DE102005055128B4

DE102005055128B4 - Viraler Vektor, dessen Verwendung zur Therapie von Leberzellkarzinomen und pharmazeutische Mittel umfassend den Vektor

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Publication number: DE102005055128B4
Application number: DE102005055128.9A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr.med. Dr.rer.nat. Pützer Brigitte
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2005-11-15
Publication date: 2015-04-02
Anticipated expiration: 2025-11-16
Also published as: WO2007057368A1; DE102005055128A1

Abstract

Vektor umfassend eine Nukleinsäure-Sequenz der SEQ ID NO: 1.

Description

Die Erfindung betrifft einen viralen Vektor, der Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, die IL-12 und ein Kostimulator-Protein kodieren, und ferner einen AFP-Promotor und MER-I-Enhancer umfassen. Die Erfindung betrifft insbesondere einen tricistronischen adenoviralen Vektor, der IL-12p40, IL-12p35 und B7.1 co-exprimiert. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des Vektors zur Therapie von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Mittel, die den Vektor oder Viruspartikel umfassen.
Krebserkrankungen stellen eine der häufigsten Todesursachen von Menschen dar. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist beispielsweise eine Krebserkrankung mit einer mittleren Überlebensdauer von 6 Monaten bei Diagnose eines oder mehrerer größerer Tumore. HCC entsteht durch maligne Entartung der Hepatozyten, insbesondere infolge einer vorbestehenden Zirrhose oder einer bestehenden viralen Hepatitis. Die gegenwärtig verwendeten Therapieansätze, die beispielsweise Operation, Radiofrequenzablation, Chemotherapie und/oder perkutane Ethanolinjektion umfassen, weisen nur bei kleineren Tumoren gewisse Erfolge auf, während sie bei der Bekämpfung großer Tumore unzureichend sind.
Im Stand der Technik wurde des weiteren eine Gentherapie zur Krebsbehandlung vorgeschlagen. Gentherapeutische Behandlungsverfahren basieren auf der Verabreichung einer Nukleinsäure, die in die Tumorzelle aufgenommen wird und Sequenzen aufweist, die die Tumorzelle zerstören oder an ihrer Zerstörung mitwirken. Nach der Behandlungsstrategie wird zwischen der Übertragung von Tumorsuppressorgenen, der Übertragung onkolytischer Viren, der Immungentherapie und der Suizid-Gentherapie unterschieden.
Es ist beispielsweise beabsichtigt, dass im Zuge einer Krebsimmuntherapie das Immunsystem so stimuliert wird, dass es neoplastische Zellen erkennt und aus dem Patienten entfernt. Die Expression immunologisch-aktiver Proteine, wie z. B. Cytokine, an der Tumorstelle führt zu einer lokalen Anreicherung von Immuneffektorzellen und/oder der Aktivierung von tumorspezifischen T-Zellen. Der immungentherapeutische Ansatz zur Bereitstellung dieser Proteine beinhaltet einen Vektor-vermittelten Transfer der Gene, deren Produkte das Immunsystem aktivieren und eine gegen die Tumorzellen gerichtete Immunreaktion auslösen. Das Immunsystem erkennt dabei neben Antigenen auch tumorspezifische Strukturen auf der Tumorzellen. Die Aktivierung des Immunsystems kann daher zu einer Zerstörung des Tumors durch die Bestandteile des Immunsystems führen.
Es sind zahlreiche Moleküle bekannt, die das Immunsystem stimulieren und/oder eine Immunreaktion modulieren. Innerhalb der Cytokine besitzt IL-12 eine ausgeprägte Antitumor-Wirkung. Unter anderem aktiviert IL-12 NK-Zellen sowie cytotoxische T-Lymphozyten und induziert deren IFN-γ-Herstellung. IL-12 fördert auch eine Immunantwort über die Proliferation und Aktivierung von Th1 T-Helferzellen und bewirkt eine Hemmung der Tumorangiogenese in-vivo. Die Verabreichung des rekombinanten IL-12 als Antitumormittel scheiterte jedoch daran, dass dieses Cytokin in therapeutischer Dosierung toxische Nebenwirkungen aufweist.
Es wurde ebenfalls untersucht, ob eine IL-12-kodierende Nukleinsäure in den Tumor eingebracht und eine lokale Aktivierung des Immunsystems ermöglicht. Hierfür sind Vektoren bekannt, die für die verschiedenen Untereinheiten des heterodimeren IL-12 kodieren. Das Protein besteht aus zwei Untereinheiten mit relativen Molekulargewichten von 40 kDa und 35 kDa, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Sangro et al. (2004) J Oncology 22 (8), 1389–1397, injizierten intratumoral einen adenoviralen Vektor, der IL-12 unter der Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV) Promotors exprimiert. Jedoch war die Injektion mit Nebenwirkungen, wie Fieber, Übelkeit, Schweißausbrüchen und Lymphopenie verbunden. Darüber hinaus wurde nur eine geringe Immunogenität der Tumore festgestellt.
Solche Vektoren wurden deshalb auch mit kostimulatorischen Proteinen versehen. WO 2004/035799 A2 offenbart adenovirale Vektoren, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für IL-12 und mindestens ein Kostimulator-Protein kodieren, wobei das Kostimulator-Protein insbesondere der 4-1BB Ligand ist. Dadurch konnte zwar die Dosierung des Vektors gesenkt werden, so dass die Behandlung mit geringeren Nebenwirkungen verbunden war. Jedoch hat sich der Vektor bisher in klinischen Versuchen nicht durchgesetzt. Die Komplexität des Konstrukts aus mehreren kostimulierenden Proteinen und die unspezifische Steuerung der Protein-Expression über den bevorzugten CMV-Promotors sind als nachteilig anzusehen.
Im Stand der Technik sind auch tumorspezifische Promotoren bekannt, unter deren Kontrolle einige Tumorarten onkofötale Gene überexprimieren, die im normalen Gewebe nicht aktiv sind (Robson & Hirst (2003) J Biomedicine and Biotech. 2, 110–137). Bekannte tumorspezifische Gene kodieren das carcinoembryonische Antigen (CEA) und das α-Fetoprotein (AFP). AFP wird normalerweise in der fötalen Leber exprimiert und tritt ebenfalls in hepatozellulären Karzinomen auf. Der AFP-Promotor wurde beispielsweise zur gezielten Expression der Transgene HSV-tk, CD und Diphtherie-Toxin A in HCC-Tumoren verwendet. Eine Expression von immunstimulierenden Proteinen, wie z. B. IL-12, unter AFP-Promotor-Kontrolle ist dagegen nicht beschrieben. Die Aktivität des AFP-Promotors ist als schwach zu bewerten. Nachteilig ist insbesondere die Abhängigkeit der Transgen-Expression von einer AFP-Überexpression der Tumorzellen, so dass niedrige AFP-Konzentrationen zu einer geringen Effizienz der Expression in den Tumoren führen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, Vektoren bzw. pharmazeutische Mittel zur Verfügung zu stellen, die eine selektive und wirkungsvolle Immungentherapie von Leberzellkarzinomen gewährleisten.
Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die Unteransprüche beinhalten bevorzugte Ausführungsformen. Erfindungsgemäß wird ein viraler Vektor bereitgestellt, umfassend Nukleinsäure-Sequenzen, die IL-12 und ein Kostimulator-Protein kodieren, und Nukleinsäure-Sequenzen, die mindestens einen Promotor umfassen, wobei der Promotor der AFP-Promotor ist und die Nukleinsäure-Sequenzen ferner einen MER-I-Enhancer umfassen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, das der virale Vektor eine besonders vorteilhafte Co-Expression der nur in Kombination therapeutisch effizienten Gene für IL-12 und ein Kostimulator-Protein bewirkt, die ausschließlich in AFP-positiven Leberzellkarzinomen erfolgt.
Der erfindungsgemäße Vektor wird mit bekannten molekularbiologischen Techniken hergestellt. IL-12 kann sowohl als Einzelketten-IL-12 vorliegen, d. h. aus einer Aminosäure-Sequenz bestehen, welche die beiden Untereinheiten des natürlichen IL-12 als Fusionsprotein umfasst; oder die beiden Untereinheiten IL-12p35 und IL-12p40 sind getrennt und werden unabhängig translatiert. Die Untereinheiten IL-12p35 und IL-12p40 sind ein 1,1 kb Fragment bzw. ein 2,3 kb Fragment. Die cDNA von IL-12 bzw. der Untereinheiten wird aus einer genomischen Bibliothek mit Routineexperimenten isoliert, ggf. amplifiziert und subkloniert. Beispielsweise kann die cDNA für IL-12p35 in den pED (EMC) Vektor an der PstI-Restriktionsschnittstelle eingebracht sein, während die cDNA für IL-12p40 im selben pED (EMC) Vektor an der XbaI-Restriktionsschnittstelle enthalten ist.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter „Nukleinsäure-Sequenzen, die ein Kostimulator-Protein kodieren” solche Sequenzen, die bei der Expression in Zellen Proteine erzeugen, die als Zelloberflächenproteine vorliegen und spezifisch von Rezeptoren der Immunzellen, insbesondere T-Zellen, gebunden werden, so dass eine vorhandene Immunreaktion verstärkt wird. Die cDNA des Kostimulator-Proteins wird mit fachgemäßen Techniken ebenfalls bevorzugt in einem Plasmid bereitgestellt, wie z. B. pCA13. Kostimulator-Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. cDNA-Sequenzen werden aus entsprechenden Datenbanken oder anderweitiger Fachliteratur ausgewählt, in-vivo oder in-vitro synthetisiert und in das passende Plasmid inseriert.
Die Nukleinsäuren für IL-12 bzw. dessen Untereinheiten und das Kostimulator-Protein können in einer einzigen Expressionskassette enthalten sein, so dass ein polycistronisches Transkript entsteht, oder jede Protein-kodierende Nukleinsäure ist in einer separaten Expressionskassette enthalten, so dass folglich mehrere Expressionskassetten vorliegen. Die Reihenfolge der Nukleinsäure-Sequenzen innerhalb der Expressionskassette oder die Anordnung mehrerer Expressionskassetten im Vektor ist beliebig. Die einzelnen Cistrone innerhalb der Expressionskassette können durch nicht-kodierende Sequenzabschnitte getrennt sein, vorzugsweise Sequenzen für Interne Ribosomen-Eintritts-Stellen (Internal Ribosome Entry Site), kurz IRES-Sequenzen genannt, so dass insbesondere polycistronische Transkripte effektiv translatiert werden. Die IRES-Sequenzen entstammen beispielsweise dem kommerziell erhältlichen pCITE-2-Vektor (Novagen). Vorzugsweise wird eine Expressionskassette kreiert, in der IL-12p40 stromaufwärts von IL-12p35 liegt und sich stromabwärts davon das Kostimulator-Protein befindet, wobei sämtliche Protein-kodierenden Sequenzen durch IRES-Sequenzen separiert sind.
Die 5'-flankierenden Regionen des AFP-Gens enthaften DNA-Sequenzen für die AFP-Enhancer-Domäne und den AFP-Promotor. Deren Orientierung, Bezeichnung und Nukleotid-Nummerierung, wie sie auch in der vorliegenden Spezifikation verwendet werden, entspricht dem AFP-Genom (Zhang et al. (1992) JBC 267 (15), 10676–10682). Die Enhancer-Domäne wird in drei Fragmente unterteilt, die als Enhancer I, Enhancer II und Enhancer III bezeichnet werden. Innerhalb dieser Fragmente sind die als minimale Enhancer-Regionen (MER) bezeichneten MER-I-Enhancer, MER-II-Enhancer und MER-III-Enhancer lokalisiert. Der erfindungsgemäße Vektor kann die Nukleinsäure-Sequenzen für die AFP-Enhancer-Domäne oder Teile davon umfassen. Unter Teilen der AFP-Enhancer-Domäne sind im Sinne der Erfindung die genannten Enhancer-Fragmente, minimalen Enhancer-Regionen und/oder Nukleinsäure-Sequenzen, die die Genexpression der Expressionskassette unter ihrer Kontrolle verstärken, zu verstehen. In der vorliegenden Erfindung ist der MER-I-Enhancer als Bestandteil des viralen Vektors bevorzugt.
Der AFP-Promotor (ca. 900 bp Fragment) und MER-I-Enhancer (ca. 400 bp Fragment) werden mittels PCR einzeln oder zusammenhängend amplifiziert und beispielsweise in den pCR2.1TOPO-Vektor über EcoRI subkloniert. Vorzugsweise enthält der murine AFP-Promotor die Basenpaare von –1009 bis +37 und der humane AFP-Promotor die Basenpaare von –230 bis +29. Ein bevorzugter muriner MER-I-Enhancer im Sinne der Erfindung enthält die Basenpaare von –2497 bis –2193 oder bis zu weitere 100 Basenpaare am 5'- und/oder 3'-Ende des vorgenannten Sequenzbereichs, besonders bevorzugt die Basenpaare von –2574 bis –2190. Der Fachmann ist in der Lage, beispielsweise durch Sequenzüberlagerungen und Homologievergleiche, die den bevorzugten murinen Sequenzen entsprechenden Nukleinsäure-Sequenzen in anderen Spezies, wie z. B. im Menschen, aufzufinden. Der humane AFP-Enhancer umfasst die beiden Domänen A und B. Die Enhancer-Domäne A enthält vorzugsweise die Basenpaare von –4900 bis –3300 und die Enhancer-Domäne B die Basenpaare von –3700 bis –3300. Es ist auch möglich, nur die Enhancer-Domäne B zu verwenden, die allein ausreichend im Sinne der Erfindung ist.
Es versteht sich, das der erfindungsgemäße Vektor weitere Elemente umfassen wird, die z. B. für die Vektor-Replikation oder Protein-Expression essentiell sind. Sie werden mit dem Fachmann bekannten Methoden generiert.
Die nachfolgenden Schritte der Herstellung einer vollständigen und funktionsfähigen Expressionskassette und in einem viralen Vektor werden durch den viralen Ursprung determiniert, so dass auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Molekularbiologie verwiesen wird. Handelt es sich beispielsweise um einen adenoviralen Vektor kommt vorzugsweise des AdEasy-System zum Einsatz (He et al. (1998) PNAS USA, 95, 2509–2514). Promotor, Enhancer, Expressionskassette und Terminationssignal werden hierbei in die Polylinker-Region des Adenovirus-Shuttle-Plasmids pShuttle (AdEasy) ligiert, nach Co-Transformation mit dem Plasmid pAdEasy1, das die restliche Adenovirus-Sequenzen enthält, in E. coli rekombiniert, rekombinante DNA isoliert, damit Zellen, wie z. B. 293-Zellen, transfiziert und der Virusstock durch Amplifikation in den 293-Zellen erhalten. Der adenovirale Vektor ist zusätzlich deletiert zu einem Vektor der ersten Generation oder der zweiten Generation. Entsprechende Vektoren sind im Stand der Technik umfassend bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Nukleinsäure-Sequenzen, die IL-12 und das Kostimulator-Protein kodieren, und die Nukleinsäure-Sequenzen, die den AFP-Promotor und den MER-I-Enhancer umfassen, in einer Expressionskassette angeordnet. Unter einer Expressionskassette ist vorliegend die Gesamtheit der Nukleinsäure-Sequenzen zu verstehen, die für die Expression eines oder mehrerer Gene notwendig ist, und die mindestens die zu exprimierenden Gen-Sequenzen sowie regulatorische Elemente für die Transkription und Translation enthält, die beispielsweise initiierend, verstärkend, inhibierend, terminierend etc. wirken, wobei die Nukleinsäure-Sequenzen eine funktionelle und ggf. auch strukturelle Einheit, vorzugsweise auf Ebene der Primärstruktur, bilden. Die Expressionskassette steht insbesondere unter der Kontrolle nur eines Promotors und nur eines Enhancer-Elements. Es ist natürlich auch denkbar, dass mehrere Promotoren in einer Expressionskassette verwendet werden, deren Anzahl z. B. derjenigen der Cistrone entspricht.
Erfindungsgemäß ist das Kostimulator-Protein B7.1, B7.2, IL-2 oder 4-1BBL. Bevorzugt ist B7.1 (CD80), durch das die Immunantwort gegen den Tumor wesentlich verstärkt und die Toxizität von IL-12 reduziert wird, so dass die Vektordosis bei gleicher Effizienz reduziert werden kann. Die Interaktion von IL-12 und B7.1 zeigt einen synergistischen Effekt. Ihre Kombination ist besonders effizient bei der Induktion der Tumorunterdrückung und einer spezifischen, lange anhaltenden Antitumor-Immunität. Das Kostimulator-Protein kann auch ein Cytokin oder Protein mit Cytokin-Aktivität, d. h. ein Cytokin-Agonist, sein.
Die Transgene sind speziesspezifisch wirksam. Für die Anwendung am Menschen sind die humanen Gene erforderlich und im Sinne der Erfindung bevorzugt. Vorzugsweise ist folglich humanes B7.1 das Kostimulator-Protein. IL-12 umfasst IL-12p40 und IL-12p35, vorzugsweise humanes IL-12p40 und humanes IL-12p35. Es versteht sich, dass auch der AFP-Promotor und der MER-I-Enhancer in Abhängigkeit von der zu behandelnden Spezies zu wählen sind. Bevorzugt sind ein humaner AFP-Promotor und ein humaner MER-I-Enhancer. Die Nukleinsäure-Sequenzen können jedoch auch von anderen Arten abstammen oder mit im Stand der Technik bekannten Verfahren modifiziert werden, sofern die Aktivität der Proteine im Bereich von mindestens 50%, vorzugsweise von mindestens 70% der entsprechenden Aktivität des humanen Genprodukts bleibt. Veränderungen der Gensequenz, die zu einer Verstärkung der Aktivität der Proteine führen, sind selbstverständlich hierin mit umfasst.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Nukleinsäure-Sequenzen ferner IRES-Sequenzen, die in der Expressionskassette zwischen IL-12 und dem Kostimulator-Protein, oder zwischen IL-12p40, IL-12p35 und dem Kostimulator-Protein angeordnet sind. IRES-Sequenzen stammen von den 5' untranslatierten Regionen der Picomaviren, die eine Cap-unabhängige Initiation der Translation an internen AUG-Tripletts ermöglichen. Vorzugsweise sind die IRES-Sequenzen vom Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) abgeleitet. Mit Vektoren, die für jedes Cistron, das sich nicht unmittelbar hinter dem Promotor befindet, eine IRES-Sequenz aufweisen, wird eine hohe Expression der immunstimulierenden Gene erreicht. Die Verbindung aller Transgene durch IRES-Sequenzen gewährleistet eine gleichmäßige Co-Expression, insbesondere der IL-12-Untereinheiten IL-12p35 und IL-12p40, die für die volle Funktion der Transgene notwendig ist. Im Zuge der Verbindung existiert eine einzige Expressionskassette, die die Expression der therapeutischen Gene vom di- oder tricistronischen Transkript realisiert. Hierdurch werden Re-Arrangements und Ungleichmäßigkeiten in der Gen-Expression vermieden. Es können sowohl identische als auch voneinander verschiedene IRES-Sequenzen in einem Vektor verwendet werden. Im letzteren Fall ist die Rekombinationsfrequenz unter diesen Sequenzen vorteilhaft minimiert, aber die Expressionsrate der Proteine kann herabgesetzt sein, so dass identische IRES-Sequenzen bevorzugt sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfassen die Nukleinsäure-Sequenzen ferner ein Polyadenylationssignal aus dem Simian-Virus 40, das die Expressionskassette terminiert. Das Simian-Virus 40 Polyadenylationssignal, kurz SV40 polyA-Signal genannt, wird als Bestandteil der Expressionskassette aufgefasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Nukleinsäure-Sequenzen, die hMER-I-Enhancer, hAFP-Promotor, hIL-12p40, EMCV IRES, hIL-12p35, EMCV IRES, hB7.1 und SV40 polyA-Signal umfassen, in der angegebenen Reihenfolge in 5'-3'-Orientierung in der Expressionskassette angeordnet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor als viraler Vektor bezeichnet, wenn es sich um eine Nukleinsäure-Sequenz handelt, die Sequenzen viralen Ursprungs umfasst, welche die Verpackung der Nukleinsäure in Virushüllen erlauben. In Abhängigkeit vom viralen Ursprung können die Vektoren ein adenoviraler Vektor, adeno-assoziierter Vektor, lentiviraler Vektor, HSV-Vektor, retroviraler Vektor, baculoviraler Vektor oder Semliki-Forrest-Vektor sein. Erfindungsgemäß ist ein adenoviraler Vektor bevorzugt. Bei den adenoviralen Vektoren kann es sich um solche der ersten Generation (mit Deletionen in den Regionen E1 und E3), der zweiten Generation (mit Deletionen in E1, E2, E3, E4 etc.), um replikationskompetente (onkolytische Adenoviren) oder um Helfer-abhängige adenovirale Vektoren handeln. Entsprechende adenovirale Vektoren sind z. T. für die Gentherapie am Menschen zugelassen und somit als sicher eingestuft.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der adenovirale Vektor mindestens eine Deletion der Region E1 auf. E1 enthält die viralen Gene E1A, E1B und für das Protein IX, deren Deletionen zum Replikationsdefekt des Vektor führen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist auch die E3-Region deletiert, so dass ein klassischer Erstgenerationsvektor vorliegt. Erfindungsgemäß ist die E1-Region durch die Expressionskassette substituiert. Das bedeutet, dass die Expressionskassette an der Stelle der E1-Region liegt. Es spielt dabei keine Rolle, ob der Austausch der Nukleinsäure-Sequenzen simultan oder zeitlich versetzt erfolgt. Vorzugsweise befindet sich die Expressionskassette in der deletierten E1-Region des Adenovirus Typ 5 (Ad5), bei dem es sich um einen Serotyp der Adenovirus-Untergruppe C handelt. Ad5-DNA-Sequenzen sind beispielsweise im Shuttle-Plasmid pShuttle (AdEasy) enthalten, insbesondere von Karteneinheit (map unit, mu) 0 bis 1, wobei 1 mu ca. 360 bp entspricht, und von mu 9,8 bis 15,8. Zwischen den angegebenen Bereichen sind der Promotor, ein Polylinker mit einmaligen Restriktionsschnittstellen und ein SV40 polyA-Signal angeordnet. Die restlichen DNA-Sequenzen von Ad5 sind in einem anderen Plasmid, wie z. B. pAdEasy1, enthalten und werden im Zuge einer Co-Transformation mit den genannten Ad5-Sequenzen des pShuttle-Plasmids zu einem funktionsfähigen erfindungsgemäßen viralen Vektor rekombiniert.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen rekombinanten adenoviralen Vektor (rAdAFPpehIL12B7.1), der die Expressionskassette hIL-12p40 – EMCV IRES – hIL-12p35 – EMCV IRES – hB7.1 – SV40 polyA–Signal unter der Kontrolle des stromaufwärts gelegenen MER-I-Enhancers/AFP-Promotors in der deletierten E1-Region von Ad5 trägt. Ganz besonders bevorzugt ist ein Vektor, der eine Nukleinsäure-Sequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst oder Varianten, Mutanten, Teile der Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen. Die Nukleinsäure-Sequenz der SEQ ID NO: 1 stellt den nicht-codogenen Strang der Expressionskassette dar. Es versteht sich, dass der Vektor auch den dazu komplementären (codogenen) Strang umfassen kann. Vorzugsweise umfasst der Vektor eine doppelsträngige Nukleinsäure, besonders bevorzugt eins dsDNA, die die DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 und die dazu komplementäre DNA-Sequenz basengepaart umfasst. Mutanten können beispielsweise durch Substitution, Deletion, Insertion, Translokation, Inversion und/oder Addition von zumindest einem Nukleotid erhalten werden. Varianten der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz können durch Modifikationen, wie z. B. Alkylierung, Arylierung oder Acetylierung von zumindest einem Nukleotid, Einbau von Enantiomeren und/oder durch Fusion der Sequenzen mit einem oder mehreren Nukleatiden oder einer Nukleinsäure-Sequenz entstehen. Der Vektor kann auch aus RNA aufgebaut sein, die eine Variante im Sinne der Erfindung darstellt. Teile der Sequenzen beschränken sich auf jene Abschnitte, die für eine bestimmte Funktion des Vektors, insbesondere die Selektivität und Expressionsfähigkeit, hinreichend sind. Sämtliche Veränderungen der Sequenz sind zwangsläufig durch das Erfordernis des Funktionserhalts beschränkt. Vorzugsweise weist eine Nukleinsäure-Sequenz, die zur DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 funktionsanalog ist, eine Homologie von mindestens 60% auf, besonders bevorzugt von mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80%. Homologe Sequenzen können auch von anderen Arten abstammen und die selbe Funktion besitzen. Funktionsanaloge Sequenzen verschiedener Spezies können einen niedrigeren Grad der Homologie aufweisen, vorzugsweise aber mindestens 30%. Die vorliegende Nukleinsäure-Sequenz der SEQ ID NO: 1 enthält den murinen AFP-Promotor und den murinen MER-I-Enhancer. Es versteht sich, dass der humane AFP-Promotor und der humane MER-I-Enhancer in den Schutzumfang der erfindungsgemäßen SEQ ID NO: 1 eingeschlossen sind. Sie können an die Stelle der murinen Bestandteile treten. Für die aufgezeigten Veränderungen derartiger Nukleinsäure-Sequenzen sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Molekularbiologie verwiesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Viruspartikel, die den erfindungsgemäßen Vektor umfassen. Als Viruspartikel werden Nukleinsäuren bezeichnet, die von den Hüllproteinen eines Virus umschlossen sind.
Die Erfindung betrifft ferner eine Zelle, die den erfindungsgemäßen Vektor und/oder das erfindungsgemäße Viruspartikel umfassen. Dazu wird die Zelle, insbesondere eine eukaryotische Zelle, mit dem Vektor bzw. Viruspartikel transfiziert, in dessen Ergebnis eine genetisch modifizierte Zelle entsteht. Die Zellen werden auch als transgene Zellen bezeichnet. Die Erfindung bezieht sich auch auf Zellkulturen, Gewebe, Organe und ähnliches, die Zellen mit den o. g. erfindungsgemäßen Konstrukten umfassen. Des weiteren betrifft die Erfindung Organismen, welche die genannten erfindungsgemäßen Zellen umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein pharmazeutisches Mittel, das den erfindungsgemäßen Vektor oder das erfindungsgemäße Viruspartikel umfasst, vorzugsweise mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen. Ein pharmazeutisches Mittel im Sinne der Erfindung ist jedes Mittel, welches in der Therapie, Verlaufskontrolle oder Nachbehandlung von Patienten eingesetzt werden kann, die zumindest zeitweise eine pathogene Modifikation des Gesamtzustandes bzw. des Zustandes einzelner Teile des Patientenorganismus zeigen, insbesondere infolge eines Leberzellkarzinoms. Die jeweilige Dosis bzw. der Dosisbereich für die Gabe des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels ist groß genug, um den gewünschten therapeutischen Effekt der Induktion einer Immunantwort zu erreichen. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, der Konstitution und dem Geschlecht des Patienten variieren sowie die Schwere der Erkrankung berücksichtigen. Es versteht sich, dass die spezifische Dosis, Häufigkeit und Dauer der Verabreichung darüber hinaus von einer Vielzahl an Faktoren abhängen, wie z. B. Struktur des verwendeten Vektors, Expression der immunstimulierenden Proteine, Ernährungsgewohnheiten des zu behandelnden Individuums, Art der Verabreichung, Ausscheidungsrate und Kombination mit anderen Medikamenten. Die individuelle Dosis kann sowohl in Bezug auf die primäre Erkrankung als auch in Bezug auf das Eintreten eventueller Komplikationen eingestellt werden. Die exakte Dosis ist durch einen Fachmann mit bekannten Mitteln und Methoden feststellbar.
In einer Ausgestaltung der Erfindung werden die Viruspartikel in einer Konzentration von maximal 1 × 10¹¹ infektiösen Viruspartikeln (PFU) pro Dosiereinheit verabreicht, vorzugsweise 1 × 10⁹ PFU pro Dosiereinheit. Sowohl in verschiedenen Zellkultursystemen als auch im Murmeltier(woodchuck)-Modell führte der Vektor bei einer Dosis von 1 × 10⁹ PFU zu einer starken spezifischen Expression der therapeutischen Gene IL-12 und B7.1 in Hepatomazellen, die nicht mit toxischen Effekten verbunden war. Die Dosierung kann auch deutlich unter den genannten Werten bleiben und nicht mehr als 1 × 10⁸ PFU pro Dosiereinheit, vorzugsweise 1 × 10⁷ PFU pro Dosiereinheit, besonders bevorzugt 1 × 10⁶ PFU pro Dosiereinheit betragen. Die Experimente wurden auch in immunkompetenten Fellmäusen (Maustumormodell) durchgeführt. Damit bewirken die erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Viruspartikel eine Zerstörung oder signifkante Reduzierung des Tumors bereits bei besonders geringer Dosierung.
Zur Unterstützung der medizinischen Wirkung, d. h. insbesondere der Immunantwort, kann das pharmazeutische Mittel in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auch weitere Wirkstoffe umfassen. Die therapeutische Wirkung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel kann dann beispielsweise darin bestehen, dass durch die Induktion der Expression der immunologisch-aktiven Proteine als erwünschter Nebeneffekt bestimmte Antitumor-Medikamente besser wirken oder durch die Verminderung der Dosis die Anzahl der Nebenwirkungen dieser Medikamente reduziert wird.
Erfindungsgemäß ist das vorliegende pharmazeutische Mittel zur therapeutischen Behandlung von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen, geeignet. Die vorherige Lehre der Erfindung und deren Ausführungsformen sind gültig und ohne Einschränkungen auf pharmazeutische Mittel anwendbar, sofern es sinnvoll erscheint. Es versteht sich, dass auch der Wirt des pharmazeutischen Mittels in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist.
Das Einbringen des pharmazeutischen Mittels in eine Zelle respektive einen Organismus kann erfindungsgemäß auf jede Art und Weise geschehen, die es ermöglicht, dass die Tumorzellen mit den im Mittel enthaltenen Vektoren bzw. Viruspartikeln in Kontakt gebracht und an den Tumor abgegeben werden sowie eine Expression der immunstimulierenden Proteine induziert wird. Das pharmazeutische Mittel der vorliegenden Erfindung kann oral, intradermal, subkutan, intramuskulär, intravenös und/oder intratumoral angewendet werden. Die gewählte Art der Verabreichung richtet sich nach der Indikation, der zu verabreichenden Dosis, Individuums-spezifischen Parametern etc. Insbesondere ermöglichen die verschiedenen Arten der Verabreichung eine ortsspezifische Therapie, die Nebenwirkungen minimiert und die Vektordosis verringert. Bevorzugt ist die intratumorale Injektion. Die Applikation kann z. B. mit Hilfe sogenannter Impfpistolen, die den Vektor mittels Goldkugeln in die Haut einbringen, oder mittels Spritzen, die den Vektor unter die Haut oder in den Muskel einbringen, geschehen.
Um die therapeutische Wirkung der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder Viruspartikel zu erhöhen, können den daraus hergestellten pharmazeutischen Mitteln pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie z. B. Adjuvantien, zugesetzt werden. Im Sinne der Erfindung ist jede Substanz, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Viruspartikeln eine Wirkung ermöglicht, verstärkt oder modifiziert, ein Adjuvants. Bekannte Adjuvantien sind beispielsweise Aluminiumverbindungen, wie z. B. Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, Saponine, wie z. B. QS 21, Muramyldipeptid oder Muramyltripeptid, Proteine, wie z. B. Gammainterferon oder TNF, MF 59, Phosphatdibylcholin, Squalen oder Polyole. Des weiteren kann DNA, die eine immunstimulatorische Eigenschaft hat oder für ein Protein mit Adjuvants-Effekt kodiert, parallel oder in einem Konstrukt appliziert werden.
Das pharmazeutische Mittel kann als Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung, Dispersion oder Suspension vorliegen. Die Darreichungsformen des pharmazeutischen Mittels werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise eingesetzten Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart in einer geeigneten Dosierung und in an sich bekannter Weise hergestellt. Die erfindungsgemäßen Vektoren oder erfindungsgemäßen Viruspartikel im pharmazeutischen Mittel können beispielsweise in Liposomen oder Liposomen mit Replikations-kompetenten Adenoviren (RCA) eingebracht werden, als Polyglycol-ummantelte Adenoviren, Antikörper-verbrückte Adenoviren (die an einen für das Virus und einen Zellmarker spezifischen Antikörper gebunden sind), Kassette in einem RCA oder als für die Vermehrung im Tumor konditionelles RCA (mit der E1-Funktion unter Kontrolle eines tumorspezifischen Promotors) vorliegen, oder mit RCAs vermischt sein. Grundsätzlich können auch pharmazeutisch annehmbare und dem Fachkundigen bekannte Exzipienten einen Teil der erfindungsgemäßen Mittel oder Formulierungen bilden. Diese Exzipienten umfassen beispielsweise auch Salze, verschiedene Füller, zusätzliche Pufferagenzien, Chelatbildner, Antioxidantien, Co-Lösungsmittel und dergleichen.
Vorzugsweise liegt das pharmazeutische Mittel als Injektionslösung vor. Für die Herstellung der Injektionslösung können wässrige Medien, wie z. B. destilliertes Wasser oder physiologische Salzlösungen verwendet werden. Das pharmazeutische Mittel kann auch als feste Zusammensetzung, beispielsweise im lyophilisierten Zustand vorliegen, und dann durch Zugabe eines auflösenden Mittels, wie z. B. destilliertes Wasser, vor der Verwendung bereitet werden. Die Konzentration der therapeutisch aktiven Vektoren bzw. Viruspartikel in der Formulierung kann zwischen 0,1 bis 100 Gewichtsprozenten variieren. Die anfängliche Immunogenität der Tumorzellen kann durch mehrere Injektionen verstärkt werden. Alternativ kann das pharmazeutische Mittel als Trägermaterial, wie z. B. auf Basis von Cellulosesulfat, formuliert sein, das den Vektor nach Implantation in den Tumor über einen gewissen Zeitraum freisetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors, des erfindungsgemäßen Viruspartikels oder der erfindungsgemäßen Zelle zur Therapie von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors, des erfindungsgemäßen Viruspartikels oder der erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Medikaments zur Therapie von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen.
Die Erfindung lehrt ferner ein Verfahren zur Behandlung von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen, wobei eine effektive Dosis des erfindungsgemäßen Vektors oder des erfindungsgemäßen Viruspartikels einem zu behandelnden Probanden verabreicht wird. Der zu behandelnde Proband ist insbesondere ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch. Das Therapieprinzip besteht darin, durch direkte intratumorale Injektion eine gegen den Tumor gerichtete Immunantwort zu induzieren. In einem alternativen Therapieverfahren können dem Patienten auch Tumorzellen entnommen werden und diese Zellen in-vitro mit einer effektiven Dosis des erfindungsgemäßen Vektors oder des erfindungsgemäßen Viruspartikels behandelt werden. Die behandelten Zellen können dem Organismus sofort re-implantiert werden, so dass das körpereigene Immunsystem die Antigen-präsentierenden Tumorzellen zerstört und die Vektoren bzw. Viruspartikel – sofern genetisch dazu befähigt und in hinreichender Konzentration vorhanden – propagieren. Oder die behandelten Zellen werden in-vitro mit Immunzellen kontaktiert, die die Tumorzellen attackieren und deren Rückbildung betreiben, so dass im Anschluss daran die verbliebenen gesunden Leberzellen re-implantiert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird also ein viraler Vektor bereitgestellt, der die selektive und therapeutisch effiziente Expression von IL-12 und einem Kostimulator-Protein erlaubt. Unter der Kontrolle des AFP-Promotors, der in adulten normalen Leberzellen und in Nicht-Hepatomazellen inaktiv ist, wird die selektive Expression der Transgene in Leberzellkarzinomen, vorzugsweise in AFP-positiven hepatozellulären Karzinomen erreicht. Durch die tumorspezifische Expression werden gesundes Lebergewebe und anderes Gewebe geschont. Das ist insbesondere vorteilhaft, da IL-12 in hohen Konzentrationen, wie sie z. B. infolge hoher Vektorkonzentrationen auftreten, cytotoxisch wirkt. Damit ist eine erhöhte Sicherheit des erfindungsgemäßen Vektors gegeben. Die Kopplung des AFP-Promotors mit dem MER-I-Enhancer stellt eine hohe, stabile und gleichmäßige Co-Expression aller Proteine sicher. Die Expression ist derjenigen unter Kontrolle des CMV-Promotors vergleichbar oder sogar besser und weist darüber hinaus den entscheidenden Vorteil der gezielten Expression in HCC-Tumoren auf. Co-Expression, hohes Konzentrationsniveau und Selektivität der Proteinexpression im erfindungsgemäßen Vektor gehen mit einer erheblichen Verbesserung seiner Applikation und des therapeutischen Effekts einher. Die synergistische Wirkung der durch die erfindungsgemäßen Vektoren kodierten Proteine ermöglicht den Einsatz niedriger Vektordosierungen, die wiederum geringere Nebenwirkungen hervorbringen, wie z. B. ein vermindertes Risiko einer Autoimmunerkrankung für den Patienten. Gleichzeitig ist die Vektortoxizität verringert. Die Reduzierung der Vektordosis verbessert auch die Sicherheit beim klinischen Einsatz, indem die Wahrscheinlichkeit einer Verbreitung des Vektors im zu behandelnden Organismus verringert wird. Durch die Immungentherapie werden nicht nur der Primärtumor, sondern auch die Metastasen eliminiert. Neben der kompletten Tumorrückbildung wird die Ausbildung einer permanenten Antitumorimmunität erreicht. Des weiteren können größere Tumormassen oder mehrere Tumorherde gleichzeitig behandelt werden, ohne Nebenwirkungen zu erzeugen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Beispielen für konkrete Ausführungsformen näher erläutert. In den Beispielexperimenten werden Standardreagenzien und Puffer verwendet, die frei von Kontaminationen sind.
1 zeigt die Vektorkarte des rekombinanten adenoviralen Vektors rAdmAFPpehIL12B7.1.
2 zeigt die Basenpaar-Sequenz des rekombinanten adenoviralen Vektors rAdmAFPpehIL12B7.1.
3 zeigt die Aktivität verschiedener Promotoren in unterschiedlichen Zelllinien.
BEISPIEL 1: Herstellung des Vektors rAdmAFPpehIL12B7.1
Die IL-12p35 und IL-12p40 cDNAs des humanen IL-12 und die cDNA des kostimulierenden Moleküls B7.1 (CD80) wurden vom Genetics Institute (Andover, MA, USA) zur Verfügung gestellt. Bei der IL-12p35 Untereinheit handelt es sich um ein 1,1 kb großes Fragment, das im pED (EMC) Vektor an der PstI-Schnittstelle enthalten war. Die IL-12p40 Untereinheit ist ein 2,3 kb großes Fragment, das im gleichen Vektor an der XbaI-Schnittstelle enthalten war. Die hB7.1 cDNA wurde als Plasmid (pCA13huB7) von Dr. S. Dessureault (Toronto, Kanada) erhalten. In der Expressionskassette befindet sich die IL-12p40 Untereinheit stromaufwärts von der IL-12p35 cDNA und der CD80 cDNA (1). Zwischen den einzelnen cDNAs befinden sich jeweils eine IRES-Sequenz des Encephalomyokarditis-Virus (EMCV). Die IRES-Sequenzen stammen aus dem pCITE-2 Vektor von Novagen. Das Plasmid mit der vollständigen Expressionskassette für humanes IL-12B7.1 (phIL12B7) wurde von Dr. Stewart zur Verfügung gestellt.
Das Gen-Konstrukt rAdmAFPpehIL12B7.1 wurde mit dem AdEasy-System generiert, das von B. Vogelstein, Memphis, TN, USA, zur Verfügung gestellt wurde (He et al. (1998) PNAS USA 95, 2509–2514). Für die Herstellung von rAdmAFPpehIL12B7.1 wurde der Vektor durch die Beseitigung der E1-Region, die die viralen Gene E1A, E1B und Protein IX enthält, replikationsdefekt gemacht. Außerdem wurde die E3-Region deletiert, so dass es sich um einen rekombinanten adenoviralen Erstgenerationsvektor handelt. Anschließend wurden die folgenden Schritte durchgeführt:
Das SV40 Polyadenylierungssignal (160 bp Fragment) wurde aus dem pMH4-Plasmid über BglII/SalI-Restriktion herausgeschnitten, aufgefüllt (blunt ended) und in die NotI-Schnittstelle des pShuttle Plasmids inseriert (und sequenziert).
Der murine α-Fetopratein (AFP1) Promotor (–1009 bis +37) wurde mittels PCR amplifiziert (899 bp Fragment), in den pCR2.1TOPO-Vektor über EcoRI subkloniert und anschließend nach EcoRI-Restriktion (blunt ended) in die Polylinker-Region (SalI-Schnittstelle, blunt ended) des AdEasy pShuttle-Plasmids integriert (und sequenziert).
Der erhaltene Vektor (pShuttle/polyA–Signal/AFP-Promotor) wurde mit HindIII geschnitten und mit Klenow aufgefüllt (blunt ended). In die aufgefüllte HindIII-Schnittstelle dieses Plasmids wurde der mittels PCR amplifizierte MER-I-Enhancer (–2574 bis –2190) (384 bp Fragment) (EcoRI-Verdau/blunt ended aus pCR2.1TOPO) kloniert (und sequenziert).
In die EcoRV-Schnittstelle des erhaltenen Plasmids wurde die IL12B7.1 cDNA (3950 bp Fragment, NotI/XhoI aus dem Plasmid phIL12B7 herausgeschnitten und blunt ended) inseriert (und sequenziert). Das so generierte Plasmid enthält die humane IL12B7.1 Expressionskassette für das humane Interleukin-12 (hIL-12) Gen, bestehend aus den beiden Untereinheiten IL-12p35 und IL-12p40, und das humane B7.1 (CD80) Gen (hB7.1), unter der Kontrolle des murinen AFP-Promotors/MER-I-Enhancers und terminiert durch das Polyadenylierungssignal von SV40.
Die Rekombination erfolgte nach Co-Transformation mit dem Plasmid AdEasy1, welches die restlichen Adenovirus-Sequenzen enthält, in E. coli BJ 5183 Bakterien. Der resultierende Virusvektor wurde anschließend in 293-Zellen propagiert.
Der finale Vektor rAdmAFPpehIL12B7.1 trägt die hIL-12p40 – ECMV IRES – hIL-12p35 – EMCV IRES – hB7.1 – Expressionskassette in der deletierten E1-Region von Ad5 (1, 2).
BEISPIEL 2: Selektivität und Aktivität des AFP-Pramotors/MER-I-Enhancers
Die Aktivität des murinen AFP-Promotors/MER-I-Enhancers, wie er im Vektor rAdmAFPpehIL12B7.1 enthalten ist, wurde in-vitro in Reporter-Assays mit der Aktivität des AFP-Promotors sowie mit weiteren Promotoren verglichen. Hierzu wurde ein Reporter-Gen im Plasmid pGL3 unter die Kontrolle jeweils eines anderen Promotors gestellt. Mit den erhaltenen Plasmiden pGL3 Basic, pGL3 SV40, pGL3 CMV, pGL3 TERT, pGL3 AFP P + E und pGL3 AFP wurden die humanen hepatozellulären Karzinomzelllinien Hep3B und HepG2, humane embryonische Nierenzellen 293, humane Osteosarcoma-Zellen Saos-2, humane Vorhaut-Fibroblasten VH6 und die humane Cercix-Krebszelllinie HeLa transfiziert. Die Ergebnisse in 3 zeigen, dass sowohl der AFP-Promotor als auch der AFP-Promotor/MER-I-Enhancer ausschließlich in den HCC-Zelllinien zur Expression des Reporter-Gens führten, während sie in den Nicht-HCC-Zelllinien nicht aktiv waren. Eine Selektivität der übrigen Promotoren konnte nicht beobachtet werden. Der AFP-Promotor/MER-I-Enhancer bewirkte eine deutlich stärkere Genaktivierung als der AFP-Promotor allein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vektor umfassend eine Nukleinsäure-Sequenz der SEQ ID NO: 1.
Viruspartikel umfassend den Vektor nach Anspruch 1.
Zelle umfassend den Vektor nach Anspruch 1 und/oder das Viruspartikel nach Anspruch 2, wobei solche menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, die unter Vernichtung von Embryonen gewonnen wurden.
Organismus umfassend die Zelle nach Anspruch 3.
Pharmazeutisches Mittel umfassend den Vektor nach Anspruch 1 oder das Viruspartikel nach Anspruch 2, vorzugsweise zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen.
Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 5 zur therapeutischen Behandlung von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen.
Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 5 oder 6 zur oralen, intravenösen, subkutanen, intramuskulären und/oder intratumoralen Anwendung, vorzugsweise zur intratumoralen Injektion.
Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es als Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung, Dispersion oder Suspension vorliegt, vorzugsweise als Injektionslösung.
Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Viruspartikel in einer Konzentration von maximal 1 × 10¹¹ infektiösen Viruspartikeln (PFU) pro Dosiereinheit vorliegen, vorzugsweise 1 × 10⁹ PFU pro Dosiereinheit.
Verwendung des Vektors nach Anspruch 1, des Viruspartikels nach Anspruch 2 oder der Zelle nach Anspruch 3 zur Therapie von Leberzellkarzinomen, vorzugsweise von hepatozellulären Karzinomen.