DE10046175A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen - Google Patents

Abstract

Verfahren zum automatisierten Züchten und/oder Behandeln von Zellen für diagnostische Zwecke mit einer Zellkulturplatte, die eine Vielzahl von auf der Oberseite der Zellkulturplatte offenen und auf der Unterseite geschlossenen Bohrungen aufweist, in denen Zellen aufgenommen werden, mit einer dynamischen Zufuhr von Sauerstoff und/oder Nährstoffen zu den als Zellkulturräume fungierenden Bohrungen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatisier­ ten Züchten und/oder Behandeln von Zellen für diagno­ stische Zwecke. Die Erfindung betrifft weiterhin auch eine Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen und die Verwendung einer Zellkulturplatte zu diesem Zweck.

In der älteren DE 199 35 643.2 A1 ist eine Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen beschrieben, wobei auf einem Träger ein formbarer Zellkulturraum angeordnet ist. Der Zellkulturraum wird dabei durch den Träger oder eine Trägerfolie auf einer Seite und eine Zellkulturfolie auf der anderen Seite, die ela­ stisch ist, gebildet. Mit einer Vorrichtung dieser Art, ist es möglich, eine Massenkultur von Zellen mit großer Variabilität und für viele Einsatzzwecke durch­ zuführen.

Zum weiteren Stand der Technik wird auch auf die DE 197 19 751 A1 verwiesen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum automatisierten Züchten und/oder Behandeln von Zellen zu schaffen, wobei auf möglichst geringem Raum eine hohe Anzahl von Zellen, die auch von unterschiedlicher Art sein kön­ nen, für diagnostische Zwecke gezüchtet und/oder be­ handelt werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das in An­ spruch 1 genannte Verfahren gelöst.

In den Ansprüchen 5 und 6 ist jeweils eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Die Verwendung einer an sich bekannten Zellkulturplat­ te zur Lösung der gestellten Aufgabe ist in Anspruch 13 aufgezeigt.

Zellkulturplatten dieser Art sind in der Medizin, ins­ besondere in der Arzneimittelforschung, allgemein un­ ter der Marke Wellplatte oder Multiwellplatte bekannt. Dabei werden in Bohrungen bzw. Vertiefungen der Zell­ kulturplatte Zellen für analytische Tests eingebracht. Anschließend werden die Zellen durch Pipettieren mit den verschiedensten Substanzen in Berührung gebracht, und deren Auswirkungen auf die Zellen beobachtet.

Erfindungsgemäß wird jedoch nunmehr in völliger Ab­ wandlung der bisherigen Verwendung einer derartigen Zellkulturplatte, diese zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen in einem dynamischen Verfahren verwendet. Dies bedeutet, durch die Zufuhr von Sauerstoff und/oder Nährstoffen, welche kontinuierlich oder auch diskontinuierlich erfolgt, lassen sich nunmehr Zellen über einen längeren Zeitraum züchten und/oder behan­ deln und beobachten. Die hierzu erforderliche Zufuhr von Nährstoffen und Sauerstoff kann auf die verschie­ denartigste Weise erfolgen.

In einfacher Weise können dabei Nährstoffe und Sauer­ stoff gemeinsam durch eine kontinuierliche oder auch diskontinuierliche Durchströmung der nunmehr zu Zell­ kulturräumen umfunktionierten Vertiefungen bzw. Boh­ rungen geleitet werden.

In einer sehr vorteilhaften Ausgestaltung der Erfin­ dung kann jedoch eine separate Zufuhr von Sauerstoff in den Zellkulturraum von der Unterseite der Zellkul­ turplatte aus über eine gaspermeable Folie oder Mem­ brane eingebracht werden. Normalerweise sind die Zell­ kulturplatten mit stabilen, gasundurchlässigen Böden versehen. Ersetzt man nun diese Böden durch eine ent­ sprechende gaspermeable Folie bzw. Membrane und sorgt für eine entsprechende Sauerstoff- bzw. Luftzufuhr zu diesen Bereichen, so ist eine einfache und sehr inten­ sive Sauerstoffzufuhr zu den Zellen gegeben.

Eine weitere Möglichkeit zur Zufuhr von Nährstoffen und/oder Sauerstoff kann darin bestehen, daß in wenig­ stens einen Teil der Bohrungen bzw. Zellkulturräume der Zellkulturplatte Einsätze einsetzbar sind, welche jeweils mit Zulaufbohrungen und Rücklaufbohrungen ver­ sehen sind.

Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen Unteransprüchen und aus den nachfolgend anhand der Zeichnung beschrie­ benen Ausführungsbeispielen.

Es zeigt:

Fig. 1 eine Zellkulturplatte (Multiwellplatte) in perspektivischer Ansicht;

Fig. 2 einen Schnitt nach der Linie II-II der Fig. 1 in vergrößerter Darstellung mit der Ausbil­ dung der Bohrungen der Zellkulturplatte, je­ weils als Zellkulturraum;

Fig. 3 einen Schnitt nach der Linie III-III der Fig. 2;

Fig. 4 eine alternative Ausgestaltung der Ausbildung von Zellkulturräumen in einem Schnitt ähnlich dem nach der Fig. 2;

Fig. 5 eine weitere Ausgestaltung zur Bildung von Zellkulturräumen, ebenfalls in einem Schnitt entsprechend dem nach der Fig. 2;

Fig. 6 prinzipmäßig die Zufuhr und Abfuhr von Nähr­ stoffen zu den Zellkulturräumen in einer Draufsicht; und

Fig. 7 ausschnittsweise eine Ausgestaltung, wobei die Zellkulturräume unter Druck setzbar sind.

Zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen für diagno­ stische Zwecke wird eine an sich bekannte Zellkultur­ platte 1 (Multiwellplatte) verwendet, die im allgemei­ nen entsprechend ihrer Größe, eine hohe Anzahl von Löchern bzw. Bohrungen 2 aufweist. Die Bohrungen 2 haben Durchmesser von wenigen Millimetern bis zu meh­ reren Millimetern, und deren Anzahl kann bis zu mehre­ ren Hundert Stück pro Zellkulturplatte 1 betragen.

Aus den Fig. 2 bis 5 sind verschiedene Ausgestal­ tungen der Bohrungen 2 bzw. deren Umfunktionierung zu Zellkulturräumen 2' ersichtlich. Gemäß Fig. 2 wird in jede Bohrung 2, die als Zellkulturraum 2' dienen soll, ein Einsatz 3 eingesetzt, der mit einer Zulaufbohrung 4 und einer Rücklaufbohrung 5 versehen ist, welche sich von der Oberseite der Zellkulturplatte 1 bis ~zu deren Unterseite erstrecken, wobei die Unterseiten der Zellkulturplatte bzw. die Bohrungen 2 mit Böden 6 ab­ geschlossen sind. Die Einsätze 3 werden somit von der Oberseite der Zellkulturplatte 1 aus in die offenen Bohrungen 2 eingesetzt. Zur Abdichtung der Zellkultur­ räume 2' sind die Einsätze 3 jeweils umfangseitig mit einem Dichtring 19 versehen.

Von der jeweils zu dem Boden 6 gerichteten Seite eines Einsatzes 3 aus, ragt ein Trennsteg 7 in Richtung auf den Boden 6. Der Trennsteg 7 liegt zwischen der Zu­ laufbohrung 4 und der Rücklaufbohrung 5 und erstreckt sich, wie aus der Fig. 3 ersichtlich ist, quer über die Bohrung 2. Durch den Trennsteg 7 wird erreicht, daß die über die Zulaufbohrung 4 eingebrachten Nähr­ stoffe nicht in einem "Kurzschluß" direkt zu der Rück­ laufbohrung 3 strömen können. Durch den Trennsteg 7 werden sie gezwungen, entsprechend den gesamten Zell­ kulturraum 2' zu durchströmen und dabei die auf den Boden 6 aufgebrachten Zellen 8 zu überströmen. Gleich­ zeitig kann der Trennsteg 7 auch zur Zentrierung bzw. zum leichteren Einführen des Einsatzes 3 in die Boh­ rung 2 dienen.

Bei der in der Fig. 2 links dargestellten Ausgestal­ tung mit dem Einsatz 3 erfolgt die Sauerstoffzufuhr zu den Zellen 8 zusammen mit der Zufuhr von Nährstoffen über die Zulaufbohrung 4. Entfernt man den festen Bo­ den 6 und ersetzt diesen durch eine gaspermeable Folie oder Membrane 9 entsprechend der rechts in der Figur in der Dicke stark vergrößert dargestellten Ausgestal­ tung, so kann eine sehr intensive und direkte Sauer­ stoffzufuhr von der Unterseite der Zellkulturplatte 1 aus durch die gaspermeable Folie erfolgen (siehe Pfei­ le). Auf der gaspermeablen Folie 9, die in den Figuren aus Übersichtlichkeitsgründen wesentlich dicker darge­ stellt ist, erfolgt die Zucht und die Behandlung der Zellen 8.

Die Fig. 4 zeigt anstelle einer Vielzahl von in die Bohrungen 2 einzusetzenden Einsätze 3 eine Deckplatte 10, welche in der Fig. 1 nur ganz allgemein gestri­ chelt dargestellt ist. In die Deckplatte 10 sind in entsprechenden Bohrungen der Deckplatte Zulaufan­ schlüsse 4' und Rücklaufanschlüsse 5' eingesetzt. Wie ersichtlich, ragen die Zulaufanschlüsse 4' im Ver­ gleich zu den Rücklaufanschlüssen 5' deutlich tiefer in die dazugehörigen Bohrungen 2 bzw. die Zellkultur­ räume 2'. Wie weiter ersichtlich, wird durch diese Maßnahme ebenfalls erreicht, daß keine Kurzschlußströ­ mung direkt von einem Zulauf zu einem Rücklauf er­ folgt. Die Zellen 8 werden vielmehr von dem Nährmedium überströmt. In der Fig. 4 sind ebenfalls die beiden Varianten mit einem festen Boden 6 und einer gasperme­ ablen Folie bzw. Membrane 9 nebeneinander dargestellt.

Links in der Fig. 4 ist dargestellt, wie die Deckplat­ te 10 durch Schrauben 11 mit der Zellkulturplatte 1 verbunden ist. Rechts ist dargestellt, daß anstelle oder zusätzlich zu einer Verbindung über Schrauben 11 auch eine Abdichtung durch eine Dichtungseinrichtung 12 zwischen der Deckplatte 10 und der Zellkulturplatte 1 erreicht werden kann.

In der Fig. 5 ist prinzipmäßig eine zweiteilige Aus­ bildung der Deckplatte 10 mit einer oberen Abdeckung 10a und einer unteren Abdeckung 10b dargestellt. Wie ersichtlich, sind die obere Abdeckung 10a und die un­ tere Abdeckung 10b abstandseinstellbar miteinander verbunden. Durch dazwischen gelegte Federn 13 wird eine Vorspannung erreicht. Die obere Abdeckung 10a wird über Stege 14 an den Rändern der Zellkulturplatte 1 umlaufend auf diese aufgesetzt. Die untere Abdeckung 10b ist mit Bohrungen versehen, durch die Zulaufan­ schlüsse 4' und Rücklaufanschlüsse 5', ähnlich der Ausgestaltung nach der Fig. 4, geschoben sind. Die Zulaufanschlüsse 4' und Rücklaufanschlüsse 5' sind entsprechend auch durch die obere Abdeckung 10a entwe­ der auf deren Oberseite oder gegebenenfalls auch seit­ lich an den Rändern herauszuführen. Durch die Federn 13 wird eine Abdichtung der Zellkulturräume erreicht, weil die untere Abdeckung 10b entsprechend dicht auf der Oberseite der Zellkulturplatte 1 aufliegt. Gleich­ zeitig werden auf diese Weise auch Ansätze 15, die auf der Unterseite der unteren Abdeckung 10b nach unten aus dieser vorstehen in die Bohrungen 2 zur Bildung von abgeschlossenen Zellkulturräumen 2' eingeführt.

Aus der Fig. 5 ist in gestrichelter Darstellung auch ersichtlich, daß man die gesamte Einheit mit der Zell­ kulturplatte 1 in eine Wanne 16 setzen kann. Die Zell­ kulturplatte 1 sitzt dabei umlaufend dicht auf der Wanne 16 auf. Zwischen den in diesem Falle aus einer gaspermeablen Folie bzw. Membrane 9 gebildeten Boden und dem Wannenboden befindet sich ein Zwischenraum 17. Führt man Sauerstoff in die Wanne 16 ein, z. B. über Bohrungen 18, so erfolgt eine sehr intensive direkte Sauerstoffversorgung für die in den Zellkulturräumen 2' liegenden Zellen 8 durch die Folie bzw. Membrane 9.

Die Bohrungen 18 können vorzugsweise der Größe der Bohrungen 2 entsprechen. Der Zwischenraum 17 kann ge­ gebenenfalls entfallen, wobei in diesem Fall die Zell­ kulturplatte 1 direkt auf dem Boden der Wanne 16 auf­ sitzt und über eine, vorzugsweise dem Durchmesser der Zellkulturräume 2' entsprechende Öffnung, mittels ei­ ner gaspermeablen Folie 9 bzw. Membran 9 ein Gasaus­ tausch erfolgen kann. Die Bohrungen 18 in der Wanne 16 ermöglichen noch eine Sichtverbesserung bei mikrosko­ pischer Beobachtung der Zellen. Vorzugsweise ist hier­ für auch das Material der Deckplatte 10 wie auch der Wanne 16 aus transparentem Material hergestellt, wie z. B. Polycarbonat oder Polysteren.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrich­ tung wird aus einer an sich bekannten Zellkulturplatte 1 eine Art Bioreaktor zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen. Durch die dynamische Zufuhr von Nährmedium und Sauerstoff ist dabei auch eine Langzeitkultur mög­ lich.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Automati­ sierungsmöglichkeit von routinemäßig ablaufenden Pro­ zessen, wie z. B. von in beliebigen nach oben offenen Kulturgefäßen.

An sich bekannte Zellkulturplatten herkömmlicher Bau­ art können auf einfache Weise auch für das erfindungs­ gemäße Verfahren abgewandelt werden. So kann z. B. auf einfache Weise der feste Boden 8 entfernt werden und eine gaspermeable Folie 9 über die nun auf beiden Sei­ ten offenen Bohrungen 2 auf der Unterseite der Zell­ kulturplatte 1 gespannt werden. Über die gaspermeable Folie 9 kann man die Entwicklung der Zellen 8 auch im Bedarfsfall beobachten, wozu die Folie 9 entsprechend durchsichtig auszubilden ist.

Dadurch, daß die Zellen 8 sehr definiert als Schicht mit zweidimensionaler Ausdehnung in den Zellkulturräu­ men 2' wachsen bzw. angeordnet sind, läßt sich die gesamte Zellkulturplatte 1 im Bedarfsfalle auch ein­ frieren, wenn man die Zellen transportieren oder bis zu deren Verwendung zwischenlagern möchte.

In der Regel wird man für das Kulturverfahren alle oder einen Großteil der Bohrungen 2 einer Zellkultur­ platte zu Zellkulturräumen 2' umfunktionieren. Im Be­ darfsfalle ist es selbstverständlich auch möglich, auch nur einzelne Zellkulturräume 2' mit entsprechend einzelnen Einsätzen 3 zu schaffen, da die Einsätze 3 auch alleine einsetzbar sind. Die Einsätze 3 können auch bei einzelnen Kultureinheiten individuell ange­ strömt bzw. entleert werden.

Wesentlich ist in jedem Falle, daß für eine ausrei­ chende Sauerstoffversorgung zu den Zellen 8 gesorgt wird, um auch ein länger dauerndes Zellkulturverfah­ ren, insbesondere für "anspruchsvolle" Zellen, durch­ führen zu können. Aufgrund der Ausgestaltung der be­ kannten Zellkulturplatten 1, insbesondere der Bohrun­ gen 2, war eine Züchtung und/oder Behandlung von Zel­ len in der erfindungsgemäßen Form bisher nicht mög­ lich.

In der Fig. 6 ist prinzipmäßig die Zufuhr und die Ab­ fuhr von Nährstoffen und gegebenenfalls von Sauerstoff zu den Zellkulturräumen 2 in einer Draufsicht darge­ stellt. Wie ersichtlich, ist dabei ein gemeinsamer Zulaufanschluß 20 vorgesehen, von welchem aus über mehrere Zweigleitungen 21 die einzelnen Zellkulturräu­ me 2 mit Nährmedium und gegebenenfalls auch mit Sauer­ stoff versorgt werden. Anschließend folgt wiederum über einzelne Zweigleitungen 22 eine gemeinsame Abfuhr über einen Ablaufanschluß 23.

Durch den gemeinsamen Zulaufanschluß 20 und den ge­ meinsamen Ablaufanschluß 23 läßt sich die Vorrichtung z. B. in Form einer "docking station" verwenden, die man an eine Zentralstation anschließt, eventuell ge­ meinsam mit anderen Vorrichtungen. Auf diese Weise lassen sich sehr große Brutstöcke bzw. Zuchtvorrich­ tungen schaffen.

Die gemeinsame Zufuhr und die gemeinsame Abfuhr mit den Zweigleitungen 21 und 22 kann z. B. durch entspre­ chende Leitungen, Aussparungen oder Kanäle in der Deckplatte 10 erfolgen, von wo aus dann über einzelne Zweigleitungen 21 jeweils einzeln die Zellkulturräume 2 versorgt werden. In Verbindung mit der Wanne 16 läßt sich auf diese Weise eine Art Kassettenstruktur schaf­ fen. Im Bedarfsfalle können auch mehrere Einheiten übereinander angeordnet werden. Dies ist z. B. dadurch möglich, daß man mehrere Zellkulturplatten 1 überein­ ander anordnet, wobei die Versorgung mit Nährmedium und mit Sauerstoff durch dazwischenliegende Deckplat­ ten 10 erfolgen kann, welche entsprechend, z. B. je­ weils auf ihrer Oberseite und auf ihrer Unterseite, mit gemeinsamen Zulaufanschlüssen 20, Zweigleitungen 21 und 22 und gemeinsamen Ablaufanschlüssen 23 verse­ hen sind.

Je nach Größe der Zellkulturräume 2 und deren Anzahl kann es gegebenenfalls erforderlich sein, daß mehrere Deckplatten 10 mit darin angeordneten Zulaufanschlüs­ sen 20, Zweigleitungen 21 und 22 und Ablaufanschlüssen 23 vorgesehen sind, die aus Platzgründen mit entspre­ chend versetzt angeordneten Zweigleitungen 21 und 22 versehen sind, damit alle Zellkulturräume 2 versorgt werden können.

Zusätzlich und alternativ kann man auch die Zellkul­ turplatten 1 selbst mit gemeinsamen Zulaufanschlüssen 20, Zweigleitungen 21 und 22 und mit gemeinsamen Ab­ laufanschlüssen 23 jeweils versehen, um jeden Zellkul­ turraum 2 erreichen zu können. Hierzu kann man z. B. eine Zellkulturplatte 1 in der Mitte aufteilen und im Bereich der Trennebene die Strömungskanäle einbringen. In jedem Fall sollte jedoch eine Kanalführung geschaf­ fen werden, durch die eine gleichmäßige Versorgung aller Zellkulturräume 2 gewährleistet wird.

Die Folie bzw. die Membrane 9 kann im Bedarfsfalle auch mikroporös ausgestaltet sein, was den Vorteil hat, daß man nicht nur von oben, sondern zusätzlich oder alternativ auch von unten her Nährmedium in die Zellkulturräume 2' einbringen kann.

In der Fig. 7 ist eine sehr vorteilhafte Ausgestaltung dargestellt, wobei die Zellkulturräume 2' unter Druck gesetzt werden können. Hierzu ist die Zellkulturplatte 1 auf der Oberseite durch einen druckdichten Dom 24 und auf der Unterseite durch einen druckdichten Behäl­ ter 25 abgeschlossen. Die Öffnungen 2 auf der Obersei­ te der Zellkulturplatte 1 sind mit einer flexiblen Folie 26 abgeschlossen, welche im Bedarfsfalle auch gaspermeabel oder mikroporös sein kann, um von dieser Seite aus eine Versorgung der in den Zellkulturräumen 2' sich befindenden Zellen 8 mit Sauerstoff/Luft und/oder Nährmedium zu erreichen. Auf der Unterseite sind die Zellkulturräume 2' ebenfalls durch die Mem­ brane 9, welche gaspermeabel oder mikroporös ausgebil­ det ist, abgeschlossen.

Durch nicht näher dargestellte Druckanschlüsse 27 kann über entsprechende Druckquellen ein Raum 28 zwischen dem Dom 24 und der Folie 26 und ein Raum 29 zwischen der Membrane 9 und dem Boden des Behälters 25 unter Über- oder Unterdruck gesetzt werden. Die Steuerung der Druckverhältnisse ist dabei beliebig. Dies bedeu­ tet, es kann abwechselnd Druck von oben oder von unten oder auch gleichzeitig auf die Zellkulturräume 2' aus­ geübt werden. Hierzu verformen sich die Folie 26 und die Membrane 9 entsprechend (siehe gestrichelte Dar­ stellung). Auf diese Weise werden die Zellen 8 ent­ sprechend mechanisch bewegt, was z. B. erhebliche Vor­ teile für die Erstellung von Geweben, wie z. B. Kno­ chen, Knorpel, Muskulatur und dergleichen, besitzt, da durch Dehnungen im Sinne von Konditionierungen bzw. einem Training simuliert werden können. Zusätzlich können in den Zellkulturräumen 2' rhythmische oder intermittierende Druckbelastungen erzeugt werden. Durch diese Maßnahmen lassen sich in vivo-Verhältnisse besser simulieren.

Durch die Verwendung der Folie 26 sind die Zellkultur­ räume 2' im Bedarfsfalle auch Pipettierungsprozessen zugänglich. Anstelle einer einfachen Folie 26 können die Öffnungen 2 auch durch eine septumartiges Kunst­ stoffmembran abgedeckt werden.

Anstelle von Druckbelastungen oder auch zusätzlich können elektrische Ströme den Zellen 8 auferlegt wer­ den. Auf diese Weise können z. B. auch Dehnungen über elektromagnetische Felder ausgelöst werden, was z. B. für Herzmuskelzellen, ZNS-Zellen (neuronale Zellen) von Vorteil ist. Auf diese Weise kann man z. B. Medika­ mente testen, die die Herzfrequenz beschleunigen oder reduzieren, wozu die elektrischen Ströme praktisch Herzmuskelzellen elektrisch stimulieren. Auf diese Weise kommt es zu Interaktionen zwischen einem techni­ schen und einem biologischen System.

Die vorstehend beschriebene Zellkultursysteme können im Bedarfsfalle auch in Form eines Bioreaktors bzw. im Sandwich-System miteinander kombiniert werden. Hierzu ist es lediglich erforderlich, anstelle einer Wanne 16 oder dem Behälter 25 einen entsprechend gestalteten Zwischenboden vorzusehen, so daß sich - wie in der Fig. 7 gestrichelt angedeutet - eine weitere Einheit 30 unter dem Behälter 25 bzw. unter einem entsprechen­ den Zwischenboden anschließt. Dabei können mehrere derartige Einheiten übereinander angeordnet werden. Der dabei entstehende Bioreaktor kann in diesem Falle stufenförmig aufgebaut sein oder auch spiegelbildlich, wobei sich an die in der Fig. 7 beschriebene Einheit spiegelbildlich eine weitere Einheit anschließt. In diesem Falle dient der Raum 29 zur Zufuhr von Luft/Sauerstoff und/oder Nährmedium sowohl für die Zellkulturplatte 1 als auch für die in der Einheit 30 sich befindende Zellkulturplatte (nicht dargestellt). Selbstverständlich sind im Bedarfsfalle jedoch auch getrennte Zu- und Abflüsse möglich.

Anstelle von einfachen Zellen 8 in den Zellkulturräu­ men 2' können selbstverständlich auch mehrschichtige Kulturen gezüchtet werden.

Als eines der wesentlichen Unterschiede zum Stand der Technik ist festzuhalten, daß es sich bei dem vorlie­ genden Zellkultursystem um dynamische Prozesse han­ delt, welche kontinuierlich oder intermittierend ab­ laufen können und nicht nur um eine statische Züchtung von Zellkultursystemen, welche nach Anlegen nicht mehr weiterbehandelt werden.

Grundsätzlich liegen bei dem vorliegenden System drei Verfahren mit dazugehörigen Vorrichtungen vor, näm­ lich:

• 1. Im einfachsten Fall sind geschlossene Böden vorhan­ den und die Versorgung der Zellkulturräume 2' er­ folgt von oben über die Öffnungen bzw. Bohrungen 2 mit entsprechenden Zulaufbohrungen 4 und Rücklauf­ bohrungen 5.
• 2. Eine Ausgestaltung der Zellkulturplatten 1 mit ei­ ner gaspermeablen oder mikroporösen Membrane 9 auf der Unterseite und abgeschlossenen Bohrungen 2 auf der Oberseite, mit oder ohne Zulaufbohrungen 4 und Rücklaufbohrungen 5.
• 3. Elastische Folien sowohl auf der Oberseite als auch auf der Unterseite der Zellkulturplatte 1, die gas­ permeabel oder mikroporös sein können und welche mit entsprechenden Drücken belastet werden. Die gaspermeable oder mikroporöse Membrane 9 auf der Unterseite kann aus einer Vielzahl von einzelnen Membranen gebildet sein, die die Zellkulturräume 2' auf der Unterseite jeweils abdecken. Im allgemeinen wird man jedoch eine Folie verwenden, die die ge­ samte Unterseite der Zellkulturplatte 1 entspre­ chend abdeckt, wie dies in der Fig. 7 dargestellt ist.

Erfindungsgemäß können nunmehr komplexe Zellkultursy­ steme, die entsprechend höhere Anforderungen an die Mikroumgebung stellen, behandelt werden. Dabei kann man in den Bohrungen 2 der Zellkulturplatte 1 auch eine 3-D Struktur mit zweidimensionaler Ausdehnung definieren, die in vivo dem Abstand von einer Kapilla­ re zur nächsten Kapillare entspricht. Dieser bioarti­ fizielle Gewebeschnitt dient der Erstellung organoty­ pischer Kulturbedingungen auf kleinstem Raum und er­ möglicht es somit auch komplexere Kokultursysteme un­ ter Verwendung von verschiedenen Zelltypen und extra­ zellulärer Matrix dem High-Throughput-Screening zu­ gänglich zu machen.

Grundsätzlich liegt bei dem erfindungsgemäßen Verfah­ ren ein Dünnschichtkultursystem vor, das in vorteil­ hafter Weise von unten oxigeniert wird und das der physiologischen Zelldichte entspricht, und zwar in dem Abstand einer Blutkapillare im Organismus bis zur nächsten Blutkapillare.

Eines der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung liegt in der Miniaturisierung mit möglichst kleinen Einheiten auf engem Raum. Auf diese Weise werden auch wenig Zellen für ein Kulturverfahren benötigt, die sich dann während des Verfahrens entsprechend vermeh­ ren können.

Eines der Haupteinsatzgebiete des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung hierzu ist deshalb die Untersuchung bzw. die Auswirkung von Chemikalien und Pharmazeutikas auf Zellen, insbesondere auf menschli­ che Zellen. Auf diese Weise können Tierversuche, die sehr aufwendig und teuer durchzuführen sind, zumindest teilweise ersetzt werden.

Claims (25)

1. Verfahren zum automatisierten Züchten und/oder Behandeln von Zellen für diagnostische Zwecke mit einer Zellkulturplatte (1), die eine Vielzahl von auf der Oberseite der Zellkulturplatte (1) offenen und auf der Unterseite geschlossenen Bohrungen (2) aufweist, in denen Zellen aufgenommen werden, mit einer dynamischen Zufuhr von Sauerstoff und/oder Nährstoffen zu den als Zellkulturräume (2') fun­ gierenden Bohrungen (2).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährstoffe mit oder ohne Sauerstoff die Boh­ rungen (2) durchströmen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoff durch eine gaspermeable Ausbildung der Böden (6) in die Bohrungen (2) eingebracht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Böden (6) oder eine anstelle der Böden (6) vorgesehene Membrane (9) mikroporös sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume (2') mit unterschiedlichen Drücken beaufschlagt werden.

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil der Bohrungen (2) der Zellkul­ turplatte (1) auf ihren von den Öffnungen abge­ wandten Seiten mit gaspermeablen oder mikroporösen Folien oder Membranen (9) als Böden abgeschlossen sind.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einen Teil der Bohrungen (2) der Zellkulturplatte (1) Einsätze (3) einsetzbar sind, welche jeweils mit Zulaufbohrungen (4) und Rück­ laufbohrungen (5) versehen sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Einsätze (3) jeweils auf ihrem zu den Böden (6) gerichteten Seiten mit einem Trennsteg (7) zwischen den Zulaufbohrungen (4) und den Rücklauf­ bohrungen (5) versehen sind.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß von den Zulaufbohrungen (4) und Rücklaufbohrungen (5) aus jeweils Zulaufanschlüsse (4') und Rück­ laufanschlüsse (5') sich in Richtung zu den Böden (6) erstrecken, wobei die Zulaufanschlüsse (4') und die Rücklaufanschlüsse (5') jeweils unter­ schiedlich weit in die Bohrungen (2) ragen.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einsätze (3) umfangseitig jeweils mit einem Dichtring (19) Versehen sind.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturplatte (1) mit einer Deckplatte (10) abgedeckt ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckplatte (10) durch Schrauben (11) mit der Zellkulturplatte (1) verbunden und/oder die Zell­ kulturplatte (1) durch eine Dichtungseinrichtung (12) abgedichtet ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckplatte (10) zweiteilig ausgebildet ist, mit einer oberen Abdeckung (10a) und einer unteren Abdeckung (10b), wobei die beiden Abdeckungen (10a, 10b) elastisch oder zueinander beweglich mit­ einander verbunden sind.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Abdeckung (10b) mit Ansätzen (15) ver­ sehen ist, die in wenigstens einen Teil der Boh­ rungen (2) ragen, und die mit Zulaufanschlüssen (4') und Rücklaufanschlüssen (5') versehen sind.

15. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckplatte (10) mit wenigstens einem Zulaufan­ schluß (20), mit Zweigkanälen (21, 22) und mit we­ nigstens einem Ablaufanschluß (23) zur Versorgung der Zellkulturräume (2) mit Nährmedium und/oder Sauerstoff versehen sind.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Deckplatten (10) zur Versorgung von ein oder mehreren Zellkulturplatten (1) vorgesehen sind.

17. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturplatte (1) zweiteilig ausgebildet ist, wobei in der Trennebene wenigstens ein Zu­ laufanschluß (20), Zweigkanäle (21, 22) und wenig­ stens ein Ablaufanschluß (23) vorgesehen sind.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturplatte (1) in eine Wanne (16) einge­ setzt ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Wanne (16) mit Sauerstoffzuleitungen und Sau­ erstofföffnungen (18) in ihrer Wandung versehen ist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume (2') über Druckanschlüsse (27) unter wechselnden Druck setzbar sind.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu der elastischen Membrane (9) auf der Unterseite der Zellkulturplatte (1) die Bohrungen (2) auf der Oberseite der Zellkulturplatte (1) mit einer elastischen Folie (26) abgedeckt ist, und daß Zwischenräume (28, 29) über und unterhalb der Zellkulturplatte (1) unter Druck setzbar sind.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckplatte (10) und/oder die Wanne (26) bzw. der Behälter (25) als Zwischenbehälter ausgebildet sind, und daß über die Zwischenbehälter ein oder mehrere Einheiten (30) zur Bildung eines Bioreak­ tors mit gemeinsamen oder mit separaten Anschlüs­ sen ansetzbar sind.

23. Verwendung einer Zellkulturplatte (1) nach einem der Ansprüche 6 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturplatte (1) in eine Wanne (16) einge­ bracht ist und mit einer Deckplatte (10) und einem Wannenboden zur automatisierten Perfusion versehen ist.

24. Verwendung einer Zellkulturplatte (1), die eine Vielzahl von auf der Oberseite der Zellkulturplat­ te (1) offenen Bohrungen (2) aufweist, die auf der Unterseite durch Böden (6) abgeschlossen sind, zum automatisierten Züchten und/oder Behandeln von Zellen (8) für diagnostische Zwecke, die in die Bohrungen (2) eingebracht werden.

25. Verwendung einer Zellkulturplatte nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil der Böden (6) der Zellkultur­ platte (1) gaspermeabel oder mikroporös ausgebil­ det ist.