DE60032910T3

DE60032910T3 - Mittel zum nachweis und zur behandlung von krankheiten die in verbindung stehen mit fgfr3

Info

Publication number: DE60032910T3
Application number: DE60032910T
Authority: DE
Inventors: David Cappellen; Dominique Chopin; Francois Radvanyi; David Ricol; Jean-Paul Thiery
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-04
Publication date: 2010-07-29
Anticipated expiration: 2020-05-05
Also published as: AU5214500A; EP1208231A2; EP1208231B1; CA2372990A1; ES2280218T3; WO2000068424A3; CA2372990C; WO2000068424A2; ES2280218T5; DE60032910D1; DE60032910T2; EP1208231B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Mittel, d. h. Verfahren und Wirkstoffe, zum Nachweisen bzw. Behandeln von Pathologien, die mit FGFR3 und/oder dem FGFR3-Stoffwechselweg verknüpft sind.
Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 (FGFR3) gehört zu einer Familie von strukturell verwandten Tyrosin-Kinase-Rezeptoren (FGFRs 1–4), die von vier verschiedenen Genen codiert werden. Diese Rezeptoren sind Glycoproteine, die aus zwei bis drei extrazellulären immunglobulin(Ig)artigen Domänen, einer Transmembrandomäne und einer aufgespaltenen Tyrosin-Kinase-Domäne zusammengesetzt sind. Alternatives mRNA-Spleißen führt zu vielen verschiedenen Rezeptorvarianten. Die Isoformen FGFR3-IIIb und FGFR3-IIIc resultieren aus sich gegenseitig ausschließenden Spleißereignissen, bei denen die zweite Hälfte der juxtamembranen Ig-artigen Domäne entweder von dem 151 Nucleotide langen Exon 8 (IIIb-Variante) oder dem 145 Nucleotide langen Exon 9 (IIIc-Variante) codiert wird.
Spezifische Punktmutationen im FGFR3-Gen, die verschiedene Domänen des Proteins beeinflussen, sind mit autosomal dominanten Störungen des menschlichen Skeletts assoziiert, wie Hypochondroplasie, Achondroplasie, schwerer Achondroplasie mit Entwicklungsverzögerung und Acanthosis nigricans sowie thanatophorer Dysplasie. Mehrere Berichte haben gezeigt, dass diese Mutationen zu einer konstitutiven Aktivierung des Rezeptors führen. Berücksichtigt man dieses Ergebnis zusammen mit der Skelettwucherung, die man bei in Bezug auf Nullallele von Fgfr3 homozygoten Mäusen beobachtet, so erscheint FGFR3 als negativer Regulator des Knochenwachstums.
Im Gegensatz zu dieser hemmenden Rolle wurde auch eine onkogene Rolle von FGFR3 bei der Entwicklung von multiplem Myelom (MM) vorgeschlagen. Bei dieser malignen Proliferation von Plasmazellen ist in 20–25% der Fälle eine chromosomale Translokation t(4;14)(p16.3;g32.3) mit Bruchpunkten, die sich 50 bis 100 kb zentromer zu FGFR3 befinden, vorhanden und ist mit einer Überexpression von FGFR3 assoziiert.
In sehr seltenen Fällen (2 von 12 MM-Zelllinien und 1 von 85 primären MM-Tumoren) wurden aktivierende Mutationen von FGFR3, die zuvor bei Störungen des menschlichen Skeletts identifiziert wurden, gefunden, die aber stets von der t(4;14)(p16.3;g32.3)-Translokation begleitet wurden.
Durch Untersuchung verschiedener Krebserkrankungen fanden sie Erfinder überraschenderweise eine Rolle von FGFR3 bei Krebserkrankungen, die auf Epithelgewebe zurückgehen, d. h. Karzinome.
Die Beteiligung von FGFR3 bei einer solchen Entwicklung von soliden Tumoren ist mit einer konstitutiven Aktivierung verknüpft: Sie kann durch eine autokrine Schleife (Ligandenselbsterzeugung) und/oder durch Aktivieren von Mutationen in FGFR3 aktiviert werden. Überraschenderweise findet man solche Mutationen in primären Tumoren, und es handelt sich um somatische Mutationen (Mutationen der genomischen DNA).
Bisher ist die einzige FGFR3-Isoform, die in Epithel identifiziert wurde, die FGFR3-IIIb-Isoform.
Die Erfindung bezieht sich also auf ein Verfahren zum Nachweisen von humanen Blasenkarzinomen.
Gemäß einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auch auf die Verwendung von inhibitorischen Anti-FGFR3-Antikörpern zur Herstellung von Wirkstoffen, mit denen humane Blasenkarzinome behandelt werden können.
Transgene Tiere, mit deren Hilfe die Effizienz solcher Wirkstoffe getestet werden kann, werden beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung zum Nachweisen von humanen Blasenkarzinomen in einer biologischen Probe, die aus Blasengewebe und Urin ausgewählt ist, umfasst das Identifizieren von FGFR3-aktivierenden Mutationen.
Für eine solche Identifizierung können Standardverfahren angeendet werden, wie Immunhistochemie oder der Nachweis der entsprechenden RNA, DNA und des codierten Proteins, die in der Probe enthalten sind, insbesondere nach deren Extraktion. Eine gemeinsame Methode für einen solchen Nachweis umfasst das Amplifizieren durch PCR, RT-PCR oder RT-PCR-SSCP (Einzelstrang-Konformationspolymorphismus) mit FGFR3-spezifischen Primern und das Nachweisen der Amplifikationsprodukte gemäß den üblichen Verfahren. Eine entsprechende Ausführungsform wird in den im Folgenden angegebenen Beispielen beispielhaft erläutert. Eine weitere gemeinsame Methode umfasst die Verwendung von Antikörpern und den Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einer geeigneten Markierung.
Die aktivierende Funktion einer Mutation kann durch die Beobachtung von aktivierenden Signalen, wie Rezeptor-Phosphorylierung, Zellproliferation (z. B. Thymidin-Einbau) oder indirekten Wirkungen, wie Einfließen von Calcium, Phosphorylierung von Zielsequenzen, bestimmt werden.
Insbesondere umfasst die Identifizierung das Suchen nach Einzelnucleotidmutationen in der genomischen DNA und/oder ihren Produkten, d. h. RNA, Protein, wobei der Ausdruck ”Produkt” auch cDNA umfasst.
Insbesondere umfasst das Verfahren das Suchen nach Mutationen, die Cysteinreste in den extrazellulären oder der Transmembrandomäne des Rezeptors erzeugen.
Alternativ dazu oder in Kombination mit der obigen Ausführungsform umfasst es das Suchen nach Mutationen, die zu wenigstens einer Aminosäuresubstitution in der Kinase-Domäne des Rezeptors führen.
Insbesondere umfasst das Verfahren der Erfindung das Suchen nach Mutationen in Exon 7, das die Verbindung zwischen den immunglobulinartigen Domänen II und III von FGFR3 codiert, in Exon 10, das die Transmembrandomäne codiert, in Exon 15, das die Tyrosin-Kinase-Domäne I codiert, und/oder in dem Exon, das den C-terminalen Teil codiert.
Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren der Erfindung das Suche nach Fehlsinnmutationen, wie sie bei thanatophorer Dysplasie, NSC, Achondroplasie, SADDAN (”severe achondroplasia with developmental delay and acanthosis nigricans schwere Achondroplasie mit Entwicklungsverzögerung und Acanthosis nigricans) oder Hypochondroplasie.
Solche FGFR3-aktivierenden Mutationen umfassen insbesondere R248C, S249C, G372C, S373C, Y375C, K652E, K652M, 3809G, 3809C, 3809R, J809L, P250R, G377C, G382R, A393E, N542K (die Codons sind gemäß dem offenen Leseraster der FGFR3-IIIb-cDNA nummeriert).
Die folgenden FGFR3-aktivierenden Mutationen werden besonders identifiziert: R248C, S249C, G372C, K652E und Y375C.
Das Verfahren ist für den Nachweis von humanen Blasenkarzinomen geeignet. Ein großes Problem bei oberflächlichem Harnblasenkrebs besteht darin, Tumoren, die fortschreiten, von solchen, die dies nicht tun, zu unterscheiden. Es wird erwartet, dass Einsichten in die genetischen und epigenetischen Veränderungen, die an Harnblasenkrebs beteiligt sind, geeignete Informationen liefern, um diese Unterscheidung zu erleichtern. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung Mittel bereit, um das Dilemma zwischen einer harnblasenschonenden Strategie und einer Zystektomie zu lösen, und trägt zu einer individuelleren intravesikalen Instillation und endoskopischen Überwachungsmethode bei.
Wie die in den Beispielen angegebenen Ergebnisse zeigen, scheint FGFR3 bei Ta-T1-Harnblasenkarzinomen tatsächlich ein wichtiges Onkogen zu sein. Die FGFR3-aktivierenden Mutationen scheinen häufig mit Tumoren assoziiert zu sein, die nicht fortschreiten. Eine Multivarianzanalyse zeigte, dass der FGFR3-Mutationsstatus weiterhin geeignet ist, um statistisch signifikant die Gutartigkeit vorherzusagen. FGFR3-Mutationen liefern also eindeutige Informationen, die Stadium und Grad ergänzen können. Die Verwendung dieser aktivierenden Mutationen allein und/oder in Kombination mit anderen Faktoren, anhand derer sich die Aggressivität von Tumoren vorhersagen lässt, liefert dann relevante prognostische Informationen.
Das Verfahren könnte auch verwendet werden, um zum Beispiel Gebärmutterhals-, Lungen-, Brust-, Kolon- und Hautkrebs nachzuweisen.
Das Nachweisverfahren gemäß der Erfindung lässt sich auf die Diagnose von humanen Blasenkarzinomen sowie auf die Prognose oder das Follow-Up der Effizienz einer Therapie anwenden.
Das Verfahren wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem man Kits verwendet, die die geeigneten Reagentien und eine Gebrauchsanweisung umfassen.
Offenbart wird hier die Herstellung von Wirkstoffen mit einer antiproliferativen Wirkung auf Karzinomzellen. Solche Wirkstoffe umfassen als aktive Prinzipien Mittel, die durch Hemmung der Synthese von FGFR3-DNA oder durch Hemmung ihrer Expressionsprodukte (RNA, Proteine) wirken. Insbesondere enthalten solche Wirkstoffe Tyrosin-Kinase-Inhibitoren, die für FGFR3 spezifisch sind.
Gemäß einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegenden Erfindung auf inhibitorische Antikörper, die gegen FGFR3 und insbesondere gegen wenigstens eine extrazelluläre Ig-artige Domäne davon gerichtet sind. Vorteilhafterweise sind die inhibitorischen Antikörper spezifisch für FGFR3-IIIb. Bevorzugte inhibitorische Antikörper sind monoklonale Antikörper und insbesondere Antikörper, die so modifiziert sind, dass sie in einem menschlichen Körper keine immunogenen Reaktionen induzieren (z. B. humanisierte Antikörper). Die inhibitorischen Antikörper der Erfindung werden für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von humanen Blasenkarzinomen verwendet.
Beschrieben werden auch weitere geeignete Inhibitoren, die Antisense-Oligonucleotide umfassen, welche gegen eine Wildtyp- oder mutierte FGFR3-Isoform gerichtet sind.
Die Verabreichung und Dosierung der Inhibitoren wird vom Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Karzinom, dem Gewicht und Alter des Patienten bestimmt. Zum Beispiel werden Antikörper auf dem Injektionsweg verabreicht.
Beschrieben werden hier sehr interessante Mittel zum Nachweisen und Behandeln von Karzinomen, wobei berücksichtigt wird, dass Krebserkrankungen, die auf Epithelgewebe zurückgehen (Karzinome), ungefähr 90% der malignen Neoplasmen darstellen.
Offenbart werden Zelllinien, die mutierte Formen von FGFR3 exprimieren können. Insbesondere werden S249C-mutierte FGFR3-Formen offenbart. So wurden T24-Zelllinien, die S249C-mutierte FGFR3-Formen konstitutiv exprimieren, und HeLa-Zelllinien, die S249C-mutierte FGFR3-Formen induzierbar exprimieren, erhalten (siehe zum Beispiel Lit. (6)).
Als man Nacktmäusen solche Zelllinien injizierte, wurde eine erhöhte Tumorigenität beobachtet.
Solche Zelllinien sind in vitro (Follow-Up der Rezeptor-Phosphorylierung) oder in vivo (Untersuchung der Tumorigenität von Nacktmäusen) geeignet, um die inhibitorische Wirkung gegen FGFR3 zu untersuchen.
Zelllinien, die mit FGFR2, FGFR1 oder FGFR4 transfiziert sind, sind besonders gut für die Untersuchung der Spezifität von zu testenden Inhibitoren geeignet.
Offenbart werden auch Konstrukte, die durch Transgenese eine mutierte FGFR3-Form in Epithelien exprimieren können, und auf die so erhaltenen transgenen Tiere, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie solche Konstrukte umfassen.
Beispiele für Konstrukte, die für die Injektion in Keimzellen von Tieren vorgesehen sind, umfassen einen Kerstin-Promotor, insbesondere Kerstin-14-Promotor, und cDNA von mutiertem FGFR3.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden in den folgenden Beispielen angegeben, wobei Bezug genommen wird auf:
die 1A bis 1B, die in primären Tumoren FGFR3-IIIb-Gen-aktivierende Mutationen ergeben;
die 2A bis 2E, die sich auf FGFR3-IIIb-Wildtyp-(2A) und mutierte proonkogene (2B–2T) Sequenzen beziehen. Es sei angemerkt, dass die Sequenzen der 2B bis 2T als solche in den Umfang der Erfindung fallen. Überall entlang der Sequenz kann es stumme Polymorphismen geben, so dass es für jede Mutante tatsächlich mehrere mögliche Sequenzen geben kann; und
die 3a und 3b, die jeweils a) progressionsfreie Kaplan-Meier-überlebenskurven gemäß FGFR3-Mutationen (gestrichelte Linie: mutiertes FGFR3, durchgezogene Linie: nichtmutiertes FGFR3; Log-Rank-Test, p = 0,014) und b) krankheitsspezifische Kaplan-Meier-überlebenskurven gemäß FGFR3-Mutationen (gestrichelte Linie: mutiertes FGFR3, durchgezogene Linie: nichtmutiertes FGFR3; Log-Rank-Test, p = 0,007) darstellen.
Beispiel 1: FGFR3-Genmutationen in Harnblasen- und Zervixkarzinom
FGFR3-IIIb- und FGFR3-IIIc-Transcriptkonzentrationen wurden durch Reverse-Transcription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bei 76 primären Harnblasenkarzinomen und 29 primären invasiven Zervixkarzinomen untersucht.
FGFR3-IIIb, die einzige Isoform, die signifikant exprimiert wird, wurde bei 72 von 76 (94%) Harnblasenkarzinomen und 27 von 29 (93%) Zervixkarzinomen nachgewiesen.
Dann wurde eine PCR-SSCP-Analyse sowohl mit revers transcribierter RNA als auch mit genomischer DNA durchgeführt, um nach FGFR3-codierenden Sequenzvarianten in 26 Harnblasen- und 12 Zervixkarzinomen, die das Gen exprimieren, zu suchen. Die Ergebnisse sind in den 1a und 1b gezeigt, die die Identifizierung von FGFR3-Genmutationen in humanen Karzinomen angeben:

– a: gibt die Identifizierung von somatischen Mutationen durch direkte Sequenzierung von PCR-Produkten an. Normal: konstitutive DNA; Tumor: Tumor-DNA.
– b: gibt FGFR3-Mutationen an, die mit Störungen und Krebserkrankungen des Skeletts assoziiert sind.

Die schematische Struktur von FGFR3 ist gezeigt (Ig I–III: immunglobulinähnliche Domänen; TM: Transmembrandomäne; TK-1 und -2: Tyrosin-Kinase-Domänen), und die Stellen der bekannten humanen Fehlsinnmutationen, die mit thanatophorer Dysplasie (TD) und schwerer Achondroplasie (SADDAN), Harnblasen- und Zervixkarzinom (carc.) und multiplem Myelom (MM) assoziiert sind, sind angegeben. Übliche Aminosäureabkürzungen werden verwendet, um die Mutation, die man in der jeweiligen pathologischen Situation findet, hervorzuheben. Die Mutationen an Codon 807, die für TD verantwortlich gemacht werden, ersetzen ein Stopcodon (J) durch eine Aminosäure (G, C, R oder L), und die mRNA wird somit weiter translatiert, bis ein anderes im Raster liegendes Stopcodon 423 Nucleotide stromabwärts erreicht wird, was also zu einem um 141 Aminosäuren längeren Protein führt.

Bei bestimmten Proben wurden abnorm migrierende Banden beobachtet (1a), und die direkte Sequenzierung von PCR-Produkten ergab Einzelnucleotidsubstitutionen bei 9 von 26 Harnblasenkarzinomen (35%) und 3 von 12 (25%) Zervixkarzinomen (1b und Tabelle 1). Tabelle 1

Zusammenfassung von FGFR3-Genmutationen bei primären Harnblasen- und Zervixkarzinomen
Probe	Histopathologie	Codon	Nt-Position	Mutation	vorhergesagte Wirkung
1447, Harnblase	Karz., Ta G2	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
342, Harnblase	Karz., Tla G1	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
813, Harnblase	Karz., Tla G1	372	1114	GGC zu TGC	Gly zu Cys
1393.1, Harnblase	Karz., Tla G3	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
506, Harnblase	Karz., Tlb G2	372	1114	GGC zu TGC	Gly zu Cys
1084, Harnblase	Karz., Tlb G3	652	1954	AAG zu GAG	Lys zu Glu
745.1, Harnblase	Karz., T2 G3	248	742	CGC zu TGC	Arg zu Cys
1077, Harnblase	Karz., T3 G2	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
1210, Harnblase	Karz., T3 G2	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
4.13, Zervix	Karz., Stadium II	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
4.139, Zervix	Karz., Stadium II	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys
6.96.1, Zervix	Karz., Stadium II	249	746	TCC zu TGC	Ser zu Cys

Histopathologie: histopathologische Klassifikation der Tumoren (Karz.: Karzinom; TNM- und HUGO-Klassifikation werden für Harnblasen- bzw. Zervixkarzinom verwendet); Codon und mutiertes Nucleotid (Nt-Position) sind gemäß dem offenen Leseraster der FGFR3-IIIb-cDNA nummeriert.
Mutationen wurden in den folgenden Exons gefunden.

– Exon 7, das die Verbindung zwischen den immunglobulinartigen Domänen II und III von FGFR3 codiert (eine C-zu-T-Transition an Codon 248 bei Patient 745.1 und eine C-zu-G-Substitution an Codon 249 bei Patient 1447);
– Exon 10, das die Transmembrandomäne codiert (eine G-zu-T-Transversion an Codon 372 bei Patient 813);
– Exon 15, das die Tyrosin-Kinase-Domäne II codiert (eine A-zu-G-Transition an Codon 652 bei Patient 1084).

Die Analyse der dazu passenden konstitutiven DNA von den Patienten, für die solches Material verfügbar war (n = 8) bewies die somatische Natur dieser FGFR3-Mutationen (1).
Verblüffenderweise ist jede der hier identifizierten FGFR3-Fehlsinnmutationen, d. h. R248C, S249C, G372C und K652E, an thanatophorer Dysplasie (TD) beteiligt. In Anbetracht der Anwesenheit von zwei zusätzlichen Aminosäuren in der IIIb-Isoform, die in Epithelkrebserkrankungen exprimiert werden, im Vergleich zur IIIc-Isoform, die in Knochen exprimiert wird, sind die Mutationen G372C und K652E in der Tat zu den für TD verantwortlichen Mutationen G370C und K650E äquivalent.
Die S249C-Mutation war die am häufigsten beobachtete, die 5 von 9 (55%) Harnblasenkarzinomen und alle Zervixkarzinome (3 von 3, 100%), bei denen FGFR3-Genveränderungen bisher identifiziert wurden, betraf.
Die Mutationen R248C, S249C und G372/370C erzeugen Cysteinreste in den extrazellulären oder der Transmembrandomäne des Rezeptors, und die Mutation K652/650E führt zu einer Aminosäuresubstitution in der Kinase-Domäne des Rezeptors.
Beispiel 2: Inhibitoren
Eine Möglichkeit, die verschiedenen FGFR3-Inhibitoren zu testen, umfasst das Transfizieren von Zelllinien, so dass sie die mutierten Formen von FGFR3 oder Wildtyp-FGFR3 oder nur das Neomycin- oder Hygromycin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle eines starken Promotors, wie des CMV-, RSV-, SV40-Promotors, exprimieren. Die tumorigenen Eigenschaften dieser Zelllinien können dann in vitro oder in vivo in Nacktmäusen miteinander verglichen werden. Die verschiedenen Inhibitoren werden unter Verwendung dieser verschiedenen Zelllinien in vitro oder in vivo getestet. Phosphorylierung, Proliferation oder indirekte Wirkungen von FGFR3, wie Einfließen von Calcium, werden gemessen. So können daraus transgene Mäuse abgeleitet werden, die in verschiedenen Epithelien das mutierte FGFR3 exprimieren. Diejenigen Mäuse, die Tumoren entwickeln, sind geeignete Werkzeuge zum Testen der Effizienz von in Frage kommenden hemmenden Wirkstoffen. Solche transgenen Tiere fallen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 3: FGFR3-Mutationen in Ta-T1-Tumoren bei Harnblasenkrebs
Harnblasenkrebs ist eine Krankheit mit einem Spektrum von Formen und ist in hohem Maße unvorhersagbar. Zum Zeitpunkt der Anfangsdiagnose weisen ungefähr 80% der Patienten einen oberflächlichen Tumor auf. Zu den oberflächlichen Harnblasenkrebserkrankungen gehören Carcinoma in situ (Tis), Ta- und T1-Läsionen (TNM-Klassifikation). Ta/T1-Läsionen sind meistens papilläre urotheliale Karzinome: Ta-Läsionen dringen nicht in die Basalmembran ein, während T1-Läsionen in die Lamina propria eindringen, aber nicht in den Entleerungsmuskel der Blasenwand eindringen. Carcinoma in situ sind flache, cytologisch hochgradige Karzinome, die auf das Urothel beschränkt sind. Ein primäres isoliertes Carcinoma in situ ist eine sehr seltene Form und geht häufiger mit Ta/T1-Läsionen einher. Trotz einer transurethralen Resektion allein oder kombiniert mit unterstützenden intravesikalen Therapien leiden mehr als die Hälfte der Patienten mit Ta/T1-Tumoren an Rezidiven. In den meisten Fällen sind die Rezidive ebenfalls oberflächlich, aber etwa 5% der Ta- und 30–50% der T1-Tumoren schreiten in unvorhersagbarer Weise bis zur Muskelinvasion fort, mit einem hohen Risiko der Entwicklung von Metastasen und des Todes durch Blasenkrebs.
Der Umgang mit oberflächlichem Blasenkrebs beruht auf klinikopathologischen Parametern. Drei Gruppen von Tumoren können gemäß ihrem Potential zu Rezidiv und Progression als wenig, mittel und hochriskant definiert werden. Diese Klassifikation wird verwendet, um unterstützende intravesikale Therapien und Blasenüberwachung zu empfehlen, aber sie ist keine ausreichend empfindli che Diskriminante zur Verwendung bei der Bestimmung der geeigneten Behandlung und des geeigneten Überwachungsmodus für einen gegebenen Patienten. Obwohl eine Therapie mit Bacillus Calmette-Gutirin (BCG) die effektivste Behandlung für die Hochrisikogruppe zu sein schien, weisen langfristige Ergebnisse darauf hin, dass eine Progression in 40% der Fälle innerhalb von 10 Jahren und in mehr als 50% der Fälle innerhalb von 15 Jahren erfolgt. Für manche Forscher rechtfertigten diese Ergebnisse die Verwendung einer vorgreifenden radikalen Zystektomie bei hochriskanten oberflächlichen Urothelkarzinomen, obwohl die Gefahr besteht, das eine erhebliche Zahl von Patienten überbehandelt wird. Das Follow-Up von oberflächlichen Ta- und T1-Blasenkarzinomen stellt die größte Arbeitsbelastung von Urologen dar, die an der Behandlung von Blasenkrebs beteiligt sind. Die derzeitige Strategie beruht auf häufigen zystoskopischen Bewertungen unter Verwendung eines Zeitplans, der großenteils empirisch ist, ohne die individuellen Merkmale des Tumors zu berücksichtigen.
Die Einschränkungen des derzeitigen Umgangs mit Blasenkrebs beweisen die Notwendigkeit von prognostischen Markern, die die Verwendung von selektiven aggressiven Behandlungen von Patienten mit hohem Risiko der Progression ermöglichen, während Patienten mit geringem Risiko unnötige Prozeduren erspart bleiben. Mehrere chromosomale Loci und spezifische Gene sind an der Blasentumorigenese beteiligt. Der Verlust des ganzen oder eines Teils von Chromosom 9 in vielen TaG1-Tumoren lässt vermuten, dass die Inaktivierung eines oder mehrerer Gene auf Chromosom 9 möglicherweise ein frühes Ereignis bei der urothelialen Transformation ist. Die prognostische Signifikanz von Verlusten auf Chromosom 9 ist unklar. Veränderungen des P53- und des RB-Gens, die den Kontrollpunkt der G1-Zellen steuern, wurden eindeutig beschrieben und sind mit der Aggressivität von oberflächlichen und invasiven Blasenkarzinomen assoziiert. Trotz dieser neueren Einsichten in die molekularen Mechanismen der Progression von Blasenkarzinom hatten diese Marker noch keinen Einfluss auf die klinische Praxis.
Die folgenden Assays wurden durchgeführt, um die Zuverlässigkeit der FGFR3-Mutationen als Marker zu bewerten.
Material und Verfahren
Patienten und Gewebeproben
Vierundsiebzig Proben von oberflächlichen Ta/T1-Blasenkarzinomen wurden von 74 Patienten durch transurethrale Resektionen erhalten, die von Januar 1988 bis Dezember 1998 am Hopital Henri Mondor, Créteil, Frankreich, durchgeführt wurden. Von den Tumoren wurden die Stadien gemäß der TNM-Klassifikation (1) und die Grade gemäß den von der World Health Organization empfohlenen Kriterien (2) bestimmt. Diese Reihe bestand aus 25 pTa- und 49 pT1-Tumoren mit 28 Grad-G1-, 33 Grad-G2- und 13 Grad-G3-Tumoren. Die 64 Männer und 10 Frauen hatten ein mittleres Alter von 64 Jahren (Bereich: 29 bis 94 Jahre). Keiner der Patienten hatte zum Zeitpunkt der transurethralen Resektion nachweisbare distante Metastasen. Die Patienten wurden durch transurethrale Resektion (TUR) allein (n = 25), TUR mit anschließender Mitomycin-C-Instillation (n = 10) oder mit TUR und BCG (n = 39) gemäß den Empfehlungen des Comité de cancerologie de I'Association Française d'Urologie (CCAFU) behandelt. Es gab keine Änderung der Strategie bei der Behandlung von oberflächlichem Blasenkrebs während des Zeitraums der Studie. Progression war als Auftreten eines pP2 oder höheren Stadiums oder das Auftreten einer Lymphknoteninvasion oder Metastase oder von Tod durch Krebs definiert. Krankheitsspezifische Überlebenskurven wurden aufgetragen, wobei Tod durch Urothelkrebs als Endpunkt verwendet wurde. Das Follow-Up beruhte auf systematischer Zystoskopie und Cytologie und Bildgebungsstudien nur, wenn dies angezeigt war. Alle Besuche ambulanter Patienten und Aufnahmen in das Krankenhaus wurden in einer Datenbank aufgezeichnet, anhand derer die Studiendaten berechnet wurden.
Tumor-DNA wurde aus formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe oder aus Proben, die frisch in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden (4), extrahiert. Normale DNA-Proben aus peripherem Blut waren für 27 Patienten verfügbar.
FGFR3-Mutationsanalyse
Mutationen im FGFR3-Gen wurden durch SSCP-Analyse nachgewiesen. Die Exons 7, 10, 15 und 20 des FGFR3-Gens wurden analysiert, da diese Exons alle Mutationen beherbergen, die zuvor bei Harnblasenkarzinomen und thanatophorer Dysplasie identifiziert wurden. Alle Mutationen, die durch SSCP-Analyse nachgewiesen wurden, wurden durch direkte bidirektionale Sequenzierung von genomischer Tumor-DNA bestätigt. Dazu passende normale DNA, falls verfügbar, wurde auf beiden Strängen sequenziert, um die somatische Natur dieser Mutationen nachzuweisen.
Statistische Verfahren
Assoziationen zwischen dem FGFR3-Mutationsstatus und anderen Daten (Geschlecht, Alter, Stadium und Grad) wurden unter Verwendung von χ²- und Student-t-Test getestet. Progressionsfreie und krankheitsspezifische Überlebenskurven wurden unter Verwendung von Kaplan-Meier-Schätzungen aufgetragen. Die Überlebenszeitverteilungen wurden unter Verwendung des Log-Rank-Tests miteinander verglichen. Das proportionale Hazard-Regressionsmodell nach Cox wurde verwendet, um die Wirkung von Mutationen zu testen, während es gleichzeitig die Grundlinien-Patienten- und Tumorcharakteristiken erklärte. Der Einfluss der Covariaten auf die Wirkung der FGFR3-Mutation wurde in einer Multivarianzanalyse bewertet, die einen Modus ”schrittweise vorwärts” und einen Modus ”schrittweise rückwärts” beinhaltete, wobei das MPRL-Verfahren (maximales partielles Wahrscheinlichkeitsverhältnis) verwendet wurde. Die Grenze zur Eingabe eines Terms betrug 0,15, und die Grenze zur Entfernung eines Terms betrug 0,10. Statistische Analysen wurden durchgeführt, wobei BMDP^®- und 5-Plus^®-Software verwendet wurde.
Ergebnisse

FGFR3-Fehlsinnmutationen wurden bei 41 der 74 (55%) Ta/T1-Harnblasentumoren beobachtet. Die gefundenen FGFR3-Mutationen sind in der folgenden Tabelle 2 beschrieben: Tabelle 2

Zahl der Tumoren (%)	Codon*	nt-Position*	Mutation	vorhergesagte Wirkung
5 (12%)	248	742	CGC → TGC	Arg → Cys
28 (68,5%)	249	746	TCC → TGC	Ser → Cys
5 (12%)	372	1114	GGC → TGC	Gly → Cys
2 (5%)	375	1124	TAT → TGT	Tyr → Cys
1 (2,5%)	652	1954	AAG → GAG	Lys → Glu

* Das Codon und das mutierte Nucleotid (nt-Position) sind gemäß dem offenen Leseraster der FGFR3-IIIb-cDNA nummeriert. FGFR3-IIIb ist die Isoform, die in Epithelzellen exprimiert wird.

S249C war die häufigste Mutation und wurde in 16 der 21 (76%) mutierten Ta-Tumoren und in 12 der 20 (60%) mutierten T1-Tumoren gefunden. Dazu passende konstitutive DNA, die in 15 der Fälle von Tumoren mit Mutationen verfügbar war, enthielt Wildtypsequenzen, was die somatische Natur dieser Mutationen beweist.

Die Korrelation zwischen Geschlecht, Alter, Stadium, Grad und FGFR3-Mutationsstatus ist in Tabelle 3 angegeben: Tabelle 3

	FGFR3-Wildtyp	FGFR3-Mutante	p-Wert (χ² oder Student-t-Test)
Geschlecht
männlich	29	35
weiblich	4	6	0,9779
Alter (Jahre)
Mittelwert	64,30	63,22
Bereich	[29,15–86,10]	[34,3–94,4]	0,7393
Stadium
Ta	4	21
T1	29	20	0,001
Grad
G1	7	21
G2	14	19
G3	12	1	0,0003

Statistisch signifikante Korrelationen wurden zwischen FGFR3-Mutationen und niedrigem Stadium (p = 0,001) und geringem Grad (p = 0,0003), aber nicht zwischen diesen Mutationen und Alter oder Geschlecht beobachtet (Tabelle 2).
Bei einem medianen Follow-Up von 4,3 Jahren (Bereich: 6 Monate bis 11 Jahre) zeigten in der Gruppe des mutierten Tumors (n = 41 Patienten) 3 Patienten eine Progression, und einer starb, während in der Gruppe des nichtmutierten Tumors (n = 33 Patienten) zehn Patienten eine Progression zeigten und acht starben. Der mediane Follow-Up betrug in der nichtmutierten Gruppen 5,6 Jahre (Bereich: 7 Monate bis 11 Jahre) und in der mutierten Gruppen 4,1 Jahre (Bereich: 6 Monate bis 9 Jahre).
Um FGFR3-Mutationen als Marker für die Folgen beim Patienten zu untersuchen, berechneten wir die progressionsfreie Überlebenszeit- und die krankheitsspezifi sche Überlebenszeit-Wahrscheinlichkeitskurve nach Kaplan-Meier für die beiden Gruppen von Patienten und untersuchten die Unterschiede unter Verwendung des Log-Rank-Tests. Die progressionsfreie und die krankheitsspezifische Überlebenszeit zeigten an, dass FGFR3-Mutationen mit einem geringeren Risiko der Progression (p 0,014) und einer längeren Überlebenszeit (p = 0,007) assoziiert sind (3). Wir testeten mehrere Variablen (Alter, Geschlecht, Stadium, Grad), aber in einer Univarianzanalyse war nur das Stadium signifikant mit der Progression und der Überlebenszeit assoziiert. Wenn nur T1-Patienten analysiert wurden, war die Korrelation für die krankheitsspezifische Überlebenszeit immer noch signifikant (p = 0,03) und für die progressionsfreie Überlebenszeit beinahe signifikant (p = 0,052).

Eine Multivarianzanalyse wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Korrelation zwischen FGFR3-Mutationsstatus und progressionsfreier Überlebenszeit oder krankheitsspezifischer Überlebenszeit von anderen Faktoren, anhand derer sich der Ausgang vorhersagen lässt, unabhängig ist. Bei der progressionsfreien Überlebenszeit wurden die folgenden Covariaten in das Cox-Modell eingeführt: Mutation, Stadium, Grad und Geschlecht. Bei der krankheitsspezifischen Überlebenszeit waren Mutation und Grad die einzigen Covariaten, die in das Modell eingeführt wurden, da unter weiblichen oder Ta-Patienten keine durch die Krankheit bedingten Todesfälle beobachtet wurden. Wenn der FGFR3-Status in das Modell eingegeben wurde, lieferten weder das Stadium noch der Grad einen zusätzlichen prognostischen Wert für die Tumorprogression. Bei der Analyse der krankheitsspezifischen Überlebenszeit war die FGFR3-Mutation ebenfalls die einzige Covariate, die in das Modell eingegeben wurde, da der Grad keine zusätzlichen prognostischen Informationen lieferte. Die relativen Risiken und ihre 95%-Konfidenzintervalle (CI) sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

	Progression		krankheitsspezifische Überlebenszeit
	relatives Risiko	95%-CI	relatives Risiko	95%-CI
FGFR3
Wildtyp	1		1
Mutante	0,23	(0,06; 0,83)	0,10	(0,01; 0,80)
Andere Variablen tragen nicht signifikant zu dem Modell bei.

Vorwärts- und Rückwärts-Verfahren ergaben beide dasselbe Modell.
Wie durch die obigen Ergebnisse gezeigt wird, waren die aktivierenden FGFR3-Mutationen bei Harnblasenkarzinomen häufig.
Alle Karzinome, die einen mutierten Rezeptor aufwiesen, exprimierten den Rezeptor in ähnlichen oder oberhalb der Mengen, die bei normalen Geweben beobachtet werden. Dann werden vorteilhafterweise immunhistochemische Verfahren verwendet, um den Rezeptor zu finden.
Der Nachweis einer FGFR3-Mutation in Harnblasenkarzinomen scheint ein gutes Prognostikum zu sein, das den Ärzten wertvolle Mittel an die Hand gibt, um Karzinome, die aufgrund der hohen Häufigkeit von Rezidiven ein medizinisches Problem darstellen, zu behandeln und zu beobachten.
Durch Verwendung von SSCP oder PCR gekoppelt an eine für die Mutation S249C spezifische (stellt 75% der Mutationen dar) enzymatische Restriktionsspaltung bei Patienten, die Harnblasenkarzinome mit S249C-Mutation aufweisen, konnte die Mutation in 60% der Fälle in Urin nachgewiesen werden.
Beispiel 4: Nachweis von FGFR3-Mutationen im Urin von Patienten
Genomische DNA wird aus dem Urin von Patienten extrahiert und durch PCR in Gegenwart von ³²P-markiertem dCTP unter Verwendung von Standardverfahren amplifiziert. Die folgenden Primer wurden verwendet, um die Mutation S249C nachzuweisen:
30 PCR-Zyklen wurden durchgeführt.
Die Amplifikationsprodukte werden mit Cac8I verdaut. Durch FGFR3-Mutation entsteht eine zusätzliche Stelle, und auf einem Elektrophorese-Gel wird eine entsprechende Bande beobachtet.
Ähnlich können die folgenden Primer und Enzyme verwendet werden zum Nachweis von:
Literatur

1. Sobin LH, Fleming ID. TNM Classification of Malignant Tumors, fifth edition (1997). Union Internationale Contre le Cancer and the American Joint Committee on Cancer. Cancer 1997; 80: 1803–4.
2. Epstein JI, Amin MB, Reuter VR, Mostofi FK. The World Health Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Bladder Consensus Conference Committee. Am J Surg Pathol 1998; 22: 1435–48.
3. Rischmann P, Bittard H, Chopin D, et al. Tumeurs Urothéliales. Prog Urol 1998; 8: 25–50.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweisen von humanen Blasenkarzinomen in einer biologischen Probe, die aus einem Blasengewebe und Urin ausgewählt ist, umfassend Identifizieren von FGFR3-aktivierenden Mutationen.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach einzelnen Nucleotidmutation(en) in Nucleinsäuren der Gruppe bestehend aus genomischer DNA, RNA oder cDNA.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach einzelnen Mutation(en) in Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach Mutationen, die Cysteinreste in den extrazellulären oder transmembranösen Domänen des Rezeptors erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach Mutationen, die zu wenigstens einer Aminosäurensubstitution in der Kinasedomäne des Rezeptors führen.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach aktivierenden Mutation(en) von FGFR3-IIIb.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach Mutation(en) in der Gruppe bestehend aus Exon 7, das die Verbindungsstelle zwischen immunoglobulinähnlichen Domänen II und III von FGFR3 codiert, Exon 10, das die transmembranöse Domäne codiert, Exon 15, das die Tyrosinkinasedomäne I codiert, und dem Exon, das den C-terminalen Teil codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ein Screening nach Missense-Mutationen, wie beispielsweise jenen, die an letaler Dysplasie, NSC, Achondroplasie, SADDAN oder Hypochondroplasie beteiligt sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Mutationen R248C, S249C, G372C, S373C, Y375C, K652E, K652M, J809G, J809C, J809R, J809L, P250R, G377C, G382R, A393E, N542K umfassen.
Verfahren nach Anspruch 9, umfassend ein Screening nach R248C-, S249C-, G372C-, K652E- und Y375C-Mutationen.
Verwendung eines inhibitorischen Antikörpers, der gegen FGFR3 gerichtet ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen Blasenkarzinomen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der inhibitorische Antikörper monoklonal ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der inhibitorische Antikörper humanisiert ist.