DE69425673T2

DE69425673T2 - Gerät und verfahren zur polymersynthese mit gerüsten

Info

Publication number: DE69425673T2
Application number: DE69425673T
Authority: DE
Inventors: M. Brennan
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1994-10-19
Publication date: 2001-04-19
Anticipated expiration: 2014-10-20
Also published as: US20030069411A1; EP1025902A3; WO1995011262A1; JP3677041B2; CA2174648C; JP2005187821A; US5472672A; JPH09507505A; DE69425673D1; ATE195671T1; JP3862726B2; JP4182104B2; EP1025902B1; EP0734397B1; EP1025902A2; JP2006206883A; US5529756A; US20110124529A1; US20050281719A1; EP0734397A1

Description

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung bezieht sich insgesamt auf eine Polymersynthesevorrichtung, und insbesondere auf eine Polymersynthesevorrichtung, welche Reihenanordnungen verwendet.

Stand der Technik

In jüngster Zeit spielen Oligonucleotide eine zunehmende und entscheidendere Rolle in der diagnostischen Medizin, in der forensischen Medizin und in der Molekularbiologieforschung. Eine Hauptfunktion dieser Polymere ist insbesondere ihre Verwendung bei Genprobenuntersuchungen zur Feststellung spezifischer Nukleinsäuresequenzen.
Genprobenuntersuchungen werden für viele Zwecke verwendet, zu denen die genetische Beratung, die Gewebeklassifizierung und die molekularbiologische Forschung gehören. Beispielsweise kann eine Person daraufhin untersucht werden, ob er oder sie das Gen für die Huntingtonsche Krankheit oder zystische Fibrose trägt. Eine andere Art der Verwendung der Genprobenanalysen umfaßt die Bestimmung der Verträglichkeit vor einer Gewebetransplantation und des Zusammenpassens von Gewebe- oder Blutproben in der Gerichtsmedizin. In der molekularbiologischen Forschung werden diese Untersuchungen schließlich extensiv zur Erforschung von Homologien zwischen Genen unterschiedlicher Arten und zum Klonen von Genen eingesetzt, für die nur eine partielle Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz bekannt ist, beispielsweise bei der Polymerase-Kettenreaktion (pcr).
Bei dieser Art von Untersuchungen wird für gewöhnlich auf das Vorhandensein einer speziellen Nukleinsäuresequenz, üblicher weise einer DNS-Sequenz geprüft, obwohl RNS-Sequenzen ebenfalls verwendet werden können. Dies wird, wie auf diesem Gebiet bekannt ist, durch Verwendung von Oligonucleotiden erreicht, die so synthetisiert werden, daß sie spezifische vorgegebene Sequenzen haben. Die Sequenz einer Oligonucleotidprobe kann auf bekannten Aminosäurensequenzen, die als DNS-Sequenzen bekannt sind, oder auf einer "Schätzungs"-Probe beruhen, die auf einer Homologie für bekannte oder vermutete DNS- oder Aminosäuresequenzen basiert. Da DNS ein "degenerierter" Code ist und mehrere DNS-Sequenzen eine einzige Aminosäuresequenz ergeben, verwenden Genprobenanalysen basierend auf einer Aminosäurefrequenz häufig Pools von verwandten Oligonucleotiden, von denen jedes eine unterschiedliche spezifische Nucleotidsequenz hat. Es ist deshalb häufig erforderlich, eine große Anzahl von verwandten, jedoch verschiedenen Oligonucleotiden zu erzeugen, um ein einziges Gen zu klonen.
Zusätzlich zu der tatsächlichen Sequenz gibt es eine Anzahl von Parametern, die bei der Synthese von Oligonucleotiden geändert werden können. Es ist auch häufig erforderlich, dieses Polymere in einer Vielfalt von Längen zu synthetisieren, da im allgemeinen die Genprobenanalyse um so spezifischer ist, je länger die Oligonucleotidprobe ist, wobei bei jeder besonderen Anwendung eine Spezifizierung erwünscht oder unerwünscht sein kann. Oligonucleotide können aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden oder Mischungen davon hergestellt werden. Alternativ möchte man auch Oligonucleotide mit modifizierten oder Nicht-Standard-Basen oder eingeschlossenen nichtradioaktiven Markierungen haben. Für bestimmte Anwendungszwecke können in gleicher Weise Oligonucleotide mit geänderten Ribose-Phosphat-Rückgraten erzeugt werden.
Neben der Genprobenanalyse gibt es noch einige andere Verwendungen von Oligonucleotiden. Beispielsweise kann die Ausbildung eines Einzelstrang-Oligonucleotids mit einer speziellen Sequenz bei der Bildung von extrem stabilen Triplex-DNS-Strukturen verwendet werden. Zu weiteren Anwendungen gehören der direkte Aufbau von synthetischen Genen und Plasmidvektoren durch Anbinden oder Verbinden von 5'-Phosphat-Oligonucleotid- Bausteinen.
Durch die Zunahme der Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden hat sich der Bedarf entsprechend gesteigert. Dies wiederum steigert die Entwicklung von neuen Synthesevorrichtungen und von Methodologien für Basisverfahren nach Oligonucleotiden mit individuell definierter Sequenz. Diese Vorrichtungen und Verfahren sind jedoch im allgemeinen sehr aufwendig in der Anwendung und für eine Massenproduktion nicht leicht verfügbar. Bei der gegenwärtigen Generation von automatisierten DNS-Sequenzsynthetisierern wird gewöhnlich ein derivatisierter massiver Träger, beispielsweise kontrolliertes Porenglas (CPG), in eine individuelle Reaktionskammer einer Säule eingebracht, um an ihr für das Einleiten der Feststoffphasensynthese einen stabilen Anker zu haben. Unter Verwendung einer Reihe von komplexen Ventilanordnungen und Pumpen, die mit der Säule gekoppelt sind, werden in einer vorgegebenen Weise die geeigneten ausgewählten Reagenzien nacheinander durch die Kammer filtriert. Ein Kontakt des Reagenz mit den Polymereinheiten, die vorher an dem CPG befestigt wurden, welches in der Kammer durch eine poröse Fritte als Probenträger gehalten und abgestützt wird, verursacht eine Reaktion, die an ihm zu einem aufgereihten Wachstum führt.
Obwohl jede Säule dieser Anordnung eine schnelle Massenproduktion einer homogenen Population von sequenzdefinierten Oligonucleotiden zuläßt, bieten die vorhandenen Anordnungen nur vier Säulenfähigkeiten. Eine erhöhte Säulenkapazität ist aufgrund der physikalischen Grenzen der Ventilausgestaltung eingeschränkt. Deshalb können nur vier unabhängige Synthesezyklen gleichzeitig ausgeführt werden. Da außerdem die Synthesevorrichtungen im allgemeinen einer integrierten Automation mit anderen robotischen Laborgerätschaften nicht zugänglich sind, muß eine Bedienungsperson eingreifen, um jede einzelne Synthesesäule von Hand zu füllen und zu leeren. Eine solche Handha bung erhöht die menschliche Fehlerquote.
Eine bedeutendere Begrenzung besteht darin, daß alle Reagenzien durch einen gemeinsamen Hauptkanal durchgeschleust werden. Deshalb kann nur ein Reagenz oder eine Kombination davon gleichzeitig in ausgewählten Säulen abgeschieden werden. Beispielsweise kann in der Säule eins das Reagenz "Tetrazol" nicht abgeschieden werden, während ein spezielles Amidit-Reagenz gleichzeitig in Säule vier abgeschieden wird. Außerdem muß für jede gesonderte Synthese oder Reaktion der gemeinsame Hauptkanal und die zugehörige Ventilanordnung mit einem Reinigungsmittel so gespült werden, daß restliche Amidit- oder Entblockungsreagenzien nicht in unerwünschter Weise in einer Säule abgeschieden werden. Dieser Lösungsweg verschwendet Zeit und erhöht die Kosten der Bedienungsperson.
Bekannt ist auch die Reihensynthese von gebundenen Oligonucleotiden oder Peptiden. Bei einem Lösungsweg für eine parallele Synthese, die als Teebeutelverfahren oder als Scheibenkonstruktion bekannt ist, wird eine Reihenanordnung von einzelnen Paketen oder Scheiben von Feststoffträgerperlen physikalisch in vier Amidit-Untermengen für eine Behandlung mit dem ausgewählten Amidit sortiert. Nachdem jedes Paket von Perlen mit dem gemeinsamen Reagenz behandelt worden ist, müssen die Pakete erneut von Hand in vier Untermengen für den darauffolgenden Synthesezyklus sortiert werden. Jedes Sortieren und Neusortieren ist für die Herstellung von großen Reihen von Oligonucleotiden zu mühsam und arbeitsintensiv.
Ein weiterer Lösungsweg unter Verwendung von Reihenanordnungen ist das Stifteintauchverfahren für eine parallele Oligonucleotidsynthese (Geysen, J. Org. Chem. 56, 6659 (1991)). Bei diesem Verfahren werden kleine Mengen des Feststoffträgers zu Reihen von magnetgesteuerten Polypropylenstiften geschmolzen, die danach in Schalen der geeigneten Reagenzien eingetaucht werden. Die Dichte der Anordnungen ist jedoch begrenzt, und das verwendete Tauchverfahren erweist sich in der Praxis als beschwerlich.
Auf der Southern, Genome Mapping Sequence Conference, May 1991 in Cold Spring Harbour, N. Y., wurde ein weiteres Schema für eine Oligonucleotid-Reihensynthese offenbart, bei welchem ausgewählte Bereiche auf einer Glasplatte physikalisch maskiert und die gewünschte chemische Reaktion in dem nicht-maskierten Abschnitt der Platte ausgeführt wird. Das Problem bei diesem Verfahren besteht darin, daß nach jeder Interaktion die alte Maske entfernt und eine neue aufgebracht werden muß. Fodor et al., Science 251, 767 (1991), beschreiben ein anderes Verfahren zum Synthetisieren sehr dichter 50-um-Reihenanordnungen von Peptiden (und potentiell Oligonucleotiden) unter Verwendung einer maskenausgerichteten photochemischen Schutzgruppenentfernung und von synthetischen Zwischenprodukten. Dieses Verfahren ist durch die geringe Geschwindigkeit der photochemischen Schutzgruppenentfernung und durch die Empfindlichkeit gegenüber Nebenreaktionen (beispielsweise Thymidin-Dimer-Bildung) bei der Oligonucleotidsynthese beschränkt. Khrapko et al. schlagen in FEBS Letters 256, 118 (1989) eine vereinfachte Synthese und Immobolisierung von Mehrfach-Oligonucleotiden durch direkte Synthese auf einem zweidimensionalen Träger vor, wobei eine druckerartige Vorrichtung verwendet wird, die zu einer Probenahme von jedem der vier Nucleotiden in vorgegebenen Punkten auf der Matrix fähig ist. Es werden jedoch keine Einzelheiten angegeben, wie eine solche Vorrichtung hergestellt oder verwendet werden soll.
Zusammenfassend zeigt sich, daß der verwandte Stand der Technik zahlreiche Ideen und Informationen bezüglich der Synthese von Reihen von Oligonucleotiden oder Peptiden für die Bestimmung von Nucleotidsequenzen oder der Aminosäuresequenzen spezifischer, sich bindender Peptide enthält. Die vorhandenen oder vorgeschlagenen Verfahren sind jedoch beschränkt und lassen eine zweckmäßige und zuverlässige Massenproduktion sehr großer Reihen nicht zu, die für eine wirksame Sequenzierung in großem Maßstab erforderlich sind.
WO-A-90/02605 bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren für eine parallele Festphasensynthese einer Vielzahl von Peptiden auf einem Präparativmaßstab (d. h. Milligramm oder mehr).
US-A-5,106,583 bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Analysieren unbekannter isolierter Proteine durch Aufbrechen der Bindungen zwischen Aminosäuren durch Hydrolyse.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Polymersynthesevorrichtung und ein Verfahren zum Aufbau von Polymerketten mit definierter Sequenz bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Polymersynthesevorrichtung und eines Verfahrens zur Herstellung von Reihen von Oligonucleotiden oder Peptiden in großer Menge auf eine reproduzierbare und schnelle Weise.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Polymersynthesevorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, welches den Reagenzabfall während der Herstellung der Reihen von Oligonucleotiden in großer Menge verringert.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Polymersynthesevorrichtung und eines Verfahrens zur Herstellung von Reihen von Oligonucleotiden einer großen Menge bei reduzierten Kosten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Polymer-Reihen-Synthesevorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, das dauerhaft ist, kompakt ist, leicht aufrechtzuerhalten ist, eine minimale Anzahl von Komponenten hat, von ungeschultem Personal leicht eingesetzt werden kann und wirtschaftlich in der Herstellung ist.
In Übereinstimmung mit den vorliegenden Zielen stellt die vor liegende Erfindung eine Polymersynthesevorrichtung zum Aufbau einer Polymerkette durch sequentielle Zugabe von Polymereinheiten zu einem festen Träger in einem flüssigen Reagenz
- mit einer Basisanordnung, die einen Reaktionsbehälter und wenigstens eine Öffnung aufweist, die sich in den Behälter erstreckt,
- mit wenigstens einem in dem Behälter angeordneten festen Träger zum Wachsen und Immobilisieren einer Polymerkette auf ihm,
- mit einer Reagenzlösung in dem Behälter in Kontakt mit dem festen Träger und mit wenigstens einer Polymereinheit der Polymerkette, die an dem festen Träger festgelegt ist,
- mit einer Rückhalteeinrichtung, die in dem Behälter angeordnet und so ausgebildet und bemessen ist, daß sie den Durchgang des festen Trägers durch die Öffnung im wesentlichen unterbindet,
- wobei die Öffnung einen Einlaß in den Behälter und einen Auslaß sowie eine solche Größe und Abmessung hat, daß eine Kapillar-Flüssigkeitsdichtung gebildet wird, um die Reagenzlösung in dem Behälter zur Ermöglichung des Polymerkettenwachstums darin zurückzuhalten, wenn eine Druckdifferenz zwischen einem ersten auf den ersten Reaktionsbehälter ausgeübten Gasdruck und einem zweiten auf den Öffnungsauslaß ausgeübten Gasdruck geringer ist als eine vorgegebene Größe,
- mit einer Druckreguliereinrichtung zum Regulieren der Druckdifferenz derart, daß, wenn die Druckdifferenz die vorgegebene Größe überschreitet, die Reagenzlösung aus dem Behälter durch die Öffnung ausgetrieben wird, und
- mit einem oberen Kammermechanismus bereit, der mit einer Oberseite der Basisanordnung so zusammenwirkt, daß eine obere, den Reaktionsbehälter darin einschließende Kammer gebildet wird, wobei die Reguliereinrichtung mit der oberen Kammer zum Regulieren der Druckdifferenz in Verbindung steht.
Die Synthesevorrichtung kann weiterhin einen Einlaß in die gemeinsame Kammer, der stromauf von den Anschlüssen angeordnet ist, sowie einen Auslaß aus der gemeinsamen Kammer aufweisen, der stromab von den Auslässen angeordnet ist. Mit dem Einlaß ist eine Druckgasquelle für einen kontinuierlichen Gasstrom durch die gemeinsame Kammer von der Kammeraufstromseite zur Kammerabstromseite und aus dem Auslaß heraus gekoppelt, um aus der gemeinsamen Kammer giftige Dämpfe zu spülen, die von den Reagenzien emittiert werden, sowie Luft und Feuchte an einem Einsickern zu hindern.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Syntheseverfahren zum Aufbau einer Polymerkette durch sequentielle Zugabe von Polymereinheiten zu wenigstens einem festen Träger zum Wachsen und Immobilisieren einer Polymerkette darauf in einem flüssigen Reagenz bereit, bei welchem
A) ein flüssiges Reagenz in einen Reaktionsbehälter in Kontakt mit einem festen Träger und wenigstens eine Polymereinheit der Polymerkette eingebracht wird, die an dem festen Träger festgelegt ist, wobei der Behälter wenigstens eine sich in ihn erstreckende Öffnung und eine solche Größe und Abmessung hat, daß eine Kapillar-Flüssigkeitsdichtung gebildet wird, um die Reagenzlösung in dem Behälter zur Ermöglichung des Wachstums der Polymerkette auf dem festen Träger zurückzuhalten,
B) ein erster Gasdruck an den Reaktionsbehälter derart angelegt wird, daß eine Druckdifferenz zwischen dem ersten Gasdruck und einem zweiten, an einem Auslaß der Öffnung ausgeübten Gasdruck eine vorgegebene Größe überschreitet, die erforderlich ist, um die Kapillar-Flüssigkeitsdichtung aufzuheben und die Reagenzlösung aus dem Behälter durch die Öffnung auszutreiben, und
C) giftige, von der Reagenzlösung emittierte Dämpfe aus einer gemeinsamen, den Reaktionsbehälter einschließenden Kammer durch Führen eines Gases von einer Druckgasquelle, die mit einem Einlaß in die Kammer verbunden und stromauf von dem Reaktionsbehälter angeordnet ist, und aus der Kammer durch einen Auslaß heraus, der von der gemeinsamen Kammer weggeht und stromab von dem Reaktionsbehälter angeordnet ist, ausgespült werden.
Die Anordnung der vorliegenden Erfindung hat weitere vorteilhafte Ziele und Merkmale, die aus der folgenden Beschreibung der besten Ausführung der Erfindung und den beiliegenden Ansprüchen unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung deutlicher werden, in denen
Fig. 1 eine auseinandergezogene perspektivische Draufsicht auf die Polymersynthese-Reihenvorrichtung ist, die erfindungsgemäß aufgebaut ist,
Fig. 2 eine perspektivische Unteransicht einer Kopfanordnung der Polymersynthese-Reihenvorrichtung von Fig. 1 ist, welche die ausgesparten Anschlußenden zeigt,
Fig. 3 eine Seitenschnittansicht der Polymersynthese-Reihenvorrichtung von Fig. 1 ist, die die Spülwirkung des Inertgasstroms durch die gemeinsame Kammer zeigt,
Fig. 4 eine Stirnschnittansicht der Polymersynthese-Reihenvorrichtung von Fig. 1 ist, die eine schwenkbar an einer Rahmenanordnung angebrachte Kopfanordnung zeigt,
Fig. 5 eine vergrößerte Seitenschnittansicht der Polymersynthese-Reihenvorrichtung im wesentlichen längs der Linie 5-5 von Fig. 3 ist, die die Kapillar-Flüssigkeitsdichtung zeigt, die zwischen der flüssigen Reagenzlösung und der entsprechenden Fritte und Öffnung ausgebildet ist,
Fig. 6 eine vergrößerte Seitenschnittansicht der Polymersynthese-Reihenanordnung im wesentlichen längs der Linie 6-6 von Fig. 3 ist, die die Ballondichtung zeigt,
Fig. 7 eine vergrößerte, schematische perspektivische Drauf sicht auf eine an der Kopfanordnung der Polymersynthese-Reihenvorrichtung angebrachten Zuführanordnung ist, und
Fig. 8A und 8B die Ergebnisse der Versuche der Oligonucleotide Nr. 14 bzw. Nr. 15 von Beispiel 1 wiedergeben.

Beste Art der Durchführung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf wenige spezifische Ausgestaltungen beschrieben, wobei die Beschreibung der Erfindung nur veranschaulichend und nicht als Begrenzung der Erfindung ausgelegt werden soll. Es können verschiedene Modifizierungen bezüglich der vorliegenden Erfindung an den bevorzugten Ausführungsformen vom Fachmann ausgeführt werden, ohne die eigentliche Idee und den Rahmen der Erfindung, wie er durch die beiliegenden Ansprüche definiert ist, zu verlassen. Anzumerken ist, daß zum besseren Verständnis gleiche Bauteile mit gleichen Bezugszeichen in den verschiedenen Figuren bezeichnet sind.
In Fig. 1 und 2 ist eine Polymersynthesevorrichtung, die insgesamt mit 20 bezeichnet ist, zum Aufbau der Polymerkette durch sequentielle Zugabe von Polymereinheiten zu einem festen Träger in einem flüssigen Reagenz gezeigt. Obwohl die Vorrichtung 20 insbesondere zum Aufbau von sequenzdefinierten Oligonucleotiden geeignet ist, kann die vorliegende Erfindung auch für die Synthese irgendeiner Polymerkette verwendet werden. Der Ausdruck "Polymereinheit" soll deshalb als eine Komponente definiert werden, die an andere Komponenten der gleichen oder von unterschiedlicher Art zur Bildung einer Polymerkette, wie Oligonucleotiden und Peptidketten, definiert werden.
Bei einer Ausführungsform hat die in Kurzform bezeichnete Synthesevorrichtung 20 eine Kopfanordnung, die insbesondere mit 21 bezeichnet ist, und eine Vielzahl von Anschlüssen 22 (Fig. 2), die daran insgesamt in einer Abstandsbeziehung angebracht sind. Jeder Anschluß 22 ist mit einem Speicher 23 (Fig. 7) für flüssiges Reagenz 24 für eine regulierte Zuführung durch sie hindurch verbunden. Weiterhin gehören eine insgesamt mit 25 bezeichnete Basisanordnung, die wenigstens einen Reaktionsbehälter 26 aufweist, und ein insgesamt mit 27 (Fig. 3) bezeichneter Transportmechanismus dazu, der mit wenigstens einer Kopfanordnung 21 und Basisanordnung 25 zur Erzeugung einer Relativbewegung dazwischen verbunden ist. Dadurch sind ein ausgewählter Reaktionsbehälter 26 und ein ausgewählter Anschluß 22 in fluchtender Ausrichtung für das Einbringen eines ausgewählten Reagenz 24 in den Reaktionsbehälter für die Synthese einer Polymerkette positioniert. Zwischen der Kopfanordnung und der Basisanordnung ist zur Bildung einer gemeinsamen Kammer 31 (Fig. 3), welche sowohl den Reaktionsbehälter als auch die Anschlüsse darin einschließt, eine insgesamt mit 30 bezeichnete Gleitdichtung angeordnet.
Bei der bevorzugten Ausführungsform wird eine Reihe von Behältern 26 (Fig. 1) vorgesehen, die in einer Mikrotiter-Platte 32 ausgebildet sind, die von einer Gleitplatte 33 der Basisanordnung 25 getragen wird. Die Synthesevorrichtung ist insbesondere so gestaltet, daß sie eine Mikrotiter-Platte mit 96 Behältern verwendet (zur Vereinfachung der Darstellung sind nicht alle Behälter gezeigt), die in 12 gleich beabstandeten Reihen 34, von denen sich jede quer zu einer Längsachse 35 der langgestreckten Basisanordnung 25 erstreckt, mit 8 gleich beabstandeten Spalten 36 in der Breite ausgerichtet sind. Die Mikrotiter-Platte 32 wird vorzugsweise aus einem chemisch inerten Material, wie Polypropylen, hergestellt. Natürlich kann jede beliebige Anzahl von Behältern oder Anordnung von Reihen und Spalten verwendet werden, ohne von der Idee und Art der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Fig. 1 und 2 zeigen weiterhin, daß die Anschlüsse 22, die in Montageblöcken 37 der Kopfanordnung 21 angebracht sind, weiterhin zu einer Anordnung von Anschlußreihen 40 und -spalten 41 ähnlich der Anordnung der Behälter 26 ausgerichtet sind. Bei der bevorzugten Ausführung entspricht die Anzahl der An schlußspalten 41, von denen sich jede parallel zu einer Längsachse 42 der Kopfanordnung 21 erstreckt, der Anzahl der Behälterspalten 36. Dadurch entspricht jeder Anschluß 22 in einer speziellen Bank oder Reihe 40 von Anschlüssen einer entsprechenden Spalte 36 von Behältern 26 und ist dazu ausgerichtet. Die Anschlüsse in irgendeiner Reihe 40 und Spalte 41 sind im gleichen Abstand voneinander angeordnet, wie er zwischen den Behälterreihen 34 und -spalten 36 vorhanden ist, was eine gleichzeitige Ausrichtung zwischen einen oder mehreren Behälterreihen 34 mit ausgewählten Anschlußreihen 40 während eines einzigen Zyklus ermöglicht. Das bedeutet, daß die Anordnung von Behältern zur Anordnung der Anschlüsse längs einer Vielzahl von Positionen für das gleichzeitige Abscheiden ausgerichtet werden kann.
Diese Anordnungstechnik für eine sequenzdefinierte Oligonucleotidsynthese wurde zuerst aus der hochdichten Oligonucleotidreihen-Chipanordnung für eine Hybridisierungssequenzbildung entwickelt, die in dem US-Patent 5474796, angemeldet am 4. September 1991, offenbart ist. Deshalb wird diese Aufreihungstechnik für sich nicht als neues Merkmal der vorliegenden Erfindung beansprucht. Diese Anordnung ist jedoch weder geeignet noch passend für Produktionsfähigkeiten im großen Maßstab nach der vorliegenden Erfindung, was nachstehend beschrieben wird.
Um die Organisation und Herstellung von Polymerketten zu vereinfachen, verbindet eine Zulieferanordnung 43 (Fig. 7) der Synthesevorrichtung zur Steuerung der Zufuhr der flüssigen Reagenzien durch die Anordnung von Anschlüssen alle Anschlüsse 22 in einer speziellen Bank oder Reihe 40 mit einem gemeinsamen, unabhängigen flüssigen Reagenzspeicher 23 miteinander, während jede Bank oder Reihe 40 von Anschlüssen mit einem verschiedenen flüssigen Reagenz verbunden ist, das bei einer speziellen Polymersynthese zugeführt wird. Beispielsweise kann die erste Reihe 40 von Anschlüssen 22 nur den Aktivator Tetrazol abgeben, während die zweite Reihe von Anschlüssen das Ami dit-Thymidin spendet. Bei der Oligonucleotidsynthese kann sich diese Reihenfolge der Verteilung der flüssigen Reagenzien nach unten für Amidit-Adenosin, Cytosin und Guanin, die zusätzliche Basis AnyN, das Waschlösungsmittel/Reaktionslösungsmittel Acetonitril, die Kappe Essigsäureanhydrid, die Kappe N-Methylimidazol, Jod und die Entblocker Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure fortsetzen, alles Reagenzien, die für die Synthese von Oligonucleotiden mit definierter Sequenz verwendet werden. Zur Vereinfachung der Darstellung sind nur fünf Reihen von Anschlüssen gezeigt. Selbstverständlich kann der in der Anordnung vorhandene Anschluß mit irgendeinem Reagenzspeicher in Verbindung gebracht werden.
Die Zuführanordnung 43 der vorliegenden Erfindung setzt jede Bank von Anschlüssen mit einem gemeinsamen Reagenzspeicher 23 über unabhängige Abgaberohre 44 in Verbindung. Jedes Rohr hat einen Durchgang 45 (Fig. 6) und ist mit einem Ende mit dem jeweiligen Anschluß verbunden und endet mit seinem gegenüberliegenden Ende in dem flüssigen Reagenz 24, das in dem Speicher enthalten ist. Diese Rohre sitzen im Preßsitz in Öffnungen 46, die sich durch Montageblöcke 37 und eine Kopfplatte 47 der Kopfanordnung 21 erstrecken. Die flexible und halbelastische Beschaffenheit eines jeden Rohrs 44, vorzugsweise TEFLON®, was durch Kontakt mit den Reagenzien gegen einen Qualitätsverlust widerstandsfähiger ist, gibt eine ausreichende Abdichtung zwischen der Rohraußenseite und der jeweiligen Öffnung.
Das distale Ende eines jeden Rohres 44 bildet, wie in Fig. 2 und 6 gezeigt ist, einen Anschluß 22, der sich in quer angeordnete Schlitze 50, jedoch nicht darüber hinaus, erstreckt, die in einer Bodenfläche 51 der Kopfplatte 47 ausgebildet sind. Jeder unabhängige Anschluß 22 ist dementsprechend so ausgespart, daß er die Oberseite 52 einer Basisgleitplatte 33 während der relativen Gleitbewegung dazwischen nicht beeinträchtigt. Das unabhängige Erstrecken jedes Anschlusses in Schlitze 50 begünstigt ferner das Entfernen oder Entsorgen von restlichem flüssigen Reagenz, das sich am Ende des Anschlusses nach der Zuführung von Reagenz aus ihm angesammelt hat.
Es gibt zwei wesentliche Belange bei der Zuführung von flüssigem Reagenz durch die Anschlüsse 22, nämlich 1) wie wird ein Tröpfchen sauber so ausgeworfen, daß kein Tropfen am Ende des Anschlusses hängenbleibt, und 2) wie vermeidet man, daß der Inhalt der Reaktionskammer spritzt, wenn der Reagenzstrom in den Behälter zugeführt wird. Die Auswurfgeschwindigkeit des Reagenz aus dem Anschluß muß ausreichen, um ein Vermischen zwischen dem ersten und zweiten zugeführten Reagenz in der Reaktionskammer auszulösen. Sehr kleine Tröpfchen können sauber mit hohen Auswurfgeschwindigkeiten ausgeworfen werden, haben jedoch keine ausreichende kinetische Energie, um die Oberflächenspannung der bereits in dem Behälter befindlichen Flüssigkeit zur Herbeiführung eines Mischens zu überwinden. Im Gegensatz dazu können größere Tröpfchen ebenfalls sauber mit hohen Auswurfgeschwindigkeiten ausgeworfen werden, neigen jedoch zu einem Verspritzen des Inhalts auf die benachbarten Behälter. Bei niedrigeren Auswurfgeschwindigkeiten neigen die Reagenzien dazu, den letzten Tropfen an dem Anschlußende hängenzulassen, was auch eine Funktion der Querschnittsfläche des Endes ist. Darüber hinaus ändert sich der Flüssigkeitsdurchsatz durch kleine Kapillarrohre direkt mit dem Zuführdruck und umgekehrt zur Rohrlänge und umgekehrt zum Durchmesser. Alle diese Variablen müssen, wenn der Zuführdruck und die Anschlußausgestaltungen konzipiert werden, ebenso wie die Baumaterialien berücksichtigt werden, damit die Reagenzien sauber herausgedrückt werden können, ohne daß ein Resttropfen von flüssigem Reagenz an dem Anschlußende hängenbleibt. Abhängig von dem flüssigen Reagenz kann es deshalb günstiger sein, es in einem kontinuierlichen Strom, als Reihe von Pulsen oder in Tröpfchenform abzugeben.
Jeder Reagenzspeicher 23 hat, wie in Fig. 7 gezeigt ist, ein Druckrohr 53, das mit einer Kompressorvorrichtung (nicht gezeigt) verbunden ist, die den Speicherluftraum 54 mit Druck beaufschlagt, um das gespeicherte flüssige Reagenz aus dem Speicher heraus und durch die entsprechenden Abgaberohre 44 zu treiben. Die Zuführung von Reagenzien durch die Abführrohre 44 wird durch eine Anordnung von unabhängigen Ventilanordnungen 55 gesteuert, von denen jede in Reihe dazu angeordnet ist. Diese Ventilanordnungen werden vorzugsweise von magnetgetriebenen Mikroabsperrventilen gebildet, von denen jedes weniger als 5 ms für eine Zuführung von genauen Volumina an flüssigem Reagenz öffnen und schließen kann.
Um einen konstanten Zuführdruck über jedem Abgaberohr 44 und somit einen konstanten Zuführmengenstrom an flüssigem Reagenz durch einen Anschluß in einer Bank oder Reihe 40 von Anschlüssen 22 sicherzustellen, endet jedes Abgaberohr unabhängig in dem in dem Reagenzspeicher enthaltenen flüssigen Reagenz. Somit ergibt sich bei dieser Ausgestaltung unabhängig von der für die Zuführung eingesetzten Anzahl von Anschlüssen eine Zuführung mit ungleichförmigem Durchsatz, der durch sich ändernden Leitungsdruck verursacht würde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wirken die Basisanordnung 25 und die Kopfanordnung 21 mit einem Transportmechanismus 27 für einen Relativbewegung zwischen der Basisanordnung und der Kopfanordnung zusammen, um die Reihenanordnung von Behältern mit der Reihenanordnung von Anschlüssen in einer Vielzahl von Positionen fluchtend auszurichten. Vorzugsweise bewegt der Transportmechanismus die Basisanordnung (strichpunktierte Linien in Fig. 3) längs ihrer Längsachse 35 derart, daß die Behälter jeder Reihe 34 fluchtend zu den Anschlußspalten 41 ausgerichtet bleiben. Die Basisanordnung 25 wird dafür durch eine Rahmenanordnung 57 (Fig. 3 und 4) für eine Hin- und Herbewegung in Richtung der Pfeile 60 gleitend getragen. Die Gleitplatte 33, welche die Mikrotiterplatte 32 trägt, ist gleitend verschiebbar in einem Schienenmechanismus 61 der Rahmenanordnung 57 für eine fluchtend ausgerichtete Bewegung aufgenommen. Durch Steuern der Zuführung von Reagenz durch ausgewählte Anschlüsse (über Ventilanordnungen 55) und durch Handhabung des Transportmechanismus kann somit eine Vielzahl von homogenen Populationen von Polymeren mit definierter Sequenz in ausgewählten Behältern auf schnelle und reproduzierbare Weise gleichzeitig synthetisiert werden.
Der Transportmechanismus 27 hat eine Schrittmotoranordnung 62, die schematisch in Fig. 3 dargestellt und funktionsmäßig mit der Gleitplatte 33 gekoppelt ist. Die Basisanordnung 25 wirkt so mit dem Schienenmechanismus 61 und dem Schrittmotor für eine lineare schrittweise Bewegung zusammen, um die Reihenanordnung von Behältern zu der Reihenanordnung von Anschlüssen in einer Vielzahl von Positionen fluchtend auszurichten. Natürlich kann der Transportmechanismus auch von irgendeiner Motor-/Schienenausgestaltung gebildet werden, welche die Basisanordnung bezüglich der Kopfanordnung bewegt.
Bevor eine Polymersynthese beginnt oder nachdem der Syntheseprozeß beendet worden ist, kann die Anordnung von Behältern außerhalb einer gemeinsamen Kammer 31 positioniert und der offenen Umgebung für den Zugang ausgesetzt werden, indem die Behälter 26 (über eine Bewegung der Basisanordnung 25) ganz nach rechts oder ganz nach links von der Gleitdichtung 30 bewegt werden. Dadurch kann die Behälteranordnung gereinigt oder mit Feststoffträgermaterial beladen werden, was noch erläutert wird. Wenn außerdem einmal sich die Behälter und Anschlüsse innerhalb der gemeinsamen Kammer befinden, kann ein Zugang durch eine Scharnieranordnung 63 erfolgen, wie in Fig. 4 gezeigt ist, die die Kopfanordnung 21 schwenkbar an der Rahmenanordnung 57 trägt.
Unter Bezug auf Fig. 1, 3 und 5 wird im folgenden die Gleitdichtung der vorliegenden Erfindung beschrieben. Bei der Oligonucleotidsynthese durch Phosphoramiditbindung gibt es zwei chemische technische Hauptforderungen, da die Bindungsreaktionen schnell und irreversibel sind. So müssen vorzugsweise Wasser und Sauerstoff aus der gemeinsamen Reaktionskammer während der Synthese ausgeschlossen sein. Phosphoramidite sind gegen über einer Hydrolyse durch Spuren von Wasser und gegenüber Oxidation durch Kontakt mit Luft empfindlich. Deshalb wird die Gleitdichtung 30 zwischen der Bodenfläche 51 der Kopfanordnung 21 und der oberen Fläche 52 der Basisanordnung 25 angeordnet, um so umgebungsmäßig sowohl die Reaktionsbehälter als auch die Anschlüsse in einer gemeinsamen Kammer 31 zu haben. Durch Strömenlassen eines Inertgases durch die gemeinsame Kammer 31, um die Luft und Wasserspuren aus der Kammer zu entfernen, können eine Hydrolyse und Oxidation auf ein Minimum reduziert, wenn nicht gänzlich ausgeschlossen werden, was nachstehend im einzelnen erläutert wird.
Die Gleitdichtung 30 muß so ausgebildet sein, daß sie ein Umgebungsbehältnis bleibt, während sich die Basisanordnung bezüglich der Kopfanordnung verschieben kann. Bei der bevorzugten Ausgestaltung wird die Gleitdichtung 30 von einer elastischen, rechtecksförmigen Dichtung aus einer hydrolysebeständigen Folie oder in Ballonform gebildet, deren oberes Ende an der Unterseite 51 des Kopfes angebracht ist und deren gegenüberliegendes oder unteres Ende 64 in Gleitkontakt mit der oberen Fläche 52 der Basis steht. Diese spezielle Dichtung, die vorzugsweise aus Kautschuk oder dergleichen zusammengesetzt ist, erhöht die Dichtungsintegrität zwischen dem unteren Ende 64 der Dichtung und der oberen Fläche 52 der Basis, wenn der Druck in der gemeinsamen Kammer zunimmt. Fig. 5 zeigt, daß sich das untere Ende 64 der Dichtung am Umfang nach innen zum Innenraum der gemeinsamen Kammer 31 verjüngt. Bei Zunahme des Kammerdrucks dehnt sich die Wand der Dichtung 30 nach außen aus, wodurch der Oberflächenkontakt zwischen dem unteren Ende der Dichtung und der oberen Fläche der Basis zunimmt und den Dichtungseingriff dazwischen verbessert.
Zur Erleichterung eines Gleitkontakts bei Aufrechterhaltung des Umgebungsumschließungsbehältnisses hat die Dichtung 30 eine klebefreie Beschichtung oder Lage 65 (Fig. 5) vorzugsweise aus TEFLON® zwischen dem unteren Ende der Dichtung und der oberen Fläche der Basis. Diese Schicht dient weiter als Schutz der Dichtung gegenüber einer Oberflächenabsorption von restlichen flüssigen Reagenzien, welche bei Kontakt zu einer Qualitätsverschlechterung der Dichtung teilweise aufgrund ihrer elastischen Beschaffenheit tendieren. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, kann die obere Fläche 52 der Basisanordnung auch eine Beschichtung oder Lage 66 aus TEFLON® aufweisen, um den Gleitkontakt zu begünstigen und um die obere Fläche vor restlichem Reagenz zu schützen.
Natürlich braucht die Abdichtung zwischen dem unteren Ende 64 der Dichtung und der oberen Fläche 52 der Basis nicht hermetisch zu sein. Die Hauptfunktion der Dichtung besteht darin, Sauerstoff aus der Reaktionskammer auszuschließen. Es ist deshalb wesentlich, im Normalfall einen minimalen positiven Druck im Inneren der Kammer 31 zu jeder Zeit während der Synthese aufrechtzuerhalten, der etwas größer ist als der Atmosphärendruck, so daß der Gasstrom, falls ein Leck auftritt, nach außen ginge. Diese minimale positive Druckdifferenz beträgt gewöhnlich etwa 69 Pa (1/100 psi) bis etwa 689 Pa (1/10 psi).
Wie vorher erwähnt und in Fig. 3, 5 und 6 zu sehen ist, möchte man die Luft und Wasserspuren aus dem Reaktionskopfraum der Kammer mit einem Inertgas, vorzugsweise Argon, herausspülen, um die Hydrolyse und die Oxidation der Amidite während der Synthese auf ein Minimum zu reduzieren. Weiterhin möchte man das Inertgas kontinuierlich durch den Kopfraum strömen lassen, um die empfindlichen Amidite vor den Kappenbildungs- und Entblockungsreagenzien wie wäßrigem Joddampf oder Trichloressigsäure, zu schützen, die mit dem Amiditen reagieren. Dies wird durch Einführen eines Inertgasstroms (dargestellt durch Pfeile 67) durch die gemeinsame Kammer 31 von einem stromauf von der Reihenanordnung von Anschlüssen 22 angeordneten Gaseinlaß 70 aus erreicht, der aus der Kammer durch einen Gasauslaß 71 austritt, der stromab von den Anschlüssen angeordnet ist. Der Gaseinlaß 70 ist mit einer Gasquelle (nicht gezeigt) durch ein Einlaßrohr 72 (Fig. 1) verbunden, die außerdem für den Überdruck in der gemeinsamen Kammer 31 sorgt, der erforderlich ist, um Sauerstoff von der Umgebung auszuschließen. Da der Kopfraum der gemeinsamen Kammer relativ klein ist (in den Figuren ist er zur Veranschaulichung übertrieben groß gezeigt), kann ein ausreichender Gasstrom vorbei in den Anschlüssen erzeugt werden, um die Kammer ohne großen Gasvoluminaverbrauch zu reinigen oder auszuspülen.
Der Gaseinlaß ist vorzugsweise mit einem langgestreckten Einlaßschlitz 70 (Fig. 2) versehen, der sich in die Kopfplatte 47 erstreckt und quer zu der Längsachse 42 der Kopfplatte 47 ausgerichtet ist. Die Form und Ausrichtung sorgen für einen im wesentlichen laminaren Inertgasstrom von dem stromauf liegenden Einlaß 70 zum stromab liegenden Einlaß 71, wodurch ein Gasquerstrom über die Anschlüsse auf ein Minimum reduziert wird und um die Totzonen mit stillstehenden Reagenzdämpfen aus der Kammer auszuspülen. Zu vermerken ist, daß der Gaseinlaß auch von einer Reihe von Öffnungen gebildet werden kann, die sich quer über die Kopfplatte 47 erstrecken, und daß der Gasauslaß 71 von einem langgestreckten Schlitz oder von einer Reihe von Öffnungen gebildet werden kann.
Aufgrund des Gasstroms durch die Kammer befinden sich die gegen Säure und Feuchte empfindlichen Phosphoramide stromauf von den Entblockungs- und Kappenreagenzien, die eine Diffusionsgassperre bilden, was den Ausspüleffekt maximiert. Gemäß Fig. 3 würden die Phosphoramide von den Anschlüssen 22 näher zum Gaseinlaß 70 abgegeben werden, während die Kappenbilder, Waschmittel und Entblocker von den Anschlüssen abgegeben werden, die sich näher am Gasauslaß 71 stromab von den Phosphoramid-Abgabeanschlüssen befinden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Polymersynthesevorrichtung 20, wie am besten in Fig. 5 und 6 zu sehen ist, mit Reaktionsbehältern 26 versehen, die wenigstens eine Öffnung, die insgesamt mit 74 bezeichnet ist, haben, welche sich in den Behälter erstreckt. In dem Behälter ist wenigstens ein massiver Träger 75 angeordnet, auf dem eine Polymerkette wächst und mobilisiert wird. Die Reagenzlösung 76 in dem Behälter 26 steht in Kontakt mit dem festen Träger 75, wobei wenigstens eine Polymereinheit der Polymerkette an dem festen Träger festgelegt ist. Die Öffnung 74 hat einen Einlaß 77 in den Behälter 26 von der Seite der gemeinsamen Kammer aus und einen Auslaß 80 aus dem Behälter heraus in ein darunterliegendes unteres Auffangbassin 81. Wesentlich ist, daß die Öffnung eine solche Größe und Abmessung hat, daß eine kapillare Flüssigkeitsdichtung mit der darin enthaltenen Reagenzlösung 76 gebildet wird, um die Reagenzlösung in dem Behälter zurückzuhalten, um in ihm das Wachstum der Polymerkette zu ermöglichen. Um die Lösung 76 in den Behältern 26 zurückzuhalten, muß außerdem eine Druckdifferenz zwischen einem Gasdruck der gemeinsamen Kammer, welcher auf die Reagenzlösung in den Reaktionsbehältern 26 ausgeübt wird, und zwischen einem zweiten Gasdruck, der auf die Öffnungsauslässe 80 (dargestellt durch Pfeile 79 in Fig. 6) ausgeübt wird, kleiner als ein vorgegebener Wert sein. Schließlich wird eine Druckreguliervorrichtung 82 vorgesehen, um die Druckdifferenz so zu regulieren, daß dann, wenn die Druckdifferenz den vorgegebenen Wert überschreitet, die Reagenzlösung 76 aus dem Behälter 26 durch die Öffnung 74 ausgetrieben wird (Fig. 5).
Wenn also eine richtige Ausrichtung zwischen ausgewählten Behältern 26' mit ausgewählten Anschlüssen 22' (Fig. 6) unter Verwendung der Reihenanordnungstechnik und der neuen oben erwähnten Vorrichtung erreicht ist, können flüssige Reagenzien in ausgewählten Behältern 26' abgelegt werden. Die abgelegten Reagenzlösungen sammeln sich quer über der genau bemessenen Öffnung 74 in Kombination mit einer relativ kleinen Druckdifferenz (nicht größer als der vorgegebene Wert), um einen Meniskus über der Öffnung 74 zu bilden und um eine kapillare Flüssigkeitsabdichtung zu schaffen, damit die Lösung in dem Behälter zurückgehalten wird, ohne durch die Öffnung abzulaufen. Diese Dichtung trennt die gemeinsame Reaktionskammer in wirksamer Weise von der Umgebung des darunter befindlichen Auffangbassins 81. Wenn eine ausreichende Zeit abgelaufen ist, um die Synthesereaktion abzuschließen (insgesamt etwa eine Minute), wird die Reagenzlösung aus dem Behälter 26 durch die Öffnung 74 und in das untere Auffangbassin 81 durch Erhöhen der Gasdruckdifferenz über den vorgegebenen Betrag entleert, wodurch die Kapillarkräfte in der Öffnung überwunden werden (Fig. 5). Danach können die abgeführten Reagenzlösungen aus dem Auffangbassin durch einen Abflußauslaß 83 abgezogen werden. Dieses Verfahren wird für jeden Synthesezyklus (d. h. Entblockungs-, Wasch-, Kupplungs-, Kappen- und Oxidierungsschritte) wiederholt, bis das gewünschte definierte Synthesepolymer hergestellt ist.
In dem Boden des Behälters 26 zwischen der Öffnung 74 und dem festen Träger 75 ist eine insgesamt mit 84 bezeichnete Rückhaltevorrichtung vorgesehen, die so ausgebildet und bemessen ist, daß sie einen Durchgang des festen Trägers durch die Öffnung im wesentlichen verhindert. Die Rückhaltevorrichtung 84 wird vorzugsweise von einer Fritte aus Polyethylen- oder Glasfaser gebildet, die als eine Filtermembran wirkt, welche den Durchfluß der Reagenzlösung ermöglicht, während der feste Träger und die darauf gewachsene Polymerkette in dem Behälter zurückgehalten werden. Die Porosität der Fritte ist ebenfalls ein Faktor bei der Ausbildung der kapillaren Flüssigkeitsdichtung und bei der Bestimmung der Druckdifferenz, die zum Entleeren des Reaktionsbehälters erforderlich ist.
Zur Regulierung und Steuerung der Druckdifferenz zwischen der gemeinsamen Kammer 31 und dem unteren Auffangbassin 81 ist, wie erwähnt, eine Druckreguliervorrichtung 82 vorgesehen, die funktionsmäßig dazwischengeschaltet ist. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist die Druckreguliervorrichtung 82 in einem Stück mit der Gasstromanordnung ausgebildet, die zum Ausspülen von Reagenzgiftstoffen aus dem Kopfraum in der gemeinsamen Kammer 31 verwendet wird. Nach dem freien Ausspülen der Kammer durch Inertgas vom Gaseinlaß 70 zum Gasauslaß 71 wird die minimale Druckdifferenz im allgemeinen zwischen etwa 1/100 psi bis etwa 1/10 psi gehalten. Diese Druckdifferenz ist ausrei chend positiv, um ein Einsickern von Umgebungsluft in die gemeinsame Kammer zu unterbinden, reicht jedoch nicht aus, um die Kapillarkräfte der kapillaren Flüssigkeitsdichtung in jedem Behälter zu überwinden. Durch Unterbindung oder Beschränkung des Ausstroms von Inertgas durch den Gasauslaß 71 kann der Druck in der Kammer 31 erhöht werden, wodurch die Druckdifferenz zum Entleeren der Behälter (Fig. 5) gesteigert wird, wenn der Druck im Auffangbassin nicht mit dem gleichen Wert oder mehr gesteigert wird.
Die Druckreguliervorrichtung 82 hat deshalb ein Kammerventil 85 (Fig. 1), das mit dem Gasauslaß 71 verbunden ist, um den Abstrom von die gemeinsame Kammer 31 spülendem Inertgas zu steuern. Durch ausreichendes Fließen oder Drosseln des Stroms durch das Kammerventil 85 kann dementsprechend die Druckdifferenz über den vorgegebenen Wert erhöht werden, so daß die Behälter gleichzeitig Reagenzlösung entleeren können. In gleicher Weise kann durch ausreichendes Öffnen des Kammerventils 85 die Druckdifferenz unter den vorgegebenen Wert abgesenkt werden, wenn man die abgelegte flüssige Lösung in den ausgewählten Behältern zurückhalten möchte.
Die flüssige Reaktionslösung fließt nicht im Leckstrom aus der Behälteröffnung 74 ab oder entleert sich aus ihr, bis eine ausreichende Flüssigkeitssäule in dem Behälter oder eine ausreichende Gasdruckdifferenz zwischen der gemeinsamen Kammer und dem unteren Auffangbassin vorhanden ist, um die Kapillarkräfte in der Öffnung zu überwinden. Die Größe des schwerkraft- und druckbedingten Leckstroms aus der Öffnung wird hauptsächlich durch die Viskosität des Lösungsmittel, die Porosität der Fritte, die Größe der Öffnung und die Gasdruckdifferenz bestimmt. Beispielsweise tragen eine 10-u-UHMW-Polyethylenfritte und eine Öffnung mit 0,04 cm² (0,015 in²) eine Flüssigkeitssäule von wenigstens 2,0 cm (0,79 Zoll) aus Acetonitril (mit einer Viskosität von etwa 0,345 Centipoise (7,2 · 10&supmin;&sup5; (lbf · s)/ft2) bei einer Betriebstemperatur von etwa 20ºC (68ºF)), bevor ein Überwinden der Kapillarkräfte in der Öffnung beginnt. Andererseits stellt sich durch Erhöhen der Druckdifferenz über den vorgegebenen Wert (insgesamt etwa 6895 Pa (1 psi) bis etwa 34474 Pa (5 psi)) ein schnelles Entleeren des Behälters ein. In der Praxis ist es erforderlich, eine Druckdifferenz zwischen etwa 17237 Pa (2,5 psi) und etwa 34474 Pa (5 psi) aufrechtzuerhalten, um die Reagenzlösung gleichzeitig aus den Reaktionsbehältern in ausreichendem Maße abzuführen. Wenn sich die einzelnen Behälter zu leeren beginnen, nimmt der Durchsatz an Inertgas durch die leeren Behälter der Mikrotiterplatte merklich zu, wodurch der Druck in der gemeinsamen Kammer 31 abnimmt. Diese Abnahme des Innendrucks verringert dementsprechend den Entleerung- oder Ablaufstrom der Reagenzlösung durch die Öffnungen, wobei der Effekt durch die rückhaltende Filtermembran 84 verstärkt wird.
Natürlich kann die Druckdifferenz auch durch Ausbildung eines Vakuums im unteren Auffangbassin 81 zum Entleeren der Reaktionsbehälter erzeugt werden. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß eine Zugangsöffnung 86 in das untere Auffangbassin 81 durch einen Deckel 87 abgedichtet werden kann und daß ein Ablaufauslaß 83 mit einer Vakuumpumpe verbunden werden kann, die in dem Bassin ein Vakuum erzeugt. Die Druckdifferenz kann also auch aus einer Kombination von Überdruck in der gemeinsamen Kammer 31 und einem Vakuum in dem Auffangbassin 81 erzeugt werden. Da sich die Reagenzlösung in dem Reaktionsbehälter für eine Reaktion anstelle eines kontinuierlichen Strömens durch die Kammer, wie es bei einigen bekannten Anordnungen verwendet wird, ansammeln kann, wird der Verbrauch an Reagenz wesentlich minimiert, was Kosten spart. Die Laborkosten werden durch Minimierung jeder Zykluszeit ebenfalls reduziert.
Um alle gleichzeitigen Wirkungen zu koordinieren, ist zwischen den Transportmechanismus 27, die Ventilanordnungen 55 und die Druckreguliervorrichtung 82 ein Steuermechanismus 90 (Fig. 7) funktionsmäßig geschaltet. Es kann eine Ablaufdatei eingegeben werden, die eine geordnete Liste der Behälterposition, des Maßstabs, eine abschließende Entblockungsinstruktion und die ATGC- und N-(ungerade Base)-Sequenz für jedes Oligonucleotid enthält. Die Datei wirkt mit einer Steuerdatei zusammen, die zur Anzeige der tatsächlichen Anzahl und Reihenfolge der Entblockungs-, Wasch-, Kupplungs-, Kappen-, Oxidierungsschritte und der Länge der Zeit für Warteschritte und Druck und/oder Vakuum für Abzugsschritte verwendet wird, welche den kompletten Kupplungszyklus bilden.
Oligonucleotide werden gewöhnlich auf festen Trägern aus gesteuertem Porenglas (CPG) synthetisiert, wobei das erste Nucleotid vorher mit dem CPG durch die 3'-Succinat-Verbindung verknüpft ist. Bei der Vorbereitung der Polymersynthese wird deshalb jeder Behälter individuell mit dem richtigen CPG-Derivativ geladen. Obwohl man mit einer vollen Syntheseplatte unter Verwendung nur eines CPG-Derivativs, beispielsweise T (d. h. dT-Icaa-CPG), beginnen könnte, möchte man eine Reihensynthese durchführen, bei der sich irgendeine Base in der ersten Position befinden kann. Das individuelle Abwiegen und Überführen von Mengen von 0,5 mg von geeignetem trockenen CPG- Derivativ auf jeden Behälter kann umständlich und zeitraubend sein.
Bei der vorliegenden Erfindung wird zum Abscheiden der genauen Menge von CPG in einen Reaktionsbehälter eine Technik mit einer Aufschlämmung mit ausgeglichener Dichte verwendet. Durch Suspendieren des CPG in einer Suspensionslösung kann eine gewünschte Menge von CPG durch Pipettieren, entweder automatisch oder von Hand, eines entsprechenden Volumens der Suspensionslösung in einem Behälter genau abgelegt werden. Beispielsweise kann eine sich nicht absetzende 10%→1% Gewichts-/Volumensuspension von CPG in einer 2,5 : 1-Volumen-/Volumen-Dibrommethan- Dichlormethan-Lösung hergestellt werden. Danach kann vor der Synthese unter Verwendung der oben erwähnten Technik das CPG aus der Suspensionslösung gewaschen und entfernt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese einer Polymerkette bereitgestellt, welches die Schritte aufweist:
A) Ausrichten eines Reaktionsbehälters 26 und eines ausgewählten Anschlusses 22 der Synthesevorrichtung 20 durch den Transportmechanismus 27, der mit wenigstens einer Kopfanordnung 21 und einer Basisanordnung 25 verbunden ist, um eine Relativbewegung dazwischen zu erzeugen,
B) Abscheiden eines flüssigen Reagenz 24 in einen Behälter 26 aus einem Reagenzspeicher 23 durch einen Anschluß, um die Synthese einer Polymerkette zu ermöglichen, und schließlich
C) Ausspülen von giftigen Dämpfen, die von den Reagenzien emittiert werden, aus der gemeinsamen Kammer 31 durch Führen eines Gases aus einer Druckgasquelle, die mit einem Einlaß 70 in die gemeinsame Kammer 31 verbunden und stromauf von den Anschlüssen angeordnet ist, und aus der gemeinsamen Kammer durch einen Auslaß 71 heraus, der stromab von den Anschlüssen angeordnet ist.
Für den Aufbau einer Polymerkette durch sequentielles Zugeben von Polymereinheiten zu wenigstens einem festen Träger, um auf ihm eine Polymerkette in einem flüssigen Reagenz wachsen zu lassen und zu immobilisieren, wird ein weiteres Verfahren der Polymersynthese bereitgestellt. Das Verfahrens weist die Schritte auf
A) Abscheiden von flüssigem Reagenz 24 in einem Reaktionsbehälter 26, der eine geeignet bemessene Öffnung 74 hat, in Kontakt mit wenigstens einem festen Träger 75, wobei wenigstens eine Polymereinheit der Polymerkette auf dem festen Träger 75 festgelegt ist, und Ausbilden einer kapillaren Flüssigkeitsdichtung, um die Reagenzlösung in dem Behälter 26 zu halten, damit die Polymerkette auf dem festen Träger 75 wachsen kann, und darauf folgend
B) Anlegen eines ersten Gasdrucks an die Reaktionskammer 31 derart, daß eine Druckdifferenz zwischen dem ersten Gasdruck und einem zweiten Gasdruck, der auf einen Auslaß 80 der Öffnung 74 ausgeübt wird, den vorgegebenen Wert überschreitet, der erforderlich ist, um die kapillare Flüs sigkeitsdichtung zu überwinden und um die Reagenzlösung aus dem Behälter 26 durch die Öffnung 74 auszutreiben.
Durch Wiederholen der Schritte der beiden vorstehend erwähnten Verfahren kann eine kontinuierliche Kette von Polymereinheiten gebildet werden.
Das folgende Beispiel dient zur besseren Beschreibung der Art und Weise der Verwendung der vorstehend beschriebenen Erfindung sowie zur Darlegung der in Betracht gezogenen besten Art der Durchführung der verschiedenen Aspekte der Erfindung. Selbstverständlich dient dieses Beispiel in keiner Weise dazu, den wahren Rahmen der Erfindung zu beschränken, sondern wird nur zu Erläuterungszwecken angegeben. Selbstverständlich kann jedes Verfahren der Oligonucleotidsynthese bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Beispiel 1

Synthese einer Reihenanordnung von 15 Oligonucleotiden

Das allgemeine Synthese-Arbeitsverfahren folgt den veröffentlichten Arbeitsgängen für das Phosphoramidit- und Wasserstoffphosphonat-Verfahren der Oligonucleotidsynthese, beispielsweise Verfahren, wie sie in Oligonucleotides und Analogues: A Practical Approach, F. Eckstein, Ed. IRL Press, Oxford University; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait, Ed., IRL Press, Washington D. C.; und US-Patent Nrn. 4,458,066, 4,500,707 und 5,047,524 beschrieben sind. Selbstverständlich können bei der vorliegenden Erfindung auch andere Verfahren der Oligonucleotidsynthese verwendet werden.
Die Basisschritte der Synthesereaktion sind bei geeigneten Acetonitril-Waschschritten insgesamt die folgenden:
a) Das erste Nucleosid, das an der 5'-Position geschützt worden ist, wird auf einen festen Träger derivatisiert, gewöhnlich gesteuertes Porenglas (CPG), oder wird präderivatisiert erhalten.
b) Die Zuckergruppe des ersten Nucleosids wird unter Verwendung von Trichlor-Dichlormethan-Essigsäure als Schutz entfernt oder detrityliert, was ein farbiges Produkt ergibt, das für den Reaktionsfortschritt überwacht werden kann.
c) Das zweite Nucleotid, bei welchem die Phosphor-Zucker- und Basengruppen geschützt sind, wird der wachsenden Kette, gewöhnlich bei Vorhandensein eines Tetrazol-Katalysators, zugegeben.
d) Das erste Nucleosid, das nicht reagiert hat, wird unter Verwendung von Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol zur Vermeidung von fortdauernden Fehlern mit Kappen versehen.
e) Zur Bildung des stabilieren Phosphat-Triesters wird gewöhnlich unter Verwendung von Jodreagenzien der Phosphit- Triester oxidiert.
f) Der Prozeß wird abhängig von der gewünschten Länge des Oligonucleotids nach Bedarf wiederholt.
g) Es erfolgt das Abtrennen von dem festen Träger, wofür gewöhnlich wäßriges Ammoniak bei erhöhten Temperaturen über einen Zeitraum von Stunden verwendet wird.
Entsprechend wird eine Ablaufdatei aufgestellt, welche die 3'- 5'-Sequenz und die Behälternummer für jedes zu synthetisierende Oligonucleotid, den Maßstab der Reaktion für jedes Nucleotid anzeigt und angibt, ob am Ende der Reaktion bei dem Produkt eine abschließende Detritylierung durchgeführt werden soll. Die Software ist so ausgelegt, daß sie eine gleichzeitige unabhängige Synthese von Oligonucleotiden unterschiedlicher Längen und Maßstäbe trägt. Die Sequenz von 15 unterschiedlichen Oligonucleotiden ist in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
Es wird eine Steuerdatei erstellt, die die Folge der Reaktionsschritte enthält, die während eines Kupplungszyklus ausgeführt werden. Die Grundbefehle sind WASCHEN (Volumen), ENTBLOCKUNG (Volumen), KUPPLUNG, KAPPE, OXIDIEREN, WARTEN (Sekunden) und ABZIEHEN (Druck/Vakuumsekunden), wie es in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt ist. TABELLE 2
Es wird eine Konfigurationsdatei erstellt, welche die Betriebscharakteristika der Maschine, die Flüssigkeitsdurchsätze, die Konzentration und die Moläquivalente enthält, die für jedes der Reagenzien verwendet werden, wie es in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt ist. TABELLE 3
Es wurden Platten mit 96 Behältern verwendet, die einen konischen unteren Abschnitt haben, der zur Aufnahme einer Filterplatte mit 0,50 cm (0,196 Zoll) im Preßsitz ausgespart war. Unter dem Filter befand sich eine Krümmungsverengung und eine Kapillar-Flüssigkeitsdichtungsöffnung mit einem Durchmesser von 0,05 cm (0,020 Zoll) mal einer Länge von 0,89 cm (0,350 Zoll). Der Außendurchmesser der Kapillardichtung am Auslaßende betrug 0,09 cm (0,035 Zoll). Nach dem Einpassen in Whatman-GF/A-Filter betrug der Gasdurchsatz durch eine vollständige trockene Platte mit einem oberen Kammerdruck von 6895 Pa (1 psi) 10 l/min. Bei einem Kammerdruck von 138 Pa (0,02 psi) trägt die Kapillardichtung am Boden des Synthesebehälters eine Acetonitril-Flüssigkeitssäule von etwa 1 cm über dem Filter, bevor ein langsamer Leckstrom beginnt. Die Platten wurden aus geformtem Polypropylen hergestellt.
Jedem Behälter wird die genaue Menge von CPG mit einer derivatisierten ersten Base, entweder A, T, C oder G zugegeben. Beispielsweise wurden 0,5 mg CPG bei einer 20-Nanomol-Maßstabs-Reaktion verwendet. Die CPG-Perlen wurden einer Aufschlämmung in Dibrommethan-Chloroform zugesetzt, die in jedem Behälter pipettiert wurde. Dieser Schritt wurde in einer üblichen Laboratmosphäre vor dem Laden der Platte in die Maschine ausgeführt. Nach dem Laden der Platte in die Maschine wird ein WASCH-Acetonitril-Zyklus durchgeführt, um die Aufschlämmung auszuspülen und um festzustellen, daß alle Behälter richtig ablaufen.
Die Anschluß-Ventilspeicher wurden mit Argon gespült und dann mit frischen Reagenzien aus den Vorratsflaschen durch Drucküberführung befüllt, um eine Verunreinigung durch Luft und Wasser zu vermeiden. Die Ventilspeicher wurden dann auf den Konfigurationsdruck von 27579 Pa (4 psi) unter Druck gesetzt. Dann wurde die Anschlußverrohrung gefüllt durch Abgabe einer kleinen Menge von Flüssigkeit, wobei sich die Gleitplatte in der Reinigungsposition für jedes Reagenz befindet.
Während der Reagenzzugabe und der Reaktionswarteperioden wurde der laminare Spülgasstrom über die Reaktionskammer auf 0,4 l/min bei einem Innendruck von etwa 138 Pa (0,02 psi) einreguliert. Während des Entfernens des zugegebenen Reagenz und der Waschzyklen wurde der Kammerdruck auf ein Maximum von 34474 Pa (5 psi) erhöht. Bei 17237 Pa (2,5 psi) entleerten sich die Synthesebehälter mit einem Mengenstrom von etwa 150 λ/s.
Dann wurde die Maschine in den AUTOmatik-Modus geschaltet, um mit der tatsächlichen Synthese zu beginnen. Die Maschine pausierte während des ersten, zweiten und letzten Zyklus, um eine Sammlung der ENTBLOCKUNGS-Trityl-Produkte für eine kolorimetrische Analyse zu ermöglichen. Dies wurde dadurch erreicht, daß eine zweite 96-Behälter-Mikrotiterplatte in die untere Vakuum-/Abzugkammer unmittelbar unter die kapillaren Austrittsenden der Syntheseplatte geschoben wurde. Unter Verwendung eines Plattenlesers wurde die optische Dichte der Detritylierungslösung bei 490 nm gelesen. Der Wert für den ersten Zyklus bestätigte die Menge des in einen Behälter geladenen CPG, und ein Vergleich des zweiten Zyklus mit dem letzten Zyklus erlaubte eine Berechnung des Synthesekupplungswirkungsgrads. Der letzte Zykluswert zeigte auch die Oligonucleotidmenge, die man nach der Seitenketten-Schutzgruppenentfernung durch Ammoniakabspaltung erhält.
Nachdem die Maschine die Synthese in allen Behältern abgeschlossen hat, wird die Syntheseplatte aus der Maschine entfernt. Die Syntheseplatte wird auf der Oberseite einer zweiten 96-Behälter-Deprotektor-Platte (Beckman Tiefbehälter-Titerplatte 267001) gestapelt. Die Oligonucleotide wurden von dem Träger durch Pipettieren von 200 ul konzentrierter NH&sub4;OH in jeden Behälter abgelöst, worauf eine Inkubation bei 25ºC für 15 min erfolgt. Die Ammoniak-Abspaltungslösungen wurden durch das Filter und den Kapillarauslaß in die Behälter der Schutzgruppenentfernungsplatte durch Druck, Vakuum oder vorzugsweise kurzes Zentrifugieren des Stapels herausgespült. Dieser Abspaltschritt wurde zweimal mit frischen Aliquots von Ammoniak wiederholt.
Wenn die für die Synthese verwendeten Phosphoramidite Benzoyl- und Isobutyryl-Schutzgruppen hatten, wurde die abschließende Schutzgruppenentferung durch Erhitzen des rohen Ammoniakabspaltprodukts abgeschlossen. Die Behälter der Schutzgruppenentfernungs-Titerplatte wurden mit einer mit Vertiefungen versehenen Siliconkautschukkappe (Beckman 267002) abgedichtet und die Kappen an Ort und Stelle unter Verwendung einer federbelasteten Plattenpresse gehalten. Die abgedichtete Vorrichtung wurde in einem Luftofen oder Wasserbad über 8 bis 15 Stunden auf 55ºC gehalten und dann in einem Eisbad abgekühlt. Die Schutzgruppenentfernungsplatte wurde von der Presse entfernt und vor dem Entfernen der Kappe kurz zentrifugiert.
Die Ammoniaklösung wurde dann bis zur Trockenheit unter Verwendung eines Savant 210 Speed Vac, die mit einem Mikroplattenrotor versehen war, verdampft. Die so erhaltenen Oligonucleotidtabletten waren insgesamt ausreichend rein für eine direkte Verwendung in den meisten Sequenz-Primer- und PCR-Anwendungen. Die Oligonucleotidmenge, die durch die letzte Trityl- Prüfung vorhergesagt wurde, wurde durch eine optische Dichte bei 260 nm und die Homogenität des Produkts verifiziert, die durch HPLC oder Kapillargel-Elektrophorese geprüft wurde. Die Kapillar-Elektrophorese-Analyse wurde auf einem Applied Biosystems 270A-Gerät nach dem Herstellerprotokoll für Oligonucleotide 14 und 15 aus dem obigen Versuch durchgeführt und sind in den Fig. 8A bzw. 8B gezeigt. Typische Ausbeuten für eine 20- Nanomol-Maßstab-Synthese eines 20-mer kann 2,5 OD (85 Mikrogramm) betragen.

Claims

1. Polymersynthesevorrichtung (20) zum Aufbau einer Polymerkette durch sequentielle Zugabe von Polymereinheiten zu einem festen Träger (75) in einem flüssigen Reagenz (76)

- mit einer Basisanordnung (25), die einen Reaktionsbehälter (26) und wenigstens eine Öffnung (74) aufweist, die sich in den Behälter (26) erstreckt,

- mit wenigstens einem in dem Behälter (26) angeordneten festen Träger (75) zum Wachsen und Immobilisieren einer Polymerkette auf ihm,

- mit einer Reagenzlösung (76) in dem Behälter (26) in Kontakt mit dem festen Träger (75) und mit wenigstens einer Polymereinheit der Polymerkette, die an dem festen Träger (75) festgelegt ist,

- mit einer Rückhalteeinrichtung (84), die in dem Behälter (26) angeordnet und so ausgebildet und bemessen ist, daß sie den Durchgang des festen Trägers (75) durch die Öffnung (74) im wesentlichen unterbindet,

- wobei die Öffnung (74) einen Einlaß (77) in den Behälter (26) und einen Auslaß (80) sowie eine solche Größe und Abmessung hat, daß eine Kapillar-Flüssigkeitsdichtung gebildet wird, um die Reagenzlösung (76) in dem Behälter (26) zur Ermöglichung des Polymerkettenwachstums darin zurückzuhalten, wenn eine Druckdifferenz zwischen einem ersten auf den Reaktionsbehälter (26) ausgeübten Gasdruck und einem zweiten auf den Öffnungsauslaß (80) ausgeübten Gasdruck geringer ist als eine vorgegebene Größe,

- mit einer Druckreguliereinrichtung (82) zum Regulieren der Druckdifferenz derart, daß, wenn die Druckdifferenz die vorgegebene Größe überschreitet, die Reagenzlösung (76) aus dem Behälter (26) durch die Öffnung (74) ausgetrieben wird, und

- mit einem oberen Kammermechanismus (21), der mit einer Oberseite (52) der Basisanordnung (25) so zusammenwirkt, daß eine obere, den Reaktionsbehälter darin einschließende Kammer (31) gebildet wird, wobei die Reguliereinrichtung (82) mit der oberen Kammer (31) zum Regulieren der Druckdifferenz in Verbindung steht.

2. Polymersynthesevorrichtung (20) nach Anspruch 1, welche weiterhin eine Druckgasquelle aufweist, die mit einem Einlaß (70) in die obere Kammer (31) verbunden und stromauf von der Öffnung (74) angeordnet ist, wobei die obere Kammer (31) einen Auslaß (71) aus der oberen Kammer (31) hat, der stromab von der Öffnung (74) angeordnet ist, wodurch von der Reagenzlösung (76) emittierte giftige Dämpfe aus der oberen Kammer (31) durch Führen eines Gases aus der Druckgasquelle durch die obere Kammer (31) weggespült werden.

3. Polymersynthesevorrichtung (20) nach Anspruch 2, bei welcher die Reguliereinrichtung (82) weiterhin ein mit dem Auslaß (71) verbundenes Kammerventil (85) aufweist, das den Gasabstrom aus der Kammer (31) abhängig vom Anstieg der Druckdifferenz über die vorgegebene Größe oder abhängig von einem Absinken der Druckdifferenz unter die vorgegebene Größe steuert.

4. Polymersynthesevorrichtung (20) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher die Rückhalteeinrichtung (84) ein Filterelement aufweist, das in dem Behälter (26) zwischen der einen Öffnung (74) und dem Tragaufbau angeordnet ist.

5. Polymersynthesevorrichtung (20) nach Anspruch 4, bei welcher das Filterelement (84) und die Öffnung (74) so zusam menwirken, daß die Kapillar-Flüssigkeitsdichtung gebildet wird.

6. Polymersynthesevorrichtung (20) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche weiterhin einen unteren Kammermechanismus (81) aufweist, der mit einer Unterseite der Basisanordnung (25) so zusammenwirkt, daß eine untere Kammer gebildet wird, in der die Öffnung (74) eingeschlossen ist, wobei die Reguliereinrichtung (82) mit der unteren Kammer zur Regulierung der Druckdifferenz in Verbindung steht.

7. Syntheseverfahren zum Aufbau einer Polymerkette durch sequentielle Zugabe von Polymereinheiten zu wenigstens einem festen Träger (75) zum Wachsen und Immobilisieren einer Polymerkette darauf in einem flüssigen Reagenz (76), wobei das Verfahren die Schritte aufweist:

A) Einbringen eines flüssigen Reagenz (76) in einen Reaktionsbehälter (26) in Kontakt mit wenigstens einem festen Träger (75) und Einbringen wenigstens einer Polymereinheit der Polymerkette, die an dem festen Träger (75) festgelegt ist, wobei der Behälter (26) wenigstens eine sich in ihn erstreckende Öffnung (74) und eine solche Größe und Abmessung hat, daß eine Kapillar-Flüssigkeitsdichtung gebildet wird, um die Reagenzlösung (76) in dem Behälter (26) zur Ermöglichung des Wachsens der Polymerkette auf dem festen Träger (75) zurückzuhalten,

B) Anlegen eines ersten Gasdrucks an den Reaktionsbehälter (26) derart, daß eine Druckdifferenz zwischen dem ersten Gasdruck und einem zweiten an einem Auslaß (80) der Öffnung (74) ausgeübten Gasdruck eine vorgegebene Größe überschreitet, die erforderlich ist, um die Kapillar-Flüssigkeitsdichtung aufzuheben und die Reagenzlösung (76) aus dem Behälter (26) durch die Öffnung (74) auszutreiben, und

C) Ausspülen von giftigen, von der Reagenzlösung (76) emittierten Dämpfen aus einer gemeinsamen, den Reaktionsbehälter (26) einschließenden Kammer (31) durch Führen eines Gases von einer Druckgasquelle, die mit einem Einlaß (70) in die Kammer (31) verbunden und stromauf von dem Reaktionsbehälter (26) angeordnet ist, uhd aus der Kammer (31) durch einen Auslaß (71) heraus, der von der gemeinsamen Kammer (31) weg geht und stromab von dem Reaktionsbehälter (26) angeordnet ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, welches weiterhin den Schritt aufweist, die Druckdifferenz durch eine Druckreguliereinrichtung (82) abhängig vom Anstieg der Druckdifferenz über die vorgegebene Größe oder vom Absinken der Druckdifferenz unter die vorgegebene Größe zu steuern.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, welches weiterhin den Schritt aufweist, die Schritte A), B) und C) zu wiederholen, um wenigstens eine fortlaufende Kette von Polymereinheiten zu bilden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches weiterhin das Bereitstellen einer Anordnung von Reaktionsbehältern (26), von denen jeder von der gemeinsamen Kammer (31) umschlossen ist, und das Ausführen der Schritte A) bis C) für jeden Reaktionsbehälter aufweist.