DE69730157T2

DE69730157T2 - Molekül, welches genotyp und phänotyp zusammenführt und dessen anwendungen

Info

Publication number: DE69730157T2
Application number: DE69730157T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Machida-shi YANAGAWA; Naoto Machida-shi NEMOTO; Etsuko Yokohama-shi MIYAMOTO; Yuzuru Urawa-shi HUSIMI
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2017-10-18
Also published as: US6361943B1; EP0962527A1; JP3683282B2; EP0962527B1; US20030022230A1; EP1477561B1; US20020072087A1; DE69739163D1; EP1477561A2; DE69730157D1; WO1998016636A1; EP1477561A3; EP0962527A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Molekül, das den Genotyp einem Phänotyp zuordnet. Genauer gesagt betrifft es ein Molekül, das einem Phänotyp einen Genotypen zuordnet, umfassend einen Nukleinsäureteil mit einer Nukleotidsequenz, die den Genotyp darstellt und einem Proteinanteil, der ein Protein umfasst, das an der Ausprägung des Phänotyps beteiligt ist. Das Molekül, das dem erfindungsgemäßen Phänotyp den Genotyp zuordnet, ist eine sehr nützliche Substanz, die bei dem molekularevolutionären Engineering verwendet werden kann, wie beispielsweise bei der Modifizierung von Enzymen, Antikörpern, Ribozymen und anderen dieser funktionalen Biopolymere sowie bei der Erzeugung von Biopolymeren mit Funktionen, die in lebenden Organismen nicht gefunden werden.
Durch Fortschritte in der Biochemie, Molekularbiologie und Biophysik ist gelernt worden, dass lebende Organismen molekulare Maschinen sind, die durch Interaktionen zwischen Molekülen funktionieren und sich propagieren. Unter den Eigenschaften der lebenden Organismen der Erde sind die Bewahrung der genetischen Information in DNA-Nukleotidsequenzen und ihre Fähigkeit, diese Information durch das Medium der mRNA in funktionale Proteine zu übersetzen, elementar. Aufgrund des Fortschritts in der Gentechnik können nun Biopolymere mit gewünschten Sequenzen, wie beispielsweise Nukleotide und Peptide leicht synthetisiert werden. Proteindesign und RNA-Design sind heute aufgrund ihrer Existenz in der Gentechnologie ein Fokus der Aufmerksamkeit. Die Ziele des Proteindesigns und des RNA-Designs liegen darin, das Puzzle der dreidimensionalen Strukturen aufzulösen, die benötigt werden, damit Proteine und RNA spezifische Funktionen erfüllen und Menschen ermöglichen, ungehindert Proteine und RNS, die gewünschte Funktionen besitzen, zu designen. Aufgrund der Diversität und der Komplexität dieser Strukturen und der Schwierigkeit einer theoretischen Annäherung an ihre dreidimensionalen Strukturen sind das gegenwärtige Proteindesign und RNA-Design noch immer in einem Stadium des Modifizierens einiger Reste an aktiven Stellen und des Beobachtens von Veränderungen in der Struktur und der Funktionen. Das menschliche Wissen hat also noch nicht das Stadium des Designs von Proteinen und RNAs erreicht.
Das Verständnis von Funktionen von Biopolymeren in ihrer Beziehung zu den grundlegenden Prozessen des höheren Lebensphänomens wird die Aufklärung des Zusammenhangs zwischen der molekularen Proteinstruktur und der Funktion notwendig machen. Die gedankliche Linie, die wir im folgenden einnehmen, ist nicht nur die, das beste aus dem "menschlichen Wissen" zu machen, sondern auch von der "Weisheit der Natur" zu profitieren. Das liegt daran, dass wir beschlossen haben, dass wir die Fähigkeit erwerben müssten, beide umzusetzen, um die vorliegenden Schwierigkeiten des Proteindesigns zu überwinden und mit dem Design und der Herstellung funktionaler Biopolymere voranzukommen. Wenn die klassischen Verfahren auf das Design von Proteinen mit neuen Funktionen und Aktivitäten übertragen werden, kann die Schwierigkeit des Proteindesigns mittels ortsspezifischen Mutationen manchmal vermieden werden. Dieses kann bezeichnet werden als "von der Weisheit der Natur profitieren".
Obwohl der Nachteil dieses Verfahrens die Schwierigkeit des Screenens zum Identifizieren von Mutanten mit neuen Mutationen und Aktivitäten ist, wird diese Schwierigkeit durch RNA-Katalysatoren überwunden, die kürzlich in das Rampenlicht getreten sind. Es sind Versuche unternommen worden, eine RNA mit spezifischen Eigenschaften aus RNAs auszuwählen, die so synthetisiert wurden, dass sie eine extrem große Anzahl an Zufallssequenzen (ungefähr 1013 Arten) haben (Ellington, A. D. & Szostak, J. W. (1990) Nature, 346, 818–822).
Dies ist ein Beispiel des molekularevolutionären Engineerings. Wie durch dieses Beispiel belegt wird, ist das vorrangige Ziel des molekularevolutionären Engineerings von Proteinen, optimale Sequenzen durch das Suchen eines weitreichenden Sequenzbereichs in einer Größenordnung zu finden, die beim konventionellen Proteinengineering unvorstellbar ist. Durch das "das beste aus dem menschlichen Wissen machen", um ein Screeningsystem hierfür zu erstellen, wird es möglich, zahllose quasi optimale Sequenzen um die optimalen Sequenzen herum zu entdecken, und dadurch ein experimentelles System für das Untersuchen der "Sequenzversus Funktion" zu konstruieren.
Die bemerkenswerten Funktionen lebender Körper wurden durch den evolutionären Prozess erworben. Wenn daher die Evolution repliziert werden kann, sollte es möglich sein, Enzyme, Antikörper, Ribozyme und andere funktionale Biopolymere zu modifizieren, und außerdem Biopolymere mit Funktionen zu erzeugen, die in lebenden Organismen in dem Labor nicht gefunden werden. Es ist überflüssig zu sagen, dass die Forschung an der Proteinmodifizierung und die Erzeugung von Ziel. von äußerster Wichtigkeit in zahlreichen Aspekten der Biotechnologie ist, wie beispielsweise bei der Verwendung von Enzymen als industrielle Katalysatoren, Biochips, Biosensoren und für das Engineering von Zuckerketten.
Angesichts der Tatsache, dass molekulares Design unter Verwendung der Strukturtheorie noch immer in einem nicht perfekten Zustand ist, wie durch die kontinuierliche hohe Anerkennung für das "Screening" symbolisiert wird, hat die evolutionäre Technik den praktischen Wert als eine wirksamere Strategie bei der Verwendung zum Auswählen nützlicher Proteine. Das Bauen einer "Zeitmaschine", die in der Lage ist, eine Evolution in einem Labor effizienter herzustellen, falls dies möglich wäre, würde nicht nur die Modifizierung von Enzymen, Antikörpern (Vakzine, monoklonale Antikörper etc.) und anderer existierender Proteine ermöglichen, sondern auch den Weg bereiten für die Herstellung von Enzymen zum Zersetzen von Umweltverschmutzungen, für Reinigungsmittel und andere und neue Proteine, die in der biologischen Welt nicht vorhanden sind. Wenn ein experimentelles System für die Proteinevolution etabliert werden kann, kann es deswegen erwartet werden, dass es in aggressiver Weise für die Anwendung in einem weiten Bereich von Feldern verwendbar ist, einschließlich der Kraftstoffeinsparung und der Energiekonservierung in industriellen Verfahren, der Energieproduktion und im Umweltschutz. Das Zuordnungsmolekül der vorliegenden Erfindung ist eine sehr nützliche Substanz bei der Proteinmodifizierung und in anderen Aspekten des molekularevolutionären Engineerings.
Stand der Technik
Molekularevolutionäres Engineering ist ein Studiengebiet, das versucht, das molekulare Design funktionaler Polymere durch das Verwenden einer molekularen Evolution mit Hochgeschwindigkeit im Labor durchzuführen, d. h, durch Laboruntersuchungen und Optimierung der adaptiven Bewegung von Biopolymeren in einem Sequenzbereich. Es ist eine vollständig neue molekulare Biotechnologie, die zuerst 1990 erste substanzielle Ergebnisse ergab (Yuzuru Husimi (1991) Kagaku, 61, 333–240; Yuzuru Husimi (1992) Koza Shinka, Band 6, University of Tokyo Publishing Society).
Das Leben ist das Produkt der molekularen Evolution und der natürlichen Selektion. Die Evolution von Molekülen ist ein universelles Lebensphänomen, aber ihr Mechanismus ist nichts, das durch Studien aufgeklärt werden kann, die die Geschichte der vergangenen Evolution zurückverfolgt. Der Ansatz des Konstruierens und Untersuchens des Verhaltens von einfachen Molekülen und Lebenssystemen, die in dem Labor entstehen, stellt eher besseres fundamentales Wissen hinsichtlich der molekularen Evolution bereit und ermöglicht die Etablierung einer verifizierbaren Theorie, die auf das molekulare Engineering anwendbar ist.
Es ist bekannt, dass sich ein Polymersystem entwickeln wird, wenn es die folgenden fünf Bedingungen erfüllt: (1) ein offenes System, das sich weit außerhalb des Gleichgewichts befindet, (2) ein selbstreplikatives System, (3) ein Mutationssystem, (4) ein System mit einer Genotyp- und Phänotyp-Zuordnungsstrategie, und (5) ein System mit einer geeigneten Adaptionstopographie im Sequenzbereich. (1) und (2) sind Bedingungen für das Auftreten einer natürlichen Selektion, und (5) ist vorher durch die physikochemischen Eigenschaften des Biopolymers festgelegt. Die Genotyp- und Phänotyp-Zordnung aus (4) ist eine Voraussetzung für die Evolution durch natürliche Selektion.
Die folgenden drei Strategien werden in beiden, der natürlichen Welt und dem molekularevolutionären Engineering angenommen: (a) einen Ribozymtyp, auf dem der Genotyp und der Phänotyp auf dem gleichen Molekül getragen werden, (b) einen Virustyp, in dem der Genotyp und der Phänotyp einem Komplex bilden, und (c) einen Zelltyp, in dem der Genotyp und der Phänotyp in einem einzelnen Abteil enthalten sind (1).
Hinsichtlich des Ribozymtyps (a), in dem der Genotyp und der Phänotyp auf dem gleichen Molekül getragen werden, sind ein einfaches System, und Erfolge mit RNA-Katalysatoren (Ribozyme) bereits berichtet worden (Hiroshi Yanagawa (1993) New Age of RNA, Seiten 55–77, Yodosha).
Wahrnehmbare Problempunkte des Zelltyps (c) sind (1) der Durchschnittseffekt, (2) der Exzentrizitätseffekt und (3) der Zufalls-Replikations-Effekt. Der Durchschnittseffekt entsteht durch die Zuordnung des Genotyps zum Phänotyp, der sich statistisch ausmittelt und zweideutig wird, wenn die Anzahl an Kopien des Zellgenoms groß ist. Da ein evolviertes Genom nur eines unter einer Anzahl an Zahlen von Kopien (n) in einer Zelle ist, wird die Leistungsverbesserung ausgemittelt und ein Kampf um das Überleben in der Zellpopulation beginnt bei dem Selektionskoeffizienten (s)/n. Eine geringere Kopienanzahl (n) ist deswegen für den Zelltyp vorteilhaft. Aufgrund des Vorhandenseins des Exzentrizitätseffekts muss jedoch, wenn die Anzahl an Segmenten groß ist, n sehr groß sein, um den Exzentrizitätseffekt zu verhindern. Der offensichtliche Selektionskoeffizient in dem Kampf um das Überleben in der Zellpopulation kann daher erwartungsgemäß viel kleiner sein als im Falle des Virustyps.
Da die Dauer, die für eine Selektion benötigt wird, proportional vom Reziprokwert des Selektionskoeffizienten ist, ist die Rate der Evolution viel niedriger als die des Virustyps. Außerdem ist der Zufallsreplikationseffekt (3) für den Zelltyp fatal. Das ist deswegen so, da die Zufallsreplikation von segmentierten essenziellen Genen durch diesen Effekt die Replikation aller essenziellen Gene vor der Zellteilung extrem schwierig macht. Das bedeutet, dass selbst wenn ein essenzielles Gen mit einer vorteilhaften Mutation auftreten sollte, die Wahrscheinlichkeit, dass diese repliziert wird und an eine Tochterzelle weitergegeben wird, extrem niedrig ist.
Das Zusammenführen des Genotyps und des Phänotyps, wie im Virustyp (b), ist notwendig für eine effiziente Evolution.
Es sind bereits zahlreiche Techniken vorgeschlagen worden und im Entwicklungsprozess, für das molekularevolutionäre Engineering des Virustyp (b), der einen Komplex des Genotyps und des Phänotyps bildet, einschließlich des Phagendisplays (Smith, G. P. (1985) Science 228, 1315–1317; Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science 249, 386–390), Ppolysome Display (Mattheakis, L. C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022–9026), kodierte kombinatorische Bibliothek (Brenner, S. & Lerner, R. A. (1992) PrNatl. Acad. Sci. USA 89, 5381–5383) und Cellstat (Husimi, Y. et al. (1982) Rev. Sci. Instrum. 53, 517–522).
Trotz der Bedeutung der Größenordnung des suchbaren Sequenzbereichs im molekularevolutionären Engineering ist ein Verfahren zum umfassenden Suchen eines Sequenzbereichs, das dem eines Ribozymtyps vergleichbar ist, ist für den Virustyp noch nicht entwickelt worden.
Der Grund hierfür liegt darin, dass Viren, die gegenwärtig in einem Verfahren, wie beispielsweise Phagendisplays, verwendet werden, Parasiten existierender Zellen sind und deswegen unvermeidlicherweise den Zwängen, die durch die Wirtszellen ausgeübt werden, unterworfen sind, von den aufgelistet werden können: (1) dass nur ein begrenzter Sequenzbereich aufgrund der Restriktion durch die Zellen untersucht werden kann, (2) Membranpermeabilität, (3) der Neigung aufgrund des Wirts, und (4) Begrenzung der Bibliothek aufgrund der Wirtspopulation.
Das Polysomen-Display-Verfahren (Mattheakis, L. C. & Dower, W. J. (1995) WO95/11922) verbindet eine Nukleinsäure und ein Protein über ein Ribosom mittels nicht-kovalenter Bindung. Es ist deswegen geeignet, wenn die Kettenlänge der Peptidposition kurz ist, aber trifft Handhabungsprobleme an, wenn die Kettenlänge so lang ist wie ein Protein. Da das riesige Ribosom zwischengeschaltet ist, sind die Bedingungen der Zeit des Selektionsarbeitsschrittes (d. h. Absorption, Eluierung und Ähnliches) einer schweren Einschränkung unterworfen. Die kodierten kombinatorischen Bibliotheken (Janda, F. H. & Lerner, R. A. (1996) WO96/22391) ordnen einem chemisch synthetisierten Peptid ein Nukleinsäuretag über Kügelchen zu. Da die Ausbeute der chemischen Synthese von Proteinen mit ungefähr 100 Resten aufgrund der gegenwärtig verfügbaren Technologien extrem schlecht ist, kann diese Technik mit kurzkettigen Peptiden, aber nicht mit langkettigen Proteinen benutzt werden.
Eine vorstellbare Methode des Überwindens dieser Probleme ist die Verwendung eines zellfreien Translationssystems. Ein virusartiges Strategiemolekül, das einfach den Genotyp an den Phänotyp in dem zellfreien System bindet, hat eine Anzahl an Vorteilen, einschließlich der folgenden: (1) dass eine riesige Mutantenpopulation, die die des Ribozymtyps erreicht, synthetisiert werden kann, (2) die Erzeugung verschiedener Proteine ohne Abhängigkeit von einem Wirt, (3) kein Problem hinsichtlich der Membranpermeabilität, und (4) dass der 21. Code zum Einschleusen einer nicht-nativen Aminosäure verwendet werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Molekül bereitzustellen, das ein virusartiges Operations-Replikon umfasst, das die Vorteile des zuvor erwähnten virusartigen Strategiemoleküls aufweist, eine höhere Effizienz als Phagen zeigt, und weniger Beschränkungen aufgrund der Einstellung der Umweltbedingungen erleidet, insbesondere ein Molekül, das als "in-vitro-Virus" bezeichnet werden kann, wobei eine Nukleinsäure und ein Protein durch eine chemische Bindung aneinander gebunden sind, d. h. ein Molekül, in dem ein Genotyp einem Phänotyp zugeordnet ist. Noch genauer ist die vorliegende Erfindung erfüllt worden, um eine Molekül bereitzustellen, das eine 1 : 1 Beziehung zwischen der Information und der Funktion aufweist, welches für die Herstellung funktionaler Proteine und Peptide verwendet werden kann, indem eine Genotyp(Nukleinsäure)-Zuordnung zum Phänotyp (Protein) durchgeführt wird, indem ein zellfreies Proteinsynthesesystem verwendet wird, und indem das 3'-terminale Ende eines Gens an das C-terminale Ende eines Proteins mit Hilfe einer kovalenten Bindung an einem Ribosom erfolgt. Außerdem ist es ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, funktionale Zielproteine oder Peptide durch die Untersuchung eines großen Sequenzbereichs zu erhalten, welcher durch die Wiederholung der Selektion von Molekülen durchgeführt wird, die Genotypen Phänotypen zuzuordnen, die wie oben gebildet werden (ebenfalls nachfolgend als "in-vitro-Virus" bezeichnet) durch das in-vitro-Selektionsverfahren, und die Vermehrung von Genteilen der ausgewählten in-vitro-Viren durch Reverse Transkriptions-PCR, und weiter durch die Amplifikation, während Mutationen eingeschleust werden.
Die vorstelligen Erfinder haben ernsthaft Untersuchungen durchgeführt, um die oben erwähnten Ziele zu erreichen und als Ergebnis haben sie herausgefunden, dass zwei Arten von Molekülen, die einem Genotyp einen Phänotyp zuordnen, umfassend eine Nukleinsäure und ein Protein, die chemisch aneinander gebunden wurden, an einem Ribosom in einem zellfreien Protein-Synthesesystem konstruiert werden können. Sie haben außerdem herausgefunden, dass ein Protein-Evolutionssystem konstruiert werden kann, wobei die Zordnungsmoleküle (in-vitro-Viren) durch das in-vitro-Selektionsverfahren ausgewählt wurden, Genteile der ausgewählten in-vitro-Viren mittels Reverser Transkriptase-PCR amplifiziert werden, und die Gene während des Einschleusens von Mutationen weiter amplifiziert werden. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser Befunde erfüllt worden.
Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung ein Molekül bereitstellt, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, welches einen Nukleinsäureanteil mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die den Genotyp darstellt, und einem Proteinanteil, der ein Protein umfasst, das beim Aufweisen des Phänotyps beteiligt ist, wobei der Nukleinsäureteil und der Proteinteil durch eine chemische Bindung direkt verbunden sind.
Gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das zuvor erwähnte Zuordnungsmolekül bereitgestellt, wobei ein 3'-terminales Ende des Nukleinsäureteils und ein C-terminales Ende des Proteinteils durch eine kovalente Bindung gebunden sind, und das zuvor erwähnte Zuordnungsmolekül, wobei ein 3'-terminales Ende des Nukleinsäureteils kovalent an ein C-terminales Ende des Proteinanteils gebunden ist, Puromycin ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls das zuvor erwähnte Zuordnungsmolekül bereitgestellt, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen umfasst, das ein Protein kodiert, und dass der Proteinanteil ein Translationsprodukt des Gens des Nukleinsäureteils ist. Der Nukleinsäureteil umfasst bevorzugt ein Gen, das aus RNA zusammengesetzt ist, und eine Suppressor-tRNA, die durch einen Spacer an das Gen gebunden ist. Die Suppressor-tRNA umfasst bevorzugt einen Antikodon, der einem Terminationskodon des Gens entspricht. Alternativ dazu kann der Nukleinsäureteil ein Gen umfassen, das aus RNA und einem Spaceranteil, das aus DNA und RNA zusammengesetzt ist, oder aus DNA und Polyethylenglykol. Der Nukleinsäureteil kann ein Gen umfassen, das aus DNA zusammengesetzt ist, und einen Spaceranteil, der aus DNA und RNA zusammengesetzt ist.
Als weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren zum Konstruieren eines Moleküls zum Zuordnen des Genotyps zu einem Phänotyp bereitgestellt werden, welches umfasst (a) Binden einer DNA, die eine Sequenz umfasst, die einer Suppressor-tRNA entspricht, an ein 3'-terminales Ende einer DNA, die ein Gen enthält, durch einen Spacer, (b) Transkribieren des erhaltenen DNA-gebundenen Produktes in RNA, (c) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, und welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA, und (d) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produktes als mRNA, um einen Nukleinsäureanteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden; und ein Verfahren zum Konstruieren eines Moleküls, das einen Genotyp einem Phänotyp zuordnet, welches umfasst (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches kein Terminationskodon hat, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines chimären Spacers, der aus DNA und RNA zusammengesetzt ist, an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, an ein 3'-terminales Ende des erhaltenen gebundenen Produktes gebunden werden kann, und (e) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem in ein Translationsprodukt des Gens unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produktes als mRNA, um einen Nukleinsäureteil zu binden, der das Gen enthält.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das oben erwähnte Konstruktionsverfahren bereitgestellt, wobei das Nukleosid oder die Substanz mit der chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, Puromycin ist.
Als weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Konstruieren eines Moleküls bereitgestellt, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, welches umfasst (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches keinen Terminationskodon hat, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines chimären Spacers, der aus DNA und Polyethylenglykol zusammengesetzt ist an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an ein 3'-terminales Ende des erhaltenen gebundenen Produkts, und (e) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Synthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produktes als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Als weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Konstruieren eines Moleküls bereitgestellt, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, welches umfasst (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches keinen Terminationskodon hat, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines Spacers, der aus doppelsträngiger DNA zusammengesetzt ist an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit chemischer Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder an eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an ein 3'-terminales Ende des erhaltenen gebundenen Produktes, und (e) Durchführen einer Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebunden Produktes als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Als ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Konstruieren eines Moleküls bereitgestellt, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, welches umfasst (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches keinen Terminationskodon besitzt, und einer Nukleotidsequenz eines Spacers, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder an eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA gebunden wird, (d) Hinzugeben einer kurzkettigen PNA oder DNA zu einem 3'-terminalen Endseitenteil des Gens in dem erhaltenen RNA-gebundenen Produkt, um eine doppelsträngige Kette zu bilden, und (e) Durchführen einer Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produkts als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Als ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Proteinevolutionssimulierung bereitgestellt, welches einen Konstruktionsschritt, zum Konstruieren von Zuordnungsmolekülen einer DNA umfasst, die ein Gen enthält, durch eines der Konstruktionsverfahren, die oben erwähnt wurden, einen Selektionsschritt zum Selektionieren der Zuordnungsmoleküle, die in dem Konstruktionsschritt erhalten wurden, einem Mutationen einschleusenden Schritt zum Einschleusen einer Mutation in einen Genteil eines Zuordnungsmoleküls, das in dem Selektionsschritt ausgewählt wurde, und einen Amplifikationsschritt zum Amplifizieren des Genteils, der in dem Mutation einschleusenden Schritt erhalten wurde. In dem Verfahren zur Evolutionssimulierung werden der Konstruktionsschritt, der Selektionsschritt, der Mutationen einführende Schritt und der Amplifikationsschritt bevorzugt wiederholt durchgeführt, indem die DNA, die in dem Amplifikationsschritt erhalten wurde, für den Konstruktionsschritt bereitgestellt wird. Außerdem wird ein Apparat zum Durchführen des oben erwähnten Verfahrens zur Evolutionssimulierung bereitgestellt, welcher eine Vorrichtung zum Konstruieren von Zuordnungsmolekülen umfasst, wobei diese Vorrichtung eine erste Bindungsvorrichtung zum Binden einer DNA umfasst, welche eine Sequenz umfasst, die einer Suppressor-tRNA entspricht, an ein 3'-terminales Ende einer DNA, die ein Gen enthält, durch einen Spacer, eine Transkriptionsvorrichtung zum Transkribieren des DNA-gebundenen Produktes, das in der ersten Bindungsvorrichtung erhalten wurde in RNA, einer zweiten Bindungsvorrichtung zum Binden an ein 3'-terminales Ende der RNA, die mit einer Transkriptionsvorrichtung erhalten wurde, eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz gebunden werden kann, welche eine chemische Struktur hat, die der einer Aminosäure analog ist, und eine dritte Bindungsvorrichtung zum Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des gebundenen Produktes, was in der zweiten Bindungsvorrichtung als mRNA erhalten wurde, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen für das Translationsprodukt des Gens enthält, zu binden, oder eine Vorrichtung zum Konstruieren von Zuordnungsmolekülen, wobei diese Vorrichtung eine Transkriptionsvorrichtung zum Transkribieren einer DNA, die ein Gen enthält, in RNA umfasst, eine erste Bindungsvorrichtung zum Binden eines chimären Spacers, der aus DNA und RNA zusammengesetzt ist, einen chimäreren Spacer, der aus DNA und Polyethylenglykol zusammengesetzt ist, einen doppelsträngigen Spacer, der aus DNA und DNA zusammengesetzt ist, oder einen doppelsträngigen Spacer, der aus RNA und einer kurzkettigen Peptidnukleinsäure (PNA) oder DNA zusammengesetzt ist, an ein 3'-terminales Ende der RNA, die durch die Transkriptionsvorrichtung erhalten wird, eine zweite Bindungsvorrichtung zum Binden an das 3'-terminale Ende des RNA-Spacers, der wie durch die erste Bindungsvorrichtung gebunden, erhalten wurde, ein Nukleosid oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, binden kann, und einer dritten Bindungsvorrichtung zum Durchführen einer Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des gebundenen Produktes, das durch die zweite Bindungsvorrichtung als mRNA erhalten wird, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden; eine Selektionsvorrichtung zum Selektionieren der konstruierten Zuordnungsmoleküle; eine Mutationseinschleusungsvorrichtung zum Einschleusen einer Mutation in einen Genteil des Zuordnungsmoleküls, das ausgewählt wurde; und eine Amplifikationsvorrichtung zum Amplifizieren des Genteils, in den die Mutation eingeschleust worden ist.
Als noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Untersuchen der intermolekularen Wirkung von Protein/Protein oder Protein/Nukleinsäure bereitgestellt, welche einen Konstruktionsschritt zum Konstruieren von Zuordnungsmolekülen durch irgendeines der zuvor erwähnten Konstruktionsverfahren umfasst, und einen Untersuchungsschritt zum Untersuchen der intermolekularen Wirkung der Zuordnungsmoleküle, die in dem Konstruktionsschritt erhalten wurden mit einem anderen Protein oder einer Nukleinsäure.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Strategien für die Zuordnung von Genotyp (Nukleinsäureteil), zum Phänotyp (Proteinteil).
2 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Moleküls, das den Genotyp dem Phänotyp der vorliegenden Erfindung zuordnet, wobei ein Nukleinsäureteil und ein Proteinteil auf ortsspezifische Weise gebunden sind.
3 zeigt chemisch modifizierte Teile der 3'-terminalen Enden der Nukleinsäureteile, die eine Stelle der Herstellung des Moleküls sind, das den Genotyp dem Phänotyp zuordnet (in-vitro-Virus).
4 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Moleküls, das den Genotyp dem Phänotyp der vorliegenden Erfindung zuordnet, wobei ein Nukleinsäureanteil und ein Proteinanteil in einer nicht ortsspezifischen Weise gebunden sind.
5 ist eine Fotografie eines Elektrophoresebildes, das die Spaceroptimierung in dem ortsspezifischen Verfahren zeigt. Es zeigt die Ergebnisse einer 4%igen Polyacrylamidgelelektrophorese (in Gegenwart von 8 mol Harnstoff) einer DNA, die durch ein Verfahren erhalten wurde, das die Translation jedes RNA-Genoms mit einem Spacer in einer Länge umfasst, die jeder der hergestellten Fraktionen a, b und c entsprechen, in Gegenwart von biotinylierter Lysyl-tRNA in einem E. coli zellfreien Translationssystem, die spezifische Absorption auf Streptavidinbeschichteten Magnetkügelchen, die Reverse Transkription und Amplifikation mittels PCR (die Färbung war eine Silberfärbung). Spur 1 ist für die Länge des Spacers der Fraktion a (255 bis 306 Reste), Spur 2 ist die für Spacerlänge von Fraktion 2 (102 bis 238 Reste), und Spur 3 ist für die Spacerlänge von Fraktion c (0 bis 85 Reste).
6 ist eine Fotografie eines Elektrophoresebildes, das die Bindung eines Nukleinsäureteils an ein Proteinteil in einem ortsspezifischen Verfahren zeigt. Die Ergebnisse wurden mit einer 18%igen Polyacrylamidgelelektrophorese (in Gegenwart von 8 mol Harnstoff und SDS) erhalten: Spur 1 für ein Translationsprodukt von mRNA, die vier Wiederholungsregionen des tau-Proteins kodieren, welches in einem E. coli zellfreien Translationssystem erhalten wurde, während es mit [³⁵S]-Methionin markiert wurde, und Spur 2 für ein Translationsprodukt der mRNA, deren 3'-terminales Ende an sup-tRNA mit Puromycin gebunden war, und dessen 5'-terminales Ende mit [³²P] markiert war, welches in einem zellfreien E. coli Translationssystem erhalten wurde.
7 ist eine Fotografie eines Elektrophoresebildes, das die Bindung eines Nukleinsäureteils und Proteinteils in einem nicht ortsspezifischen Verfahren zeigt. Die Ergebnisse wurden durch eine 18%ige Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten (in Gegenwart von SDS): Spur 1 für ein Translationsprodukt von mRNA, die die vier Wiederholungsregionen eines tau-Proteins kodieren, welches in einem E. coli zellfreien Translationssystem erhalten wurde, während es mit [³⁵S]-Methionin markiert wurde, und Spur 2 für ein Translationsprodukt der mRNA, deren 3'-terminales Ende durch einen Spacer an Puromycin gebunden war, markiert mit [³²P], welches in einem E. coli zellfreien Translationssystem erhalten wurde, und Spur 3 für das Translationsprodukt der Spur 2, welches mit Ribonuklease T2 verdaut wurde.
8 zeigt ein Beispiel des Verfahrens zum Konstruieren des Moleküls, das dem Genotyp einen Phänotyp zuordnet (in-vitro-Virus) gemäß der vorliegenden Erfindung.
9 ist eine Fotografie eines Elektrophoresebildes, das die Bindung von rCpPur an den C-Terminus der 3'-terminalen Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins zeigt. Drei Arten von Genomen, d. h. eines mit einem Stopkodon, aber keinen DNA-Spacer (die erste Spur von links), eine, die weder ein Stopkodon, noch einen DNA-Spacer hat (die zweite Spur von links), und eine, die keinen Stopkodon hat, aber einen DNA-Spacer aufweist (die dritte Spur von links), jede am 3'-terminalen Ende der mRNA, die die N-terminale Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins kodiert, wurden konstruiert und in einem zellfreien Translationssystem unter Verwendung von Kaninchenreticulozytenlysat in Gegenwart von rCpPur, welches mit [³²P] für 20 Minuten bei 30°C markiert ist. Die Translationsprodukte wurden mittels 11,25%iger SDS-PAGE analysiert. Die Spur am rechten Ende zeigt das Ergebnis eines Produkts, das durch die Translation der mRNA erhalten wird, die die N-terminale Hälfte des menschlichen tau-Proteins (1–165) in Gegenwart von [³⁵S]-Methionin unter gleichen Bedingungen, wie oben erwähnt, in das Protein. Die Spur am rechten Ende zeigt das Ergebnis eines in-vitro-Virusgenoms, das mit [³²P] unter den gleichen Bedingungen wie oben markiert ist.
10 ist eine Fotografie eines Elektrophoresebildes, das die Erzeugung von in-vitro-Viren in einem zellfreien Translationssystem zeigt. (A) zeigt den zeitlichen Verlauf der Erzeugung von in-vitro-Viren. Ein Genom, das aus der mRNA zusammengesetzt ist, die die N-terminale Hälfte des menschlichen tau-Proteins (1–165), einem DNA-Spacer (105 mer), einem Peptidakzeptor, und rCpPur wurde in einem zellfreien Translationssystem unter Verwendung von Kaninchen-Retikulusslysat und enthaltend enthaltend [³⁵S]-Methionin translatiert und das Translationsprodukt wurde in einem zeitlichen Verlauf (nach 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 40 Minuten) bei 30°C untersucht. Die Translationsprodukte wurden mit Hilfe einer 11,25%igen SDS-PAGE analysiert. Die erste Spur von links zeigt das Ergebnis, das unter Verwendung der RNA erhalten wurde, die die N-terminale Hälfte des humanen tau-Proteins (1–165) als mRNA enthält, und beim Untersuchen der Inkorporation von [³⁵S]-Methionin in das Protein unter der gleichen Bedingung wie oben erwähnt. Die Spur am rechten Ende zeigt das Ergebnis des in-vitro-Virusgenoms, das mit ³²P markiert ist. (B) zeigt den Einfluss der Konzentration des in-vitro-Virusgenoms für die Erzeugung von in-vitro-Viren. Spur 1 zeigt die Ergebnisse eines Genoms, das mit [³²P]-rCpPur am 3'-terminalen Ende markiert ist, Spur 2 ist für ein Genom (1,2 μg), an das rCpPur an dessen 3'-terminales Ende angehängt ist, Spur 3 für ein Genom (0,33 μg), an das rCpPur an dessen 3'-terminales Ende angehängt wurde, und Spur 4 für ein Genom (0,64 μg), an das rCpPur an dessen 3'-terminales Ende angehängt wurde. Hinsichtlich der Spuren 2 bis 4 wurden die Genome in einem zellfreien Translationssystem unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysat und enthaltend [³⁵S]-Methionin für 20 Minuten bei 30°C translatiert. Die Translationsprodukte wurden mittels 11,25%iger SDS-PAGE analysiert.
11 ist eine Fotografie eines Elektrophoresebildes, das die Erzeugung von in-vitro-Viren in einem zellfreien Translationssystem zeigt. Ein in-vitro-Virus-Genom, das aus der mRNA, die die N-terminale Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins kodiert, einem DNA-Spacer (105 mer), ein Peptidakzeptor, und [³²P]-rCpPur besteht, wurde unter Verwendung des Kaninchen-Retikulozyten-Lysats bei 30°C für 20 Minuten translatiert. Die Translationsprodukte wurden durch 11,25%ige SDS-PAGE analysiert. Die Bindung des Genoms und des Proteins konnten durch den Verdau mit Mungbohnen-Nuklease bestätigt werden. Wenn das Translationsprodukt (Spur 3) mit Mungbohnen-Nuklease verdaut wurde, traten Banden auf (Spur 4) an den Positionen, die dem Monomer und dem Dimer entsprechen (Spur 1) der N-terminalen Hälfte des menschlichen tau-Proteins (1–165). Spur 2 zeigt das Ergebnis eines in-vitro-Virusgenoms, das mit ³²P markiert ist.
12 zeigt Verfahrensschritte eines Protein-Evolutions-Simulierungsverfahrens, bei dem in-vitro-Viren verwendet wurden.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
In dieser Beschreibung werden einige technische Termini verwendet, und diese technischen Termini haben die folgenden Bedeutungen, wenn sie hier verwendet werden. Der Begriff "Nukleinsäureanteil" bedeutet ein gebundenes Produkt eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, z. B. RNA, DNA, PNA (Peptidnukleinsäure; Polymere, die Nukleinsäuren umfassen, die über Aminosäureanaloga verbunden sind) und ähnliche, und "Proteinanteil" bedeutet ein gebundenes Produkt einer Aminosäure oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, wie beispielsweise die natürlich auftretenden Aminosäuren und die nicht natürlich auftretenden Aminosäuren. Der Begriff "Suppressor-tRNA (Sup-tRNA)" bedeutet eine tRNA, die eine Mutation durch strukturelle Veränderung unterdrücken kann, z. B. das Ablesen eines Terminationskodons der mRNA als Kodon, der einer bestimmten Aminosäure entspricht. Die Expression "mit einer Nukleotidsequenz, die den Genotyp darstellt" bedeutet, dass ein Gen oder ein Teil davon enthalten ist, der mit einem Genotyp verbunden ist. Die Expression "enthaltend ein Protein, das an dem Aufzeigen eines Phänotyps beteiligt ist" bedeutet beispielsweise ein Protein, dessen Expression per se eine Eigenschaft des Phänotyps ist, ein Protein, das am Aufweisen einer Eigenschaft eines Phänotyps durch dessen Funktion als ein Enzym oder ähnliches beteiligt ist.
Der Spacer, der am 3'-terminalen Ende des Nukleinsäureteils lokalisiert ist, kann jeder Spacer sein, vorausgesetzt, dass es eine Polymersubstanz ist, die bevorzugt eine Länge von nicht weniger als 100 Å, mehr bevorzugt ungefähr 100 bis 1.000 Å hat. Genauer gesagt, einzelsträngige Ketten von RNA oder DNA, doppelsträngige Ketten aus DNA und DNA, doppelsträngige Ketten aus RNA und kurzkettige PNA oder DNA (z. B. ungefähr 15 bis 25 Nukleotide) und Polymermaterialien wie beispielsweise Polysaccharide, welche natürlich auftretende oder synthetische, synthetische-organische Polymersubstanzen, wie beispielsweise Polyethylenglykole, bevorzugt Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht von ungefähr 3.000 bis 30.000 und ähnliche können erwähnt werden.
Der Nukleinsäureanteil und der Proteinanteil des Zuordnungsmoleküls der vorliegenden Erfindung sind durch eine chemische Bindung, wie beispielsweise eine kovalente Bindung, verbunden. Insbesondere sind solche, die durch das Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, oder eines gebundenen Produktes davon, das am 3'-terminalen Ende des Nukleinsäureteils vorhanden ist, an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, welche am C-Terminus des Proteinanteils vorhanden ist, über eine chemische Bindung, z. B. eine kovalente Bindung, bevorzugt.
Für die Bindung zwischen dem Nukleinsäureteil und dem Proteinteil, z. B. Pyromycin, 3'-N-Aminoacylpuromycinaminonukleosid (PANS-Aminosäure), welche eine Amidbindung als chemische Bindung am 3'-terminalen Ende des Nukleinsäureteils hat, z. B. PANS-Gly, wobei der Aminosäureanteil Glycin ist, PANS-Val, wobei der Aminosäureanteil Valin ist, PANS-Ala, wobei der Aminosäureanteil Alanin ist, und weitere PANS- (jede der anderen Aminosäuren), wobei der Aminosäureanteil eine der anderen Aminosäuren ist, kann verwendet werden. 3'-N-Aminoacyladenosinaminonukleosid (AANS-Aminosäure), welche als die chemische Bindung ein Amidbindung umfasst, wie durch eine Dehydratisierungskondensierung der Aminogruppe des 3'-Aminoadenosins und der Carboxylgruppe einer Aminosäure, z. B. AANS-Gly, wobei der Aminosäureanteil Glycin ist, AANS-Val, wobei der Aminosäureanteil Valin ist, AANS-Ala, wobei der Aminosäureanteil Analin ist und weitere AANS (jede der anderen Aminosäuren), wobei der Aminosäureanteil jede der anderen Aminosäuren ist, können ebenfalls verwendet werden. Solche, die aus einem Nukleosid oder einem Nukleosid, das an eine Aminosäure über eine Esterbindung gebunden ist, können ebenfalls verwendet werden. Außerdem können alle anderen Materialien mit einem Bindungsmodus, der in der Lage ist, ein Nukleosid oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die einem Nukleosid analog ist und einer Aminosäure oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die einer Aminosäure analog ist, ebenfalls verwendet werden.
Das Molekül, das den Genotyp einem Phänotyp der vorliegenden Erfindung zuordnet, kann hergestellt werden durch beispielsweise (1) ein Verfahren, wobei die Bindung des Nukleinsäureanteils und des Proteinanteils in einer ortsspezifischen Weise gebildet wird, oder (2) ein Verfahren, wobei die Bindung des Nukleinsäureanteils und des Proteinanteils in einer nicht-ortsspezifischen Weise gebildet wird, welche nachfolgend erklärt wird.
Zuerst, (1) wird das Verfahren, wobei die Bindung des Nukleinsäureanteils und des Proteinanteils in ortsspezifischer Weise gebildet werden, erklärt.
In diesem Verfahren wird ein Molekül, das einen Genotyp einem Phänotyp zuordnen kann hergestellt durch (a) Binden einer DNA, umfassend eine Sequenz, die einer sup-tRNA entspricht, an das 3'-terminale Ende einer DNA, die ein Gen enthält durch einen Spacer, (b) Transkribieren des erhaltenen DNA-gebundenen Produktes in RNA, (c) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, z. B. Puromycin, an das 3'-terminale Ende der erhaltenen RNA, (d) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem, z. B. einem E. coli-zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produktes als mRNA und dadurch (e) Bereitstellen eines Moleküls, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, umfassend ein Gen-RNA (Genotyp) und ein Protein (Phänotyp), welches das Translationsprodukt des Gens ist, welche chemisch durch ein Nukleosid oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, z. B. Puromycin, gebunden ist.
Das bedeutet, gemäß diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wenn ein Terminationskodon in die A-Stelle des Ribosoms während der Proteinsynthese eintritt, eine sub-tRNA entsprechend inkorporiert ist, und ein Nukleosid oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, z. B. Puromycin, welche am 3'-terminalen Ende der sub-tRNA vorhanden ist, an ein Protein durch Einwirkung der Peptidyltransferase (2) gebunden ist. Deswegen ist dieses Verfahren ortsspezifisch für die Bildung der Bindung zwischen dem Nukleinsäureanteil und dem Protein, welches vom genetischen Code abhängt.
Es ist bekannt gewesen, dass Puromycin (3) die Proteinsynthese in Bakterien inhibiert Nathans, D. (1964) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 51, 585–592; Takeda, Y. et al. (1960) J. Biochem. 48, 169–177) und in tierischen Zellen (Ferguson, J. J. (1962) Biochim. Biophys. Acta 57, 616–617; Nemeth, A. M. & de la Haba, G. L. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1190–1193). Puromycin, dessen Struktur der Struktur von Aminoacyl-tRNA ähnelt, reagiert mit Peptidyl-tRNA, die an die P-Stelle des Ribosoms gebunden ist, und wird von dem Ribosom als Peptidylpuromycin freigesetzt, und unterbricht dadurch die Proteinsynthese (Harris, R. J. (1971) Biochim. Biophys. Acta 240, 244–262).
Es ist aufgrund der Probleme, die die Reinigung von sup-tRNA und der leicht hydrolysierbaren Esterbindung am 3'-terminalen Ende der tRNA betreffen, nicht praktikabel, native sup-tRNA zu reinigen und diese an mRNA zu binden. Durch Untersuchungen der Identität der RNA ist es aufgeklärt worden, dass nicht-modifizierte tRNA, wie intakte tRNA aminoacyliert werden kann, und dass die aminoacylierte nicht-modifizierte tRNA in ein Ribosom aufgenommen werden kann und translatiert wird (Shimizu, M. et al. (1992) J. Mol. Evol. 35, 436–443). Die Identität der tRNA wird ebenfalls verwendet, um sup-tRNA herzustellen.
Es ist berichtet worden, dass die Aminoacyl-Synthetasen von Alanin, Histidin und Leucin die Antikodons davon nicht erkennen (Tamura, K. et al. (1991) J. Mol. Recog. 4, 129–132). Deswegen kann es erwartet werden, dass durch das Ersetzen des Antikodons von tRNA für Alanin mit einem Terminationskodon (z. B. Amber), tRNA für Alanin (sup-tRNA) eingebaut werden würde, entsprechend dem Terminationskodon.
In dieser Hinsicht stellt sich die Frage, ob tRNA deren 5'-terminale Endseite nicht durch RNAse P oder ähnliche gemacht wurde, anders als bei der gewöhnlichen tRNA, in die A-Stelle des Ribosoms eintreten kann oder nicht. Dieses ist das wichtigste zu untersuchende Problem beim Bestimmen der Möglichkeit des Modells der vorliegenden Erfindung. Es ist bekannt gewesen, dass die 3'-terminalen Enden des Brome Mosaic Virus (BMV) und des Turnip Yellow Mosaic Virus (TYMV) eine tRNA-artige Struktur haben und dass sie durch Aminoacylsynthetase aminoacyliert werden und in einer Effizienz von 1% in einem zellfreien Translationssystem inkorporiert werden (Chen, J. M. & Hall, T. C. (1973) Biochemistry 12, 4570–4574). Unter der Annahme, dass RNA von BMV selbst zu 1% durch das Ribosom eingeschlossen wird, kann erwartet werden, dass RNA mit einer intakten tRNA an dessen 3'-terminalem Ende noch wirksamer eingebaut werden kann.
Selbst wenn sie in einer Wirksamkeit von 10% oder weniger der einer intakten tRNA inkorporiert wird, gibt es eine vernünftige Möglichkeit, dass sie die Kompetition mit dem Freisetzungsfaktor durch den Konzentrationseffekt gewinnen kann.
Deswegen wurde, bevor das Experiment zum Binden eines Proteins an das 3'-terminale Ende von mRNA-sup tRNA (mRNA, die an ihrem 3'-terminalen Ende mit sub-tRNA durch einen Spacer ligiert ist) untersucht, ob sogar sup-tRNA, die von mRNA getrennt war, in die A-Stelle des Ribosoms eintreten kann und an ein Protein gebunden wurde. Eine sup-tRNA, deren 3'-terminales Ende an Puromacin gebunden war, wurde wirklich hergestellt und zu einem zellfreien Protein-Synthesesystem hinzugegeben, um zu untersuchen, ob der sup-tRNA-Anteil in die A-Stelle des Ribosoms eintritt, entsprechend dem Auftreten eines Terminationskodons und an ein Protein gebunden wird. Die Region mit 4 Wiederholungen des tau-Proteins (127 Reste) wurde als mRNA verwendet (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392–399). Als Ergebnis konnte bestätigt werden, dass wenn die Translation in einem zellfreien Proteinsynthesesystem durchgeführt wurde, die sub-tRNA mit Puromycin an dessen 3'-terminalem Ende in die A-Stelle des Ribosoms, die einem Terminationskodon entspricht, inkorporiert wurde, und an ein Protein gebunden wurde (2).
Dann wurden RNA-sup-tRNA gebundene Produkte mit verschiedenen Längen des Spacers zwischen mRNA und sup-tRNA konstruiert, und es wurde versucht, eine optimale Länge des Spacers auszuwählen, der die beste Wirksamkeit des Einschließens des sup-tRNA-Anteils in die A-Stelle des Ribosoms ergab, mit Hilfe des in-vitro-Selektionsverfahrens. Als Ergebnis wurde gefunden, dass das RNA-sup-tRNA gebundene Produkt mit einer gewissen Spacerlänge chemisch an ein Protein gebunden wurde, das das Translationsprodukt hiervon mit einer guten Effizienz war.
Um das Molekül zu konstruieren, das den Genotyp einem Phänotyp der vorliegenden Erfindung zuordnet, wurde ein Nukleosid oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche an das 3'-terminale Ende des Nukleinsäureanteils gebunden werden soll und kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur analog der einer Aminosäure gebunden ist, z. B. 2'-Deoxycytidylylpuromycin (dCpPur) und Ribocytidylpuromycin (rCpPur) (3) müssen zuerst synthetisiert werden.
Ein beispielhaftes Verfahren zum Synthetisieren von dCpPur ist wie folgt. Zuerst kann Puromycin-5'-monophosphat durch das chemische Phosphorylieren der 5'-Hydroxylgruppe des Puromycins unter Verwendung von Phosphoroxychlorid und Trimethylphosphat hergestellt werden. Dann kann die Aminogruppe des Aminosäureanteils und die 2'-Hydroxylgruppe des Riboseteils in Puromycin-5'-monophosphat durch das Umsetzen von Puromycin-5'-monophosphat mit Trifluoressigsäure und Trifluoressigsäureanhydrid geschützt werden. Das geschützte Produkt kann mit Bz-DMT-Deoxycytidin umgesetzt werden, wobei die Aminogruppe des Pyrimidinrings und die 5'-Hydroxylgruppe des Riboseanteils in Deoxycytidin in Gegenwart des Kondensationsmittels geschützt werden. Dicyclohexylcarbodiimid, und dann mit Essigsäure und Harnstoff entschützt werden, um 2'-Deoxycytidylylpuromycin (dCpPur) zu ergeben. pdCpPur kann durch das Phosphorylieren der 5'-Hydroxylgruppe des dCpPur mit Polynukleotidkinase erhalten werden.
Das Ribocytidylpuromycin kann durch das Kondensieren von Puromycin und rC-β-Amidit mit Schutzgruppen in Gegenwart von Tetrazol und das Oxidieren und Entschützen des Produktes hergestellt werden.
Dann wird die Konstruktion eines gebundenen Produktes, das den Nukleinsäureteil zum Binden des Nukleinsäureteils und des Proteinteils auf ortsspezifische Weise nachfolgend beschrieben werden.
Als gebundenes Produkt, das den Nukleinsäureteil darstellt, der für das ortsspezifische Verfahren verwendet wird, kann beispielsweise ein gebundenes Produkt umfassen 5'-(T7-Promotorregion)-(Shine-Dalgarno (SD) Sequenzregion)-(mRNA-Region)-(Spaceregion)-(spu-tRNA-Region)-(Pyrumycinregion)-3', welche auf diese Weise verbunden sind, erwähnt werden.
Bei der Herstellung dieses gebundenen Produktes für den Nukleinsäureanteil wird ein Plasmid, das die Region mit 4 Wiederholungen umfasst, welches die Mikrotubulie-bindende Region des humanen tau-Proteins ist, welche aus htau24 (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392–399) bezeichnet wird, stromabwärts des T7-Promotors (pAR3040) inseriert, zuerst konstruiert und es wird mit den Restriktionsenzymen BglII und BamHI verdaut, um eine lineare DNA hervorzubringen. Diese DNA wird als eine Matrize verwendet und eine Amplifizierung wird mittels PCR unter Verwendung von Primern für die Stromaufwärtsregion, welche die T7-Region enthält (vorwärts) und für die Stromabwärtsregion, die die SD-Region enthält und eine Region um den Initiationskodon (rückwärts), und Taq-DNA-Polymerase durchgeführt.
In dem obigen Verfahren können drei Methionine an den Rückwärtsprimer angehängt werden, um die Detektionssensitivität für radioaktives Methionin in dem Proteinanteil nach der Proteinsynthese zu verstärken. Das heißt, dass Leucin an der Position 4 und Lysin an den Positionen 5 und 8 der Region mit den 4 Wiederholungen durch Methionin ersetzt werden. Zum Schluß enthält das translatierte Protein mit den 4 Wiederholungen vier Methionine insgesamt. Dann wird eine Amplifizierung unter Verwendung von PCR unter Verwendung einer DNA durchgeführt, die die Region mit den 4 Wiederholungen als linearisierte Matrize enthält, eine komplementäre Kette des Rückwärtsprimers, der oben erwähnt wurde als Vorwärtsprimer und ein Rückwärtsprimer, der so entworfen wurde, dass das C-terminale Ende der Region mit den 4 Wiederholungen einen Amberkodon als Terminationskodon haben sollte.
Die zwei Arten von DNA-Fragmenten, die mittels PCR amplifiziert werden, d. h. das DNA-Fragment, das den T7-Promotor und die SD-Region enthält und das DNA-Fragment, das die Region mit 4 Wiederholungen enthält, werden gemischt, anfänglich ohne Primer verlängert und dann mittels PCR wieder unter Verwendung eines Primers amplifiziert, der die Sequenz des T7-Promotors als Vorwärtsprimer enthält, und einem Primer, der ein Terminationskodon an dem C-terminalen Terminus der Region mit den 4 Wiederholungen als Rückwärtsprimer enthält.
Dieses DNA-gebundene Produkt (T7-Promotor-SD-4-Wiederholungen) wird an ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit kohäsiven Enden an beiden Enden, und das aus 17 Resten in Tandem zusammengesetzt ist unter Verwendung der DNA-Ligase ligiert, um Ligationsprodukte mit verschiedenen Spacerlängen hervorzubringen.
Nach der Ligierung wurde das Produkt in drei Fraktionen (a, b, c) aufgrund der Länge mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) fraktioniert. Der Spacer wird als (17)n dargestellt, wobei n = 15 bis 18 für Fraktion a, n = 6 bis 14 für Fraktion b, und n = 0 bis 5 für Fraktion c sind. Als sup-tRNA wird eine native Alanyl-tRNA, deren verschiedene Stellen und der Antikodon in amber (UAG) modifiziert sind, durch chemische Synthese hergestellt. Diese sup-tRNA wird unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an die Ligationsprodukte der Fraktionen a, b und c mit verschiedenen Spacerlängen ligiert. Als Ligationsstelle wird eine überschüssige Menge an einzelsträngiger Backing-DNA verwendet, und nachdem sie einmal durch Temperaturerhöhung geschmolzen wurden, werden die Stränge angelagert und ein komplementärer Strang wird gebildet und ligiert. Nach der Ligierung wird das Ligierungsprodukt mittels PCR unter Verwendung von Primern für das 5'-Ende und 3'-terminale Ende des Ligationsproduktes amplifiziert. Dieses DNA-Ligationsprodukt wird unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase transkribiert, um ein RNA-Ligationsprodukt zu bilden.
Durch das Ligieren des chemisch synthetisierten pdCpPur an das 3'-terminale Ende dieses RNA-Ligationsproduktes unter Verwendung von T4-RNA-Ligase kann ein RNA-Ligationsprodukt, 5'-(T7-Promotorregion)-(SD-Region)-(4 Wiederholungsregion)-(Spacerregiori)-(sup-tRNA-Region)-(Puromycin)-3' erhalten werden, welches als ein Gen in einem zellfreien Proteinsynthesesystem verwendet werden kann.
Die Proteinsynthese wird durch das Hinzugeben des obigen RNA-Ligationsproduktes als mRNA zu einem zellfreien Proteinsynthesesystem, wie beispielsweise einem zellfreien Proteinsyntheseextrakt von E. coli oder Kaninchen-Reticulozyten durchgeführt. Um eine optimale Spacerlänge zum Erhalten der wirksamsten Bindung des Nukleinsäureteils (RNA) und des Proteinteils zu erreichen, wird das folgende Experiment durchgeführt.
Das bedeutet, dass die Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung der oben erwähnten RNA-Ligationsprodukte mit drei Arten verschiedener Spacerlängen entsprechend den Fraktionen a, b und c als Gen durchgeführt wird. In dieser Synthese, durch Hinzugeben von tRNA, die mit modifiziertem Lysin, welches eine Biotinbindung durch die ε-Aminogruppe des Lysins umfasst, wird Biotinyllysin an verschiedenen Positionen der Lysinreste in dem translatierten Protein mit 4 Wiederholungen inkorporiert. Nach der Proteinsynthese werden magnetische Kügelchen, die mit Streptavidin auf ihrer Oberfläche beschichtet sind, hinzugegeben, um das Protein zu isolieren, das das Biotin inkorporiert hat.
Falls der Nukleinsäureteil (RNA) sich durch Puromycin an den Proteinteil gebunden hat, sollte der Nukleinsäureteil (RNA) an das C-terminale Ende des Proteins gebunden sein. Wenn eine Reverse Transkription unter Verwendung einer Sequenz durchgeführt wurde, die der N-terminalen Region der 4 Wiederholungen als Vorwärtsprimer und der 3'-terminalen Endportion der sup-tRNA als Rückwärtsprimer entsprechend und mittels Polyacrylgelelektrophorese analysiert werden, um zu bestätigen, ob das RNA-Protein gebundene Produkt tatsächlich durch die Magnetkügelchen aufgenommen wurde, wurde eine Bande revers transkribierter DNA nur für die Spacerlänge der Fraktion c beobachtet. Das bedeutet, dass das RNA-Ligationsprodukt mit einer Spacerlänge der Fraktion c am effizientesten an den Proteinteil gebunden wird.
Nun wird über (2) das Verfahren erklärt, wobei die Bindung des Nukleinsäureteils an den Proteinteil in einer nicht-ortspezifischen Weise durchgeführt wird.
In diesem Verfahren kann ein Molekül, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, durch (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches kein Terminationskodon hat, (b) das Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) das Binden eines chimären Spacers, der aus DNA und RNA zusammengesetzt ist, an das 3'-terminale Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder einer Subtanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, z. B. Puromycin, an das 3'-terminale Ende des gebundenen Produktes, (e) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produktes als mRNA, und dadurch (f) Hervorbringen eines Moleküls, das einem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, umfassend eine Gen-RNA und ein Protein, das das Translationsprodukt des Gens ist, welche chemisch durch Puromycin oder ähnliche gebunden sind.
Das bedeutet, dass diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Nukleosid oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, z. B. Puromycin, welche am 3'-terminalen Ende des Nukleinsäureteils vorhanden ist, nicht in die A-Stelle des Ribosoms eintritt, die dem Terminationskodon der mRNA am Ribosom entspricht, sondern zufällig in Abhängigkeit von der Spacerlänge eintritt, und Puromycin oder ähnliche am 3'-terminalen Ende des RNA-DNA-chimär-Nukleinsäureanteils chemisch an ein Protein gebunden ist, durch die Einwirkung der Peptidyltransferase (4). Deswegen ist dieses Verfahren nicht ortsspezifisch hinsichtlich der Bildung einer Bindung zwischen dem Nukleinsäureteil und dem Protein, welches nicht von dem genetischen Code abhängt.
In diesem Verfahren kann das Molekül, das dem Genotyp einen Phänotyp zuordnet, unter Verwendung eines nicht-ortsspezifischen Ligationsproduktes für den Nukleinsäureteil auf gleiche Weise wie in dem oben erwähnten ortsspezifischen Verfahren in (1) hergestellt werden.
Als Ligationsprodukt, das den Nukleinsäureteil bildet, der für das nicht-ortsspezifische Verfahren verwendet wird, kann beispielsweise ein Ligationsprodukt, zusammengesetzt aus 5'-(T7-Promotorregion)-(Shine-Dalgarno (SD)-Sequenzregion)-(mRNA-Region)-(Spacerregion)-(Puromycinregion)-3', welche in dieser Reihenfolge in einer Sequenz verbunden ist, erwähnt werden.
Bei der Konstruktion dieses Ligationsproduktes für den Nukleinsäureteil kann die Herstellung von der T7-Promotorregion zu dem Ende der Region mit den 4 Wiederholungen ähnlich der sein, die für die Herstellung des Ligationsproduktes des Nukleinsäureteils, welches in (1) dem ortsspezifischen Verfahren, welches oben erwähnt wurde sein, vorausgesetzt, dass ein Primer, der so entworfen wurde, dass er keinen Terminationskodon hat, in dem die zwei Terminationskodons am C-terminalen Ende der 4 Wiederholungen ersetzt werden, Ocre (CTG) und Ambre (TAA) mit CAG (Glutamin) und AAA (Lysin) als ein Rückwärtsprimer für die PCR-Amplifizierung des Ligationsproduktes verwendet werden, welches oben konstruiert wurde, und als Schablone verwendet wird.
Dieses DNA-Ligationsprodukt wird als eine Schablone unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase transkribiert, um ein entsprechendes RNA-Ligationsprodukt zu ergeben. Dieses einzelsträngige RNA-Ligationsprodukt wird separat an jedem der einzelsträngigen chemisch synthetisierten DNA-Linker (Kettenlänge; 20, 40, 60 und 80 Nukleotiden) unter Verwendung von T4-RNA-Ligase ligiert. Dann wird jedes Ligationsprodukt an ein einzelsträngiges DNA-RNA-chimäres Oligonukleotid, umfassend 25 Reste (DNA; 21 Reste, RNA; 4 Reste) ligiert, welches als Peptidakzeptor entworfen ist, in dem T4-DNA-Ligase in Gegenwart ein einzelsträngiger Backing-DNA verwendet wird.
Da die Sequenz des Peptidakzeptors die 3'-terminale Endsequenz von Alanyl-tRNA enthält, und die Inkorporation eines Puromycinderivats in die A-Seite des Ribosoms verstärkt, ist es bevorzugt, den Peptidakzeptor zwischen der Spacerregion und der Puromycinregion zu verwenden.
Durch das Ligieren des oben chemisch synthetisierten pdCpPur an das 3'-terminale Ende des obigen Ligationsproduktes unter Verwendung von T4-RNA-Ligase kann ein chimäres RNA-DNA-Ligationsprodukt erhalten werden, 5'-(T7-Promotorregion (RNA))-(SD-Region (RNA))-(4 Wiederholungen umfassende Region (RNA))-(Spacerregion (DNA))-(Peptidakzeptorregion)- (Puromycin)-3', welche als ein Gen für ein zellfreies Proteinsynthesesystem verwendet werden kann.
Wenn die Proteinsynthese unter Verwendung des oben erwähnten chimären RNA-DNA-Ligationsproduktes als Gen in einem zellfreien Proteinsynthesesystem durchgeführt wird, kann ein gebundenes Produkt erhalten werden, umfassend einen Nukleinsäureteil (chimäres RNA-DNA-Ligationsprodukt, Genotyp) und einen Proteinteil (Phänotyp), welche durch eine chemische Bindung durch Puromycin verbunden sind.
In dem oben erwähnten Verfahren kann auch ein chimärer Spacer aus DNA und Polyethylenglykol anstelle des chimären Spacers aus DNA und RNA verwendet werden.
In dem obigen Verfahren kann auch ein Spacer, der aus einer doppelsträngigen Kette aus DNA und DNA zusammengesetzt ist, oder eine doppelsträngige Kette aus RNA und einem kurzkettigen PNA oder DNA (z. B. ungefähr 15 bis 25 Nukleotide) anstelle des chimären Spacers aus DNA und RNA verwendet werden. Der Spacer, der aus dem Doppelstrang aus DNA und DNA zusammengesetzt ist, muss nicht notwendigerweise über die gesamte Länge doppelsträngig sein, und er kann im größten Teil doppelsträngig sein (für gewöhnlich sind mehrere Reste an beiden Enden einzelsträngig, und der verbleibende Teil ist doppelsträngig). Der doppelsträngige Spacer, der aus RNA und kurzkettigem PNA oder DNA zusammengesetzt ist, kann ebenfalls durch (a) Herstellen einer DNA, enthaltend ein Gen, welches kein Terminationskodon, und eine Nukleotidsequenz eines Spacers (b), Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (Binden der erhaltenen RNA an das 3'-terminale Ende eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der einer Aminosäure analog ist, gebunden werden, und (d) durch das Zugeben eines kurzkettigen PNA oder DNA an das 3'-terminale Endseitenteil des Gens in dem erhaltenen RNA-gebundenen Produkt, um eine doppelsträngige Kette zu bilden.
Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Genrekombinationstechniken, wie beispielsweise Isolierung und Herstellung von Nukleinsäuren, Ligation von Nukleinsäuren, Synthese von Nukleinsäuren, PCR, Konstruktion von Plasmiden und Translation in zellfreien Systemen, können durch Verfahren, die in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder ähnliche Verfahren durchgeführt werden, solange es nicht anders angegeben wurde.
Das Zuordnungsmolekül der vorliegenden Erfindung kann auch durch das aufeinanderfolgende Binden jedes dieser Elemente durch irgendwelche bekannten chemischen Bindungsverfahren zusätzlich zu dem oben beispielhaft dargestellten Verfahren erhalten werden.
Das Proteinevolutionssimulationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das die Schritte umfasst (1) Herstellung von in vitro Virus Genomen, (2) Kompetierung von in-vitro-Viren, (3) Selektionsverfahren, (4) Einschleusung einer Mutation und (5) Amplifizierung, wie in 12 gezeigt wird. Diese Schritte oder die Wiederholung dieser Schritte, falls benötigt, ermöglichen die Modifizierung und Bildung von funktionalen Proteinen. Von diesen Schritten können die Schritte (1) und (2) durch die oben im Detail erklärten Verfahren durchgeführt werden. Das bedeutet, dass Schritt (1) der Herstellung des gebundenen Produktes entspricht, welches ein Nukleosid umfasst oder die Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, und der Schritt (2) entspricht der Herstellung des Zuordnungsmoleküls des gebundenen Produktes. Die Schritte (3), (4) und (5) werden nachfolgend beschrieben.
Das Selektionsverfahren (3) bedeutet ein Verfahren zum Untersuchen der Funktion (biologischen Aktivität) von Proteinteilen, die die in-vitro-Viren bilden, und das Auswählen von in-vitro-Viren auf der Grundlage der gewünschten biologischen Aktivität. So ein Verfahren ist bekannt gewesen und z. B. beschrieben in Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science, 249, 386–390; Devlin, P. E. et al. (1990) Science, 249, 404–406; Mattheakis, L. C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022–9026 und ähnlichen.
Dann werden Mutationen in die Nukleinsäureteile der ausgewählten in-vitro-Viren eingeschleust, und die in-vitro-Viren werden mittels PCR oder ähnliche in den Schritten (4) Einschleusung einer Mutation, und in (5) Amplifizierung, amplifiziert. Wenn der Nukleinsäureteil der in-vitro-Viren aus RNA zusammengesetzt ist, kann die Mutation eingeschleust werden, nachdem eine cDNA durch Reverse Transkriptase synthetisiert wurde. Die Amplifizierung des Nukleinsäureteils kann auch durchgeführt werden, während die Mutation eingeschleust wird. Die Einschleusung einer Mutation kann leicht durch bereits etablierte, fehleranfällige PCR, durchgeführt werden (Leung, D. W., et al. (1989) J. Methods Cell Mol. Biol., 1, 11–15), Sexual-PCR (Stemmer, W. P. C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751) oder ähnliche.
(1) In-vitro-Virusgenome können unter Verwendung von Nukleinsäureteilen für in-vitro-Viren konstruiert werden, in die eine Mutation eingeschleust wurde und amplifiziert wurde, (2) in-vitro-Viren können unter Verwendung der in-vitro-Virusgenome komplettiert werden, (3) in-vitro-Viren können auf der Grundlage einer gewünschten biologischen Aktivität ausgewählt werden, und (4) die Mutationseinschleusung und die Amplifizierung können durchgeführt werden. Durch die Wiederholung dieser Schritte, wie gewünscht, kann die Modifizierung und Bildung funktionaler Proteine umgesetzt werden.
Die Mittel, die in dem Apparat der vorliegenden Erfindung zum Durchführen der zuvor erwähnten Proteinevolutionssimulierungsverfahren enthalten sind, sind an sich bekannte, und die Arbeitsschritte in diesen Mitteln, wie beispielsweise die Zugabe von Reagenzien, das Rühren, die Temperaturkontrolle und die Untersuchung der biologischen Aktivität können gemäß Verfahren, die per se bekannt sind, durchgeführt werden. Durch das Kombinieren dieser Arbeitsschritte kann ein automatischer oder semi-automatischer Apparat der vorliegenden Erfindung konstruiert werden.
Der Schritte des Konstruierens von Zuordnungsmolekülen in dem Verfahren zum Untersuchen von Protein/Protein- oder Protein/Nukleinsäure-intermolekularen Aktionen der vorliegenden Erfindung umfasst im allgemeinen die Schritte des (1) Synthetisierens von mRNA aus einer Genbibliothek oder einer cDNA-Bibliothek, und Konstruieren eines in-vitro-Genoms, und (2) Konstruieren eines in-vitro-Virus, umfassend mRNA und ein entsprechendes Protein, welche an ein Ribosom gebunden sind, durch das Verwenden eines zellfreien Proteinsynthesesystems.
Der Schritt (1) entspricht der Synthese von mRNA unter Verwendung von RNA-Polymerase aus cDNA oder DNA, von denen die Sequenz bekannt ist, und welche eine Sequenz enthält, die einem ORF entspricht, cDNA der DNA, deren Sequenz unbekannt ist, und die ein Fragment enthält, welches aus der Fragmentierung mit einem geeigneten Restriktionsenzym oder ähnlichem resultiert, und die Konstruktion eines in-vitro-Virusgenoms unter Verwendung der mRNA.
Die Schritte der obigen (1) in-vitro-Virusgenombildung und (2) in-vitro-Viruskonstruktion können durch die Konstruktionsverfahren, die oben im Detail beschrieben wurden, durchgeführt werden.
Der Untersuchungsschritt zum Untersuchen der intermolekularen Wirkung zwischen den Zuordnungsmolekülen und anderen Proteinen oder Nukleinsäuren (DNA oder RNA) umfasst für gewöhnlich die Schritte (3) Auswählen von nur den Proteinen mit einer besonderen Funktion aus den in-vitro-Viren, die in dem Schritt (2) hergestellt wurden, und (4) Unterwerfen der ausgewählten in-vitro-Viren gegenüber einer Reversen Transkription, Amplifizierung und Sequenzierung.
In dem Schritt (3) werden Zielproteine oder Nukleinsäuren (DNA oder RNA) und andere Substanzen, z. B. Sacharide und Lipide, an eine Mikroplatte, Kügelchen oder ähnliches durch kovalente Bindungen oder nicht-kovalente Bindungen zuvor gebunden, und die in-vitro-Viren, die im Schritt (2) hergestellt wurden, werden hinzugegeben, um sie unter bestimmten Temperaturbedingungen über einen bestimmten Zeitraum umzusetzen, und sie werden gewaschen, um in-vitro-Viren zu entfernen, die nicht an das Ziel gebunden sind. Dann werden die in-vitro-Viren, die an die Ziele gebunden haben, freigesetzt. Dieser Schritt kann durchgeführt werden durch das bereits etablierte ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Crowther, J. R. (1995) Methods in Molecular Biology, Band 42, Humana Press Inc.) oder eine ähnliche Technik.
In dem Schritt (4) werden die freigesetzten in-vitro-Viren in Schritt (3) revers transkribiert und durch Reverse Transkriptions-PCR amplifiziert, und die amplifizierte DNA wurde direkt oder nach der Klonierung sequenziert.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren wird es möglich, eine Funktion eines Genproduktes zu identifizieren (Protein), das einem Gen entspricht, dessen Funktion unbekannt ist, in dem (1) mRNA von Gen-DNA synthetisiert wird, deren Sequenz bekannt ist oder nicht bekannt ist, um in-vitro-Virusgenome zu konstruieren, (2) Konstruieren von in-vitro-Viren unter Verwendung der in-vitro-Virusgenome, (3) Selektionieren nur derer aus den in-vitro-Viren, die an ein Ziel-Protein oder eine Nukleinsäure oder andere Substanzen, z. B. Sacharide und Lipide, binden und (4) Unterwerfen der in der ausgewählten in-vitro-Viren gegenüber einer Reversen Transkription, Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung.
Um das Verfahren zum Untersuchen der intermolekularen Wirkung, das oben erwähnt wurde, durchzuführen, kann ein Apparat durch das Kombinieren bekannter geeigneter Vorrichtungen hergestellt werden. Die Vorrichtungen, die in dem Apparat enthalten sind, können per se bekannte sein, und Arbeitsschritte in diesen Vorrichtungen, wie die Zugabe von Reagenzien, Umrühren, Temperaturkontrolle und die Untersuchung der biologischen Aktivität können gemäß den per se bekannten Verfahren durchgeführt werden. Unter Kombinierung dieser Arbeitsschritte kann ein automatischer oder semi-automatischer Apparat zum Untersuchen intermolekularer Wirkungen konstruiert werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird noch genauer unter Bezugnahme der folgenden Beispiele erklärt. Die folgenden Beispiele sollen jedoch so verstanden werden, dass sie eine Hilfe zum Erreichen eines besseren Verständnisses der vorliegenden Erfindung darstellen, und der Bereich vor vorliegenden Erfindung ist in keiner Weise durch diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1: Herstellung von in-vitro-Virus (1)
<1> Herstellung des 3'-terminalen Endteils des Nukleinsäureteils
(a) Synthese phosphorylierten Puromycins (pPur)
Materialien
Pyromycin-(3'-[α-amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3deoxy-N,N'-dimethyl-adenosin) wurde von Sigma erhalten. Phosphoroxychlorid und Trimethylphosphat wurden von Wako Pure Chemicals bezogen.
Verfahren
Eine Lösung, die durch das Mischen von Phosphoroxychlorid (1,5 mmol) und Trimethylphosphat (11,4 mol) hergestellt wurde, wurde eisgekühlt und Puromycin (0,3 mmol) wurde hierzu gegeben, um sie ausreichend zu mischen, und das Gemisch wurde für 7 Stunden bei 0°C reagieren gelassen (Yoshikawa, M. et al. (1969) Bull. Chem. Soc. Jap. 42, 3505–3508). Die Reaktionsgemische wurden dann zu einem eisgekühlten Gemisch aus Aceton (40 ml) und Ether (20 ml), welches Natriumperchlorat (NaClO₄, 0,4 g) enthält, gegeben und ausreichend gerührt. Dann wurde Wasser (720 ml) zu dem Gemisch hinzugegeben und das Gemisch wurde bei 4°C für 24 Stunden gerührt, um die Chlorgruppen zu hydrolysieren. Das präzipitierte Produkt wurde nach der Hydrolyse durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Aceton und Ether gewaschen. Das erhaltene weiße Pulver wurde in Vacuo getrocknet, um phosphoryliertes Puromycin mit einer Ausbeute von 70 bis 90%, bezogen auf das Puromycin, zu ergeben.
(b) Schützen des phosphorylierten Puromycins durch Acetylierung
Materialien
Trifluoressigsäure (TFA) wurde von Nacalai Tesque bezogen. Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) wurde von Wako Pure Chemicals bezogen.
Verfahren
Das getrocknete, phosphorylierte Puromycin (0,2 mmol) und TFA (5 ml) wurden gemischt und TFAA (2 ml) wurde zu dem Gemisch bei –10°C hinzugegeben, gefolgt von Rühren. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde unter Rühren reagieren gelassen (Weygand, F. & Gieger, R. (1956) Chem. Ber. 89, 647–652). Die Reaktion wurde durch das Zugeben von Wasser (50 ml) gequenched und das TFA wurde durch Wiederholen eines Verfahrens, umfassend die Zugabe von Wasser (10 ml) und Verdampfen zur Trockenheit unter reduziertem Druck in 5malen entfernt. Schließlich wurde Wasser (50 ml) zu dem erhaltenen Produkt hinzugegeben, gefolgt von einer Lyophilisierung, um phosphoryliertes Puromycin zu ergeben, in dem die Aminogruppe des Aminosäureanteils in Puromycin und die 2'-Hydroxylgruppe des Riboseteils mit Acetylgruppen geschützt waren, mit einer Ausbeute von 50 bis 60%, bezogen auf das phosphorylierte Puromycin.
(c) Synthese von dCpPur (2'-Deoxycytidyl(3'→5')puromycin)
Materialien
BZ-DMT-Deoxycytidin (N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxycytidin) wurde von Sigma bezogen und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) wurde von Watanabe Chemical bezogen. Das Pyridin wurde von Nacalai Tesque bezogen.
Verfahren
Das phosphorylierte Puromycin, das mit Acetylgruppen geschützt ist (40 μmol) und Bz-DMT-Deoxycytidin (600 μmol) wurden durch Wiederholen eines Verfahrens, das die Zugabe von Pyridin (2 ml) und Verdampfung bis zur Trockenheit über 3male dehydratisiert, und schließlich wurde Pyridin (2 ml) hinzugegeben. DCC (400 μmol) wurde zu dem Gemisch unter Rühren hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 3 Tage bis 2 Wochen bei Raumtemperatur umgesetzt (Ralph, R. K. et al. (1965) J. Am. Chem. Soc. 87, 5661–5670; und Harris, R. J. et al. (1972) Can. J. Biochem. 50, 918–926). Nach der Reaktion wurde die DMT-Gruppe durch eine Umsetzung mit 80%iger Essigsäure (5 ml) für 2 Stunden entfernt. Dann wurde die Acetylgruppe durch eine Umsetzung mit konzentriertem wässrigem Harnstoff/Ethanol (6 ml, Volumenverhältnis: 2 : 1) bei 20°C für 2 Tage konzentriert. Der aufkonzentrierte wässrige Harnstoff wurde durch Verdampfung unter reduziertem Druck entfernt, und der Rest wurde in Wasser gelöst (40 ml). Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule aufgetragen, die mit QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia) bepackt war und daran absorbiert. Fraktionen, die das Zielprodukt enthalten, wurden mit 0,5 mol Triethylamincarbonat (TEAB, pH 7,5) eluiert, lyophilisiert und schließlich mittels HPLC aufgetrennt, um entschütztes dCpPur mit einer Ausbeute von 1 bis 5%, bezogen auf das Puromycin, zu ergeben.
<2> Herstellung eines Nukleinsäureteils (in-vitro-Virusgenom)
Zwei Arten von in-vitro-Virusgenomen, d. h. (1) eines zum Binden eines Nukleinsäureteils und eines Proteinteils in ortsspezifischer Weise, und (2) eines zum Binden eines Nukleinsäureteils und eines Proteinteils in nicht-ortsspezifischer Weise wurden hergestellt.
Materialien
Ein zellfreies E. coli-Proteinsynthesesystem (E. coli S30 Extract System für lineare Matrizen) wurde von Promega bezogen. T7-RNA-Polymerase, T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Kinase, menschlicher Plazenta-Ribonukleaseinhibitor, EcoRI, BamHI und Deoxyribonukleotide wurden von Takara Shuzo bezogen. Die Restriktionsenzyme BstNI und BglII wurden von New England Labs. bezogen. Hinsichtlich [³⁵S]-Methionin und [γ-³²P]-ATP wurden die von Amersham, und für die Taq-DNA-Polymerase die von Kurabo und Grainer verwendet. Hinsichtlich der anderen biochemischen Reaktionsmittel wurden solche von Sigma und Wako Pure Chemicals verwendet. Ein Plasmid, das die Mikrotubuli bindende Region des menschlichen tau-Proteins (4 Wiederholungen) (pAR3040) enthält, wurde durch das Herauspicken des Gens voller Länge des menschlichen tau-Proteins aus einer cDNA-Bibliothek eines menschlichen Hirns, das in λZAPII kloniert war, durch PCR hergestellt, wobei das Gen in ein Plasmid eingeschleust wurde, nur die Region mit 4 Wiederholungen des Plasmids amplifiziert wurde und das amplifizierte Produkt in ein Plasmid eingeschleust wurde. Als PCR (Polymerasekettenreaktion)-Apparat wurde das Modell PTC-100 (MJ Research) und Modell ASTEC PC800 (Astec) verwendet.
(1) Herstellung eines Genoms für die ortsspezifische Bindung
A. Herstellung von DNA für den mutierten Teil mit 4 Wiederholungen

1) Ein Plasmid (pAR3040), umfassend die Mikrotubuli-Region (4 Wiederholungen) des menschlichen tau-Proteins (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392–399) wurde hergestellt und durch Verdau mit den Restriktionsenzymen BglII und BamHI linearisiert.
2) Der Teil mit 4 Wiederholungen, der die T7-Promotorregion und die Shine-Dalgarno-Sequenz enthält, wurde mittels PCR aus dem oben hergestellten Genom amplifiziert. Für diese Amplifizierung wurden als Primer Left+ (SEQ ID NO: 1) für die 5'-Seite verwendet, und Right– (SEQ ID NO: 2) für die 3'-Seite. Right– hatte eine solche Sequenz, dass das Leucin vor dem Ocre-Terminationskodon in ein Amber-Terminationskodon mutiert werden sollte. Die PCR-Bedingungen waren 92°C/30 Sekunden für die Denaturierung, 65°C/30 Sekunden für die Anlagerung, und 73°C/1 Minute für die Verlängerung und dieser Zyklus wurde 30mal wiederholt.
3) Dann wurde das amplifizierte Genom gereinigt, und unter Verwendung der PCR mutiert, um die Inkorporation von Methionin zu fördern und dadurch die Detektion eines radioaktiven Isotops zu verstärken. Das bedeutet, dass die Primer Left– (SEQ ID NO: 3) und Right+ (SEQ ID NO: 4), die eine Region enthalten, von der man wünschte, dass sie mutiert wird, synthetisiert. Zuerst wurde die DNA aus 2) oben als Matrize verwendet und mittels PCR mit den Primern Left+ und Left– amplifiziert, und die amplifizierte DNA wurde als "Left" bezeichnet. Die Amplifizierung mittels PCR wurde ebenfalls mit den Primern Right+ und Right– durchgeführt, und die amplifizierte DNA wurde als "Right" bezeichnet. Nach einer denaturierenden 5%igen Polyacrylamidgelelektrophorese wurden "Left" und "Right" aus dem Gel ausgeschnitten und extrahiert. Die ausgeschnittenen Left und Right wurden zuerst mittels PCR unter den gleichen Bedingungen wie oben ohne Primer amplifiziert. Des weiteren wurden 1 μl aus diesem Reaktionsgemisch als Matrize verwendet und es wurde mittels PCR unter gleichen Bedingungen mit den Left+- und Right–-Primern amplifiziert. Aus dem obigen Verfahren wurde DNA der mutierten Region mit 4 Wiederholungen, in der die Anzahl an Metioninen von 1 auf 4 erhöht wurde, hergestellt.

B. Ligierung von Alanin-Suppressor-tRNA (Ala-sup tRNA), enthaltend Spacer mit verschiedenen Längen an dem Teil mit 4 Wiederholungen

1) Die BamHI-Stelle, die in der 3'-terminalen Endsequenz der obigen Region mit 4 Wiederholungen lokalisiert ist, die in dem obigen Punkt A. erhalten wurde, wurde mit BamH1 verdaut. Dann wurde nur die Region mit 4 Wiederholungen in der 5'-terminalen Endsequenz extrahiert und unter Verwendung von QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) extrahiert und gereinigt, um das 3'-terminale Endfragment an der BamH1-Stelle zu entfernen.
2) Das gereinigte Produkt aus 1) oben und Spacer-A (SEQ ID NO: 5), welches am 5'-terminalen Ende mit der T4-Kinase phosphoryliert wurde, wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, wobei sie mit dem Spacer-B (SEQ ID NO: 6) aneinandergereiht wurden.
3) Spacer-C (SEQ ID NO: 7), welcher durch T4-Kinase phosphoryliert wurde, und Spacer-B, der eine Region aufweist, die komplementär zu Spacer-C ist, wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die Reaktion wurde bei 15°C für 2 Stunden durchgeführt. Dann wurde das Produkt mittels Ethanolpräzipitierung gereinigt.
4) Die Produkte der obigen Abschnitte 2) und 3), Spacer-D (SEQ ID NO: 7) und sup-tRNA (SEQ ID NO: 9), die am 5'-terminalen Ende phosphoryliert waren, wurden in T4-DNA-Ligasepuffer gelöst, bei 85°C für 2 Minuten denaturiert und auf Eis abgekühlt. Nach der Zugabe von T4-DNA-Ligase wurde es erlaubt, für 2 Stunden bei 15°C umzusetzen, und es wurde dann einer Phenolextraktion und Ethanolpräzipitierung unterworfen.
5) Das in dem obigen 4) erhaltene Produkt wurde als Matrize verwendet, und eine Amplifizierung wurde durch PCR unter Verwendung des Primers Left+, und eines Primers 3'Pur- (SEQ ID NO: 10) unter den Bedingungen von 92°C/30 Sekunden für die Denaturierung, 65°c/30 Sekunden für das Annealing und 73°C/1 Minute für die Verlängerung, wobei der Zyklus 30mal wiederholt wurde, durchgeführt. Das Produkt wurde einer denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen. Drei Regionen, A, B und C, die verschiedene Migrationsentfernungen aufwiesen, wurden ausgeschnitten, und die DNA wurde aus den Bereichen extrahiert.
6) Die DNAs, die aus A, B und C in dem obigen 5) extrahiert wurden, und mit verschiedenen Längen, wurden als Schablonen verwendet und eine Amplifizierung wurde wieder mittels PCR unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, und die Längen der Produkte wurden mittels Elektrophorese bestimmt, und sie wurden als Schablonen-DNA für die Transkription verwendet. Im Ergebnis wurde gefunden, dass die Anzahl an Spacer-C, der in jedes Produkt der Fraktionen inseriert war, 0 bis 5 für die Fraktion c war, 6 bis 14 für die Fraktion b und 15 bis 18 für die Fraktion a.

C. Herstellung eines RNA-Geaoms und Ligierung von dCpPur
Die Regionen A, B und C, die in dem obigen B erhalten wurden, wurden bei 37°C für 2 Stunden unter Verwendung von T7-Polymerase in RNA transkribiert. Des weiteren wurde das dCpPur, das in dem obigen <1> Herstellung des 3'-terminalen Endteils des Nukleinsäureteils erhalten wurde, in Gegenwart von ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase für 24 Stunden bei 15°C phosphoryliert und an das oben erwähnte transkribierte RNA-Genom unter Verwendung von T4-RNA-Ligase für 50 Stunden bei 4°C ligiert. Aus diesem Verfahren konnte ein Genom, das eine sup-tRNA mit Puromycin an dessen 3'-terminalem Ende enthielt, konstruiert werden.
(2) Herstellung eines Genoms für eine nicht-ortsspezifische Bindung
A. Herstellung von DNA und RNA aus mutierter Region mit 4 Wiederholungen
DNA aus der mutierten Region mit 4 Wiederholungen wurde prinzipiell auf die gleiche Weise wie im zuvor erwähnten (1) A hergestellt. Die Terminationskodons wurden jedoch durch das Auswechseln der zwei Terminationskodons, Amre und Ocre in Glutamin bzw. Lysin eliminiert, und ein neuer Primer New/Right- (SEQ ID NO: 10 wurde synthetisiert, um die 3'-terminale Endsequenz purinreich zu machen, und mit Left+ für die PCR-Amplifizierung verwendet. Die Amplifizierung mittels PCR wurde unter den Bedingungen von 92°C für 30 Sekunden für die Denaturierung, 65°C für 30 Sekunden für die Anlagerung und 73°C für 1 Minute für die Verlängerung durchgeführt, wobei jeder Zyklus 30mal wiederholt wurde. Diese DNA wurde als Schablone verwendet, um ein RNA-Genom durch eine Umsetzung bei 37°C für 2 Stunden unter Verwendung von T7-Polymerase zu erhalten.
B. Ligierung der Spacer 1 bis 4
Nach einer Reaktion bei 36°C für eine Stunde mit T4-Polynukleotidkinase des Spacers 1, der eine DNA war, die aus 21 Nukleotiden (SEQ ID NO: 11) zusammengesetzt war, Spacer 2, welcher eine DNA, die aus 40 Nukleotiden zusammengesetzt war (SEQ ID NO: 12), Spacer 3, welcher eine DNA war, die aus 60 Nukleotiden zusammengesetzt war (SEQ ID NO: 13) oder Spacer 4, welcher eine DNA war, die aus 80 Nukleotiden zusammengesetzt war (SEQ ID NO: 14) wurde die RNA, die in dem obigen A erhalten wurde, an die Spacer durch eine Reaktion bei 10°C für 48 Stunden unter Verwendung von T4-RNA-Ligase ligiert.
C. Ligierung eines Peptidakzeptors (P-Akzeptor)
Ein Peptidakzeptor (P-Akzeptor, SEQ ID NO: 15), welcher eine chimäre Nukleinsäure war, die aus 21 Nukleotiden DNA und 4 Nukleotiden RNA zusammengesetzt war, d. h. 25 Nukleotide insgesamt, wurde synthetisiert, um die Inkorporationseffizienz in Ribosomen durch das Ligieren hiervon an dessen 3'-terminales Ende an dCpPur zu steigern. Um das 5'-terminale Ende des P-Akzeptors zu phosphorylieren, wurde es bei 36°C für eine Stunde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase umgesetzt. Dann wurde das Produkt mit Back3' (SEQ ID NO: 16) mit der komplementären Sequenz hierfür backed, und an das 3'-terminale Ende jedes der Spacer ligiert, die in dem zuvor erwähnten B hergestellt wurden, durch eine Reaktion für 2 Stunden bei 16°C unter Verwendung von T4-RNA-Ligase. Dieser P-Akzeptor wurde ebenfalls direkt an das 3'-terminale Ende der RNA ligiert, die in dem obigen A durch eine Umsetzung bei 10°C für 48 Stunden unter Verwendung von T4-RNA-Ligase erhalten wurde, und das Produkt wurde als Non-Spacer-Genom bezeichnet.
D. Ligierung von dCpPur
Das in dem obigen <1> erhaltene dCpPur "Herstellung von 3'-terminalem Endteil des Nukleinsäureteils" wurde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase bei 15°C für 24 Stunden phosphoryliert, und an das 3'-terminale Ende jedes der Genome, die im obigen C hergestellt wurden, unter Verwendung von T4-RNA-Ligase bei 4°C für 50 Stunden ligiert. Durch dieses Verfahren konnten chimäre RNA-Genome, die Puromycin an dessen 3'-terminalem Ende umfassen, hergestellt werden.
<3> Optimierung des Nukleinsäureteils
A. Ortsspezifisches Verfahren
Jedes der RNA-Genome, die in dem obigen <2>, (1) hergestellt wurde, welche in jede der Längen der Fraktionen a, b und c klassifiziert wurde, wurde in 50 μl E. coli zellfreien Translation System [E. coli S30 Extract Systems for Linear Templates (Promega)] translatiert, welches biotinyliertes Lysyl-tRNA (Promega) enthielt, und nach der Zugabe von 5 mg Streptavidin beschichteten Magnetkügelchen (Dynabeads, Dynal) zu jedem Reaktionsröhrchen, wurde es für eine Stunde inkubiert. Dann wurden die Dynabeads mit einem Magnet eingesammelt, und der Überstand wurde abgesaugt. Die verbliebenen Dynabeads wurden zweimal mit B&W-Puffer (1.000 μl) gewaschen. Die Kügelchen wurden weiter zweimal mit RT-PCR-Puffer (500 μl) gewaschen, und in RT-PCR-Puffer (500 μl) resuspendiert. Die Suspension (50 μl) wurde in ein 500 μl Eppendorf-Röhrchen transferiert und nachdem die Dynabeads mit einem Magnet immobilisiert waren, wurde der Überstand abgesaugt. Zu den verbliebenen Dynabeads wurde RT-PCR-Puffer, Reverse Transkriptase und Taq-Polymerase [Access RT-PCR System (Promega)] hinzugegeben. Die Reverse Transkription wurde bei 48°C für 1 Stunde durchgeführt, und die PCR wurde unter den Bedingungen von 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 40 Sekunden und 68°C für 1 Minute und 40 Sekunden durchgeführt, wobei jeder Zyklus 40mal wiederholt wurde, in dem die Primer Right+ (SEQ ID NO: 4) und 3'Pur- (SEQ ID NO: 10) verwendet wurden. Die Ergebnisse der Analyse der Fraktionen a, b und c durch Elektrophorese werden in 5 gezeigt.
Eine Bande wurde in der Gruppe der Fraktion c (Spur 3 der 5) detektiert. Diese Bande wurde aus dem Gel durch Elektrophorese separiert, an "Left" ligiert mit dem T7-Promotor und der Shine-Dalgarno-Region mittels PCR und mittels PCR unter Verwendung der Primer Left+ (SEQ ID NO: 3) und 3'Pur- (SEQ ID NO: 10) amplifiziert. Dieses Genom wurde als "Stranger" bezeichnet.
Dann wurde, um zu untersuchen, ob das Protein, das tatsächlich von Stranger translatiert wurde, tatsächlich an den mRNA-Teil gebunden war (RNA-Genomanteil) nach der Transkription mit pdCpPur an dessen 3'-terminalem Ende unter Verwendung von T4-RNA-Ligase ligiert, dephosphoryliert am 5'-terminalen Ende der RNA unter Verwendung von HK-Phosphatase (Epicentre) bei 30°C für 1 Stunde, und mit [γ-³²P]-ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase markiert. Das Produkt wurde zu einem zellfreien Translationssystem in E. coli als mRNA hinzugegeben und für 1 Stunde und 40 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Ergebnisse einer 18%igen SDS-PAGE des Produktes werden in 6 gezeigt. Aus den Ergebnisse kann gesehen werden, dass der Nukleinsäureteil (Genotyp) und der Proteinanteil (Phänotyp) gebunden waren, um in-vitro-Viren zu bilden, d. h. Moleküle, die einen Genotyp einem Phänotyp zuordnen in einer Rate von ungefähr 80% oder mehr.
B. Nicht-ortsspezifische Methode
Da ein kurzer Spacer bereits in dem ortsspezifischen Verfahren verwendet wurde, wurde dCpPur, welches am 5'-terminalen Ende in Gegenwart von [γ-³²P]-ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert worden ist an das 3'-terminale Ende des "Non-spacer" RNA-Genoms ohne einen Spacer durch die Reaktion unter Verwendung von T4-RNA-Ligase für 50 Stunden bei 4°C ligiert. Das Produkt wurde zu einem E. coli zellfreien Translationssystem zusammen mit der mRNA gegeben, welche die gewöhnlichen vier Wiederholungen kodiert, und für eine Stunde und 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Diese Reaktionsmischung (10 μl) wurde mit Ribonuklease T2 verdaut und einer gleichen Menge des Reaktionsgemischs wurde in 18%iger SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt, und mittels eines Image-Analysegerätes BAS2000 (Fujifilm) (7) analysiert.
Als Ergebnis trat für die Probe, die mit Ribonuklease T2 verdaut wurde, eine Bande in der gleichen Migrationsentfernung wie die der Kontrolle auf, wobei die 4 Wiederholungen mit [³⁵S]-Methionin markiert sind, da die Probe, die in dem freigesetzten Proteinteil enthalten ist. Andererseits trat eine Bande oberhalb des Proteins mit 4 Wiederholungen für die nicht-behandelte Probe ein, d. h. es wurde herausgefunden, dass diese Bande ein eindeutig größeres Molekulargewicht wiederspiegelte. Diese Bande schien nicht der markierten mRNA selbst zu entsprechen (ungefähr 400 Nukleotide), da sie einen weiteren Weg migrierte als die tRNA. Deswegen wurde sie als eine Substanz, die aus zusammengesetzter und gebundener RNA und Protein identifiziert. Das bedeutet, dass diese Ergebnisse zeigten, dass der Nukleinsäureteil in nicht-ortsspezifischer Weise an das Protein gebunden war.
Beispiel 2: Herstellung des in-vitro-Virus (2)
<1> Herstellung des 3'-terminalen Endteils der Nukleinsäureregion
(a) Synthese von rCpPur (Ribocytidyl(3'→5')puromycin
Materialien
Jedes Material wurde von den folgenden Herstellern bezogen: Puromycin von Sigma, rC-β-Amidit (N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-tert-butyldimethylsilyl)-cytidin-3'-O-[O-(2-cyanoethyl)-N,N'-diisopropyl-kphosphoramidit]) von Japan PerSeptive, Tetrazol von Japan Millipore, Tetrabutylammoniumfluorid von Aldrich, QAE-Sephadex von Pharmacia und Kieselgel für die Chromatographie von Merck.
Verfahren
Puromycin (50 mg, 92 μmol) wurde in trockenem Pyridin (2 ml) gelöst und durch Verdampfung unter reduziertem Druck dehydratisiert. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Hierzu wurden 4 5 einer Tetrazollösung in Acetonitril (15 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mittels Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (TLC, Entwicklungslösungsmittel: Chloroform : Methanol = 9 : 1) überwacht. Die Reaktion wurde für gewöhnlich in einem Tag beendet. Nach der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem Rest wurde eine 0,1 M Lösung Iod in Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser (80 : 40 : 2,3 ml) hinzugegeben, und der gebildete Phosphittriester wurde unter Rühren bei Raumtemperatur oxidiert. 1 1/2 Stunden später wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde mit Chloroform extrahiert. Dieser Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde Kieselerdegel-Säulenchromatographie unterworfen und mit Chloroform/Methanol = 90 : 1 eluiert. Das Ribocytidylpuromycin (CpPur) mit Schutzgruppen wurde vom Kieselgel TLC (Entwicklungslösungsmittel; Chloroform : Methanol = 9 : 1) bei einem Rf von 0,32 eluiert. Dann wurden die Schutzgruppen entfernt. Das Ribocytidylpuromycin mit Schutzgruppen wurde zuerst mit 80% einer wässrigen Lösung aus Essigsäure (0,5 ml) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Nachdem die Essigsäure unter reduziertem Druck entfernt wurde, wurde zu dem Rest eine gemischte Lösung aus wässrigem Harnstoff/Ethanol = 2 (0,5 ml) zugegeben. Nachdem das Gemisch bei Raumtemperatur für 15 Stunden stehengelassen wurde, wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und zu dem Rest wurde eine 1 M Lösung Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran (0,5 ml) hinzugegeben, um β-Cyanoethylgruppen zu entfernen. 30 Minuten später wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von QAE-Sephadex unterzogen und mit 0 bis 0,5 M linearem Gradienten aus Triethylamincarbonat eluiert. Das Eluat wurde gesammelt und lyophilisiert, um 10 mg Ribocytidylpuromycin zu ergeben. Es wurde bestätigt, dass das synthetisierte Produkt Ribicytidylpuromycin ist, durch die Tatsachen, dass es äquimolare Mengen von Cytidin und Puromycin-5'-phosphat nach einem Verdau mit Nuklease P1 ergab und dass molekulare Ionen [M + H]⁺ bei m/z 777 in MALDI/TOF-Massenspektrometrie auftraten.
<2> Nukleinsäureteil (Herstellung eines in-vitro-Virusgenoms)
Materialien
Ein zellfreies Proteinsynthesesystem aus Kaninchen-Reticulozytenlysat (Nuklease-behandeltes Kaninchen-Reticulozytenlysat) wurde von Promega bezogen. T7-RNA-Polymerase, T4-DNA-Ligase, T4-RNA-Ligase, T4-Polynukleotidkinase, menschlicher Plazenta-Ribonuklease-Inhibitor, EcoRI, BamHI und Deoxyribonukleotide wurden von Takara Shuzo bezogen. Die Restriktionsenzyme BstNI und BglII wurden von New England Labs bezogen. Hinsichtlich [³⁵S]-Methionin und [³²P]-γ-ATP wurden die von Amersham, und für Taq-DNA-Polymerase die von Kurabo und Grainer verwendet. Hinsichtlich der anderen biochemischen Reagenzien wurden solche von Sigma und Wako Pure Chemicals verwendet. Ein Plasmid, das die N-terminale Hälftenregion des menschlichen tau-Proteins (Aminosäurereste 1 bis 165) (pAR3040) enthält, wurde durch Herauspicken des Gens voller Länge des menschlichen tau-Proteins mit Hilfe des PCR-Verfahrens aus einer cDNA-Bibliothek eines menschlichen Hirns, das in λZAPII kloniert war, hergestellt, wobei das Gen in ein Plasmid eingeschleust wurde, und nur die N-terminale Hälftenregion mittels PCR amplifiziert wurde, und das amplifizierte Produkt in ein Plasmid eingeschleust wurde. Als PCR(Polymerase- Kettenreaktion)-Apparat wurde das Modell ASTEC PC800 (Astec) verwendet.
(1) Herstellung des Genoms
A. Herstellung von DNA für die N-terminale Hälftenregion
mRNAs, die die Region der N-terminalen Hälfte des humanen tau-Proteins (Aminosäurereste 1 bis 165) mit oder ohne Stopkodon kodieren, welche mit einem Spacer, Peptidakzeptor, und rCpPur an deren 3'-terminalem Ende ligiert waren, wurden wie folgt hergestellt (8).

1) Ein Plasmid, in das die Region der N-terminalen Hälfte des humanen tau-Proteins (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392–399) (PAR3040) eingeschleust war, wurde durch einen Verdau mit einem Restriktionsenzym BglII linearisiert.
2) Die Region der N-terminalen Hälfte (Aminosäurereste 1 bis 165) wurden aus dem obigen Genom mittels PCR amplifiziert. Als Primer wurden verwendet Left1 (SEQ ID NO: 18) für die 5'-Stelle und Right1 (SEQ ID NO: 19) mit dem Stopkodon, oder Right2 (SEQ ID NO: 20) ohne Stopkodon für die 3'-Stelle. Die PCR-Bedingungen bestanden aus 92°C für 30 Sekunden für die Denaturierung, 65°C für 30 Sekunden für die Anlagerung und 73°C für 1 Minute für die Verlängerung und dieser Zyklus wurde 30mal wiederholt.
3) Eine DNA-Sequenz, die aus der Promotorregion der T7-RNA-Polymerase, der Kozak-Sequenz und der DNA-Sequenz, die dem Aminosäurerest Nrn. 1 bis 25 des menschlichen rau-Proteins entspricht, welche in dieser Reihenfolge verbunden waren (SEQ ID NO: 21) wurde durch chemische Synthese hergestellt.
4) Die zwei Arten gereinigter DNA, die in den Verfahren der obigen 2) und 3) erhalten wurden, wurden mit einer Zwei- Schritt-PCR wie folgt verbunden. Das bedeutet, dass ein Gemisch der zuvor erwähnten zwei Arten von DNA zuerst in Abwesenheit von Primer amplifiziert wurden, und anschließend in Gegenwart von Primern von Left2 (SEQ ID NO: 22) und Right1 (SEQ ID NO: 19) oder Right2 (SEQ ID NO: 20) amplifiziert wurden. Aus dem obigen Verfahren wurde eine DNA, die die Promotor-T7-RNA-Polymerase und eine Kozak-Sequenz an einer stromaufwärts liegenden Stelle des ORF der Endregion der N-terminalen Hälfte des menschlichen tau-Proteins enthält, hergestellt. Eine RNA wurde durch eine Umsetzung unter Verwendung dieser DNA als Schablone und von T7-RNA-Polymerase bei 37°C für 2 Stunden erhalten.

B. Ligierung eines Spacers und Peptidakzeptors
Spacer 5 (SEQ ID NO: 23) und ein Peptidakzeptor (P-Akzeptor, SEQ ID NO: 15), welcher eine chimäre Nukleinsäure war, die aus einer 21-Nukleotid-DNA und 4-Nukleotid-RNA zusammengesetzt ist, d. h. 25 Nukleotide insgesamt wurde chemisch synthetisiert. Das 5'-terminale Ende des Peptidakzeptors wurde durch eine Umsetzung bei 36°C für eine Stunde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, und der Peptidakzeptor wurde mit einer Splint-DNA (SEQ ID NO: 24) mit einer Sequenz, die hierzu komplementär ist, gestützt, und an das 3'-terminale Ende des Spacers 5 durch eine Umsetzung bei 16°C für 2 Stunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert.
C. Ligierung von RNA und Spacer-Peptidakzeptor
Das Ligierungsprodukt des Spacer-5-Peptidakzeptors, das in dem obigen B erhalten wurde, wurde einem 5'-terminalen Ende durch eine Umsetzung bei 36°C für eine Stunde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, und an die RNA, die in dem obigen A erhalten wurde, durch eine Umsetzung für 48 Stunden bei 4°C unter Verwendung von T4-RNA-Ligase erhalten.
D. Ligierung von rCpPur
das rCpPur, das in dem obigen <1> Herstellung von 3'-terminalem Endteil des Nukleinsäureteils erhalten wurde, wurde durch eine Umsetzung bei 15°C für 24 Stunden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und an das 3'-terminale Ende des Genoms, das in dem obigen C hergestellt wurde, durch eine Umsetzung für 30 Minuten bei 37°C unter Verwendung von T4-RNA-Ligase hergestellt. Aus diesem Verfahren konnte ein chimäres RNA-Genom mit Puromycin an dessen 3'-terminalem Ende konstruiert werden.
E. Binden von rCpPur an das C-terminale Ende der N-terminalen Hälfte des humanen tau-Proteins
Es wird davon ausgegangen, dass zum Erhalten einer wirksamen Bindung eines C-terminalen Endes eines Proteins und einer RNA, die dieses kodiert, der Abstand zwischen dem Puromycin und einem Stopkodon, und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Stopkodons wichtige Faktoren werden würden. Deswegen, um die Wirkungen dieser Faktoren zu untersuchen, wurden die folgenden drei Arten von Genomen, mRNAs, die die N-terminale Hälfte des humanen tau-Proteins jeweils (1) mit einem Stopkodon, aber ohne einen DNA-Spacer, (2) weder ein Stopkodon noch einen DNA-Spacer, und (3) kein Stopkodon, aber mit einem DNA-Spacer an deren 3'-terminalem Ende hergestellt. Unter Verwendung dieser drei Arten von Genomen wurde eine Proteinsynthese in Gegenwart von rCpPur, das mit ³²P in einem zellfreien Translationssystem unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (9) gebildet. Es wurde herausgefunden, dass, wenn das 3'-terminale Ende keinen DNA-Spacer hatte, rCpPur an den C-Terminus des Proteins mit einer ähnlichen Effizienz unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Stopkodons gebunden wurde. Das bedeutet, dass die an rCpPur gebundenen Proteine in der SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) (die ersten und die zweiten Spuren von links in 9) an der gleichen Stelle auftraten, wie die des Proteinmonomers, das mit [³⁵S]-Methionin markiert war (die am weitesten rechts liegende Spur in 9). Andererseits, wenn mRNA einen DNA-Spacer hatte, wurde rCpPur an das C-terminale Ende des Proteins mit einer Wirksamkeit von ungefähr dreimal mehr als die, die in den zwei vorherigen Arten von mRNA erhalten wurden, selbst ohne ein Stopkodon gebunden (die dritte Spur von links, 9). Dieses Ergebnis kann so betrachtet werden, dass es eine Translationspause des Ribosoms anzeigt, die an der DNA-Sequenz auftrat, und als Ergebnis konnten rCpPur und das Protein effizient gebunden werden. Außerdem legt dieses Ergebnis nahe, dass wenn ein Genom ohne ein Stopkodon mit einem DNA-Spacer und rCpPur an dessen 3'-terminalem Ende als mRNA in einem zellfreien Translationssystem verwendet wird, Puromycin an dem 3'-terminalen Ende der mRNA effizient an das C-terminale Ende des entsprechenden translatierten Proteins gebunden wird.
<3> Konstruktion eines in-vitro-Virus in einem zellfreien Translationssystem
Das Genom, das in dem obigen <2> Nukleinsäureanteil (Herstellung eines in-vitro-Virus-Genoms), das aus mRNA zusammengesetzt ist, die die N-terminale Hälfte des humanen tau-Proteins (1165), einen DNA-Spacer (105 mer), einen Peptidakzeptor und rCpPur zusammengesetzt ist, wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulozyten-Lysats translatiert. Wenn die Inkorporation von [35S]-Methionin in das Protein zuerst unter Verwendung einer RNA untersucht wurde, die die N-terminale Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins als mRNA kodiert, traten Banden bei Stellen auf, die dem Monomer entsprechen (ungefähr 28 KDa) und dem Dimer (ungefähr 55 kDa) der N-terminalen Hälfte (1–165). In diesem Fall war das Monomer das Hauptprodukt und das Dimer wurde in einer extrem geringen Menge beobachtet (die erste linke Spur in 10A). Dieses Ergebnis deutet an, dass die RNA, die die Hälfte des humanen tau-Proteins (1–165) kodiert, als mRNA funktioniert. Wenn das Genom aus einer mRNA, die die N-terminale Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins kodiert, einem DNA-Spacer (105 mer), einem Peptidakzeptor und rCpPur zusammengesetzt war, in einem ähnlichen zellfreien Translationssystem translatiert wurde, das [35S]-Methionin enthält, wurden die Produkte im Zeitverlauf (5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 40 Minuten) übersetzt, trat eine neue breite Bande an einer Stelle, leicht über der des Genoms zusätzlich zu den Banden an den Stellen des Monomers und Dimers (die erste rechte Spur in 10(A)) auf. Die Intensität dieser Bande stieg mit dem Anstieg der Reaktionsdauer (die zweiten bis fünften Spuren von links in 10(A)) und ein Anstieg der Genommenge (Spuren 3 und 4 in 10(B)). Diese Ergebnisse deuten an, dass das Genom an das C-terminale Ende des Proteins mit einer kovalenten Bindung durch Puromycin gebunden wurde. Dies bedeutet auch, dass ein Genotyp kovalent an einen Phänotyp gebunden wurde. Das heißt, dass ein Molekül, das einen Genotyp einem Phänotyp zuordnet, gebildet wurde. Die vorstelligen Erfinder haben diese Zuordnungsmoleküls als in-vitro-Virus bezeichnet. Die Wirkung der Länge des DNA-Spacers auf die Bildung von in-vitro-Virus wurde untersucht, und es wurde gefunden, dass das in-vitro-Virus nicht wirksam mit einer Länge von ungefähr 80 mer gebildet wurde, und dass es eine Länge von mindestens 100 mer benötigte.
Außerdem war die Erzeugung eines in-vitro-Virus durch die Verwendung von rCpPur, das mit ³²P markiert war, bestätigt worden. Das bedeutet, dass ein Genom, das aus einer mRNA zusammengesetzt ist, die die N-terminale Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins, DNA-Spacer (105 mer), Peptidakzeptor und [³²P]-rCpPur zusammengesetzt war, unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysat translatiert wurde. Die Bindung des Genoms und des Proteins wurde durch einen Verdau mit Mungbohnen-Nuklease bestätigt. Das heißt, dass wenn das Translationsprodukt (Spur 3 in 11) mit Mungbohnen-Nuklease verdaut wurde, Banden an den Stellen, die dem Monomer und dem Dimer entsprechen (Spur 1 in 11) der N-terminalen Hälfte (1–165) des humanen tau-Proteins (Spur 4 in 11) auftraten. Dies deutet an, dass rCpPur, das mit ³²P markiert war, an das 3'-terminale Ende des Proteins angehängt wurde. Aus diesem Ergebnis wurde auch bestätigt, dass das Genom an das C-terminale Ende des Proteins mit einer kovalenten Bindung durch Puromycin gebunden wurde. Die Effizienz der Bindung wurde auf ungefähr 10% eingeschätzt. Da das in-vitro-Virusgenom mit einer Konzentration von 40 bis 100 pmol/ml hergestellt werden kann, würden die in-vitro-Viren in einer Population, die 2,4 bis 6 × 1012 Mutanten enthalten, erzeugt und diese Zahl entspricht 10.000mal der, die in dem Phagen-Display-Verfahren (Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science 249, 386–390) erreicht wird. Die Genom-Zuordnung zum Phänotyp hat Vorteile, z. B. eliminiert es das Problem, das die Permeabilität betrifft, und es ermöglicht die Inkorporation zahlreicher, nicht natürlich auftretender Aminosäuren, und dadurch ermöglicht es die Synthese einer extrem großen Menge an Mutanten oder die Erzeugung von zahlreichen funktionalen Proteinen.
Beispiel 3: Protein-Evolution-Simulierungsverfahren unter Verwendung von in-vitro-Viren
Das Protein-Evolutions-Simulierungsverfahren, das die in-vitro-Viren verwendet, umfasst, wie in 12 gezeigt, (1) die Konstruktion von in-vitro-Virusgenomen, (2) die Komplettierung von in-vitro-Viren, (3) ein Selektionsverfahren, (4) die Einschleusung einer Mutation, und (5) die Amplifizierung und es ermöglicht die Modifizierung und Erzeugung funktionaler Proteine. Insbesondere erlaubt die Wiederholung dieser Schritte eine effiziente Modifizierung und Erzeugung funktionaler Proteine. Von diesen Schritten wurden die Schritte (1) und (2) spezifisch in den Beispielen 1 und 2 oben erwähnt, erklärt. Deswegen werden die Schritte (3), (4) und (5) in diesem Beispiel erklärt werden.
Zuerst wurde untersucht, ob Peptide, die für einen Antikörper spezifisch sind, ausgewählt werden. Spezifischer gesagt, wurde Maus-IgG als Antikörper verwendet, und die bekannte ZZ-Region des Proteins A (Nilsson, B., et al., (1987) Protein Eng., 1, 107–113) wurde als eine Peptidsequenz verwendet, die spezifisch an den Antikörper gebunden werden soll. Als eine Kontrolle wurde die N-terminale Region (1–105) des humanen tau-Proteins (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392–399) verwendet. Gemäß den Konstruktionsverfahren für in-vitro-Viren, die in den obigen Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden, wurden in-vitro-Virusgenome, die die ZZ-Region des Protein A kodieren und die N-terminale Region (1–105) des menschlichen tau-Proteins hergestellt. Mit verschiedenen Verhältnissen des in-vitro-Virusgenoms, das die ZZ-Region des Protein A und des in-vitro-Virusgenoms, das die N-terminale Region 1–105) des menschlichen tau-Proteins kodiert, welche von 1 : 1, 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1.000 oder ähnlichen variieren, wurden sie in einem zellfreien Translationssystem unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysat für 10 Minuten bei 30°C translatiert. Dann wurde das Translationsprodukt verdünnt und zentrifugiert, um unlösliche Fraktionen zu entfernen, und der Überstand wurde zu einer Mikroplatte gegeben, die mit Maus-IgG beschichtet war (zuvor blockiert mit Rinderserumalbumin), und für 2 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Dann wurde das Translationsprodukt von der Mikroplatte entfernt und es wurde mit einem Waschpuffer (50 mmol Tris/Essigsäure, pH 7,5, 150 mmol NaCl, 10 mmol EDTA, 0,1% Tween 20) für 6male insgesamt gewaschen, und zweimal mit einem Elutionspuffer (1 mol Essigsäure, pH, 2,8) eluiert. Die eluierte Lösung wurde einer Ethanolpräzipitierung unterworfen, und die Präzipitate wurden in sterilem Wasser (20 μl) gelöst, und als Schablone für eine Reverse Transkriptions-PCR verwendet. Die Reverse Transkriptions-PCR wurde unter Verwendung von Reverser Transkriptase (Avian Myeloblastose Virus Reserve Transkriptase, Promega), DNA-Polymerase (Tf1 DNA-Polymerase, Promega) und RT+ (SEQ ID NO: 25) und RT– (SEQ ID NO: 26) als Primer durchgeführt. Nach der Reaktion bei 48°C für 40 Minuten wurde die Reverse Transkriptase durch eine Behandlung bei 94°C für 5 Minuten inaktiviert und ein Zyklus von 94°C für 30 Sekunden, 66°C für 40 Sekunden und 72°C für 40 Sekunden wurde 30mal wiederholt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde elektrophoretisch bei 55°C auf einem 4%igen Polyacrylamidgel, enthaltend 8 mol Harnstoff, aufgetrennt und durch Silberfärbung beobachtet. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass das in-vitro-Virusgenom, das die ZZ-Region des Protein A enthält, selbst in einer Menge von 1/100 des Kontrollgenoms, d. h. des in-vitro-Virusgenoms, das die N-terminale Region (1–105) des humanen tau-Proteins enthält, amplifiziert werden konnte. Dieses Ergebnis zeigt an, dass das in-vitro-Virusgenom, das die ZZ-Region des Protein A enthält, spezifisch an Maus-IgG durch die translatierte ZZ-Region des Protein A gebunden wurde. Dadurch wurde bestätigt, dass die in-vitro-Viren selektioniert werden konnten. Die Einschleusung einer Mutation und Amplifizierung kann durchgeführt werden durch die Verwendung der bereits etablierten fehleranfälligen PCR (Leung, D. W., et al., (1989) J. Methods Cell Mol. Biol., 1, 11–15) Sexual PCR (Stemmer, W. P. C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. If USA 91, 10747–10751) oder ähnliche. Deswegen wurde verifiziert, dass das Protein-Evolutions-Simulierungsverfahren, das in 12 gezeigt ist, möglich ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül, das einen Genotyp (Nukleinsäureteil) einem Phänotyp (Proteinteil) zuordnet, und Konstruktionsverfahren hierfür bereitgestellt. Es werden ebenfalls ein Protein-Evolutions-Simulierungsverfahren unter Verwendung von Molekülen, die einem Genotyp einen Phänotyp zuordnen (in-vitro-Viren) bereitgestellte, das gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wird, welches das Auswählen der in-vitro-Viren durch das in-vitro-Selektionsverfahren umfasst, das Amplifizieren des Genteils einer extrem geringen Menge der ausgewählten in-vitro-Viren mittels Reverse Transkriptase-PCR, und außerdem dem Durchführen einer Amplifizierung, während eine Mutation eingeschleust wird, und ähnlichem. Das Molekül, das den Genotyp dem Phänotyp zuordnet, das Protein-Evolutions-Simulierungsverfahren, das es verwendet und ähnliche der vorliegenden Erfindung sind eine extrem nützliche Substanz oder experimentelles System für die evolutionäre molekulare Gentechnik, d. h. die Modifizierung von funktionalen Biopolymeren, wie beispielsweise Enzymen, Antikörpern und Ribozymen und die Bildung von Biopolymeren, die Funktionen haben, die nicht in lebenden Organismen gefunden werden.

Claims

Molekül, das einen Genotyp einem Phänotyp zuordnet, welches einen Nukleinsäureteil umfaßt, der eine Nukleotidsequenz hat, welche den Genotyp wiedergibt, und einen Proteinteil, der ein Protein umfaßt, das beim Aufzeigen des Phänotyps beteiligt ist, wobei der Nukleinsäureteil und der Proteinteil durch eine Substanz direkt durch eine chemische Bindung mit einer chemischen Struktur verbunden ist, die von einem Mitglied stammt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Puromycin, 3'-N-Aminoacylpuromycinaminonukleosid und 3'-N-Aminoacyladenosinaminonukleosid besteht, und dieser Proteinteil durch diesen Nukleinsäureteil kodiert wird.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei ein 3'-terminales Ende des Nukleinsäureteils und ein C-terminales Ende des Proteinteils mit einer kovalenten Bindung verbunden sind.
Das Zuordnungsmolekül gemäß jedem der Ansprüche 1 oder 2, wobei ein 3'-terminales Ende des Nukleinsäureteils kovalent an das C-terminale Ende des Proteinsteils gebunden ist, Puromycin ist.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen umfaßt, das aus einer RNA und einer Suppressor-tRNA zusammengesetzt ist, das durch einen Abstandshalter an das Gen gebunden ist.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 4, wobei die Suppressor-tRNA einen Antikodon umfaßt, der dem Terminationskodon des Gens entspricht.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen umfaßt, das aus einer RNA und einem Abstandhalter zusammengesetzt ist, der aus DNA und RNA besteht.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen, das aus RNA besteht, und einen Abstandshalter, der aus DNA und Polyethylenglycol zusammengesetzt ist, umfaßt.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen, das aus RNA besteht, und einen Abstandshalter, der aus einer doppelsträngigen DNA besteht, umfaßt.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen, das aus RNA besteht, und einen Abstandshalter, der aus einem RNA-Doppelstrang und einer kurzkettigen Peptidnukleinsäure (PNA) oder DNA zusammengesetzt ist, umfaßt.
Das Zuordnungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei der Nukleinsäureteil ein Gen, das aus DNA besteht, und einen Abstandshalter, der aus DNA und RNA zusammengesetzt ist, umfaßt.
Verfahren zum Herstellen des Zuordnungsmoleküls wie in Anspruch 4 definiert, welches umfaßt (a) Binden einer DNA, die eine Sequenz umfaßt, welche einer Suppressor-tRNA entspricht, mit Hilfe eines Abstandshalters an das 3'-terminale Ende einer DNA, die ein Gen enthält, (b) Transkribieren des erhaltenen DNA-gebundenen Produkts in RNA, (c) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an das 3'-terminale Ende der erhaltenen RNA, und (d) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produkts als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Verfahren zum Konstruieren des Zuordnungsmoleküls wie in Anspruch 6 definiert, welches umfaßt (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches keinen Terminationskodon hat, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines chimären Abstandshalters, der aus DNA und RNA zusammengesetzt ist, an das 3'-terminale Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder an eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an das 3'-terminale Ende des erhaltenen gebundenen Produkts, und (e) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produkts als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Konstruktionsverfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das Nukleosid oder die Substanz mit der chemischen Struktur, die der des Nukleosids analog ist, Puromycin ist.
Verfahren zum Konstruieren des Zuordnungsmoleküls wie in Anspruch 7 definiert, welches umfaßt (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welche keinen Terminationskodon hat, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines chimären Abstandshalters, der aus DNA und Polyethylenglycol besteht, an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit der chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an das 3'-terminale Ende des erhaltenen gebundenen Produkts, und (e) Durchführen der Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produkts als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Verfahren zum Konstruieren des Zuordnungsmoleküls wie in Anspruch 8 definiert, welches umfaßt (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welches keinen Terminationskodon hat, (b) Transkribieren der herstellten DNA in RNA, (c) Binden eines Abstandshalters, der aus doppelsträngiger DNA besteht, an ein 3'-terminales Ende der erhaltenen RNA, (d) Binden eines Nukleosids oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder an eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an das 3'-terminale Ende des erhaltenen gebundenen Produkts, und (e) Durchführen einer Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produkts als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Verfahren zum Konstruieren des Zuordnungsmoleküls wie in Anspruch 9 definiert, welches umfaßt (a) Herstellen einer DNA, die ein Gen enthält, welche keinen Terminationskodon und eine Nukleotidsequenz eines Abstandshalters hat, (b) Transkribieren der hergestellten DNA in RNA, (c) Binden eines Nukleosids oder einer Substanz mit einer chemischen Struktur, die der eines Nukleosids analog ist, welche kovalent an eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur gebunden werden kann, die der einer Aminosäure analog ist, an das 3'-terminale Ende der erhaltenen RNA, (d) Hinzugeben einer kurzkettigen PNA oder einer DNA an den 3'-terminalen Teil des Seitenendes des Gens in dem erhaltenen RNA-gebundenen Produkt, um eine doppelsträngige Kette zu bilden, und (e) Durchführen einer Proteinsynthese in einem zellfreien Proteinsynthesesystem unter Verwendung des erhaltenen gebundenen Produkts als mRNA, um einen Nukleinsäureteil, der das Gen enthält, an ein Translationsprodukt des Gens zu binden.
Verfahren zur Proteinevolutionssimulierung, welches einen Konstruktionsschritt zum Konstruieren von Zuordnungsmolekülen von DNA, die ein Gen enthält, durch ein Konstruktionsverfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 11, 12, 14, 15 und 16 definiert ist, einen Selektionsschritt zum Selektionieren der Zuordnungsmoleküle, die in dem Konstruktionsschritt erhalten wurden, einen Mutations-einführenden Schritt zum Einfügen einer Mutation in einen Teil eines Gens eines Zuordnungsmoleküls, welches im Selektionsschritt ausgewählt wurde, und einen Amplifikationsschritt zum Amplifizieren des Genteils, welcher in dem Mutationseinführenden Schritt erhalten wurde, umfaßt.
Verfahren zur Proteinevolutionssimulierung gemäß Anspruch 17, wobei der Konstruktionsschritt, der Selektionsschritt, der Mutations-einführende Schritt und der Amplifikationsschritt wiederholt durchgeführt werden, indem die DNA, die in dem Amplifikationsschritt erhalten wurde, im Konstruktionsschritt bereitgestellt wird.
Verfahren zum Untersuchen von intermolekularen Protein/Protein- oder Protein/Nukleinsäure-Wirkungen, welches einen Konstruktionsschritt zum Konstruieren von Zuordnungsmolekülen mit Hilfe des Konstruktionsverfahrens, das in irgendeinem der Ansprüche 11, 12, 14, 15 und 16 definiert ist, und einen Untersuchungsschritt zum Untersuchen der intermolekularen Wirkung der in dem Konstruktionsschritt erhaltenen Zuordnungsmoleküle mit einem anderen Protein oder einer Nukleinsäure umfaßt.