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DE3001187A1 - Verfahren zur herstellung von gereinigtem s-sulfoniertem gamma -globulin - Google Patents

Verfahren zur herstellung von gereinigtem s-sulfoniertem gamma -globulin

Info

Publication number
DE3001187A1
DE3001187A1 DE19803001187 DE3001187A DE3001187A1 DE 3001187 A1 DE3001187 A1 DE 3001187A1 DE 19803001187 DE19803001187 DE 19803001187 DE 3001187 A DE3001187 A DE 3001187A DE 3001187 A1 DE3001187 A1 DE 3001187A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
buffer solution
gamma globulin
sulfonated
gel
substituent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19803001187
Other languages
English (en)
Other versions
DE3001187C2 (de
Inventor
Yoshinori Akimoto
Akinobu Funatsu
Komei Ohashi
Shuzoh Oyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Original Assignee
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken filed Critical Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Publication of DE3001187A1 publication Critical patent/DE3001187A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3001187C2 publication Critical patent/DE3001187C2/de
Granted legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829—Blood
    • Y10S530/83—Plasma; serum
    • Y10S530/831—Cohn fractions

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Biochemistry (AREA)
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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

ι Verfahren zur Herstellung von gereinigtem S-sulfoniertem:
Gamma-Globulin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von '<
Gamma-Globulin, insbesondere ein Verfahren zur Herstel- !
lung von gereinigtem, S-sulfoniertem Gamma-Globulin |
durch Behandlung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin mit I
einem Ionenaustauscher, wodurch agglutinierte Moleküle '>
des S-sulfonierten Gamma-Globulins ausreichend entfernt j
werden, um den Gehalt an der einzelmolekularen Verbin- ! dung zu erhöhen,und die unerwünschte antikomplementäre
Wirkung so weitgehend verringert wird, daß das ge- !
wünschte biologisch und physikalisch stabile S-sulfo- i
nierte Gamma-Globulin erhalten wird. ι
Gamma-Globulin, das vom Blutplasmagemisch fraktioniert .
worden ist, weist bekanntlich Antikörper-Aktivitäten j
gegen verschiedene Infektionskrankheiten auf und ist !
wertvoll als sog. Immunglobulinpräparat für die Prophy- i
laxe und Therapie verschiedener Infektionskrankheiten. ,
Das übliche Immunglobulinpräparat enthält jedoch agglu- ;
tinierte Moleküle, die während seiner Reinigung gebil- I
det werden,und kann daher nicht intravenös, sondern nur ,
intramuskulär verabreicht werden. Es ist ferner bekannt, [
daß, wenn ein Gamma-Globulinpräparat, das eine große j
Menge agglutinierter Moleküle enthält, einem Patienten J
intravenös verabreicht wird, ein Komplement im Patienten· schnell aktiviert wird, wodurch verschiedene Nebenwir- j
kungen wie Blutdrucksenkung, Erhöhung der Körpertemperatur, Störungen des Kreislaufsystems o.dgl. ausgelöst werden. Wenn andererseits das Gamma-Globulin intramuskulär verabreicht wird, sind die verabreichte Menge und die Penetrationsgeschwindigkeit des Gamma-Globulins in die Blutgefäße begrenzt, so daß die intramuskuläre Verabreichung ungeeignet ist, wenn ein schneller Anstieg!
030031/0670
der Antikörperkonzentration im Blut erforderlich ist» j
Es besteht somit ein Bedürfnis für ein verbessertes ;
Gamma-Globulin, das intravenös ohne Störungen durch i
antikomplementäre Aktivität verabreicht werden kann» I
Für die Herstellung von intravenös verabreichbarem Gamma-Globulin wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, i beispielsweise ein Verfahren zur Behandlung mit Pepsin j (siehe H.E. Schultze, Deutsche Medizinische Wochen- , schrift 87 (1962) 1643 und ein Verfahren zur Behandlung | mit Plasmin (siehe J.T. Sgouris, Vox Sanguinis 13 (1967) j 711. Bei dem Verfahren zur Behandlung mit einer Protease! wie Pepsin wird jedoch das Gamma-Globulin in zwei oder j mehr Verbindungen mit niedrigerem Molekulargewicht ! zersetzt, so daß der gebildete Antikörper innerhalb ; einer kürzeren Zeit verschwindet und ferner die biologische Aktivität des Fc-Fragments des Gamma-Globulinmoleküls durch Abschneiden des Fc-Fragments erniedrigt ; wird.
Es wurde ferner vorgeschlagen, ein intravenös verab- -reichbares Gamma-Globulin ohne die vorstehend genannten . Nachteile zu bilden, d.h. das gewünschte Gamma-Globulin herzustellen, ohne die Struktur des Gamma-Globulins wesentlich zu verändern, beispielsweise nach einem Ver- : fahren zur Behandlung von Gamma-Globulin bei pH 4 (siehe ι S. Barundun et al in Vox Sanguinis 13 (1967) 93) und nach einem Verfahren zur Behandlung mit ß-Propiolacton (siehe W. Stephan in Vox Sanguinis 28 (1975)422). Bei dem Verfahren der Behandlung bei pH 4 wird jedoch der ι Gehalt an agglutinierten Molekülen während der Lagerung ! des hierbei erhaltenen Gamma-Globulins erhöht, wodurch \
wiederum die antikomplementäre Wirkung erhöht wird. ι Außerdem heißt es, daß das durch Behandlung mit ß-Propiolacton gebildete Gamma-Globulin möglicherweise als '. Antigen wirksam ist, wenn es verabreicht wird.
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BAD ORIGINAL
Kürzlich wurde von Masuho et al berichtet, daß ein geeignetes, intravenös verabreichbares Gamma-Globulin durch Sulfonierung der S-S-Kette von Gamma-Globulin hergestellt werden kann (US-PS 4 059 571; japanische Patentveröffentlichung (ungeprüft) Nr. 1630/1976). Das von Masuho et al hergestellte S-sulfonierte Gamma-Globulin bewahrt das ursprüngliche große Molekül durch Wasserstoffbindung, während die S-S-Bindung gebrochen wird und es somit eine erheblich verringerte antikomplementäre Wirkung zeigt, während es die Antikörperfunktion vollständig bewahrt (es wird festgestellt, daß j die Höhe der antikomplementären .Wirkung bei einer j Proteinkonzentration von 5 Gew.-% (nachstehend als "CH-q" bezeichnet) 30% oder weniger beträgt). Ferner wird das j S-sulfonierte Gamma-Globulin leicht reduziert und dann ι unter Bildung des ursprünglichen Gamma-Globulins oxidiert, wenn es dem menschlichen Körper verabreicht wird ] (siehe Masuho et al, Journal of Biochemistry 19 (1976) 1377). Ferner wurde durch klinische Versuche nachgewie- j
sen, daß das S-sulfonierte Gamma-Globulin an Patienten mit Hypogammaglobulinämie oder Agammaglobulinämie : stabil verabreicht werden kann (siehe Noboru Kobayashi, International Academy of Blood Transfusion (Paris) 1978).
Das S-sulfonierte Gamma-Globulin ist somit ausgezeichnet und wertvoll als intravenös verabreichbares Gamma-Globulinpräparat, so daß ihm viel Aufmerksamkeit gewid- · met wird. Dieses Produkt hat jedoch den Nachteil, daß es kaum im technischen Maßstab hergestellt werden kann. Wenn nämlich bei dem vorstehend genannten Herstellungs- ] verfahren nach Masuho et al das als Ausgangsmaterial dienende Gamma-Globulin genügend gereinigt wird und j weniger agglutinierte Moleküle enthält, kann das gewünschte S-sulfonierte Gamma-Globulin mit niedriger antikomplementärer Aktivität erhalten werden; wenn jedoch das übliche für die Großherstellung verwendete Gamma- ι globulin, z.B. das nach der Cohn1 Fraktioniermethode \
330031/0670
-Τι unter Verwendung von Äthanol bei niedriger Temperatur !
hergestellte Gamma-Globulin als Ausgangsmaterial verwen» ;
det wird, hat das hergestellte S-sulfonierte Gamma= J
! Globulin nicht eine so niedrige antikomplementäre Akti- I
5 vitä't (beim niedrigsten CH5()-Wert etwa 30 bis 20%) . Das | Verfahren nach Masuho et al ist somit im Prinzip ausge-
J zeichnet, jedoch ist bei ihm irgendeine zusätzliche ! ι Behandlung erforderlich, um das gewünschte Produkt mit hoher Stabilität bei der.Großherstellung zu erhalten»
Bei intensiven Bemühungen der Anmelderin, ein verbesser-'
tes Verfahren zur Herstellung des gewünschten S~sulfo- !
nierten Gamma-Globulins mit genügend niedriger antikom- j
plementärer Wirkung zu entwickeln, auch wenn irgend- j
ein übliches Ga.mma-Globulin, das viel agglutinierte j
Moleküle enthält, als Ausgangsmaterial verwendet wird, wurde nun gefunden, daß das angestrebte Ziel erreicht
wird, wenn nach der Sulfonierungsreaktion das erhaltene ■
S-sulfonierte Gamma-Globulin mit einem Ionenaustauscher !
behandelt wird, wodurch das gewünschte S-sulfonierte '
Gamma-Globulin mit äußerst geringer antikomplementärer '.
Wirkung erhalten wird. !
Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von intravenös verabreichbarem Gamma-Globulin im großtechnischen Maßstab sowie ein S-sulfo- ' niertes Gamma-Globulin, das überwiegend aus Einzelmole- ι külen mit weniger agglutinierten Molekülen besteht und eine äußerst geringe antikomplementäre Wirkung aufweist. Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur ; Reinigung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin. j
Gemäß der Erfindung wird das durch Sulfonieren von übli- ·
ehern Gamma-Globulin nach einem bekannten Verfahren hergestellte S-sulfonierte Gamma-Globulin durch einen Ionen- .
austauscher geleitet und hierbei in eine Fraktion, die 1 überwiegend agglutinierte Moleküle enthält, und eine :
Fraktion,' die überwiegend Gamma-Globulin in Form von '
t)30031/ÖS7ß
Einzelmolekülen enthält, getrennt. Die letztgenannte ι Fraktion wird aufgefangen, wobei das gewünschte S-sulfo- : nierte Gamma-Globulin mit äußerst niedriger antikomple- ! mentärer Aktivität erhalten wird. Das nach dem Verfahren I gemäß der Erfindung in Einzelmolekülen erhaltene S-sulfonierte Gamma-Globulin hat einen CH5Q-Wert von weniger , als 10% und eignet sich daher als intravenös verabreich- ! bares Immunglobulinpräparat.
Das als Ausgangsmaterial dienende S-sulfonierte Gamma-Globulin kann aus einem üblichen Gamma-Globulin herge- ; stellt werden, das gewöhnlich nach dem Cohn' Fraktio- , nierverfahren, das international in großem Umfang für j die Herstellung von Gamma-Globulin angewendet wird (siehe
J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459),hergestellt wird. Das · Gamma-Globulin wird durch Behandlung mit einem Oxida- !
tionsmittel, z.B. einem Alkalimetalltetrathionat, einem ι Alkalimetalljodosobenzoat, einem molekularen Sauerstoff j enthaltenden Gas (z.B. Luft) oder einer Sulfitionen bildenden Verbindung (z.B. schweflige Säure) sulfoniert (siehe j US-PS 4 059 571; japanische Patentveröffentlichung :
(ungeprüft) 1630/1976 und 76418/1976). Das S-sulfonierte; Gamma-Globulin kann gegebenenfalls nach einem üblichen ; Verfahren, z.B. durch Dialyse, gereinigt werden. ;
Der im Rahmen der Erfindung verwendete Ionenaustauscher j ist vorzugsweise eine wiederholt verwendbare Säule ohne j spzielle Aktivierung, hat ein hohes Bindungsvermögen ;
und ist vorzugsweise ein autoklavierbares Gel mit guter ; Stabilität unter verschiedenen Bedingungen, z.B. bei ι verschiedenen pH-Werten, Ionenstärken usw. j
i Als Ionenaustauscher eignen sich Anionenaustauscher und !
Kationenaustauscher, jedoch werden Anionenaustauscher ! vom Standpunkt der biologischen und physikalischen j Stabilität des Produkts bevorzugt. Der Anionenaustauscher kann in Kombination mit dem Kationenaustauscher verwen- j det werden. "j
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Beispiele geeigneter Anionenaustauscher sind Agarosegel, j in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ' ist (z.B. das Produkt "DEAE-Sepharose CL-6B"), Dextran= . gel, in das ein anionischer Substituent eingeführt wor- j den ist (z.B. die Produkte "DEAE-Sephadex"und "QAE-Sephadex"), Cellulosegel, in das ein anionischer Sub- | stituent eingeführt worden ist (z.B. DEAE-CeIlulose und ί TEAE-CeIlulose), Polyvinylgel? in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist (z„Bo das Produkt "DEAE-TOYOPEAL), Amylosegel, in das ein anianischer Substituent eingeführt worden ist, u„dgla Als anionische j Substituenten kommen Diäthylaminoäthyl (DEAE), Triäthyl aminoäthyl (TEAE) und Diäthyl-(2-hydroxypropyl)amino» äthyl (QAE) in Frage.
Beispiele geeigneter Kationenaustauscher sind Agarosegel, in das ein kationischer Substituent eingeführt wor- ' den ist (z.B. das Produkt "CM-Sepharose CL-6B"),Dextran- : gel, in das ein kationischer Substituent eingeführt wor-. den ist (z.B. die Produkte "CM-Sephadex" und "SP-Sepha- > dex"), Cellulosegel, in das ein kationischer Substituent: eingeführt worden ist (z.B. CM-Cellulose), Polyvinylgel, ' in das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist (z.B. das Produkt "CM-TOYOPEAL") und Amylosegel, in ' das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist» Als kationische Substituenten kommen Carboxymethyl (CM), Sulfopropyl (SP) und Sulfoäthyl (SE) in Frage«, \
Die Adsorption des S-sulfonierten Gamma-Globulins am '
Ionenaustauscher kann wie folgt lurchgeführt werden: Das : S-sulfonierte Gamma-Globulin wird mit einem lonenaustauscher in einer Pufferlösung für die Entwicklung behandelt, die optimale Wasserstoffionenkonzentration
(pH-Wert) und optimale Ionenstärke aufweist« Hierdurch |
wird das in Einzelmolekülen vorliegende S-sulfonierte ; Gamma-Globulin am Ionenaustauscher adsorbiert. Bei dieser
Behandlung durchlaufen die agglutinierten Moleküle des j
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-10-
ί ■' j
S-sulfonierten Gamma-Globulins und auch das nicht sulfo-j nierte Gamma-Globulin den Ionenaustauscher, ohne daran !
j adsorbiert zu werden. Nach der Adsorption wird der !
! ι
Ionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, j 5 um das agglutinierte Gamma-Globulin und andere Verun- j ι reinigungen vollständig zu entfernen. j
Die für die Adsorption des als Einzelmoleküle vorliegenden Gamma-Globulins verwendete Pufferlösung hat einen pH-Wert von 4 bis 10, vorzugsweise von 7 bis 8, und eine Ionenstärke (u) von 0,01 bis 0,15, vorzugsweise von 0,03 bis 0,09 im Fall des Anionenaustauschers. Bei Verwendung eines Kationenaustauschers hat die Pufferlösung einen i pH-Wert von 4 bis 6,5, vorzugsweise von 5 bis 6, und ! eine Ionenstärke von 0,01 bis 0,1, vorzugsweise von 0,035 bis 0,07. Die Konzentration des der Adsorptionsbehandlung zu unterwerfenden S-sulfonierten Gamma-Globulins ist ι nicht entscheidend wichtig, jedoch wird es unter Berücksichtigung des Austauschvermögens des Ionenaustauschers \ vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 12% (Gew./ j
Vol.) verwendet. ;
Als Pufferlösungen für die Entwicklung eignen sich bei- j spielsweise eine Phosphatpufferlösung, eine Citrat- i pufferlösung, eine Tris-phosphatpufferlosung, eine Tris-HCl-Pufferlosung, eine Boratpufferlösung und eine j Acetatpufferlösung. j
Das am Ionenaustauscher in Form von Einzelmolekülen i adsorbierte S-sulfonierte Gamma-Globulin läßt sich durch '
Elution mit einer Pufferlösung, die im pH-Wert und in j der Ionenstärke von der Pufferlösung für die Entwicklung !
verschieden ist, leicht davon isolieren. Die Pufferlösung für die Elution hat bei Verwendung eines Anionenaustau- , schers einen pH-Wert von 3 bis 4 und bei Verwendung eines Kationenaustauschers einen pH-Wert von 6 bis 9. Die > Pufferlösung für die Elution muß eine höhere Ionenstärke ■
(u) als die Pufferlösung für die Entwicklung haben. '
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Vorzugsweise liegt diese Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8. Als Pufferlösungen für die Elution eignen sich beispielsweise Phosphatpufferlösungen, Glycin-HCl-Puffer«J lösungen, Citratpufferlösungen und wäßrige Natriumacetat=« lösungen. Diese Pufferlösungen können Natriumchlorid enthalten.
Die Reinigungsbehandlung gemäß der Erfindung wird gewöhn^ lieh bei Raumtemperatur durchgeführt, kann jedoch auch unter Kühlen erfolgen.
Das gemäß der Erfindung gereinigte S-sulfonierte Gamma-Globulin hat einen höheren Gehalt an Einzelmolekülen, eine geringere antikomplementäre Aktivität und eine größere Stabilität als das Produkt vor der Reinigung. Wenn beispielsweise das bei dem in Beispiel 1 beschrie= genen Versuch verwendete S-sulfonierte Gamma-Globulin (drei Chargen) nach dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung von DEAE-Sepharose CL-6B und CM-Sepharose CL-6B gereinigt und das erhaltene Produkt so eingestellt wurde, daß seine Proteinkonsentration 5% betrug, zeigten die Produkte die in Tabelle 1 genannten Werte für antikomplementäre Aktivita"t(CH,-0) , Gehalt an Einzelmolekülen (gemessen durch Analyse mit der Ultrazentrifuge) und Schüttelstabilität (gemessen mit Hilfe des Unterschiedes in der Lichtstreuung nach Schütteln in einer Kahn-Schüttelmaschine).
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- 12 Tabelle 1
Charge Vor der Nach der Reinigung
Nr.
Reinigung
unter Verwendung v. DEAE-Sepharose
unter Verwendung von CM-Sepharose
Antikomplementäre Wirkung* (CH50), %
II
III
3 5
Schüttel I 100 5 42
stabilität ·*· II 80 8 38
III 136 2 30
• Gemessen nach der Kabat-Mayer-Methode (siehe Experimental Immunochemistry (1961) 225.
·· Gemessen nach Zentrifugation bei 60.000 UpM für 50 Minuten mit Beckmann-Ultrazentrifuge.
··· Gemessen durch Schütteln des Produkts bei einer Amplitude von 3,4 cm/Sek und 3,7 Zyklen/Sek. für 4 Std., Bestrahlen mit Licht und anschließende Messung der Differenz der Lichtstreuung vor und nach dem Schütteln (siehe Standard for Biological Preparations, herausgegeben vom Ministry of Health and Welfare, Japan).
Wie die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, weist das gemäß der Erfindung gereinigte S-sulfonierte Gamma-Globulin eine äußerst stark verringerte antikomplementäre Wirkung von 10% oder weniger bei einer Proteinkonzentration von 5% im Vergleich zu dem Produkt vor der Reinigung auf. Bei Verwendung eines Anionenaustauschers wird sie ganz besonders stark verringert. Der Gehalt an Einzelmolekülen steigt von 75 bis 80% (vor der Reinigung) auf 90 bis 95% (nach der Reinigung). Bei der Analyse durch, Ultrazentrifugation sind die stark agglutinierten Moleküle kaum nachzuweisen, weil sie un-
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Gehalt an I 82 92 90
Einzelmolekülen II 84 92 92
in % *· III 85 94 95
■- ■: -; ;"": 3001 IB?
- 13 -
mittelbar nach Beginn der Zentrifugation ausgefällt
■ werden, jedoch gönnen die agglutinierten Moleküle bei
J der Gelchromatographie-Analyse (zeB„ Dünnschicht-Gel-Chromatographie) in Polymere und Oligomere getrennt wer-5 den. Diese Analyse durch Gelchromatographie bestätigte,
j daß der Gehalt an Monomerem (Einzelmolekül) von 60% bis
70% (vor der Reinigung) auf 85% oder mehr (nach der
Reinigung) erhöht wurde. Ferner ergibt die Messung der
Lichtstreuung vor und nach der Reinigung, daß das gemäß
. 10 der Erfindung gereinigte S-sulfonierte Gamma=-Globulin
: eine äußerst hohe Stabilität aufweist und selbst durch
; Schütteln keine unlösliche Substanz ausgefällt wird» j
'■ Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter ' erläutert. In diesen Beispielen beziehen sich die j 15 Prozentsätze auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.
Beispiel 1 '
248 g Natriumtetrathionat wurden in 1500 ml Natriumchlo^. j
rid enthaltender Phosphatpufferlösung (pH 7,6) gelöst, |
und 408 g Natriumsulfit wurden in 3500 ml der gleichen ι
Pufferlösung gelöst, worauf die Lösungen zur Sterilisa- ]
tion filtriert wurden. Jede in dieser Weise hergestellte
Lösung wurde zu 10 1 einer 15%igen wäßrigen Lösung von ;
Gamma-Globulin gegeben, das aus menschlichem Blutplasma ;
; nach der Äthanol-Fraktionierungsmethode hergestellt wor=
' 25 den war. Das Gemisch wurde 4,5 Stunden bei 430C langsam
■■ gerührt, um die Sulfonierung vorzunehmen. '
Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gegen phy- '
siologische Kochsalzlösung dialysiert, um überschüssiges ι
Sulfonierungsmittel zu entfernen, und dann mit einer j Pufferlösung für die Entwicklung (Phosphatpufferlösung?
Ai = 0,06, pH 7,5) ins Gleichgewicht gebracht. |
Die Lösung des S-sulfonierten Gamma-Globulins in dem
Phosphatpuffer wurde auf eine Proteinkonzentration von
©30031/
! etwa 8% eingestellt, und 15 1 Lösung wurden entwickelt, ] indem sie durch eine Säule (16 1) des Ionenaustauschers
;· DEAE-Sepharose CL-6B (Hersteller Pharmacia), die mit
der gleichen, vorstehend genannten Phosphatpufferlösung 5 ins Gleichgewicht gebracht worden war, geleitet wurde.
Die Fraktion (P-I), die durch die Säule lief, ohne am
i Ionenaustauscher adsorbiert zu werden, war eine Lösung
j mit einer Proteinkonzentration von etwa 2% (16 1).
! Die Säule wurde mit der gleichen, vorstehend genannten
1 10 Phosphatpufferlösung gewaschen, und als fast kein Pro-
! tein mehr nachgewiesen wurde, wurde eine Acetatpuffer-
j lösung (u = 0,1, pH 4,0) durch die Säule geleitet und
' die eluierte Fraktion (P-II) aufgefangen. Diese Fraktion
(P-II) war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration
15 von etwa 2,5% (32 1).
Jede in der beschriebenen Weise erhaltene Fraktion wurde j mit wäßriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert, auf j eine Proteinkonzentration von etwa 5% eingeengt und dann j gegen eine 2,25% Glycin enthaltende isotonische Phos- ' 20 phatpufferlösung dialysiert. Verschiedene Eigenschaften ! der in der beschriebenen Weise erhaltenen Produkte wur- j den auf die unter Tabelle 1 beschriebene Weise gemessen, j Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt. ι
Tabelle 2 !
Vor der Nach der Reiniqunq
Reiniqunq P-I P-II
Antikomplementäre
Wirkung (CH50), %		 24 52 ί
4
Gehalt an Einzel
molekülen, %		 82 50 94
Schüttelstabilität 120 207 3
Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, hat die Fraktion! P-I eine hohe antikomplementäre Wirkung und enthält eine'
große Menge agglutinierter Moleküle und weist schlechte
35 Schüttelstabilität auf. Im Gegensatz hierzu weist die
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gewünschte Fraktion P-II eine genügend niedrige anti- j komplementäre Wirkung, einen hohen Gehalt an Einzelmole- ! külen und eine äußerst stark gesteigerte Schüttelstabi- | lität auf. Die Komponenten mit unerwünschten Eigenschaften sind somit als Fraktion P-I wirksam entfernt worden,,
Das Trennschema oder -modell der Fraktionen bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch ist in Fig, I dargestellt, in der die Fraktionsnummer als Abszisse und die optische Dichte jeder Fraktion bei einer Wellenlänge von 280 nm als Ordinate aufgetragen ist.
Die Lösung des S-sulfonierten Gamma-Globulins vor der Reinigung (A), die Fraktion P-I (B) und die Fraktion J P-II (C) wurden ferner der Analyse durch Ultrazentrifu- ! gation (X) und der Analyse durch Dünnschicht-Gelfiltra- ■ tion (Y) unterworfen. Der Verlauf dieser Analysen ist in Fig. 2 dargestellt. Die Analyse durch Ultrazentrifugie- !
ren wurde bei einer Proteinkonzentration von etwa 1,67% ,
i und bei 60.000 UpM für 50 Minuten unter Verwendung einer1 Beckmann-Ultrazentrifuge und die Analyse durch Dünnschicht-Gelfiltration nach der Migita-Methode (Annual ι Report of Inst. Virus Research, Kyoto Univ. 8 (1965) 130) durchgeführt. In Fig. 2 bedeutet "a" die aus Einzelmolekülen bestehende Substanz (7S); "b", "c" und "d" sind Oligomere (9S, IIS und 13S), während "p" ein Polymeres bedeutet. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, zeigen beide Analysen einen ähnlichen Verlauf bzw. ein ähnliches Schema, jedoch erscheint die Menge der stark agglutinier ten Moleküle bei der Analyse durch Dünnschicht-Gelfiltration höher als bei der Analyse durch Ultrazentrifugation. Im Schema der Analyse durch Ultrazentrifugation erscheint das Polymere nicht. Beide Analysen zeigen, daß die Fraktion P-I eine große Menge agglutinierter Moleküle und die Fraktion II eine erhöhte Menge an Einzelmolekülen enthält. '
030031/0570
- 16 -
: Beispiel 2
j Eine 15%ige wäßrige Gamma-Globulinlösung wurde auf die j in Beispiel 1 beschriebene Weise sulfoniert und anschließend dialysiert. Die hierbei erhaltene Lösung von j 5 S-sulfoniertem Gamma-Globulin wurde auf eine Protein- ! konzentration von etwa 7% eingestellt. Etwa 100 1 der Lösung wurden durch 150 1 einer Säule geleitet, die mit dem Ionenaustauscher DEAE-Sepharose CL-6B, der mit einer Citratpufferlösung (μ = 0,03, pH 7,5) ins Gleichgewicht gebracht worden war, gefüllt war. Die Fraktion (P-I), die die Kolonne durchlief, ohne am Ionenaustauscher adsorbiert zu werden, war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,5% (etwa 125 1). ι
Nach dem Waschen der Säule auf die in Beispiel 1 beschriegene Weise wurde eine Natriumchlorid enthaltende Glycin-HCl-Pufferlösung (u = 0,55, pH 3,5) durch die Säule ! geleitet und die eluierte Fraktion (P-II) aufgefangen. Die Fraktion (P-II) war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 2% (etwa 245 1).
Die in dieser Weise erhaltenen Fraktionen wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, worauf ihre Eigenschaften in der gleichen Weise gemessen wurden Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
25
Vor der Nach der Reinigung
Reinigung P-I P-II
Antikomplementäre
Wirkung (CH50), "%		 25 58 5
Gehalt an Einzel
molekülen, % 		82 50 94
Schüttelstabilität 137 238 3
030031 /067$
Beispiel 3
Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise, jedoch unter Verwendung einer Citratpufferlösung (u = 0,03, pH 7,5) anstelle der Phosphatpufferlösung (u = 0,06, pH 7,5) als Pufferlösung für die Entwicklung wurden etwa 15 1 einer Lösung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin mit einer Proteinkonzentration von etwa 7% entwickelt, indem sie durch 16 1 einer Säule, die mit DEAE-Sepharose CL-6B gefüllt war, geleitet wurde«, Hierbei wurden 15,6 1 einer Fraktion P-X mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,7% erhalten. Unter Verwendung einer Citratpufferlösung Cu = 0,614, pH 6,0) als Pufferlösung für die Elution wurden 31 1 einer Fraktion P-II mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,2% erhalten.
=15 Beispiel 4
Der in Beispiel 3 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch eine Phosphatpufferlösung (u = 0,06, pH 7,5) verwendet wurde. Hierbei wurden etwa 14 1 einer Fraktion P-I mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,8% erhal- ; ten. Ferner wurden durch Elution mit einer Glycin-HCl-Pufferlösung (u = 0,542, pH 3,5) 29 1 einer Fraktion P-II mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,4% erhal- ! ten. I
; Beispiel 5 j
' 25 Der in Beispiel 3 beschriebene Versuch wurde wiederholt, .
wobei jedoch eine Tris-HCl-Pufferlösung (u = 0,0175, ! pH 8,5) als Pufferlösung für die Entwicklung und eine j '. Natriumchlorid enthaltende Phosphatpufferlösung
j (u = 0,45, pH 6,0)als Pufferlösung für die Elution ver-,30 wendet wurden. Hierbei wurden 22 1 einer Fraktion P-I
mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,2% und eine j Fraktion P-II (27 1) mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,6% erhalten.
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Beispiel 6
Eine auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellte wäßrige Lösung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin wur-j de durch Dialyse gegen einen Acetatpuffer (ju = 0,05, ι pH 5,3) ins Gleichgewicht gebracht. Die Lösung wurde auf ι eine Konzentration an S-sulfoniertem Gamma-Globulin von
etwa 7% eingestellt. 15 Liter der erhaltenen Lösung
! wurden durch 16 1 einer Säule geleitet, die mit dem
j Ionenaustauscher CM-Sepharose CL-6B (Hersteller Pharma-10 cia) gefüllt war, der mit der gleichen vorstehend ge-
I
J nannten Acetatpufferlösung ins Gleichgewicht gebracht j worden war. Die Fraktion (P-I), die die Säule durchlief, j ohne daran adsorbiert zu werden, war eine Lösung mit
einer Proteinkonzentration von etwa 1,9% (13 1).
Nach dem Waschen der Ionenaustauschersäule auf die in j Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine wäßrige Natrium-! acetatlösung (u = 0,2) durch die Säule geleitet und die | eluierte Fraktion (P-II) aufgefangen. Diese Fraktion P-Il war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa
2,5% (27 1).
Die in dieser Weise erhaltenen beiden Fraktion wurden
auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt,
worauf ihre Eigenschaften in der gleichen Weise gemessen
wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.
Tabelle 4
Vor der Nach der Reiniqunq
Reinigung P-I P-II
Antikomplementäre
Wirkung (CH50), % 25 32 8
Gehalt an Einzel
molekülen, % 83 48 95
Schüttelstabilität 102 180 32
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Leerseite

Claims (12)

-X- Dr.-J:ig. f-in; : . - ..;. ·■-; JJ . Or. Fuos l.-üiuii./.ik Min Kiri ' ; · !. !.-!-!'/-m. Ciiiolu Xollor Oiji'.-ir.y. S:'!!,v · Of. V/rwer Deidimcnnliaus, D-iOJU Köln ] AvK/Ax 1129 14.Jan. 198o Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem S-sulfoniertem Gamma-Globulin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein S-sulfoniertes Gamma-Globulin mit einem Ionenaustauscher in einer Pufferlösung für die Entwicklung behandelt und hierdurch das als Einzelmoleküle vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin am Ionenaustauscher adsorbiert und dann das als Einzelmoleküle vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin mit einer Pufferlösung für die Elution eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher einen Anionenaustauscher verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher Agarosegel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist9 Dextrangel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, Cellulosegel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, Polyvinylgel, in das ein anionischer Substituent ein-
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- '_ ■ .: . : : 3001Ί87
geführt worden ist, und/oder Amylosegel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, verwendet, wobei der anionische Substituent aus der aus Diäthylaminoäthyl, Triäthylaminoäthyl und Diäthyl-(2-hydroxypropyl)aminoäthyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 10 und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,15 als Pufferlösung für die Entwicklung verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekenn- i zeichnet', daß man eine Pufferlösung mit einem pH-Wert i von 3 bis 4 und einer Ionenstärke, die nicht höher ist ; als die Ionenstärke der Pufferlösung für die Entwick- ! lung, als Pufferlösung für die Elution verwendet. ;
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ; man für die Elution eine Pufferlösung mit einer Ionen-j stärke im Bereich von 0,05 bis 0,8 verwendet. ■ :
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher einen Kationenaustauscher verwendet. ,
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kationenaustauscher Agarosegel, in das ein kationischer Substituent eingeführt ist, Dextrangel, in das ein kationischer Substituent eingeführt ist, . Cellulosegel, in das ein kationischer Substituent ein-i geführt ist, Polyvinylgel, in das ein kationischer ' Substituent eingeführt ist,und/oder Amylosegel, in das [ ein kationischer Substituent eingeführt ist, verwendet,' wobei der kationische Substituent aus der aus Carboxy- I methyl, Sulfopropyl und Sulfoäthyl bestehenden Gruppe : ausgewählt ist. !
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9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von ' 4 bis 6,5 und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,1 als ;
Entwicklungspufferlösung verwendet. '
!
10. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekenn- ' ! zeichnet, daß man eine Pufferlösung mit einem pH-Wert ! ! von 6 bis 9 und einer Ionenstärke, die höher ist als
die Ionenstärke der Entwicklungspufferlösung, als ; Elutionspufferlösung verwendet« j
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, :
daß man eine Entwicklungspufferlösung mit einer Ionen-=·! stärke im Bereich von 0,05 bis 0,8 verwendet. '
12. Gereinigtes S-sulfoniertes Gamma-Globulin mit hohem ] Gehalt an Einzelmolekülen und geringer antikomplementärer Wirkung, hergestellt nach dem Verfahren gemäß ' Anspruch 1 bis 11. ,
Ü30031/QS70
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