DE69032841T2

DE69032841T2 - Rekombinante zellen für therapien von infektionen und hyperprolieferative störungen und deren herstellung

Info

Publication number: DE69032841T2
Application number: DE69032841T
Authority: DE
Inventors: Mark A. West Roxbury Ma 02132 Goldsmith; Robert O. San Francisco Ca 94122 Ralston
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-01-23
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2010-01-23
Also published as: JP2859252B2; US5837510A; US5861290A; PT92931B; JPH10179181A; DE69033975D1; PT92931A; ATE219519T1; ATE174514T1; DE69032841D1; DE69033975T2

Description

Die Erfindung betrifft Gentechnik und die Behandlung von hyperproliferativen Störungen und Infektionen.

Hintergrund der Erfindung

Die Therapie viraler Infektionen steckt in ihren Anfängen. Bakterielle Infektionen werden typischerweise mit Mitteln, wie Antibiotika, welche die Unterschiede zwischen dem infizierenden Organismus und seinem Wirt hinsichtlich des Stoffwechsels ausnutzen, behandelt. Viren verwenden jedoch weitgehend die wirtseigenen Enzyme, um ihre Replikation zu bewirken und lassen folglich wenige Möglichkeiten für einen pharmakologischen Eingriff. Durch Verwendung starker Regulationselemente erreicht der Virus Transkription und Translation seiner eigenen Gene auf Kosten von Wirtsgenen.
Bei den Säugetieren wird eine virale Infektion natürlicherweise durch cytotoxische T- Lymphozyten, welche virale Proteine, wenn sie auf der Oberfläche der Wirtszellen exprimiert werden, erkennen und die infizierten Zellen lysieren, bekämpft. Die Zerstörung der infizierten Zelle vermeidet die weitere Virusreplikation. Andere Verteidigungsmittel schließen die Expression von Interferon, welche die Proteinsynthese und die Virusknospung inhibiert und die Expression von Antikörpern, welche freie Viruspartikel aus den Körperflüssigkeiten entfernen, ein. Das Auslösen dieser natürlichen Mechanismen erfordert jedoch das Bloßlegen der Virusproteine für das Immunsystem. Viele Viren, z. B. Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1), zeigen eine Ruhe- oder Latenzphase, während der wenig oder keine Proteinsynthese durchgeführt wird. Die Virusinfektion ist während solcher Phasen im wesentlichen unsichtbar für das Immunsystem.
Retroviren befördern die infektiöse Form ihres Genoms in Form eines RNA-Strangs. Nach Infektion wird das RNA-Genom in DNA revers transkribiert und wird dann typischerweise in die chromosomale Wirt-DNA an einer zufälligen Stelle integriert. Gelegentlich erfolgt die Integration an einer Stelle, welche ein Gen, welches für einen essentiellen zellulären Rezeptor oder Wachstumsfaktor codiert, verkürzt, oder welche ein solches Gen unter Kontrolle des starken viralen cis-aktiven Regulationselements stellt, was eine Transformation der Zelle in einen malignen Zustand zur Folge haben kann.
Viren können auch infolge der Wirksamkeit ihrer transaktiven Regulationsfaktoren auf Regulationssequenzen der Wirtszelle onkogen sein. Tatsächlich war Onkogenese das charakteristische Merkmal, welches zur Entdeckung der ersten bekannten, menscheninfizierenden Retroviren führte. HTLV-I und HTLV-II (humane T-lymphotrope Viren I und II) wurden in den Blutzellen von Patienten, welche unter Adultativ-T-Zell-Leukämie (ATL) litten, identifiziert, und es wurde angenommen, daß sie die neoplastische Transformation durch die Wirkung ihrer transaktiven Faktoren auf die Lymphozyten-Promotor-Bereiche induzieren. HTLV-I und II infizieren vorzugsweise menschliche Lymphozyten und verursachen gelegentlich deren Transformation zur Malignität. Seitdem wurde herausgefunden, daß zwei weitere Retroviren Menschen infizieren: HIV-I und HIV-II, die ätiologischen Erreger von AIDS. HIV-I und II tragen jedoch anscheinend nur durch ihre immunsuppressiven Wirkungen zu Krebs bei.
HIV-I und II infizieren anscheinend Zellen, welche das CD4-Oberflächenprotein exprimieren. Dieses Protein ist in großer Menge auf Thymozyten und einigen T-Lymphozyten vorhanden und in einem geringeren Umfang auf einigen Antigen-präsentierenden Zellen. Die HIV- Infektion ist anfänglich durch grippeähnliche Symptome gekennzeichnet, gefolgt von einer langen Latenzperiode, welche 5 bis 10 Jahre dauern kann. Nach Beginn ihrer aktiven Phase hat die HIV-Infektion eine schnelle Verminderung der Population der "Helfer"-T-Lymphozyten (TH) zur Folge, welche üblicherweise als eine Verminderung des Verhältnisses von T4&spplus;/T8&spplus; (CD4&spplus;/CD8&spplus;)T-Lymphozyten erkannt wird. Der Patient macht typischerweise schwere Diarrhoe durch, und, falls das zentrale Nervensystem infiziert ist, zeigt er eine Form von Demenz. Die Verarmung an TH-Zellen legt das Immunsystem lahm, und der Patient erliegt einer opportunistischen Infektion durch z. B. P. carinii oder Cytomegalovirus, oder dem Karposi-Sarkom. Das natürliche Immunsystem scheint gänzlich unfähig zu sein, eine HIV-Infektion zu bekämpfen, abgesehen vom typischen Vorhandensein des anscheinend neutralisierenden Serum-Antikörper- Titers während der Latenz.
Die gegenwärtige Therapie einer HIV-Infektion ist per se hauptsächlich auf die Verabreichung von AZT beschränkt, um die virale Progredienz zu hemmen, obwohl M. S. Hirsch, J. Infect. Dis. (1988), 157: 427-31 über eine synergistische Hemmung von HIV durch AZT zusammen mit GM-CSF (Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) oder α-Interferon berichtet. AZT (3'-Azido-3'-desoxythymidin) ist ein Vertreter einer Klasse von Didesoxynukleosid-(ddN)-Antivirusmittel. Diese Mittel stützen sich auf die Fähigkeit der Wirts-DNA-Polymerasen, ein ddN nicht anzunehmen und die Neigung der viralen Polymerasen, ddNs zu akzeptieren und sie in replizierende Polynukleotide einzubauen. Nach Einbau stoppt ein ddN die Polymerisation, da es nicht die 3'-Hydroxylgruppe, welche für die nächste Phosphodiesterbindung notwendig ist, besitzt. Die ddNs sind typischerweise in ihrer verabreichten Form inaktiv und hängen hinsichtlich der Umwandlung in das aktive Triphosphat ddNTP von der Phosphorylierung durch Wirtszellenzyme ab.
H. Mitsuya et al., Nature (1987), 325: 773-78 beschreiben die Organisation des HIV-Genoms und schlagen verschiedene Strategien zur Entwicklung von HIV-Therapien vor. Erdachte Therapien schließen die Verabreichung von Gegensinn-RNA (αls freie Stränge oder codiert durch einen "Antivirus"), um die Virustranskription zu hemmen, die Verabreichung von Glykosylierungsinhibitoren, die Verabreichung von Interferonen, um die Virusknospung zu hemmen, und die Verabreichung von Didesoxynukleosidanaloga, um die Virusreplikation zu hemmen, ein. Didesoxynukleosidanaloga-Mittel, welche nützlich für eine HIV-Therapie sind (z. B. AZT, ddC, etc.), hängen hinsichtlich der Aktivierung durch Phosphorylierung von Wirtszellenzymen ab. D. Baltimore, Nature (1988), 335: 395-96 schlug vor, durch Entfernen von Knochenmarkszellen aus einem infizierten Subjekt und durch Transfizieren der hämatopoetischen Zellen in dem Knochenmarkextrakt mit DNA oder einem Virus, codierend für eine RNA oder ein Protein, fähig, das Wachstum von HIV zu stören, AIDS zu behandeln. Die DNA könnte eine RNA, welche an HIV-Regulationsproteine Gegensinn-RNA, mutierte Viruspolypeptide oder ein virales DNA- Bindungsprotein, welchem seine Regulatorfunktion fehlt, binden kann, codieren. Die transfizierten Zellen würden dann wieder in das Subjekt eingeführt und mit einem selektiven Vorteil versehen, um die Dissemination sicherzustellen.
A. I. Dayton et al. Cell (1986), 44: 941-47 beschreiben, daß das HIV-tat-Gen essentiell für die virale Proteinsynthese und -replikation ist. Dayton schlug vor, daß man HIV durch Störung von tat hemmen könnte, ohne die Wirtszelle anderweitig zu beeinträchtigen. M. A. Muesing et al., Cell (1987), 48: 691-701 beschrieben, daß das tat-Protein (eher als die tat-mRNA allein) für die Transaktivierung essentiell ist. Muesing fand auch heraus, daß eine tat-art-Fusion (mit 114 Aminosäuren, fusioniert mit dem C-Terminus von tat durch Deletion von 7 Nukleotiden), die volle tat-Aktivität behält. A. D. Frankel et al., Science (1988), 240: 70-73 beschrieben, daß tat in vitro metallgebundene Dimere bildet, und schlug vor, daß mögliche Behandlungen von AIDS die Chelatinierung von Metallionen oder Konkurrenz um tat-Monomerbindung einschließen kann. A. D. Frankel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1988); 85: 6297-30 beschrieben die Synthese eines HIV-1-tat-Fragments, welches die Metallbindungseigenschaften von tat behielt. Das Fragment bildete mit nativem tat Heterodimere und konnte tat aus Homodimeren verdrängen. Frankel schlug vor, die Dimerisierung von tat unter Verwendung des tat-Fragments zu hemmen, wobei Liposomen zur Beförderung der Peptide oder eines tat-Fragment-Gens verwendet werden. Die Aminosäuresequenz, beschrieben für tat aus einem HIV-1-Isolat, lautet:
Ein ähnliches Protein wurde in HIV-2 gefunden.
Die tar-Sequenz, welche in cis wirkt und durch HIV-tat reguliert wird, wurde etwa bei den Nukleotiden +19 bis +82 in dem HIV-1-Genom aufgefunden. Die Sequenz enthält zwei ausgedehnte umgekehrte Sequenzwiederholungen, und es wird demgemäß vorausgesagt, daß sie fähig ist, Stammschleifenstrukturen zu bilden (Muessing, a. a. O.). HIV-2 zeigt einen ähnlichen Bereich.
Haseltine, US-PS 4 738 922 beschrieb die HTLV-I- und -II-LTR-Promotorbereiche und ihre Verwendung zusammen mit trans-Aktivatoren (luk) in Vektoren für eine verstärkte Expres sion heterologer Proteine am Beispiel von Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). HTLV-I- LTR fördert anscheinend die konstitutive Expression, welche in der Gegenwart von HTLV-I-luk weiter verstärkt wird, wohingegen HTLV-II-LTR anscheinend HTLV-II-luk für die Expression benötigt. Haseltine bemerkte, daß trans-aktive Virusfaktoren die Expression sowohl von Wirtszellgenen als auch von Virusgenen verändern können, und Haseltine beschrieb das Konzept, einen Vektor mit der HTLV-LTR, fusioniert mit einem heterologen Gen, in eine Zelle mit dem HTLV-Genom einzuführen, was die trans-Aktivierung des heterologen Gens und die Überexpression seines Produkts zur Folge hat. Haseltine beschrieb die Verwendung von HTLV-LTR in Abwesenheit von luk, um leere Capsidvaccine zu erzeugen, und schlug vor, das HTLV-LTR zur Expression von Antigenen zu verwenden, um die Zerstörung der Zelle durch monoclonale oder polyclonale Antikörper zu erreichen.
E. A. Dzierzak et al., Nature (1988), 331: 35-41 beschrieben ein prototypisches Gentherapieverfahren an Mäusen. Dzierzak entfernte Knochenmarkzellen aus Mäusen, setzte die Mäuse lethaler Bestrahlung aus und führte humane β-Globin(BG)-Gene in das entfernte Mark unter Verwendung eines retroviralen Vektors, pSV(X)neo, ein. Das BG-Gen wurde in der Weise eingefügt, daß es in der entgegengesetzten Richtung zur Provirustranskription gelesen wird, und Konstrukte sowohl mit als auch ohne die viralen LTR-Enhancerbereiche wurden hergestellt. Den Mäusen wurde dann das rekombinante hämatopoetische Stammzellen enthaltende Knochenmark wieder eingesetzt. Dzierzak fand, daß humanes β-Globin in den resultierenden rekombinanten Mäusen exprimiert wurde und daß die Expression nur in Zellen der Erythroidlinie gefunden wurde. J.-K. Yee et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA (1987), 84: 5197-201 beschrieben die Konstruktion von retroviralen Vektoren, codierend für HPRT unter der Kontrolle von entweder dem Metallothioneinpromotor oder dem humanen Cytomegalovirus(hCMV)-Promotor. Yee fand, daß die HPRT-Expression sich verdoppelte, sobald die Transkriptions-Regulations-Sequenzen aus dem U3-Bereich des retroviralen LTR deletiert wurden.
S. F. Yu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986), 83: 3194-98 beschrieben die Konstruktion von selbstinaktivierenden("SIN") retroviralen Gentransfervektoren. SIN-Vektoren werden durch Deletion der Promotor- und Enhancersequenzen aus dem U3-Bereich des 3'-LTR erzeugt. Ein funktionierender U3-Bereich im 5'-LTR erlaubt die Expression des rekombinanten Virusgenoms in geeigneten Verpackungszellinien. Nach Expression seiner genomischen RNA und reverser Transkription in cDNA wird der U3-Bereich des 5'-LTR des ursprünglichen Provirus deletiert und durch den U3-Bereich des 3'-LTR ersetzt. Folglich ersetzt der nichtfunktionsfähige 3'- LTR-U3-Bereich, sobald der SiN-Vektor integriert, den funktionsfähigen S'-LTR-U3-Bereich und macht den Virus unfähig, das genomische Transkript mit voller Länge zu exprimieren. Yu konstruierte ein rekombinantes Virus unter Verwendung der Mo-MuLV-LTR-Bereiche und der Verpackungs(psi)-Sequenz und fügte ein Neomycinresistenz(Neo)-Gen unter der Kontrolle von entweder einem Metallothioneinpromotor (Virus MT-N), einem HSV-tk-Promotor (Virus TK- N) oder einem SV40-Promotor (Virus SV-N) als einen selektierbaren Marker ein. Yu fügte auch ein humanes c-fos-Gen unter der Kontrolle eines humanen Metallothioneinpromotors (hMT) in TK-N ein und zeigte die induzierbare Transkription von c-fos in NIH-3T3-Zellen nach Infektion mit dem rekombinanten Virus.
S. L. Mansour et al., Nature (1988), 336: 348-52 beschrieben ein Verfahren zur Selektion von Zellen nach homologer Rekombination mit einem linearen Transfektionsvektor. Ein linearer Vektor wurde mit einem Bereich, homolog zu einem Zielgen, mit einem Neomycinresistenzgen, eingefügt in ein Exon des homologen Bereichs und mit einem HSV-tk-Gen außerhalb des homologen Bereichs, hergestellt. Nach spezifischer homologer Rekombination zeigte die transformierte Zelle einen für den Zielbereich und HSV-tk negativen und für Neoymcinresistenz positiven Phänotyp (homologe Rekombination in die Zielstelle unterbricht das Gen der Zielstelle und kann nicht das tk-Gen einbauen). Der Phänotyp unterscheidet Zellen mit homologer Rekombination von solchen mit nichtspezifischer Integration, da die letzteren Zellen einen für das Zielgen, HSV-tk und Neomycinresistenz positiven Phänotyp zeigen. Neomycinresistenz wird durch Kultivieren der Zellen mit Neomycin getestet, wohingegen tk&spplus; durch Kultivieren der Zellen mit Gancyclovir (welches durch tk in ein toxischer Produkt umgewandelt wird) getestet wird.
Maniatis et al., Science (1987), 236: 1237-1245 liefern einen Überblick über das Thema induzierbare gewebsspezifische Genexpression in Eukaryonten.
R. D. Palmiter et al., Cell (1987), 80: 435-43 beschreiben die Herstellung transgener Mäuse mit einem DNA-Konstrukt, codierend für die Diphtheria-A-Kette unter Kontrolle des Elastasepromotors. Der Elastasepromotor ist nur in pankreatische azinöse Zellen aktiv und fördert die Expression von Elastase. Die DNA-Konstrukte wurden in Mäuseeier mikroinjiziert, und die resultierende Nachkommenschaft wurde untersucht. Transgene Mäuse, in denen das Konstrukt aktiv war, konnten kein normales Pankreasgewebe entwickeln.
Das Diphtheria-Toxingen in einem solchen Konstrukt konnte z. B. durch ein Ricin-A-Gen ersetzt werden (siehe Piatak et al., J. Biol. Chem. (1988) 263, 4837-4843).
M. E. Selsted et al., J. Clin. Invest. (1985), 76: 1436-39 beschrieben die erste Aminosäuresequenz für drei verwandte humane cytotoxische Effektor-Polypeptide, bezeichnet als humane neutrophile antimikrobielle Peptide (HNPs). Die drei HNPs besitzen 29 bis 30 Aminosäurereste und zeigen eine Wirksamkeit gegen Bakterien, Pilze und den Herpes-simplex-Virus (T. Gantz et al., J. Clin. Invest. (1985), 76: 1427-35).
T. L. Wasmoen et al., J. Biol. Chem. (1988), 263: 12559-63 beschrieben die erste Aminosäuresequenz des humanen eosinophilen Granula-Hauptbasisproteins ("human eosinophil granule major basic protein" (MBP)). MBP ist ein Effektor-Polypeptid mit 117 Aminosäureresten, einem pl von 10,9 und zeigt eine cytotoxische Wirksamkeit gegen Säugetierzellen und Parasiten.
M. A. Adam et al., J. Virol. (1988), 62: 3802-06 beschrieben retrovirale Vektoren, welche eine effiziente Verpackung von RNA zeigen, mit einer psi&spplus;-Sequenz. RD. Cone et al., Mol. Cell. Biol. (1987), 7: 887-97 beschrieben die Konstruktion von retroviralen Vektoren (pSVX), welche ein humanes β-Globingen einschlossen und die Verwendung der rekombinanten Vektoren, um die Expression von humanem β-Globin in einer murinen Erythroleukämiezellinie zu erreichen. A. D. Miller et al., Mol. Cell. Biol. (1986), 6: 2895-902 beschrieben Zellinien, welche zur Verpackung replikationsdefekter retroviraler Vektoren nützlich sind.
Guild et al., J. Virol. (1988), 62 : 3795-801 beschrieben retrovirale Vektoren mit der Mo- MuLV-LTRs- und psi(Verpackungs)-Sequenz, welche nützlich für die Übertragung vollständiger Gene in Säugetierzellen sind. Guild verwendete β-Actin- und Histonpromotoren (welche im wesentlichen in allen Zellen aktiv sind), um die Transkription von neor (αls ein selektierbarer Marker) zu erreichen. Die Expression des neo wurde in vivo gezeigt, nachdem virusinfizierte Knochenmarkszellen dazu verwendet worden waren, lethal bestrahlte Mäuse wiederherzustellen.
A. D. Friedman et al., Nature (1988), 335: 452-54 beschrieben die Transfektion von tk&supmin;- Mäusezellen mit Plasmiden, welche HSV-1-tk und HSV-1-VP16 exprimieren. VP16 wirkt als ein Transaktivator für die Transkription der unmittelbar frühen Gene des Herpes-simplex-Virus (HSV-1). Auf dem VP16-Plasmid wurde der Promotor durch den Mo-MSV-Promotor ersetzt, und der Carboxy-Terminus des VP 16 wurde deletiert. Das resultierende Plasmid codierte für ein mutiertes VP 16-Protein, welches mit Wildtyp-VP 16 um die DNA-Bindung konkurrierte. Transfizierte Zellen zeigten Resistenz gegen HSV-1-Replikation nach späterer Infektion. Friedman schlug vor, daß man Resitenz gegen HIV dadurch induzieren könnte, daß man mit einer dominanten Mutante des HIV-Transaktivatorproteins (tat) transfiziert.
J. Sodroski et al., Science (1985), 229: 74-77 beschrieben die Lage des HIV-tat-Gens. J. Sodroski et al. Science (1985), 227: 171-73 beschrieben die Konstruktion eines Plasmids mit CAT unter der Kontrolle des HIV-LTR. Das HIV-LTR enthält das Transaktivierungsbereich(tar)-Gen, welches durch tat induziert wird. Sodroski entdeckte, daß transaktivierende Faktoren die Transkription von Genen unter der Kontrolle des HIV-LTR induzieren würden. B. M. Peterlin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986), 83: 9734-38 beschrieben Plasmide mit dem HIV-tar-Gen und die Effekte von Orientierung und Position von tar auf die Transaktivierung durch tat. Peterlin fand, daß tar am besten funktioniert, wenn es sich strangabwärts von einem Promotor und einem Enhancer befindet. Die Aktivierung mit tat erhöhte die Transkription zu RNA. G. J. Nabel et al., Science (1988), 239: 1299-302 beschrieben, daß ein HIV-tat-III- CAT-Fusionsplasmid durch HSV und transaktive Adenovirusfaktoren aktiviert werden konnte. B. K. Felber et al., Science (1988), 239: 184-87 beschrieben einen Assay auf HIV, bei dem D4-exprimierende Zellinien, transfiziert mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)- Gen unter Kontrolle des HIV-LTR verwendet wurden. Nach Infektion mit HIV exprimierten die transfizierten Zellinien CAT proportional zur Menge des vorhandenen Virus. Felber schlug vor, den Assay als ein Mittel zur Überprüfung möglicher Anti-HIV-Arzneimittel hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Viruswachstum zu hemmen und zur Identifizierung von Anti-tat-Mitteln zu verwenden.
EP-A-0 334 301, welche ein früheres Prioritätsdatum besitzt, aber nicht bis zum 27. September 1989 veröffentlicht war, beschreibt replikationsdefekte rekombinante Retroviren zur Verwendung bei einer therapeutischen Behandlung, wobei solche Retroviren eingeschlossen sind, welche ein Vektorkonstrukt tragen, welches fähig ist, die Expression von Herpes-simplex- Vinysl-Thymidinkinase in humanen Zellen unter der Kontrolle eines Promotors, welcher durch ein intrazelluläres, mit einem humanen Krankheitszustand assoziiertes Signal regulierbar ist, zu steuern. Ex vivo-Wirtszellen, enthaltend solche Vektorkonstrukte, werden auch in EP-A- 0 334 301 zur Verwendung bei einer therapeutischen Behandlung vorgeschlagen.

Beschreibung der Erfindung

Ein Aspekt der Erfindung ist es jetzt, ein Verfahren bereitzustellen zur Behandlung einer Wirtszelle ex vivo gegen eine hyperproliferative Störung oder eine Infektion durch einen infektiösen Erreger, wobei die Infektion oder hyperproliferative Störung durch einen humanen krankheitsassoziierten trans-aktiven Regulationsfaktor, welcher fähig ist, die Expression von Genen zu regulieren, gekennzeichnet ist und wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
Einführen eines Polynukleotidkonstrukts, umfassend eine cis-aktive Regulationssequenz, welche durch den genannten trans-aktiven Regulationsfaktor kontrollierbar ist, und eines Effektorgens unter der Kontrolle der genannten cis-aktiven Regulationssequenz, dessen Expression die Zelle empfänglich für Schutz oder Zerstörung macht, in die Zelle, wobei das Effektorgen ein Genprodukt codiert, welches:
(a) ein Cytokin,
(b) ein Protein, welches die Glykosylierung, die Myristylierung oder die Phosphorylierung von Proteinen des infektiösen Erregers oder von Proteinen, welche für die hyperproliferative Störung spezifisch sind, inhibiert,
(c) eine RNase oder
(d) ein Ribozym
ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein DNA-Konstrukt zur Verwendung bei dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, welche zur Übertragung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte an die Wirtszellen nützlich ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Polynukleotidkonstrukt, welches zum Schutz einer ausgewählten Zellpopulation gegen eine Infektion nützlich ist, welches eine cis-aktive Sequenz, welche die Expression eines Effektorgens nur in der Gegenwart humaner krankheitsassoziierter transaktiver Faktoren, welche im wesentlichen nur in der ausgewählten Zellpopulation gefunden werden, fördert und unter der Kontrolle der cis-aktiven Sequenz ein Effektorgen, geeignet für ein wie oben definiertes erfindungsgemäßes Verfahren, dessen Expression die Zellen der genannten Zeilpopulation empfänglich für Schutz oder Zerstörung macht, umfaßt. Vorzugsweise stammt die cis-aktive Sequenz aus dem Wirt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung eines generischen Polynukleotidkonstrukts der Erfindung.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung des Vektors pTB 1.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung des Vektors pMXSVNeo-tar/tk.

Durchführungsarten der Erfindung

A. Definitionen

Der Ausdruck "Behandlung", wie hier verwendet, bezieht sich auf das Vermindern oder Abmildern von Symptomen in einem Subjekt, das Verhindern einer Verschlimmerung oder einer weiteren Entwicklung von Symptomen, die Hemmung oder die Eliminierung des verursachenden Erregers oder die Verhinderung der Infektion oder der Störung in einem Subjekt, welches davon frei ist. Demgemäß kann die Behandlung eines Krebspatienten, z. B. in der Verminderung der Tumorgröße, der Eliminierung maligner Zellen, der Verhinderung einer Metastase oder der Verhinderung eines Rückfalls bei einem Patienten, welcher geheilt worden ist, bestehen. Eine Infektionsbehandlung schließt die Zerstörung des infizierenden Erregers, die Hemmung oder die Störung seines Wachstums oder seiner Reifung, die Neutralisation seiner pathologischen Effekte und dergleichen ein.
Der Ausdruck "Infektion", wie hier verwendet, schließt Infektion durch Viren, Bakterien, Pilze und andere Parasiten, wie Leishmania und Malariaparasiten, ein. "Infektiöse Erreger" schließen im Bereich der Erfindung Viren, wie HIV-I, HIV-II, HTLV-I, HTLV-II, Herpes-simplex-Virus (HSV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV), humane Papillomviren (HPV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Poliovirus und dergleichen ein; Bakterien, wie B. pertussis, und die verursachenden Erreger von Tetanus, Diphtherie, Cholera und dergleichen; Mycobakterien, wie M. tuberculosis, und den verursachenden Erreger von Lepra; Hefen und Pilze, wie C. albicans und P. carinii; Parasiten, wie Malariaplasmodien, Lamblien und dergleichen, ein. Bestimmte erfindungsgemäße Verfahren und Konstrukte sind für intrazelluläre infektiöse Erreger, wie Viren, Malariaerreger und dergleichen, am geeignetsten, wohingegen andere Verfahren und Konstrukte bei extrazellulären Infektionen anwendbar sind.
Der Ausdruck "hyperproliferative Störung" bezieht sich auf Störungen, welche durch eine abnormale oder pathologische Proliferation von Zellen gekennzeichnet ist, z. B. Krebs, Psoriasis, Hyperplasia und dergleichen.
Der Ausdruck "cis-aktive Regulationssequenz" bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, welche fähig ist, auf einen trans-aktiven Faktor zu reagieren und die Transkription von cis-liegenden Genen zu steigern. Geeignetste cis-aktive Regulationssequenzen können aus demjenigen infektiösen Erreger stammen, zu dessen Bekämpfung sie verwendet werden. Der tar- Bereich aus dem HIV-1-LTR ist z. B. eine geeignete cis-aktive Regulationssequenz zur Behandlung von HIV-1. Dort, wo eine zelltypspezifische Expression angestrebt wird, kann man cis-aktive Sequenzen verwenden, wie z. B. (für T-Zellen) das CD2-Antigen (Genbank HUMATCCD2), IL-2 (Genbank HUMIL2A), den IL-2-Rezeptor (Genbank HUMIL2R1), das CD1-Antigen (Genbank HUMHTA1), das CD3-Antigen (Genbank HUMATCT31), das CD4- Antigen (Genbank HUMATCT4), die T-Zellprotease (Genbank MUSSPTCS); für B-Zellen IgG (Genbank HUMIGCA 1), MHC-1-Antigen (Genbank HUMMHA2), für Makrophagen, Mac-1- Antigen (Genbank HUMMLAP), IL-1 (Genbank HUMIL1P) und dergleichen. Die cis-aktive Regulationssequenz kann in multiplen Tandemkopien verwendet werden, um ihre Konkurrenz mit der endogenen cis-aktiven Regulationsstelle zu erhöhen. Geeignete Sequenzen zur Behandlung hyperproliferativer Störungen (speziell Krebsarten) sind aus den Bindungsstellen bekannter Onkoproteine oder durch Identifikation eines bekannten Proteins, dessen Expression durch ein Onkogen verändert wird, erhältlich. Die cis-aktive Regulationssequenz muß fähig sein, eine ausreichende Expression des Effektorgens bereitzustellen, um Empfänglichkeit gegen Schutz oder Zerstörung der Zelle zu verleihen, sobald sie durch den trans-aktiven Faktor aktiviert wird, ohne eine wesentliche konstitutive Expression in Abwesenheit des trans-aktiven Faktors zuzulassen. Die Auswahl der cis-aktiven Sequenz wird vom trans-aktiven Faktor, welcher mit der zu behandelnden Infektion oder Störung assoziiert ist, und vom ausgewählten Effektorgen abhängen. Der HIV-LTR enthält z. B. sowohl den tar-Bereich, welcher hochselektiv für HIV-tat ist, als auch einen Bereich, welcher durch den endogenen Kernfaktor NF-KB aktiviert wird (der LTR besitzt Tandern-NF-KB-Bindungsbereiche). Obwohl die tar-Sequenz in Abwesenheit von tat die Expression stark supprimiert (siehe z. B. Muesing, Peterlin, a. a. O.), beeinflussen die cis-aktiven Elemente strangaufwärts der tar-Sequenz den Grad der konstitutiven Expression ("Undichtigkeit"), welche in Abwesenheit von tat auftritt. Der Grad der Undichtigkeit in Abwesenheit von tat kann durch Deletion oder Substitution der cis-aktiven Elemente innerhalb der HIV-1-LTR (z. B. NF-KB-Bindungsstellen) kontrolliert werden. Um die tar-Sequenz zusammen mit Effektorgenen, welche fähig sind, ein Genprodukt zu exprimieren, welches in sehr niedrigen intrazellulären Konzentrationen wirksam ist, würde man die NF-KB-Bindungsstellen unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen vor dem Einführen des Vektors in die Wirtszellen entfernen. Im Gegensatz dazu muß man, falls das Effektorgen für ein Produkt codiert, welches nicht besonders toxisch für die Wirtszelle ist, aber welches für eine wirksame Virushemmung in höherer Konzentration benötigt wird, eine cis-aktive Sequenz verwenden, welche nach Induktion eine starke Expression bereitstellt, aber eine konstitutive Expression auf niedrigem Niveau zulassen kann.
Die Wortverbindung "empfänglich für Schutz oder Zerstörung" bedeutet, daß nach Infektion oder im Fall einer hyperproliferativen Störung die Gegenwart des Effektorgens innerhalb der Wirtszelle die Zelle entweder (α) befähigt, den infektiösen Erreger oder den hyperproliferativen Zustand zu hemmen oder (b) das Effektorgen tötet die Wirtszelle oder macht sie empfindlich gegen ein zusätzliches exogenes toxisches Mittel. Das zusätzliche "toxische Mittel" schließt nicht das Wirtsimmunsystem oder Antikörper ein, da die Immunität in Fällen von Infektion oder hyperproliferativer Störung oft supprimiert oder ineffektiv ist.
Wie hier zuvor aufgezeigt, kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotidkonstrukt z. B. für Cytokine codieren, welche infektiöse Erreger stören oder hemmen können oder welche cytotoxisch sein können, z. B. Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktoren, Kolonie-stimulierende Faktoren, transformierende Wachstumsfaktoren (α und β), epidermale Wachstumsfaktoren und dergleichen. Cytokinexpression ist auch bei der Behandlung hyperproliferativer Störungen nützlich. Cytokine können z. B. Tumore direkt hemmen oder abtöten oder können eine Differenzierung in einen finalen (nichtneoplastischen) Zustand induzieren.
Der Ausdruck "Effektorgen" bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, welche, wenn sie exprimiert wird (infolge der Wirkung des trans-aktiven Faktors auf die eis-aktive Regulationssequenz), die Wirtszelle, wie oben definiert, empfänglich für Schutz oder Zerstörung macht. Das Effektorgen muß ein Gen sein, welches nicht natürlicherweise durch den verwendeten cisaktiven Regulationsbereich reguliert wird. Wie zuvor aufgezeigt, schließt eine Klasse geeigneter Effektorgene auf dem mRNA-Niveau funktionelle Gene ein, insbesondere Gene, welche für Ribozyme codieren (V. Walbot et al., Nature (1988), 334: 196-97). Eine weitere Klasse Effektorgene schließt Gene, welche für Cytokine, welche nützlich für antivirale oder anti-hyperproliferative Störungen sind, codieren, wie Tumornekrosefaktor, α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon, transformierender Wachstumsfaktor-β und Interleukin-2 ein. Andere Effektorgene für ein erfindungsgemäßes Konstrukt codieren für Inhibitoren der Glykosylierung, Phosphorylierung oder Myristylierung von Virusproteinen. RNase ist auch geeignet. Man kann wahlweise den transaktiven Faktor durch Bereitstellen einer Vielzahl cis-aktiver Sequenzen in Verbindung mit einer starken Terminationssequenz "titrieren".
Im Zusammenhang der zellspezifischen Expression muß das Effektorgen die Empfänglichkeit der Zelle für Schutz, aber nicht für Zerstörung verleihen. Demgemäß vermeidet man, eine ganze Klasse von Zellen, wie die Klasse der TH-Zellen, auszulöschen.
Erfindungsgemäße Polynukleotidkonstrukte können auch für die Behandlung von Autoimmunstörungen entworfen werden, wobei eine cis-aktive Sequenz, welche auf einen transaktiven Faktor reagiert, welche für diese spezifischen Immunzellen, welche an der speziellen behandelten Autoimmunstörung teilhaben kennzeichnend ist und ein Effektorgen, welches die Aktivität der Zellen supprimiert, verwendet werden.
Der Ausdruck "Ribozym" bezieht sich auf ein katalytisches RNA-Polynukleotid, welches fähig ist, eine RNA-Spaltung an einer spezifischen Sequenz zu katalysieren. Ribozyme sind nützlich, um spezielle mRNA-Moleküle anzugreifen. Bei chronischer myelogener Leukämie hat eine chromosomale Translokation, welche die Gene bcr und abl einschließt (Philadelphia-Chromosom), z. B. die Expression eines bcr-abl-Fusionsproteins zur Folge, von dem angenommen wird, daß es zur abnormalen Funktion des abl-Onkoproteins führt. Da die Fusion zwischen dem bcr- und dem abl-Gen an Stellen innerhalb eines der beiden Introns erfolgt, enthält das gespleißte bcrabl-Fusionstranskript an der Spleißverbindung zwischen dem bcr- und dem abl-Exon nur zwei mögliche Sequenzen. Da die bcr-abl-mRNA nur in lymphoiden Zellen, welche diese onkogene Chromosomentranslation durchgemacht haben, auftritt, kann ein Ribozym spezifisch für jeden der beiden bcr-abl-Fusions-mRNA-Spleißverbindungen hergestellt werden, und somit kann die Expression des entsprechenden Onkoproteins gehemmt werden.
Der Ausdruck "Vektor", wie hier verwendet, bezieht sich auf jedes Polynukleotidkonstrukt, welches fähig ist, die cis-aktive Regulationssequenz und das ausgewählte Effektorgen (die Effektorgene) zu codieren und fähig ist, diese Gene auf geeignete Zielzellen zu übertragen. Die Vektoren können linear oder zirkulär, doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Die Vektoren können DNA-, RNA-, DNAJRNA-Hybride und DNA- und/oder RNA-Polynukleotide mit chemisch modifizierten Basen umfassen. Geeignete Vektoren innerhalb des Bereichs der Erfindung schließen lineare dsDNA-Segmente, Plasmide, rekombinante Viren (z. B. rekombinanter Vaccinia, Adenovirus, Adeno-assoziierte Viren und dergleichen), replikationsdefekte retrovirale Vektoren (einschließlich humaner, affenartiger, muriner und dergleichen), geeignete nichtpathogene Derivate replikationsfähiger retroviraler Vektoren und dergleichen ein. Replikationsdefekte retrovirale Vektoren werden gegenwärtig bevorzugt.

B. Allgemeines Verfahren

Die Herstellung der Polynukleotidkonstrukte wird unter Verwendung von Verfahren, welche allgemein im Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt. Sobald ein infektiöser Erreger oder eine hyperproliferative Störung zur Behandlung ausgewählt worden ist, besteht die erste Stufe darin, einen assoziierten trans-aktiven Faktor, eine geeignete cis-aktive Sequenz und ein Effektorgen zu identifizieren.
Einige virale trans-aktive Faktoren sind bereits bekannt und charakterisiert. Andere virale trans-aktive Faktoren können durch Delektionsanalyse des clonierten Virusgenoms identifiziert werden. Ein neuer Virus kann z. B. unter Verwendung von Standardtechniken cloniert und sequenziert und die offenen Leseraster identifiziert werden. Dann werden unter Verwendung von Restriktionsenzymen Deletionsmutanten hergestellt und die mutierten Viren auf Transkriptionsfähigkeit in geeigneten Wirtszellen geprüft. Mutanten, welche eine sehr niedrige mRNA-Transkription zeigen, fehlt wahrscheinlich entweder ein Gen, welches für einen trans-aktiven Faktor oder eine cis-aktive Regulationssequenz codiert. Ob die Deletion den trans-aktiven Faktor oder die cis-aktive Sequenz betrifft, kann allgemein durch Untersuchung der Position und des Inhalts der genomischen Sequenz bestimmt werden (z. B. cis-aktive virale Regulationssequenzen werden allgemein strangaufwärts von offenen Leserastern gefunden). Die Sequenz des cis-aktiven viralen Bereichs kann hinsichtlich seiner Homologie mit bekannten cis-aktiven Bereichen verglichen werden. Da homologe cis-aktive Sequenzen mit dem gleichen trans-aktiven Faktor reagieren können, können folglich geeignete endogene trans-aktive Faktoren identifiziert werden. Wahlweise können virale Proteine in geeigneten Wirten rekombinant exprimiert (z. B. Bakterien, Hefe, Säugetier-Zellkultur) und gereinigte Extrakte markiert und hinsichtlich Bindung an die virale Genbibliothek überprüft werden. In dieser Weise können geeignete trans-aktiver Faktor/cis-aktive Sequenzpaare identifiziert werden. Die Eignung des Paares kann unter Verwendung des CAT-Expressionsassays, welcher unten und in den Beispielen ausführlich beschrieben wird, eingeschätzt werden. In diesen Assays wird die cis-aktive Sequenz in einen geeigneten Vektor cloniert und ein geeignetes Reportergen (z. B. CAT, β-Galactosidase etc.) an die cis-aktive Sequenz ligiert, um eine cis-Kontrolle bereitzustellen. Das Testkonstrukt wird dann in einen geeigneten Wirt überführt (z. B. Säugetier-Zellkultur) und in Gegenwart und Abwesenheit des trans-aktiven Faktors auf Reportergenexpression geprüft. Geeignete Effektorgene sind im Fachgebiet bekannt oder können unter Verwendung von Standardtechniken cloniert werden.
Intrazelluläre Parasiten (einschließlich Viren) induzieren oftmals Interferonexpression. Folglich sollte die Isolierung der cis-aktiven Interferonsequenz die Identifizierung trans-aktiver Faktoren, welche in die Anti-Parasitantwort einbezogen sind, und die Herstellung von geeigneten erfindungsgemäßen Polynukleotidkonstrukten erlauben. Hyperproliferative Störungen werden durch ungeeignete Genregulation oder Genproduktaktivität gekennzeichnet, wobei typischerweise Zellwachstums- oder Differenzierungsfaktoren und gelegentlich Gene, welche für Strukturproteine codieren, betroffen sind. Ungeeignete Genregulation kann sich aus der Expression eines dysfunktionellen trans-aktiven Faktors (z. B. eines Faktors, in welchem eine Verkürzung oder eine Mutation die Inhibition des Faktors beseitigt hat oder welcher irreversibel bindet, etc.) aus der Überexpression eines trans-aktiven Faktors oder Rezeptors (z. B. infolge der trans-lokationalen Nebeneinanderstellung eines starken Promotors) oder aus anderen Defekten ergeben. In jedem Fall zeigt die Störung charakteristischerweise einen trans-aktiven Faktor, welcher entweder unterschiedlich zu denjenigen, welche in normalen Fällen gefunden werden, ist oder welcher in abnormal großen Mengen vorhanden ist. Trans-aktive Faktoren, welche von Viren codiert werden, welche mit hyperproliferativen Störungen assoziiert sind (z. B. HTLV-I, HTLV-II, die E6- und E7-Gene von HPV Typ 16 und Typ 18) können auch dazu verwendet werden, die Expression eines Effektorgens, wie hierin beschrieben, zu regulieren. Sobald die betreffende cisaktive Sequenz identifiziert worden ist, kann ein geeignetes Effektorgen ausgewählt werden. Da die charakteristischen trans-aktiven Faktoren allgemein zumindest etwas homolog zu normalen trans-aktiven Faktoren sind, ist es wahrscheinlich, daß die cis-aktive Sequenz eine gewisse Regulation durch den endogenen trans-aktiven Faktor in normalen Zellen zeigt. Folglich sind bevorzugte Effektorgene zur Behandlung von hyperproliferativen Störungen solche, die in geringen Spiegeln verhältnismäßig ungiftig für die Wirtszelle sind. Die Aktivität der trans-aktiven Faktoren kann jedoch in den hyperproliferativen Zellen konstitutiv hoch sein, wohingegen die Aktivität in normalen Zellen niedriger und schwankend (wie während des Zellzyklus) sein kann. Dieser Unterschied kann ausgenutzt werden, um die Akkumulation hoher Spiegel Effektorgenprodukt in hyperplastischen Zellen zuzulassen.
In ähnlicher Weise wurden viele zelltypspezifische trans-aktive Faktoren und cis-aktive Regulationssequenzen entdeckt und in der Literatur beschrieben. Zusätzliche cis-aktive Regulationssequenzen können durch die oben in groben Zügen dargestellten Verfahren bestimmt werden. Es sollte beachtet werden, daß in einigen Fällen ein trans-aktiver Faktor, assoziiert mit einer hyperproliferativen Störung, und seine cis-akive Regulationssequenz identisch mit den normalen zelltypspezifischen Faktoren und Regulationssequenzen sind. In solchen Fällen wird die hyperproliferative Störung typischerweise durch eine zu hohe Konzentration von trans-aktivem Faktor verursacht. Dementsprechend muß das Effektorgen sorgfältig ausgewählt werden.
Bezug nehmend auf Fig. 1 wird ein generischer retroviraler Vektor der Erfindung dargestellt. Der Vektor umfaßt ein 5'-retrovirales LTR und eine Primerbindungsstelle (1), eine psi- Verkapselungs-(Verpackungs-)Signalsequenz (2), eine wahlweise 3'-RNA-.Prozessierungssignalsequenz (3), ein Effektorgen (4), eine 5'-cis-aktive Regulationssequenz (5) einschließlich eines Promotors, gegebenenfalls einen Promotor (6) und ein selektierbares Markergen (7) und ein 3'- retrovirales LTR und eine Primerbindungsstelle (8). Sequenzen 1 bis 8 bilden den retroviralen Anteil des Vektors, wohingegen Sequenz 9 typischerweise aus einem Plasmid stammt und für die Erhaltung des Vektors in Zellkultur sorgt. Das 5'-LTR (1) und das 3'-LTR (8) sorgen für reverse Transkription und Integration des Vektors in das Wirtszellgenom. Geeignete LTRs schließen solche, welche aus Moloney murinem Leukämievirus ("Molony murine leukemia virus" (Mo- MuLV)) (Shinnick et al., Nature (1981), 293: 543), Harvey murinem Sarkomvirus ("Harvey murine sarcoma virus (Ha-MSV), (Van Beveran et al., Cell (1981), 27: 97), HTLV-I, HTLV-II, HIV-1 und HIV-2 stammen, ein. In replikationsdefekten Retroviren ist der U3-Bereich des 3'- LTR (8) inaktiviert. Die psi-Sequenz (2) muß eingeschlossen sein, um den Vektor in die Viruskapside, welche in der Verpackungszellinie erzeugt werden, einzuschließen, aber ist ansonsten nach Integration in das Wirtsgenom inaktiv. Geeignete psi-Sequenzen wurden von Cepko et al., Cell (1984), 37: 1053-62, Guild et al., a. a. O.; und Kriegler et al., Cell (1984), 38 : 483 beschrieben. Dort, wo der Vektor nichtretroviral ist und durch Transfektion eher als durch Infektion einzufügen ist, können die LTR-Sequenzen und die psi-Sequenz weggelassen werden. Das Effektorgen (4) ist wie oben beschrieben. Bei rekombinanten retroviralen "internem Promotor"- Vektoren wird das Effektorgen (4) mit seinem eigenen Promotor/cis-aktiver Regulationssequenz (5) und einer Terminatorsequenz/Polyadenylierungssequenz (4) bereitgestellt (obwohl die Terminator- und PA-Sequenz aus dem Effektorgen stammen kann).
Das Effektorgen kann in beiden möglichen Richtungen orientiert sein, ist aber üblicherweise in der Richtung entgegengesetzt zum LTR-Leseraster orientiert. In rekombinanten retroviralen "Enhancer-Ersatz"-Vektoren ist das Effektorgen (4) in der gleichen Richtung wie das LTR orientiert und wird nicht mit einer separaten cis-aktiven Regulationssequenz (5) oder Terminatorsequenz/Polyadenylierungssequenz (4) ausgestattet. Stattdessen wird die cis-aktive Regulationssequenz innerhalb des 3'-LTR-(8)-U3-Bereichs bereitgestellt, so daß das Effektorgen durch den cis-aktiven Regulationsbereich nur nach reverser Transkription kontrolliert wird.
Der selektierbare Marker (7), falls vorhanden, codiert für ein Merkmal, welches die Zellen, welche die Markersequenz exprimieren, befähigt, unter Selektionsbedingungen für transfizierte Zelle zu überleben. Der selektierbare Marker codiert typischerweise für ein Enzym, welches Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, z. B. Chloramphenicol, Neomycin (Southern, et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982), 1: 327-41) oder Hygromycin (Gritz et al., Gene (1983), 25: 179- 88). Der selektierbare Marker, wenn verwendet, wird üblicherweise mit seinem eigenen Promotor (6) bereitgestellt, welcher die Expression des Markergens während der Selektion der transfizierten/infizierten Zellen erlaubt. Geeignete Markergenpromotoren schließen den Histonpromotor, den HSV-1-tk-Promotor und den Metallothioneinpromotor ein.
Sequenz 9 ist eine Polynukleotiderhaltungssequenz, welche für die dauerhafte Erhaltung des Vektors innerhalb der Produzentenzellen sorgt. Typischerweise stammt Sequenz 9 aus einem Plasmid und stellt einen Replikationsursprung (wie pBR322 ori oder der Hefe-2u-Ursprung) und (üblicherweise) einen antibiotischen Resistenzmarker bereit. Geeignete Erhaltungssequenzen schließen pXf3, pBR322, pUClB, pML und dergleichen ein. Im Fall, daß lineare DNA-Segmente für die gezielte Integration verwendet werden, kann der Vektor an einer Stelle innerhalb Sequenz 9 linearisiert werden. Die LTR-Bereiche 1 und 8 werden durch Sequenzen, homolog zu der Sequenz der angestrebten gezielten Rekombination ersetzt. Sequenz 2 wird deletiert. Sequenz 9 schließt Polynukleotidsequenzen, welche für den Erhalt und die Replikation in mikrobiellen Wirten sorgen, ein, und schließen zusätzlich einen Gegen-Selektionsmarker ein (welcher für die Deletion von transfizierten Wirtszellen, welche eine nichtspezifische Integration durchgemacht haben, sorgt).
Als ein Prototypsystem zu Entwicklung von Polynukleotidkonstrukten, welche in den Bereich der beanspruchten Erfindung fallen, beschlossen die benannten Erfinder zuerst, analoge Konstrukte, enthaltend das Thymidinkinasegen von Herpes-simplex-Virus-Typ 1 (HSV-1-tk) zu betrachten. HSV-1-tk kann eine Vielfalt von Didesoxynuklkeosidanaloga (ddNs) durch Umwandlung dieser Mittel in die (5')-Monophosphatspezies aktivieren. Die ddNMPs können als kompetitive Inhibitoren der zellulären Nukleotid- oder Nukleosidkinasen wirken und dadurch eine Verarmung des zellulären Nukleotidpools verursachen; der Umwandlung in Triphosphatspezies durch zelluläre Enzyme folgend können die ddNTPs in naszierende DNA- (und möglicherweise RNA)-Stränge eingebaut werden und dadurch einen Strangabbruch verursachen.
Eines der am besten charakterisierten ddNs, welche durch HSV-1-tk aktiviert werden können, ist Acyclovir (Acyclo-G). Die Sicherheit und Wirksamkeit von Acyclovir leitet sich vor allem aus seiner selektiven Aktivierung durch HSV-1-tk ab: Acyclo-G wird in Acyclo-GMP einige tausend Mal effizienter durch die HSV-1-Thymidinkinase (tk) als durch die zelluläre Thymidinkinase umgewandelt (Km für HSV-1-tk = 0,005x Km Vero tk; Vrel HSV-1-tk = 3.000.000x Vrel Vero tk). Zelluläre Enzyme wandeln dann Acyclo-GMP in Acyclo-GTP um, welche durch HSV-1-DNA-Polymerase in DNA eingebaut wird und den Abbruch der Virus- DNA-Synthese verursacht. Acyclo-GTP hemmt die HSV-1-DNA-Synthese bei etwa 1/20 der Konzentration, welche für die gleiche Hemmung der zellulären DNA-Synthese erforderlich ist (P. A. Furman et al., J. Virol. (1979), 32: 72-77).
Soweit eine cis-aktive Regulationssequenz identifiziert worden ist, wird sie hinsichtlich ihrer Wirkung in einem Modellsystem getestet. Die cis-aktive Regulationssequenz kann z. B. in ein Plasmid mit einem geeigneten Regulatorgen, wie CAT oder β-Galactosidase cloniert werden. Das Plasmid wird dann in eine geeignete Zellinie transfiziert (z. B. CHO-Zellen, HeLa, HUT78 und dergleichen). Der trans-aktive Faktor kann durch die Auswahl einer Wirtszellinie, welche den trans-aktiven Faktor exprimiert, oder durch Cotransfektion der Zellinie mit einem Plasmid, welches für den trans-aktiven Faktor unter der Kontrolle eines anderen Promotors (entweder induzierbar oder konstitutiv) codiert, bereitgestellt werden. Die transfizierten Wirtszellen werden dann auf die Expression des Reportergens geprüft.
Die Eignung eines Effektorgens, wie HSV-1-tk, wird durch Clonierung in ein geeignetes Plasmid unter der Kontrolle des ausgewählten cis-aktiven Regulationsbereichs bewertet. Das Plasmid enthält vorzugsweise auch einen selektierbaren Marker, durch den man diejenigen Zellen, welche durch den Vektor genetisch transformiert wurden, selektieren kann.
Die allgemeine Struktur retroviraler Vektoren, welche dazu verwendet werden können, rekombinante Retroviren, enthaltend ein Effektorgen, verbunden mit cis-aktiven Regulationselementen, zu erzeugen, wird in Fig. 1 gezeigt. Die zugrundliegenden retroviralen Vektoren für die Expression von HSV-1-tk stammen aus Molony murinem Leukämievirus (Mo-MuLV). Alle Mo-MuLV-Gene (gag, pol und env) wurden aus den Vektoren entfernt, um vollständig replikationsdefekte Viren zu erzeugen. Die verbleibenden Komponenten sind für die Expression und die Verpackung von Virus-RNA, reverse Transkription und Integration und Transkription des tk- Gens (und eines Markergens, falls gewünscht) in den Zielzellen erforderlich. Diese Komponenten bestehen aus den langen terminalen Wiederholungssequenzen ("Long Terminal Repeats" (LTRs)) von Mo-MuLV, den Plus- und Minus-Strang-Primerbindungsstellen und dem RNA- Verkapselungssignal (Psi-Sequenz).
Um die Expression von HSV-1-tk in einer zelltypspezifischen Weise zu regulieren, wird eine hybride Transkriptionseinheit konstruiert, in der die Codierungssequenz einer zelltypspezifischen Transkriptionseinheit durch die HSV-1-tk-codierende Sequenz ersetzt wird.
Die Expression des HSV-1-tk-Gens über diese Vektoren kann auf zwei Wegen erreicht werden. Der erste Typ Vektor verwendet ein separates Enhancer/Regulationselement, um die Expression von HSV-1-tk zu regulieren. Bei diesem Typ Vektor schreitet die Transkription von HSV-1-tk in entgegengesetzter Richtung zum Plus-Sinn des Provirus fort (wie in Fig. 1 gezeigt). Das tk-Gen wird mit seinem eigenen Polyadenylierungssignal bereitgestellt und kann auch, falls gewünscht, mit einem Intron zwischen der tk-codierenden Sequenz und dem Polyadenylierungssignal bereitgestellt werden. Eine mögliche Transkriptionsstörung in dieser ersten Klasse Vektoren kann durch Entfernen der Enhancer/Regulationselement-Sequenzen aus dem 3'- LTR des Vektors vermindert werden. Da nur die U3-Sequenzen des 3'-LTR in Virus-RNA transkribiert werden, bilden diese Sequenzen beide LTRs im resultierenden Provirus. Dies erlaubt die Integration der proviralen cDNA, aber hat den Verlust der Enhancer- und Regulationselemente aus beiden LTRs des Provirus zur Folge.
Beim zweiten Typ Vektor (Enhancer-Ersatzvektor) stellt das Mo-MLV-LTR die Enhancer- und die Regulationselementsequenzen, welche die Expression des HSV-1-tk-Gens kontrollieren, bereit. Das Mo-MLV-LTR kann die Expression heterologer Gene in einer Vielfalt von Zelltypen (einschließlich hämatopoetischen Stammzellen) steuern, aber ist in T-Zellen am wirksamsten. Die Kontrolle von zelltypspezifischer Genexpression von HSV-1-tk kann durch Substitution der Enhancer/Regulationselementsequenzen innerhalb des 3'-Mo-MLV-LTR durch spezifische Enhancer/Regulationselementsequenzen erreicht werden. Das 5'-Mn-MLV-LTR bleibt in dem Vektor, um eine effiziente Expression der Virus-RNA in der Verpackungszellinie, welche zur Erzeugung von infektiösem Virus verwendet wird, zu gestatten.
Ein selektierbares Markergen kann in diese Vektoren 3' vom HSV-1-tk-Gen eingebaut werden, um eine in-vitro-Selektion der transformierten Zellen zu gestatten. Die Expression des Markergens wird durch sein eigenes regulatorisches Element erreicht. Allgemein würde dieses regulatorische Element aus einem mäßig aktiven zellulären Gen, welches in allen Geweben konstitutiv exprimiert wird, stammen. Einige Beispiele für solche regulatorische Elemente würden der cytoplasmatische β-Actinpromotor, die Histonpromotoren und die Promotoren für glykolytische Enzyme sein.
Der zweite Typ Vektor verwendet ein separates Enhancer/regulatorisches Element, um die Expression von HSV-1-tk zu regulieren. Bei diesem Typ Vektor schreitet die Transkription von HSV-1-tk in entgegengesetzter Richtung zum Plus-Sinn des Provirus fort. Das tk-Gen wird mit seinem eigenen Polyadenylierungssignal bereitgestellt und kann auch, falls erwünscht, mit einem Intron zwischen der tk-codierenden Sequenz und dem Polyadenylierungssignal bereitgestellt werden. Eine mögliche Transkriptionsstörung in dieser zweiten Klasse Vektoren kann durch Entfernen der Enhancer/regulatorische Elementsequenzen aus dem 3'-LTR des Vektors vermindert werden. Dies gestattet die Integration der proviralen cDNA, aber hat den Verlust der Enhancer und regulatorischen Elemente aus beiden LTRs des Provirus zur Folge.
Ein selektierbarer Marker kann wie bei der ersten Klasse Vektoren bereitgestellt werden und wird in der entgegengesetzten Richtung von HSV-1-tk transkribiert. Die Transkription beginnt folglich im Zentrum des integrierten Provirus und schreitet in entgegengesetzte Richtungen in einer Weise analog der Transkription der E2/E3-Gene von humanen Adenoviren fort.

Formulierung und Verabreichung

Die erfindungsgemäßen Polynukleotidkonstrukte können abhängig von der Art des Konstrukts formuliert werden. Dort, wo der Vektor z. B. ein kompetenter (infektiöser) Virus ist, kann er in der gleichen Weise wie lebende Virusimpfstoffe formuliert werden. Solche Formulierungen sind typischerweise gepufferte physiologische Kochsalzlösungen zur Injektion oder gepufferte orale Formulierungen, wobei jede von beiden gegebenenfalls Antibiotika enthalten kann. Liposomenformulierungen können nach Standardverfahren hergestellt werden, z. B. durch Suspendieren von Lipiden in Chloroform, Trocknen der Lipide auf den Wandungen eines Gefäßes und Hydratisieren der Lipide mit einer das Polynukleotid konstruktenthaltenden Lösung. Geeignete Lipide einschließlich Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Lecithin und dergleichen sind im Fachgebiet bekannt. Ein synthetisches Lipid, welches für die Polynukleotidtransfektion besonders nützlich ist, ist N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,Ntrimethylammoniumchlorid, welches im Handel unter dem Namen Lipofectiri erhältlich ist (erhältlich von BRL, Gaithersburg, MD) und von P. L. Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1987), 84: 7413 beschrieben wird.
Rekombinante retrovirale Vektoren können auch für eine in-vivo-Verabreichung formuliert werden (falls replikationsdefekt). Vektoren, welche auf HIV-1 oder HIV-2 basieren, zeigen den gleichen zellulären Tropismus wie der native Virus und stellen somit ein effizientes und umfassendes Mittel, um bei der Behandlung einer HIV-1- oder HIV-2-Infektion auf die geeignete Zellpopulation in vivo abzuzielen, bereit. Vektoren auf der Grundlage von HIV können die HIV- LTR-Promotoren, die tar-Sequenz und das tat-Gen zur Kontrolle der Expression heterologer Gene verwenden. Man kann die Zielzellenspezifität des Vektors durch geeignete Auswahl der Verpackungskonstrukte (z. B. env-Gen) verfeinern. Das isolierte HIV-ISp162 (M. Quiroga et al., "Modern Approaches to New Vaccines" (1989, Cold Spring Harbor Laboratories), S. 80) ist von Natur aus selektiv für eine Makrophageninfektion: folglich kann durch Verpackung des Vektors in eine von HIV-1sP162 abgeleitete Hülle die gezielte Übertragung an die Makrophagen bewirkt werden. In ähnlicher Weise kann durch Verpacken der Vektoren unter Verwendung rekombinanter Hüllgene, welche Sequenzen, abgeleitet aus den vom Hepatitis-B-Virus (oder HAV oder HCV) stammenden Hüllen oder Kapside einbauen, eine gezielte Übertragung auf Hepatozyten erreicht werden. Durch Verwendung einer Verpackungszellinie, welche aus HIV-2 stammende Hüllproteine exprimiert, kann man ein wirksames Verfahren zur gezielten Übertragung der erfindungsgemäßen Vektoren zum Schutz von TH-Zellen infolge der Affinität von gp160env für CD4&spplus; (Smith et al. Science (1987), 238: 1704-06) erreichen.
Die Verabreichungsart der erfindungsgemäßen Polynukleotidkonstrukte hängt von der Eigenart des Vektors ab. Retrovirale Vektoren können z. B. durch Impfung parenteral oder oral verabreicht werden. Da, wo der Vektor ein infektiöser rekombinanter Virus ist, kann die Verabreichung durch parenterale Injektion, orale oder intranasale Verabreichung und dergleichen erfolgen. Liposomenformulierungen werden vorzugsweise mittels eines intranasalen Sprays oder mittels intravenöser Injektion verabreicht. Das gegenwärtig bevorzugte Verabreichungsverfahren erfolgt durch Inkubation defekter retroviraler Vektoren mit abgesaugten autologen Knochenmarkszellen oder T-Lymphozyten ex vivo, gefolgt von der Wiedereinführung der behandelten Zellen durch Standardtechniken. Kurz zusammengefaßt werden die Knochenmarkszellen mittels im Fachgebiet für Knochenmarkstransplantation bekannten Techniken abgesaugt und werden allgemein aus dem Becken abgesaugt. Falls angestrebt (insbesondere bei der Behandlung von Leukämie und anderen hyperplastischen Störungen) wird das Subjekt nach dem Absaugen von Knochenmark mit Chemotherapie oder Radiotherapie behandelt, um die Belastung durch infizierte oder hyerproliferierende Zellen zu vermindern. Das Aspirat kann überprüft werden, um unerwünschtes Material zu entfernen (z. B. Tumorzellen, Bakterien, Viruspartikel und dergleichen), z. B. durch Immunpräzipitation, Immunadsorption, Immunoreaktion mit Komplementfixierung, fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren ("fluorescence-activated cell sorting" (FACS)) und dergleichen. Idealerweise werden die hämatopoetischen Stammzellen markiert und unter Verwendung stammzellspezifischer Mabs (monoclonale Antikörper (monoclonal antibodies)) isoliert. Das überprüfte Aspirat wird dann mit einem erfindungsgemäßen Konstrukt transfiziert oder infiziert. Ein Infektionsverfahren besteht darin, die abgesaugten Zellen in Kontakt mit infektiösen Titern von replikationsdefekten retroviralen Vektoren über einen Zeitraum ausreichend, um eine wirksame Inokulation sicherzustellen, in Kultur zu halten. Wachstumsfaktoren für hämatopoetische Zellen (z. B. IL-3) können während der Cokultivierung zugegeben werden (E. A. Dzierzak, a. a. O.). Die bekannten Calciumphosphat-Transfektionstechniken für murine Zellen können verwendet werden (siehe z. B. E. A. Dzierzak, a. a. O.; S-F. Yu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986), 83 : 3194-98). Konstrukte können auch durch Elektroporation eingeführt werden (S. Mansour, a. a. O.). Wahlweise kann man ein Transfektionsmittel, wie Lipofectin® verwenden. Dort, wo der Vektor einen Marker einschließt, können die infizierten Zellen durchgemustert und, falls gewünscht, selektiert werden. Die infizierten Zellen werden dann unter Verwendung von Verfahren, welche bei autologer Knochenmarkstransplantation verwendet werden, typischerweise intravenöse Infusion oder Injektion, wieder in das Subjekt eingeführt. Man kann auch Lymphozyten entweder in vivo oder ex vivo unter Verwendung erfindungsgemäßer Konstrukte transfizieren oder infizieren. Die Infektion mit Konstrukten auf MLV-Basis wird vorzugsweise ex vivo durchgeführt, da die Hülle durch humanes Komplement inaktiviert wird. Spezifische Untergruppen der Lymphozytenpopulation können durch Verwendung monoclonaler Antikörper zur Abtrennung der gewünschten Untergruppe oder durch andere im Fachgebiet bekannte Verfahren selektiert werden: siehe z. B. P. W. Kantoff et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986), 83: 6563-67.
Falls gewünscht, kann man einige der Lymphozyten oder Knochenmarkszellen in Verpackungszellen überführen, dadurch, daß man unabhängige Konstrukte, welche für gag-pol und env codierenden viralen Gene exprimieren können, einführt, gefolgt von der Einführung eines erfindungsgemäßen Vektors. O. Danos et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1988), 85: 6460-64. Wenn die autologen Verpackungszellen in das Subjekt wiedereingeführt werden, hat die kontinuierliche Expression von replikationsdefektem Retrovirus während der Lebenszeit der Zelle die Übertragung des erfindungsgemäßen therapeutischen Konstrukts auf eine große Zahl von Wirtszellen zur Folge.

C. Beispiele

Die unten vorgelegen Beispiele werden als zusätzlicher Leitfaden für den durchschnittlichen Fachmann bereitgestellt und sind nicht so aufzufassen, daß die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkt wird.

BEISPIEL 1

Rekombinante retrovirale Vektoren

Retrovirale Vektoren wurden unter Verwendung von Standardtechniken für die Manipulation rekombinanter DNA konstruiert (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)). Die bei der Konstruktion der retroviralen Vektoren verwendeten Plasmide wurden von den folgenden Quellen erhalten: pMX1112SVNeo war eine Spende von M. McMann (UCSF), SV-N war eine Spende von E. Gilboa (konstruiert wie beschrieben von Yu, a. a. O.).
Das Plasmid pMX1112SVNeo wurde durch Einfügen eines Cla-Cla-Fragments des frühen SV40-Promotors, verbunden mit dem neor-Gen in das Plasmid pMX1112 konstruiert (beschrieben von A. M. C. Brown et al., "Retroviral Vectors", Seiten 189-212, in "DNA Cloning: a practical approach", Bd. 3 (D. M. Glover, Hrsg. IRL Press, 1987)). Das SV40-neor-Gen wurde zwischen die psi-Verpackungssequenz und den 3'-Mo-MuLV-LTR-Bereich auf dem Plasmid positioniert. Das Plasmid pMXSVNeol8 wurde aus pMX1112SVNeo hergestellt, dadurch, daß die EcoRI-Stelle strangaufwärts des 5'-Mo-MuLV-LTR entfernt wurde, ein EcoRI-Linker an der XhoI-Stelle eingefügt wurde und der pUC 18-Polylinker zwischen der neuen EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle angefügt wurde. Das Plasmid pTARI enthält das HIV-5'-LTR (einschließlich der tar-Sequenz), ein CAT-codierendes Gen und ein SV40-Polyadenylierungssignal und t-Intron, und wurde durch Clonierung des XhoI-NarI-Fragments von HIV-1 (SF2) (R. Sanchez-Pescador et al., Science (1982), 227: 484-92) in pML konstruiert. Ein synthetischer Polylinker wurde an der NarI-Stelle angefügt und das Stul-BamHI-Fragment von pSV2CAT (C. M. Gorman et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA (1982), 79: 6777-81), enthaltend das CAT-Gen und SV40-RNA-Prozessierungssignale, wurde eingefügt, um pTAR1 bereitzustellen. Das pTAR1 wurde mit Asp718 und Xhol gespalten, und das resultierende Fragment in pMXSVNeo18 cloniert, um pTB1, gezeigt in Fig. 2, herzustellen. Das Plasmid pTAT 1 wurde mit dem HIV-tat-Gen unter Kontrolle des SV40-EP konstruiert und durch das SV40-Polyadenylierungssignal flankiert (Peterlin et al., a. a. O.). Das Plasmid pRT enthält das HSV-1-tk-Gen, den Promotor und die RNA-Prozessierungssignale. Das Plasmid ptar/tk wurde durch Clonierung des BgIII-EcoRI-Fragments von pRT (enthaltend die tk-codierende Sequenz und das Polyadenylierungssignal) in pTAR1 an die Stelle des CAT-Gens hergestellt. Das Plasmid pMXSVNeo-tar/tk wurde durch Clonierung des Asp718-EcoRI-Teils von ptar/tk in den pMXSVNeol8-Polylinker konstruiert (pMXSVNeotar/tk ist in Fig. 3 dargestellt).
Amphotrope Retroviren, welche menschliche Zellen infizieren können, wurden mittels Standardtechniken hergestellt (R. Mann et al., Cell (1983), 33: 153-59). Kurz zusammengefaßt, die amphotrope Verpackungszellinie PA-317 (Miller et al., Mol. Cell. Biol. (1986), 6: 2895-902; ATCC CRL-9078) wurde mit einem Plasmidvektor unter Verwendung der CaPO&sub4;-Copräzipitationstechnik transfiziert (R. Graham et al., Virol. (1973), 52: 456-67). 10 ug Plasmidvektor und 25 ug Lachssperma-DNA-Träger wurden als ein CaPO&sub4;-Copräzipitat in einer 60 mm Gewebskulturschale für 8 bis 16 h auf 5 · 10&sup5; PA-317-Zellen angewendet. Das Präzipitat wurde entfernt, und die Monoschicht wurde mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Frisches Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium, DMEM, ergänzt durch 10% fötales Kälberserum und Antibiotika) wurde eingesetzt, und die Zellen wurden für 2d wachsen und sich erholen gelassen. Die transfizierten Zellen wurden dann trypsiniert und in einen 150 mm² T-Kolben überführt und für 10 bis 14d in einem 0,8 mg/ml G418 enthaltenden Medium gezogen. Die resultierenden G418-resistenten Kolonien wurden trypsiniert und durch beschränkte Verdünnung in Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen cloniert. Der von den einzelnen Clonen hergestellte rekombinante Retrovirus wurde durch Infektion von humanen Zellinien (HeLa, ATCC CCL 2; HUT78, ATCC TIB 161) charakterisiert, um den Virustiter und die Bildung der korrekten proviralen Struktur zu bestimmen.
Ecotrope rekombinante Retroviren wurden wie oben beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die ecotrope Verpackungszellinie Psi-2 (R. Mann, a. a. O.) anstelle von PA-317 verwendet wurde.

BEISPIEL 2

Infektion von Zellen mit rekombinanten Retroviren

Zellinien wurden mit rekombinanten Retroviren unter Verwendung von Standardverfahren infiziert (R. Mann, a. a. O.).
Kurz zusammengefaßt, S · 106 Zellen wurden in 60 mm Gewebskulturschalen plattiert und für 16 h wachsen gelassen. Zellfreie Überstände von Verpackungszellen, enthaltend Plasmidvektoren, wurden auf die Zielzellen für 6 bis 8 h in Gegenwart von 8 ug/ml Polybren angewendet. In dem Fall, in dem die Viren den G418-Resistenzmarker trugen, wurden die Zellen wie für die Herstellung von Verpackungsclonen, wie oben beschrieben, gezogen, selektiert und cloniert. Bei Retroviren, welche HSV-1-tk trugen, aber denen der G418-Resistenzmarker fehlte, wurden der Titer unter Verwendung von tk- Zellinien bestimmt: L-M (tk-) (ATCC CCL 1.3) für ecotrope Viren, 143-B-Zellen (ATCC CRL 8303) für amphotrope Viren. Die Selektion für tk&spplus;- Kolonien wurde unter Verwendung von HAT-Medium durchgeführt.

BEISPIEL 3

Assay auf Trans-Aktivierung durch HIV-tat

Die Plasmide pTARl, pTB 1 und pTB2 (mit dem HIV LTR-Bereich in der entgegengesetzten Orientierung von pTB1), codierend CAT unter der Kontrolle der cis-aktiven HIV-tar- Regulationssequenz wurden in HeLa-Zellen transfiziert. Das Plasmid pTATI, welches das HIVtat-trans-aktive Mittel exprimiert, wurde in die Hälfte der HeLa-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen lysiert und ¹&sup4;C-Chloramphenicol wurde mit den Lysaten inkubiert. Die Produkte wurden mit EtOAc extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, daß CAT in HeLa-Zellen, welche sowohl ein tar-codierendes Plasmid als auch ein tat-codierendes Plasmid enthielten, exprimiert wurde, aber nicht in HeLa- Zellen, welchen das pTATI-Plasmid fehlte. Obwohl das Niveau der konstitutiven Expression (Undichtigkeit) von pTARI, pTB1 und pTB2 etwas unterschiedlich war, war die CAT-Expres sion in Reaktion auf HIV-tat in Zellen, enthaltend pTB 1 und pTB2, höher als in Zellen, enthaltend pTARl (ohne die Mo-MuLV-LTRs und den SV40-Enhancer).

BEISPIEL 4

Konstruktion spezifischer Vektoren

Retrovirale Vektoren, welche in den Bereich der beanspruchten Erfindung fallen, schließen Vektoren analog zu oder identisch mit Vektoren, welche im folgenden beschrieben sind, mit der allgemeinen, in Fig. 1 gezeigten Struktur, ein.
SIN-tar/tk-H4Neo: dieser Vektor verwendet den selbstinaktivierenden Vektor, beschrieben von Yu, unter Verwendung der cis-aktiven HIV-tar-Sequenz und des HSV-1-tk-Effektorgens und enthält eine Neomycinresistenz unter Kontrolle des H4-Histonpromotors. Dieses Plasmid verleiht Empfänglichkeit für ddNs an HIV-infizierte Zellen.
SIN-CD4/tk- (-H4Neo): dieser Vektor ist identisch mit dem oben beschriebenen SINtar/tk-H4Neo-Vektor mit der Ausnahme, daß die cis-aktive tar-Sequenz durch die cis-aktive Sequenz, welche die Expression des CD4-Antigens in TH-Zellen fördert, ersetzt wurde. Der Histonpromotor/Neomycinresistenzmarker ist faktultativ. Dieser Vektor verleiht Empfänglichkeit für ddNs an alle CD4&spplus;-Zellen. Da gegenwärtig angenommen wird, daß das CD4-Antigen beim Eindringmechanismus von HIV von Bedeutung ist, würde dieser Vektor auch bei der Behandlung einer HIV-Infektion nützlich sein.
SIN-Macl/tk- (-H4Neo): dieser Vektor ist ähnlich dem SIN-tar/tk-H4Neo, wobei die cis-aktive HIV-tar-Sequenz durch die cis-aktive Sequenz, welche die Expression des Macl-Antigens in Makrophagen reguliert, ersetzt wurde. Der Histonpromotor/Neomycinresistenzmarker ist fakultativ. Dieser Vektor verleiht Empfänglichkeit für ddNs an alle Makrophagen, welche auch als Wirtszellen für HIV dienen.
SIN-tar/rA-H4Neo: dieser Vektor verwendet die cis-aktive HIV-1-tar-Sequenz, um das Ricin-A-Effektorgen zu kontrollieren und verwendet neor als selektierbaren Marker. SIN-fos/ppt dieser Vektor verwendet den selbstinaktivierenden Vektor, beschrieben von Yu, unter Verwendung der cis-aktiven Sequenz des fos-Onkogens (R. Treisman, Cell (1986), 46: 567-74) unter Verwendung eines pflanzlichen Phosphotransferase-Effektorgens. Dieser Vektor würde in Kombination mit einem ddN bei der Behandlung von fos-Typ-Malignitäten nützlich sein.
SIN-pcna/tnfdieser Vektor verwendet die cis-aktive Sequenz, regulierend das proliferierende Zellen-Kernantigen (beschrieben von J. E. Selis, Leukemia (1988), 2: 561-601) und ein Tumor-Nekrosefaktor-Effektorgen. Obwohl PCNA in allen Fällen exprimiert wird, ist die Expression transient und erfolgt nur während der Zellteilung. Folglich würden normale, mit dem Vektor infizierte Zellen keine toxischen Konzentrationen von TNF herstellen, wohingegen neoplastische hyperproliferierende Zellen, welche fortwährend bei der Zellteilung sind, toxische Konzentrationen exprimieren würden.
SIN-acg/ifn: dieser Vektor verwendet die cis-aktive Regulationssequenz, welche für die Expression von α-chorionalem Gonadotropin sorgt (S. E. Goelz, Science (1985), 228: 187-90) in Kombination mit einem β-Interferon-Effektorgen. Dieser Vektor, wie der vorhergehende Vektor, stützt sich auf die Tatsache, daß acg in normalen Zellen selten exprimiert wird und würde bei der Krebsbehandlung nützlich sein.
SIN-IGG/Rbz: dieser Vektor verwendet die cis-aktive Sequenz von IgG zusammen mit einem Ribozym-Effektorgen, spezifisch für die bcl/abl-Spleißstelle, welche bei chronisch myelogener Leukämie (CML) auftritt. Da IgG in B-Zellen exprimiert wird, wird ein zelltypspezifischer Schutz gegen CML erhalten.
SIN-e7/Ld: dieser Vektor verwendet die cis-aktive Sequenz, welche auf das E7-Gen des humanen Papillomvirus Typ 16 (HPV16) reagiert, in Verbindung mit einem Purin-2'-desoxyribonukleosidasegen von Leishmania donovani. Da die Expression des HPV16-E7-Gens mit einem Gebärmutterhalscarcinom assoziiert ist (Phelps et al., Cell (1988), 53: 539-47), zerstört dieser Vektor (in Kombination mit dem Mittel 6-Methylpurin-2-desoxyribosid) Zellen, in denen das E7- Gen exprimiert wird.
HIV-2ltk: dieser Vektor stammt aus HIV-2, aus dem alle internen Gene, mit Ausnahme des Teils des gag-Gens, welches mit dem psi-(Verkapselungs-)Signal überlappt, und des rev- Reaktionselements aus dem env-Gen deletiert wurden. Das HSV-1-tk-Gen wurde 3' der psi-Sequenz eingefügt und wurde unter Kontrolle des HIV-2-LTR exprimiert. Falls erwünscht, kann die HIV-2-tar-Sequenz durch die HIV-1-tar-Sequenz ersetzt werden. Dieser Vektor kann dazu verwendet werden, HSV-1-tk von einer Genom-langen RNA zu exprimieren, wobei die ATG- Codons der HIV-gag-Sequenz deletiert oder verändert werden (Guild et al., a. a. O.), so daß eine Expression des HSV-1-tk-Gens von seinem eigenen ATG-Startcodon erhalten wird. Wahlweise kann man den HIV-2-env-Spleißakzeptor unmittelbar 5' des HIV-1-tk-Gens einschließen, ohne die gag-Startcodons zu verändern und erhält folglich die Expression des HSV-1-tk über eine gespleißte subgenomische mRNA. In jedem Fall ist die Expression von HSV-1-tk von der Komplementation durch tat entweder von einem residenten HIV-1-Provirus oder einem superinfizierenden HIV-1-Virus abhängig. Die Expression von tk in Kombination mit der Verabreichung von ACV oder GCV aktiviert dann toxische Spiegel des antiviralen Mittels und zerstört folglich die infizierte Zelle. Diese Konstrukte können entweder in HIV-2-Hüllen oder in HIV-1SF162- Hüllen, wobei letztere für die gezielte Übertragung und Zerstörung infizierter Makrophagen nützlich sind, verpackt werden.
HIV-2/TCR-tk: dieses Konstrukt enthält intern den T-Zellrezeptorpromotor, um die Expression von HSV-1-tk zu steuern und enthält das RRE aus env und das psi-Signal aus dem 5'-Ende des HIV-2-gag-Gens. Das 3'-LTR des Vektors wurde durch Einführen der TCR-αkonstanter Bereich-Enhancersequenz (beschrieben von Ho et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA (1989), 86: 6714) gemäß dem Prinzip, beschrieben von J. Overhauser et al., J. Virol. (1985), 54: 133-34 für die Konstruktion eines Glucocorticoid-reagierenden MoMLV modifziert. Der HIV-2/TCR-tk-Vektor kann dazu verwendet werden, CD4&spplus;-Zellen in vivo zu infizieren und genetisch zu transformieren. Da weder der Vektor noch die T4-Zelle normalerweise tat enthält, tritt keine Expression von Transkripten, welche in dem viralen LTR beginnen, in Abwesenheit einer HIV-Infektion auf. Die Initiation der Transkription (Expression von tk) erfolgt vom internen TCR-Promotor. Die Expression von diesem Promotor wird durch die Gegenwart der TCRα-Enhancer, eingebaut in die proviralen LTRs, gesteigert. Dieser Vektor sorgt für die konstitutive Expression von tk in den genetisch transformierten TH-Lymphozyten, was wiederum ein antivirales Mittel (z. B. ACV, ddC und dergleichen) aktiviert. Ein analoger Vektor kann durch Substitution der verwendeten HIV-Sequenzen durch MLV-Viruskomponenten und durch Verwendung einer MLV-amphotropen Verpackungszellinie hergestellt werden.

BEISPIEL 5

In-vivo-Verabreichung der Konstrukte

(A) Verpackungszellinien für Vektoren auf HIV-Basis werden wie folgt konstruiert: die gag-pol-codierende Sequenz wird aus HIV-1 oder HIV-2 isoliert und in einen Expressionsvektor unter Kontrolle des unmittelbar frühen Hauptpromotors ("major immediate early (MIE) promotor") des humanen Cytomegaliovirus (CMV) eingefügt. Eine geeignete Polyadenylierungssequenz wird 3' der gag-pol-Einfügung bereitgestellt, z. B. die polyA-codierende Sequenz von SV40. Sowohl die gag-pol- als auch die env-Sequenzen müssen das rev-Reaktionselement (RRE), welches im env-codierenden Bereich vorliegt, enthalten, um Kernexport zu erreichen (M. H. Malim et al., Nature (1989), 338: 254-57).
Die env-Sequenz (einschließlich des RRE), welche die letztendliche Spezifität des fertiggestellten Vektors bestimmt, wird von einem ausgewählten HIV-1, HIV-2 oder SIV-I-Isolat erhalten und wird in einen separaten Expressionsvektor unter Kontrolle des CMV-MIE-Promotors eingefügt. Bei dieser Konstruktion wird eine β-Globin-polyA-Sequenz verwendet. Ein Intron kann 5' der env-codierenden Sequenz eingefügt werden, welches gegebenenfalls eine für einen Marker oder ein Reportergen (z. B. neor) codierende Sequenz enthält.
Separate ähnliche Vektoren werden konstruiert, um tat-cDNA und rev-cDNA unter Kontrolle des frühen 5V40-Promotors einzuführen. Diese Vektoren verwenden SV40-polyA- Sequenzen. Durch Trennung der codierenden Sequenzen für gag-pol, env, tat und rev wird die Möglichkeit einer Rekombination, bei der ein funktioneller HIV-Virus regeneriert wird, miminiert.
Die Expressionsvektoren werden dann dazu verwendet, eine Verpackungszellinie durch Transfektion einer geeigneten Zellinie, z. B. NIH-3T3, HeLa oder dergleichen, zu konstruieren. Nach Transfektion mit einem erfindungsgemäßen retroviralen Vektor wird ein erfindungsgemässes verpacktes Konstrukt hergestellt, welches die Wirtszellpopulation, welche während einer bona-fide-HIV-Infektion infiziert sind (hauptsächlich TH-Zellen), infizieren kann.
(B) Makrophagen/Monocyten-tropische Konstrukte werden dem Verfahren des obigen Teils A folgend hergestellt, aber es wird das HIV-15F162-env-Gen verwendet, um das env-Protein bereitzustellen.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung einer Wirtszelle ex vivo gegen eine hyperproliferative Störung oder eine Infektion durch einen infektiösen Erreger, wobei die Infektion oder die hyperproliferative Störung durch einen humanen krankheitsassoziierten trans-aktiven Regulationsfaktor, welcher fähig ist, die Expression von Genen zu regulieren, gekennzeichnet ist und wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Einführen eines Polynukleotidkonstrukts, umfassend eine cis-aktive Regulationssequenz, welche durch den genannten trans-aktiven Regulationsfaktor kontrollierbar ist, und eines Effektorgens unter der Kontrolle der genannten cis-aktiven Regulationssequenz, dessen Expression die Zelle empfänglich für Schutz oder Zerstörung macht, in die Zelle, wobei das Effektorgen ein Genprodukt codiert, welches:

(a) ein Cytokin;

(b) ein Protein, welches die Glykosylierung, die Myristylierung oder die Phosphorylierung von Proteinen des infektiösen Erregers oder von Proteinen, welche für die hyperproliferative Störung spezifisch sind, inhibiert,

(c) eine RNase; oder

(d) eine Ribozym

ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgenprodukt ein Cytokin ausgewählt aus α-Interferon, β-Interferon, Gamma-Interferon, transformierendem Wachstumsfaktor-β, Interleukin-2 oder eine Kombination davon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgenprodukt Gamma- Interferon ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die cis-aktive Regulationsequenz in mindestens zwei Tandemkopien, welche funktionell mit dem Effektorgen verbunden sind, vorhanden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgen funktionell verbunden ist mit:

mindestens zwei Kopien einer Polynukleotidsequenz, welche homolog zu einem Bereich eines Regulationselements des infektiösen Erregers oder der hyperproliferativen Störung ist und welche fähig ist, einen trans-aktiven Faktor, welcher mit dem infektiösen Erreger oder der hyperproliferativen Störung assoziiert ist, zu binden, wobei die homologen Polynukletotidsequenzen mit den Be reichen des Regulationselements des infektiösen Erregers oder den Regulationselementen der hyperproliferativen Störung um den trans-aktiven Faktor konkurrieren; und

einem starken Terminatorbereich.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der infektiöse Erreger HIV-1 oder HIV-2 umfaßt und der trans-aktive Regulationsfaktor tat umfaßt.

7. Polynukleotidkonstrukt zur Behandlung einer Wirtszelle gegen eine hyperproliferative Störung oder eine Infektion durch einen infektiösen Erreger, wobei die Infektion oder die hyperproliferative Störung durch einen humanen krankheitsassoziierten trans-aktiven Faktor, welcher fähig ist, die Expression von DNA zu regulieren, gekennzeichnet ist und wobei das Konstrukt folgendes umfaßt:

eine cis-aktive Regulationssequenz, welche durch den trans-aktiven Regulationsfaktor kontrollierbar ist; und

ein Effektorgen unter der Kontrolle der cis-aktiven Regulationssequenz, dessen Expression die Zelle empfänglich für Schutz oder Zerstörung macht, wobei das Effektorgen für ein Genprodukt codiert, welches:

(a) ein Cytokin;

(b) ein Protein, welches die Glykosylierung, die Myristylierung oder die Phosphorylierung von Proteinen des infektiösen Erregers oder von Proteinen, welche spezifisch für die hyperproliferative Störung sind, inhibiert;

(c) eine RNase; oder

(d) ein Ribozym

ist.

8. Konstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgen ein Cytokin ausgewählt aus α-Interferon, β-Interferon, Gamma-Interferon, transformierendem Wachstumsfaktor-β, Interleukin-2 oder eine Kombination davon codiert.

9. Konstrukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgen für Gamma-Interferon codiert.

10. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner umfaßt:

eine Polynukleotiderhaltungssequenz, welche für die dauerhafte Erhaltung des Konstrukts innerhalb von Säugetierzellen sorgt.

11. Konstrukt nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Erhaltungssequenz einen viralen Vektor oder einen Zielgenvektor umfaßt.

12. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es einen rekombinanten viralen Vektor ausgewählt aus Vaccinia, HIV- 1, HIV-2, Adenovirus und adeno-assoziiertem Virus umfaßt.

13. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es einen replikationsdefekten retroviralen Vektor umfaßt.

14. Konstrukt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der replikationsdefekte retrovirale Vektor ferner eine das Glykoprotein gp160env codierende Sequenz, welche aus HIV-1 oder HIV-2 stammt, umfaßt.

15. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die cis-aktive Regulationssequenz fähig ist, auf das HIV-tat-Protein zu reagieren.

16. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 15; dadurch gekennzeichnet, daß die cis-aktive Regulationssequenz in mindestens zwei Tandemkopien, welche funktionell mit dem Effektorgen verbunden sind, vorhanden ist.

17. Zusammensetzung zur Behandlung einer Wirtszelle gegen eine hyperproliferative Störung oder eine Infektion durch einen infektiösen Erreger, wobei die Zusammensetzung folgendes umfaßt:

ein Polynukleotidkonstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16; und

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch ge kennzeichnet, daß der pharmazeutisch annehmbare Träger ein Liposom umfaßt.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom ferner Antikörper spezifisch für die Wirtszellen, bei denen eine Behandlung angestrebt wird, umfaßt.

20. Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 16, oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung oder zur Therapie des menschlichen oder tierischen Körpers.

21. Konstrukt oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Therapie dem Schutz einer ausgewählten Population von Zellen in einem Organismus gegen eine Infektion oder eine hyperproliferative Transformation dient.

22. Polynukleotidkonstrukt zum Schutz einer ausgewählten Population von Zellen in einem Organismus gegen eine Infektion oder eine hyperproliferative Transformation, wobei das Konstrukt folgendes umfaßt:

eine cis-aktive Sequenz, welche die Expression eines Effektorgens nur in der Gegenwart von humanen krankheitsassoziierten trans-aktiven Faktoren, welche im wesentlichen nur in der ausgewählten Zellpopulation gefunden werden, fördert; und

unter der Kontrolle der cis-aktiven Sequenz, ein Effektorgen unter der Kontrolle der cis-aktiven Regula tionssequenz, dessen Expression die Zellen der Zellpopulation empfänglich für Schutz oder Zerstörung macht, wobei das Effektorgen ein Genprodukt codiert, welches:

(a) ein Cytokin;

(c) eine RNase; oder

(d) ein Ribozym

ist.

23. Konstrukt nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgen für ein Cytokin ausgewählt aus α-Interferon, β-Interferon, Gamma-Interferon, transformierendem Wachstumsfaktor-β, Interleukin-2 oder eine Kombination davon codiert.

24. Konstrukt nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Effektorgen für Gamma-Interferon codiert.

25. Konstrukt nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die cis-aktive Regulationssequenz mindestens in zwei Tandemkopien, welche funktionell mit dem Effektorgen verbunden sind, vorhanden ist.

26. Ex vivo-Zellen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

27. Virales Partikel enthaltend ein virales Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 11 bis 14.

28. Virales Partikel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es ein replikationsdefekter rekombinanter Retrovirus ist.

29. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend virale Partikel nach Anspruch 27 oder Anspruch 28 kombiniert mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.