DE19641876A1 - Streptavidinmuteine - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Streptavidinmuteine, Ver
fahren zur Herstellung derartiger Proteine über rekombinante
DNA-Technologie, sowie die Verwendung dieser Streptavidinmu
teine zur Isolierung, Reinigung bzw. Bestimmung von biologi
schen Substanzen, insbesondere von anderen rekombinanten Pro
teinen.
Das System Biotin/Streptavidin ist ein heutzutage in der Mole
kularbiologie allgemein bekanntes Bindungssystem, dessen Be
deutung in den letzten Jahren erheblich zugenommen hat und
welches in unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt
wird. Dabei macht man sich die spezifische Affinität zwischen
Biotin und Streptavidin zunutze, die gleichzeitig mit einer
Affinitätskonstante in der Größenordnung von 1013 eine der
stabilsten bekannten nichtkovalenten Wechselwirkungen ist.
Wichtige herkömmliche Anwendungen bestehen in diversen Abtren
nungs- und Nachweisverfahren unter Verwendung meist biotiny
lierter Enzyme oder/und Antikörper in unterschiedlichen Varia
tionen. Beispiele sind z. B. ELISA, Western Blot etc. Eine
Voraussetzung für derartige Verfahren besteht darin, daß das
im Verfahren in biotinylierter Form verwendete Reagenz bzw.
Enzym zunächst in Reinform erhalten werden kann, um die Bioti
nylierung, die in einer chemischen Reaktion erfolgt, durch
führen zu können.
Für bestimmte Anwendungen ist jedoch eine Biotinylierung nicht
oder zumindest nicht in einfacher Weise möglich, wie bei
spielsweise beim Nachweis und bei der Aufreinigung rekombinant
hergestellter Proteine, die zuvor noch nicht isoliert wurden.
In der Vergangenheit wurde daher nach Wegen gesucht, das Bio
tin/Streptavidin-System zu modifizieren, um seinen Anwendungs
bereich zu erweitern.
Ein erfolgreicher Ansatz bestand in der Herstellung von Pep
tidliganden, die ebenfalls eine spezifische Bindungsaffinität
zu Streptavidin aufweisen. Geeignete Peptidliganden und ent
sprechende Fusionsproteine sind in DE-OS 42 37 113 offenbart.
Der Vorteil dieser Peptidliganden im Vergleich zu Biotin be
steht im wesentlichen darin, daß deren kodierende Sequenz auf
DNA-Ebene mit dem Gen eines gewünschten Proteins verknüpft und
anschließend zusammen mit der des Proteins koexprimiert werden
kann, wodurch ein mit dem Peptidliganden markiertes, d. h. an
ihn fusioniertes, rekombinantes Protein gebildet wird. Auf
grund der geringen Größe der Peptidliganden und der Tatsache,
daß sie an den N- oder C-Terminus des gewünschten Proteins
angehängt werden können, d. h. also in Bereichen, die für die
Struktur und biochemische Funktion eines Proteins häufig keine
große Bedeutung haben, ist es im allgemeinen auch nicht not
wendig, nach der Isolierung und vor Verwendung des Proteins zu
anderen Zwecken den Peptidliganden wieder abzuspalten, so daß
auch diesbezüglich eine günstige Verfahrensökonomie gegeben
ist. In der Tat ist bisher kein Fall bekannt geworden, bei dem
eine Abspaltung erforderlich gewesen wäre. Sollte dennoch die
Notwendigkeit der Abspaltung bestehen, kann dies durch Inse
rierung einer Proteasespaltstelle zwischen Bindungspeptid und
Proteinsequenz bewerkstelligt werden.
Geeignete derartige Peptidliganden sind ausführlich beschrie
ben, beispielsweise bei Schmidt und Skerra, Protein Eng. 6
(1993), 109-122 und J. Chromatogr. A 676 (1994), 337-345 sowie
bei Schmidt et al., J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766.
Vorteile des Streptavidin-Peptidligand-Systems bestehen darin,
daß die Reinigung rekombinanter Proteine überhaupt möglich
wird und daß diese Reinigung z. B. durch Affinitätschromatogra
phie unter sehr milden Elutionsbedingungen erfolgen kann, da
der gebundene Peptidligand als Teil des rekombinanten Proteins
kompetitiv von Biotin bzw. dessen Derivaten verdrängt wird.
Außerdem gelingt über den Peptidliganden der Nachweis des
rekombinanten Proteins beispielsweise durch Western Blot,
ELISA oder durch Immunmikroskopie mittels geeigneter Strepta
vidinkonjugate.
Ein Nachteil dieses Systems bestand bisher in einer relativ
niedrigen Affinität. Für den Komplex zwischen Streptavidin und
dem als Strep-tag bezeichneten Peptidliganden (AWRHPQFGG)
wurde mittels isothermer Titrationskalorimetrie eine Affini
tätskonstante von 2,7 . 104 M-1 bestimmt. Obwohl es Hinweise
gab, daß die Bindung für ein den Peptidliganden enthaltendes
Fusionsprotein etwas stärker sein könnte, ist es wün
schenswert, über ein System mit prinzipiell verbesserter Affi
nität zu verfügen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit
darin, das System Streptavidin/Peptidligand hinsichtlich der
Bindungsstärke zu optimieren.
Nach anfangs durchgeführten Versuchen, die Sequenz des Peptid
liganden weiter zu optimieren, mußte davon ausgegangen werden,
daß die Peptidliganden gemäß DE-OS-42 37 113 offensichtlich
bereits ein Optimum darstellten und dieser Ansatz somit wenig
erfolgversprechend war.
Mit der Verfügbarkeit der Kristallstruktur des Strepta
vidin/Peptidligand-Komplexes in hoher Auflösung konnte zwar
ein besseres Verständnis der molekularen Wechselwirkungen bzw.
der strukturellen Merkmale gewonnen werden (Schmidt et al.
1996), supra), es konnte aus diesen Strukturdaten jedoch keine
klare Information erhalten werden ob und in welcher Weise eine
Modifizierung der Peptidsequenz oder des Streptavidins in ra
tionaler Weise durchgeführt werden kann, um die Affinität zu
verbessern und somit die eingangs gestellte Aufgabe zu lösen.
In einem evolutiven Forschungsansatz wurde nun überraschender
weise festgestellt, daß eine Verbesserung der Bindungsaffi
nität für das Streptavidin/Peptidligand-System durch Mutation
im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 53 von Streptavidin
erreicht werden kann.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Poly
peptid, ausgewählt aus Muteinen von Streptavidin, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß es (a) innerhalb des Bereichs
der Aminosäure-Positionen 44 bis 53, bezogen auf die Aminosäu
resequenz von Wildtyp-(wt)-Streptavidin (Nomenklatur gemäß
Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882),
mindestens eine Mutation, insbesondere einen Aminosäureaus
tausch enthält und (b) eine höhere Bindungsaffinität für Pep
tidliganden, umfassend die Aminosäuresequenz Trp-X-His-Pro-
Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y
und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeu
ten, aufweist als wt-Streptavidin.
Außerhalb des Bereichs der Aminosäurepositionen 44 bis 53
können die Streptavidinmuteine der vorliegenden Erfindung der
Aminosäuresequenz von wt-Streptavidin entsprechen. Anderer
seits kann die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Muteine
auch außerhalb des Bereichs der Aminosäuren 44 bis 53 Unter
schiede zur wt-Streptavidinsequenz aufweisen. Derartige Va
rianten der Streptavidinsequenz umfassen natürlich vorkommende
sowie künstlich erzeugte Varianten und unter den Abweichungen
werden Austausche, Insertionen, Deletionen von Aminosäurere
sten sowie N- oder/und C-terminale Additionen verstanden.
Die Angabe "höhere Bindungsaffinität" bezieht sich im Sinne
der vorliegenden Anmeldung auf einen Komplex aus einem erfin
dungsgemäßen Streptavidinmutein und einem Peptidliganden gemäß
DE-OS-42 37 113 und kann durch übliche Verfahren, z. B. ELISA,
Fluoreszenztitration oder Titrationskalorimetrie bestimmt
werden. Die auf diese Weise bestimmte Bindungsaffinität wird
durch Kenngrößen angegeben, wie etwa Affinitäts- und Dissozia
tionskonstante oder thermodynamische Parameter. Die Erhöhung
der Bindungsaffinität, die mit einem erfindungsgemäß innerhalb
des Bereichs der Aminosäurepositionen 44 bis 53 veränderten
Streptavidinmutein im Vergleich zum entsprechenden unveränder
ten Streptavidin erhalten wird, beträgt im allgemeinen minde
stens Faktor 5, bevorzugt mindestens Faktor 10 und stärker
bevorzugt mindestens Faktor 20. Bevorzugte erfindungsgemäße
Streptavidinmuteine umfassen mindestens eine Mutation im Be
reich der Aminosäurepositionen 44 bis 47.
Bevorzugte erfindungsgemäße Streptavidinmuteine sind von
Streptavidinvarianten abgeleitet, die am N- oder/und C-Termi
nus verkürzt sind. Besonders bevorzugt sind die aus dem Stand
der Technik bekannten Minimal-Streptavidine, die sowohl N- als
auch C-terminal verkürzt sind. Ein bevorzugtes Polypeptid
gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt außerhalb des mutage
nisierten Bereichs die Aminosäuresequenz eines Minimal-Strep
tavidins, das N-terminal im Bereich der Aminosäurepositionen
10 bis 16 beginnt und C-terminal im Bereich der Aminosäurepo
sitionen 133 bis 142 endet. Besonders bevorzugt entspricht das
Polypeptid außerhalb des Mutationsbereichs einem Minimal-
Streptavidin, das eine Aminosäuresequenz von Position Ala13 bis
Ser139 umfaßt und gegebenenfalls einen N-terminalen Methionin
rest aufweist. Die Numerierung von Aminosäurepositionen be
zieht sich in dieser Anmeldung durchgehend auf die Numerierung
von wt-Streptavidin (Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14
(1986), 1871-1882).
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Streptavidinmuteine sind
dadurch gekennzeichnet, daß an Position 44 Glu durch eine
hydrophobe aliphatische Aminosäure, z. B. Val, Ala, Ile oder
Leu, ersetzt ist, an Position 45 eine beliebige Aminosäure
vorhanden ist, an Position 46 eine hydrophobe aliphatische
Aminosäure vorhanden ist oder/und an Position 47 Val durch
eine basische Aminosäure, z. B. Arg oder Lys, insbesondere Arg,
ersetzt ist. Streptavidinmuteine, bei denen die hydrophobe
aliphatische Aminosäure an Position 46 Ala ist, d. h. daß an
Position 46 kein Austausch vorliegt, oder/und bei denen die
basische Aminosäure an Position 45 Arg ist, haben eine beson
ders hohe Affinität für die bei Schmidt et al., Supra, be
schriebenen Peptidliganden mit den Sequenzen AWRHPQFGG (Strep-
tag) bzw. WSHPQFEK (Strep-tag II).
Spezifische Beispiele für erfindungsgemäße Streptavidinmuteine
besitzen im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 die
Sequenzen Val44-Thr45-Ala46-Arg47 oder Ile44-Gly45-Ala46-Arg47.
Aus praktischen Erwägungen ist es wünschenswert, über einen
weiteren Liganden zu verfügen, der aufgrund einer höheren Bin
dungsaffinität oder/und bei Anwesenheit in höheren Konzentra
tionen die Bindung der vorstehend definierten Peptidliganden
(gemäß DE-OS-42 37 113) zum erfindungsgemäßen Streptavidinmu
tein wieder auflösen kann. Auf diese Weise ist es möglich,
einen gebundenen Peptidliganden bzw. Proteine, an die ein
Peptidligand fusioniert ist, unter sehr milden Elutionsbedin
gungen freizusetzen. Unter diesem Aspekt betrifft die vorlie
gende Erfindung somit solche erfindungsgemäßen Streptavidinmu
teine, deren Bindungsaffinität für Peptidliganden derart ist,
daß sie kompetitiv durch andere Streptavidin-Liganden, z. B.
Biotin, Iminobiotin, Liponsäure, Desthiobiotin, Diaminobiotin,
HABA (Hdroxyazobenzolbenzoesäure) oder/und Dimethyl-HABA,
wieder eluiert werden können. Die Verwendung von gefärbten
Substanzen wie etwa HABA hat den Vorteil, daß die Elution
visuell überprüft werden kann.
Ungeachtet dessen ist jedoch, wie vorstehend definiert, die
Bindungsaffinität des Streptavidinmuteins für Peptidliganden
höher als die des zugrundeliegenden wt-Streptavidins. Die
Bindungsaffinität, ausgedrückt als Affinitätskonstante, ist
somit bezogen auf den Peptidliganden ABRHPQFGG (im folgenden
auch als Strep-tag bezeichnet) größer als 2,7 . 104 M-1 bzw.
bezogen auf WSHPQFEK (im folgenden auch als Strep-tag II be
zeichnet) größer als 1,4 . 104 M-1, d. h. größer als die ver
öffentlichten Werte für die Komplexbildung der jeweiligen
Peptidliganden mit wt-Streptavidin (innerhalb der Fehlergren
zen). Im allgemeinen liegt die Affinitätskonstante für das
Strep-tag II mindestens um einen Faktor 10, bevorzugt um einen
Faktor 10 bis 200 über den jeweiligen Werten für wt-Streptavi
din.
Für bestimmte Nachweisverfahren kann es bevorzugt sein, die
Streptavidinmuteine der vorliegenden Erfindung in markierter
Form zu verwenden. Demgemäß ist ein weiterer Gegenstand dieser
Erfindung ein erfindungsgemäßes Polypeptid, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß es zumindest eine Markierung trägt.
Geeignete Markierungsgruppen sind dem Fachmann bekannt und
umfassen die üblichen Radio-, Fluoreszenz-, Lumineszenz- und
Chromophormarkierungen sowie Substanzen bzw. Enzyme, die in
einer chemischen oder enzymatischen Reaktion ein bestimmbares
Substrat erzeugen. Dabei können alle für wt-Streptavidin be
kannten Markierungen auch an die erfindungsgemäßen Streptavi
dinmuteine gekoppelt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung
eine Nukleinsäure, die eine für das Streptavidin kodierende
Sequenz umfaßt. Eine derartige Nukleinsäure ist gegebenenfalls
operativ mit einer für ein Signalpeptid kodierenden Sequenz
verknüpft und in einer besonderen Ausführungsform ist die für
das Signalpeptid kodierende Sequenz die Sequenz für das OmpA-
Signalpeptid. Darüberhinaus können jedoch auch, insbesondere
in Abhängigkeit des verwendeten Expressionssystems bzw. der
Wirtszelle, andere Signalpeptide verwendet werden und sogar
bevorzugt sein. Derartige Signalpeptide sind im Stand der
Technik in großer Anzahl bekannt und werden hier nicht einge
hend erläutert. Bevorzugt ist aber die cytoplasmatische Ex
pression, d. h. mit einem Start-Methionin anstelle der Signal
sequenz (vgl. Schmidt und Skerra (1994), supra).
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung
einen Vektor, der mindestens eine Kopie einer vorstehend ge
nannten Nukleinsäure in operativ funktioneller Umgebung ent
hält. Unter einer operativ funktionellen Umgebung werden
solche Elemente verstanden, die die Expression, d. h. Trans
kription oder/und eine nachfolgende Prozessierung der mRNA
ermöglichen, begünstigen, erleichtern oder/und erhöhen. Bei
spiele für derartige Elemente sind etwa Promotoren, Enhancer,
Transkriptionsinitiationsstellen und -terminationsstellen,
Translationsinitiationsstellen, polyA-Stellen etc.
Der Vektor wird in Abhängigkeit vom vorgesehenen Expressions
system ausgewählt und hierfür kommen sowohl single copy-Plas
mide, multi copy-Plasmide als auch Vehikel, die eine Integra
tion der Nukleinsäure in das Wirtsgenom begünstigen, in Be
tracht. Geeignete Vektoren sind in großer Anzahl aus dem Stand
der Technik bekannt und werden hierin nicht ausführlich be
schrieben. Sie enthalten gegebenenfalls übliche, für Vektoren
verwendete Elemente, wie Resistenzen, Selektionsmarker
oder/und Elemente, die z. B. eine Amplifizierung der Nuklein
säure oder die Induktion der Expression gestatten.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung
eine Zelle, die mit einem derartigen Vektor, welcher als In
sert mindestens eine Kopie einer für ein erfindungsgemäßes
Streptavidinmutein kodierenden Nukleinsäuresequenz trägt,
transformiert oder transfiziert ist. Die Auswahl der Zelle ist
nicht sonderlich kritisch und im allgemeinen können beliebige
Zellen, die für derartige Zwecke geeignet sind, verwendet
werden. Es kommen sowohl prokaryontische als auch eukaryon
tische Zellen sowie Hefen in Betracht. Aus praktischen Gründen
werden zur Expression eines unglykosilierten Proteins wie im
vorliegenden Fall im allgemeinen prokaryontische Zellen bevor
zugt und insbesondere E. coli.
Unter einem nochmals anderen Aspekt betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsge
mäßen Streptavidinmuteins, welches durch die folgenden
Schritte gekennzeichnet ist:
- (a) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für das Streptavidinmutein kodierende Nukleinsäure umfaßt,
- (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen eine Expression des Streptavidinmuteins erfolgt,
- (c) Gewinnen des Polypeptids.
Bezüglich des Herstellungsverfahrens ist zu beachten, daß die
erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine aufgrund ihrer Bindungs
fähigkeit mit dem zelleigenen Biotin eine toxische Wirkung
ausüben können. Die Bedingungen beim Kultivieren der Wirts
zelle sollten daher so gewählt werden, daß das entstehende
Expressionsprodukt entweder mittels einer geeigneten Signalse
quenz aus dem Inneren der verwendeten Wirtszelle z. B. in das
Periplasma oder das Kulturmedium ausgeschleust wird oder in
Form unlöslicher Inclusion bodies (Einschlußkörper) im Inneren
der Zelle aggregiert. Im ersteren Fall kann das erfindungs
gemäße Streptavidinmutein aus der periplasmatischen Zellfrak
tion oder dem Zellüberstand gewonnen werden, während im letz
teren Fall Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens die
Lyse der Wirtszellen, die Gewinnung des Streptavidinmuteins in
Form von Inclusion bodies und die Renaturierung des Streptavi
dinmuteins umfaßt. Als Wirtszelle ist in diesem Fall E. coli
bevorzugt.
Die praktischen Anwendungsmöglichkeiten für die erfindungs
gemäßen Streptavidinmuteine bzw. das System Streptavidinmu
tein/Peptidligand entsprechen im wesentlichen denjenigen der
herkömmlichen Systeme Streptavidin/Biotin bzw. Streptavidin/
Peptidligand. Vorteile ergeben sich insbesondere in Situatio
nen, bei denen eine höhere Bindungsstärke als zwischen nativem
Streptavidin und Peptidligand erwünscht ist, bzw. in Situatio
nen, bei denen eine Biotinylierung eines interessierenden
Substrats nicht möglich oder ungünstiger zu bewerkstelligen
ist als die entsprechende Verknüpfung mit einem Peptidligan
den.
Die Vorzüge gegenüber dem herkömmlichen Streptavidin/Biotin-
System kommen insbesondere bei der Affinitätschromatographie
bzw. in Reinigungs-, Isolierungs- oder Bestimmungsverfahren
für rekombinante Proteine zum Tragen. Demnach betrifft die
Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Strepta
vidinmuteins in einem Verfahren zur Isolierung, Reinigung oder
zum Nachweis eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der
Formel Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Ami
nosäure darstellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu
und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man eine
das zu isolierende oder zu reinigende Protein enthaltende
Flüssigkeit mit dem gegebenenfalls immobilisierten Streptavi
dinmutein unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt, um
eine Bindung der Peptidsequenz an das Streptavidinmutein zu
bewirken, den resultierenden Komplex aus der Flüssigkeit ab
trennt und das Protein aus dem Komplex freisetzt oder nach
weist. Besonders vorteilhaft wird die Peptidsequenz in Form
des Strep-tag oder Strep-tag II gewählt. Vorzugsweise ist die
Peptidsequenz an den N- oder/und C-Terminus des Proteins fu
sioniert. Das Streptavidinmutein kann an eine Festphase gebun
den oder mit ihr bindefähig sein.
Ein Vorzug bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Systems
Streptavidinmutein/Peptidligand in einem Isolierungs- oder
Reinigungsverfahren besteht darin, daß zur Elution des den
Peptidliganden tragenden Fusionsproteins sehr milde Bedingun
gen verwendet werden können. So kann eine mit dem Streptavi
dinmutein gekoppelte Festphase, wie etwa eine Affinitätschro
matographiesäule, an welche das Fusionsprotein adsorbiert
wurde, mit einer ausreichenden Konzentration eines Liganden,
ausgewählt aus Biotin und Derivaten davon, inkubiert werden,
um das Fusionsprotein aus dem Komplex freizusetzen. In diesem
Zusammenhang hat sich die Verwendung von Desthiobiotin als
besonders vorteilhaft herausgestellt.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine in
Nachweisverfahren kann im wesentlichen analog zu den entspre
chenden Verfahren erfolgen, die für herkömmliches Streptavidin
bekannt sind. Eine darüber hinausgehende Anwendungsmöglichkeit
ergibt sich bei der qualitativen oder quantitativen Bestimmung
eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-
His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure dar
stellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg
oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man das zu bestim
mende Protein mit einem markierten Streptavidinmutein unter
geeigneten Bedingungen, um eine Bindung der Peptidsequenz an
das Streptavidinmutein zu bewirken, in Kontakt bringt und die
Markierung bestimmt. Ein derartiges Bestimmungsverfahren kann
beispielsweise qualitativ zum Nachweis von Proteineri in We
stern Blots oder quantitativ als ELISA durchgeführt werden.
Geeignete Markierungen sind alle bekannten radioaktiven und
nichtradioaktiven Markierungsgruppen, z. B. Lumineszenzgruppen,
Enzyme, Metalle, Metallkomplexe etc. Das Streptavidin kann
direkt z. B. durch kovalente Kopplung markiert sein. Aber auch
indirekte Markierungen, z. B. markierte Anti-Streptavidin-Anti
körper oder biotinylierte Enzyme usw. können eingesetzt wer
den.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Strepatividinmuteine zur Immobilisierung
eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-
His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure dar
stellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg
oder Lys bedeuten, fusioniert ist. Diese Immobilisierung er
folgt vorzugsweise an mit Streptavidinmuteinen beschichteten
Festphasen wie etwa Mikrotiterplatten, Mikrobeads aus organi
schen oder aus paramagnetischen Materialien oder Sensorchips.
Außerdem ist es natürlich auch möglich, die erfindungsgemäßen
Streptavidinmuteine im herkömmlichen Streptavidin/Biotin(deri
vat)-System zu verwenden. In anderen Worten bedeutet dies die
Verwendung der erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine zur Be
stimmung oder Gewinnung von Substanzen, die eine mit Strepta
vidin bindefähige Gruppe tragen. Sofern nur ein Teil des wt-
Streptavidins durch die erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine
ersetzt wird, können dabei über die Ausbildung gemischter
Tetramere nochmals besondere Wirkungen erzielt werden.
Gemäß einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die Erfindung
auch einen Reagenzienkit, der ein erfindungsgemäßes Streptavi
dinmutein sowie gegebenenfalls übliche Puffer-, Hilfs- und
Zusatzstoffe umfaßt. Ein solcher Reagenzienkit ist insbeson
dere zur Verwendung in einem vorstehend beschriebenen Isolie
rungs-, Reinigungs- oder Bestimmungsverfahren vorgesehen. Der
Kit ist jedoch auch für andere Verfahren geeignet, bei denen
das herkömmliche Streptavidin/Biotin-System verwendet wird,
z. B. für Nukleinsäurehybridisierungsassays oder Immunoassays.
Der Reagenzienkit kann das erfindungsgemäße Streptavidinmutein
in festphasengebundener oder/und markierter Form enthalten.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die nachste
henden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 eine Schemazeichnung des Vektors pASK75-SAp dar
stellt;
Fig. 2 eine Graphik darstellt, welche die Bindungsaffinität
von rekombinantem wt-Streptavidin im Vergleich zu
erfindungsgemäßen Streptavidinmuteinen in einem
ELISA zeigt;
Fig. 3 die Bindungsaffinität von rekombinantem wt-Strepta
vidin im Vergleich zu einem erfindungsgemäßen Strep
tavidinmutein in einer Fluoreszenztitration zeigt
und
Fig. 4 die Reinigung eines Strep-tag-Fusionsproteins unter
Verwendung eines Streptavidinmuteins durch Affini
tätschromatographie zeigt.
Fig. 1 zeigt den Expressionsvektor pASK75-SAp, der eine für
ein Minimal-Streptavidin (Ala13 bis Ser139) kodierende Sequenz,
eine für das OmpA-Signalpeptid kodierende Sequenz, sowie den
Tetracyclin Promotor/Operator (tetP/O) zur Transkriptionsregula
tion enthält.
Weitere gekennzeichnete Regionen des Vektors sind die inter
genische Region des filamentösen Phagen f1 (f1-IG), der Repli
kationsursprung (ori), das β-Lactamasegen (bla) für die Ampi
cillinresistenz, das Tetracyclinrepressorgen (tetR) und der
Lipoprotein-Transkriptionsterminator (tlpp).
Das die kodierenden Sequenzen für Signalpeptid und Minimal-
Streptavidin enthaltende hybride Strukturgen beginnt an der
Xbal-Stelle und reicht stromabwärts bis zur HindIII-Stelle.
Der Übergang zwischen Signalsequenz und Streptavidin erfolgt
an der StuI/PvuII-Stelle. Die SacII-Stelle, die zum Inserieren
der mutierten Streptavidingensequenzen verwendet wurde, ist
ebenfalls angegeben.
Fig. 2 zeigt die verbesserte Affinität der erfindungsgemäßen
Streptavidinmuteine für den Peptidliganden Strep-tag II in
einem ELISA. Dazu wurden jeweils Reihen einer ELISA-Platte mit
äquivalenten Konzentrationen eines rekombinanten wt-Streptavi
din (Raute), des Muteins "1" (Kreis) oder "2" (Quadrat) be
schichtet oder lediglich mit BSA (Kreuz) abgesättigt. Nach
Absättigen und Waschen wurden die Vertiefungen mit einem ge
reinigten Fusionsprotein aus bakterieller Alkalischer Phospha
tase (PhoA) und Strep-tag II in den aus dem Graph ersichtli
chen Konzentrationen inkubiert. Nach Waschen zur Entfernung
von ungebundenem Protein wurde die Aktivität des gebundenen
PhoA-Strep-tagII-Fusionsproteins in Gegenwart von p-Nitrophe
nol gemessen. Die Daten wurden durch nicht-lineare Regression
nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate angepaßt. Die
folgenden Kd-Werte wurden erhalten: 0,21 µM für Mutein "1";
0,30 µM für Mutein "2"; 18 µM für rekombinantes wt-Streptavi
din.
Fig. 3 ist eine Graphik, welche die Bindungsaffinität von
rekombinantem wt-Streptavidin im Vergleich zu erfindungsgemä
ßen Streptavidinmuteinen in einer Fluoreszenztitration zeigt.
Eine Lösung des wt-Streptavidins (Raute), des Muteins "1"
(Kreis) oder "2" (Quadrat) wurde mit einer Lösung des synthe
tisierten Strep-tag II-Peptids, welches N-terminal mit Anthra
nilsäure derivatisiert war, titriert und die Fluoreszenz der
Tryptophan- und Tyrosinreste dabei gemessen (Anregung bei 280
nm; Emission bei 340 nm). Die experimentellen Bedingungen sind
in Beispiel 6 beschrieben. Durch nicht-lineare Regression der
Datenpunkte nach der Theorie einfacher Komplexbildung wurde
für den Peptidkomplex ein KD-Wert von 13,0 ± 1,3 µM für wt-
Streptavidin ermittelt, während die Mutanten "1" und "2" KD-
Werte von 1,37 ± 0,08 µM bzw. 1,02 ± 0,04 µM zeigten.
Fig. 4 zeigt die Reinigung des Fusionsproteins aus der bakte
riellen Alkalischen Phosphatase und Strep-tag II durch Affini
tätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten er
findungsgemäßen Streptavidinmuteins "1".
Fig. 4 zeigt das Elutionsprofil (anhand der Absorption des
Eluats bei 280 nm) bei der affinitätschromatographischen Rei
nigung des Fusionsproteins der bakteriellen Alkalischen Phos
phatase mit dem Strep-tag II aus dem bakteriellen periplasma
tischen Zellextrakt unter Verwendung des immobilisierten
Streptavidinmuteins "1". Die experimentellen Bedinungen sind
in Beispiel 4 beschrieben. Nach Entfernung der Wirtsproteine
durch Waschen mit Chromatographiepuffer wurde nacheinander mit
Lösungen von Diaminobiotin (dab), Desthiobiotin (dtb) und
Biotin eluiert. In Gegenwart von Destiobiotin wurde das gefun
dene Fusionsprotein nahezu quantitativ eluiert. Anschließende
Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte eine
praktisch vollständige Reinheit des so isolierten Proteins.
DNA-Manipulationen wurden nach gängigen gentechnischen Metho
den durchgeführt (s. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning.
A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press). Zur
Klonierung und Expression wurde im allgemeinen der E. coli
K12-Stamm JM83 (Yanisch-Peron et al., (1985), Gene 33, 103-119)
verwendet, mit Ausnahme der Expression unter Kontrolle
des T7-Promotors, die gemäß Schmidt und Skerra (1994), supra,
durchgeführt wurde. Sequenzierungen wurden durch Plasmidse
quenzierung nach der üblichen Didesoxytechnik durchgeführt,
unter Verwendung des T7-Sequenzierkits von Pharmacia,
Freiburg. Die Synthese der Primer bzw. Oligonukleotide er
folgte unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Synthese
automaten.
Zur Konstruktion des Vektors pASK75-SAp, der die für ein Mini
mal-Streptavidin kodierende Gensequenz, fusioniert an die
kodierende Sequenz des OmpA-Signalpeptids, trägt (vgl. Fig.
1), wurde die für Minimal-Streptavidin kodierende Sequenz aus
dem Expressionsvektor pSA1 (Schmidt und Skerra, (1994), supra)
unter Verwendung der Primer
und Taq-DNA-Polymerase durch PCR amplifiziert, das Reaktions
produkt über Gelelektrophorese gereinigt, mit PvuII und
HindIII geschnitten und in das mit StuI und HindIII geschnit
tene Vektorfragment von pASK75 ligiert. Die vollständige Nu
kleotidsequenz von pASK75 ist in DE-A-44 17 598.1 angegeben.
Der dadurch erzeugte Vektor pASK75-SAp umfaßt eine DNA-Se
quenz, die für das OmpA-Signalpeptid, fusioniert an Minimal-
Streptavidin, beginnend mit Ala13 kodiert.
Eine Plasmidbank mit DNA-Sequenzen, die für im Bereich der
Aminosäurepositionen 44 bis 47 (bezogen auf wt-Streptavidin)
mutagenisierte Streptavidinderivate kodieren, wurde herge
stellt durch PCR-Amplifizierung von pASK75-SAp unter Verwen
dung der folgenden Primer:
Auf diese Weise wurden DNA-Sequenzen erzeugt, die an jeder der
vier Positionen 44 bis 47 32-fach degenerierte Codons für
jeweils alle 20 Aminosäuren bzw. ein Stopcodon enthielten.
Zusätzlich wurde an der Stelle im Bereich der Codons für die
Aminosäuren 41/42 eine KpnI-Restriktionsstelle erzeugt. Die
resultierenden PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese ge
reinigt, mit SacII und HindIII gespalten und in das entspre
chend gespaltene Vektorfragment von pASK75-SAp ligiert.
Mit dem Vektorgemisch wurden E.coli JM83-Zellen unter Verwen
dung des Calciumchloridverfahrens (Sambrook et al., 1989)
transformiert.
Zur Identifizierung von Streptavidinmuteinen mit erhöhter
Bindungsaffinität für Peptidliganden wurde ein Fusionsprotein
aus der Alkalischen Phosphatase von E.coli (PhoA) und dem
Strep-tagII-Peptid (WSHPQFEK) hergestellt, welches an ihren C-
Terminus angehängt wurde. Hierzu wurde das vollständige phoA-
Gen einschließlich der eigenen Signalsequenz und Translations
initiationsregion aus chromosomaler E.coli K12 W3110-DNA
(Bachmann, Bacteriol. Rev. 36 (1972), 525-557) unter Verwen
dung der Phosphorthioat-Primer
und Pfu-DNA-Polymerase gemäß einer von Skerra (Nucleic Acids
Res. 20 (1992), 3551 bis 3554) publizierten Methode durch PCR
amplifiziert. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde
gereinigt und mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten.
Dieses DNA-Fragment wurde dann in mehreren Schritten unter
Austausch der Region zwischen XbaI und Eco47III in das Plasmid
pASK75-strepII (konstruiert aus pASK75 durch ortsspezifische
Mutagenese unter Verwendung des Oligodeoxynukleotids 5'-CAC
AGG TCA AGC TTA TTA TTT TTC GAA CTG CGG GTG AGA CCA AGC GCT
GCC TGC) inseriert, wobei das Expressionsplasmid pASK75-PhoA
strep II erhalten wurde.
Die Proteinproduktion erfolgte in 2 l LB-Medium mit 100 µg/ml
Ampicillin, wobei die Genexpression bei A550 = 0,5 durch Zugabe
von 0,2 µg/ml Anhydrotetracyclin induziert wurde. Die Induk
tion erfolgte über Nacht bei einer Temperatur von 37°C. Das
PhoA/Strep-tag II Fusionsenzym wurde dann aus der periplasma
tischen Zellfraktion durch Streptavidin-Affinitätschromatogra
phie unter Verwendung von Diaminobiotin als Elutionsmittel
gemäß der Prozedur von Schmidt und Skerra (1994), supra, ge
reinigt. Aufgrund des Vorhandenseins von Zn(II)- und Mg(II)-
Ionen im aktiven Zentrum des Enzyms enthielt der Chromato
graphiepuffer kein EDTA.
Die in Beispiel 1 erhaltene Plasmidbank wurde auf einer hydro
philen GVWP-Membran (Millipore, Eschborn) ausplattiert, die
auf eine Agarplatte mit LB-Medium enthaltend 100 µg/ml Ampi
cillin gelegt worden war. Die Membran wurde bei 37°C für 7 bis
8 Stunden inkubiert, bis Kolonien sichtbar wurden.
Dann wurde eine zweite Membran vorbereitet, eine Immobilon P-
Membran (Millipore, Eschborn), die mit Anti-Streptavidin-
Immunglobulin (Sigma, Deisenhofen) in einer Konzentration von
720 µg/ml in PBS (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl) ca.
sechs Stunden beschichtet und danach in 3% w/v Rinderserumal
bumin (BSA), 0,5% v/v Tween in PBS ca. 2 Stunden blockiert
wurde.
Diese zweite Membran wurde auf eine M9-Minimalagarplatte, die
100 µg/ml Ampicillin und 0,2 µg/ml Anhydrotetracyclin ent
hielt, gelegt. Anschließend wurde die GVWP-Membran mit den
Kolonien auf der Oberseite auf die zweite Membran gelegt und
die relativen Positionen der beiden Membranen markiert. Nach
Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde die obere Mem
bran mit den Kolonien abgenommen und auf einer frischen LB-
Ampicillin-Agarplatte bei 4°C gelagert. Die zweite Membran
wurde ebenfalls von der Agarplatte abgenommen und dreimal eine
Minute unter Schütteln in PBS/Tween (0,1% v/v Tween in PBS)
gewaschen. Danach wurde die Membran mit 10 ml frischer PBS/Tween-Lösung,
enthaltend das gereinigte PhoA/Strep-tagII-Fu
sionsprotein (ca. 1-2 µg/ml), versetzt. Nach einstündiger
Inkubation bei Raumtemperatur wurde jeweils zweimal in PBS/Tween
und PBS-Puffer nachgewaschen. Die Signalentwicklung
erfolgte während 1 bis 2 Stunden in Gegenwart von 10 ml AP-
Puffer (100 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) unter
Zugabe von 30 µl Brom-Chlor-Indolylphosphat (BCIP) (50 mg/ml
in Dimethylformamid) und 5 µl Nitroblau-Tetrazolium (NBT) (75
mg/ml in 70% v/v Dimethylformamid). Den dabei entstandenen
Farbpunkten wurden entsprechende Kolonien auf der ersten Mem
bran zugeordnet. Nach Isolierung und Kultivierung dieser Klone
wurden zwei Streptavidinmuteine "1" und "2" identifiziert. Die
Nucleotid- und Aminosäuresequenzen in der mutagenisierten
Region für wt-Streptavidin und für die Muteine waren wie
folgt:
Zur Herstellung der Streptavidinmuteine im präparativen Maß
stab wurde das bekannte Expressionssystem für rekombinantes
Minimal-Streptavidin (Schmidt und Skerra (1994), supra) ver
wendet. Dazu wurde aus dem Vektor pSA1, der die kodierende
Region von wt-Streptavidin trägt und den T7-Promotor enthält,
der Großteil der kodierenden Region unter Verwendung der sin
gulären SacII- und HindIII-Restriktionsstellen entfernt und
durch die entsprechenden Bereiche aus den mutierten pASK75-
SAp-Plasmiden setzt. wt-Streptavidin und die Streptavidinmu
teine wurden danach in Form cytoplasmatischer Einschlußkörper
exprimiert, solubilisiert, renaturiert und durch fraktionierte
Ammoniumsulfatpräzipitation gereinigt, wie bei Schmidt und
Skerra (1994), supra beschrieben. Die Reinheit der Proteine
wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung des diskontinuierlichen
Puffersystems von Fling und Gregerson (Anal. Biochem. 155
(1986), 83-88) überprüft. Die Charakterisierung der gereinig
ten, gegen Wasser dialysierten Proteine durch Elektrospray-
Ionisations-Massenspektrometrie ergab Massen von 13334 für das
rekombinante wt-Streptavidin (theoretisch 13331,5), 13371 für
Mutein "1" (theoretisch 13372,6) und 13344 für Mutein "2"
(theoretisch 13342,5).
Die in Beispiel 3 hergestellten Streptavidinmuteine sowie wt-
Streptavidin wurden mit einer Beladung von 5 mg Protein pro ml
gequollenem Gel an NHS-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia
Freiburg) gekoppelt (Schmidt & Skerra, 1994, Supra). Nach
Blockierung der restlichen aktiven Gruppen mit 100 mM Tris/HCl,
pH 8,0 über Nacht wurden 2 ml des Gels in eine Säule mit
einem Durchmesser von 7 mm eingebracht. Um das Verhalten der
auf diese Weise immobilisierten Streptavidinmuteine bei der
Affinitätsreinigung von Strep-tag oder Strep-tag II-tragenden
Fusionsproteinen zu untersuchen, wurde der rekombinante Prote
aseinhibitor Cystatin (Schmidt & Skerra 1994, supra), der
entweder mit dem Strep-tag oder dem Strep-tag II fusioniert
war, sowie das vorstehend erwähnte PhoA/Strep tag-II Fusions
protein verwendet. Die Fusionsproteine wurden in einem Expres
sionsystem durch Sekretion in den periplasmatischen Raum pro
duziert und die periplasmatische Zellfraktion wurde wie in
Schmidt & Skerra (1994), supra beschrieben, präpariert.
Die Chromatographie erfolgte in Gegenwart von 100 mM Tris/HCl,
pH 8,0, enthaltend 1 mM EDTA (außer bei PhoA) unter Verwendung
einer Flußrate von ca. 20 ml/h und Messung der Eluatabsorption
bei 280 nm. Nach Auftragen einer Probe von 10 ml, entsprechend
der periplasmatischen Zellfraktion von 1 l E.coli Kulturmediu
m, wurde die Säule gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm
die Basislinie erreicht hatte. Danach wurde gebundenes Protein
schrittweise eluiert, durch Auftragen von jeweils 10 ml Diami
nobiotin, Desthiobiotin und Biotin (alle von Sigma, Deisenho
fen) in einer Konzentration von 2,5 mM in Chromatographiepuf
fer und in der angegebenen Reihenfolge.
Es zeigte sich, daß im Gegensatz zu wt-Streptavidin die Anwen
dung von Diaminobiotin bei den Streptavidinmuteinen nicht zu
einer Elution führte. Bei Verwendung des mit höherer Affinität
an Streptavidin bindenden Biotinderivats Desthiobition wurde
auch bei den Muteinen eine Elution in einem scharfen Maximum
erreicht. Diese war quantitativ, da bei der nachfolgenden Elu
tion mit Biotin keine wesentliche Menge an Fusionsprotein im
Eluat nachgewiesen werden konnte (vgl. Fig. 4).
Zur Bestimmung der Bindungsaffinität der Streptavidinmuteine
für den Peptidliganden Strep-tagII wurde ein ELISA durchge
führt.
Die Vertiefungen einer 96-Loch Mikrotiterplatte (Becton Dik
kinson and Co., Oxnard, CA) wurden mit 100 µl einer Lösung von
rekombinantem wt-Streptavidin bzw. der Muteine "1" oder "2" in
einer Konzentration von jeweils 100 µg/ml in 50 mM NaHCO3, pH
9,6 über Nacht beschichtet. Die Vertiefungen wurden danach 2,5
h mit 3% w/v BSA, 0,5% v/v Tween in PBS blockiert. Nach
dreimaligem Waschen mit PBS/Tween wurden 50 µl des gleichen
Puffers zu jeder Vertiefung gegeben. In die erste Vertiefung
in jeder Reihe wurden 20 µl einer Lösung aus 20 µl von 4,85 µM
gereinigtem und dialysiertem PhoA/Strep tag II Fusionsprotein
plus 30 µl PBS/Tween gegeben und gemischt. Für die weiteren
Vertiefungen einer Reihe wurde eine Verdünnungsserie erstellt,
indem 50 µl (von insgesamt 100 µl) aus der ersten Vertiefung
herauspipettiert und mit dem Inhalt (50 µl) der nächsten Ver
tiefung in derselben Reihe vermischt wurden usw. Auf diese
Weise wurden Konzentrationen des Fusionsproteins zwischen 970
nM in der ersten Vertiefung jeder Reihe und 0,19 nM in der
zehnten Vertiefung erhalten.
Nach einstündiger Inkubation wurden die Lösungen entfernt und
die Vertiefungen jeweils zweimal mit PBS/Tween und mit PBS
gewaschen. Danach wurden 100 µl einer Lösung aus 0,5 mg/ml p-
Nitrophenylphosphat in 1 mM ZnSO4, 5 mM MgCl2, 1 mM Tris/HCl,
pH 8,0 in jede Vertiefung pipettiert. Die Aktivität des gebun
denen Fusionsproteins wurde unter Verwendung eines SpektraMAX
250 Photometers (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) als Absorp
tionsänderung bei 410 nm pro Zeit gemessen.
Die Auswertung der Daten erfolgte unter der Annahme eines
einfachen Bindungsgleichgewichts zwischen Streptavidin (Mu
tein), Monomeren (P) und PhoA/Strep-tag II Fusionsprotein (L),
wodurch die Dissoziationskonstante zu KD = [P] [L]/[P.L] gegeben
ist. Unter der Bedingung, daß [P]TOT = [P] + [P.L] und daß [L]
sehr viel größer als [P.L] ist, so daß [L]TOT ungefähr gleich
[L] ist, gilt für die Menge des gebundenen Fusionsproteins
[P.L] = [L]TOT [P]TOT/(KD + [L]TOT). Die graphische Auswertung der
erhaltenen Versuchsergebnisse ist in Fig. 2 gezeigt.
Aus den Bindungskurven ist ersichtlich, daß die zwei Strepta
vidinmuteine eine sehr ähnliche Affinität für das Strep-tag II
Fusionsprotein aufweisen, die um mehr als eine Größenordnung
über der Affinität von wt-Streptavidin liegt.
Zur Bestimmung der Dissoziationskonstante des 1 : 1-Komplexes
aus den Streptavidinmuteinen (als Monomer betrachtet) und dem
Peptidliganden wurde eine Fluoreszenztitration mit dem peptid
chemisch synthetisierten Strep-tag II durchgeführt.
Das Peptid mit der Sequenz Abz-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-
Lys-COOH (Abz steht für o-Aminobenzoesäure, d. h. Anthranilsäu
re) wurde an der festen Phase schrittweise aus Fmoc-geschützt
en Aminosäuren nach dem Fachmann bekannten Methoden in der
Reihenfolge vom C-Terminus zum N-Terminus synthetisiert, wobei
Abz als Boc-geschütztes Derivat im letzten Schitt gekoppelt
wurde. Das Peptid wurde anschließend vom Träger abgespalten
und von den Schutzgruppen befreit. Nach Reinigung durch HPLC
wurde die Molmasse mittels Felddesorptions-Massenspektrometrie
bestätigt.
Die Fluoreszenztitration wurde in einer 1.1 cm2-Quarzküvette,
welche bei 25°C thermostatisiert war, mit einem LS50-Fluores
zenzspektrophotometer der Firma Perkin Elmer (Langen) durch
geführt. Die Wellenlängen für Anregungen bzw. Emission betru
gen 280 nm sowie 340 nm, bei einer jeweiligen Schlitzbreite
von 5 nm. 2 ml der Lösung von wt-Streptavidin bzw. der Muteine
"1" und "2", welche wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt
und gegen 1 mM EDTA, 100 mM Tris/HCl pH 8,0 dialysiert worden
waren, wurden mit einer Konzentration von 1 µM (absorptions
photometrisch bestimmt für das jeweilige Monomer unter Ver
wendung eines Extinktionskoeffizienten von ε280 = 40455 M-1 cm-1)
in der Küvette vorgelegt. Dann wurden Volumina von 1 µl oder 4
µl einer 0,5 mM Lösung des Peptids in dem gleichen Puffer
wiederholt zupipettiert (insgesamt 40 µl) und nach Mischen mit
einem Rührfisch die Fluoreszenzintensität abgelesen. Die Aus
wertung der Daten erfolgte wie bei Fig. 3 beschrieben.
Claims (27)
1. Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen von Streptavidin,
dadurch gekennzeichnet,
daß es (a) innerhalb des Bereichs der Aminosäurepositio
nen 44 bis 53, bezogen auf die Aminosäuresequenz von
Wildtyp-Streptavidin, mindestens eine Mutation enthält
und (b) eine höhere Bindungsaffinität für Peptidliganden,
umfassend die Aminosäuresequenz Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-
Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und
Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeu
ten, aufweist als wt-Streptavidin.
2. Polypeptid nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß es das Mutein eines Minimal-Streptavidins ist, das N-
terminal im Bereich der Aminosäuren 10 bis 16 von Wild
typ-Streptavidin beginnt und C-terminal im Bereich der
Aminosäuren 133-142 von Wildtyp-Streptavidin endet.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß mindestens eine Mutation im Bereich der Aminosäure
positionen 44 bis 47 vorliegt.
4. Polypeptid nach Anspruch 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß an Position 44 Glu durch eine hydrophobe aliphatische
Aminosäure ersetzt ist, an Position 45 eine beliebige
Aminosäure vorhanden ist, an Position 46 eine hydrophobe
aliphatische Aminosäure vorhanden ist oder/und an Posi
tion 47 Val durch eine basische Aminosäure ersetzt ist.
5. Polypeptid nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß an Position 46 Ala vorhanden ist.
6. Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß an Position 47 Arg vorhanden ist.
7. Polypeptid nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 die
Sequenz Val44-Thr45-Ala46-Arg47 vorliegt.
8. Polypeptid nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 die
Sequenz Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 vorliegt.
9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bindungsaffinität für den Peptidliganden derart
ist, daß eine kompetitive Elution durch Streptavidin-
Liganden, ausgewählt aus Biotin, Iminobiotin, Liponsäure,
Desthiobiotin, Diaminobiotin, HABA oder/und Dimethyl-
HABA erfolgen kann.
10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Affinitätskonstante des Komplexes aus Polypeptid
und Peptidligand, bezogen auf AWRHPQFGG < 2,7 . 10-4 M-1, und
bezogen auf WSHPQFEK < 1,4 . 104 M-1 ist.
11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß es mindestens eine Markierungsgruppe trägt.
12. Nukleinsäure,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine für das Streptavidinmutein nach einem der
Ansprüche 1 bis 10 kodierende Sequenz umfaßt.
13. Vektor, umfassend mindestens eine Kopie einer Nuklein
säure nach Anspruch 12 in operativ funktioneller Umge
bung.
14. Zelle,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie mit einem Vektor nach Anspruch 13 transformiert
oder transfiziert ist.
15. Verfahren zur Herstellung eines Streptavidinmuteins nach
einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die
folgenden Schritte:
- (a) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für das Streptavidinmutein ko dierende Nukleinsäure umfaßt,
- (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen eine Expression des Streptavidinmuteins er folgt,
- (c) Gewinnen des Polypeptids.
16. Verfahren nach Anspruch 15,
wobei Schritt (c) Lyse der Wirtszellen, Gewinnung des
Streptavidinmuteins in Form von Inclusion bodies und
Renaturierung des Streptavidinmuteins umfaßt.
17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Expression in
Schritt (b) die Expression eines Signalpeptid-tragenden
Streptavidins und dessen Sekretion in das Periplasma der
Wirtszelle oder das Kulturmedium umfaßt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die
Wirtszelle E. coli ist.
19. Verwendung eines Streptavidinmuteins nach einem der An
sprüche 1 bis 11 in einem Verfahren zur Isolierung, Rei
nigung oder Bestimmung eines Proteins, das mit einer
Peptidsequenz der Formel Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei
X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und Z entwe
der beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten,
fusioniert ist, wobei man eine das zu isolierende, zu
reinigende oder zu bestimmende Protein enthaltende Flüs
sigkeit mit dem Streptavidinmutein unter geeigneten Be
dingungen, um eine Bindung der Peptidsequenz an das
Streptavidinmutein zu bewirken, in Kontakt bringt, den
resultierenden Komplex aus der Flüssigkeit abtrennt und
das Protein gegebenenfalls aus dem Komplex freisetzt oder
bestimmt.
20. Verwendung nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Streptavidinmutein an eine Festphase gebunden
oder mit ihr bindefähig ist.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zum Freisetzen des Fusionsproteins aus dem Kom
plex den Komplex mit einer ausreichenden Menge eines
Liganden für das Streptavidinmutein ausgewählt aus Biotin
und Derivaten davon inkubiert.
22. Verwendung nach Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Biotinderivat Desthiobiotin ist.
23. Verwendung eines markierten Streptavidinmuteins nach
Anspruch 11 in einem Verfahren zur Bestimmung eines Pro
teins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-His-
Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure dar
stellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z
Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man eine das
zu bestimmende Protein mit dem markierten Streptavidinmu
tein unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung der
Peptidsequenz an das Streptavidinmutein zu bewirken, in
Kontakt bringt, und die Markierung bestimmt.
24. Verwendung eines Streptavidinmuteins nach einem der An
sprüche 1 bis 11 zur Immobilisierung eines Proteins, das
mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-
Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y
und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys
bedeuten, fusioniert ist, an einer Festphase.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Peptidsequenz ausgewählt wird aus AWRHPQFGG oder
WSHPQFEK.
26. Verwendung eines Streptavidinmuteins nach einem der An
sprüche 1 bis 11 zur Bestimmung oder Gewinnung von Sub
stanzen, die eine mit Streptavidin bindefähige Gruppe
tragen.
27. Reagenzienkit zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19
bis 26, umfassend ein Streptavidinmutein nach einem der
Ansprüche 1 bis 11 sowie gegebenenfalls übliche Puffer-,
Hilfs- und Zusatzstoffe.
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