DE69113795T2

DE69113795T2 - Steroid 5-alpha-reduktase.

Info

Publication number: DE69113795T2
Application number: DE69113795T
Authority: DE
Inventors: Stefan 19M New York Ny 10023 Andersson; David W. Dallas Tx 75208 Russell
Original assignee: University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas at Austin
Priority date: 1990-04-30
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2011-04-26
Also published as: US5422262A; ATE129013T1; AU7857991A; JPH05507405A; CA2079454A1; JP3294844B2; WO1991017251A1; DE69113795D1; US5679521A; EP0528906A1; AU642501B2; EP0528906B1; CA2079454C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Enzyme, die als Steroid 5 α-Reduktasen bezeichnet werden und deren biologische Funktion es ist, die Umwandlung von Testosteron in Dihydroxytestosteron zu katalysieren. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung dieses Enzyms aus verschiedenen Quellen durch rekombinante Techniken, Nukleinsäuresegmente, die für dieses Enzym kodieren oder die als Proben für die Selektion verwandter Sequenzen verwendet werden können, wie auch Assay- Verfahren für die Identifzierung von in Frage kommenden Substanzen, die die Enzymaktivität beeinflussen werden.
Das Enzym Steroid 5α-Reduktase ist ein mikrosomales Protein, das eine zentrale Rolle bei der menschlichen Geschlechtsdifferenzierung und Androgen-Physiologie spielt. Das Interesse an diesem Protein entstammt mehreren unterschiedlichen Merkmalen. Die Steroid 5α-Reduktase katalysiert erstens die Umwandlung von Testosteron in das wirksamere Androgen Dihydrotestosteron (1). Dieses letztere Steroid induziert ein Differenzierungsprogramm während der fötalen Entwicklung, das zu der Entwicklung der männlichen äußeren Genitalien führt (2). Zweitens verursachen Mutationen in dem Gen für Steroid 5α-Reduktase eine seltene Form von männlichem Pseudohermaphroditimus, bei welcher die betroffenen Männer einen normalen internen Urogenitaltrakt, jedoch keine externen männlichen Strukturen ausbilden (3). Drittens wird die Expression des Gens durch Androgene in Geweben, wie der Prostata und der Leber reguliert (4). Ein viertes Unterscheidungsmerkmal der Steroid 5α-Reduktase ist ihre Rolle bei mehreren endokrinen Abnormalitäten, einschließlich der bösartigen Prostata-Hypoplasie, männlicher Haarlosigkeit (pattern baldness), Akne und Hirsutismus (5-7).
Es ist diese vierte Rolle, die die Forscher zu der Entwicklung von Mitteln geführt hat, die dazu dienen werden, das Enzym zu hemmen, mit der Hoffnung, daß solche Mittel sich bei der Behandlung eines oder mehrerer dieser Zustände als geeignet erweisen werden (8,9). Da das Produkt der Steroid 5α-Reduktaseaktivität, Dihydrotestosteron, bei der Induktion dieser und vielleicht anderer Zustände eine Rolle spielt, wird geglaubt, daß man durch Hemmen der Steroid 5α-Reduktasewirkung einen oder mehrere Aspekte des besonderen Zustands verbessern kann. Die Arzneimittel, die als therapeutische Mittel verwendet worden sind, umfassen prinzipiell 4-Azasteroid-Derivate, wie MK- 906 (Finasterid) und 4-MA (8,9), die als kompetitive Inhibitoren des Enzyms wirken (10). Der genaue Mechanismus, durch den diese Verbindungen in vivo wirken, muß noch aufgefunden werden.
Während diese kompetitiven Inhibitoren der Steroid 5α- Reduktase manche Hoffnung geweckt haben, z.B. bei der Behandlung von bösartiger Prostata-Hyperplasie, scheinen diese Mittel im allgemeinen an verschiedenen Problemen und potentiellen Nachteilen zu leiden, einschließlich begrenzter Wirksamkeit und sogar Hepatotoxizität. Weiterhin ist die Entwicklung zusätzlicher Inhibitoren dadurch stark behindert worden, daß früher ein geeignetes, verhältnismäßig einfaches Testsystem gefehlt hat, welches verwendet werden kann, um neue Inhibitoren zu suchen. Das bisherige, fehlende Wissen im Stand der Technik betreffend das Enzym selbst, wie z.B. die Kenntnis von dessen Struktur, hat die Entwicklung neuer therapeutischer Mittel behindert. Diesbezügliche Anstrengungen sind durch die sehr geringe Expressionsmenge dieses Enzyms in den meisten Geweben, selbst in Geweben, die auf Androgene reagieren, behindert worden (10-12).
Dementsprechend besteht gegenwärtig ein großer Bedarf für eine Ausweitung unseres Wissens über dieses Enzym, wenn die Medizinwissenschaft bei der Entwicklung neuer und wirksamerer Steroid 5α-Reduktaseinhibitoren Erfolg haben soll. Es besteht ein großer Bedarf daran, verbesserte Verfahren für das Durchsuchen von Verbindungen zu entwickeln, die die Funktion des Enzyms in einer oder mehrerer Weisen beeinflussen, wie z.B. hochempfindliche und schnelle Screening-Verfahren, die angewandt werden können, um auf solche Mittel unter einer großen Palette an in Frage kommenden Substanzen zu testen. Weiterhin besteht ein großer Bedarf daran, Mittel zum Herstellen verbesserter Zusammensetzungen biologisch aktiver Steroid 5α-Reduktase, insbesondere humaner Steroid 5α-Reduktase, bereitzustellen, die für das Fortkommen unseres Verständnisses dieses Enzyms, wie auch für die Entwicklung von Screening-Protokollen verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem allgemeinen Sinn Zusammensetzungen und Verfahren für die synthetische Herstellung von humanen Steroid 5α-Reduktasen, wie auch ihrer biologischen, funktionellen Äquivalente, und Verfahren, bei denen diese Spezies bei der Identfizierung von in Frage kommenden Substanzen verwendet werden, die deren enzymatische Funktion hemmen oder auf andere Weise modifizieren können.
In gewissen allgemeinen Ausführungsformen betrifft die Erfindung daher rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente, die für eine Steroid 5α-Reduktase kodieren. Die erfindungsgemäßen DNA-Segmente können ebenso für biologisch funktionelle, äquivalente Proteine oder Peptide kodieren, die unterschiedliche Aminosäuresequenzen besitzen, wie z.B. Spezies, die Veränderungen beinhalten, welche auf Überlegungen, wie z.B. den relativen Hydropathie-Wert der ausgetauschten Aminosäuren, basieren.
Der Ausdruck "DNA-Segment", wie er hierin verwendet wird, soll auf ein DNA-Molekül hinweisen, das in freier Form aus einer genomischen Gesamt-DNA einer bestimmten Art isoliert worden ist. Daher soll ein DNA-Segment, das für eine Steroid 5α-Reduktase kodiert, auf ein DNA-Segment hinweisen, das solche kodierenden Sequenzen enthält, die bereits aus der genomischen Gesamt-DNA einer Art, von der die DNA erhalten wird, isoliert ist. Mitumfaßt in dem Ausdruck "DNA-Segment" sind DNA-Segmente, die sowohl bei der Herstellung von Vektoren als auch bei den Vektoren selbst verwendet werden können, einschließlich z.B. Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren etc.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Steroid 5α-Reduktase" auf irgendein Protein oder Peptid mit der biologischen oder immunologischen Identität, oder beides, mit einem humanen Steroid 5 α-Reduktaseenzym hinweisen, wofür z.B. funktionelle Äquivalente als Beispiele dienen.
In bevorzugteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente, die DNA- Sequenzen beeinhalten, welche für eine Steroid 5α-Reduktase kodieren, die innerhalb ihrer Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz der Figur 7 umfaßt, die einer humanen Steroid 5α- Reduktase entspricht. Die rekombinanten Vektoren und isolierten Segmente können daher verschiedentlich die für humane Steroid 5α-Reduktase kodierende Region selbst, kodierende Regionen, die ausgewählte Abänderungen oder Modifikationen in der grundsätzlichen kodierenden Region enthalten, umfassen oder können für größere Proteine kodieren, die trotzdem Sequenzen umfassen, welche die Steroid 5α-Reduktaseaktivität vermitteln werden. Weiterhin und auf alle Fälle sollte anerkannt werden, daß aufgrund der Kodonredundanz und einer funktionellen Äquivalenz dieser Aspekt der Erfindung nicht begrenzt ist auf die bestimmten DNA-Sequenzen, die in der Figur 7 gezeigt sind.
Die rekombinanten Vektoren wie oben sind sowohl als Mittel zum Herstellen von größeren Enzymmengen als auch als Mittel zum Herstellen von kürzeren Peptiden geeignet. Es wird vorausgesehen, daß man entweder prokaryontische als auch eukaryontische Expressionssysteme verwenden kann, wenn die erfindungsgemäßen Steroid 5α-Reduktaseproteine durch rekombinante Mittel hergestellt werden sollen.
In den Fällen, in denen die Expression eines Steroid 5α- Reduktaseenzyms in einem Wirt angestrebt wird, kann es wünschenswert sein, einen Vektor, wie z.B. ein Plasmid, zu verwenden, der einen Replikationsursprung beinhaltet, wobei eukaryontische Vektoren der pCMV-Serie, wie pCMV4, als Beispiel dienen. Zum Zweck der Expression in Wirtssystemen wird man zusätzlich wünschen, die kodierenden Sequenzen in der Nähe und unter der Kontrolle eines effektiven eukaryontischen Promotors zu positionieren, wie z.B. einem SV40- oder CMV-Promotor in eukaryontischen Systemen. Um eine kodierende Sequenz unter die Kontrolle eines solchen Promotors zu bringen - egal ob es sich um einen eurkaryontischen oder prokaryontischen Promotor handelt - muß das 5'-Ende der Transkriptionsinitiationsstelle des transkriptionellen Leserasters des Proteins nur zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 Nukleotiden "stromabwärts" (d.h. 3') hinsichtlich des gewählten Promotors positioniert werden.
Weiterhin wird in den Fällen, in denen eine Wirtsexpression angestrebt wird, typischerweise gewünscht werden, in die Transkriptionseinheit, welche das Enzym umfaßt, eine geeignete Polyadenylierungsstelle (d.h. 5'-AATAAA-3') bei Eukaryonten oder einen Transkriptionsterminator im Fall von Prokaryonten einzubringen. Typischerweise wird die Poly A-Zufügungsstelle ungefähr 30 bis 2000 Nukleotide "stromabwärts" von der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination plaziert werden. Ein ähnliches Positionieren des prokaryontischen Terminators ist ebenso typisch.
Geeignete eukaryontishe Vektoren, die all das Vorstehende umfassen und in die das erfindungsgemäße Gen ohne große Schwierigkeiten inseriert werden kann, sind bekannt. Z.B. umfassen geeignete eukaryontische Vektoren pCD und pCMV, wobei das am meisten bevorzugte System pCMV ist. Zusätzlich zu pCD- und pCMV-Vektoren umfassen weitere bevorzugte eukaryontische Expressionsvektoren pMSG und pSVL von Pharmacia LKB Technology, Piscataway, N.J. Diese benutzen die MMTV- bzw. SV40-späten Promotoren. Eine DNA, wie sie in Figur 7 gezeigt ist, kann über die Eco RI-Restriktionsstelle "stromaufwärts" (d.h. 5') vom Initiationskodon (ATG), an dem die Translation des kodierten Enzyms beginnt, in einen der vorstehenden Vektoren leicht inseriert werden.
Es wird vorausgesehen, daß praktisch alle der gewöhnlich verwendeten, eukaryontischen Wirtszellen im Zusammenhang mit einer Steroid 5α-Reduktaseexpression verwendet werden können. Beispiele umfassen Zellinien, die typischerweise für eine eukaryontische Expression verwendet werden, wie z.B. AtT-20-, HepG2-, VERO-, HeLa-, CHO-, WI 38-, BHK-, COS-7-, RIN- und MDCK- Zellinien. Eine bevorzugte Linie für die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Ausführungsformen der eukaryontischen Expression ist das COS-7-System. Es ist natürlich in den Fällen, in denen eukaryontische Wirte verwendet werden, bekannt, daß rekombinante Sequenzen entweder extrachromosomal beibehalten oder tatsächlich eingebaut oder in das Genom der Wirtszelle integriert werden können. Für eine Langzeitexpression wird es gewöhnlich bevorzugt sein, Systeme zu verwenden, worin eine genomische Integration erreicht wird, wie z.B. CHO oder HepG2. In den Fällen, in denen jedoch nur eine transiente Expression gewünscht wird, wie z.B. zum Zweck des Durchsuchens nach Rekombinanten, kann eine extrachromosomale Transformation ausreichend sein, wobei COS-7- oder HeLa-Zellen als Beispiel dienen.
Die prokaryontische Expression ist eine Alternative, die in den Fällen verwendet werden kann, in denen sie gewünscht wird. Typischerweise umfassen prokaryontische Promotoren, die verwendet werden können, PL-, T7- und lac-Promotoren, wobei T7 gewöhnlich bevorzugt ist. Weitere bevorzugte bakterielle Expressionsvektoren umfassen die Plasmide pKK233-2 und pKK233-3, erhältlich von Pharmacia LKB Technology. Diese verwenden die tacbzw. trc-Promotoren.
Natürlich wird man sogar in den Fällen, in denen ein eukaryontisches System und eine eukaryontische Expression verwendet wird, trotzdem gewöhnlich wünschen, sowohl einen prokaryontischen Expressionsursprung als auch Selektionsmarker, die in prokaryontischen Systemen funktionieren, einzubringen, um ein "shuttling" der Sequenzen vom Zusammensetzen in Prokaryonten zu einer Expression in Eukrayonten zu erlauben.
Bei bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird erwartet, daß sowohl kürzere als auch längere DNA-Fragmente, die Sequenzen der Figur 7 beinhalten, oder verwandte Sequenzen zusätzliche Anwendungen finden werden, einschließlich Verwendungen bei der Herstellung kurzer, enzymatisch aktiver Peptide oder sogar als kurze DNA-Fragment-Hybridisierungsproben zur Verwendung bei z.B. dem Durchsuchen von Klonbanken. Auf alle Fälle werden Fragmente, die der Sequenz der Figur 7 entsprechen, und Abschnitte einer so kurzen Länge wie ungefähr 10 Nukleotide Anwendung gemäß diesen oder anderen Ausführungsformen finden. Dadurch, daß ein DNA-Segment Abschnitte von wenigstens ungefähr 10 bis 20 Nukleotiden mit der offenbarten DNA- Sequenz der Figur 7 gemeinsam hat, wird dieses oder dessen komplementäre Sequenz die Fähigkeit haben, ein bevorzugtes Hybrid mit Steroid 5α-Reduktase-DNA - insbesondere bei stringenteren Bedingungen, wie 0,15 M NaCl und 0,02M Natriumcitrat pH 7,4 bei 50ºC - bilden. Während ein komplementärer oder gemeinsamer Abschnitt von ungefähr 10 Nukleotiden die Fähigkeit sicherstellen wird, ein stabiles Hybrid zu bilden, können längere komplementäre Abschnitte sich für gewisse Anwendungen als wünschenswert erweisen. So kann man für gewisse Anwendungen DNA-Segmente wünschen, die längere komplementäre Abschnitte - z.B. in der Größenordnung von 18, 22 oder sogar 25 Basen umfassen.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von Steroid 5α-Reduktase durch rekombinante Techniken, wie auch die Verwendung von rekombinant hergestelltem Enzym in Screening-Assays. Erfindungsgemäße Screening- Assays werden gewöhnlich das Bestimmen der Fähigkeit einer in Frage kommenden Substanz, die enzymatische Enzymaktivität zu beeinflussen, umfassen, wie z.B. das Durchsuchen von in Frage kommenden Substanzen, um diejenigen zu identifizieren, die dessen enzymatische Funktion hemmen oder auf andere Weise modifizieren werden. Typischerweise wird dieses Verfahren das Herstellen von Steroid 5α-Reduktase durch rekombinante Techniken, danach das Testen der rekombinanten Steroid 5α-Reduktase mit einer in Frage kommenden Substanz umfassen, um die Fähigkeit der Substanz zu bestimmen, deren enzymatische Funktion zu beeinflussen. Aufgrund signifikanter Unterschiede, die von den Erfindern zwischen dem humanen Enzym und den Enzymen anderer Arten identifiziert worden sind, wird man typischerweise bevorzugen, das humane Enzym in Verbindung mit diesen Screening- Verfahren in den Fällen anzuwenden, in denen man beabsichtigt, in Frage kommende Substanzen für die Verwendung bei Menschen zu identifizieren.
Bei einem typischen Screening-Assay zum Identifizieren von in Frage kommenden Substanzen mag man wünschen, denselben rekombinanten Expressionswirt wie die Ausgangsquelle für die Gewinnung des Enyzms anzuwenden, welches gewöhnlich in der Form eines rohen Homogenisats hergestellt wird. Die das Enzym exprimierenden rekombinanten Zellen können gewaschen und homogenisiert werden, um ein rohes Proteinhomogenisat in einem gewünschten Puffer, wie hierin offenbart, herzustellen. In einem typischen Assay wird eine Proteinmenge von dem Zellhomogenisat, wie z.B. 10 bis 50 µg des Zellhomogenisatproteins in ein kleines Volumen, z.B. 0,5 ml, eines geeigneten Assay-Puffers (z.B. 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,6, Enzym aus Ratte, pH 7,0, humanes Enzym) eingebracht. Steroid-Substrate, wie z.B. Testosteron, Progesteron oder Androstendion, werden in geeigneten Mengen, wie z.B. 0,1 bis 20 µM, zu der Mischung zugegeben; danach läßt man die Reaktion durch die Zugabe des Co-Faktors NADPH beginnen. In den Fällen, in denen man ein geeignetes bekanntes Substrat für das Enzym verwendet, kann man in der obigen Art und Weise eine Grundlinienaktivität für das rekombinant hergestellte Enzym erhalten. Dann kann man, um auf Inhibitoren oder Modifikatoren der Enzymfunktion zu testen, in die Mischung eine in Frage kommende Substanz einbringen, dessen Wirkung auf das Enzym untersucht werden soll. Durch Vergleichen der Reaktionen, die in der Gegenwart oder der Abwesenheit der in Frage kommenden Substanz ausgeführt werden, kann man dann Informationen hinsichtlich der Wirkung der in Frage kommenden Substanz auf die normale enzymatische Enzymfunktion erhalten.
In bevorzugten Assays wird die enzymatische Funktion einfach dadurch gemessen, daß die Menge des hergestellten Produkts oder des verbrauchten Substrats in der experimentellen Reaktion gegenüber der Kontrolle über einen bestimmten Zeitraum hinweg gemessen wird. Man kann es daher als vorteilhaft empfinden, die Rate, zu der ein bestimmtes Substrat verbraucht wird oder das Erscheinen des Produkts zu messen. Auf alle Fälle haben die Erfinder gefunden, daß ein geeignetes Verfahren zum Messen des Erscheinens des Substrats oder des Verschwindens des Produkts die Verwendung eines markierten Substrats, wie z.B. ein radioaktiv markiertes Substrat, einschließt. Auf diese Weise können die Reaktionsprodukte durch chromatographische Mittel, wie z.B. Dünnschichtchromatographie, HPLC oder ähnliche, abgetrennt und die relativen Mengen der Materialien durch Szintillationszählung bestimmt werden.
Obwohl die vorstehend beschriebene Strategie sich bei den Erfindern als gut erwiesen hat, gibt es keinen Grund, warum nicht andere Strategien angewandt werden sollten, solange man bestimmen kann, ob eine in Frage kommende Substanz die Fähigkeit besitzt, das zu untersuchende Enzym zu modifizieren, zu verändern oder zu hemmen. Mögliche Beispiele umfassen spektrophotometrische, gaschromatographische/massenspektrophotometrische oder sogar NMR-Analysen.
Die Erfindung wird mit Hinblick auf die Zeichnungen weiter beschrieben, deren Beschreibung folgt:
Figur 1: Expressionsklonierung von Steroid 5α-Reduktase.
Leber-RNA aus weiblichen Ratten wurde an 10-25%-igen Saccharosegradienten größenfraktioniert und Aliquots der RNA auf Steroid 5α-Reduktaseaktivität in Xenopus-Oozyten untersucht. Die Fraktionen mit Peak-Aktivität wurden verwendet, um eine orientierte cDNA-Bank in einem Plasmid-RNA-Expressionsvektor zu konstruieren. E. coli-Transformanten von dieser Bank wurden in Gruppen von 150-200 Klonen zusammengefaßt und auf Enzymexpression getestet. Ein Dünnschichtchromatographieassay wurde verwendet, durch den das Substrat Testosteron (T) von Androstendion (A) und den 5α-reduzierten Formen dieser zwei Steroide (DHT bzw. 5αA) getrennt werden konnte. Sibling-Selektion eines Positiven Klonpools wurde, wie in Beispiel I beschrieben, durchgeführt.

Figur 2: Verdünnungsklonierung einer Leber-Steroid 5α- Reduktase-cDNA.

Xenopus-Oozyten wurden mit RNA des genannten Ursprungs injiziert und durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von [¹&sup4;C]Testosteron als Substrat, wie in Beispiel I beschrieben, auf Steroid 5α-Reduktaseaktivität untersucht. Spur 1, H&sub2;O-injiziert; Spur 2, RNA aus der Leber weiblicher Ratten; Spur 3, RNA, synthetisiert in vitro ausgehend von einem Gemisch aus 150-200 cDNA-Klonen; Spur 4, RNA, synthetisiert von cDNAs, die in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht worden waren; Spur 5, RNA, synthetisiert ausgehend von einem Gemisch aus 12 Klonen, die einer Horizontalreihe der Mikrotiterplatte entsprechen; Spur 6, RNA, synthetisiert von 8 Klonen, die einer Vertikalreihe dieser Platte entsprechen; und Spur 7, RNA, die von einem cDNA-Klon stammt, welcher dem Schnittpunkt der Horizontalreihe und Vertikalreihe entspricht.
Die Chromatogramme von verschiedenen Experimenten wurden für 16 Stunden einem Kodak XAR-5-Film ausgesetzt. In dem verwendeten chromatographischen System wandern hydrophobe Steroide weiter als hydrophile Steroide. Die Positionen authentischer Steroid- Standards sind auf der linken Seite der Autoradiogramme gezeigt. T, Testosteron, A, Androstandion, DHT, 5α- Dihydrotestosteron, 5αA, 5α-Androstendion. Ein endogenes Xenopus-Enzym in den Oozyten wandelt Testosteron in Androstendion um. Die mit einem Stern markierten Steroide sind nichtcharakterisierte Metabolite, die durch endogene Xenopus-Enzyme ausgehend von den 5α-reduzierten Verbindungen stammen (siehe Figur 3). Die Menge der 5α-reduzierten Metabolite in einem gegebenen Experiment variierte in Abhängigkeit von der injizierten Oozytencharge und wird daher hier nicht berechnet.

Figur 3: Substratspezifität der klonierten Steroid 5α-Reduktase.

Von einem einzigen Tier erhaltene Xenopus-Oozyten wurden mit in vitro-synthetisierter RNA, die von dem Steroid 5α-Reduktase-cDNA-Klon stammte, injiziert und danach unter Verwendung der angezeigten ¹&sup4;C-markierten Steroidsubstrate (5 µM) in der Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) des kompetitiven Inhibitors 4-MA (5 µM) auf Enzymaktivität untersucht. Die verschiedenen Steroide und Metabolite sind auf der linken und rechten Seite der Autoradiogramme gezeigt: P, Progesteron; 5αP, 5α-Dihydroprogesteron; die anderen entsprechen denjenigen, die in der Legende zu Figur 2 angezeigt sind. Die Menge der 5α-reduzierten Metabolite ist für jedes Substrat unter der Figur angezeigt und wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt, nachdem geeignete Bereiche aus dem Chromatogramm ausgeschnitten worden waren. In den Spuren 5 und 6 wurden alle radioaktiven Derivate von Dihydrotestosteron gezählt. In nicht gezeigten Experimenten war das Metabolitenmuster, das erhalten wurde, wenn Dihydrotestosteron als Substrat verwendet wurde, identisch sowohl in H&sub2;O-injizierten als auch mit Steroid 5α- Reduktase-RNA injizierten Oozyten.

Figur 4: Nukleotidsequenz der cDNA, die der Ratten-Steroid 5α- Reduktase-mRNA entspricht, vorausgesagte Aminosäuresequenz und Hydropathie-Muster des Proteins.

A, die Nukleotide sind auf der rechten Seite numeriert. Die Aminosäuren sind über der Sequenz mit der Position 1, die willkürlich dem ersten Methionin-Kodon in der Nukleotidsequenz zugewiesen wurde, numeriert. Zwei Polyadenylierungssignale sind unterstrichen. B, die Sequenz des Steroid 5α-Reduktaseproteins wurde einer Hydropathie-Analyse unter Verwendung des Algorithmus von Kyte und Doolittle (50) unterworfen. Die Sequenzen über der zentralen Trennungslinie sind hydrophil und diejenigen unter der Linie sind hydrophob.

Figur 5: In vitro-Translationsanalyse der Steroid 5α- Reduktase-RNA.

In vitro-synthetisierte Steroid 5α-Reduktase- RNA wurde in einem Retikulozytenlysat, wie in Beispiel I beschrieben, translatiert. Zusätze zu den einzelnen Röhrchen sind über dem Autoradiogramm angezeigt. Ungefähr 8% jeder Translationsreaktion wurde durch Elektrophorese in Polyacrylamid- Natriumdodecylsulfat-Gradientengelen (7-15%) analysiert. Größenstandards sind auf der linken Seite angezeigt. Die Bande bei Mr 45000 repräsentiert ein endogenes Methionin-bindendes Protein im Retikulozytenlysat. Die der Steroid 5α-Reduktase entsprechende Bande ist auf der rechten Seite des Autoradiogramms angezeigt.

Figur 6: Charakterisierung der 5'- und 3'-Enden der Steroid 5α-Reduktase-cDNA und -mRNA.

A, Expression von 3'-verkürzten RNAs in Xenopus-Oozyten. Das Steroid 5α-Reduktase-cDNA-Plasmid wurde mit dem angezeigten Restriktionsenzym linearisiert, und die resultierende Matrize wurde verwendet, um RNA in vitro zu synthetisieren. Die Oozyten wurden mit der RNA injiziert und unter Verwendung von Testosteron als Substrat auf Aktivität getestet. Die Menge an 5α-reduzierten Steroidmetaboliten wurde, wie in der Legende zu Figur 3 beschrieben, bestimmt. Die gezeigten Werte sind der Durchschnitt von zwei oder drei getrennten Experimenten für jede RNA. B, Primer-Extensionsanalyse des 5'-Endes der Leber-Steroid 5α-Reduktase-mRNA. 10 µg der Poly(A&spplus;) mRNA des angezeigten Ursprungs wurde einer Primer- Extensionsanalyse, wie in Beispiel I beschrieben, ausgesetzt. Größenstandards (STDS) sind auf der linken Seite des Autoradiogramms angezeigt. Die Exponierungszeiten bei -70ºC mit einem Verstärkerschirm betrugen 13 Stunden für die Spuren 1, 3 und 4 und 1 Stunde für die Spur 2. nt, Nukleotide.

Figur 7: cDNA-Sequenz und vorausgesagte Aminosäuresequenz der humanen Steroid 5α-Reduktase.

Die Nukleotide sind auf der linken Seite numeriert mit Punkten, die im Abstand von jeweils 10 Nukleotiden unter der Sequenz plaziert sind. Aminosäurereste sind über der Proteinsequenz numeriert. Ein potentielles Polyadenylierungssignal (AATAAA) ist unterstrichen.

Figur 8: Sequenz der humanen und Ratten-Steroid 5α-Reduktase- Proteine.

Die Aminosäuresequenzen der humanen und Ratten-Enzyme sind ausgerichtet, um die Homologie zwischen den beiden Proteinen zu zeigen. Identische Reste sind umrahmt. Der Ein- Buchstaben-Aminosäure-Code wird verwendet, wobei die Reste auf der rechten Seite der Figur numeriert sind.

Figur 9: Expression von Ratten- und humanen Steroid 5α- Reduktase-cDNAs in transfizierten COS-Zellen.

Am Tag 2 nach der Transfektion wurde [¹&sup4;C]Testosteron zu einer Endkonzentration von 2,5 µM zu dem Medium zugefügt. Zu den angezeigten Zeiten wurde das Medium von den zweifach angelegten Schalen entfernt und mit Dichlormethan extrahiert. Die Steroide wurden einer Dünnschichtchromatographie und Szintillationszählung, wie in Material und Methoden beschrieben, ausgesetzt.

Figur 10: Hemmung der humanen Steroid 5α-Reduktaseaktivität in vitro durch 4-MA und MK-906.

COS-Zellen wurden mit einem humanen cDNA-Expressionsplasmid transfiziert, mittels eines Polytron lysiert, und die Zellhomogenisate wurden in vitro, wie in Materialien und Methoden beschrieben, auf Steroid 5α- Reduktaseaktivität untersucht. 40 µg des zellulären Proteins wurden in der Gegenwart der angezeigten Konzentrationen von 4-MA (Bild A) oder MK-906 (Bild B) und 2 oder 4 µM [¹&sup4;C]Testosteron untersucht. Die Daten wurden unter Verwendung eines Apple IIe-Programms aufgetragen. Im Bild A und B definieren die Schnittpunkte der beiden Linien den Ki für den entsprechenden Inhibitor (56).

Figur 11: Hemmung der Steroid 5α-Reduktase in transfizierten COS-Zellen.

COS-Zellen wurden am Tag 0 mit einem Expressionsplasmid, das die humane oder Ratten-Steroid 5α-Reduktase-cDNA enthält, transfiziert. Am Tag 2 wurde eine Mischung, die aus 1 µM [¹&sup4;C]Testosteron und Inhibitor (4-MA, oberes Bild; MK-906, unteres Bild) bestand, zu der angezeigten Konzentration in Ethanol zum Medium der zweifach angelegten Schalen zugefügt. Die Umwandlung von Testosteron in 5α-reduzierte Produkte wurde, wie in Beispiel II beschrieben, aufgezeichnet.

1. Einführung

Ein einzigartiger Aspekt der männlichen Geschlechtsentwicklung ist die Voraussetzung, daß das von den Hoden stammende Hormon Testosteron¹ in Zielgeweben, die sich zur Bildung der männlichen äußeren Genitalien differenzieren in das Dihydrotestosteron umgewandelt werden muß (2). Diese Umwandlung wird durch ein mikrosomales Enzym - Steroid 5α-Reduktase - in der Anlage der äußeren Genitalien katalysiert (1). Die Abwesenheit der Steroid 5α-Reduktaseaktivität verursacht eine seltene Form von männlichem Pseudohermaphroditismus, die ursprünglich als pseudovaginale perineoskrotale Hypospadie bezeichnet wurde, bei der die männlichen äußeren Genitalien als weibliche Strukturen differenzieren (13, 14). Zusätzlich zu deren Lokalisierung in auf Androgen antwortenden Geweben werden hohe Raten an Steroid 5α-Reduktaseaktivität in der Leber weiblicher Ratten, jedoch nicht in der Leber männlicher Ratten gefunden (15). Ob dieses Leberenzym dasselbe ist, wie dasjenige in männlichen Zielgeweben ist sowohl strittig als auch unbekannt. Weiterhin werden die Faktoren, die die Expression dieses Enzyms regulieren, und der Grund für die benötigte Umwandlung von Testosteron in Dihydrotestosteron für die normale männliche Differenzierung kaum verstanden (1).
Die Abkürzungen und verwendeten Trivialnamen sind: Testosteron, 17β-Hydroxy-4-androsten-3-on; Dihydrotestosteron, 17β-Hydroxy-5α-androstan-3-on, 4-MA, 17β-N,N- Diethylcarbamoyl-4-methyl-4-aza-5α-androstan-3-on; Androstendion, Androst-4-en-3,17-dion; Androstandion, 5α-Androstan-3,17-dion, Progesteron, 4-Pregnen-3,20- dion; 5α-Dihydroprogesteron; 5α-Pregnan-3,20-dion; kb, Kilobase(n).
Die Wirkung der Steroid 5α-Reduktase ist ein spätes Ereignis in der männlichen Geschlechtsentwicklung, ein komplexer Prozeß, der die korrekte Interpretation von sowohl genetischen als auch hormonalen Signalen für die Entwicklung voraussetzt (2, 16).Der Prozeß beginnt vermutlich nach der Etablierung des chromosomalen Geschlechts bei der Fertilisierung mit der Expression eines vorherrschenden Regulationsproteins, das als Testisdeterminierender Faktor bezeichnet wird. Das Gen für dieses Protein wurde kürzlich kloniert und kodiert für ein Protein mit einem Strukturmotiv (der Zinkfinger), das gewöhnlich in Transkriptionsfaktoren gefunden wird (17, 18). Dieser Befund stimmt mit einer Rolle dieses Proteins bei der Induktion eines Differenzierungsprogrammes, das zu der Entwicklung der Hoden führt, überein (17). Der Hoden wiederum produziert zwei Hormone - Testosteron und ein Protein, das Müller-Hemmsubstanz genannt wird (19). Das letztere Hormon verursacht die Rückbildung der Müller-Gänge, die die Anlage der weiblichen inneren Genitalien sind (2, 19). Testosteron unterstützt die Entwicklung der männlichen inneren Genitalien (Nebenhoden, Vasa deferentia und Samenbläschen), und nach der Umwandlung zu Dihydrotestosteron durch Steroid 5α-Reduktase die Differenzierung der äußeren männlichen Strukturen (Penis, Skrotum und Prostata) (2).
Die Wirkungen sowohl von Testosteron als auch von Dihydrotestosteron bei der männlichen Entwicklung werden durch ein einzelnes Protein - den Androgen-Rezeptor, ein kürzlich kloniertes Mitglied der Steroidhormonrezeptorfamilie - vermittelt (20-23). Genetische Defekte hinsichtlich des Androgenrezeptors verhindern die Differenzierung sowohl der inneren als auch der äußeren männlichen Strukturen (24). Obwohl gezeigt worden ist, daß Dihydrotestosteron mit einer höheren Affinität als Testosteron an den Androgenrezeptor bindet (25), ist gegenwärtig nicht bekannt, warum die Wirkung des Rezeptors bei der Unterstützung der Differenzierung der äußeren männlichen Genitalien die Synthese eines Liganden mit höherer Affinität benötigt. Dieser Bedarf muß der Gegenwart weiterer regulatorischer Faktoren bei der Entwicklung der äußeren Genitalien zuzurechnen sein (1).
Obwohl die Rolle der Steroid 5α-Reduktase bei der männlichen Geschlechtsdifferenzierung aufgedeckt worden ist, sind molekulare Einsichten in das Gen und das Protein noch nicht möglich gewesen, da genetische und immunochemische Proben fehlten. Das Enzym ist von der Ratte partiell gereinigt worden und nachweislich ein integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums oder der Kernmembran (26). Viele kontroverse Ansichten existieren in der Literatur hinsichtlich der Anzahl an Steroid 5α-Reduktaseisozymen, die in der Leber und in der Prostata der Ratte vorkommen, und hinsichtlich deren Co-Faktor-Bedürfnisses (27,28). Sowohl die Leber- als auch die Prostata-Enzyme werden in einer kompetitiven Weise durch das Steroidanalogon 17β-N-N- Diethylcarbamoyl-4-methyl-4-aza-5α-androstan-3-on (4-MA) gehemmt, was andeutet, daß diese Proteine eine Sequenzhomologie in ihren Substrat-bindenden Domänen zumindest zum Teil gemeinsam haben müssen (10). Übereinstimmend mit dieser Voraussage sind die Befunde, daß die Leber- und Prostata-Enzyme die Reduktion ähnlicher Steroidsubstrate, einschließlich Testosteron, Androstendion und Progesteron, katalysieren (15, 29).
Die vorliegende Offenbarung beschreibt speziell die Klonierung und Sequenz der DNA-Segmente, die für verschiedene Steroid 5α- Reduktasen kodieren, einschließlich diejenigen von Rattenleber, Rattenprostata und sogar menschlichen Ursprungs. Mit diesen Offenbarungen mit Hinblick auf die hierin beschriebenen Lehren wird unterbreitet, daß Durchschnittsfachleute fähig sein werden, die für die Steroid 5α-Reduktasen kodierenden DNA- Segmente aus jeder gewünschten Quelle ohne unnötigen Experimentierungsaufwand herzustellen. Ebenso sind Verfahren zum Anwenden dieser DNA-Segmente offenbart, um funktionelle und untersuchbare Steroid 5α-Reduktasen herzustellen, die auf verschiedene Art und Weisen verwendete werden können, wie z.B. für die Entwicklung von Screening-Assays, um Inhibitoren des Enzyms zu identifizieren. Es wird ebenso vorausgesehen, daß diese DNA- Segmente auf andere Art und Weisen verwendet werden können, einschließlich z.B. als Proben für die Identifizierung von Individuen, die defekte Steroid 5α-Reduktasegene oder gewisse Allene dieses Gens tragen könnten, welche ein Individuum zur männlichen Haarlosigkeit, Akne, Hirsutismus und Prostatakrebs oder sogar weiteren wenig beschriebenen endokrinen Krankheiten des Androgenmetabolismus prädisponieren.

2. Screening-Assays

Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von rekombinant hergestellter Steroid 5α-Reduktase in Screening- Assays für die Identifizierung von Substanzen, die die enzymatische Enzymfunktion hemmen oder auf andere Weise modifizieren oder verändern können. Die Verwendung von rekombinant hergestelltem Enzym ist von besonderem Vorteil, weil das natürlich vorkommende Enzym nur in geringen Mengen vorhanden ist und sich als schwer zu reinigen herausgestellt hat. Weiterhin stellt dies eine schnelle Quelle des menschlichen Enzyms dar, die bisher fehlte. Die Erfinder haben überraschenderweise entdeckt, daß das humane Enzym hinsichtlich dessen Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen in Frage kommenden Substanzen ziemlich unterschiedlich von der Steroid 5α-Reduktase, die von Arten, wie z. B. der Ratte, erhalten wurde, ist. Dies ist ziemlich bedeutend, indem daß es zeigt, daß man in den Fällen, in denen man versucht, eine Verbindung zu identifizieren, die z.B. das Enzym in Menschen hemmen kann, die humane Form der Steroid 5α- Reduktase für den Screening-Assay verwenden sollte. Weiterhin deutet es an, daß frühere Untersuchungen, in denen andere Formen als das menschliche Enzym verwendet wurden, hinsichtlich Menschen nicht exakt sein können.
Die erfindungsgemäßen Screening-Assays verwenden geeigneterweise in bevorzugten Ausführungsformen das Enzym direkt von dem rekombinanten Wirt, in welchem es hergestellt wird. Dies wird am meisten bevorzugt dadurch erreicht, daß das ausgewählte Enzym in dem rekombinanten Wirt - hier einem eukaryontischen Wirt - exprimiert und danach ein rohes Homogenisat, welches das Enzym umfaßt, hergestellt wird. Ein Teil des rohen Homogenisats wird danach mit einem geeigneten Enzymsubstrat, wie z.B. Testosteron, Progesteron oder Androstendion zusammen mit der zu testenden in Frage kommenden Substanz gemischt. Durch Vergleichen der Wirkung des Enzyms auf das ausgewählte Substrat in der Gegenwart oder Abwesenheit der in Frage kommenden Substanz kann man Informationen betreffend die Fähigkeit der in Frage kommenden Substanz, die Enzymaktivität zu beeinflussen, erhalten.
Dadurch, daß die meisten dieser erfindunsgemäßen Screening- Assays entworfen werden, um Mittel zu identifizieren, die für die Hemmung der Umwandlung von Testosteron geeignet sind, werden die bevorzugten Assays Testosteron als das normale Substrat verwenden.
Es gibt vermutlich sehr unterschiedliche Ausführungsformen, die angewendet werden können, um die Wirkung der in Frage kommenden Substanz auf das erf indungsgemäße Enzym zu bestimmen, und es ist nicht beabsichtigt, daß die Erfindung auf irgendein solches Verfahren beschränkt wird. Jedoch wird es gewöhnlich wünschenswert sein, ein System anzuwenden, worin man die Fähigkeit des Enzyms messen kann, das verwendete Substrat in ein bestimmtes Produkt umzuwandeln. Ein von den Erfindern angewendetes Verfahren verwendet ein markiertes Substrat, das auf eine solche Weise markiert worden ist, daß die Markierung quantitativ in dem resultierenden Produkt noch vorhanden ist. Eine geeignete Strategie ist die Verwendung einer radioaktiven Markierung, wie z.B. C¹&sup4; oder H³, die direkt sowohl im Substrat als auch im resultierenden Produkt quantifiziert werden kann.
In bevorzugten Assays läßt man die Mischung, welche das Enzym, Substrat und die in Frage kommende Substanz enthält, für eine ausgewählte Zeitdauer inkubieren; und die entstehende inkubierte Mischung wird einem Trennungsmittel ausgesetzt, um das in der Mischung verbleibende Substrat von jeglichem produzierten Produkt zu trennen. Danach mißt man einfach die jeweilige Menge, z.B. gegenüber einer Kontrolle, zu der keine in Frage kommende Substanz zugefügt worden ist. Diese Messung kann zu verschiedenen Zeitpunkten vorgenommen werden, wenn Geschwindigkeitsdaten gewünscht werden. Daraus kann man die Fähigkeit der in Frage kommenden Substanz bestimmen, die Enzymfunktion zu verändern oder zu modifizieren.
Zahlreiche Techniken sind bekannt, die für die Trennung des Substrats vom Produkt angewendet werden können und es ist beabsichtigt, daß alle solche Verfahren in den Schutzumfang der Erfindung fallen. Die Erfinder bevorzugen die Verwendung von Dünnschichtchromatographieverfahren (TLC; thin layer chromatographic method) da auf TLC beruhende Verfahren schnell, genau, billig und ziemlich empfindlich sind. Jedoch könnten weitere geeignete Techniken z.B. HPLC, spektrophotometrische, gaschromatographische/massenspektrophotometrische oder sogar NMR- Analysen umfassen. Es wird vorausgesehen, daß eine jede solche Technik verwendet werden kann, solange sie fähig ist, zwischen dem Enzymsubstrat und Produkt zu differenzieren und verwendet werden kann, um die enzymatische Funktion z.B. dadurch zu bestimmen, daß das Substrat und Produkt identifiziert oder quantifiziert wird.

3. Nukleinsäurehybridisierungs-Ausführungsformen

Wie bereits erwähnt, erlaubt die DNA-Sequenzinformation, die durch die Erfindung bereitgestellt wird, die Herstellung von relativ kurzen DNA- (oder RNA-)Sequenzen mit der Fähigkeit, spezifisch an Gensequenzen des ausgewählten Steroid 5α- Reduktasegens zu hybridisieren. Für diese Aspekte werden Nukleinsäureproben einer geeigneten Länge auf der Grundlage der ausgewählten Steroid 5α-Reduktasegensequenz, wie z.B. einer Sequenz, wie sie in Figur 7 gezeigt ist, hergestellt. Die Fähigkeit solcher Nukleinsäureproben, spezifisch an die Steroid 5α-Reduktasegensequenzen zu hybridisieren, verleihen ihnen eine besondere Verwendbarkeit für verschiedene Ausführungsformen. Vor allem können die Proben in verschiedenen Assays zum Nachweisen der Gegenwart komplementärer Sequenzen in einer gegebenen Probe verwendet werden. Jedoch wird auch auf weitere Verwendungen abgezielt, einschließlich der Verwendung der Sequenzinformation für die Herstellung von mutierten Primer-Arten oder Primer für die Verwendung bei dem Herstellen weiterer genetischer Konstrukte.
Um bestimmte erfindungsgemäße Vorteile bereitzustellen, umfaßt die bevorzugte Nukleinsäuresequenz, die für die Hybridisierungsstudien oder -assays verwendet wird, Sequenzen, die komplementär zu wenigstens einem ungefähr 10 bis 30 Nukleotide langen Abschnitt der Steroid 5α-Reduktasesequenz, wie derjenigen, die in Figur 7 gezeigt ist, sind. Eine Größe von mindestens 10 Nukleotiden hilft sicherzustellen, daß das Fragment ausreichend lang sein wird, um ein Doppelstrang-Molekül zu bilden, welches sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Abschnitte, die größer als 10 Basen sind, besitzen, sind gewöhnlich bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Menge und das Maß der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Man wird gewöhnlich bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle mit Gen-komplementären Abschnitten von 15 bis 20 Nukleotiden oder sogar länger, wenn gewünscht, zu entwerfen. Solche Fragmente können auf einfache Weise dadurch hergestellt werden, daß das Fragment z.B. durch chemische Mittel, durch Anwendung einer Nukleinsäurereproduktionstechnologie, wie der PCR-Technologie des US-Patents 4 603 102 oder durch Einführen ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren für eine rekombinante Herstellung direkt synthetisiert wird.
Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden, selektiv Doppelstrangmoleküle mit den komplementären Abschnitten des Gens zu bilden. Abhängig von der ins Auge gefaßten Anwendung wird man wünschen, verschiedene Hybridisierungsbedingungen anzuwenden, um unterschiedliche Selektivitätsgrade der Probe gegenüber der Zielsequenz zu erreichen. Für Anwendungen, die einen hohen Selektivitätsgrad benötigen, wird man typischerweise wünschen, relativ stringente Bedingungen anzuwenden, um Hybride zu bilden; z.B. wird man relativ niedrige Salz- und/oder hohe Temperaturbedingungen auswählen, wie sie z.B. durch 0,02 M-0,15 M NaCl bei in Temperaturen von 50ºC bis 70ºC bereitgestellt werden. Diese Bedingungen sind besonders selektiv und tolerieren wenige - wenn überhaupt - Unterschiede (mismatch) zwischen der Probe und der Matrize oder dem Zielstrang.
Natürlich werden für einige Anwendungen, wie z.B. in Fällen, in denen man wünscht, Mutanten unter Verwendung eines mutierten Primer-Stranges, der an eine gegebene Matrize hybridisiert, herzustellen oder in Fällen, in denen man danach strebt, für Steroid 5α-Reduktase kodierende Sequenzen für verwandte Arten, funktionelle Äquivalente oder dergleichen zu isolieren, niedriger stringente Hybridisierungsbedingungen typischerweise benötigt, um die Bildung eines Heteroduplex-Moleküls zu erlauben. In diesen Fällen kann man wünschen, Bedingungen anzuwenden, wie 0,15M-0,9M Salz bei Temperaturen im Bereich von 20ºC bis 55ºC. Kreuzhybridisierende Spezies können dadurch leicht als positiv hybridisierende Signale mit Hinblick auf Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. Auf alle Fälle ist es allgemein anerkannt, daß die Bedingungen durch die Zugabe steigender Mengen an Formamid, das dazu dient, das Hybrid-Duplexmolekül in derselben Weise wie erhöhte Temperaturen zu destabilisieren, stringenter gemacht werden. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden, und dies wird gewöhnlich eine Methode der Wahl sein, die von dem gewünschten Ergebnis abhängt.
Bei gewissen Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie z.B. einer Markierung, für den Hybridisierungsnachweis anzuwenden. Viele verschiedene geeignete Indikatormittel sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich radioaktive, enzymatische oder andere Liganden, wie z.B. Avidin/Biotin, die ein nachweisbares Signal erzeugen können. In bevorzugten Ausführungsformen wird man wahrscheinlich wünschen, ein Enzym-tag, wie z.B. Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstatt radioaktiver oder anderer umweltschädigender Reagenzien zu verwenden. Im Fall der Enzym-tags sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbare Mittel zur Identifizierung einer spezifischen Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-enthaltenden Proben bereitzustellen.
Allgemein wird ins Auge gefaßt, daß die hierin beschriebenen Hybridisierungsproben sowohl als Reagenzien bei der Lösungshybridisierung als auch in Ausführungsformen, die eine Festphase verwenden, geeignet sein werden. In Ausführungsformen, die eine Festphase umfassen, wird die Test-DNA (oder RNA) an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder auf andere Weise angeheftet. Diese fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird danach einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Proben unter den gewünschten Bedingungen ausgesetzt. Die ausgewählten Bedingungen werden von den besonderen Umständen abhängen, die auf den besonderen benötigten Kriterien basieren (abhängig z.B. vom G+C-Gehalt, der Art der Ziel-Nukleinsäure, dem Ursprung der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungsprobe etc.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, wodurch nicht-spezifisch gebundene Probemoleküle entfernt werden, wird die spezifische Hybridisierung mit Hilfe der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert.

4. Biologisch funktionelle, äquivalente Aminosäuren

Wie vorstehend bemerkt, können, wenn gewünscht, Modifikationen und Veränderungen in die Struktur der Steroid 5α-Reduktase eingeführt werden, und man wird vermutlich dennoch ein Molekül mit ähnlichen oder anderweitig wünschenswerten Merkmalen erhalten. Z.B. können gewisse Aminosäuren in einer Proteinstruktur durch andere Aminosäuren ersetzt werden ohne nennenswerten Verlust der wechselwirkenden Bindungsfähigkeit mit Strukturen, wie z.B. Antigen-bindende Regionen der Antikörper (oder z.B. Bindungsstellen auf Substratmolekülen). Da es die Wechselwirkungsfähigkeit und die Natur eines Proteins ist, die die biologisch funktionelle Aktivität dieses Proteins definieren, können gewisse Aminosäuresequenzaustausche in einer Proteinsequenz (oder natürlich deren zugrunde liegender kodierender DNA-Sequenz) eingefügt werden und man wird trotzdem ein Protein mit ähnlichen oder sogar entgegengesetzten Eigenschaften (z.B. antagonistisch gegen agonistisch) erhalten. Es wird daher von den Erfindern vorausgesehen, daß verschiedene Veränderungen in die Sequenz der Peptide (oder zugrunde liegenden DNA) ohne einen merklichen Verlust ihrer biologischen Verwendbarkeit oder Aktivität eingeführt werden können.
Die Bedeutung des hydropathischen Index von Aminosäuren hinsichtlich der Vermittlung der biologischen Wechselwirkungsfunktion auf ein Protein, ist allgemein durch Kyte et al. (50) diskutiert worden, wobei gefunden wird, daß gewisse Aminosäuren gegen andere Aminosäuren mit einem ähnlichen hydropathischen Index oder Zahlenwert ausgetauscht werden können und dennoch eine ähnliche biologische Aktivität beibehalten wird. Wie in der nachstehenden Tabelle dargestellt, wird den Aminosäuren ein hydropathischer Index auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität und Ladungsmerkmale zugewiesen. Der relative hydropathische Charakter der Aminosäure bestimmt vermutlich die Sekundärstruktur des resultierenden Proteins, die wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit Substratmolekülen definiert. TABELLE 1 Aminosäure Hydropathischer Index Isoleucin Valin Leucin Phenylalanin Cystein/Cystin Methionin Alanin Glycin Threonin Tryptophan Serin Tyrosin Prolin Histidin Glutaminsäure Glutamin Asparaginsäure Asparagin Lysin Arginin
Es wird vorgeschlagen, daß in den Fällen, in denen eine Aminosäure einen hydropathischen Index innerhalb +/-2 im Vergleich zu der auszutauschenden Aminosäure und bevorzugt innerhalb +/-1 besitzt, ein solcher Wechsel trotzdem ein Protein mit einer ähnlichen - und vielleicht sogar verbesserten - funktionellen Aktivität bereitstellen sollte. Folglich wird z.B. vorgeschlagen, daß Isoleucin, welches einen hydropathischen Index von +4,5 besitzt, durch Valin (+4,2) oder Leucin (+3,8) ersetzt werden kann und man dennoch ein Protein mit ähnlicher biologischer Aktivität erhält. Alternativ wird mit Hinblick auf das andere Ende der Skala vorgeschlagen, daß Lysin (-3,9) durch Arginin (-4,5) ersetzt werden kann, usw.
Dementsprechend basieren diese Aminosäureaustausche gewöhnlich auf der relativen Ähnlichkeit der R-Gruppensubstituenten, z.B. hinsichtlich der Größe, des elektrophilen Charakters, der Ladung und dergleichen. Allgemein umfassen beispielhafte Austausche, die verschiedene der vorstehend beschriebenen Merkmale in Betracht ziehen, die folgenden: TABELLE II Ursprünglicher Rest Beispielhafte Austausche

5. Sequenzspezifische Mutagenese

Die sequenzspezifische Mutagenese ist eine Technik, die für die Herstellung von Proteinen der zweiten Generation oder biologisch funktionelle äquivalenten Proteinen oder Peptiden, die von deren Sequenzen abstammen, durch spezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA geeignet ist. Die Technik stellt weiterhin eine schnelle Möglichkeit bereit, Sequenzvarianten z.B. durch Einführen von einem oder mehreren Nukleotidsequenzaustauschen in die DNA herzustellen und zu testen, wobei eine oder mehrere der vorstehenden Überlegungen eingeschlossen werden. Sequenzspezifische Mutagenese erlaubt die Herstellung von Mutanten unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die sowohl die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation als auch eine genügende Anzahl benachbarter Nukleotide umfassen, um eine Primer-Sequenz genügender Länge und Sequenzkomplexität bereitzustellen, damit eine stabile Doppelstrang-DNA auf beiden Seiten der zu überbrückenden Deletionsverknüpfung gebildet werden kann. Typischerweise ist ein Primer mit einer Länge von ungefähr 17 bis 25 Nukleotiden bevorzugt mit ungefähr 5 bis 10 Resten auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der zu verändernden Sequenz.
Allgemein ist die Technik der sequenzspezifischen Mutagenese im Stand der Technik gut bekannt, wobei Veröffentlichungen, wie z.B. die Referenz (61) als Beispiel dient, welche hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Wie anerkannt sein wird, verwendet die Technik typischerweise einen Phagenvektor, der sowohl in einer einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Form vorkommt. Typische Vektoren, die für die sequenzspezifische Mutagenese geeignet sind, umfassen Vektoren, wie den M13-Phagen, wie z.B. durch Referenz 62 offenbart, die hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Diese Phagen sind leicht kommerziell erhältlich und ihre Verwendung ist Durchschnittsfachleuten gewöhnlich gut bekannt.
Allgemein wird die sequenzspezifische Mutagenese in Übereinstimmung mit dieser Offenbarung dadurch durchgeführt, daß zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine Sequenz umfaßt, die die gesamte oder ein Teil der Steroid 5α-Reduktasesequenz kodiert. Ein Oligonukleotid-Primer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird gewöhnlich synthetisch, wie z.B. durch das Verfahren der Referenz 63, hergestellt. Dieser Primer wird danach mit dem einzelsträngigen Vektor hybridisiert und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z.B. E. coli Polymerase I Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des mutationstragenden Strangs zu vervollständigen. Folglich wird ein Heteroduplex-Molekül gebildet, worin ein Strang die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz umfaßt und der andere Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird danach verwendet, um geeignete Zellen, wie z.B. E. coli-Zellen zu transformieren, und Klone werden selektiert, die rekombinante Vektoren umfassen, welche die mutierte Sequenzfolge tragen.

6. Wirtszellkulturen und Vektoren

Allgemein sind natürlich Prokaryonten bevorzugt für die Anfangsklonierung der DNA-Sequenzen und die Konstruktion der für die Erfindung geeigneten Vektoren. Beispielsweise können E. coli K12-Stämme besonders geeignet sein. Weitere mikrobiellen Stämme, die verwendet werden können, umfassen E. coli B und E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sind natürlich zur Veranschaulichung gedacht und nicht beschränkend.
Prokaryonten können auch für die Expression verwendet werden. Die vorstehend erwähnten Stämme als auch E. coli W3110 (F-, lambda-, prototroph, ATCC Nr. 273325), Bacilli, wie beispielsweise Bacillus subtilus oder weitere Enterobacteriaceae, wie beispielsweise Salmonella typhimurium oder Serratus marcesans und verschiedene Pseudomonas-Arten können verwendet werden.
Allgemein werden Plasmidvektoren, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, welche von Arten stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich sowohl eine Replikationsstelle als auch Markersequenzen, die eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen erlauben. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR 322 - ein von einer E. coli-Art (siehe z.B. Referenz 64) stammendes Plasmid - transformiert. pBR 322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und erlaubt auf einfache Weise die Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR-Plasmid oder weitere mikrobielle Plasmide oder Phagen müssen auch Promotoren enthalten - oder so modfiziert werden, daß sie diese enthalten -, die von dem mikrobiellen Organismus für die Expression dessen eigener Proteine verwendet werden können.
Solche Promotoren, die sehr oft bei der Konstruktion rekombinanter DNA verwendet werden, umfassen die β-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (65-67) und ein Tryptophan (TRP)-Promotorsystem (68-69). Obwohl diese am meisten verwendet werden, sind weitere mikrobiellen Promotoren entdeckt und verwendet worden, und ihre Nukleotidsequenz betreffende, genauen Beschreibungen sind veröffentlicht worden, wodurch ein Durchschnittsfachmann in die Lage versetzt wird, diese funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (70).
Zusätzlich zu Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroorganismen, wie z.B. Hefekulturen, verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder die gemeine Bäckerhefe ist der am meisten verwendete unter den eukaryontischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl weiterer Stämme allgemein erhältlich ist. Für eine Expression in Saccharomyces wird gewöhnlich z.B. das Plasmid Yrp7, verwendet (71-73). Dieses Plasmid enthält bereits das trpl-Gen, welches einen Selektionsmarker für einen Mutanten- Hefestamm, welchem die Fähigkeit fehlt, ohne Tryptophan zu wachsen - z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (74) - darstellt. Die Gegenwart der trp1-Läsion als ein Merkmal des Hefe- Wirtszellgenoms stellt dann eine effektive Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in der Abwesenheit von Tryptophan dar.
Geeignete Promotor-Sequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (75) oder weiteren glykolytischen Enzymen (76, 77), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3- phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphat-isomerase, 3- Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat- Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Für die Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden auch die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen in den Expressionsvektor ligiert, und zwar 3' von den Sequenzen, die exprimiert werden sollen, um eine Polyadenylierung der mRNA und die Termination zu erreichen. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorregion für die Alkoholdehydrogenase 2, Isozytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Metabolismus assoziierte Abbauenzyme und die vorstehend erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die von mehrzelligen Organismen abstammen, als Wirte verwendet werden. Prinzipiell ist jede derartige Zellkultur geeignet, egal, ob es sich um eine Vertebraten- oder Invertrebraten- Kultur handelt. Jedoch gilt das größte Interesse den Vertebraten-Zellen, und die Vermehrung von Vertebraten-Zellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (78). Beispiele für solche geeigneten Wirtszellinien sind AtT-20-, VERO- und HeLa-Zellen, Ovarienzellinien des chinesischen Hamsters (CHO; chinese hamster ovary cell), W138-, BHK-, COS-7-, 293- und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren solcher Zellen umfassen gewöhnlich (wenn nötig) einen Replikationsursprung, einem vor dem zu exprimierenden Gen lokalisierten Promotor zusammen mit eventuell benötigten Ribosombindungsstellen, RNA-Spleißstellen, einer Polyadenylierungsstelle und Transkriptionsterminatorsequenzen.
Bei der Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrolle funktionen auf den Expressionsvektoren oft durch virales Material bereitgestellt. Beispielsweise stammen gewöhnlich verwendete Promotoren vom Polyoma-Virus, Adeno-Virus 2, Cytomegalo- Virus und am häufigsten vom Affenvirus 40 (SV40; Simian Virus) ab. Die frühen und späten Promotoren vom SV40-Virus sind besonders geeignet, da beide auf einfache Weise von dem Virus als ein Fragment, welches auch den viralen SV40-Replikationsursprung (79) enthält, erhalten werden können. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenso verwendet werden, vorausgesetzt die ungefähr 250 bp lange Sequenz, die von der Hind III-Stelle bis zur Bgl I-Stelle reicht, die im viralen Replikationsursprung lokalisiert ist, ist umfaßt. Weiterhin ist es auch möglich und oft erwünscht, Promotor- oder Kontrollsequenzen, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, zu verwenden, vorausgesetzt solche Kontrollsequenzen sind mit dem Wirtszellsystem kompatibel.
Ein Replikationsursprung kann so durch die Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, daß dieser einen exogenen Ursprung, wie z.B. ein von SV40 oder weiteren viralen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV, CMV) Quellen stammender Ursprung, umfaßt; der Replikationsursprung kann auch durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle integriert ist, genügt oft letzterer.

7. Eukaryontische pCMV-Expressionsvektoren

Die pCMV-Plasmide sind eine Serie von Säuger- Expressionsvektoren, die von Mitarbeitern in der Abteilung für molekulare Genetik, Universität Texas, South Western Medical Center, konstruiert wurde. Die Vektoren sind für eine Verwendung im wesentlichen in allen kultivierten Zellen entworfen worden und funktionieren extrem gut in SV40-transformierten Affen-COS-Zellinien. Die pCMV1, 2, 3 und 5-Vektoren unterscheiden sich voneinander hinsichtlich gewisser nur einmal vorkommender Restriktionsstellen, die in der Polylinker-Region unter jedem Plasmid gezeigt sind. Der pCMV4-Vektor unterscheidet sich von diesen 4 Plasmiden dadurch, daß er einen Translations-Enhancer in der Sequenz vor dem Polylinker enthält.
Die gemeinsamen Bestandteile der pCMV-Plasmide sind die folgenden. Das Vektor-Rückgrad ist pTZ18R (Pharmacia) und enthält einen Replikationsursprung des Bakteriophagen f1 für die Produktion einzelsträngiger DNA und ein Ampicillin-Resistenzgen. Die CMV-Region besteht aus den Nukleotiden -760 bis +3 der starken Promotor-regulatorischen Region des major immediate early-Gens vom humanen Cytomegalovirus (Towne-Stamm) (80).
Die Polylinker-Region kann mittels eines Apparats von Applied Biosystem synthetisiert werden. Das humane Wachstumshormon- Fragment (hGH) enthält Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale, die die Sequenzen 1533 bis 2157 dieses Gens repräsentieren (82). Es existiert eine mittelrepetitive Alu-DNA-Sequenz in diesem Fragment. Letztendlich stammte der SV40-Replikationsursprung und der Promotor-Enhancer der frühen Region (weiße Box) von dem in (83) beschriebenen pcD-X-Plasmid (HindII bis PstI-Fragment). Der Promotor ist in diesem Fragment so orientiert, daß die Transkription von der CMV/hGH- Expressionskassette wegläuft.
Die pCMV-Plasmide werden voneinander mit Blick darauf unterschieden, welche Restriktionsenzymstellen in dem Polylinker nur einmal vorkommen und durch die Gegenwart oder Abwesenheit des Translations-Enhancers. Das pCMV1-Ausgangsplasmid ist immer weiter modifiziert worden, um eine immer größere Anzahl von nur einmal vorkommenden Stellen im Polylinker zu schaffen. Um pCMV2 herzustellen wurde eine von zwei EcoRI-Stellen in pCMV1 zerstört. Um pCMV3 herzustellen, wurde pCMV1 dadurch modifiziert, daß ein kurzes Segment der SV40-Region (StuI bis ^R EcoRI) entfernt wurde und so nur einmal vorkommende PstI, SaII und BamHI- Stellen im Polylinker geschaffen wurden. Um pCMV4 herzustellen, wurde ein synthetisches DNA-Fragment, welches der 5'-nichttranslatierten Region einer vom CMV-Promotor transkribierten mRNA entspricht, eingesetzt. Die Sequenz wirkt dadurch als Translations-Enhancer, daß der Bedarf an Initiationsfaktoren bei der Proteinsynthese vermindert wird (81). Um pCMV5 herzustellen, wurde ein DNA-Segment (HpaI bis EcoRI) von der SV40- Ursprungsregion des pCMV1 entfernt, um zu erreichen, daß alle Stellen in dem ursprünglichen Polylinker nur einmal vorkommen.
Die pCMV-Vektoren sind in Affen-COS-Zellen, Maus-L-Zellen, CHO- Zellen und HeLa-Zellen angewendet worden. Bei mehreren direkten Vergleichen ergaben sie 5- bis 10-fach höhere Expressionsmengen in COS-Zellen als auf SV40 basierende Vektoren. Die pCMV- Vektoren sind verwendet worden, um den LDL-Rezeptor, Kernfaktor 1, GS α-Protein, Protein-Phosphatase, Synaptophysin, Synapsin, Insulinrezeptor, flu-Hämagglutinin, Androgenrezeptor, Sterol 26-Hydroxylase, Steroid 17- und 21-Hydroxylase, Zytochrom P- 450-Oxidoreduktase, β-adrenerger Rezeptor, Folat-Rezeptor, Cholesterinseitenketten-Spaltungsenzym und eine Reihe weiterer cDNAS zu exprimieren. Es sollte erwähnt werden, daß der SV40- Promotor in diesen Plasmiden verwendet werden kann, um weitere Gene, wie beispielsweise dominante selektierbare Marker, zu exprimieren. Letztendlich gibt es eine ATG-Sequenz im Polylinker zwischen den HindIII und PstI-Stellen, die eine falsche Translationsinitiation verursachen kann. Dieses Kodon sollte, wenn möglich, in den Expressionsplasmiden vermieden werden. Eine Veröffentlichung, die die Konstruktion und die Verwendung von pCMV1 und pCMV4 beschreibt, ist bereits erschienen (52).

8. Beispiele

Die Beispiele sind angefügt worden, um bevorzugte, erfindungsgemäße Ausführungsformen darzustellen. Manche Aspekte der folgenden Beispiele sind mit Hinsicht auf Techniken und Verfahren, für die die Erfinder gefunden und vorausgesehen haben, daß sie bei der Ausführung der Erfindung gut funktionieren, beschrieben. Diese Beispiele sind unter Verwendung der gewöhnlichen Laborpraktiken der Erfinder vorgenommen worden. Mit Blick auf die vorliegende Offenbarung und das Durchschnittskönnen werden Durchschnittsfachleute erkennen, daß die folgenden Beispiele nur beispielhaft gedacht sind und daß zahlreiche Austausche, Modifikationen und Veränderungen angewendet werden können, ohne daß man sich vom Umfang der Erfindung entfernt.

Beispiel I

Expressionsklonierung der Steroid 5α-Reduktase aus Ratte

Dieses Beispiel beschreibt von den Erfindern angewendete Techniken zum Klonieren von cDNAS, die für die Rattenleber- und Prostata-Steroid 5α-Reduktaseenzyme kodieren. Da es keine bekannte Sequenzinformation für dieses Enzym gab, auf deren Grundlage die Konstruktion von Oligonukleotidproben erreicht werden konnte, wurde eine neue Strategie entwickelt, die teilweise auf einer Strategie basiert, die die Expressionsklonierung mittels Xenopus-Oozyten anwendet und bei der Isolierung von Lymphokinen (30), Neurotransmitter-Rezeptoren (31-33) und Membrantransportern (34) verwendet wurde. Wie den nachstehend diskutierten Ergebnissen entnommen werden wird, ergaben die von den cDNAs abgeleiteten Aminosäuresequenzen, daß die Leber- und Prostata-Formen der Steroid 5α-Reduktase identisch sind. Jedoch deuteten RNA-Blotting-Experimente an, daß die Expression der Steroid 5α-Reduktase in diesen zwei Geweben durch Testosteron differenziert reguliert wird.

A. Angewendete Protokolle

1. Steroid 5α-Reduktase-Enzymassay

Oozyten der Stadien 5 und 6 wurden von weiblichen Xenopus laevis (NASCO, Fort Atkinson, WI) chirurgisch entfernt und, wie von Julius et al. (33) beschrieben, Collagenase-behandelt. Die Oozyten wurden mit 5-100 nl RNA (1 ug/ul), wie von Peacock et al. (35) beschrieben, injiziert. Nach der Injektion wurden die Oozyten bei 19ºC für 24 Stunden in modifizierter Barth- Salzlösung (35), enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin, inkubiert, um eine Expression der injizierten RNA zu erreichen. 5 bis 10 lebende Oozyten wurden danach in 1 ml modifizierte Barth-Salzlösung, enthaltend 5 αm ¹&sup4;C-markiertes Steroid (50 mCi/mMol, Du Pont-New England Nuclear), überführt und bei 37ºC für 2 bis 24 Stunden inkubiert. Dieses Protokoll mit Temperatursprung basiert auf der Beobachtung, daß die mRNA-Expression in Xenopus bei 19ºC maximal ist, während die in Xenopus exprimierte Ratten-Steroid 5α-Reduktase ein Temperaturoptimum von 37ºC aufweist. Nach der 37ºC-Inkubation wurden die Oozyten in dem Inkubationsmedium homogenisiert, und das Steroid wurde mit 10 ml Dichlormethan extrahiert. Das Lösungsmittel wurde unter Luft abgedampft, und der Rest in 0,1 ml Chloroform/Methanol (2:1, Vol./Vol.) gelöst und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel 60-Dünnschichtchromatographieplatten (E. Merck, 5748-7, Darmstadt, Deutschland) ausgesetzt. Die Chromatographieplatten wurden für 18 Stunden bei -70ºC autoradiographiert und die radioaktiven Bereiche ausgeschnitten und einer Flüssigszintillationszählung in einem vollständigen Zählungs-Cocktail (Complete Counting Cocktail; Research Products International) ausgesetzt. Die Produktidentitäten wurden durch Vergleich der RF-Werte bekannter Standards bestimmt.

2. cDNA-Klonierung

Gesamt-RNA aus weiblicher Rattenleber wurde durch ein Guanidiniumisothiocyanat/CsCl-Verfahren (36) extrahiert. Poly(A&spplus;)- angereicherte RNA wurde isoliert und durch Dichtegradientenzentrifugation in 10-25%-igen (Gew./Vol.) Saccharosegradienten, enthaltend Methylquecksilberhydroxid (37), größenfraktioniert. Nach 15-stündiger Zentrifugation bei 4ºC und 76800 X g wurden Aliquots der RNA aus jeder Gradientenfraktion durch Injektion in Xenopus-Oozyten auf Steroid 5α-Reduktase-mRNA getestet. Die positiven Fraktionen der Saccharosegradienten wurden vereinigt, und die RNA wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert. Der erste Strang der cDNA wurde unter Verwendung von mRNA, die mit 2,5 mM Methylquecksilberhydroxid und AGCGGCCGC(T)&sub2;&sub0; als Primer vorbehandelt war, synthetisiert. Die Synthese des zweiten Stranges, EcoI-Methylierung, Trimmen der Enden mit DNA- Polymerase des Bakteriophagen T4 und das Anhängen phosphorylierter EcoRI-Linker wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt (36). Die resultierende cDNA wurde mit NotI und EcoRI gespalten und in einem 1%-igen (Gew./Vol.) Agarosegel größenfraktioniert. Komplementäre DNAS größer als 1,3 kb wurden in die EcoRI- und NotI-Stellen des Bluescript-Vektors (Stratagene, La Jolla, CA) inseriert. Die rekombinanten Plasmide wurden in Escherichia coli DH5αF'IQ (GIBCO) vermehrt. Eine cDNA-Bank wurde, ausgehend von ventraler Prostata der Ratte, wie vorstehend beschrieben, konstruiert, außer, daß Hexanukleotide mit Zufallssequenz als Primer und Gesamt-Poly(A&spplus;)-RNA als Matrize verwendet wurden. Größenfraktionierte, von Prostata-mRNA stammende cDNAS wurden in die EcoRI-Stelle des λZapII-Vektors (Stratagene) inseriert. Rekombinante Bakteriophagen wurden in E. coli XL1-Blue vermehrt. Bluescript-Plasmide wurden nachfolgend durch Superinfektion mit Helfer F1-Bakteriophagen von λZap-Rekombinanten gewonnen (rescued).
Für das anfängliche Durchsuchen der cDNA-Bank aus weiblicher Rattenleber wurden Plasmid-Minipräparationen aus 20 Pools, enthaltend 150-200 cDNA-Klone/Pool, hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde mit NotI linearisiert, und die RNA in vitro unter Verwendung von RNA-Polymerase vom Bakteriophagen T7 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), wie von Julius et al. (33) beschrieben, transkribiert. Die Injektion in Xenopus-Oozyten wurde, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt. Plasmid-DNA von einem positiven Pool wurde retransformiert, und 960 Kolonien wurden stichprobenartig abgenommen und in einzelne 0,3 ml-Kulturen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt. Danach wurden Plasmid-DNAs von Pools aus 100 ul-Aliquots jeder Vertiefung hergestellt und durch Mikroinjektion getestet. Sibling-Selektion von der Mikrotiterplatte wurde durch Matrixanalyse durchgeführt.

3. Nukleinsäuresequenzierung und Primer-Extension

Überlappende Fragmente beider DNA-Stränge wurden in Bakteriophagen M13-Vektoren subkloniert und durch automatisierte Verfahren (38) unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts Modell 370A von Applied Biosystems sequenziert. Für die Primer- Extensions-Analyse wurde ein zu den Nukleotiden 70-109 der Figur 4A komplementäres Antisinn-Oligonukleotid bei 68ºC an poly(A&spplus;) RNA aus Rattenleber hybridisiert und, wie von Sudhof et al. (39) beschrieben, mit reverser Transkriptase extendiert. Direkte RNA-Sequenzierung der Steroid 5α-Reduktase-mRNA wurde, wie von Geliebter et al. (40) beschrieben, ausgeführt.

4. In vitro-Translation der RNA

Ungefähr 100 ng RNA wurde unter Verwendung von [³&sup5;S]Methionin (1100 Ci/mmol) und einem Kaninchen-Retikulozytenlysat (Promega, Madison, WI) in der Gegenwart oder Abwesenheit von Hundepankreas-Mikrosomen (41) in vitro translatiert. Nach 1- stündiger Inkubation bei 30ºC wurden die Reaktionen durch Zufügen von Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 0,2 mM oder RNase A zu 2 mg/ml gestoppt. Die Experimente mit Produkten, die in der Gegenwart von 50 ug/ml Trypsin (GIBCO) in vitro translatiert wurden, wurden für 30 Minuten bei 22ºC mit oder ohne 2% (Gew./Vol.) Triton X-100 (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Die Proteasereaktionen wurden durch Zufügen von Sojabohnen- Trypsininhibitor (Cappel, Malvern, PA) zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml gestoppt.

5. Physiologie-Experimente

Studien wurden entworfen, um einen Vergleich der mRNA-Mengen in der Leber und Prostata von normalen Ratten, von 7 Tage lang kastrierten Tieren, von 10 Tage lang kastrierten Tieren und von normalen oder 10 Tage lang kastrierten Tieren, denen an den Tagen 7-9 des Experiments Testosteron verabreicht worden war, zu ermöglichen. Geschlechtsreife, männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden durch Standard-Chirurgieverfahren am Tag 0 kastriert. Am Tag 7 wurden die experimentellen Gruppen an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit 2 mg Testosteron-Acetat oder Testosteron- Propionat, gelöst in 0,2 ml Sesamöl (15), subkutan injiziert.
Kontrolltiere wurden mit Sesamöl allein injiziert. Am Tag 10 des Experiments wurde RNA aus den Lebern und Prostatas von bis zu 15 Tieren in jeder experimentellen Gruppe präpariert und durch Blotten, wie in der Legende zu Figur 6 beschrieben, analysiert.

B Ergebnisse und Diskussion

1. Expressionsklonierung der Steroid 5α-Reduktase- cDNA aus Rattenleber

Die Figur 1 stellt die verwendete Strategie dar, um eine cDNA voller Länge für die Steroid 5α-Reduktase aus Rattenleber zu erhalten. Als mRNA-Quelle wurde weibliche Rattenleber verwendet, die aufgrund von physiologisch unbekannten Gründen hohe Raten an Enzymaktivität der Steroid 5α-Reduktase exprimiert (26). Mikroinjektion in Xenopus-Oozyten deutete an, daß diese mRNA die Synthese eines Enzyms dirigieren konnte, das die Umwandlung der Steroide in deren 5α-reduzierte Formen katalysierte (siehe unten). Saccharosegradientenfraktionierung der Rattenleber-mRNA deutete an, daß diese Aktivität von einer mRNA von ungefähr 2,5 kb kodiert wurde (Figur 1). Ähnliche Ergebnisse sind kürzlich von Farkash et al. (42) berichtet worden. Die mRNA in dieser Fraktion wurde in cDNA umgewandelt, größenfraktioniert und in einen RNA-Expressionsvektor kloniert. Um Probleme mit Antisinn-Hemmung zu vermeiden, wurde die cDNA-Bank in einer orientierten Weise konstruiert (Figur 1). Zwanzig Pools, die jeweils 150-200 cDNA-Klone enthielten, wurden danach verwendet, um mRNA zu synthetisieren, die wiederum in Oozyten injiziert wurde, um die Bestimmung der Steroid 5α-Reduktaseaktivität durch Dünnschichtchromatographieanalyse zu ermöglichen. Aus einem aktiven Pool wurde nachfolgend eine für dieses Enzym kodierende cDNA fast voller Länge durch Verdünnungsklonierung isoliert (Figur 1).
Die Figur 2 veranschaulicht die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographieassays der Verdünnungsklonierung. Bei allen Untersuchungen wurde der Test auf Steroid 5α-Reduktaseaktivität in injizierten Oozyten unter Anwendung eines Temperatursprung- Protokolls durchgeführt, wie vorstehend in Sektion A.2. genau ausgeführt ist. Mikroinjektion von Wasser in Xenopus-Oozyten deckte eine endogene Aktivität auf, die das Testosteron- Substrat in Androstendion umwandeln konnte, jedoch wurde nur eine geringe bzw. keine Aktivität gefunden, die diese Steroide in deren 5α-reduzierte Formen umwandelte (Spur 1). Wenn dagegen mRNA aus weiblicher Rattenleber injiziert wurde, exprimierten die Oozyten eine Aktivität, die sowohl Dihydrotestosteron und 5α-Androstandion als auch mindestens zwei weitere Steroid- Metabolite erzeugte (Spur 2). Diese letzteren unidentifizierten Steroide stammten von 5α-reduzierten Metaboliten ab, die durch die injizierte mRNA erzeugt wurden (siehe unten).
Die Spur 3 der Figur 2 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, nachdem RNA, ausgehend von einem der anfänglich 20 cDNA- Plasmidpools, die 150-200 unabhängige Klone enthielten, synthetisiert worden war. Das Spektrum an beobachteten Steroid- Metaboliten war identisch zu demjenigen, das nach Injektion von Leber-mRNA beobachtet worden war, was andeutet, daß dieser Pool mindestens eine Steroid 5α-Reduktase-cDNA enthalten mußte. Die cDNAs von diesem Pool wurden in E. coli retransforiniert, und einzelne Kolonien wurden abgenommen und in Mikrotiterplatten überführt. Die Spur 4 zeigt die Ergebnisse, die nach Mikroinjektion von RNA erhalten wurden, welche ausgehend von Plasmiden hergestellt worden war, die von einer Platte mit 96 Vertiefungen isoliert worden waren, welche eine Steroid 5α-ReduktasecDNA von dieser Transformation enthielt. Nachfolgende Analyse der mRNA von Plasmidpools, die den Horizontal- und Vertikalreihen dieser Mikrotiterplatte entsprachen, identifizierte eine Horizontal- (Spur 5) und Vertikalreihe (Spur 6), die ein Steroid 5α-Reduktaseplasmid enthielten. Der Schnittpunkt dieser Horizontal- und Vertikalreihe auf der Mikrotiterplatte lokalisierte die positive cDNA (Spur 7).

2. Substratspezifität der klonierten Steroid 5α- Reduktase aus Leber

Ausgehend von dem Steroid 5α-Reduktase-cDNA-Plasmid, das in Figur 2 dargestellt ist, synthetisierte RNA wurde in Oozyten mikroinjiziert und für 24 Stunden exprimiert. Die Oozyten wurden danach für weitere 24 Stunden mit verschiedenen radioaktiv markierten Steroiden inkubiert, und die gebildeten Produkte wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Figur 3, Spur 1, zeigt das typische Muster 5α-reduzierter Metabolite, die ausgehend von Testosteron gebildet wurden. Die Spur 2 deutet an, daß eine Co-Inkubation der injizierten Eier mit äguimolaren Mengen an Testosteron und dem kompetitiven Steroid 5α-Reduktaseinhibitor 4-MA zu einer wesentlichen Verringerung der Bildung dieser Produkte führte. Als Kontrolle für eine nicht-spezifische Hemmung wurde die Umwandlung von Testosteron in Androstendion, die durch ein endogenes Xenopus-Enzym (vermutlich eine 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase) (43) katalysiert wird, durch 4-MA in diesem Experiment nicht gehemmt (Spur 2). Die Daten in Spur 3 und Spur 7 deuten an, daß sowohl Androstendion als auch Progesteron Substrate für das klonierte Enzym waren. Wie im Fall von Testosteron blockierte 4-MA effizient die Reduktion dieser Steroide (Spuren 4 bzw. 8). Wenn radioaktiv markiertes Dihydrotestosteron als Substrat verwendet wurde (Spur 5), hatte der Inhibitor keine Wirkung auf die Umwandlung dieser Verbindung in weitere 5α-reduzierte Metabolite durch die endogenen Xenopus-Enzyme (Spur 6).

3. Sequenzen der Steroid 5α-Reduktase aus Leber

Die Figur 4A zeigt die Nukleotidsequenz der Leber-Steroid 5α- Reduktase-cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Proteins. Das cDNA-Insert in dem Expressionsklon war 2465 Basenpaare lang und umfaßte eine lange 3'-nicht-translatierte Region von 1691 Basenpaaren und ein ausgedehntes Translationsleseraster von 765 Basenpaaren. Ein potentielles Polyadenylierungssignal ist an der Position 2446, stromaufwärts von einer Ananderreihung von A-Resten, vorhanden, was andeudet, daß das authentische 3'-Ende dieser cDNA vorhanden ist. In der vorausgesagten Aminosäuresequenz kommen 3 Methioninreste innerhalb der ersten 19 Aminosäuren vor. Der Kontext des ersten ATG ist hinsichtlich 6 von 9 Nukleotiden mit der idealen Kozak- Konsensussequenz (44) identisch, was andeutet, daß dieses Kodon das aminoterminale Methionin der Steroid 5α-Reduktase spezifiziert. Mit dieser Annahme würde das offene Leseraster für ein hydrophobes Protein von 255 Aminosäuren mit einem vorausgesagten Mr von 29343 kodieren. Über 50% der Aminosäuren in der Proteinsequenz besitzen hydrophobe Seitenketten. In Übereinstimmung mit dieser Aminosäurezusammensetzung deutet ein Hydropathie-Plot (Figur 4B) auf ein Protein mit vielen hydrophoben Bereichen hin. Ein Vergleich der in Figur 4A gezeigten Sequenz mit anderen in der Proteindatenbank der National Biomedical Research Foundation und der DNA-Sequenzsammlung von GenBank deckte keinerlei Sequenzen auf, die homolog zu der Steroid 5-- Reduktase waren.

4. Charakterisierung des Steroid 5α-Reduktaseproteins und der mRNA

Mehrere Berichte in der Literatur haben ein Rattenleberprotein von Mr 50000 identifiziert, das entweder Steroid 5α-Reduktaseaktivität besitzt oder an ein fotoaktivierbares Derivat von 4- MA kreuzverknüpft werden kann (45, 46). Um sicherzustellen, daß die in Figur 4a gezeigte Sequenz die vollständige kodierende Region der Steroid 5α-Reduktase repräsentierte, wurden 3 Untersuchungsarten durchgeführt. Erstens ergab, wie in Figur 5 gezeigt, die in vitro-Translation der von der Steroid 5-- Reduktase-cDNA erzeugten RNA in einem Kaninchen-Retikulozytenlysat ein Proteinprodukt mit einem apparenten Mr von 26000 (Spur 3). Wenn die Translationsreaktionen in der Gegenwart von Hundepankrease-Mikrosomen durchgeführt wurden, wurde ein Proteinprodukt derselben Größe beobachtet (Spur 4), was die Abwesenheit einer spaltbaren Signalsequenz in diesem Protein annehmen läßt. Die Tatsache, da die in vitro translatierte Steroid 5α-Reduktase in Mikrosomen aufgenommen wurde, wurde durch Proteaseschutz-Experimente gezeigt. Solange die vesikuläre Struktur der Mikrosomen aufrechterhalten wurde, war das translatierte Produkt größtenteils resistent gegenüber einer Spaltung durch Trypsin (Spur 5). Wenn jedoch die Mikrosomen mit dem Detergens Triton X-100 vor der Proteasebehandlung aufgebrochen wurden, dann war das Steroid 5α-Reduktaseprotein anfällig für eine Spaltung (Spur 6).
Die ungefähre Lokalisierung des Carboxylendes des Proteins wurde als nächstes durch Analysieren der Expression von RNA, die von einer Serie 3'-verkürzter Derivate der cDNA abstammte, bestimmt. Das Steroid 5α-Reduktase-cDNA-Plasmid wurde durch Spaltung mit 4 Restriktionsenzymen, die immer größere Anteile der vorausgesagten 3'-nicht-translatierten Region und/oder des Carboxylendes des Proteins intakt ließen oder entfernten, linearisiert. RNA wurde in vitro ausgehend von diesen Matrizen transkribiert, in Oozyten mikroinjiziert, und die Oozyten wurden unter Verwendung von Testosteron als Substrat auf Steroid 5α-Reduktaseaktivität getestet.
Wie in Figur 6a zusammengefaßt ist, ergab die Expression der intakten Steroid 5α-Reduktase-RNA die Reduktion von 67% des Testosteron-Substrats. Die Entfernung von 1474 Nukleotiden von der 3'-nicht-translatierten Region der mRNA beeinflußte die Expression der Enzymaktivität nicht wesentlich (BamHI-gespaltete Matrize, Figur 6a). Jedoch beseitigte die Entfernung von 1830 Nukleotiden vom 3'-Ende, welche 47 Aminosäurereste vom vorausgesagten Carboxylende des Proteins entfernt, die Steroid 5α- Reduktaseaktivität (PvuII-gespaltene Matrize, Figur 6a). Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer verkürzten RNA erhalten, die 57 Reste vom Carboxylende des Proteins entfernte (SacI-gespaltene Matrize, Figur 6a). In nicht gezeigten Experimenten erzeugten alle diese mRNAs nach in vitro-Translation in einem Retikulozytenlysat ein Protein der passenden Größe.
Die aminoterminale Region der Steroid 5α-Reduktase wurde durch Ausführen von Primer-Extensions-Experimenten an Leber-mRNA untersucht. Ein 40 Basen langer Oligonukleotid-Primer, der komplementär zu den Nukleotiden 70-109 der Figur 4a war, wurde radioaktiv markiert, an mRNA aus weiblicher und männlicher Rattenleber hybridisiert und mit reverser Transkriptase extendiert. Wie in Figur 6b gezeigt, wurde ein einzelnes Produkt von 125 Nukleotiden detektiert, wenn RNA aus weiblicher oder männlicher Leber als Matrize verwendet wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit einem einzigen 5'-Ende für die Steroid 5α-Reduktase-mRNA in diesem Gewebe überein und deuten an, daß die in Figur 4a gezeigte cDNA-Sequenz einen Klon fast vollständiger Länge repräsentiert. In zusätzlichen nicht gezeigten Experimenten wurde die Steroid 5α-Reduktase-mRNA in weiblicher Rattenleber unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Primers direkt sequenziert. Die Ergebnisse deuteten an, daß die mRNA nur 17 Nukleotide über das in Figur 4 gezeigte 5'-Ende der cDNA- Sequenz hinausgeht. Es gab keine im Leseraster befindlichen Stopp-Kodons in dieser 5'-Sequenz.

4. Die Leber- und ventralen Prostata-Formen der Steroid 5α- Reduktase sind identisch

Um zu bestimmen, ob die Steroid 5α-Reduktaseaktivitäten in der Leber und Prostata die Expression einer einzelnen mRNA zur Grundlage haben, wurde eine cDNA-Bank, die ausgehend von mRNA aus ventraler Prostata durch Random Priming hergestellt wurde, mit dem Insert durchsucht, das von dem Leber-cDNA-Klon stammte. Eine einzige Prostata-cDNA wurde nach Durchmustern von ungefähr 150000 unabhängigen Klonen isoliert. Die DNA-Sequenzanalyse der 5'- und 3'-Enden dieses Klons deutete an, daß dieser beim Nukleotid 1 begann und beim Nukleotid 1955 der in Figur 4a gezeigten Leber-cDNA-Sequenz endete. Die Sequenzen waren in diesen Regionen identisch zwischen den beiden Klonen. Die vollständige kodierende Region der von Prostata abstammenden cDNA wurde weiterhin einer DNA-Sequenzanalyse unterworfen, und ein Vergleich zu derjenigen der Leber-cDNA deckte wiederum keine Unterschiede auf. Diese Ergebnisse deuteten an, daß die Enzymaktivitäten in diesen beiden Geweben die Folge der Expression derselben mRNA waren.

5. Folgerungen

Die hier präsentierten Daten beweisen, daß eine einzelne mRNA für das Enzym Steroid 5α-Reduktase in sowohl der Leber als auch der Prostata der Ratte kodiert. DNA-Sequenzanalyse deutet an, daß diese mRNA für ein hydrophobes Protein mit einem Mr von 29000 kodiert. Diese Größe wurde durch in vitro-Translation, mRNA-Verkürzungsexperimente und Primer-Extensionsanalyse nativer mRNA bestätigt. Blot-Hybridisierungsanalysen der RNA und genomischen DNA bestätigen die Existenz einer einzigen mRNA und eines einzigen Gens für Steroid 5α-Reduktase.
Die Beteiligung der Steroid 5α-Reduktase und dessen Produkts - Dihydrotestosteron - bei der männlichen Geschlechtsentwicklung werden durch das klinische Syndrom der pseudovaginalen perineoskrotalen Hypospadie klar aufgezeigt (24). Zusätzlich zu dieser Rolle bei der Entwicklung ist Dihydrotestosteron im ausgewachsenen Organismus bei der normalen Aufrechterhaltung vieler verschiedener zellulärer und Organe betreffender Prozesse beteiligt. Tatsächlich ist die Annahme gemacht worden, daß es Dihydrotestosteron und nicht Testosteron ist, welches in dieser Beziehung das wichtigere Androgen ist (1). Als solches könnte die abnormale Expression der Steroid 5α-Reduktase und nachfolgende Dihydrotestosteron-Synthese an einer großen Anzahl menschlicher Krankheiten und endokriner Abnormalitäten beteiligt sein.
Es wird postuliert, daß eine lokalisierte Überproduktion von Dihydrotestosteron in der Prostata ein Faktor bei der bösartigen Prostata-Hypertrophie ist, einem Zustand, der die Mehrheit der älteren Männer betrifft (47). Ähnlich ist Dihydrotestosteron mit der Bildung von Akne und der Manifestation männlicher Haarlosigkeit (pattern baldness) in Verbindung gebracht worden (48). Letztendlich gibt es eine Hypothese für die Rolle dieses Hormons bei der Entwicklung und/oder der Anfälligkeit für Prostatakrebs, die zweithäufigste Krebsform in den Vereinigten Staaten (49). Der genaue Beitrag der Steroid 5α- Reduktase an diesen Krankheitsstadien blieb bisher im Ungewissen, da keine biochemischen oder genetischen Untersuchungsverfahren verfügbar waren. Die hier präsentierten Ergebnisse stellen viele gegensätzliche Auffassungen klar, die hinsichtlich dieses Enzyms 20 Jahre lang in der Literatur existierten und können die benötigten Untersuchungsverfahren bereitstellen.

Beispiel 11

Klonierung und Expression der humanen Steroid 5α-Reduktase

Das vorliegende Beispiel beschreibt die Verfahren, die von den Erfindern angewendet wurden, um durch die Klonierung des humanen Steroid 5α-Reduktasegens für humane Steroid 5α-Reduktase kodierende DNA-Segmente herzustellen. Bei diesem Verfahren wurde die in Beispiel I beschriebene Ratten-cDNA als Kreuzhybridisierungsprobe verwendet, um eine ausgehend von humaner Prostata hergestellte cDNA-Bank zu durchsuchen. Eine 2,1 kb-cDNA wurde identifiziert, und die DNA-Sequenzanalyse deutete an, daß die humane Steroid 5α-Reduktase ein hydrophobes Protein von 259 Aminosäuren mit einem vorausgesagten Mr von 29462 war. Jedoch deckte ein Vergleich der Sequenzen des humanen und Ratten- Proteins nur eine 60%-ige Identität auf. Die Transfektion von Expressionsvektoren, die humane und Ratten-cDNAs enthielten, in Affen-COS-Zellen führte zu der Synthese von hohen Raten an Steroid 5α-Reduktase-Enzymaktiviät. Die beiden in COS-Zellen exprimierten Enzyme zeigten eine ähnliche Substratspezifität für natürlich vorkommende Steroidhormone.
Unter Verwendung der in Verbindung mit der Erfindung entwickelten Screening-Assays entdeckten die Erfinder jedoch überraschend, daß potentielle therapeutische Inhibitoren deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Wirkung auf das humane Enzym im Vergleich zu der Wirkung auf die Ratten-Spezies zeigten. Beispielsweise zeigten synthetische 4-Aza-Steroide deutliche Unterschiede hinsichtlich deren Fähigkeiten, die humanen und Ratten-Steroid 5α-Reduktasen zu hemmen.

A. Angewendete Protokolle

1. Materialien

Radioaktiv markierte Steroide wurden von Du Pont - New England Nuclear erhalten, und die Steroidstandards waren von Sigma und Steraloids, Inc. Die 4-Aza-Steroide, 4-MA (17β-N,N-diethylcarbamoyl-4-methyl-4-aza-5α-androtan-3-on) und MK-906 (17β-N-t- butylcarbamoyl-4-aza-5α-androst-1-en-3-on) wurden von Merck Sharp und Dohme Research Laboratories zur Verfügung gestellt. Die Inhibitoren wurden einer chemischen Ionisierungs-Massenspektroskopie ausgesetzt, um vor deren Gebrauch ihre Identität zu bestätigen.

2. cDNA-Klonierung

Zwei cDNA-Banken wurden ausgehend von humaner Prostata-mRNA konstruiert. Für die erste cDNA, bereitgestellt von Dr. M.J. McPhaul von der Universität Texas, Southwestern Medical Center (22), wurde in den Bakteriophagen λgt10-Vektor, wie in Beispiel I beschrieben, ligiert. Für die zweite wurde Prostatagewebe von einem Patienten, an dem aufgrund einer prostatischen Hypoplasie ein chirurgischer Eingriff vorgenominen worden war, erhalten und für die Isolierung der polyadenylierten RNA verwendet (51). Eine größenfraktionierte cDNA-Bank wurde nachfolgend in λgt10 hergestellt (51) (siehe Beispiel I). Klone dieser Banken wurden unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen reduzierter Stringenz durchsucht (51). Die DNA-Sequenzanalyse wurde unter Verwendung automatisierter Verfahren an einem DNA-Sequenziergerät Modell 370A von Applied Biosystems (Foster City, CA) durchgeführt. RNA-Blotting wurde wie beschrieben durchgeführt (51).

3. Expressionsvektor-Konstruktion

Eine den Nukleotiden 1-1962 (siehe Beispiel I) entsprechende Ratten-Steroid 5α-Reduktase-cDNA wurde in den pCMV4-Expressionsvektor ligiert (52). Eine den Nukleotiden 1 bis 842 der Figur 7 entsprechende humane cDNA wurde anfänglich in pCMV4 ligiert. Um diese schlecht exprimierte humane cDNA zu modifizieren (siehe unten), wurden Oligonukleotide, die vom 3'-Ende der cDNA (5' ATAGATCTACCATGGCAACGGCGA 3') oder von der 3'-nichttranslatierten Region (5' AAAGTCCATAGAGAAGCGCCATTGG 3') stammten, in einer Polymerase-Kettenreaktion (53) verwendet, um die humane cDNA wie nachstehend beschrieben zu verändern. Nach der Amplifizierung wurde das Produkt in pCMV4 ligiert.

4. Expression der Steroid 5α-Reduktase-cDNAs in COS-Zellen

Affen-COS-M6-Zellen wurden wie beschrieben transfiziert (52). Der Assay auf Steroid 5α-Reduktaseaktivität in intakten Zellen wurde, wie in Beispiel I beschrieben, ausgeführt, außer, daß in
Ethanol gelöstes [¹&sup4;C]-markiertes Steroid zu dem Medium der transfizierten Zellen zugefügt wurde und die nachfolgenden organischen Extraktionen mit Dichlormethan ausgeführt wurden. Dünnschichtchromatographie und Flüssigszintilationszählung wurden, wie in Beispiel I beschrieben, durchgeführt. Um die IC&sub5;&sub0;- Werte für die 4-MA- und MK-906-Inhibitoren zu bestimmen, wurde eine Mischung aus [¹&sup4;C] Testosteron und Inhibitor in Ethanol zu dem Medium der transfizierten Zellen zugefügt, bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert und, wie vorstehend beschrieben, behandelt.
Um die Steroid 5α-Reduktaseaktivität in vitro auszutesten, wurden die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion geerntet, einmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und entweder in flüssigem N&sub2; eingefroren oder direkt mit einem Polytron bei einer Proteinkonzentration von 2 mg/ml in 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 150 mM KCl und 1 mM EDTA homogenisiert. Ein typischer Assay enthielt 10 bis 50 ug Zellhomogenisat- Protein in 0,5 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6, Ratten- Enzym; pH 7,0, humanes Enzym). Die Steroide wurden in 5 ul Ethanol zugefügt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von NADPH zu einer Endkonzentration von 2-5 mM gestartet. Die Inkubationen wurden für 10 Minuten bei 37ºC durchgeführt und durch Zugabe von 5 ml Dichlormethan gestoppt. Die organischen Extraktionen und die Dünnschichtchromatographieanalyse wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Bildung von 5α-reduzierten Steroidprodukten war hinsichtlich des Proteins über einen Bereich von 10 bis 50 ug und hinsichtlich der Inkubationszeit über eine Zeitdauer von 1 bis 30 Minuten linear.

B. Ergebnisse

1. Identifizierung und Analyse der humanen Steroid 5-- Reduktase-cDNAs

Um für humanes Steroid 5α-Reduktase kodierende Klone zu isolieren, wurden cDNA-Banken, die ausgehend von Prostata-mRNA konstruiert worden waren, bei reduzierter Stringenz mit einem radioaktiv markierten Fragment durchsucht, welches der kodierenden Region der Ratten-cDNA entsprach. Nach Durchsuchen von 3 x 10&sup6; Rekombinanten von zwei verschiedenen cDNA-Banken wurden insgesamt 5 cDNA-Klone isoliert. Jede dieser cDNAs wurde einer Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung unterworfen und repräsentierte eine Art von mRNA.
Die Sequenz des längsten cDNA-Inserts und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des humanen Steroid 5α-Reduktaseproteins sind in Figur 7 gezeigt. Von der DNA-Sequenz leitet sich eine Prostata-mRNA von mindestens 2,1 kb mit einer 3'-nicht-translatierten Region von ungefähr 1,3 kb ab. Innerhalb der 3'- nicht-translatierten Sequenz ist ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) 15 Nukleotide 5' zu einer Polyadenin-Aneinanderreihung lokalisiert, was andeutet, daß das authentische 3'-Ende dieser cDNA vorhanden ist. Eine 5'-nicht-translatierte Region von 30 Nukleotiden befindet sich vor einem Translationsleseraster von 780 Nukleotiden, welches für das Steroid 5α-Reduktaseprotein kodiert.
RNA-Blotting-Experimente deuteten an, daß diese cDNA an eine einzige Spezies humaner Prostata-mRNA von ungefähr 2,3 kb hybridisierte. Southern-Blot-Analyse und das Durchsuchen von Banken humaner genomischer DNA haben ähnlich die Gegenwart eines funktionellen Gens, das homolog zu dieser Steroid 5α-Reduktase-cDNA ist, aufgedeckt.

2. Struktur der humanen Steroid 5α-Reduktase und Vergleich mit dem Ratten-Enzym

Die Aminosäuresequenz der humanen Steroid 5c'-Reduktase wurde aus dem cDNA-Insert durch Vergleich mit derjenigen des funktionellen Ratten-Enzyms gefolgert. Das humane Enzym ist 259 Reste lang mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 29462. Über 40% der Aminosäuren in dieser Sequenz sind hydrophob, und nur 16% besitzen positiv oder negativ geladene Seitenketten (Figur 7). Diese Beobachtungen stimmen mit der intrazellulären Membranlokalisierung des Enzyms überein.
Die Ausrichtung der Sequenzen des humanen und Ratten- Steroid 5α-Reduktaseproteins ist in Figur 8 gezeigt. Das humane Enzym ist am Amino-Terminus 4 Aminosäuren länger als das Ratten- Enzym, und überraschenderweise beträgt die Gesamtidentität zwischen diesen zwei Proteinen nur 60%. Es ist ein einziger Methioninrest innerhalb der ersten 89 Aminosäuren des humanen Proteins vorhanden, während es 3 Methionine innerhalb der ersten 19 Reste des Ratten-Proteins gibt (Figur 8). Ein Vergleich der Sequenz des humanen Proteins mit denjenigen, die in der Datenbank der Genentech Corp. und National Biomedical Research Foundation vorhanden sind, deckte keine extensiv homologen Sequenzen auf.

3. Expression der humanen und Ratten-Steroid 5α-Reduktase in COS-Zellen

Um zu bestimmen, ob die beobachteten Sequenzunterschiede zwischen den humanen und Ratten-Steroid 5α-Reduktaseproteinen deren biochemische Eigenschaften beeinflussen, wurden die beiden cDNAs in Affen-COS-Zellen exprimiert. Für die Ratten-cDNA wurde ein den Nukleotiden 1 bis 1975 entsprechendes Fragment in den pCMV4-Expressionsvektor ligiert. Für die humane cDNA wurde ein den Nukleotiden 1 bis 842 der Figur 7 entsprechendes Fragment anfänglich in pCMV4 ligiert. Nachfolgende Transfektionsstudien deckten auf, daß die Expression dieser humanen cDNA eine 10- fach geringere Menge an Steroid 5α-Reduktase-Enzymaktivität ergab im Vergleich zu derjenigen, die ausgehend von Ratten-cDNA erhalten wurde. Die Betrachtung der Sequenz am 5'-Ende der humanen cDNA deckte ein stromaufwärts von der Position 5 befindliches ATG auf (Figur 7), das möglicherweise eine falsche Translationsinitation bewirken könnte, was zu der beobachteten Expressionsverminderung führt. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Polymerase-Kettenreaktion verwendet, um: 1) eine nur einmal vorkommende BglII-Restriktionsenzymstelle in die 5'- nicht-translatierte Region der cDNA einzuführen, 2) die stromaufwärts befindliche ATG-Sequenz zu entfernen und 3) einen optimalen Kontext für das ATG der Steroid 50'-Reduktase wieder herzustellen. Die Transfektion dieser modifizierten humanen cDNA in COS-Zellen führte zu der Expression von Raten an Steroid 5α-Reduktase-Enzymaktivität, die gleich war zu denjenigen, die mit dem Ratten-cDNA-Konstrukt erhalten wurden (s.u.).
Die Figur 9 zeigt die Ergebnisse eines in vivo-Experiments in Abhängigkeit der Zeit, bei welchem COS-Zellen mit Expressionsvektoren, die cDNAs für die Ratten- oder humane Steroid 5-- Reduktase trugen oder mit dem pCMV4-Vektor allein transient transfiziert wurden. 48 Stunden nach der Transfektion wurde [¹&sup4;C] Testosteron zu einer Endkonzentration von 2,5 uM zu den Zellmedien zugefügt, und die Umwandlung dieses Substrats in 5α-reduzierte Steroidprodukte wurde zu den angezeigten Zeiten durch Dünnschichtchromatographie aufgezeichnet. Die mit entweder den Ratten- oder humanen Steroid 5α-Reduktase-cDNAs transfizierten Zellen wandelten in einer Stunde die Hälfte des Ausgangssubstrats in die Produkte um (Figur 9). Die unspezifische Umwandlung in den mit dem Vektor allein transfizierten Zellen war gering, mit nur 0,5% Umwandlung, die nach einer Stunde stattfand.
Diese hohe Expressionsrate der cDNAs machte es möglich, den Assay auf Steroid 5α-Reduktaseaktivität mit Homogenisaten, die von transfizierten Zellen stammten, in vitro durchzuführen. Die Homogenisate wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt, und verschiedene biochemische Parameter wurden zuerst optimiert, um das Maximum der Steroid 5α-Reduktaseaktivität zu erhalten. Sowohl die Ratten- als auch die humanen Enzyme zeigten breite pH-Optima um 7,0. Das Einbringen von NADPH in den COS- Zellhomogenisierungspuffer hatte keinen Effekt auf die Stabilität der beiden Enzyme. Die spezifischen Aktivitäten der exprimierten Enzyme lagen im nmol/min/mg Protein-Bereich und waren folglich gleich zu denjenigen, die für Leberhomogenisate weiblicher Ratten berichtet worden waren (54).
Die Tabelle I zeigt die apparenten Km und Vmax-Werte, die mit 5 verschiedenen Steroid-Substraten für sowohl die Ratten- als auch humanen Steroid 5α-Reduktasen in vitro bestimmt wurden.
Die kinetischen Konstanten wurden ausgehend von einem Linweaver-Burk-Plot der Steroid 5α-Reduktaseaktivität in der Gegenwart von 0,6 bis 20 uM Substrat und die apparenten Km- und Vmax-Werte durch lineare Regressionsanalyse bestimmt. Die apparenten Km-Werte, die für diese 3 Substrate erhalten wurden, sind in guter Übereinstimmung mit denjenigen, die in der Literatur veröffentlicht worden waren (25). Ähnlich zeigten beide Enzyme sehr geringe Aktivitäten gegenüber 11 β-substituierten Steroiden, wie z.B. Cortisol oder Corticosteron (Tabelle 1). TABELLE I Charaktisierung der in transfizierten COS-Zellen exprimierten Ratten- und humanen Steroid 5α- Reduktase in vitro Ratte Mensch SUBSTRAT Vmax (nmol/min/mg Protein) Testosteron Androstendion Progesteron Cortisol Corticosteron INHIBITOR Die COS-Zelltransfektion, Zellhomogenisatpräparation und der Enzym-Assay wurden, wie in Materialien und Methoden beschrieben, durchgeführt. Jeder Km-Wert repräsentiert den Durchschnitt mindestens zweier Experimente, die an verschiedenen tagen unter Verwendung von Zelllysaten, welche ausgehend von verschiedenen Transfektionen hergestellt wurden, durchgeführt wurden. Obwohl beide Enzyme wirksam gegenüber Cortisol und Corticosteron waren, waren die Mengen der gebildeten 5α-reduzierten Produkte zu gering, um genaue kinetische Konstanten zu erhalten.
Die apparenten Ki-Werte wurden danach für zwei 4-aza-substituierte Steroide (4-MA und MK-906) bestimmt, welche Inhibitoren sowohl der humanen als auch Ratten-Steroid 5α-Reduktase-Enzyme darstellen (10). Die Studien wurden anfänglich in vitro nach einem Protokoll, in dem zwei Konzentrationen des [¹&sup4;C] Testosteron-Substrats in der Gegenwart steigender Konzentrationen eines gegebenen Inhibitors angewendet wurden, ausgeführt. Die erhaltenen Daten wurden mittels Dixon-Plots analysiert, um den Hemmungstyp und den apparenten Ki-Wert zu bestimmen (56). Die Figur 10 stellt die Ergebnisse dar, die in einem typischen Experiment mit Extrakten, welche ausgehend von mit humaner cDNA transfizierten COS-Zellen hergestellt worden waren, erhalten wurden. Die Ergebnisse beider Inhibitoren mit den Ratten- und humanen Enzymen sind in Tabelle I zusammengefaßt. Es wurde gefunden, daß die 4-MA-Verbindung in einer kompetitiven Weise sowohl die Ratten- als auch humanen Enzyme mit einem apparenten Ki im niedrigen Nanomolar-Bereich hemmt, eine Beobachtung, die in Übereinstimmung mit früher berichteten Werten steht (10). Überraschenderweise war MK-906 weniger wirksam als Inhibitor des humanen Enzyms (Ki = 340-620 nM) als ein solcher des Ratten-Enzyms (Ki = 3-5 nM).
Um diese in vitro-Ergebnisse zu bestätigen, wurden für die MK- 906- und 4-MA-lnhibitoren die IC&sub5;&sub0;-Werte unter Verwendung von intakten COS-Zellen, die mit den cDNAs der humanen und Ratten- Steroid 5α-Reduktase transfiziert worden waren, bestimmt. Wie in Figur 11 gezeigt, waren beide Verbindungen gleich wirksam hinsichtlich der Hemmung des Ratten-Enzyms. Jedoch war 4-MA ungefähr 10-fach wirksamer als MK-906 hinsichtlich der Hemmung des humanen Enzyms.

C. Diskussion

Die Isolierung und Charakterisierung einer humanen Steroid 5α- Reduktase-cDNA wird durch das vorliegende Beispiel beschrieben. RNA-Blot-Analyse deutete an, daß eine einzige mRNA-Spezies in der Prostata vorhanden war. DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß das humane Enzym 259 Aminosäuren enthielt, die 60% identisch zu denjenigen des Ratten-Enzyms waren. Die Transfektion der humanen und Ratten-cDNAs in Affen-COS-Zellen führte sowohl in intakten Zellen als auch in Zellhomogenisaten zu einer hohen Rate an Steroid 5α-Reduktaseaktivität. Die für verschiedene Steroid-Substrate und Inhibitoren berechneten Reaktionskonstanten deckten Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den humanen und Ratten-Enzymen auf.
Unter den beobachteten Unterschieden zwischen diesen beiden Proteinen sind mehrere bemerkenswert. Erstens sind die beiden Enzyme ziemlich unterschiedlich hinsichtlich ihrer Aminosäurensequenzen (Figur 8). Dieses Fehlen einer Konservierung ist am auffälligsten bei den 130 aminoterminalen Resten, in denen nur 50% der Aminosäuren identisch sind. Eine 75%-ige Konservierung in der carboxy-terminalen Hälfte führt zu einer Gesamtidentität von 60%. Mit der Ausnahme einer 4 Aminosäuren langen Verlängerung am Amino-Terminus des humanen Proteins mußten zum Erreichen einer maximalen Identität durch Ausrichtung keine Lücken in die beiden Sequenzen eingeführt werden. Die Hydropathie- Plots der humanen und Ratten-Enzyme, die durch den Algorithmus von Kyte und Doolittle berechnet wurden (50), sind fast identisch. Folglich könnten die beiden Proteine eine ähnliche Sekundärstruktur beinhalten, obwohl sie nur 60% ihrer Aminosäuren gemeinsam haben. Interessanterweise sind die beiden cDNAs auf Nukleinsäureebene 70% identisch in ihren kodierenden Regionen, ein Wert, der gewöhnlich aus dem Vergleich anderer homologer Sequenzen von Ratte und Mensch erhalten wird (57).
Das biochemische Verhalten der in COS-Zellen exprimierten Ratten- und humanen Enzyme ist ebenso ein Anzeichen für die Konservierung hinsichtlich des Vorhandenseins unterschiedlicher Strukturen. So zeigen die beiden Proteine eine Präferenz für Progesteron als Substrat über Testosteron und Androstendion (Tabelle I). Obwohl beide Enzyme Δ&sup4;, 11 β-substituierte Steroide reduzieren würden, waren für die Aktivitätsmessung sehr lange Inkubationszeiten mit diesen Substraten nötig. Die Tatsache, daß ähnliche apparente KmS für natürlich vorkommende Steroid- Substrate für die Ratten- und humanen Enzyme gemessen wurden, läßt annehmen, daß die beiden cDNAs für homologe Proteine und nicht unterschiedliche Isozyme kodieren.
Die Aktivitäten sowohl der Ratten- als auch humanen Enzyme in COS-Zellhomogenisaten waren bei physiologischen pH-Werten am höchsten. Dieses Ergebnis war für das humane Enzym unerwartet, da frühere Berichte ein pH-Optimum von ungefähr 5,0 bis 5,5 in Zellhomogenisaten, die ausgehen von Prostata (10), Nebennieren (11) oder Genitalienhautfibroblasten (12) hergestellt worden waren, bestimmten. Die Existenz einer Steroid 5α-Reduktaseaktivität mit einem alkalischen pH-Optimum ist ebenso für humane Fibroblasten berichtet worden (12, 58). Die Beziehung zwischen diesen Enzymen mit saurem und alkalischem pH-Optimum und dem von der humanen cDNA kodierten Protein ist zur Zeit unbekannt. Es ist möglich, daß es zwei Steroid 5α-Reduktasegene in Menschen gibt; jedoch belegen die gegenwärtigen genetischen Daten nur die Existenz eines für Steroid 5α-Reduktase kodierenden Gens im menschlichen Genom (59).
Unterschiede hinsichtlich des biochemischen Verhaltens der Ratten- und humanen Proteine wurden unter Verwendung synthetischer 4-Aza-Steroid-Inhibitoren aufgedeckt (Tabelle I). So war die Verbindung 4-MA ein wirksamer kompetitiver Inhibitor sowohl der Ratten- als auch humanen Enzyme, während MK-906 in sowohl in vivo- als auch in vitro-Assaysystemen ein 10-100-fach besserer Inhibitor des Ratten-Proteins als des humanen Proteins (Figuren 10 und 11) war. Ein tiefgreifender Unterschied zwischen den inhibitorischen Fähigkeiten dieser beiden Steroide wurde früher in einer Studie nicht entdeckt, welche das biochemische Verhalten der Steroide 5α-Reduktaseenzyme aus Ratten-, humaner und Hunde-Prostata verglich (10). Der Grund für diese Diskrepanz ist zur Zeit nicht bekannt, könnte jedoch im Zusammenhang mit Unterschieden hinsichtlich der spezifischen Aktivitäten der untersuchten Enzyme (nmol/min/mg Protein) (Tabelle I) gegenüber pmol/min/mg Protein (10)) oder mit der verschiedenen zellulären Umgebungen der beiden Enzyme (Affennierenzellen hier gegenüber humaner Prostata (10)) stehen.
Die Fähigkeit, hohe Mengen an humaner Steroid 5α-Reduktase in Säugerzellen zu exprimieren, sollte das Entwerfen wirksamerer und spezifischerer Inhibitoren dieses Enzyms für eine therapeutische Anwendung erleichtern (60). Zusätzlich sollte die Verfügbarkeit der humanen cDNA die Charakterisierung von Mutationen in der Steroid 5α-Reduktase erlauben, welche die Enzymaktivität vermindern und zu männlichem Pseudohermaphroditismus führen (3).
Obwohl die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist es für Durchschnittsfachleute offensichtlich, daß Variationen bei der Zusammensetzung, dem Verfahren und bei den Stufen oder der Folge der Stufen des hierin beschriebenen Verfahrens angewendet werden können, ohne von dem Konzept und dem Umfang der Erfindung abzuweichen. Insbesondere wird es offensichtlich sein, daß bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, die hierin beschriebenen Mittel ersetzen können, wobei dieselben oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden würden. Alle solche ähnlichen Ersatzmittel und Modifikationen, die für Durchschnittsfachleute offensichtlich sind, gelten als innerhalb des Umfangs und des Konzepts der Erfindung, wie sie durch die anhängenden Ansprüche definiert ist, liegend.

Referenzen

Die nachstehend aufgelisteten Referenzen sind hierin durch Bezugnahme in dem Maß eingeführt, daß sie die hierin verwendeten Verfahren, Techniken und/oder Zusammensetzungen ergänzen, erklären, lehren oder dafür Hintergrundwissen bereitstellen.
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Claims

1. DNA-Segment, welches für eine humane Steroid 5α-Reduktase kodiert, wobei das Segment durch ein Verfahren erhältlich ist, welches umfaßt:

(a) Herstellen einer Klon-Bank, die ausgehend von Wirtszellen hergestellt ist, welche DNA-Segmente rekombinanter, humaner DNA umfassen, wobei mindestens eine Wirtszelle ein DNA-Segment einschließt, das für ein Protein kodiert, welches die Aminosäuresequenz der Figur 7 umfaßt;

(b) Durchsuchen der Klon-Bank, um eine Wirtszelle zu identifizieren, die ein humanes Steroid 5α-Reduktase-DNA- Segment umfaßt, wobei die Klon-Bank durch ein Verfahren durchsucht wird, welches umfaßt:

A: Herstellen eines Oligonukleotid-Primers oder einer Oligonukleotid-Sonde, welcher(s) einen Abschnitt der in Figur 7 dargestellten DNA-Sequenz umfaßt; und Hybridisieren der Sonde mit DNA von den besagten Wirtszellen, um eine Wirtszelle zu identifizieren, welche ein humanes Steroid 5α-Reduktase-DNA-Fragment umfaßt; oder

B: Exprimieren der rekombinanten DNA durch Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um die besagte Expression zu bewirken; Testen auf die Herstellung von Steroid 5α-Reduktase durch

(1) Inkubieren der besagten Wirtszellen mit radioaktiv markiertem Steroid;

(2) Homogenisieren der besagten Wirtszellen;

(3) Extrahieren des besagten Steroids;

(4) Aussetzen des besagten Steroids einer Dünnschichtchromatographie;

(5) Ausschneiden der radioaktiven Bereiche aus den Chromatographieplatten;

(6) Aussetzen der radioaktiven Bereiche einer Flüssigszintillationsmessung;

(7) Identifizieren der Produkte durch Vergleich mit RF-Werten bekannter Standards, um 5α-reduzierte Formen des besagten Steroids nachzuweisen;

(c) Auswählen der so identifizierten Wirtszelle und Herstellen des DNA-Segments daraus.

2. DNA-Segment nach Anspruch 1, worin das besagte DNA-Segment für humane Steroid 5α-Reduktase mit einer Aminosäuresequenz, welche mehr als 60 % Identität mit der Aminosäuresequenz der Figur 7 aufweist, kodiert.

3. DNA-Segment nach Anspruch 2, welches weiterhin dahingehend definiert ist, daß es die für die Steroid 5α-Reduktase kodierende Nukleinsäuresequenz der Figur 7 umfaßt.

4. Rekombinanter Vektor, welcher ein DNA-Segment gemäß Anspruch 1 umfaßt.

5. Rekombinante Wirtszelle, welche ein rekombinantes DNA-Segment, das dem DNA-Seqment gemäß Anspruch 1 entspricht, beinhaltet.

6. Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 5, welche weiterhin dahingehend definiert ist, daß sie eine eukaryontische Wirtszelle ist.

7. Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 6, worin das DNA-Segment in das Genom der Wirtszelle integriert ist.

8. Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 5, worin das DNA-Segment auf einem rekombinanten Vektor positioniert ist.

9. Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 5, welche weiterhin dahingehend definiert ist, daß sie dazu fähig ist, eine biologisch aktive Steroid 5α-Reduktase zu exprimieren.

10. DNA-Segment, welches eine Sequenz umfaßt, die für eine humane Steroid 5α-Reduktase kodiert, worin das Segment mindestens einen 20 Nukleotide langen Abschnitt der in Figur 7 dargestellten DNA-Sequenz umfaßt.

11. DNA-Segment nach Anspruch 10, worin das Segment wenigstens einen 30 Nukleotide langen Abschnitt der in Figur 7 dargestellten DNA-Sequenz umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung von Steroid 5α-Reduktase, umfassend die Schritte des:

(a) Herstellens eines rekombinanten Wirts, wie durch Anspruch 9 definiert; und

(b) Kultivierens des rekombinanten Wirts unter Bedingungen, die die Herstellung von Steroid 5α-Reduktase durch den Wirt erlauben.

13. Verfahren zum Nachweisen der Fähigkeit einer in Frage kommenden Substanz, die enzymatische Aktivität der Steroid 5α-Reduktase zu beeinflussen, umfassend die Schritte des:

(a) Herstellens von Steroid 5α-Reduktase gemäß Anspruch 12; und

(b) Testens der Steroid 5α-Reduktase mit einer in Frage kommenden Substanz, um die Fähigkeit der Substanz nachzuweisen, eine enzymatische Funktion der Steroid 5α- Reduktase zu beeinflussen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Steroid 5α-Reduktase getestet wird, um zu bestimmen, ob sie durch die in Frage kommende Substanz gehemmt wird.

15. DNA-Segment, welches eine Sequenz umfaßt, die für eine humane Steroid 5α-Reduktase kodiert, ausgewählt aus der Sequenz der Figur 7 einer DNA-Sequenz, die für dieselbe Aminosäuresequenz wie die DNA-Sequenz der Figur 7 kodiert und einer Sequenz, die an die DNA-Sequenz der Figur 7 hybridisiert, ausgenommen eine Sequenz, die identisch ist mit der DNA-Sequenz der Figur 4.

16. Humane Steroid 5α-Reduktase, welche durch das DNA-Segment gemäß Anspruch 15 kodiert wird.

17. Verwendung der humanen Steroid 5α-Reduktase geiriäß Anspruch 16 für die Identifizierung von Substanzen, die die enzymatische Funktion der Reduktase hemmen oder anderweitig modifizieren oder verändern.