätstests, wie in der vorstehenden Methode (m) beschrieben, mit Milzzellen von Mäusen durchgeführt, die immunisiert worden waren, wie vorstehend in (I) beschrieben wird. Tabelle 4 zeigt einen repräsentativen Test. Die Immunisierung mit IL-6-Transfektanten induzierte erhöhte Spiegel von cytotoxischen Lymphocyten (CTLs), welche negative und positive IL-6-Tranfektanten wirksamer abtöteten als die durch D122-Elterzellen induzierten CTL. DIF1 (mit Gamma- IFN-cDNA transfizierte D122-Zellen, die hohe Spiegel von MHC-Klasse-1-Antigenen exprimieren) war ein empfindlicheres Ziel für diese CTLs als IL-6-Transfektanten. YAC- 1-Zellen, die ein empfindliches Ziel für die NK-Aktivität sind, wurden durch diese CTLs nicht lysiert. Tabelle 4 Lytische Aktivität in vitro von CTLs, die durch D122-Zellen und IL-6-Transfektanten induziert wurden
- [0041] Die Werte zeigen die prozentuale spezifische Lyse, die mit den Verhältnissen von Effektor- zu Zielzellen (E/T-Verhältnisse) von 100 : 1 und 50 : 1 erhalten wurde. Die mit [³&sup5;S]-Methionin markierten Zielzellen wurden in einem 16-Stunden-Test mit Effektorzellen umgesetzt. Die cytolytische Aktivität auf YAC-1 wurde nach zehn Stunden Inkubation bestimmt. Der prozentuale Fehler lag bei den Mittelwerten aus den dreifach ausgeführten Tests unter 5%.
- [0042] Da bekannt ist, daß IL-6 pleiotrope Effekte auf das Immunsystem ausübt, wurde durch die vorstehende Methode (n) auch getestet, ob IL-6-sezernierende Tumorzellen die Ansammlung von Makrophagen in höheren Spiegeln bewirken als die Elterzellen. D122- oder DIL6-7-Zellen wurden nach der Bestrahlung i.p. injiziert. Die Peritonealexsudate wurden an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Injektion entnommen und die Zellen auf unspezifische Esterasen angefärbt.
- [0043] Fig. 5 zeigt den prozentualen Anteil von Makrophagen an den Zellen des Peritonealexsudats von Mäusen, denen D122- und DIL6-7-Zellen injiziert worden waren. Der prozentuale Anteil von Makrophagen ist der prozentuale Anteil von Esterase- positiven Zellen in den Exsudaten (die vorliegenden Tumorzellen wurden von der Zählung ausgenommen). Der prozentuale Anteil von Makrophagen in den Peritonealexsudaten von naiven Mäusen beträgt 5%. Für jeden Punkt in der Abbildung wurden sechs Felder mit 100 Zellen gezählt und der Mittelwert ± S. D. berechnet. Am Tag fünf wurde eine Erhöhung des prozentualen Anteils der peritonealen Makrophagen sowohl bei D122- als auch bei DIL6-7-injizierten Mäusen festgestellt, wobei jedoch bei den D122- injizierten Mäusen 40% der Zellen des Peritonealexsudats auf unspezifische Esterasen angefärbt wurden, während bei den DIL6-7-injizierten Mäusen 66% der Zellen des Peritonealexsudats Esterase-positiv waren.
- [0044] Da vorstehend gezeigt wurde, daß IL-6-Transfektanten im Wirt Immunantworten stimulieren, wurde als nächstes getestet, ob sie gegen D122-Elterzellen immunisieren können. C57BL/6-Mäuse wurden dreimal mit DIL6-2-, 7- und D122-Zellen i.p. immunisiert, wie in der vorstehenden Methode (1) beschrieben. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung erhielten die Mäuse eine i.v.-Injektion mit lebenden D122-Zellen, anschließend wurde die Überlebenszeit der Mäuse festgestellt. Fig. 6 zeigt die Überlebenszeit-Kurven der Mäuse, die mit bestrahlten und Mitomycin-C-behandelten Tumorzellen vorimmunisiert und mit 5 · 10&sup5; lebenden D122-Zellen i.v. infiziert worden waren. Am Tag 160 lebten 6 von 7 Mäusen, die mit DIL6-7 immunisiert worden waren, und sie waren frei von Metastasen, während nur eine von sieben Mäusen, die mit D122 immunisiert worden waren, nach 120 Tagen noch lebte. Die Immunisierung mit dem schwach IL-6-exprimierenden DIL6-2 ergab nur einen unvollständigen Schutz (3 von 7 Mäusen überlebten 120 Tage ohne Metastasen). Dies zeigt, daß die Vorimmunisierung mit IL-6- produzierenden transfizierten Zellen die Mäuse in dem Versuch der experimentellen Metastasierung und der verlängerten Überlebenszeit gegen die hoch-metastatischen D122-Zellen schützt.
- [0045] Außerdem wurde in einem "Immuntherapie-Verfahren" getestet, ob die IL-6- Transfektanten Tumor-enthaltende Mäuse gegen die metastatische Ausbreitung von Elterzellen schützen können. Männliche C57BL/6-Mäuse erhielten i.f.p.-Injektionen mit 2 · 10&sup5; lebenden D122-Zellen, und elf Tage nach der Injektion, wenn tastbare lokale Tumoren festgestellt werden konnten, wurden die Mäuse wöchentlich, sechs Wochen lang, mit i.p.-Injektionen von 2 · 10&sup6; Mitomycin-C-behandelten D122- und DIL6-7-Zellen immunisiert. Die Kontrollgruppe erhielt PBS-Injektionen. Die Immunisierung hatte keinen Einfluß auf das Wachstum der Primärtumoren in der Pfote. Die Primärtumoren wurden amputiert und die Mäuse 26 Tage nach der Amputation getötet, zu diesem Zeitpunkt verendeten die nicht-immunisierten Mäuse mit einem schweren Befall an Lungenmetastasen. Die Immunisierung mit D122-Zellen schützte nur unwesentlich gegen die metastatische Ausbreitung der lokalen Elterzellen, während die Immunisierung mit der positiven IL-6-Transfektante DIL6-7 das Ausmaß der Metastasen signifikant verminderte (Fig. 7). Sieben von 13 Lungen wogen weniger als 271 mg (das normale Lungengewicht von vier bis fünf Monate alten männlichen Mäusen beträgt etwa 200 mg), und vier der sieben Lungen waren vollständig frei von Metastasen. Wenn ein ähnliches Experiment mit CD1-Nacktmäusen durchgeführt wurde, konnten keine therapeutischen Effekte festgestellt werden. Das metastatische Wachstum der D122-Zellen war in behandelten und nicht-behandelten nackten Mäusen gleich hoch (nicht gezeigt).
- [0046] Somit induzierten die IL-6-Transfektanten in vivo Schutzmechanismen, durch welche die Empfänger gegen die metastatische Ausbreitung von hoch-metastatischen Elterzellen geschützt wurden.
- [0047] F10.9 ist ein gering-immunogener und hoch-metastatischer Clon des B16-F10- Melanoms. F10.9-Zellen wurden mit dem Plasmid pSVβ&sub2;9, das eine menschliche IL-6- eDNA enthält, und mit dem Plasmid pSV&sub2;-neo co-transfiziert. 15 neo-resistente Clone wurden auf die Sekretion von IL-6 durchgemustert und ein positiver Clon, FIL6-8, für die weitere Charakterisierung ausgewählt. F10.9-Zellen wurden auch mit Virusansätzen transduziert, die den Retrovirus-Experssionsvektor pZL-IL6 enthielten (vgl. Methoden), die aus mit dem Vektor trans-infizierten AM12-Zellen erhalten wurden, und die Clone FIL6-23, 25, 29 und 30 wurden isoliert. F10.9-neo ist ein Pool von F10.9-Zellen, die nach der Transduktion mit einem Virusansatz isoliert wurden, der den Retrovirusvektor pZL enthielt. Die F10.9-neo-Zellen werden bei Untersuchung der Wirkung der Infektion und der Expression des Neomycin-Resistenz-Gens auf die Eigenschaften von F10.9- Zellen als Kontrolle eingesetzt.
- [0048] Die IL-6-Spiegel in den Überständen von Zellen mit dem übertragenen IL-6-Gen wurden getestet, wobei die IL-6-abhängige murine Hydridomzellinie B9 verwendet wurde. Fig. 8 zeigt, daß die Sekretion der F10.9-IL-6-Transfektante signifikant geringer ist als die Sekretion von IL-6-transduzierten F10.9-.Zellen. Ein sehr geringer Spiegel von IL-6 (< 0,03 IU/ml) wurde im Überstand der F10.9-Zellen selbst gefunden.
- [0049] Die IL-6-Transfektante FIL6-8 wuchs ähnlich oder sogar etwas schneller als die negativen Kontrollgruppen (F10.9 und F10.9-neo), während die IL-6-transduzierten Zellen etwas langsamer wuchsen als die Kontrollgruppen (Tabelle 5). Die spontane Metastasierung wurde 29 Tage nach der Amputation der Tumor-enthaltenden Pfoten untersucht, zu diesem Zeitpunkt verendeten die Mäuse, denen F10.9-Elterzellen injiziert worden waren, mit einem schweren Befall an Lungenmetastasen. Alle IL-6-transduzierten Zellen und die IL-6-Transfektante FIL6-8 waren nicht-metastatisch (gelegentlich wurden Lungen mit einer bis zwei kleinen Metastasen beobachtet). Die experimentelle Metastasierung wurde 34 Tage nach der i.v.-Injektion getestet (Tabelle 5). Die sehr schwach IL-6-sezernierenden Zellen FIL6-8 zeigten eine stark ausgeprägte Fähigkeit zur Metastasenbildung, ähnlich wie die F10.9- und F10.9-neo-Zellen, während die IL-6- transduzierten Zellen einen gering-metastatischen Phänotyp aufwiesen, d. h. die Mehrzahl der Mäuse in der Gruppe hatte nicht-metastatische Lungen oder Lungen mit einer bis sechs kleinen Metastasen und eine bis drei von acht Mäusen hatten Lungen mit einem mittleren bis schweren Befall an Metastasen. Diese Heterogenität der Lungengewichte ist aus dem Unterschied zwischen den Mittel- und den Medianwerten der Lungengewichte ersichtlich. Tabelle 5 Bösartige Phänotypen von F10.9- und IL-6-sezernierenden Zellen in syngenen C57BL/6-Mäusen
- [0050] Acht Mäuse in jeder Versuchsgruppe erhielten i.f.p.-Injektionen mit 2 · 10&sup5; Zellen (spontane Metastasierung) oder i.v.-Injektionen mit 5 · 10&sup4; Zellen (experimentelle Metastasierung). Zur Untersuchung der spontanen Metastasierung wurden die Tumor- enthaltenden Pfoten amputiert, wenn der Tumor einen Durchmesser von 8 bis 9 mm erreicht hatte, und die Mäuse wurden 34 Tage nach der Injektion getötet. K1 ist eine positive Kb-Transfektante des F10.9-Clons.
- * Die Pfoten von sechs der acht Mäusen wuchsen nicht.
- [0051]
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Claims (10)
1. Anti-Tumor-Impfstoff, umfassend inaktivierte bösartige menschliche
Krebszellen, die zuvor dem Patienten durch Biopsie oder chirurgischen
Eingriff entnommen wurden, und in die ein Gen, das für humanes IL-6
kodiert, als einziges exogenes Gen insertiert wurde.
2. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem die besagten Zellen von humanen
Tumorzellen mit der Fähigkeit zur Metastasenbildung abgeleitet sind.
3. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem die besagten Zellen von humanen
Tumorzellen, die im wesentlichen keine Fähigkeit zur
Metastasenbildung haben, abgeleitet sind.
4. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem die besagten Zellen
Nicht-Tumorzellen sind, und die besagten Nicht-Tumorzellen primäre
Fibroblastenzellen oder eine Fibroblasten-Zellinie sind.
5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das in die Zellen
insertierte Gen in einem Expressionsvektor in die Zellen eingeführt
wurde, so daß die konstitutive Produktion von humanem IL-6 in vivo
ermöglicht wird.
6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das in die Zellen
insertierte Gen in einem retroviralen Vektor in die Zellen eingeführt
wurde, so daß die konstitutive Produktion von humanem IL-6 in vivo
ermöglicht wird.
7. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die besagten Zellen
inaktiviert wurden durch Bestrahlung und/oder Behandlung mit
Mitomycin C.
8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend etwa 1 · 10&sup6; bis
etwa 1 · 10&sup9; humane IL-6 transfizierte Zellen.
9. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß er in injizierbarer Form vorliegt.
10. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das besagte Gen in
die Zellen durch Transduktion der Zellen mit Virus-Stammlösungen
insertiert wurde, die einen retroviralen Expressionsvektor enthalten.
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