DE1233095B

DE1233095B - Verfahren zur Gewinnung eines antiinflammatorisch wirksamen Produktes aus Citrus-Fruechten

Info

Publication number: DE1233095B
Application number: DEM65393A
Authority: DE
Inventors: Dr Peter Patt; Dr Guenther Vogel
Original assignee: Dr Madaus GmbH and Co
Current assignee: Madaus Holding GmbH
Priority date: 1965-05-28
Filing date: 1965-05-28
Publication date: 1967-01-26
Also published as: FR5508M; US3504085A

Description

Verfahren zur Gewinnung eines antiinflammatorisch wirksamen Produktes aus Citrus-Früchten In Citrus-Früchten, speziell in den vielen kultivierten Varietäten, kommen zahlreiche, zum Teil gut untersuchte Inhaltsstoffe vor, wovon einige dadurch besonderes Interesse beanspruchen, da sie spezifische pharmakologische Wirkungen entfalten.
So sind z. B. Vitamine und Provitamine mit ihrer eindeutigen Wirksamkeit als Inhaltsstoffe allgemein bekannt.
Weniger gut untersucht sind die Flavonoide hinsichtlich ihrer pharmakologischen Eigenschaften.
A. Szent G y ö r g y i (Nature London, 138, 27 [1936]), bezeichnete diese Substanzen in seinen Untersuchungen als »Permeabilitätsvitamine« oder »Vitamin P« bzw. »Faktor P«.
Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß in den Citrusarten eine antiinflammatorisch wirksame Fraktion nachgewiesen werden kann, die nicht identisch ist mit den bisher diskutierten Stoffen der Flavonoidreihe. Diese Fraktion hat in antiinflammatorischen Testen eine etwa 4'/2maul stärkere Wirkung als Hydrocortisonphosphat (L. F r e e d m a n, A. J. M e r -r i t t, Science, 139, 344 [1963]).
L. F reedman und A. J. Merritt gewinnen diese Fraktion dadurch, daß ein wasserlöslicher Trockenextrakt aus Schalen und Pulpe von Orangen und Grapefrüchten in Methanol gelöst und vom Ungelösten befreit wird. Durch Einengen der methanolischen Lösung und Zugabe des fünffachen Volumens Essigester fallen weitere Stoffe aus, die gleichfalls entfernt werden. Die klare Essigesterlösung ergibt beim Eindampfen zur Trockne ein gelbes Pulver.
Nach papierchromatographischer Trennung in sechs Komponenten auf Whatman-Papier Nr. 3, im System Butanol zu Eisessig zu Wasser (4: 1: 5), erwies sich eine der abgetrennten Zonen als antiinflammatorisch wirksam.
Es wurde demgegenüber überraschenderweise gefunden, daß auf einem völlig anderen Wege gleichfalls ein hochantiinflammatorisch wirksames Produkt durch eine einfache Ausfällung mit einem Elektrolyten gewonnen werden kann.
Nach diesem Verfahren kann das antiinfiammatorisch wirksame Produkt dadurch erhalten werden, daß ein wäßriger Extrakt aus zerkleinerten und entsafteten frischen Citrus-Früchten, getrockneten Schalen dieser Citrus-Früchte oder aus getrockneten unreifen Citrus-Früchten mit einem Volumen gesättigter wäßriger Lösung von Ammoniumsulfat behandelt und die dabei entstehende Fällung gewonnen wird.
Im einzelnen geht man so vor, daß die Früchte nach Vorzerkleinerung mit der 5- bis 10flachen Menge Wasser zu einem feinen Brei homogenisert und dabei gleichzeitig extrahiert werden. Die Zellteile und Schwebestoffe lassen sich auf Zentrifugen und/oder durch Filtration entfernen, so daß eine blanke Lösung erhalten wird. Diese Lösung versetzt man anschließend unter Rühren mit dem gleichen Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung. Es entsteht eine Fällung (feinst verteilt), die nach einigem Stehen (12 bis 24 Stunden) völlständig ist.
Die Fällung wird in der Zentrifuge gesammelt, abzentrifugiert und zum Schluß vorzugsweise im Vakuum bei 500 C getrocknet. Die getrocknete Fällung läßt sich leicht zu einem trockenen, nicht hygroskopischen Pulver verreiben.
Das trockene Produkt zeigt in einer Reihe von Testen eine hohe antiinflammatorische Wirksamkeit.
Es hemmt z. B. die Rattenpfoten-Ödeme nach intraplantarer Zufuhr der folgenden Substanzen: Histamin, Serotonin, Kaolin, Formalin und Bradykinin.
Die Deff 300/o (jene Dosis, die an einem ausreichend großen Kollektiv von Tieren eine mittlere Ödemhemmung von 300/o bewirkt) beträgt am Ovalbumin-Ödem der Rattenpfote = 1 mg/kg (bei i. v. Applikation).
Freedman und Merritt geben als entsprechende Dosis ihrer wirksamsten Fraktion 3 mg/kg an. Die von ihnen isolierte Substanz ist etwa 41/2mal wirksamer als Hydrocortisonphosphat. Auf das nach vorstehendem Verfahren gewonnene Produkt übertragen, bedeutet das eine zwölfmal stärkere Wirksamkeit gegenüber Hydrocortison.
Beim Vergleich mit einem bekannten Antiphlogistikum - Phenylbutazon - wird die starke antiinflammatorische Wirksamkeit des Pulvers noch deutlicher. So hemmt Phenylbutazon das Ovalbumin-Ödem von Ratten in einer Dosis von 60 mg/kg. Das Dextran-Ödem wird durch 200 mg/kg gehemmt D o m e n j o z, R., Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak., 225, 14 [1955]); und zur Hemmung des Kaolin- und Formalin-Ödems werden mindestens 100 mg/kg benötigt (T h e o b a 1 d, W., Inaug. Diss. Homburg/Saar, 1954). Diesem bekannten Antiphlogistikum gegenüber besitzt das nach dem vorstehenden Verfahren gewonnene Produkt somit eine etwa 60- bis 200mal stärkere antiinfiammatorische Wirksamkeit.
Das nach dem Verfahren gewonnene Produkt ist ferner in der Lage, die Kapillarresistenz (sogenannte Petechientest) der Vitamin-P-arm ernährten Ratte zu steigern. Die Kapillarpermeabilität, geprüft am Verhalten des sogenannten Polyvinylpyrrolidon-Ödems (zurMethodiks. Vogel,G. und M.-L.Marek, Arzneimittelforschung, 11, 356 [1961]) der Ratte (50 mg/kg i. y. gleichzeitig mit Ödemprovokation) und an dem Übertritt von Flüssigkeit und Polyvinylpyrrolidon aus dem Plasma in der Lymphe (zur Methodiks.Vogel, G.u.H.Ströcker, Pflügers Arch. ges. Physiol., 279, 187 [1964]) von Ratten (25 und 50 mg/2 ml/kg 1 Stunde nach Beginn des vierstündigen Versuchs) ergibt eine »Abdichtung« der Kapillarmembranen für Wasser und für Makromoleküle. Die durch Histamin bzw. physiologisch aktive Polypeptide wie Bradykinin und Kallidin gesteigerte Kapillarpermeabilität wird durch das erfindungsgemäß hergestellte Produkt wieder normalisiert.
Das Produkt vermag in Dosen von 0,5 bis 2,5 mg/ 0,5mol Herz am isolierten Meerschweinchenherzen nach L a n g e n d o r f f die coronare Perfusion um mehr als 60°/o zu steigern.
Das erfindungsgemäß gewonnene Produkt ist sehr gut verträglich; bis zu 100mg/kg i. v. bewirken an der Katze keine merkliche Blutdruckreaktion im arteriellen System.
Beispiel 1 Aus 2,6 kg frischen Citrusrückständen der Saftgewinnung wird ein wäßriger Extrakt hergestellt.
Hierzu wird die 5- bis 10fach Menge Wasser zugesetzt und die Masse so zerkleinert, daß nach etwa einer Stunde ein homogener Brei entstanden ist. Je nach der Citrusvarietät wird in Abhängigkeit vom Pektingehalt ein unterschiedlich viskoser Brei erhalten.
Die Wassermenge muß dabei so eingerichtet werden (5- bis 10flach), daß anschließend auf einer hochwirksamen Zentrifuge (10 bis 15000 g) und gegebenenfalls später bei Filtration die Zell- und Gewebeteile sowie Schwebestoffe entfernt werden können und eine blanke Lösung erhalten wird.
Diese Lösung wird im Vakuum bei etwa 50"C zur Trockne gebracht. Es resultiert ein dunkelbraun gefärbter hygroskopischer Rückstand von etwa 3,5 bis 4°/0 des Schalengewichtes, der als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des Wirkstoffes dient.
20 g des Trockenrückstandes werden in 400 bis 800 ml Wasser suspendiert und vom Ungelösten abfiltriert. Die blanke wäßrige Lösung wird unter Rühren mit 400 bis 800 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt (Verhältnis 1: 1 Volumen) und 24 Stunden stehengelassen. Es entsteht ein feiner Niederschlag, der durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der überstehenden Lösung abgetrennt wird. Der gewonnene Niederschlag ist von zäher Konsistenz, läßt sich jedoch nach Trocknen, vorzugsweise im Vakuum bei 50"C, leicht pulverisieren. Es resultiert ein braunes, nicht mehr hygroskopisches Pulver von etwa 10 Gewichtsprozent der Einwaage.
Beispiel 2 1 kg getrocknete Schalen von Citrus-Früchten oder 1 kg unreife Citrus-Früchte werden mit 15 1 Wasser zu einem Brei homogenisiert und, wie unter Beispiel 1 beschrieben, ein von Gewebeteilchen und Schwebestoffen befreiter wäßriger Extrakt hergestellt. Der Extrakt wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, vorzugsweise im Vakuum bei 50"C zur Trockne gebracht oder auch nach Einengen auf 1,5 bis 3,01 direkt mit 1,5 bis 3,01 einer wäßrigen, gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt und in vorbeschriebener Weise aufgearbeitet.
Beispiel 3 Das nach Beispiel 1 oder 2 erhaltene Endprodukt wird mit reinem Alkohol erschöpfend extrahiert, wobei das aus der Mutterlauge anhaftende Ammoniumsulfat als ungelöster Rückstand verbleibt.
Die filtrierte alkoholische Lösung wird vorzugsweise im Vakuum bei 50"C getrocknet und pulverisiert.
Beispiel 4 Das nach Beispiel 1 oder 2 bzw. 3 gewonnene Produkt wird erschöpfend mit Essigester extrahiert.
Die wirksame Substanz bleibt ungelöst und kann anschließend vorzugsweise im Vakuum bei 50"C getrocknet werden.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Gewinnung eines antiinflammatorisch wirksamen Produktes aus Citrus-Früchten, dadurch gekennzeichn et, daß ein von Gewebeteilchen und Schwebestoffen befreiter, wäßriger Extrakt aus unreifen oder reifen, frischen oder getrockneten Früchten mit dem gleichen Volumen einer wäßrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt, der beim Stehen auftretende Niederschlag von der überstehenden Lösung abgetrennt und nach dem Trocknen, vorzugsweise im Vakuum bei 50"C, pulverisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene pulverförmige Produkt in reinem Alkohol aufgenommen, die alkoholische Lösung vom Unalkalischen getrennt und, vorzugsweise im Vakuum bei 50"C, zur Trockne gebracht und pulverisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene pulverförmige Produkt erschöpfend mit Essigester extrahiert und der ungelöste Rückstand wiederum, vorzugsweise im Vakuum bei 50"C, getrocknet und pulverisiert wird.