DE69112830T2

DE69112830T2 - Hybrides calcitonin.

Info

Publication number: DE69112830T2
Application number: DE69112830T
Authority: DE
Inventors: Tohru Hoshi; Eigoro Murayama
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd; Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; AGC Inc
Priority date: 1990-04-09
Filing date: 1991-04-08
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2011-04-09
Also published as: ATE127479T1; IL97761A0; HU9203198D0; EP0529075A1; HUT63636A; FI924542L; CN1055540A; US5831000A; AU646451B2; DE69112830D1; AU7549491A; GR3018146T3; NO923887D0; NO923887L; EP0529075B1; WO1991015511A1; EP0529075A4; YU63291A; DK0529075T3; FI924542A7

Description

Die Erfindung betrifft neue Calcitoninanaloge mit biologischen Aktivitäten.
Es ist bekannt, daß Calcitonin in natürlicher Form im Aal, Lachs, Huhn, Schwein, Menschen, Rind, Schaf und in der Ratte vorkommt. Unabhängig von seinem Ursprung besteht natürlich vorkommendes Calcitonin aus 32 Aminosäuren. Menschliches Calcitonin hat zum Beispiel die nachstehende Peptidstruktur:
Aal-Calcitionin hat die nachstehende Peptidstruktur:
Das Calcitonin, das natürlicherweise in Menschen und Tieren vorkommt, wird nachstehend allgemein als "natives Calcitonin" bezeichnet.
Die Japanischen Patent-Veröffentlichungen Nr. 277698/1988, 284198/1988, 287800/1988, J. Biochem. Band 159 (1986), S. 125, Endocrinology, Band 117 (1987), S. 80 und J. Biochem. Band 162 (1987), S. 399, offenbaren Analoge zu nativem Calcitonin. Analoge für natives Calcitonin schließen ein: Analoge, bei denen mindestens einer der Aminosäurereste im nativen Calcitonin mit einem anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist (Substitutionstyp); Analoge, bei denen mindestens einer der Aminosäurereste im nativen Calcitonin fehlt (Deletionstyp); Analoge, denen mindestens ein Aminosäurerest zwischen Aninosäureresten im nativen Calcitonin oder an einem Ende davon zugefügt ist (Additionstyp); und Analoge, bei denen zwei oder mehr der Substitutions-, Deletions- und Additionstypen miteinander kombiniert sind. Wenn zwei oder mehr Aminosäurereste ausgetauscht, entfernt oder zugefügt sind, können sie in der Peptidstruktur aufeinanderfolgend oder auseinanderliegend sein. Diese Arten von nicht-nativem Calcitonin werden nachstehend als "Calcitoninanaloge" bezeichnet.
Natives menschliches Calcitonin kommt zwar natürlicherweise im Menschen vor, aber es wurde gezeigt, daß seine biologischen Aktivitäten beim Menschen gering sind. Andererseits haben native Calcitonine, die von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammen, wie vom Lachs, Aal und Huhn, hohe biologische Aktivitäten für Menschen und sind vielversprechend für die Verwendung als Heilmittel für Osteoporose, neoplastische Hypercalcämie und Morbus Paget. Weiterhin sind Aal-Calcitoninanaloge kommerziell als Heilmittel hergestellt worden. Natives Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt und seine Analoge verursachen jedoch beim Menschen Nebenwirkungen wie schwere Nausea, Störungen der Funktionen des Verdauungstrakts und Antigenwirkung. Menschliches Calcitonin hat wenige, falls überhaupt irgendwelche dieser Nebenwirkungen.
Nausea, verursacht durch natives Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, und durch seine Analoge, wird in den nachstehenden Druckschriften beschrieben:
1) K. Takahashi et al., "Gan to Kagaku Ryoho (Cancer and Chemotherapy)", Band 12, Nr. 10 (1985), 2004-2010;
2) J. Egawa et al., "Gan no Rinsho (Clinical Aspects of Cancer)", Band 30, Nr. 3 (1984), 251-258; und
3) G.F. Mazzuoli et al., Calcif. Tissue Int., 38 (1986), 3-8.
Die Störungen der Funktionen des Verdauungstrakts, verursacht durch natives Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, und durch seine Analoge, werden in den nachstehenden Druckschriften beschrieben:
1) K. Jonderko, Gut (England), 30 (1989), 430-435;
2) K. Jonderko et al., J. Clin. Gastroenterol., 12 (1990), 22-28; und
3) J. Hotz et al., Digestion, 20 (1980), 180-189.
Die Antigenwirkung von nativem Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, und seiner Analoge, wird in den nachstehenden Druckschriften beschrieben:
1) F.R. Singer et al., J. Clinical Invest. 51 (1972), 2331- 2338;
2) J.G. Haddad et al., J. Clinical Invest. 51 (1972), 3133- 3141; und
3) A. Grauer et al., J. Bone and Mineral Res. 5 (1990), 387- 391.
Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, neue Calcitoninanaloge bereitzustellen, die im Fachgebiet noch nicht bekannt gewesen sind. Kurz gesagt, die vorliegende Erfindung stellt Calcitonin bereit, welches hohe biologische Aktivitäten für Menschen aufweist und dennoch wenig Nebenwirkungen bei Menschen hat. Das erfindungsgemäße Calcitonin ist ein Hybrid von menschlichem Calcitonin und Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, nämlich ein hybrides Calcitonin, zusammengesetzt aus einem Peptidsegment in menschlichem Calcitonin und einem Peptidsegment in Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung stellten fest, daß sich die Nebenwirkungsaktivität, die bei Menschen durch Calcitonin verursacht wird, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, hauptsächlich am Aminoende befindet, insbesondere in dem Peptidsegment, das aus den terminalen Aninosäureresten 1 - 16 besteht. Es wurde auch gefunden, daß, während alle diese 16 terminalen Aminosäurereste ersetzt werden können, die unerwünschten Nebenwirkungen ausgeschaltet werden konnten, indem mindestens 10 solcher Aminosäurereste ersetzt werden.
Für die hauptsächlichen biologischen Aktivitäten von Calcitonin, das von Menschen und von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, ist die Aminosäuresequenz am Carboxylende wichtig, wie es in den nachstehenden Druckschriften beschrieben wurde:
1) René Maier et al., FEBS Letters 48 (1974), 68;
2) René Maier et al., Clinical Endocrinology 5 (1976), 3275,
3) R.M. Epand et al., Eur. J. Brochom. 159 (1986), 125; und
4) D.M. Findlay et al., Endocrinology 117 (1987), 399.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung stellten fest, daß das vorstehend aufgeführte Peptidsegment, nämlich das Peptidsegment am Carboxylende mit den hauptsächlichen biologischen Aktivitäten, keine aktiven Stellen hatte, die unerwünschte Nebenwirkungen bei Menschen auslösen, und entwickelten basierend auf diesem Ergebnis ein hybrides Calcitonin. Infolgedessen kann unter dem Gesichtspunkt einer Reduzierung von Nebenwirkungen das Peptidsegment, bestehend aus Aminosäureresten in der 11. und den anschließenden Positionen in Richtung auf das Carbaxylende zu, entweder menschliches Calcitonin oder Calcitonin umfassen, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt.
Unter dem Gesichtspunkt biologischer Aktivitäten wird andererseits Calcitonin mit höheren biologischen Aktivitäten als menschliches Calcitonin bevorzugt. Infolgedessen ist das dem Carboxylende nähere Peptidsegment vorzugsweise ein Peptidsegment, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, und das höhere biologische Aktivitäten für Menschen als menschliches Calcitonin hat. In dieser Hinsicht hat das betrachtete Peptidsegment mindestens 4 Aminosäurereste und vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste.
Von den vorstehend beschriebenen Gesichtspunkten aus betrachtet besteht das erfindungsgemäße hybride Calcitonin aus zwei Peptidabschnitten, von denen einer den 1. bis 10. Aminosäurerest vom Aminoende umfaßt, welcher ein Segment in vom Menschen stammenden Calcitonin ist, und der andere den 29. bis 32. Aminosäurerest in Richtung Carboxylende umfaßt, nämlich ein Segment in von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammendem Calcitonin, wobei das dazwischenliegende Peptidsegment, das aus dem 11. bis 28. Aminosäurerest besteht, die Aminosäuresequenz eines der beiden Arten von Calcitonin hat. Falls gewünscht, kann es einen Übergang von der Aminosäuresequenz von menschlichem Calcitonin zu der von nicht-menschlichem Calcitonin an jeder Stelle des Peptidsegments zwischen dem 11. und 28. Aminosäurerest geben.
Um eine weitere Verringerung der Nebenwirkungen zu erreichen, ist das Peptidsegment am aminoterminalen Ende vorzugsweise aus dem 1. bis 13. Aminosäurerest von menschlichem Calcitonin zusammengesetzt. Um eine weitere Verbesserung der biologischen Aktivitäten zu erreichen, besteht das Peptidsegment an der 22. bis zur 32. Position vorzugsweise aus einem Peptidsegment, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt. Das Peptidsegment von der 14. bis 21. Position am aminoterminalen Ende kann die Aninosäuresequenz von jeder Art von Calcitonin haben, und es kann an jeder Position dieses dazwischenliegenden Segments einen Übergang von der Aminosäuresequenz von menschlichem Calcitonin zu der von nicht-menschlichem Calcitonin geben. Im am meisten bevorzugtem Fall besteht das erfindungsgemäße hybride Calcitonin aus einem Peptidsegment von menschlichem Calcitonin an der 1. bis 16. Position am aminoterminalen Ende und einem Peptidsegment in nicht-menschlichem Calcitonin an der 17. bis 32. Position.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung des zeitabhängigen Profils der Calciumkonzentration in Blutplasma während Behandlung mit verschiedenen Arten von Calcitonin;
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung des zeitabhängigen Profils der Stimulationsschwellenwerte nach der Verabreichung von verschiedenen Arten von Calcitonin;
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung der Anderungen des Körpergewichts von Ratten, denen verschiedene Arten von Calcitonin verabreicht wurden;
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung der Futteraufnahme der Ratten, denen verschiedene Arten von Calcitonin verabreicht wurden;
Fig. 5 ist eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Konzentration von Lachs-Calcitonin und Antikörperbindung; und Fig. 6 - 9 sind grafische Darstellungen des Wirkungsgrads der Bindung von Lachs-Calcitonin und zwei hybriden Calcitoninen an Anti-Lachs-Calcitonin-Mensch-Seren.
Der hier verwendete Begriff "menschliches Calcitonin" bedeutet sowohl natives menschliches Calcitonin als auch nicht-native menschliche Calcitoninanaloge. In ähnlicher Weise bedeutet der Begriff "nicht-menschliches Calcitonin oder Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt", sowohl natives Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, als auch nicht-native Analoge dieses nichtmenschlichen Calcitonins. Tiere mit Ausnahme der Menschen schließen vorzugsweise ein, sind aber nicht begrenzt auf Lachs, Aal und Huhn. Die Anzahl der ausgetauschten, entfernten oder zugefügten Aminosäurereste in den zwei Arten von Calcitoninanalogen ist nicht begrenzt auf irgendeinen bestimmten Wert, ist aber vorzugsweise nicht mehr als 5. Falls ein Peptidsegment von Interesse nicht mehr als 5 Aminosäurereste enthält, ist die Zahl der ausgetauschten, entfernten oder zugefügten Aminosäurereste vorzugsweise nicht höher als eins, und falls das Peptidsegment nicht mehr als 10 Aminosäurereste enthält, ist die entsprechende Zahl der ausgetauschten, entfernten oder zugefügten Aminosäurereste vorzugsweise nicht höher als 3.
Im Falle des Peptidsegments von menschlichem Calcitonin ist die Sequenz der ersten 10 Aminosäurereste vom aminoterminalen Ende vorzugsweise die gleiche wie die von nativem menschlichem Calcitonin, oder das Peptidsegment eines menschlichen Calcitoninanalogen kann die gleiche Aminosäuresequenz wie natives menschliches Calcitonin haben, außer daß der Methioninrest in Position 8 durch einen Valinrest ersetzt ist. Das gesamte Peptidsegment von menschlichem Calcitonin betreffend ist ein bevorzugtes Analoges so beschaffen, daß nicht mehr als zwei Aminosäurereste von nativem Calcitonin ausgetauscht, von diesem entfernt oder diesem zugefügt sind. Das am meisten bevorzugte Analoge ist so beschaffen, daß das Peptidsegment, als ganzes genommen, vom nativen Typ nur durch die Substitution am Methioninrest in Position 8 abweicht.
Im Falle des Peptidsegments von Calcitonin, das von Tieren mit Ausnahme der Menschen stammt, ist es vorzugsweise das gleiche wie das Peptidsegment des entsprechenden nativen Calcitonins, oder es kann das Peptidsegment von einem nichtmenschlichen Calcitoninanalogen sein, bei dem nicht mehr als 3 Aminosäurereste vom nativen Typ ausgetauscht, von diesem entfernt oder diesem zugefügt sind. Ein mehr bevorzugtes Analoges ist so beschaffen, daß das Peptidsegment, als ganzes genommen, eine Sequenz hat, in der nur ein Aminosäurerest vom nativen Typ ausgetauscht oder von diesem entfernt ist. Bevorzugte Tiere mit Ausnahme der Menschen sind solche, deren Calcitonin höhere biologische Aktivitäten beim Menschen aufweist. Beispiele von solchen Tieren schließen Fische, wie Lachs und Aal, und Vögel wie das Huhn ein. Lachs und Aal sind mehr bevorzugt, wobei Lachs besonders bevorzugt ist.
In Anbetracht dieser Tatsachen hat das erfindungsgemäße hybride Calcitonin vorzugsweise die nachstehende Aminosäuresequenz:
Im erfindungsgemäßen hybriden Calcitonin ist der Teil der Struktur von ganzem Calcitonin, der von Tieren mit Ausnahme der Menschen wie Lachs, Aal und Huhn, stammt, welcher Nebenwirkungen verursacht, wenn er Menschen verabreicht wird (z.B. Nausea, Störungen der Funktionen des Verdauungstrakts und Antigenwirkung) durch das entsprechende Segment von menschlichem Calcitonin ersetzt, das keine solchen Nebenwirkungen verursacht, wobei die Nebenwirkungen, die durch den vorherigen Teil verursacht sind, vermindert oder völlig beseitigt sind. Dies entspricht der Aussage, daß das erfindungsgemäße hybride Calcitonin die pharmakologisch aktive Stelle von menschlichem Calcitonin durch das entsprechende Segment von nicht-menschlichem Calcitonin ersetzt hat, um die gewünschten physiologischen Aktivitäten von menschlichem Calcitonin zu verstärken.
Das erfindungsgemäße hybride Calcitonin kann durch Festphasensynthese unter Verwendung von Polymerharzen synthetisiert werden, oder durch Flüssigphasensynthese, welche im Fachgebiet der organischen Synthese gewöhnlich verwendet wird. Im Falle der Synthese einer vergleichsweise kleinen Menge von Peptiden wird die Anwendung von Festphasensynthese bevorzugt. Andererseits wird im Falle der Synthese einer großen Menge von Peptiden der Einsatz von Flüssigphasensynthese bevorzugt. In Beispielen, die später in dieser Beschreibung beschrieben werden, wurden Peptide durch Festphasensynthese synthetisiert. Wenn jedoch das erfindungsgemäße hybride Calcitonin in einer großen Menge synthetisiert werden muß, wird der Einsatz von Flüssigphasensynthese, welche eine allgemein bekannte Technik in der Peptidsynthese ist, bevorzugt.
Das übliche Verfahren der Flüssigphasensynthese beginnt mit der Synthese von mindestens zwei Teilpeptiden aus je zwei oder mehr Aminosäureresten, verbindet dann diese Teilpeptide jeweils aufeinanderfolgend und erzielt schließlich das gewünschte Peptid mit der vorstehend spezifizierten Aminosäuresequenz (im Falle der vorliegenden Erfindung ist das gewünschte Peptid das bereits vorstehend beschriebene hybride Calcitonin) . Die Flüssigphasensynthese ist weiter durch die Durchführung der Reaktion der Peptidsynthese in einem flüssigen Medium, insbesondere in einem Medium wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, charakterisiert. Ein Teilpeptid besteht typischerweise aus 2 - 20, vorzugsweise 3 - 15 Aminosäureresten. In einem bevorzugten Fall werden etwa 2 - 10 Einheiten dieser Teilpeptide synthetisiert und dann nacheinander verknüpft, um das gewünschte Peptid auf zubauen.
In der vorstehend beschriebenen Peptidsynthese werden reaktive Derivate von Aminosäuren typischerweise als Ausgangsmaterialien verwendet. Falls die Ausgangsaminosäure andere aktive funktionelle Gruppen enthält als solche, welche Peptidbindungen bilden, werden jene aktiven funktionellen Gruppen vorzugsweise mit Schutzgruppen geschützt, die davon nach dem Ende der Peptidsynthese entfernt werden. Das in der vorliegenden Erfindung herzustellende Peptid hat eine 1-7-Disulfidbrücke, die in jeder gewünschten Stufe in Anschluß an die Synthese eines Teilpeptids mit einer 1-7-Sequenz gebildet wird. Diese Disulfidbrücke hat jedoch geringe Beständigkeit und wird vorzugsweise nach dem Ende der Peptidsynthese gebildet. Diese Bedingungen für die Verfahren von Schutz und Entfernung der Schutzgruppen und die Bildung einer Disulfidbrücke sind auch vorzugsweise in der Festphasensynthese übernommen worden, die nachstehend beschrieben werden soll.
Die Festphasensynthese ist ein Verfahren, bei dem ein Peptid mit der gewünschten Aminosäuresequenz durch aufeinander folgende Bindung von Aminosäureresten an ein Trägerharz synthetisiert wird. Dieses Verfahren kann mit einem automatischen Synthesizer automatisch durchgeführt werden.
Harze, die in der Festphasensynthese verwendet werden können, schließen Chlormethylharze, Oxymethylharze, 4- (Oxymethyl) phenylacetamidomethylharze, Benzhydrylaminharze und Polyacrylamidharze ein.
Den Erfordernissen entsprechend sind die in diesen Synthesen verwendeten Aminosäuren geschützte Aminosäuren. Beispiele für α-Aminoschutzgruppen sind eine Carbobenzoxygruppe (Z), eine tertiär-Butyloxycarbonylgruppe (Boc), eine Triphenylmethylgruppe (Trt), eine 9- Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc), eine Formylgruppe (HOC) und eine Acetylgruppe (Ac). Beispiele für α- Carboxylschutzgruppen sind eine Benzylgruppe (Bzl), eine tertiär-Butylgruppe (But), eine Methylgruppe (Me), eine Ethylgruppe (Et) und eine Phenacylgruppe (Pac). Gruppen die zum Schutz der funktionellen Gruppen in Seitenketten von Aminosäuren verwendet werden können schließen ein: eine Benzylgruppe (Bzl), eine p-Toluolsulfonylgruppe (Tos), eine p- Nitrophenylgruppe (NO&sub2;), eine Benzhydrylgruppe (Bzh), eine Acetamidomethylgruppe (Acm), eine tertiär-Butylgruppe (But), eine tertiär-Butyloxycarbonylgruppe (Boc), eine Cyclohexylgruppe (CHex) und eine 4-Methoxy-2,3,6- trimethylbenzolsulfonylgruppe (Mtr). Abhängig von der gestellten Aufgabe können eine oder mehrere dieser Schutzgruppen verwendet werden.
Die aufeinanderfolgende Additionsreaktion von Aminosäuren kann durch dehydratisierende Kondensation unter Verwendung von Carbodiimiden oder mit Hilfe von Aktivestern durchgeführt werden. Geeignete Carbodiimide umfassen Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, und geeignete Aktivester umfassen einen N-Hydroxysuccinimidester (-OSu), einen Pentafluorphenolester (-Opfp) und einen Dihydroxybenztriazinester (-ODhbt).
Reaktionslösungsmittel die verwendet werden können schließen ein: DMF, THF, Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat, Dioxan, DMS0, N-Methylpyrrolidon, Pyridin und Wasser.
In Abhängigkeit von der Art der zu entfernenden Schutzgruppen und von der Aufgabenstellung können zahlreiche Mittel zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet werden, wobei geeignete Beispiele Fluorwasserstoff, Trifluoressigsäure, Trifluormethansulfonsäure, Ammoniak/Methanol, Bromwasserstoff/Essigsäure, Wasserstoff/Palladium-auf- Aktivkohle, Quecksilberacetat, Essigsäure/Zinkpulver und Alkali/Wasser-Methanol einschließen.
Während oder nach der Synthese können zahlreiche Reinigungstechniken verwendet werden, wie Umkehrphasenchromatographie, Normalphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie sowie Umkristallisation. Disulfidbrücken können durch Oxidation an der Luft oder mit Kaliumhexacyanoferrat (III) gebildet werden.
Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, sollen aber in keiner Weise als Einschränkung betrachtet werden.
Beispiele 1 - 6 erläutern die Synthese der Proben von erfindungsgemäßem hybriden Calcitonin, und Beispiel 7 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Aminosäurezusammensetzung für die Calcitoninproben, die in den Beispielen 1 - 6 synthetisiert wurden. Beispiele 8 - 10 beschreiben die zur Bestimmung der Hauptaktivitäten des erfindungsgemäßen hybriden Calcitonins durchgeführten Versuche. Beispiele 11 - 14 beschreiben die zum Nachweis der Beseitigung der Nebenwirkungen von Calcitonin durchgeführten Versuche.

Beispiel 1

Synthese von hybridem (1-16) -Mensch/ (17-32)- Lachs-Calcitonin:
Die Synthese wurde mit einem Festphasensyntheseverfahren unter Verwendung eines automatischen Synthesizers durchgeführt.
(1) Anknüpfung von Prolin an Benzhydrylamin-(BHA)-Harz
Zehn Gramm BHA-Harz (-NH&sub2;: 0,38 mmol/g) wurden in 100 ml DMF suspendiert und aufgequollen. Nach Entfernung des Überstands wurden zusätzlich 100 ml DMF zugefügt, gefolgt vom Zusatz von Bocprooh (15 mmol), DCC (20 mmol) und HOBT (20 mmol). Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Filtration mit einem Glasfilter wurde das sich daraus ergebende Harz mit Methylenchlorid gewaschen.
Anschließend wurden 200 ml einer Methylenchloridlösung hinzugefügt, die 10% (v/v) Essigsäureanhydrid enthielt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 h geschüttelt, um die restlichen Aminogruppen zu blockieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz mit Methylenchlorid gewaschen und unter verminderten Druck getrocknet.
Nach dem Trocknen wurden 50 ml einer Methylenchloridlösung hinzugefügt, die 50% (v/v) Trifluoressigsäure enthielt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 h geschüttelt. Nach Filtration mit einem Glasfilter wurde das erhaltene Harz nacheinander mit Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid und Triethylamin gewaschen und unter verminderten Druck getrocknet.
(2) Sequentielle Additionsreaktion von Aminosäuren
Ein Gramm vom in (1) gewonnenen Harz wurde in die Säule eines automatischen Synthesizers gepackt und Aminosäuren wurden nacheinander unter den nachstehenden Bedingungen hinzugefügt.
(i) Reaktion: 30 min bei RT im Lösungsmittel DMF
(ii) Waschen: 10 min bei RT mit DMF
(iii) Fmoc-Entfernung: 10 min bei RT mit 20% (v/v) Piperidin im Lösungsmittel DMF
(iv) Waschen: 10 min bei RT mit DMF
Durch Wiederholen der Schritte (1) - (4) wurden 31 Aminosäuren, die Pro folgen, hinzugefügt. Die verwendeten Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgezählt. Tabelle 1
Nach der Reaktion wurden die Schutzgruppen und das Harz mit Fluorwasserstoff vom Peptid entfernt, und das Peptid wurde mit Äther gewaschen. Der Niederschlag wurde in einer wässerigen Lösung von 50% (v/v) Essigsäure aufgelöst und der unlösbare Anteil abfiltriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wobei ca. 600 mg Rohpeptid gewonnen wurden.
(3) Reinigung und die Bildung von Disulfidbrücken
Ein Teil (ca. 500 mg) vom Rohpeptid wurde in Wasser aufgelöst, das 0,1% (v/v) TFA enthielt, und die Lösung wurde einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie auf einer ODS- Säule unterworfen.
Unter Verwendung von Lösung A (Acetonitril mit 0,1% (v/v) TFA) und Lösung B (Wasser mit 0,1% (v/v) TFA) wurde die Säule mit einem stufenweisen Gradienten (A/B in % (v/v)) eluiert, der von 20 über 30 bis 40% anstieg, und Fraktionen bei 30% Elution wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Peptid (46 mg) wurde in 50 ml 0,05% (v/v) Essigsäure gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde mit 3 M Ammoniaklösung auf 8,5 eingestellt. Anschließend wurden 1,5 ml von 0,1 M K&sub3;Fe(CN)&sub6; hinzugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 min gerührt, um Disulfidbrücken zu bilden. Nach Einstellung des pH-Werts auf 5,0 mit 50% Essigsäure wurde ein Anionenaustauscherharz (Cl&supmin;-Form) hinzugefügt und das Gemisch wurde 20 min gerührt, gefolgt vom Abfiltrieren des Harzes.
Das Filtrat wurde konzentriert und einer Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie auf einer ODS-Säule unterworfen und wieder durch das vorstehend beschriebene Verfahren gereinigt. Fraktionen bei 30% Elution wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei 28 mg vom gewünschten Peptid erhalten wurden.

Beispiel 2

Synthese von hybridem (1-16) -menschliches/ (17- 32) -Aal-Calcitonin:
(1) Sequentielle Additionsreaktion von Aminosäuren
Ein Gramm vom Prolin enthaltenden, in Schritt (1) von Beispiel 1 hergestellten BHA-Harz wurde in die Säule eines automatischen Synthesizers gepackt und Aminosäuren wurden unter den in Schritt (2) von Beispiel 1 angewendeten Reaktionsbedingungen hinzugefügt. Die verwendeten Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2 Nach der Reaktion wurde das Peptidharz mit dem in Schritt (2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren behandelt, wodurch ca. 510 mg Rohpeptid gewonnen wurden.
(2) Reinigung und die Bildung von Disulfidbrücken
Ein Teil (ca. 450 mg) von Rohpeptid wurde einer Reinigung und der Bildung von Disulfidbrücken mit der in Schritt (3) von Beispiel 1 verwendeten Vorgehensweise unterzogen, wobei 32 mg gereinigtes Peptid gewonnen wurden.

Beispiel 3

Synthese von hybridem (1-16, Met&sup8; T Val&sup8;) menschlichen Analog/ (17-32) -Aal-Calcitonin:
(1) Sequentielle Additionsreaktion von Aminosäuren
Ein Gramm vom Prolin enthaltenden, in Schritt (1) von Beispiel 1 hergestellten BHA-Harz wurde in die Säule eines automatischen Synthesizers gepackt und Aminosäuren wurden unter den in Schritt (2) von Beispiel 1 angewendeten Reaktionsbedingungen hinzugefügt. Die verwendeten Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3
Nach der Reaktion wurde das Peptidharz mit dem in Schritt (2) von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren behandelt, wobei ca. 580 mg Rohpeptid gewonnen wurden.
(2) Reinigung und die Bildung von Disulfidbrücken
Ein Anteil (ca. 500 mg) vom Rohpeptid wurde einer Reinigung und der Bildung von Disulfidbrücken nach dem in Schritt (3) von Beispiel 1 angewendeten Verfahren unterworfen, wobei 35 mg gereinigtes Peptid gewonnen wurden.

Beispiel 4

Synthese von hybridem (1-16) menschlichen/(17- 31-Des-Leu¹&sup9;)-Aal-Analog-Calcitonin
(1) Sequentielle Additionsreaktion von Aminosäuren
Ein Gramm vom Prolin enthaltenden, in Schritt (1) von Beispiel 1 hergestellten BHA-Harz wurde in die Säule eines automatischen Synthesizers gepackt und Aminosäuren wurden unter den in Schritt (2) von Beispiel 1 angewendeten Reaktionsbedingungen hinzugefügt. Die verwendeten Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgelistet. Tabelle 4
Nach der Reaktion wurde das Peptidharz nach der in Schritt (2) von Beispiel 1 beschriebenen Methode behandelt, wobei ca. 520 mg Rohpeptid gewonnen wurden.
(2) Reinigung und die Bildung von Disulfidbrücken
Ein Anteil (ca. 450 mg) vom Rohpeptid wurde einer Reinigung und der Bildung von Disulfidbrücken nach dem in Schritt (3) von Beispiel 1 angewendeten Verfahren unterworfen, wobei 23 mg gereinigtes Peptid gewonnen wurden.

Beispiel 5

Synthese von hybridem (1-13) menschlichen/(14- 32)-Lachs-Calcitonin:
Die Synthese wurde nach einem Festphasensyntheseverfahren unter Anwendung eines automatischen Synthesizers durchgeführt.
(1) Anknüpfung von Prolin an Benzhydrylamin-(BHA)-Harz
Zehn Gramm BHA-Harz (-NH&sub2;: 0,38 mmol/g) wurden in 100 ml DMF suspendiert und aufgequollen. Nach Entfernen des Überstands wurden zusätzlich 100 ml DMF hinzugefügt, gefolgt vom Zusatz von BocProOH (19 mmol), DCC (19 mmol) und HOBT (19 mmol). Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Filtration mit einem Glasfilter wurde das erhaltene Harz mit Methylenchlorid gewaschen. Anschließend wurden 200 ml einer 10% (v/v) Essigsäureanhydrid enthaltenden Methylenchloridlösung hinzugefügt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h gerührt, um die restlichen Aminogruppen zu blockieren. Nach Abschluß der Reaktion wurde das Gemisch mit
Methylenchlorid gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Nach dem Trocknen wurden 50 ml einer 50% (v/v) Trifluoressigsäure enthaltenden Methylenchloridlösung hinzugefügt und das Gemisch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtration mit einem Glasfilter wurde das resultierende Harz nacheinander mit Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid und Triethylamin gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Ein Anteil des resultierenden Harzes wurde mit einem Aminosäureanalysator analysiert und es wurde gefunden, daß 0,31 mmol Prolin pro Gramm Harz enthalten war.
(2) Sequentielle Additionsreaktion von Aminosäuren
Ein Gramm des in Schritt (1) gewonnenen Harzes wurde in die Säule eines automatischen Synthesizers gepackt und Aminosäuren wurden nacheinander unter den nachstehenden Bedingungen hinzugefügt.
(i) Additionsreaktion: 30 min bei RT im Lösungsmittel DMF
(ii) Waschen: 10 min bei RT mit DMF
(iii) Fmoc-Entfernung: 10 min bei RT mit 20% (v/v) Piperidin im Lösungsmittel DMF
(iv) Waschen: 10 min bei RT mit DMF
Durch Wiederholen der Schritte (1) - (4) wurden 31 Aminosäuren nach Pro hinzugefügt. Die verwendeten Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle 5 aufgelistet. Tabelle 5
Nach der Reaktion wurden das Harz und die Schutzgruppen vom Peptid mit Fluorwasserstoff entfernt und das Peptid wurde mit Ether gewaschen. Der Niederschlag wurde in einer wässerigen Lösung von 50% (v/v) Essigsäure gelöst und der unlösliche Anteil wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wobei ca. 720 mg Rohpeptid gewonnen wurden.
(3) Reinigung und die Bildung von Disulfidbrücken.
Ein Anteil (ca. 700 mg) vom Rohpeptid wurde in 0,1% (v/v) TFA enthaltenden Wasser aufgelöst und die Lösung einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie auf einer ODS-Säule unterworfen.
Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, bestehend aus Wasser und Acetonitril mit 0,1% TFA, wurde die Säule mit einem stufenweisen Gradienten von Acetonitril eluiert, der von 20% (v/v) über 30% (v/v) bis 40% (v/v) anstieg, wobei Fraktionen bei 30% (v/v) Elution gesammelt und gefriergetrocknet wurden (primäre Reinigung).
Das gefriergetrocknete Peptid (ca. 80 mg) wurde in 80 ml von 0,05% (v/v) Essigsäure gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 3 M wäßrigen Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Anschließend wurden 1,5 ml von 0,1 M K&sub3;Fe(CN)&sub6; hinzugefügt und das Gemisch zur Bildung von Disulfidbrücken 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 mit 50% (v/v) Essigsäure wurde ein Anionenaustauscherharz (Cl--Form) hinzugefügt und das Gemisch 20 min gerührt, gefolgt vom Abfiltrieren des Harzes.
Das Filtrat wurde konzentriert und wieder einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie auf einer ODS-Säule unterzogen, welche mit dem bei der primären Reinigung angewendeten Lösungsmittelsystem mit einem stufenweisen Gradienten von Acetonitril von 25, 27 über 30 bis 35% (v/v) eluiert wurde (sekundäre Reinigung). Fraktionen bei 30% (v/v) Elution wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei 53 mg vom Titel-Peptid gewonnen wurden.

Beispiel 6

Synthese von hybridem (1-21) menschlichen/(22- 32)-Lachs-Calcitonin:
Ein Gramm vom Prolin enthaltenden, in Schritt (1) von Beispiel 5 hergestellten BHA-Harz wurde in die Säule eines automatischen Synthesizers gepackt und Aminosäuren wurden unter den in Schritt (2) von Beispiel 5 angewendeten Reaktionsbedingungen hinzugefügt. Die verwendeten Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle 6 aufgelistet. Tabelle 6
Nach der Reaktion wurde das Peptidharz mit der in Schritt (2) von Beispiel 5 eingesetzten Methode behandelt, wobei ca. 860 mg Rohpeptid gewonnen wurden.
(2) Reinigung und die Bildung von Disulfidbrücken
Ein Anteil (ca. 850 mg) vom Rohpeptid wurde einer Reinigung und der Bildung von Disulfidbrücken mit den in Schritt (3) von Beispiel 5 verwendeten Verfahren unterzogen.
Das sich ergebende Filtrat wurde konzentriert und wieder einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie auf einer ODS- Säule unterzogen, welche mit dem bei der primären Reinigung angewendeten Lösungssystem mit einem stufenweisen Gradienten von Acetonitril von 24 bis 35% (v/v) über 26, 28 und 30% (v/v) eluiert wurde (sekundäre Reinigung). Fraktionen bei 28% (v/v) Elution wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei 66 mg des gewünschten Peptids gewonnen wurden.

Beispiel 7

Analyse der Aminosäurezusammensetzung
Jedes der in den Beispielen 1 - 6 hergestellten gereinigten hybriden Calcitonine wurde bei 150ºC 1 h in Gegenwart von 6 N HCl hydrolysiert und die Aminosäurezusammensetzung wurde mit einem Aminosäure- Analysator analysiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Aminosäure Anmerkung: Die theoretischen Werte sind in Klammern gesetzt.

Beispiel 8

Test der biologischen Aktivitäten
Die sechs neuen, in den Beispielen 1 - 6 hergestellten Calcitonine wurden in einer 0,1 M Natriumacetat-Pufferlösung (pH-Wert 4,2) gelöst, die 0,1% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, und nüchternen (24 h ohne Nahrung) männlichen SD- Ratten (4 Wochen alt) in die Schwanzvene injiziert. Eine Stunde später wurde die Konzentration von Serumcalcium nach dem OCPC-Verfahren gemessen (Calcium C - Test Wako von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4 Die Calcitoninaktivität, die einen 10%igen Abfall der Konzentration von Serumcalcium verursachte, wurde als 10 mU festgelegt und die Anzahl der Einheiten pro Milligramm von Calcitonin wurde als "spezifische Aktivität" bezeichnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 neues Calcitonin spezifische Aktivität (U/mg) Beispiel * Durchschnitt für zwei Messungen

Beispiel 9

Wirksamkeit von Calcitoninen gegen Hypercalcämie
Verfahren:
Vitamin D&sub3; (5 mg/kg) wurde 5 Wochen alten männlichen SD- Ratten an 4 aufeinanderfolgenden Tagen oral verabreicht, um experimentelle Modelle von hypercalcemischen Ratten zu erhalten. Am 5. Tag wurden hybrides (1-16)-menschliches/(17- 32)-Lachs-Calcitonin (hybrides Calcitonin 1), Lachs-Calcitonin und menschliches Calcitonin jeweils in einer Menge von 4 IU/kg subcutan injiziert. Nach bestimmten Zeitintervallen wurde Blut entnommen und die Calciumkonzentration im Plasma gemessen.
Ergebnisse und Diskussion:
Die zeitabhängigen Profile von Plasma-Calcium- Konzentrationen für die Test-Calcitonine sind in Fig. 1 gezeigt. Wie man in Fig. 1 sehen kann, verursachten alle getesteten Calcitonine, nämlich hybrides Calcitonin 1, Lachs- Calcitonin und menschliches Calcitonin, eine schnelle Senkung der erhöhten Blutcalciumkonzentration. Es ist deshalb klar, daß das erfindungsgemäße hybride Calcitonin ebenso wirkungsvoll wie Lachs-Calcitonin und menschliches Calcitonin gegen Hypercalcämie ist.

Beispiel 10 Analgetische Wirkung von Calcitoninen

Verfahren:
i) Tier
zehn männliche Kaninchen (Kbl:JW) mit einem Gewicht von 2,7 - 3,2 kg wurden verwendet.
ii) Einsetzung einer Führungskanüle für intraventrikuläre Verabreichung
Die Kaninchen wurden unter Narkose mit Pentobarbital (30 mg/kg, i.v.) in einem stereotaktischen Gerät gesichert. Nachdem die Kopfhaut eingeschnitten worden war, wurde eine Führungskanüle für intraventrikuläre Verabreichung (Plastic Products) in das linke seitliche Ventrikel von jedem Tier eingeführt und mit Dentalzement fixiert (stereotaktische Koordinaten vom Bregma: nach hinten 4,0 mm; seitlich 5,5 mm; ventral 5,5 mm). Nach einwöchiger Rekonvaleszenz wurden die Kaninchen dem nachstehend beschriebenen Versuch unterzogen. Nach dem Versuch wurde Methylenblau injiziert, um die Kanülenlage zu verifizieren.
iii) Antinociception-Test
Die Kaninchen wurden mit einem Kaninchenhalter fixiert und ein Loch mit einem Durchmesser von 1 mm und einer Tiefe von 1 mm wurde in beide Seiten eines oberen Hauptschneidezahns mit einem Dentalbohrer gebohrt. Eine Stimulationselektrode wurde in jedes Loch eingepaßt und elektrische Stimulation (5 msec, 5 Hz, 3 sec Dauer) wurde bei verschiedenen Spannungen mit einem elektrischen Stimulator (Nihon Kohden Corp.) verabreicht, um die Stimulationsschwellenwerte (V) zu messen, die Schleckreaktionen (Schlecken und die Bewegung von Lippen und Unterkiefer) bei den Tieren auslösten. Messungen wurden eine Stunde vor der Wirkstoffverabreichung, unmittelbar nach der Verabreichung, sowie 0,5 h, 1,0 h, 1,5 h, 2,0 h, 3,0 h und 4,0 h nach der Verabreichung durchgeführt.
Die getesteten Wirkstoffe waren hybrides (1-16)- menschliches/(17-32)-Lachs-Calcitonin (hybrides Calcitonin 1), Lachs-Calcitonin und menschliches Calcitonin, wobei jedes in einer 8 IU/kg entsprechenden Menge intraventrikulär verabreicht wurde. Physiologische Kochsalzlösung wurde zur Kontrolle verwendet.
Ergebnisse und Diskussion:
Die zeitabhängigen Profile der Stimulationschwellenwerte für die Test-Calcitonine sind in Fig. 2 gezeigt. Wie man aus Fig. 2 ersehen kann, verursachten die drei Calcitonine vergleichbare Zunahmen des Schwellenwerts, der 0,5 - 1,5 h nach der Wirkstoffgabe seinen Spitzenwert hatte. Es ist deshalb berechnet worden, daß das erfindungsgemäße hybride Calcitonin bezüglich der analgetischen Wirkung ebenso wirkungsvoll ist wie Lachs-Calcitonin und menschliches Calcitonin.

Beispiel 11

Wirkungen von Calcitoninen auf die Hemmung von Körpergewichtszunahme und Appetit
Verfahren:
Ratten wurde hybrides (1-16) menschliches/(17-32)-Lachs- Calcitonin (hybrides Calcitonin 1), menschliches Calcitonin und Elcatonin intramuskulär injiziert, und ihr Körpergewicht und ihre Nahrungsaufnahmen wurden 24 h später gemessen.
Ergebnisse:
Die Änderungen des Körpergewichts von Ratten nach Verabreichung der verschiedenen Calcitonine sind in Fig. 3 und ihre Nahrungsaufnahmen in Fig. 4 gezeigt. Jedes der Calcitonine wurde in drei unterschiedlichen Dosen verabreicht: 12,5 IU/kg, 50 IU/kg und 200 IU/kg. Für die Körpergewichtsänderungen wurden die gemessenen Werte über 5 Ratten gemittelt und für die Nahrungsaufnahme wurden die gemessen Werte für 5 Ratten addiert.
Diskussion:
Wie es aus Fig. 3 und 4 klar wird, zeigten Lachs- Calcitonin und Elcatonin dosisabhängige Wirkungen auf die Hemmung von Körpergewichtszunahme und Appetit, während hybrides Calcitonin 1 und menschliches Calcitonin keine Unterschiede beim Körpergewicht und bei der Nahrungsaufnahme verursachten. Es kann deshalb die Schlußfolgerung gezogen werden, daß das erfindungsgemäße hybride Calcitonin ebenso geringe Wirkungen auf Körpergewichtszunahme und Appetit verursacht wie menschliches Calcitonin.

Beispiel 12

Wirkungen von Calcitoninen auf die Magenentleerungszeit
Verfahren:
Weiblichen, seit dem Vortag fastenden Beagles wurde hybrides (1-16)menschliches/(17-32)-Lachs-Calcitonin (hybrides Calcitonin 1), Lachs-Calcitonin, menschliches Calcitonin und physiologische Kochsalzlösung über eine Schädelvene injiziert. Eine Stunde später wurden darmlösliche Aspirintabletten (mit 200 mg Wirkstoff) oral verabreicht, zusammen mit 25 ml Wasser. Danach wurden Blutproben aus der anderen Schädelvene zu bestimmten Zeitintervallen entnommen, und das nach der üblichen Methode gewonnene Plasma wurde bei -20ºC bis zur Messung gelagert.
Sobald es die Darmwand durchwandert, wird das meiste aufgenommene Aspirin metabolisiert und tritt in den Blutstrom als Salicylsäure ein. Infolgedessen wurde Salicylsäure im Plasma als Marker für Aspirin bestimmt. Ethanol (200 ul) wurde zu 50 ul Plasma hinzugefügt und das Gemisch bei 10,000 UpM 1 min zentrifugiert und der so erhaltene Überstand einer HPLC unterzogen.
Ergebnisse:
Die Verzögerungswirkung jedes Calcitonins auf die Magenentleerungszeit ist in Tabelle 9 zusammengefaßt. Die Differenz zwischen der Zeit von der Calcitoningabe bis zur Absorption von Aspirin und die Zeit von der Verabreichung von physiologischer Kochsalzlösung bis zur Absorption von Aspirin wurde für jedes Tier berechnet, um die Verzögerung der Magenentleerungszeit zu bestimmen. Tabelle 9 Dosis, Haltezeit, Verzögerungzeit, Calcitonin Calcitonin 1 hybrides Lachs-Calcitonin menschliches
Anmerkungen:
"Lag"-Zeit: Zeit von Aspiringabe bis zu seiner Absorption
Verzögerungszeit: zeitliche Differenz zur Aspirinabsorption zwischen Calcitonin und physiologischer Kochsalzlösung
Diskussion:
Wie Tabelle 9 zeigt, hatte Lachs-Calcitonin eine sehr starke Wirkung bei der Verzögerung der Magenentleerungszeit, während menschliches Calcitonin nur eine geringe Wirkung hatte. Hybrides Calcitonin 1 war bei der Verzögerung der Magenentleerungszeit menschlichem Calcitonin ähnlicher als Lachs-Calcitonin. Es kann deshalb die Schlußfolgerung gezogen werden, daß das erfindungsgemäße hybride Calcitonin 1 der vorliegenden Erfindung in einer höheren Dosis von Aktivitätseinheiten verabreicht werden kann als Lachs- Calcitonin.

Beispiel 13

Wirkungen von Calcitoninen auf die gastrointestinale Motilität beim Hund im Wachzustand.
Verfahren:
Ein gesunder Beagle mit einem Gewicht von ungefähr 10 kg wurde mit einer i.v.-Injektion von Pentobarbitalnatrium betäubt und die Bauchhöhle unter aseptischen Bedingungen geöffnet.
Extraluminale Kraftübertrager wurden auf die Serosa des Antrums des Magens, Zwölffingerdarms und Jejunums genäht, um zirkuläre Muskelkontraktionen zu messen, wie vorher berichtet (Itoh et al., Gastroenterol. Jpn. 12 (1977), 275.
Die Zuleitungsdrähte dieser Übertrager wurden aus der Bauchhöhle herausgeführt und dann durch einen zwischen den Schulterblättern gemachten Hauteinschnitt herausgeleitet.
Nach der Bauchoperation wurde ein 5 cm langer longitudinaler Hauteinschnitt am rechten vorderen Hals gemacht, um die äußere Halsvene freizulegen.
Ein Silastic-Schlauch (französische Größe 8,5, Dow Corning, Midland, MI) wurde in die vordere Vena cava durch die Vene eingeführt und auf die angrenzende Haut als i.v.- Injektionsweg von Testwirkstoffen genäht.
Nach der Operation wurde dem Hund ein Schutzmantel angelegt, um die Zuleitungsdrähte und den Silastic-Schlauch zu schützen.
Der Hund wurde in einem eigenen Versuchskäfig gehalten und mit handelsüblichem Hundefutter um 17:00 Uhr gefüttert, wobei Wasser frei zugänglich war.
Die gastrointestinale motorische Aktivität wurde auf einem Thermostift-Schreibrecorder (WR-3101, Graphtic, Tokyo, Japan) durch Verbinden der Anschlußdrähte der Übertrager mit den Verbindungskabeln der Verstärker (UG-5, Nihon Kohden, Tokyo, Japan) aufgezeichnet.
Ungefähr zwei Wochen postoperativ konnte das gastrointestinale Kontraktionsvermögen in zwei Aktivitätshauptmuster unterteilt werden, nämlich Zwischenzustände und Verdauungszustände.
Im Zwischenzustand wurde beobachtet, daß in regelmäßigen Intervallen von 100 bis 120 min im Magen-Antrum ein IMC (im Zwischenzustand wandernder motorischer Komplex, "interdigestive migrating motor complex") auftrat und sich durch den Zwölffingerdarm und das Jejunum mit konstanter Geschwindigkeit fortpflanzte.
Bei allen Tieren unterbrach die Fütterung das normale IMC- Muster. Versuche wurden während des Zwischenzustands durchgeführt. Der Wirkstoff wurde in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung gelöst und über den angelegten Silastic- Schlauch etwa 10 sec lang mit einem Volumen von 0,3 ml/kg verabreicht.
Anschließend wurde 15 min nach dem Ende des IMC im Antrum des Magens mit 0,9% Kochsalzlösung gespült. Die Zeit bis zum Auftreten des nächsten IMC ab Verabreichung des Wirkstoffs wurde gemessen und als Index für die Hemmungwirkung des Wirkstoffs auf die gastrointestinale Motilität verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
Ergebnisse: Tabelle 10 Lachs-Calcitonin menschliches Calcitonin Hybrid-Calcitonin 1Hybrid-Calcitonin 2 Dosis, ug/kg
Anmerkungen:
1. Die Indizes von "IMC-Verzögerung" verstehen sich wie folgt.
0 ... Nächster IMC ereignete sich innerhalb von 180 min nach Verabreichung.
0,5. .. Nächster IMC ereignete sich nach mehr als 180min, aber innerhalb von 300 min nach Verabreichung.
1 ... Nächster IMC ereignete sich einen Tagnach Verabreichung.
2 ... Nächster IMC ereignete sich zwei Tagenach Verabreichung.
3 ... Nächster IMC ereignete sich drei Tagenach Verabreichung.
2. Hybrides Calcitonin 1 war (1-16)-menschliches/(17-32)- Lachs-Calcitonin und hybrides Calcitonin 2 war (1-21)- menschliches/(22-32)-Lachs-Calcitonin.
Diskussion:
Wie in Tabelle 10 gezeigt, hemmte das i.v. verabreichte Lachs-Calcitonin dosisabhängig das Auftreten des nächsten IMC beim Hund im Wachzustand.
Bei einer Dosis von 3 ug/kg war das Auftreten des nächsten IMC um 3 Tage verzögert. Andererseits hatte menschliches Calcitonin nur einen geringfügigen Effekt auf den IMC.
Obwohl hybride Calcitonine ebenfalls den IMC hemmten, verzögerten diese Verbindungen das Auftreten des nächsten IMC nur um einen Tag, selbst bei der höchsten geprüften Dosierung (100 ug/kg)
Unsere Ergebnisse zeigen eindeutig auf, daß hybride Calcitonine eine schwächere Wirkung als Lachs-Calcitonin auf die gastrointestinale Motilität beim Hund in Wachzustand hatten.
Diese Ergebnisse deuteten ebenfalls darauf hin, daß hybride Calcitonine voraussichtlich weniger nachteilige Wirkungen auf den Gastrointestinaltrakt verursachen werden als Lachs-Calcitonin.

Beispiel 14

Kreuzreaktion zwischen menschlichen Antikörpern gegen Lachs-Calcitonin und hybridem Calcitonin.
Verfahren:
Lachs-Calcitonin wurde mit einem üblichen Festphasensyntheseverfahren synthetisiert. Lachs-Calcitonin, markiert mit ¹²&sup5;I, wurde nach dem Tejedor-Verfahren hergestellt (Tejedor, F. und Ballesta, J.P.G.: Analytical Biochemistry 127 (1982), 143-149)
Vier Arten von menschlichen Seren, die nachweislich Antikörper nach Verabreichung von Lachs-Calcitonin enthielten, wurden von Dr. Frederick R. Singer (CEDERS-SINAI MEDICAL CENTER) hergestellt. Die Antikörper-Titer dieser Seren gegen Lachs-Calcitonin waren die folgenden:
Nr. 1 1 : 4000 Nr. 2 1 : 8000
Nr. 3 1 : 8000 Nr. 4 1 : 2000
1) Bestimmung des Verhältnisses der Serumverdünnung
Eine 0,1 M Borat-Pufferlösung (pH 8,0), die 0,5% BSA, 0,9% NaCl, 0,1% NaN&sub3; und 0,05% Tween 20 enthielt, wurde als Reaktionspuffer verwendet. Dieser Reaktionspuffer, menschliches Anti-Lachs-Calcitonin-Serum (verdünnt mit dein Reaktionspuffer zu einer Endverdünnung von 100 - 6.400) und eine Lösung von markierten Calcitonin wurden in ein Hilfsrohr (Spitz-Typ von Salschted Inc., mit den Maßen 12 x 75 mm) in den jeweiligen nachstehend gezeigten Mengen gefüllt, gründlich gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Reaktionspuffer menschliches Anti-Lachs-Calcitonin-Serum Lösung von markiertem Calcitonin *1 vollständige Bindung (B) *2 nicht-spezifische Bindung (NSB)
Die Reaktionslösung wurde mit 500 ul von 0,2% BGG (Rinderγ-Globulin, Sigma) gut gemischt, weiterhin mit 1 ml von 25% PEG #6000 gemischt, gründlich gerührt und danach bei Raumtemperatur 15 min stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde dann mit einer Zentrifuge ("Bucket"-Typ) (O5RP-22 von Hitachi) bei 3.000 UpM 10 min bei 4ºC zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands durch Absaugen wurde die Radioaktivität des Rückstands mit einem Gammazähler gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
2) Konkurrierende Reaktion zwischen ¹²&sup5;I-markiertem Lachs- Calcitonin und Lachs-Calcitonin oder hybridem Calcitonin.
Der Reaktionspuffer, verschiedene Arten von Calcitonin, Anti-Lachs-Calcitonin-Mensch-Serum und die Lösung von markierten Calcitonin wurden in den jeweiligen nachstehend angezeigten Mengen in ein Hilfsrohr gefüllt und anschließend in gleicher Weise behandelt wie bei der Bestimmung der Serumverdünnung. Reaktionspuffe Calcitonin Anti-Lachs-Calcitonin-Mensch-Serum Lösung von markierten Calcitonin
Die beiden verwendeten hybriden Calcitonine waren: 1. (1- 16) -Mensch/ (17-32) -Lachs-Calcitonin; 2. (1-21) -Mensch/(22-32)- Lachs-Calcitonin.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 - 9 gezeigt.
Ergebnisse und Diskussion:
Es wurde untersucht, ob ¹²&sup5;I markiertes Lachs-Calcitonin mit Lachs-Calcitonin um Anti-Lachs-Calcitonin-Mensch-Serum Nr. 1 (Fig. 5) konkurriert. Man erhielt ähnliche Kurven, wenn Anti-Lachs-Calcitonin-Mensch-Seren Nr. 2 - 4 verwendet wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß Lachs-Calcitonin mit dem markierten Lachs-Calcitonin bei einer Dosis von mindestens 1 ng/ml zu konkurrieren begann.
Versuche mit den vier Arten von Seren zeigten, daß weder hybrides Calcitonin 1 noch 2 von den Anti-Lachs-Calcitonin- Mensch-Seren erkannt wurde (Fig. 6 - 9).
Es wird deshalb gefolgert, daß das erfindungsgemäße hybride Calcitonin als ein wirkungsvolles Medikament für Patienten verwendet werden kann, die Anti-Lachs-Calcitonin- Antikörper produzieren.
Das erfindungsgemäße hybride Calcitonin hat den herausragenden Vorteil, daß es ebenso starke biologische Aktivitäten wie Lachs-, Aal- und Huhn-Calcitonine aufweist, wobei es aber keine Nebenwirkungen einschließlich Brechreiz, Störungen in den Funktionen des Verdauungstrakts und Antigenwirkung verursacht. Es hat ferner einen Verfahrensvorteil in der Hinsicht, daß Nebenreaktionen, die sonst während der Synthese auftreten würden, durch Austausch von Met&sup8; in menschlichem Calcitonin gegen Val&sup8; verhindert werden können.

Claims

1. Hybrides Calcitonin, bestehend aus zwei Peptidsegmenten und dadurch gekennzeichnet, daß

(1) ein Segment ein Peptidsegment von humanem Calcitonin oder ein Analoges davon ist, wobei das Segment an der näher zum aminoterminalen Ende gelegenen Seite lokalisiert ist, und das andere Segment ein Peptidsegment von Calcitonin ist, das von einem Tier, ausgewählt aus Fischen und Vögeln, stammt oder ein Analoges davon, wobei das Segment an der näher zum carboxyterminalen Ende gelegenen Seite lokalisiert ist,

(2) das Peptidsegment an der näher zum aminoterminalen Ende gelegenen Seite mindestens 10 Aminosäurereste von humanem Calcitonin oder einem Analogen davon umfaßt und das Peptidsegment an der näher zum carboxyterminalen Ende gelegenen Seite mindestens 6 Aminosäurereste eines von einem Tier, ausgewählt aus Fischen und Vögeln, abstammenden Calcitonins oder einem Analogen davon umfaßt,

(3) das Peptidsegment von humanem Calcitonin oder einem Analogen davon, das an der näher zum aminoterminalen Ende gelegenen Seite lokalisiert ist, entweder ein Peptidsegment von nativem humanen Calcitonin oder ein Peptidsegment von einem humanen Calcitonin-Analogen ist, wobei nicht mehr als zwei Aminosäurereste des Peptidsegments von nativem humanen Calcitonin ausgetauscht, von diesem deletiert oder diesem zugefügt wurden, und der erste und siebte Aminosäurerest vom aminoterminalen Ende ein Cysteinrest ist, und

(4) das Peptidsegment eines von einem Tier, ausgewählt aus Fischen und Vögeln, stammenden Calcitonins oder eines Analogen davon, das an der näher zum carboxyterminalen Ende gelegenen Seite lokalisiert ist, ein Peptidsegment von nativem Fisch-Calcitonin oder nativem Vogel-Calcitonin ist oder ein Peptidsegment von einem Fisch-Calcitoninanalogen oder einem Vogel- Calcitoninanalogen, wobei nicht mehr als drei Aminosäurereste des Peptidsegments von nativem Fisch-Calcitonin oder nativem Vogel-Calcitonin ausgetauscht, von diesem entfernt oder diesem zugefügt wurden.

2. Hybrides Calcitonin nach Anspruch 1, wobei das Fisch-Calcitonin von Aal oder Lachs und das Vogel-Calcitonin vom Huhn stammt.

3. Hybrides Calcitonin nach Anspruch 1, wobei das erste Peptidsegment die Aminosäurereste 1 bis n (n = 13 - 21) vom aminoterminalen Ende umfaßt.

4. Hybrides Calcitonin nach Anspruch 3, wobei das Peptidsegment von einem humanen Calcitoninanalogen einen Valinrest besitzt, der gegen den 8. Methioninrest in nativem humanem Calcitonin ausgetauscht ist.

5. Hybrides Calcitonin nach Anspruch 3, wobei das zweite Peptidsegment ein Peptidsegment von nativem Aal- oder Lachs-Calcitonin ist oder ein Peptidsegment von einem Calcitoninanalogen, wobei ein Aminosäurerest in dem Peptidsegment von nativem Aal- oder Lachs-Calcitonin substituiert oder von diesem entfernt worden ist.

6. Hybrides Calcitonin, wobei die Sequenz vom ersten bis zum 16. Aminosäurerest vom aminoterminalen Ende der von dem ersten bis zum 16. Aminosäurerest in nativem humanen Calcitonin entspricht, und die Sequenz vom 17. bis 32. Aminosäurerest der vom 17. bis zum 32. Aminosäurerest in nativem Aal- oder Lachs-Calcitonin entspricht.

7. Hybrides Calcitonin mit der folgenden Strukturformel:

8. Hybrides Calcitonin nach Anspruch 7 mit der folgenden Strukturformel

9. Verfahren zur Herstellung von hybridem Calcitonin nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mit der Sequenz dieses hybriden Calcitonins durch Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese synthetisiert wird und die Disulfidbrücke dieses Peptids während eines beliebigen Stadiums der Synthese dieses hybriden Calcitonins gebildet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Peptid mit der Sequenz dieses hybriden Calcitonins ohne Bildung der Disulfidbrücke vollständig synthetisiert wird und die Disulfidbrücke danach gebildet wird.

11. Arzneimittel, enthaltend das hybride Calcitonin nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 11, umfassend das Kombinieren eines hybriden Calcitonins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem Träger, Diluent und/oder Excipienten.

13. Verwendung des hybriden Calcitonins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels mit nur geringen Nebenwirkungen zur Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen die Verabreichung von Calcitonin indiziert ist.