DE10325172A1

DE10325172A1 - Preparation of L-amino acids, particularly threonine, useful as animal feed additives, by culturing Enterobacteriaceae that overexpress the bacterioferritin gene

Info

Publication number: DE10325172A1
Application number: DE2003125172
Authority: DE
Inventors: Mechthild Dr. Rieping; Thomas Dr. Hermann
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2003-06-04
Publication date: 2004-01-22

Abstract

Preparing L-amino acids (I), particularly threonine, or fodder additives containing (I), by fermentation of Enterobacteriaceae overexpressing the bfr (bacterioferritin, also known as cytochrome b1) gene, is new. An independent claim is also included for Enterobacteriaceae, particularly Escherichia coli in which the bfr gene (or equivalent) is overexpressed.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das bfr-Gen verstärkt wird.This invention relates to a method for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-threonine, using tribes the Enterobacteriaceae family, in which the bfr gene is enhanced.

L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.L-amino acids, especially L-threonine, find in human medicine and in the pharmaceutical industry, in the food industry and especially in animal nutrition.

Es ist bekannt, dass L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z.B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z.B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z.B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known that L-amino acids are caused by Fermentation of strains the Enterobacteriaceae, especially Escherichia coli (E. coli) and Serratia marcescens. Because of the great importance is constantly worked on improving the manufacturing process. process improvements can fermentation Activities, such as. emotion and supply of oxygen, or the composition of the nutrient media such as. the sugar concentration during fermentation, or the processing of the product form, e.g. by ion exchange chromatography, or the intrinsic performance characteristics of the microorganism concern yourself.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z.B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z.B. L-Threonin produzieren.To improve performance these microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. In this way you get tribes that resistant to antimetabolites such as the threonine analogue α-amino-β-hydroxyvaleric acid (AHV) or auxotroph for regulatory metabolites and L-amino acids like e.g. Produce L-threonine.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht. Zusammenfassende Information zur Zell- und Molekularbiologie von Escherichia coli und Salmonella ist in Neidhardt (ed): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Bilogy, 2^nd edition, ASM Press, Washington, D.C., USA, zu finden.For several years, methods of recombinant DNA technology have also been used to improve the strains of the Enterobacteriaceae family which produce L-amino acids by amplifying individual amino acid biosynthesis genes and examining the effect on production. Summary Information cellular and molecular biology of Escherichia coli and Salmonella in Neidhardt (ed): to find Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Bilogy, 2 ^nd edition, ASM Press, Washington, DC, USA.

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen.The inventors have the task posed new measures for the improved fermentative production of L-amino acids, in particular L-threonine, provide.

Beschreibung der Erfindungdescription the invention

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren, und in denen die für das bfr-Gen kodierende Nukleotidsequenz verstärkt wird.The invention relates to a Process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-threonine, using microorganisms from the Enterobacteriaceae family, which in particular already produce L-amino acids, and where those for the nucleotide sequence encoding bfr is amplified.

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin.The following are L-amino acids or amino acids mentioned, are therefore one or more amino acids including theirs Salts, selected from the group L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan and L-arginine meant. L-threonine is particularly preferred.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene um mindestens eine (1) Kopie erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.In this context, the term "reinforcement" describes the increase the intracellular activity or concentration of one or more enzymes or proteins in one Microorganism encoded by the appropriate DNA by, for example, the copy number of the gene or genes by at least one (1) copy increased, a strong promoter or a gene or allele used for a corresponding Enzyme or protein with a high activity coded and if necessary these measures combined.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.Through the measures of reinforcement, especially overexpression, becomes the activity or concentration of the corresponding protein in general at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, maximum up to 1000% or 2000% based on that of the wild-type protein respectively of activity or concentration of the protein in the starting microorganism is increased.

Gegenstand der Erfindung ist

a) ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere Threonin, oder diese Verbindungen enthaltenden Futtermittel-additiven durch Kultivieren von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das bfr-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert, in einem Medium unter für die Bildung des bfr-Genprodukts (Bacterioferritin, Cytochrome b1) geeigneten Bedingungen,
b) die gewünschte L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen sich anreichern lässt, und
c) das (die) gewünschte(n) L-Aminosäure(n) enthaltende Produkt isoliert, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100% im isolierten Produkt verbleiben.

The subject of the invention is

a) a process for the preparation of L-amino acids, in particular threonine, or feed additives containing these compounds by cultivating microorganisms of the Enterobacteriaceae family in which the bfr gene or nucleotide sequences coding therefor are amplified, in particular overexpressed, in a medium for the formation of suitable conditions for the bfr gene product (bacterioferritin, cytochrome b1),
b) the desired L-amino acid can be accumulated in the medium or in the cells, and
c) the product (s) containing the desired L-amino acid (s) is isolated, components of the fermentation broth and / or the biomass optionally remaining in an amount of 0 0 to 100% in the isolated product.

Die insbesondere rekombinanten Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, ctoseLaktose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.The particularly recombinant microorganisms, which are the subject of the present invention can L-amino acids Glucose, sucrose, ctose-lactose, fructose, maltose, molasses, optionally starch, optionally Produce cellulose or from glycerin and ethanol. It is about for representatives of the Enterobacteriaceae family selected from the genera Escherichia, Erwinia, Providencia and Serratia. The Genera Escherichia and Serratia are preferred. In the genus Escherichia is in particular the type Escherichia coli and in the Genus Serratia to name in particular the species Serratia marcescens.

Rekombinante Mikroorganismen werden durch Transformation, Konjugation oder Transduktion mit die gewünschte Gene tragenden Vektoren hergestellt.Recombinant microorganisms through transformation, conjugation or transduction with the desired genes load-bearing vectors.

Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise

– Escherichia coli TF427
– Escherichia coli H4578 (Applied Micobiology Biotechnology 29: 550-553 (1988))
– Escherichia coli KY10935 (Technical Research Laboratorien 61(11): 1877-1882 (1997))
– Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)
– Escherichia coli VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)
– Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)
– Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)
– Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
– Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)

Suitable, in particular L-threonine-producing strains of the genus Escherichia, in particular of the type Escherichia coli, are for example

- Escherichia coli TF427
- Escherichia coli H4578 (Applied Micobiology Biotechnology 29: 550-553 (1988))
- Escherichia coli KY10935 (Technical Research Laboratories 61 (11): 1877-1882 (1997))
- Escherichia coli VNIIgenetic MG442 (US-A-4278,765)
- Escherichia coli VNIIgenetic M1 (US-A-4,321,325)
- Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)
- Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)
- Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
- Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise

- Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979))
– Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3): 151-158 (1987))
– Serratia marcescens T2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992))

Suitable strains of the genus Serratia, in particular of the species Serratia marcescens, which produce L-threonine are, for example

- Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38 (6): 1045-1051 (1979))
- Serratia marcescens TLr156 (Gene 57 (2-3): 151-158 (1987))
- Serratia marcescens T2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37 (3): 255-265 (1992))

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin oder Cyclopentan-Carboxylsäure, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threoninhaltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin oder Threonin-Raffinat, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK-Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.L-threonine producing strains of the Enterobacteriaceae family preferably have, among others, one or more of the genetic or phenotypic traits selected from of the group: resistance to α-amino-β-hydroxyvaleric acid, resistance against thialysine, resistance against ethionine, resistance against α-methylserine, Resistance to diamino succinic acid, resistance to α-aminobutyric acid, resistance against borrelidine or cyclopentane carboxylic acid, resistance against rifampicin, Resistance to valine analogues such as valine hydroxamate, Resistance to purine analogs such as 6-dimethylaminopurine, neediness for L-methionine, if necessary partial and compensable need for L-isoleucine, neediness for meso-diaminopimelic acid, auxotrophy in terms of Dipeptides containing threonine, resistance to L-threonine or threonine raffinate, Resistance to L-homoserine, resistance to L-lysine, resistance against L-methionine, resistance against L-glutamic acid, resistance against L-aspartate, Resistance to L-leucine, resistance to L-phenylalanine, resistance against L-serine, resistance against L-cysteine, resistance against L-valine, Sensitivity to Fluoropyruvate, defective threonine dehydrogenase, possibly ability for sucrose utilization, reinforcement of the threonine operon, reinforcement the homoserine dehydrogenase I aspartate kinase I prefers the feed back resistant form, reinforcement the homoserine kinase, amplification of threonine synthase, amplification the aspartate kinase, optionally the feed-back-resistant form, reinforcement aspartate semialdehyde dehydrogenase, reinforcement the phosphoenolpyruvate carboxylase, where appropriate, the feed back resistant form, reinforcing the Phosphoenolpyruvate synthase, enhancement of transhydrogenase, reinforcement of the RhtB gene product, amplification of the RhtC gene product, amplification of the YfiK gene product, reinforcement a pyruvate carboxylase, and attenuation of acetic acid formation.

Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression des bfr-Gens, in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.It has been found that microorganisms the Enterobacteriaceae family after enhancement, especially overexpression of the bfr gene, in an improved manner L-amino acids, in particular L-threonine to produce.

Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik (Siehe nachfolgende Textstellen) und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.The nucleotide sequences of the genes of Escherichia coli belong the state of the art (see text below) and can also that of Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)) published genome sequence from Escherichia coli.

Das bfr-Gen wird unter anderem durch folgende Angaben beschrieben:
Bezeichnung: Bacterioferritin, Cytochrome b1, Eisen Speicher Homoprotein
Referenz: Andrews et al.; Journal of Bacteriology 171 (7): 3940-3947 (1989); Andrews et al.; Biochimica et Biophysica Acta 1078(1): 111-116 (1991); Le Brun et al.; The Biochemical Journal 312 (Pt 2): 385-392 (1995)
Accession No.: AE000409The bfr gene is described, among other things, by the following information:
Name: bacterioferritin, cytochrome b1, iron storage homoprotein
Reference: Andrews et al .; Journal of Bacteriology 171 (7): 3940-3947 (1989); Andrews et al .; Biochimica et Biophysica Acta 1078 (1): 111-116 (1991); Le Brun et al .; The Biochemical Journal 312 (Pt 2): 385-392 (1995)
Accession No .: AE000409

Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.The nucleic acid sequences can National Center for Biotechnology Information (NCBI) databases the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), the nucleotide sequence database the European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany or Cambridge, UK) or the DNA database of Japan (DDBJ, Mishima, Japan).

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen („sense mutations") ergeben. Die Verwendung endogener Gene wird bevorzugt.The in the specified passages described genes can used according to the invention become. Can continue Alleles of genes are used that result from degeneration of the genetic code or through functionally neutral meaning mutations ( "Sense mutations "). The use of endogenous genes is preferred.

Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder Allele beziehungsweise Nukleotidsequenzen.Under "endogenous genes" or "endogenous Understands nucleotide sequences " the genes or alleles present in the population of a species or nucleotide sequences.

Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.To achieve reinforcement, for example the expression of the genes or the catalytic properties of the Proteins increased become. If necessary, you can both measures be combined.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.To achieve overexpression the number of copies of the corresponding genes can be increased, or the Promoter and regulatory region or the ribosome binding site, which are upstream of the Structural gene located to be mutated. Work in the same way Expression cassettes installed upstream of the structural gene become. Through inducible promoters, it is also possible to increase expression in the course increase fermentative L-threonine production. Through measures for extension expression is also improved during the lifetime of the m-RNA. Furthermore, preventing the breakdown of the enzyme protein also the enzyme activity strengthened. The genes or gene constructs can either in plasmids with different number of copies or integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, you can still overexpression of the genes in question through change media composition and culture management.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.The specialist will find instructions for this among others with Chang and Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)) by Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), in Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), in de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), at LaVallie et al. (BIO / TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), in PCT / US97 / 13359, by Llosa et al. (plasmid 26: 222-224 (1991)) by Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), in Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), by Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) and in well-known textbooks of genetics and molecular biology.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z.B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolome et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens eine für das bfr-Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.Replicable in Enterobacteriaceae Plasmid vectors such as Cloning vectors derived from pACYC184 (Bartolome et al .; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al .; Gene 69: 301-315 (1988)) or pSC101 derivatives (Vocke and Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) can be used. In a method according to the invention, one can insert strain transformed with a plasmid vector, the Plasmid vector at least one for carries the nucleotide sequence encoding the bfr gene.

Unter dem Begriff Transformation versteht man im Allgemeinen die Aufnahme einer isolierten Nukleinsäure durch einen Wirt (Mikroorganismus).Under the term transformation is generally understood to mean the uptake of an isolated nucleic acid a host (microorganism).

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen, die die Expression der jeweiligen Gene betreffen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.It is also possible to find mutations, which concern the expression of the respective genes, by sequence exchange (Hamilton et al .; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), To convert conjugation or transduction into different strains.

Nähere Erläuterungen zu Begriffen der Genetik und Molekularbiologie findet man in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4^th ed., Springer Verlag, New York (USA), 2000) oder dem Lehrbuch von Stryer (Biochemistry, 3 rd. ed.,, Freeman and Company, New York (USA), 1988) oder dem Handbuch von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 1989).More detailed explanations of terms in genetics and molecular biology can be found in well-known textbooks in genetics and molecular biology, such as the textbook by Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4 ^th ed., Springer Verlag, New York (USA), 2000) or the textbook by Stryer (Biochemistry, 3rd ed. ,, Freeman and Company, New York (USA), 1988) or the manual by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 1989).

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des bfr-Gens, ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat oder Enzyme der Glykolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels zu verstärken. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.It can also be used for production of L-amino acids, especially L-threonine with strains the Enterobacteriaceae family may be beneficial in addition to reinforcement of the bfr gene, one or more enzymes of the known threonine biosynthetic pathway or enzymes of anaplerotic metabolism or enzymes for production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or enzymes of glycolysis or Enhance PTS enzymes or enzymes of sulfur metabolism. The Use of endogenous genes is generally preferred.

So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen von Corynebacterium glutamicum (WO 99/18228),
– das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)),
– das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
– die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
– das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
– das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (WO 02/06459),
– das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
– das für das Threoninexport-Protein kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (WO 01/92545),
– das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
– das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen (WO 03/004671),
– das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm-Gen (WO 03/004598),
– das für die Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba-Gen (WO 03/004664)
– das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose-Phosphotransferase des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons (WO 03/004674),
– das für das Enzym I des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons (WO 03/004674),
– das für die Glucose-spezifische IIA Komponente des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (WO 03/004674),
– das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen (WO 03/004670),
– das für den Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen (WO 03/004665),
– das für den globalen Regulator Csr kodierende csrA-Gen (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993)),
– das für den Regulator des fad-Regulons kodierende fadR-Gen (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)),
– das für den Regulator des zentralen Intermediärstoffwechsels kodierende iclR-Gen (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)),
– das für das 10 Kd Chaperon kodierende mopB-Gen (WO 03/004669), das auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist,
– das für die kleine Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpC-Gen des ahpCF-Operons (WO 03/004663),
– das für die große Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpF-Gen des ahpCF-Operons (WO 03/004663),
– das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen (WO 03/006666),
– das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB-Gen (WO 03/006666),
– das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysJ-Gen des cysJIH-Operons (WO 03/006666),
– das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysI-Gen des cysJIH-Operons (WO 03/006666),
– das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen des cysJIH-Operons (WO 03/006666),
– das für den positiven Regulator PhoB des pho Regulons kodierende phoB-Gen des phoBR-Operons (W 03/008606),
– das für das Sensorprotein des pho Regulons kodierende phoR-Gen des phoBR-Operons (WO 03/008606),
– das für das Protein E der äusseren Zellmembran kodierende phoE-Gen (WO 03/008608),
– das für die, durch Fructose stimulierte, Pyruvat Kinase I kodierende pykF-Gen (WO 03/008609),
– das für die 6-Phosphofructokinase II kodierende pfkB-Gen (WO 03/008610),
– das für das periplasmatische Bindeprotein des Maltose-Transports kodierende malE-Gen (WO 03/008605),
– das für die Superoxiddismutase kodierende sodA-Gen (WO 03/008613),
– das für ein Membranprotein mit anti-sigmaE-Aktivität kodierende rseA-Gen des rseABC-Operons (WO 03/008612),
– das für einen globalen Regulator des sigmaE-Faktors kodierende rseC-Gen des rseABC-Operons (WO 03/008612),
– das für die Decarboxylase Untereinheit der 2-Ketoglutarat Dehydrogenase kodierende sucA-Gen des sucABCD-Operons (WO 03/008614),
– das für die Dihydrolipoyltranssuccinase E2 Untereinheit der 2-Ketoglutarat Dehydrogenase kodierende sucB-Gen des sucABCD-Operons (WO 03/008614),
– das für die β-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase kodierende sucC-Gen des suc ABCD-Operons (WO 03/008615),
– das für die α-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase kodierende sucD-Gen des sucABCD-Operons (WO 03/008615),
– das für die Adenylat-Kinase kodierende adk-Gen (Nucleic Acids Research 13(19): 7139-7151 (1985)),
– das für ein periplasmatisches Protein mit Chaperoninartiger Funktion kodierende hdeA-Gen (Journal of Bacteriology 175(23): 7747-7748 (1993)),
– das für ein periplasmatisches Protein mit Chaperoninartiger Funktion kodierende hdeB-Gen (Journal of Bacteriology 175(23): 7747-7748 (1993)),
– das für die Isocitrat-Dehydrogenase kodierende icd-Gen (Journal of Biological Chemistry 262(22): 10422-10425 (1987)),
– das für das periplasmatische, Galaktose-bindende Transportprotein kodierende mglB-Gen (Molecular and General Genetics 229(3): 453-459 (1991)),
– das für die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase kodierende lpd-Gen (European Journal of Biochemistry 135(3): 519-527 (1983)),
– das für die E1-Komponente des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes kodierende aceE-Gen (European Journal of Biochemistry 133(1): 155-162 (1983)),
– das für die E2-Komponente des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes kodierende aceF-Gen (European Journal of Biochemistry 133(3): 481-489 (1983)),
– das für die Aminopeptidase B kodierende pepB-Gen (Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392-397 (1996)) und
– das für die Aldehyd-Dehydrogenase (E.C. 1.2.1.3) kodierende aldH-Gen (Gene 99(1): 15-23 (1991)),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.For example, one or more of the genes selected from the group can be used simultaneously

The thrABC operon coding for aspartate kinase, homoserine dehydrogenase, homoserine kinase and threonine synthase (US Pat. No. 4,278,765),
the pyc gene of Corynebacterium glutamicum coding for the pyruvate carboxylase (WO 99/18228),
The pps gene coding for phosphoenolpyruvate synthase (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992)),
The ppc gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase (Gene 31: 279-283 (1984)),
The genes pntA and pntB coding for the transhydrogenase (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
The rhtB gene which mediates resistance to homoserine (EP-A-0 994 190),
The mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase (WO 02/06459),
The rreC gene which mediates resistance to threonine (EP-A-1 013 765),
The thrE gene from Corynebacterium glutamicum coding for the threonine export protein (WO 01/92545),
The gdhA gene coding for glutamate dehydrogenase (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
The hns gene coding for the DNA binding protein HLP-II (WO 03/004671),
The pgm gene coding for the phosphoglucomutase (WO 03/004598),
- the fba gene coding for the fructose biphosphate aldolase (WO 03/004664)
The ptsH gene of the ptsHIcrr operon coding for the phosphohistidine protein hexose phosphotransferase of the phosphotransferase system PTS (WO 03/004674),
The ptsI gene of the ptsHIcrr operon coding for the enzyme I of the phosphotransferase system PTS (WO 03/004674),
The crr gene of the ptsHIcrr operon coding for the glucose-specific IIA component of the phosphotransferase system PTS (WO 03/004674),
The ptsG gene coding for the glucose-specific IIBC component (WO 03/004670),
The lrp gene coding for the regulator of the leucine regulon (WO 03/004665),
The csrA gene coding for the global regulator Csr (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993)),
The fadR gene coding for the regulator of the fad regulon (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)),
- the iclR gene coding for the regulator of the central intermediate metabolism (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)),
The mopB gene coding for the 10 Kd chaperone (WO 03/004669), which is also known under the name groES,
The ahpC gene of the ahpCF operon coding for the small subunit of the alkyl hydroperoxide reductase (WO 03/004663),
The ahpF gene of the ahpCF operon coding for the large subunit of the alkyl hydroperoxide reductase (WO 03/004663),
The cysK gene coding for cysteine synthase A (WO 03/006666),
The cysB gene coding for the regulator of the cys regulon (WO 03/006666),
The cysJ gene of the cysJIH operon coding for the flavoprotein of the NADPH sulfite reductase (WO 03/006666),
The cysI gene of the cysJIH operon coding for the hemoprotein of the NADPH sulfite reductase (WO 03/006666),
The cysH gene of the cysJIH operon coding for the adenylyl sulfate reductase (WO 03/006666),
The phoB gene of the phoBR operon coding for the positive regulator PhoB of the pho regulon (W 03/008606),
The phoR gene of the phoBR operon coding for the sensor protein of the pho regulon (WO 03/008606),
The phoE gene coding for the protein E of the outer cell membrane (WO 03/008608),
The pykF gene coding for fructose-stimulated pyruvate kinase I (WO 03/008609),
The pfkB gene coding for 6-phosphofructokinase II (WO 03/008610),
The malE gene coding for the periplasmic binding protein of maltose transport (WO 03/008605),
The sodA gene coding for superoxide dismutase (WO 03/008613),
The rseA gene of the rseABC operon coding for a membrane protein with anti-sigmaE activity (WO 03/008612),
The rseC gene of the rseABC operon coding for a global regulator of the sigmaE factor (WO 03/008612),
The sucA gene of the sucABCD operon coding for the decarboxylase subunit of the 2-ketoglutarate dehydrogenase (WO 03/008614),
The sucB gene of the sucABCD operon coding for the dihydrolipoyl transsuccinase E2 subunit of the 2-ketoglutarate dehydrogenase (WO 03/008614),
The sucC gene of the suc ABCD operon coding for the β-subunit of the succinyl-CoA synthetase (WO 03/008615),
The sucD gene of the sucABCD operon coding for the α-subunit of the succinyl-CoA synthetase (WO 03/008615),
The adk gene coding for the adenylate kinase (Nucleic Acids Research 13 (19): 7139-7151 (1985)),
The hdeA gene coding for a periplasmic protein with a chaperonin-like function (Journal of Bacteriology 175 (23): 7747-7748 (1993)),
The hdeB gene coding for a periplasmic protein with a chaperonin-like function (Journal of Bacteriology 175 (23): 7747-7748 (1993)),
The icd gene coding for isocitrate dehydrogenase (Journal of Biological Chemistry 262 (22): 10422-10425 (1987)),
The mglB gene coding for the periplasmic, galactose-binding transport protein (Molecular and General Genetics 229 (3): 453-459 (1991)),
The lpd gene coding for the dihydrolipoamide dehydrogenase (European Journal of Biochemistry 135 (3): 519-527 (1983)),
The aceE gene coding for the E1 component of the pyruvate dehydrogenase complex (European Journal of Biochemistry 133 (1): 155-162 (1983)),
The aceF gene coding for the E2 component of the pyruvate dehydrogenase complex (European Journal of Biochemistry 133 (3): 481-489 (1983)),
- the pepB gene coding for aminopeptidase B (Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392-397 (1996)) and
- the aldH gene coding for aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3) (Gene 99 (1): 15-23 (1991)),

amplified, especially overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des bfr-Gens, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
– das für die Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
– das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), WO 02/29080),
– das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), WO 02/29080),
– das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (WO 02/29080),
– das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (WO 02/36797),
– das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (WO 02/081722),
– das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen (WO 02/081721), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist,
– das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (WO 02/081698) das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist,
– das für den Sigma³⁸-Faktor kodierende rpoS-Gen (WO 01/05939), das auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist,
– das für die Aspartat Ammonium-Lyase kodierende aspA-Gen (WO 03/008603) und
– das für die Malatsynthase A kodierende aceB-Gen (WO 03/008604),

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.Furthermore, it can be advantageous for the production of L-amino acids, in particular L-threonine, in addition to enhancing the bfr gene, one or more of the genes selected from the group

The tdh gene coding for threonine dehydrogenase (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
The mdh gene coding for malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
The gene product of the open reading frame (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), WO 02/29080),
The gene product of the open reading frame (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA), WO 02/29080),
The pckA gene coding for the enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase (WO 02/29080),
The poxB gene coding for the pyruvate oxidase (WO 02/36797),
The aceA gene coding for the enzyme isocitrate lyase (WO 02/081722),
The dgsA gene coding for the DgsA regulator of the phosphotransferase system (WO 02/081721), which is also known under the name mlc gene,
The fruR gene coding for the fructose repressor (WO 02/081698), which is also known under the name cra gene,
The rpoS gene coding for the Sigma ³⁸ factor (WO 01/05939), which is also known under the name katF gene,
- The aspA gene coding for the aspartate ammonium lyase (WO 03/008603) and
The aceB gene coding for malate synthase A (WO 03/008604),

weaken, in particular switch off or reduce expression.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.In this context, the term "weakening" describes the Decrease or eliminate the intracellular activity or concentration of a or several enzymes or proteins in a microorganism which can be encoded by the corresponding DNA, for example by uses a weak promoter or a gene or allele that for a corresponding enzyme or protein with a low activity is encoded or the corresponding enzyme (protein) or gene is inactivated and where appropriate, these measures combined.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.The mitigation measures will the activity or concentration of the corresponding protein in general 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild type protein, or the activity or concentration of the protein in the parent microorganism.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des bfr-Gens, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).It can also be used for production of L-amino acids, L-threonine in particular may be advantageous in addition to enhancing bfr gene, unwanted Eliminate side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch – Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention can be carried out in a batch process (batch cultivation), can be cultivated in the fed batch (feed process) or in the repeated fed batch process (repetitive feed process). A summary of known cultivation methods is described in the textbook by Chmiel (bioprocess technology 1st introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral devices (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) ,

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.The culture medium to be used must suitably the claims of the respective tribes suffice. Descriptions of culture media of various microorganisms are in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology "of American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, ctoseLaktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsuäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Sugar can be used as a carbon source and carbohydrates such as Glucose, sucrose, ctose lactose, fructose, Maltose, molasses, starch and optionally cellulose, oils and fats such as Soybean oil, Sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as. Palmitinsuäure, stearic acid and linoleic acid, Alcohols such as Glycerin and ethanol and organic acids like e.g. acetic acid be used. These substances can used individually or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Organic Nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can used individually or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.Phosphoric acid and potassium dihydrogen phosphate can be used as the source of phosphorus or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing ones Salts are used. The culture medium must continue to have salts of Contain metals, e.g. Magnesium sulfate or iron sulfate, the for the Growth are necessary. Finally can be essential Growth substances such as amino acids and vitamins in addition can be used for the above-mentioned substances. The culture medium can also suitable precursors are added. The feed materials mentioned can added to the culture in the form of a one-off approach or more appropriate Way while fed to the cultivation become.

Die Fermentation wird im allgemeinen bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0, insbesondere 6,0 bis 8,0, durchgeführt. Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z.B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.The fermentation is general at a pH of 5.5 to 9.0, in particular 6.0 to 8.0. to pH control of the culture are basic compounds such as sodium hydroxide, Potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds like phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. To control the development of foam can Anti-foaming agents such as fatty acid be used. To maintain the stability of plasmids can selectively acting substances suitable for the medium e.g. Antibiotics are added. To maintain aerobic conditions, oxygen or Oxygen-containing gas mixtures such as Air entered the culture. The temperature of the culture is usually 25 ° C to 45 ° C, and preferably at 30 ° C up to 40 ° C. The culture is continued until a maximum of L-amino acids or L-threonine has formed. This goal is usually within reached from 10 hours to 160 hours.

Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)) beschrieben.The analysis of L-amino acids can by anion exchange chromatography with subsequent ninhydrin Derivatization takes place, as in Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)), or it can be by reversed phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie beispielsweise L- Threonin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.The method according to the invention is used for fermentative purposes Production of L-amino acids, such as L-threonine, L-isoleucine, L-valine, L-methionine, L-homoserine and L-lysine, in particular L-threonine.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention is described in The following based on exemplary embodiments explained in more detail.

Verwendete Minimal- (M9) und Vollmedien (LB) für Escherichia coli sind von J.H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Ligation, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung werden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)) durchgeführt.Minimal (M9) and full media used (LB) for Escherichia coli are from J.H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Isolation of plasmid DNA from Escherichia coli and all techniques for restriction, ligation, Klenow and alkaline phosphatase treatment are according to Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). The transformation of Unless otherwise described, Escherichia coli is named after Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).

Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von Stämmen und Transformanten ist 37°C.The incubation temperature during manufacture of tribes and transformants is 37 ° C.

Beispiel 1example 1

Konstruktion des Expressionsplasmides pTrc99AbfrConstruction of the expression plasmid pTrc99Abfr

sDas bfr-Gen aus E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des bfr-Gens in E. coli K12 MG1655 (Accession Number AE000409, Blattner et al. (Science 277, 1453 – 1474 (1997)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die 5'-Enden der Primer werden mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme und zwei bis vier zusätzlichen Basen verlängert. Dieser Teil des Primers ist in der nachfolgenden Darstellung durch Bindestrich (-) gekennzeichnet. Für den bfr5-Primer wird die Erkennungssequenz für BamHI und für den 3'-Primer die Erkennungssequenz für SalI gewählt, die in der unten dargestellten Nukleotidabfolge durch Unterstreichen markiert sind:

The bfr gene from E. coli K12 is amplified using the polymerase chain reaction (PCR) and synthetic oligonucleotides. Based on the nucleotide sequence of the bfr gene in E. coli K12 MG1655 (Accession Number AE000409, Blattner et al. (Science 277, 1453-1474 (1997)), PCR primers are synthesized (MWG Biotech, Ebersberg, Germany). The 5 'ends of the primers are provided with recognition sequences for restriction enzymes and two to four additional bases extended This part of the primer is identified by a hyphen (-) in the illustration below: The recognition sequence for BamHI is selected for the bfr5 primer and the recognition sequence for SalI for the 3 'primer, the nucleotide sequence shown below are marked by underlining:

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit „Qiagen Genomis-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 800 by grosses DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) mit der Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Herstellerangaben entsprechend mit dem Vektor pCR^®-Blunt II-TOPO^® (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 One Shot^® transformiert. Die Selektion Plasmid tragender Zellen erfolgt auf LB Agar, der mit 50 μg/ml Kanamycin versetzt ist. Nach der Plasmid DNA Isolierung wird der Vektor pCRBluntbfr mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten und das bfr-Fragment nach der Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) wird mit den Enzymen BamHI und SalI gespalten, anschliessend mit alkalischer Phosphatase entsprechend den Herstellerangaben (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) dephosphoryliert und mit dem isolierten bfr-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsansatz transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach der Plasmid DNA Isolierung durch die Kontrollspaltung mit den Enzymen BamHI und SalI, ScaI und PvuI nachgewiesen werden. Das Plasmid wird als pTrc99Abfr (1) bezeichnet.The chromosomal E. coli K12 MG1655 DNA used for the PCR is isolated according to the manufacturer's instructions with "Qiagen Genomis-tips 100 / G" (QIAGEN, Hilden, Germany). An approximately 800 by large DNA fragment can be used with the specific primers under standard PCR conditions (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) are amplified with Pfu DNA polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) correspondingly ligated with the vector pCR ^® -Blunt II-TOPO ^® (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Netherlands) and transformed into the E. coli strain TOP10 One Shot ^® . The selection of plasmid-carrying cells is carried out on LB agar, which is mixed with 50 μg / ml kanamycin After plasmid DNA isolation, the vector pCRBluntbfr is cleaved with the restriction enzymes BamHI and SalI and the bfr fragment after separation in a 0.8% agarose gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAG EN, Hilden, Germany) isolated. The vector pTrc99A (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany) is cleaved with the enzymes BamHI and SalI, then dephosphorylated with alkaline phosphatase according to the manufacturer's instructions (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany) and ligated with the isolated bfr fragment. The E. coli strain XL1-Blue MRF '(Stratagene, La Jolla, USA) is transformed with the ligation mixture and plasmid-carrying cells are selected on LB agar which has been mixed with 50 μg / ml ampicillin. Successful cloning can be demonstrated after plasmid DNA isolation by control cleavage with the enzymes BamHI and SalI, ScaI and PvuI. The plasmid is called pTrc99Abfr ( 1 ) designated.

Beispiel 2Example 2

Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AbfrProduction of L-threonine with the strain MG442 / pTrc99Abfr

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A- 4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.The L-threonine-producing E. coli Strain MG442 is described in US-A-4,278,765 and the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moscow, Russia) deposited as CMIM B-1628.

Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99Abfr und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und auf LB Agar mit 50 μg/ml Ampicillin Plasmid tragende Zellen selektioniert. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442/pTrc99Abfr und MG442/pTrc99A. Ausgewählte Einzelkolonien werden anschließend auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 3,5 g/l Na₂HPO₂·2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄·7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin, weiter vermehrt. Die Bildung von L-Threonin wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Je 250 μ1 dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0, 03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0, 018 g/l MnS0₄·1H₂O, 30 g/l CaC0₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin) überimpft und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird in der gleichen Weise überprüft, wobei jedoch keine Zugabe von Ampicillin zum Medium erfolgt. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.The strain MG442 is transformed with the expression plasmid pTrc99Abfr described in Example 1 and with the vector pTrc99A, and cells carrying LB agar containing 50 μg / ml ampicillin plasmid are selected. In this way the strains MG442 / pTrc99Abfr and MG442 / pTrc99A are created. Selected individual colonies are then placed on minimal medium with the following composition: 3.5 g / l Na ₂ HPO ₂ .2H ₂ O, 1.5 g / l KH ₂ PO ₄ , 1 g / l NH ₄ Cl, 0.1 g / l MgSO ₄ .7H ₂ O, 2 g / l glucose, 20 g / l agar, 50 mg / l ampicillin, further increased. The formation of L-threonine is checked in batch cultures of 10 ml, which are contained in 100 ml Erlenmeier flasks. 1 2 g / l yeast extract, 10 g / l (NH ₄₎ ₂ SO _4, g / l KH ₂ PO _4, 0.5 g / l MgSO ₄ · 7H ₂ O, 15: To this end, 10 ml of preculture medium of the following composition g / l CaCO ₃ , 20 g / l glucose, 50 mg / l ampicillin, inoculated and incubated for 16 hours at 37 ° C. and 180 rpm on an ESR incubator from Kühner AG (Birsfelden, Switzerland). Each 250 μl of this preculture is in 10 ml of production medium (25 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2 g / l KH ₂ PO ₄ , 1 g / l MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0.03 g / l FeSO ₄ · 7H ₂ O, 0.018 g / l MnS0 ₄ · 1H ₂ O, 30 g / l CaC0 ₃ , 20 g / l glucose, 50 mg / l ampicillin) and inoculated at 37 ° C for 48 hours. The formation of L-threonine by the parent strain MG442 is checked in the same way, but with no addition of ampicillin to the medium. After the incubation, the optical density (OD) of the culture suspension is checked using an LP2W photometer from Dr. Lange (Düsseldorf, Germany) at a measuring wavelength of 660 nm.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Threonin im steril filtrierten Kulturuüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.Then the concentration on L-threonine formed in the sterile filtered culture supernatant with an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column reaction determined with ninhydrin detection.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt. Tabelle 1

Table 1 shows the result of the test. Table 1

Kurze Beschreibung der Figur:Brief description of the figure:

1 Karte des das bfr-Gen enthaltenden Plasmides pTrc99Abfr 1 Map of the plasmid pTrc99Abfr containing the bfr gene

Längenangaben sind als ca.-Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

– Amp: Ampicillinresistenzgen
– lacI: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
– Ptrc: trc-Promotorregion, IPTG-induzierbar
– bfr: Kodierregion des bfr-Gens
– 5S: 5S rRNA-Region
– rrnBT: rRNA-Terminator-Region

Length specifications are to be understood as approximate specifications. The abbreviations and designations used have the following meaning:

- Amp: ampicillin resistance gene
LacI: gene for the repressor protein of the trc promoter
- Ptrc: trc promoter region, IPTG inducible
- bfr: coding region of the bfr gene
- 5S: 5S rRNA region
- rrnBT: rRNA terminator region

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:

– BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
– SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
s– ScaI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces caespitosus
s– PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris

The abbreviations for the restriction enzymes have the following meaning:

BamHI: restriction endonuclease from Bacillus amyloliquefaciens
- SalI: restriction endonuclease from Streptomyces albus
s - ScaI: restriction endonuclease from Streptomyces caespitosus
s - PvuI: Proteus vulgaris restriction endonuclease

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

Claims

Process for the preparation of L-amino acids, in particular L-threonine, or feed additives containing these compounds by fermentation of microorganisms of the Enterobacteriaceae family, characterized in that the bfr gene or the nucleotide sequences coding therefor are amplified, in particular overexpressed, for formation the bfr gene product (bacterioferritin, cytochrome b1) suitable conditions and the desired product isolated.

Method according to claim 2, characterized in that one has recombinant microorganisms used by transformation, transduction or conjugation of a microorganism of the Enterobacteriaceae family with a vector generated, the vector containing a bfr gene.

Method according to claim 1, characterized in that in the recombinant microorganisms Copy number of the bfr gene is increased by at least 1.

Method according to claim 3, characterized in that increasing the copy number of the bfr gene by at least 1 by integrating the gene into the chromosome of the Microorganism is achieved.

Method according to claim 3, characterized in that increasing the copy number of the bfr gene by at least 1 by an extrachromosomally replicating vector is achieved.

Method according to claim 1, characterized in that one can achieve overexpression a) the promoter and regulatory region or the ribosome binding site upstream of the bfr gene mutates, or b) Expression cassettes upstream of the bfr gene installed.

Method according to claim 1, characterized in that one uses a gene that under is under the control of a promoter.

Process according to claims 1 to 7, characterized in that microorganisms are used which additional Metabolite or antimetabolite resistance mutations individually or collectively.

Method according to claim 1, characterized in that the overexpression of the bfr gene the activity or increased concentration of the bfr gene product by at least 10% on the activity or concentration of the protein in the recipient strain.

Method according to claim 1, characterized in that one selected from the microorganisms Genera Escherichia, Erwinia, Providencia and Serratia.

Method according to claim 1, characterized in that microorganisms are used, in which one in addition further genes of the biosynthetic pathway of the desired L-amino acids are amplified, in particular overexpressed.

A method according to claim 11, characterized in that for the production of L-amino acids, in particular L-threonine, microorganisms of the Enterobacteriaceae family are fermented, in which additionally one or more of the genes selected from the group: 12.1 that for aspartate kinase, the thrABC operon coding for homoserine dehydrogenase, homoserine kinase and threonine synthase, 12.2 the pyc gene coding for pyruvate carboxylase, 12.3 the pps gene coding for phosphoenolpyruvate synthase, 12.4 the ppc gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase, 12.5 the pntA and pntB genes coding for the transhydrogenase, 12.6 the rhtB gene which mediates homoserine resistance, 12.7 the mqo gene which codes for the malate: quinone oxidoreductase, 12.8 which mediates threonine resistance, 12.9 the thrE gene coding for the threonine export protein, 12.10 the gdhA gene coding for the glutamate dehydrogenase, 12.11 the hns gene coding for the DNA binding protein HLP-II, 12.12 the pgm gene coding for the phosphoglucomutase, 12.13 the fba gene coding for the fructose biphosphate aldolase, 12.14 the ptsH gene coding for the phosphohistidine protein hexose phosphotransferase, 12.15 the ptsI gene coding for enzyme I of the phosphotransferase system, 12.16 the glucose-specific IIA Component coding crr gene, 12.17 the ptsG gene coding for the glucose-specific IIBC component, 12.18 the lrp coding for the regulator of the leucine regulon Gene, 12.19 the csrA gene coding for the global regulator Csr, 12.20 the fadR gene coding for the regulator of the fad regulon, 12.21 the iclR gene coding for the regulator of the central intermediate metabolism, 12.22 the mopB coding for the 10 Kd chaperone Gene, 12.23 the ahpC gene coding for the small subunit of alkyl hydroperoxide reductase, 12.24 the ahpF gene coding for the large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, 12.25 the cysK gene coding for cysteine synthase A, 12.26 that for Regulator of the cysB gene encoding the cys regulon,

27 that for the cysJ gene encoding the flavoprotein of the NADPH sulfite reductase, 12:28 that for the hemoprotein the NADPH sulfite reductase coding cysI gene, 12.29 that for the adenylyl sulfate reductase coding cysH gene, 30 that for the positive regulator PhoB the phoB gene encoding pho 12.Regulon, 12.31 that for the sensor protein the pho regulon encoding phoB gene, 12.32 that for the protein E the outer Cell membrane encoding phoE gene, 12.33 that for those by Fructose-stimulated, pyruvate kinase I encoding pykF gene, 12:34 that for the 6-phosphofructokinase II encoding pfkB gene, 12.35 that for the periplasmic binding protein encoding maltose transport malE gene, 12.36 that for the superoxide dismutase encoding sodA gene, 12.37 that for a membrane protein encoding with anti-sigmaE activity rSEA gene 12.38 that for a rseC gene encoding a global regulator of the sigmaE factor 12:39 that for encoding the decarboxylase subunit of 2-ketoglutarate dehydrogenase sucA gene, 12.40 that for the dihydrolipoyl transsuccinase E2 subunit of the 2-ketoglutarate SucB gene encoding dehydrogenase, 12.41 that for the β subunit the sucC gene encoding succinyl-CoA synthetase, 12.42 that for the α subunit the sucD gene encoding succinyl-CoA synthetase, 12.43 that for the Adenylate kinase-encoding adk gene, 12.44 that for a periplasmic Protein encoding chaperonin-like function hdeA gene, 12.45 that for a encoding periplasmic protein with chaperonin-like function hdeB gene 12:46 that for the icd gene encoding isocitrate dehydrogenase, 12.47 that for the periplasmic, Galactose-binding transport protein-encoding mglB gene, 12:48 that for the lpd gene encoding dihydrolipoamide dehydrogenase, 12:49 that for the E1 component of the pyruvate dehydrogenase complex coding aceE gene, 12.50 that for the E2 component of the pyruvate dehydrogenase complex coding aceF gene, 12.51 that coding for aminopeptidase B. pepB gene and 12:52 that for the aldH gene encoding aldehyde dehydrogenase, amplified, especially overexpressed.

Method according to claim 1, characterized in that microorganisms are used, in whose metabolic pathways are at least partially switched off, which the formation of the desired Reduce L-amino acid.

A method according to claim 13, characterized in that for the production of L-amino acids, microorganisms of the Enterobacteriaceae family are fermented, in which one or more of the genes selected from the group: 14.1 the tdh gene coding for the threonine dehydrogenase, 14.2 the mdh gene coding for the malate dehydrogenase, 14.3 the gene product of the open reading frame (orf) yjfA, 14.4 the gene product of the open reading frame (orf) ytfP, 14.5 that for the PckA gene coding for phosphoenolpyruvate carboxykinase, 14.6 the poxB gene coding for pyruvate oxidase, 14.7 the aceA gene coding for isocitrate lyase, 14.8 the dgsA gene coding for the DgsA regulator of the phosphotransferase system, 14.9 that fruR gene coding for the fructose repressor, 14.10 the rpoS gene coding for the Sigma ³⁸ factor, 14.11 the aspA gene coding for the aspartate ammonium lyase and 14.12 the aceB gene coding for the malate synthase A, especially attenuated or decreased expression.

Process according to claims 1 to 14, where one a) the desired one L-amino acid in the fermentation broth or accumulates in the cells of the microorganisms, and b) that (the desired) Product e) isolated, where appropriate the biomass and / or further components of the fermentation broth in an amount of ≥ 0 to 100% remain in the product.

Process according to claims 1 to 15, characterized in that L-amino acids selected from the group L-asparagine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan and L-arginine.

Process according to claims 1 to 15, characterized in that L-amino acids selected from of the group L-isoleucine, L-valine, L-methionine, L-homoserine and L-lysine.

Method according to claim 1 to 15, characterized in that L-threonine is produced.

Recombinant microorganisms from the Enterobacteriaceae family, especially the genus Escherichia, in which the bfr gene or for the encoding bfr gene product Nucleotide sequences overexpressed available.

Microorganisms, according to claim 19, characterized in that they produce L-threonine.