DE19533682A1 - Verfahren zum Anlagern und Immobilisieren von Heparin auf anorganischen Substratoberflächen von kardiovaskulären Implantanten - Google Patents

Description

Verfahren zum Anlagern und Immobilisieren von Heparin auf anorganischen Substratoberflächen von kardiovaskulären Implantaten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anlagern und Immobilisieren von Heparin auf anorganischen Substratoberflächen von kardiovaskulären Im­ plantaten, wie Herzklappen-Implantaten oder alloplastischen Gefäßwand­ stützen, die im Fachjargon üblicherweise als "Stents" bezeichnet werden.

Zum Hintergrund der Erfindung ist auszuführen, daß bei der Einpflanzung von kardiovaskulären Implantaten generell das Problem einer akuten Thrombenbildung an der Oberfläche dieser Implantate besteht, da das da­ mit in Kontakt kommende Blut zu Koagulation neigt. Um nun die Gefahr einer akuten Thrombenbildung zu reduzieren, ist es üblich, dem Patienten Antikoagulantien, z. B. Heparin-Präparate in hohen Dosierungen etwa durch Einspritzen in den Blutkreislauf zu verabreichen. Diese Art von Therapie ist jedoch mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden und da­ her grundsätzlich problematisch.

Ein Ansatz zur Lösung dieser Problematik besteht darin, gerinnungshem­ mende Medikamente auf der Oberfläche der Implantate chemisch zu binden. Damit wird das z. B. Heparin-Präparat, das auf katalytische Weise eine Koagulation des Blutes verhindert oder zumindest reduziert, nur dort ein­ gesetzt, wo diese Antikoagulationseigenschaften benötigt werden, nämlich im Kontaktbereich des Implantates mit dem Blut.

Es sind nun technische Verfahren zur Belegung organischer Materialien mit Antikoagulatien bekannt (siehe beispielsweise B. Seifert et al "Heparinisierte Polylaktide als bioresorbierbare hämokompatible Bioma­ terialien" in Biomedizinische Technik 1994; 39: S. 103 bis 104). Speziell im Zusammenhang mit Brustkorb-Drainagekathetern aus Polyvinylchlorid ist es bekannt, an das PVC-Material einen photoaktiven Polyacrylamid-Hepa­ rin-(Photo-PA/HEP-)-Komplex zu binden. Diese Photo-PA/HEP-Beschichtung führt zu einem Katheter mit einer benetzbaren Oberfläche und verbesserten Blutkontakteigenschaften. Spuren von Heparin werden dabei freigesetzt und letzteres gleichzeitig kovalent an die Oberfläche des Katheters gebunden. Bei einem derartig ausgerüsteten Brustkorb-Drainage-Katheter ist die Blut- Klumpen- und Thrombosebildung in dem Bereich minimiert, in dem der Katheter mit dem sich im Brustraum ansammelnden Blut in Kontakt steht. Die vorstehenden Erkenntnisse ergeben sich aus dem Fachbeitrag zum "Surfaces in Biomaterials Symposium" von P. Gingras et al "Surface Modi­ fication of Poly (Vinyl Chloride) Chest Drainage Catheters with Anticoagu­ lants for passive Drug Release".

Da nun die eingangs genannten kardiovaskulären Implantate aus anorga­ nischen Materialien, wie z. B. Tantal, einer Titaniegierung, medizinischem Stahl oder pyrolytischem Kohlenstoff bestehen bzw. eine anorganische Be­ schichtung beispielsweise aus amorphem Siliziumkarbid aufweisen, besteht das Problem ein entsprechendes Verfahren zu finden, um Heparin-Präpara­ te auf den genannten anorganischen Werkstoffen zu binden, damit kardio­ vaskuläre Implantate antikoagulative Eigenschaften aufweisen können.

Die Lösung dieses Problems ist im Anspruch 1 angegeben. Das demgemäß vorgeschlagene Verfahren weist folgendes Verfahrensschritte auf:

• - Aktivierung der anorganischen Substratoberfläche durch Anätzen,
• - Anlagern einer photoaktiven Benzophenonverbindung unter UV-Bestrah­ lung als Spacer mit einer Aminoschutzgruppe auf der aktivierten Sub­ stratoberfläche,
• - Abspaltung der Aminoschutzgruppe mit einer wasserfreien Piperidin­ lösung, und
• - kovalente Peptid-Bindung von Heparin an die freiliegenden und reak­ tionsfähigen Aminogruppen der Substratoberfläche durch deren Beauf­ schlagung mit einer wäßrigen Heparin-Lösung.

Auf diese Weise kann ein kardiovaskuläres Implantat mit einer anorgani­ schen Oberfläche hergestellt werden, an der biologisch aktives Heparin mit einer Oberflächenkonzentration von typischerweise 50 mIU/cm² ange­ lagert ist. Aufgrund der kovalenten Peptid-Bindung des Heparins bleibt dessen Aktivität in vitro über Tage und Wochen unverändert. Die Hepa­ rin-Aktivität hemmt in positiver Weise die Blutgerinnung an den kardio­ vasulären Implantaten, was durch um den Faktor 3,5 bis 4 gegenüber un­ behandelten Proben verlängerte Reaktions- und Gerinnselbildungszeiten bei der Thrombelastographie verifiziert werden kann.

Die Ansprüche 2 bis 8 kennzeichnen vorteilhafte Weiterbildungen des er­ findungsgemäßen Verfahrens. So kann das Heparin einerseits auf einer aktivierten Substratoberfläche auf Metall- oder Kohlenstoff-Basis direkt, andererseits aber auch auf der aktivierten Substratoberfläche einer amor­ phen Siliziumkarbid-Beschichtung des Implantats deponiert werden. Der­ artige amorphe Siliziumkarbid-Beschichtungen haben in jüngster Zeit ver­ stärkte Aufmerksamkeit als physiologisch günstige Beschichtungsart er­ fahren, deren positive Eigenschaften durch die hier beanspruchte Anlage­ rung und Immobilisierung von Heparin im Hinblick auf den erfindungsge­ mäß vorgesehenen Einsatzzweck noch stark verbessert werden können.

Die bevorzugtermaßen vorgenommene Aktivierung der Substratoberfläche durch Anätzen mit Fluorwasserstoff-Säure führt insbesondere im Zusammen­ hang mit einer amorphen Siliziumkarbid-Beschichtung zu einer wirksamen Protonierung der Oberfläche, was die Effektivität des weiteren Anlage­ rungsmechanismus unterstützt.

Die als photoaktive Beiizophenon-Verbindung bevorzugt verwendete Fmoc-p-Bz-Phe-OH-Lösung in N,N′-Dimethylformamid (DMF) beruht auf ei­ nem handelsüblichen Produkt Fmoc-p-Bz-Phe-OH, was den Herstellungsvor­ gang naturgemäß vereinfacht und rationeller gestaltet.

Die Ansprüche 6 bis 8 beziehen sich auf bevorzugte Verfahrensparameter im Zusammenhang mit der verwendeten wäßrigen Heparin-Lösung. Nähere Informationen darüber sind der Beschreibung des Ausführungsbeispiels entnehmbar.

Die Ansprüche 9 und 10 beziehen sich auf ein kardiovaskuläres Implantat, das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt ist, so daß Heparin als gerinnungshemmender Stoff mittels einer kovalenten Peptid­ bindung auf der Substratoberfläche angelagert und immobilisiert ist. Be­ vorzugtermaßen ist dabei die Substratoberfläche durch eine Beschichtung aus amorphem Siliziumkarbid gebildet.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem folgenden

Ausführungsbeispiel

Es ist vorwegzuschicken, daß das erfindungsgemäße Verfahren anhand der Anlagerung und Immobilisierung von Heparin auf einer Siliziumkarbid- (a-SiC : H)-Beschichtung (Probenfläche aus Tantal mit einer Beschichtung aus amorphem Siliziumkarbid, Probengröße 5 × 10 × 1 mm³) beschrieben wird. Die entsprechende Vorgehensweise und die mit der Probe erhaltenen Ergebnisse, wie sie im folgenden noch näher erläutert werden, können je­ doch ohne weiteres auf die Anlagerung und Immobilisierung von Heparin auf Stents übertragen werden, die mit einer Siliziumkarbid-Beschichtung versehen sind.

Zur Verfahrensweise ist auszuführen, daß die Siliziumkarbid-Oberfläche zunächst mit 40%-iger Fluorwasserstoff-Säure angeätzt wird. Dieses An­ ätzen führt zur Anlagerung von Protonen an der Oberfläche, was sich durch übliche infrarotspektroskopische Untersuchungen der a-SiC:H-Ober­ fläche ermitteln läßt.

Danach wird die Probenoberfläche mit Wasser gespült und die Probe in 2 ml einer 20×10^-6-molaren Fmoc-p-Bz-Phe-OH-Lösung in N,N′-Dimethyl­ formamid (DMF) inkubiert. Die als photoaktive Spacer-Substanz wirksame Fmoc-p-Bz-Phe-OH-Lösung ist als handelsübliches Produkt "Fmoc-p-Bz-Phe-OH", Produktnummer B 2220 der Firma "Bachem Biochemica GmbH", Heidelberg zu beziehen. Die Reduktion des Benzophenons wird durch die Bestrahlung mit UV-Licht eingeleitet. Nach der UV-Bestrahlung wird die Reaktionslösung abgegossen und die Probe mehrmals mit destilliertem Was­ ser gespült.

Der nächste Schritt umfaßt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mit 25%-iger Piperidinlösung in DMF. An der nun freiliegenden und reaktions­ fähigen Anlinogruppe erfolgt die Bindung des Heparins. Dazu wird die Probe in 1 ml einer wäßrigen Lösung, bestehend aus 10.000 IU Heparin und 50 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid-hydrochlorid für einige Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Reaktion wird durch das Abfritten der Reaktionslösung beendet.

Durch die vorstehend erläuterte Verfahrensweise wird auf der Siliziumkar­ bid-Oberfläche ein Siliziumkarbid-Spacer-Heparin-Komplex aufgebaut, wie er der folgenden Strukturformel entspricht.

Die Oberflächenkonzentration des biologisch aktiven Heparins auf der Pro­ be kann mittels einschlägiger biochemischer Verfahren zu 50 mIU/cm² be­ stimmt werden. Derartige Proben wurden weiterhin einem intensiven Spül­ vorgang in physiologischer Kochsalzlösung unterzogen, um das Verhalten der Heparin-Beschichtung im Blutstrom zu simulieren. Die entsprechenden Versuche ergaben, daß die biologische Aktivität auch nach einer Spülzeit von 14 Tagen nicht abnimmt. Dies bedeutet, daß praktisch eine 100%-ige Immobilisierung des Heparins auf der Siliziumkarbid-Oberfläche stattfin­ det.

Weiterhin wurde der Einfluß der Heparin-beladenen Beschichtung auf die Blutgerinnung durch den Vergleich der Thrombelastogramme von Proben mit Siliziumkarbid-Beschichtung ohne und mit Heparin-Anlagerung bestimmt. Die Thrombelastographie lieferte Reaktionszeiten und Gerinnselbildungs­ zeiten, die bei Proben mit Heparin-Anlagerung um den Faktor 3,5 bzw. 4 höher lagen als bei Siliziumkarbid-beschichteten Proben ohne Heparin-An­ lagerung. Diese Verzögerung der Blutgerinnung belegt, daß die Silizium­ karbid-Beschichtung mit Heparin-Anlagerung aufgrund ihrer biologischen Aktivität die Blutgerinnung an kardiovaskulären Implantaten hemmt.

Claims (10)

1. Verfahren zum Anlagern und Immobilisieren von Heparin auf organi­ schen Substratoberflächen von kardiovaskulären Implantaten, wie Herz­ klappen-Implantaten oder alloplastischen Gefäßwandstützen, mit folgenden Verfahrensschritten:

• - Aktivierung der anorganischen Substratoberfläche durch Abätzen,
• - Anlagern einer photoaktiven Benzophenonverbindung mit einer Amino­ schutzgruppe unter UV-Bestrahlung als Spacer auf der aktivierten Sub­ stratoberfläche,
• - Abspaltung der Aminoschutzgruppe mit einer wasserfreien Piperidin­ lösung, und
• - kovalente Peptid-Bindung von Heparin an die freiliegenden und re­ aktionsfähigen Aminogruppen der Substratoberfläche durch deren Beauf­ schlagung mit einer wäßrigen Heparin-Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Heparin auf einer aktivierten Substratoberfläche aus Tantal, Titanlegierung, medizi­ nischem Stahl oder pyrolytischem Kohlenstoff angelagert und immobilisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Heparin auf der aktivierten Substratoberfläche einer amorphen Silizumkarbid-Beschich­ tung des Implantates angelagert und immobilisiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der Substratoberfläche durch Anätzen mit Fluorwas­ serstoff-Säure, vorzugsweise mit 40%iger Fluorwasserstoff-Säure erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als photoaktive Benzophenonverbindung eine Fmoc-p-Bz-Phe-OH-Lösung in N,N′-Dimethylformamid verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Heparin-Lösung aus Heparin mit N-(3-Dimethylamino­ propyl)-N′-ethylcarbodiimid-hydrochlorid in Wasser besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Heparin-Lösung bezogen auf 1 ml Lösungsvolumen 10.000 IU Heparin und 50 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid-hydrochlorid enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratoberfläche mit der Heparin-Lösung für einen Zeitraum von 2 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur beaufschlagt wird.

9. Kardiovaskuläres Implantat, wie künstliche Herzklappe oder allopla­ stische Gefäßwandstütze, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und mit einer anorganischen Substratoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß Heparin mittels einer kovalenten Peptid­ bindung auf der Substratoberfläche angelagert und immobilisiert ist.

10. Kardiovaskuläres Implantat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratoberfläche durch eine Beschichtung aus amorphem Sili­ ziumkarbid gebildet ist.