CZ310098A3

CZ310098A3 - Způsob výroby nebuněčné náhrady červených krvinek a zařízení k provádění tohoto způsobu

Info

Publication number: CZ310098A3
Application number: CZ983100A
Authority: CZ
Inventors: Richard E. Dewoskin; Marc D. Doubleday
Original assignee: Northfield Laboratories, Inc.
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 1999-09-15
Also published as: BG63919B1; BR9708388A; US20080108555A1; PT928294E; CN1129608C; CN1219939A; US7521417B2; EP0928294A1; UA64710C2; NZ538045A; AP1028A; IL126376A0; US20020025343A1; AU2425397A; RU2203087C2; EP0928294B1; BG102810A; PL329108A1; CZ299357B6; NO984473L

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby náhrady červených krvinek, t.j. hemoglobinových produktů, a zařízení na tuto výrobu. Vynález se dále týká nebuněčné náhrady čeivených krvinek, která obsahuje roztok zesíťovaného, polymerovaného pyridoxylovaného hemoglobinu bez obsahu tetrameru a stromálních kontaminantů.

Dosavadní stav techniky

Řadu let krevní banky poskytují pro použití v průběhu chirurgických zákroků (v případech úrazů, apod.) plnou krev. Použití plné krve od lidských dárců není však v řadě případů vhodné, a to zejména díky problémům, souvisejícím s vyhledáváním vhodného dárce, se stabilitou a uchovatelností a v neposlední řadě i s eventuální toxicitou takovéto krve, způsobenou přítomností virů a jiných kontaminantů. Tyto problémy jsou zvláště patrné v mimořádných situacích, např. při použití plné krve ve vojenském lékařství. Díky tomu se věnovala značná pozornost vývoji náhrad plné krve od lidských dárců. Vznikla řada modifikací krve lidských nebo savčích dárců. Hemoglobin bez obsahu stromálních kontaminantů je v oboru znám svou vlastností přenosu a reverzibilního vázání kyslíku nebo jiného ligandu. Neboť toxikologické problémy zabránily jeho použití, hledaly se další způsoby, jak hemoglobin bez obsahu stromálních kontaminantů modifikovat tak, aby vznikl netoxický, farmaceuticky použitelný produkt.

»» • · ·

’..ϊ *··♦

Uvedené modifikace zahrnují (1) získání hemoglobinu bez obsahu nebo s minimálním obsahem stromatu a stromálních kontaminantů; (2) pyridoxylaci; (3) polymeraci nebo zesíťování; (4) odstranění tetrameru; a (5) modifikaci oxidem uhelnatým nebo jinými ligandy.

Hemoglobinové roztoky, připravené uvedenými postupy, sice vykazují schopnost přenášet dostatečné množství kyslíku, a tím zabraňovat ireverzibilním poškozením tkání, objevily se u nich nicméně nežádoucí vedlejší účinky a vlastnosti. Jedním z nej závažnějších vedlejších účinků je přitom např. zhoršení činnosti ledvin. Vznik tohoto problému se přičítal přítomnosti nežádoucích kontaminantů, např. bakteriálního endotoxinu nebo fragmentů membrán červených krvinek (stromatu). Přestože uvedené kontaminanty skutečně způsobují poruchy renálních funkcí, i použití hemoglobinových roztoků bez obsahu nebo s minimálním obsahem výše uvedených kontaminantů má za následek závažnou renální dysfunkci. Příčina je připisována fyziologicky nepřijatelnému množství nezpolymerovaného hemoglobinového tetrameru. Dalšími vedlejšími účinky pri infúzi tetramerového hemoglobinu jsou vazokonstrikce, hemoglobinurie, zpomalení srdečního rytmu, zvýšení středního arteriálního krevního tlaku a extravazace infuzátu zejména do pobřišniční dutiny.

Dodnes není známa jediná hemoglobinová krevní náhrada, u které by nedocházelo ke komplikacím vzniklým v souvislosti s její toxicitou. Doposud popsané produkty měly také po podání lidskému pacientovi nepřijatelně nízký poločas, což má za následek nutnost neustálé výměny krve, a to ve velmi krátkých intervalech. Potřeba hemoglobinových produktů, které jsou pro pacienta netoxické a které mají po podání vyšší hodnotu poločasu, tedy dále trvá. Samozřejmé přitom je, že tyto produkty musí být schopny reverzibilně vázat a přenášet kyslík ke tkáním, a to obdobným způsobem, jakým se tomu děje u plné krve.

4· ·

• * • <· • · ·

·· ·* • · * 1

I · · * ♦ ·· ♦♦· • · ·· ··

Podstata vynálezu

Vynález se týká hemoglobinových náhrad, které jsou pro člověka netoxické a které vykazují po podání člověku poločas minimálně 15 hodin. Hemoglobinové produkty podle vynálezu jsou pyridoxylátové a polymerované a neobsahují stromální, virové ani jiné toxické kontaminanty. Tyto produkty navíc obsahují pouze minimální množství leukocytů (bílých krvinek) a krevních destiček.

Vynález rovněž zahrnuje způsoby výroby hemoglobinových náhrad podle vynálezu. Tyto postupy zahrnují odstranění leukocytů a krevních destiček z krve; promytí a lýzu červených krvinek; odstranění stromálních kontaminantů a stromatu filtrací a tepelným zpracováním; přípravu deoxyhemoglobinu; pyridoxylaci a polymeraci; další přečištění a zahuštění; a odkysličení. Vzniklý hemoglobinový produkt může být formulován k získání hemoglobinového produktu s takovými hladinami různých elektrolytů, které leží v normálních fyziologických rozmezích.

Vynález rovněž zahrnuje vodný přípravek pyridoxyl ováného polymerovaného hemoglobinu, přičemž hemoglobin je glutaraldehydem polymerovaný hemoglobin obsahující tetramerové podjednotky, jejichž distribuce molekulárních hmotností je znázorněna na obr.3. Tento přípravek může být použit pro výrobu nebuněčné náhrady červených krvinek. V tomto případě se přípravek nejprve přečistí, čímž dochází k odstranění tetrameru, načež se sloučí s příslušným množstvím elektrolytů, čímž vzniká fyziologicky přijatelná nebuněčná náhrada červených krvinek, která je následně použitelná v případech, kdy zdravotní stav lidského pacienta vyžaduje infúzi látky - přenašeče kyslíku.

• ·

Stručný popis obrazových příloh

Obr. 1 je schématickým diagramem znázorňujícím tu fázi výroby, která vede k získání hemoglobinového roztoku prostého kyslíku pro následnou pyridoxylaci a polymeraci.

Obr. 2 je schématickým diagramem znázorňujícím tu fázi výroby, která zahrnuje pyridoxylaci a polymeraci a která vede k přečištěnému pyridoxylovanému polymerovanému hemoglobinovému produktu prostému kyslíku, a tu fázi výroby, která vede ke vzniku hemoglobinového produktu s fyziologicky odpovídajícími hladinami elektrolytů.

Obr. 3 znázorňuje stopovou analýzu polymerovaného materiálu za použití vysokotlaké kapalinové chromatografie, a to po reakci s glycinem a před přečištěním. Polymerovaný produkt je charakterizován píky při retenčních dobách 15,57, 16,08, 17,00 a 18,19. Tetramerový materiál je charakterizován píky v retenčních dobách 19,88 a 20,51. Polymerní složka tvoří 76,2 % uvedeného materiálu.

Obr. 4 znázorňuje stopovou analýzu hemoglobinového produktu podle vynálezu za použití vysokotlaké kapalinové chromatografie. Polymerovaný hemoglobin je charakterizován píky v retenčních dobách 15,7, 16,33, 17,32 a 18,56. Tetramer je charakterizován pikem v retenční době 21,18.

Obr. 5 je schématickým diagramem znázorňujícím čistící fázi sloupcovou chromatografii, která je součástí výrobního postupu podle vynálezu.

Obr. 6 je schématickým diagramem znázorňujícím čistící fázi mebránovou filtrací, která je součástí výrobního postupu podle vynálezu.

• · • · ♦

Vynález se týká nebuněčné náhrady červených krvinek, která obsahuje zesíťovaný, polymerovaný pyridoxylovaný hemoglobin bez obsahu nebo s minimálním obsahem tetramerových podjednotek, stromatu a stromálních a jiných kontaminantů.

Uváděný výraz „zesíťovaný“ znamená chemické vbudování molekulových můstků na nebo do molekuly, případně mezi molekuly, což má za následek změnu tvaru, velikosti a funkčních nebo fyzikálních vlastností dané molekuly. Zesíťované molekuly mohou být polymerované nebo nepolymerované, tj. zesíťované molekuly mohou být i tetramerní.

Uváděný výraz „tetramer“ se týká molekul hemoglobinu, jejichž molekulová hmotnost je zhruba 64 Kd; výraz se vztahuje jak k nativním, tak i intramolekulárně zesíťovaným molekulám hemoglobinu.

Uváděný výraz „vpodstatě prostý tetrameru“ označuje takovou mim čistoty s ohledem na obsah tetrameru, při kterém již nedochází ph podání uvedeného množství tetrameru u savce, jemuž je podán, k určitým biologickým odezvám. Hlavním kritériem je přitom nepřítomnost zhoršení činnosti ledvin po podání farmaceuticky účinného množství dané látky, k čemuž dochází při míře čistoty 99 % a více (podíl tetrameru je tedy nižší než 1 %). Produkt vyrobený postupem podle vynálezu neobsahuje výhodně více než 0,8 % tetrameru vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu (total hemoglobin (THb)). Jinými slovy, produkt podle vynálezu vpodstatě prostý tetrameru neobsahuje větší než fyziologicky přijatelná množství nezpolymerovaného hemoglobinového tetrameru. Výhodně obsahují produkty podle vynálezu méně než 0,5 %; nej výhodněji obsahují produkty podle vynálezu 0,3 až 0,4 % tetrameru. Bylo prokázáno, že takováto množství tetrameru jsou fyziologicky přijatelná.

Uvedené výrazy „ultrapřečištěný produkt“ nebo „přečištěný produkt“ mají stejný význam jako výraz „vpodstatě prostý tetrameru“.

Uvedený výraz „% celkového hemoglobinu“ odpovídá množství gramů hemoglobinu na 100 ml roztoku.

• 0 • · ·· • 0 0 • · 0 0 0

Uvedený výraz „polymerační roztok“ znamená roztok, který obsahuje „zesíťovací“ nebo polymerační činidlo, např. glutaraldehyd, imidostery, diaspirin, apod., v biochemicky přijateném nosiči.

Uvedený výraz „polymerovaný“ znamená vřazení molekulových můstků mezi molekuly nebo tetramemí podjednotky, přičemž velikost a hmotnost výsledného polymeru je větší než u nativního nebo tetramerního hemoglobinu. Polymerovaný hemoglobin není tetramerní hemoglobin.

Uvedený výraz „hemoglobinový roztok“ znamená roztok tetramerního hemoglobinu nebo polymerovaných molekul hemoglobinu, přičemž tyto molekuly nejsou obsazeny v buňkách červených krvinek. Takový roztok nemusí neobsahovat stroma červených kivinek nebo stromální kontaminanty. Výhodně však roztoky polymerovaného hemoglobinu neobsahují stroma ani stromální kontaminanty.

Výraz „semipermeabilní membrána“ označuje takovou membránu, která je propustná jen pro určité druhy molekul a která tak funguje jako selektivní filtr, který zabraňuje průchodu molekul určitých molekulových hmotností.

Produkt vyrobený postupem podle vynálezu - roztok polymerovaného, pyridoxylovaného hemoglobinu prostého tetramerního (nativního nebo zesíťovaného) hemoglobinu a stromálních a jiných kontaminantii, vyrobený z tepelně zpracovaného, virově inaktivovaného tetramerního hemoglobinu - je fyziologicky přijatelný a terapeuticky a klinicky použitelný. Produkt má schopnost reverzibilně vázat kyslík, což je pro transport kyslíku nezbytné. Zejména vykazuje produkt podle vynálezu solidní schopnosti při vytváření a zanikání vazby produkt - kyslík, což dokazuje i disociační křivka kyslík hemoglobin (P ₅₀), která je obdobná plné krvi. Produkt podle vynálezu váže kyslík s vysokou afinitou v plicních kapilárách a poté ho v odpovídající míře uvolňuje do tkání celého těla. Použití produktu podle vynálezu rovněž nevyžaduje stanovení kompatibility vůči příjemci.

I · · ) · · • · · · « <· · • ··· • · 1

Produkt podle vynálezu vykazuje dále po podání člověku poločas nejméně 15 hodin, výhodněji asi 24 hodin. Hemoglobinový produkt podle vynálezu může být podáván pacientovi formou infúze, a to v objemu asi 3,0 litry, a dokonce až asi 5,0 litrů. Jinými slovy, hemoglobinový produkt podle vynálezu může nahradit vpodstatě celou pacientovu krev, aniž by způsobil vazokonstrikce, otravu ledvin, hemoglobinurii nebo jiné potíže, spojené s intravenózním podáním syntetických nebo semisyntetických přenašečů kyslíku a krevních náhrad. Vynález tedy zahrnuje i způsob provedení transfúze netoxického polymerovaného pyridoxylátového hemoglobinového produktu bez obsahu stromatu a tetrameru, a to u pacienta, výhodně člověka, v množství až asi 5,0 litrů. Tento způsob zahrnuje připojení pacienta k infúznímu nebo jinému zařízení, které umožňuje provést infúzi nebo transfúzi.

Způsob výroby podle vynálezu je jedinečný v tom, že vede k produktu, v němž obsah tetrameru nepřesahuje asi 1 %, výhodněji asi 0,8 %, hmotnosti vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu v roztoku. Způsob podle vynálezu je také výhodný z toho hlediska, že umožňuje získat konečný produkt, který je vpodstatě prostý mikrobiálních a virových antigenů a patogenů. Obsah takovýchto mikrobiálních a virových antigenů a patogenů je zredukován na nedetekovatelné množtví, t.j. produkt je podle analýzy uvedené v kapitole 71 „United Stetes Pharmacopoeia“, r.XXIII, sterilní. Příkladem uvedených antigenů a patogenů jsou bakteriální, rikeciální, fungální, protozonní, virové a jiné organismy. Nej důležitější je však skutečnost, že způsob výroby podle vynálezu vede k získání biologického produktu bez obsahu virů, které způsobují hepatitidu a syndrom získaného selhání imunity (AIDS).

Co se týče jeho fyziologických vlastností, nezpůsobuje biologický produkt podle vynálezu při infúzi v množství až 5,0 litrů vazokonstrikce, renální toxicitu, hemoglobinurii, ani jiné komplikace, spojené s intravenózním podáním známých hemoglobinových roztoků, které obsahují fyziologicky nepřijatelné množství tetramemího hemoglobinu. Intravenózní podání produktu podle vynálezu nijak • » a · ·· » » > · « · · · · » · · · · · ·· · » ·· «· · · · · · · » · · · · · ·· ·* ♦· »· nesnižuje produkci moči a rychlost glomerulámí filtrace, nemá za následek extravazaci do pobřišniční dutiny a změnu zabarvení produkované moči.

Způsob výroby podle vynálezu tedy zajišťuje nebuněčnou náhradu červených krvinek, která je výhodná při ošetření úrezu, při léčení infarktu myokardu, mrtvice, akutní anémie a poruch zásobování kyslíkem, např. hypoxémii, hypoxii nebo hypoxii v posledním stádiu následkem selhání funkce plic okysličovat krev. Produkt podle vynálezu je rovněž výhodný při léčení stavů, které vyžadují přísun resuscitačních tekutin (např. trauma, specifický hemorrhagický šok), látek zvětšujících intravaskulámí objem nebo při výměnné transfúzi. Kromě použití při klinické praxi může být produkt podle vynálezu rovněž výhodně použit pro přechovávání orgánů určených pro transplantace.

Způsob výroby podle vynálezu zahrnuje následující stupně:

1. Odsátí červených krvinek a filtrace

2. Promytí/lýza buněk

3. Tepelné zpracování

4. Zahuštění ultrafiltrací

5. Odplynění

6. Chemická modifikace Precisteni

8. UP-poly koncentrace

9. Deoxidace

10. Formulování * A • A · · • A « • A 4 ► A A

Výhodnou výchozí látkou pro výrobu podle vynálezu je plná lidská krev s prošlou dobou exspirace nebo koncentrované červené krvinky. Může být rovněž použita krev s neprošlou dobou exspirace. Výhodně se použije taková plná krev, jejíž doba exspirace, vyznačená na sáčku s dárcovskou krví, není prošlá o více než 2 týdny. Použití krve s dobou exspirace prošlou o více než 2 týdny by totiž znamenalo vznik jistých obtíží při extrahování hemoglobinu a odstraňování buněčných zbytků, např. stromálních proteinů a kontaminantů.

Všechny zde popsané postupy je možno aplikovat i na krev jiných savců, a to pouze s minimálními modifikacemi, které vyplynou pro odborníka v oboru. Většina postupů se přitom provádí při teplotách od asi 2°C do asi 8°C, výhodně při teplotách okolo 4°C.

V pmběhu odsávání červených krvinek a filtrace jsou červené krvinky asepticky extrahovány ze sáčku s dárcovskou krví tak, že krev nepřichází do styku se vzduchem a prochází sérií filtrů, čímž vzniká suspenze červených krvinek se sníženým obsahem leukocytů a krevních destiček. Vzniklá suspenze je následně promyta a dochází k lýze buněk.

Suspenze se promyje 1% roztokem chloridu sodného pod atmosférou oxidu uhelnatého, čímž se odstraní zbytek plazmových proteinů. Promyté červené krvinky se poté zpracují vodou pro injekci, čímž dochází k lýze buněk. Vzniklá směs se následně přečistí filtrací s příčným tokem. Přečištěný produkt se poté zpracovává tepelně, čímž se vysráží další stromální látky, které se následně odstraní filtrací. Produktem tohoto stupně je hemoglobinový roztok bez obsahu stromatu s obsahem celkového hemoglobinu asi 3% (hmotn./obj.).

Tepelně zpracovaný hemoglobinový roztok bez stromálních kontaminantů s obsahem karboxyhemoglobinu se zahustí a odplyní za vzniku hemoglobinového roztoku s obsahem deoxyhemoglobinu. Odplynění zahrnuje nejprve sycení karboxyhemoglobinového roztoku kyslíkem po dobu asi 16 hodin. Vzniká roztok okysličeného hemoglobinu s obsahem karboxyhemoglobinu asi 7 % (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Kyslík se následně odstraní dusíkem,

9 · · · 9 · · · · ·

9 9 9 9 9 9 · · · · • 9 9 9999 9 99 9

9 9 9 9 9 · ·

99 9 99 9 · 9 9 9 · · · · argonem nebo heliem, čímž vzniká roztok s obsahem volného hemoglobinu, tj. hemoglobinu nesloučeného, s obsahem oxyhemolglobinu asi 7 % (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Vzniklý odplyněný roztok se přefiltruje a převede do nádoby, ve které je poté chemicky modifikován.

Po odplynění je hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů pyridoxylován za použití pyridoxal-5'-fosfátu (P5P) v molárním poměru pyridoxal-5'-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1. Hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů může být případně pyridoxylován za použití 2-Nor-2-formylpyridoxal-5'-fosfátu. K pyridoxylační směsi se jako redukční činidlo přidá kyanborhydrid sodný nebo výhodně borhydrid sodný. Nadbytek činidla a solí se odstraní dialýzou za použití vody bez obsahu pyrogenu nebo výhodně diafiltrací vodou pro injekci. Pyridoxylátovaný hemoglobin se poté polymeruje roztokem glutaraldehydu.

Pyridoxylovaný hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů se polymeruje vodným roztokem glutaraldehydu. Délka polymerace a množství přidaného glutaraldehydu přitom závisí na objemu hemoglobinového roztoku, požadovaném výtěžku polymerů a požadované di stři biči molekulových hmotností. Obecně lze říci, že delší doba polymerace zvyšuje výtěžek a molekulovou hmotnost polymerů. Výtěžku zhruba 75 % (hmotnost polymeru vzhledem k hmotnosti celkového hemoglobinu) je dosaženo po asi 16 až 18 hodinách polymerace. Výhodné je polymerací ukončit ve chvíli, kdy roztok obsahuje asi 75 % hmotnosti polymerů, přičemž tento okamžik je indikován pomocí „size-exclusion“ vysokotlaké kapalinové chromatografie. Konec polymerace se případně určí jako chvíle, kdy roztok obsahuje asi 65 % polymerů, t.j. po asi 2,5 hodinách.

Polymerační reakce se ukončí přídavkem vodného roztoku glycinu. Pufr musí být přidán tak rychle, jak jen to je možné. Zesíťovací proces se následně stabilizuje co nej rychlejším přídavkem vodného roztoku borhydridu sodného. Polymerovaný roztok se poté zahustí a diafiltruje pod atmosférou kyslíku za to · •to to ·· ·· ·· • to · · « · to · • · · · ···· · ·· · • · ·♦ «« ·· ······ • · ···· · · ···· ··· ·· ·· ·· ·· účelem okysličení roztoku. K roztoku se následně přidává voda, a to do chvíle, kdy roztok obsahuje asi 4 % hmotnosti hemoglobinu.

Polymeraci podle vynálezu se získají polymery, jejichž hmotnosti leží v úzkém rozmezí, jak je patrno z níže uvedeného obr.3 a z příkladu 1.

Roztok polymerovaného pyridoxylovaného hemoglobinu se poté přečistí sloupccovou chromatografii nebo filtrací (např. membránovou filtrací) nebo postupně oběma procesy, a to za účelem odstranění zbytkového nezpolymerovaného (tetramerického) hemogobinu z roztoku. Přečištěný roztok polymerovaného hemoglobinu se poté zahustí na asi 6 %, a to za použití ultrafiltračního aparátu.

Zahuštěný roztok se poté zbaví kyslíku promýváním dusíkem. Deoxidace se provádí při teplotě 10 až 12°C, a to do chvíle, kdy obsah oxyhemoglobinu klesne pod 16 % vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu.

Vzniklý deoxidovaný přečištěný roztok polymerovaného hemoglobinu se poté zahustí ultrafiltrací pod atmosférou dusíku v chlazené nádobě. Hodnota pH se upraví na asi 8,8 až 9,0, obsah elektrolytů se upraví podle potřeby tak, aby odpovídal hodnotám normální plasmy. Případně mohou být přidány běžné antioxianty, např. glutathion, askorbát nebo glukosa. Poté, co se roztok zahustí na příslušnou hodnotu, výhodně asi 10 % hmotnosti polymerizovaného pyridoxylovaného přečištěného hemoglobinu bez obsahu tetramerů a stromálních kontaminantů, je sterilizován filtrací a sterilně převeden převáděcím aparátem do vhodných farmaceuticky přijatelných obalů.

«· * ·· 9 9 99 99

9 99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 999 9 9 9 9 · · · · · 9 9

9999 999 99 99 99 99

Údaje o vzniklém hemoglobinovém roztoku jsou uvedeny níže:

Polymerovaný hemoglobin

Celk. obsah hemoglobinu (g/dl)¹	9,5-12,0
Methemoglobin (% z celk. Hb)¹	méně než 8,0
Karboxyhemoglobin (% z celk. Hb)¹	méně než 5,0
P50 (kPa)¹	3,07-4,27
Osmoíalita (mmol/kg)	280-360
Sodík (mmol/1)³	135-155
Hořčík (mmol/1)³	3,5-4,5
Chloridy (mmol/1)³	85-110
Volné železo (ppm)⁴	méně než 2
Distr.molekul.hmotn. - pík 128 Kd (%)⁵	10-24
Distr.molekul, hmotn. - pík 192 Kd (%)⁵	18-30
Distr.molekul.hmotn. - pík 256 Kd (%)^s	45-70
Tetramer (64K) (%)⁵	méně než 0,8
Endotoxin (EU/ml)⁶	méně než 0,03
Fosfolipidy (ng/Hb)⁷	méně než 50
Glykolipidy (ng/Hb)⁷	méně než 2

Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena spektrofotometricky Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena osmometricky Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena iontově selektivní elektrodou

Hladina v polymerovaném hemoglobinu stanovena atomovou absorpcí Stanovení vysokotlakou kapalinovou chromatografií „size exclusion“ > '44 44 ·4 44

4.44· 4 44 4 44 4

4 4 4 444 4 4 4 4

4 44 44 44 444444

4 4444 4 4

4444 444 44 44 44 44

Stanovení pomocí LAL za použití testovací soupravy komerčně dostupné u Associates of Cápe Cod; části soupravy mají katalogová čísla 100-5, 800-1 a3100-5.

Stanovení vysokotlakou kapalinovou chromatografií

V následující části jsou uvedeny poklady provedení podle vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, je teplota uváděna ve stupních Celsia. Pokud není uvedeno jinak, jsou procentuální hodnoty, např. celk. hemoglobin (THb), vyjádřeny údajem hmotnost/objem (w/v). Rovněž je nutno poznamenat, že je možno provádět uvedené reakce při teplotách vyšších či nižších, než je uvedeno, s výhradou, že je to obecně méně výhodné.

Pokud není uvedeno jinak, jsou všechny nádoby a nádrže použité pro způsob výroby podle vynálezu vyrobeny z nerez oceli 316-L, přičemž povrch těchto nádob a nádrží je dokonale vyleštěn, což usnadňuje a zrychluje jejich čištění. Všechny součásti spojovacího vedení a trubky jsou vyrobeny rovněž z uvedené nerez oceli nebo z teflonu či silikonu. Použité filtry a membrány jsou komerčně dostupné u společností Milliporc lne., Pall-Filtron nebo Cuno lne.

Poločas vzniklého produktu podle vynálezu je určen in vivo, a to u savců, např. člověka. Obecně je krevní vzorek u savce odebrán po uplynutí určité doby od infúze, kterou mu byl podán produkt podle vynálezu. Množství produktu se poté určí centrifugací krevního vzorku a vyjádří se jako množství plazmy, přičemž se spektrofotometricky stanoví hladina hemoglobinu v plazmě a poté se vztáhne množství produktu, které zůstává v daném organismu, k poločasu uvedeného produktu.

« ' · «« ·* ·· ·· • · · · 9 · • ··· · 9 9 9

9 9 9 99 999

9 9 9 9 9 ····

Vysokotlaká kapalinová „size-exclusion“ chromatografie se provádí následujícím způsobem:

Vzorek se zředí 0,2M pufračním roztokem fosforečnanu draselného (pH = 6,9) na hodnotu 0,2 g/dl, přefiltruje se přes 0,2pm filtr a injekčně se převede do chromatografického systému, složeného z následujících součástí (uvedeny v pořadí odpovídajícím směru průtoku systémem):

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9. 10 11

Čerpadlo Pharmacia, model 2248

- mobilní fáze: 0,2M fosforečnan draselný, pH 6,9

- průtok: 1,0 ml/min

Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 45 cm, 0,010 in.I.D. Vstřikovací tryska Rheodyne, model 7725i, s 200 pl vzorkovou smyčkou PEEK

Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 18 cm, 0,010 in.I.D.

Filtr 0,5 pm, model A431

Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 9 cm, 0,010 in.I.D. Kolona Guard, Phenomenex Biosep SEC S-3000, 75 x 7,8 mm Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 24 cm, 0,010 in.I.D. Analytická kolona, Phenomenex Biosep SEC S-3000, 600 x 7,8 mm Trubka PEEK nebo titanová trubka, délka 23 cm, 0,010 in.I.D. UV-detektor Pharmacia Uvicord SD délka vlny: 280 nm průtoková komůrka: obj. 8 pL, délka dráhy 2,5 mm rozsah: 2 AUFS časová konstanta: 10 sekund · 9

9 9

999 • ·

9··

Absorpční pík pri 280 nm je zaznamenána pomocí integrátoru LKB 221, který integruje jednotlivé plochy píku a vypočítá celkovou plochu hemoglobinu pro každý druh polymeru.

Níže uvedené příklady pomohou více pochopit podstatu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

Příklad 1

Na obr. 1 jsou znázorněny krevní konzervy 20, obsahující dárcovskou krev (plnou krev nebo koncentrát červených krvinek) s prošlou dobou exspirace. Jsou umístěny ve vhodném aseptickém odsávacím zařízení 22. Příkladem takovéhoto vhodného odsávacího zařízení je systém skládající se ze dvou odsávacích jednotek. Poté, co,je sáček s dárcovskou krví umístěn do odsávací jednotky, propíchne sáček jehla, jejíž pomocí je do sáčku převedeno asi 150 ml 1% (hmotn./obj.) vodného roztoku chloridu sodného. Z uvedeného sáčku se za sníženého tlaku nebo vakuově odsaje dárcovská krev s prošlou dobou exspirace. Odsátá krev poté prochází filtrem 24 (hloubka 100 μιη) a následně postupně ·· • ···

0 4

0 4 dvěma filtry 26 (hloubka 5 μηι). Průchodem 5 μηι filtry jsou z krve odstraněny leukocyty. Obvykle se odsaje asi 170 jednotek krve s prošlou dobou exspirace, která se uvedeným způsobem přefiltruje a následně převede do nádrže 1, jak je znázorněno na obr. 1. Filtry se poté propláchnou asi 75 litry 1% (hmotn./obj.) vodného roztoku chloridu sodného.

Předtím, než se převede krev do nádrže 1, naplní se tato nádrž asi 70 litry 1% vodného roztoku chloridu sodného. Poté, co se tedy celých 170 jednotek krve s prošlou dobou exspirace odsaje, přefiltruje a převede, a poté, co se propláchnou všechny uvedené filtry, obsahuje nádrž asi 250 litrů 4% hemoglobinového roztoku. V průběhu odsávací a filtrační fáze je v nádrži 1 udržován snížený tlak, t.j. vakuum při tlaku 2,66 až 3,72 kPa. Poté, co je do nádrže 1 převedena veškerá krev s prošlou dobou exspirace, je vakuum v nádrži 1 nahrazeno oxidem uhelnatým.

Nádrž 1 se připojí k 0,65 μιη tangenciálnímu průtokovému filtru 28 (obr.l). Původní objem 250 litrů 4% hemoglobinového roztoku se zahustí na přibližně 125 litrů 8% hemoglobinového roztoku mikrofiltrací přes uvedený tangenciální průtokový filtr. pH hemoglobinového roztoku má v tomto okamžiku hodnotu asi 6 až 6,5. Po výše uvedené zahušťovací fázi se roztok promyje 1% (hmotn./obj.) roztokem chloridu sodného. 125 litrů hemoglobinového roztoku se obvykle promyje 8 obj.díly 1% roztoku chloridu sodného (asi 1 000 litrů). Po promytí se roztok zahustí na objem asi 70 litrů, čímž vzniká asi 14% hemoglobinový roztok Objem roztoku se doplní na asi 180 litrů přídavkem vody pro injekci (WFI). Přídavkem vody pro injekci nabývají buňky na objemu a praskají, přičemž se uvolňuje hemoglobin do roztoku. Koncentrace vzniklého hemoglobinového roztoku je asi 5% celkového hemoglobinu.

Ještě v nádrži 1 se vzniklý roztok přečistí. Nej pive se zahustí na objem asi 50 litrů a filtrát se převede do nádrže 2. Pri průchodu filtrem se na filtru zachytí stromální kontaminanty a části buněčných stěn. Zbývajících 50 litrů roztoku v

99

I 9 9 9

999 999

9

9 9 9

9

99 • 9 « · 9 9 9 9 « » 9 9 1

99 nádrži 1 se promyje (diafiltruje) asi 2,5 objemovými díly vody pro injekci (WFI) a poté přidá do nádrže 1. Materiál, který zbyl v nádrži 1, se poté zahustí na objem asi 20 litrů a filtrát se přidá do nádrže 2. Celkem je tedy v nádrži 2 asi 280 litrů 3,3% hemoglobinového roztoku.

Vzniklý hemoglobinový roztok bez obsahu stromálních kontaminantů se poté tepelně zpracovává v nádrži 2 při teplotě asi 60 až 62°C, a to po dobu asi 10 hodin. Roztok se přitom průběžně protřepává. Při zahřívání se v roztoku při teplotě 55°C tvoří sraženina.

Vzniklý 3,3% hemoglobinový tepelně zpracovaný roztok bez obsahu stromálních kontaminantů se poté přefiltruje přes 0,2μιη filtr 30 a 0,1 pm filtr 32 a převede do nádrže 3. Přefiltrovaný hemoglobinový roztok se poté zahustí tak, aby byl asi 18%, a poté se promyje a diafiltruje 4 objemovými díly vody pro injekci (180 litry). Zahuštění a diafiltrace jsou dovršeny použitím ultrafiltru 34 (molekulová hmotnost 10 kd /kilodalton/). Ve výstupní nálevce 35, spojené s ultrafiltrem 34, se shromažďuje filtrát. V tomto stupni obsahuje 45 litrů 18% hemoglobinového roztoku méně než 50 ng fosfolipidů na gram hemoglobinu, méně než 2 ng glykolipidů na gram hemoglobinu, méně než 1% methemoglobinu a méně než 0,03 endotoxinových jednotek na mililitr při pH v rozmezí od 6 do 6,5. Hemoglobin v roztoku je karboxyhemoglobin.

Vzniklý karboxyhemoglobinový roztok se poté převede do nádrže 4, kde je nejprve karboxyhemoglobin oxidován a poté deoxidován. Nádrž 4 je vybavena rozstřikovaěem, napojeným na přívody plynného kyslíku a dusíku, dávkovacím zařízením, umístěným v horní části nádrže, a přetokovým sběračem pěny, napojeným na nádržku na pěnu „Foam Can“ 1 tak, že pěna vzniklá v nádrži 4 se převádí do nádržky na pěnu „Foam Can“ 36, ve které kondenzuje na kapalinu a odkud je převedena zpět do nádrže 4. Nádrž 4 dále obsahuje náplň kroužků Pall, která představuje asi jednu třetinu celkového objemu nádrže. Součástí nádržky na pěnu 36 je odplyňovací ventil. Roztok v nádrži 4 je 13% hemoglobinový' roztok.

• to • toto »* ·♦ *« ·· • » · » · · · « to*#* < to· · • ·· · · «toto · to · • toto· · · ·· »· ·« ··

Během prvního oxidačního stupně je kyslík do roztoku zaváděn rychlostí, která zajistí rovnoměrnou disperzi plynu v nádobě. Do této nádoby o objemu 200 litrů je plyn zaváděn rychlostí 25 litrů za minutu. Oxidace karboxyhemoglobinu se provádí po dobu 16 hodin, takže výsledný roztok obsahuje méně než 5 % karboxyhemoglobinu (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Oxidace se provádí při teplotě asi 10°C. Pěna, vzniklá v nádrži 4, se jímá v nádržce 36 a po usazení se vzniklý roztok převede zpět do nádrže 4.

Po oxidaci se do roztoku obdobným způsobem zavádí plynný dusík, a to po dobu asi 6 hodin, dokud v roztoku není méně než 10 % oxyhemoglobinu (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Zavádění dusíku se provádí při teplotě asi 10°C a pH v rozmezí od asi 6 do 6,5. Karboxyhemoglobin může být případně převeden na deoxyhemoglobin použitím mambránového měniče. Nutno poznamenat, že v průběhu zpěňovacího stupně vpodstatě nedochází oproti očekávání k denaturaci hemoglobinu. Vzniklý roztok deoxyhemoglobinu je nyní připraven na chemickou modifikaci.

Jak je znázorněno na obr.2, je deoxyhemoglobinový roztok převeden za účelem chemické modifikace do nádrže 5. Do této nádrže, obsahující deoxyhemoglobinový roztok o teplotě asi 4°C, je poté přidán vodný roztok pyridoxyl-5-fosfátu (P5P) (93,75 g/1) v molámím poměru P5P k hemoglobinu od 1:1 do 3:1. Výhodně je molární poměr P5P k hemoglobinu asi 2:1. Pyridoxylace se provádí při teplotě asi 4°C. Roztok P5P se obvykle přidává po dobu 1 minuty a míchá se po dobu 15 minut, načež se k hemoglobinovému roztoku přidá roztok borhydridu sodného/hydroxidu sodného při molámím poměru borhydrid sodný k hemoglobinu asi 20:1. Vhodný vodný roztok borhydridu sodného/hydroxidu sodného obsahuje 0,8 g hydroxidu sodného na 2 litry a 90,8 borhydridu sodného na 2 litry. Borhydridový roztok se přidá nej rychlejším možným způsobem v průběhu 1 minuty, načež se směs po dobu 1 hodiny míchá. Vzniklých 50 litrů roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu se poté diafiltruje za použití 10 kd ultrafiltru 38, čímž se 4 objemovými díly vody pro injekci odstraní přebytečné aa · re ·ο aa aa * a aa a · a e e · · « · · · ··· · · · ·

A < « « A A 9« ··· A·· • A · · A A A A

AAAA AAA AA AA AA AA reaktanty. Ve výpustní nálevce 40, spojené s ultrafiltrem 38, se jímá filtrát z filtru 38.

Po diafiltraci 4 objemovými díly, tj. 200 litry, vody pro injekci, je hemoglobin polymerován. Do nádrže 5, obsahující pyridoxylovaný hemoglobin, se přidá voda pro injekci v množství dostačujícím na vznik 4,5% hemoglobinového roztoku (asi 175 litrů hemoglobinového roztoku). K roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu se poté přidá roztok glutaraldehydu, a to při molárním poměru glutaraldehydu k hemoglobinu asi 24:1. Glutaraldehydový roztok se obvykle přidává dávkovacím čerpadlem po dobu asi 2,5 hodiny. Polymerační reakce se přitom nechá probíhat po dobu asi 18 hodin. Požadovaná distribuce molekulových hmotností je přitom asi 75 % polymeru a asi 25 % tetrameru. Vzniklé polymery mají molekulové hmotnosti nižší než 600 000 s převažující frakcí molekulárních hmotností v rozmezí od 100 000 do 350 000.

Když se po asi 18 hodinách polymerace dosáhne požadované distribuce molekulových hmotností, přidá se k hemoglobinovmu roztoku vodný roztok glycinu (asi 166 g/1) v molárním poměru glycin k hemoglobinu asi 140 : 1. Na obr.3 je znázorněn diagram stanovení stop vysokotlakou kapalinovou chromatografií polymerovaného hemoglobinového produktu po přídavku glycinu. Vzniklý roztok se poté po dobu asi 10 minut míchá, načež se k němu přidá výše popsaný roztok borhydridu sodného/hydroxidu sodného v molárním pornem borhydrid sodný k hemoglobinu asi 28:1. Takto vzniklá směs se poté po dobu asi 1 hodiny míchá, načež se zahustí na asi 50 litrů (ultrafiltr 38) a promyje se 4 objemovými díly (200 litry) vody pro injekci. K zahuštěnému roztoku se přidá další alikvot borhydridu sodného ve výše uvedeném molárním poměru, načež se směs opět 1 hodinu míchá. Vzniklý roztok se promyje 4 objemovými díly vody pro injekci (200 litry) za vzniku polymerovaného pyridoxylovaného tepelně zpracovaného hemoglobinu bez obsahu stromálních kontaminantů.

Vzniklý roztok se oxiduje tím, že se nechá stát pod atmosférou kyslíku a poté se převede do čistícího systému 42. Přečištění lze rovněž provést sloupcovou • · • · · · ·· ·· • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·· chromatografii, filtrací, výhodně membránovou filtrací (diafiltrací), nebo kombinací filtrace a sloupcové chromatografie.

Při jednom z provedení podle vynálezu se roztok převede do chromatografické nádoby - nádrže 6, znázorněné na obr. 5. Při tomto provedení se vzniklý roztok oxyhemoglobinu zředí v nádrži 6 na objem asi 200 litrů (4% hemoglobinový roztok) a koncentrace chloridových aniontu se upraví na 22 mM přídavkem rotoku chloridu sodného. Úprava koncentrace sodných kationtů není nutná.

Za použití chromatografické kolony 44 se poté chromatografuje pět 40-ti litrových alikvotů vzniklého hemoglobinového roztoku. Kolona 44 obsahuje afinitní gel, kterým je agarózový gel, upravený přídavkem žlutého barviva (komerční dostupnost: Affinity Chromatography, Ltd., „Mimetic Yellow“ č.l), a který vykazuje větší afinitu k polymeru než k tetramerů.

Chromatografie se provádí následujícím způsobem: do kolony 44 se převede 40 litrů oxidovaného, polymerovaného, pyridoxylovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů. Kolona se promyje asi 750 litry 30 mM vodného natriumchloridového pufru, čímž se odstraní tetramer. Kolona se následně promyje asi 250 litry 300 mM vodného natriumchloridového pufru, čímž se vymyje polymer. Polymerní frakce se jímají v nádrži 7. Nepotřebné frakce se jímají ve výpustní nálevce 46. Kolona se regeneruje přídavkem 150 litrů 15 mM roztoku kyseliny chlorovodíkové a 250 litrů 30 mM vodného roztoku chloridu sodného, načež se do této kolony převede další alikvot (40 litrů) hemoglobinového roztoku. Kolona se opět promyje 30 mM chloridem sodným a 300 mM chloridem sodným. Do kolony se k chomatografickému zpracování přidávají další alikvoty hemoglobinového roztoku, dokud není nádrž 6 vyprázdněna.

Najímané frakce v nádrži 7 se ulrafiltrují (zahustí) použitím filtru 48, spojeným s výpustní nálevkou 50, na objem asi 40 litrů (6% hemoglobinový • · ·· ·· · · • · · · · · « φ 4 444 4 ·4 4 roztok). Zahuštěný hemoglobinový roztok se poté převede do nádrže 8, kde dochází k deoxidaci.

Roztok se případně převede do filtrační recyklační nádoby 10, jak je znázorněno na obr. 6. Hemoglobinový roztok se v nádrži 10 zředí tak, že je obsah hemoglobinu v roztoku asi 4 %. Takovýto roztok se poté diafiltruje za použití 10 mM chloridu sodného a filtru 52 (propustnost: do mol. hm. 300 000, komerční dostupnost u společnosti Pall-Filtron). Filtrace probíhá do okamžiku, kdy filtrem projde asi 97 % hemoglobinového roztoku, který se jímá v nádrži 11. (Asi 3 % z celkového objemu roztoku, tj. polymery o vysoké molekulové hmotnosti, se zachytí v nádrži 10). Obsah hemoglobinu se určí spektrofotometricky za použití kooximetru.

Nádrž 11 obsahuje roztok obsahující asi 2 až 4 % hemoglobinu a 7 až 10 % tetrameru. 2- až 4% hemoglobinový roztok se poté diafiltruje za použití 10 mM chloridu sodného a filtru 54 (propustnost: do mol.hm. 100 000, komerční dostupnost u spol. Pall-Filtron), kteiýje napojen na výpustní nálevku 56. Filtrace se provádí do chvíle, kdy je „size-exclusion“ chromatografií (kolona BioSep SEC-S3000 600 x 7,8 mm) stanoven obsah tetrameru na hodnotu nižší než 0,8 % hemoglobinu. Vzniklý přečištěný hemoglobinový roztok je nejdříve ponechán v nádrži 11, načež se převede za účelem deoxidace do nádrže 8.

Nádrž 8 může být stejná jako nádiž 4, výhodně je však odlišná. Nádrž 8 je vybavena vpodstatě stejně jako nádrž nádrž 4 na obr.l a je napojena na nádržku s pěnou 58 stejným způsobem jako nádrž 4 na nádržku na pěnu 36. Deoxidace je ukončena po asi 2,5 hodinách zavádění dusíku pri teplotě asi 10°C a pH roztoku asi 7,5. Dusík je zaváděn do roztoku do chvíle, kdy tento roztok obsahuje méně než 16 % oxyhemoglobinu (vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu). Vzniklý deoxyhemoglobinový roztok se následně převede do nádrže 9, kde je formulován.

Ve formulační nádrži 9 je nejprve roztok zahuštěn na asi 7% hemoglobinový roztok, jehož pH se pri 4°C upraví na hodnotu od asi 8,8 do 9,0.

♦ · · · ► · · · ► · · · • · · · · · • · • · · · pH se upraví přídavkem 0,2M roztoku hydroxidu sodného. K hemoglobinovému roztoku o pH 8,8 až 9,0 se poté přidají roztoky elektrolytů. Jsou též přidány glukóza a glycin, a to v takovém množství, aby byly jejich výsledné koncentrace 5 g/1, respektive 1,75 g/L Do roztoku se přidá rovněž chlorid draselný, a to v takovém množství, aby byla koncentrace draselných kationtů od asi 3,5 do 4,5 mM. Dále se přidá 3M chlorid sodný, a to v takovém množství, aby byla koncentrace chloridových aniontů 85 až 110 mM. Přidá se dále laktát sodný, a to v takovém množství, aby byla koncentrace sodných kationtů 135 až 155 mM. Konečně se přidá 0,45 molární roztok kyseliny askorbové, čímž se zvýší koncentrace této kyseliny v roztoku na asi 100 mg/1. Kyselina askorbová má funkci konzervační a antioxidační látky pro účely skladování. Konečný hemoglobinový roztok má osmolalitu asi 280 až 360 mmol/kg.

Formulovaný hemoglobinový roztok se poté zahustí pomocí filtru 60, spojeného s lapačem 62, na 10% hemoglobinový roztok, který je následně sterilizován filtrací přes filtr 64 a převeden do aseptických presterilizovaných krevních konzerv.

V níže uvedené tabulce 1 jsou uvedeny charakteristiky produktu, připraveného uvedeným postupem, šarže A. Tabulka 1 rovněž zahrnuje charakteristiky produktů šarží B a C, připravených výše uvedeným postupem.

Tabulka 1

Šarže

Složka	A	B	C
Hemoglobin (g/dl)	10,4	10,2	10,2
Methemoglobin {%)	4,6	6,0	5,6
Karboxyhemoglobin (%) P50 (kPa, pH 7,35-7,45,	0,2	1,4	1,5
pCO₂ 4,66 - 5,32 kPa)	3,79	3,56	3,59
Osmolalita (mmol/kg)	318	320	317
Sodík (mmol/1)	142	144	142
Draslík (mmol/1)	4,0	4,0	4,0
Chloridy (mmol/1)	98	99	94
Volné železo (ppm)	0,7	1,2	1,0
Molekulární hmotnost	128:16	128:11	128:16
(% při jedn.mol.hm., kd)	192:26	192:23	192:26
	256^s:58	256⁸:66	256^s:58
Tetramer (%)	0,4	0,3	0,4
Endotoxin (EU/mí)	méně než 0,03	méně než 0,03	méně než 0,03

Látka obsahuje rovněž malé množství látek o vyšší molekulové hmotnosti

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Vodný roztok pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu vyznačený tím, že je schopen podání infúzí lidskému pacientovi v množství až 1,5 litru, nezpůsobujícím zhoršení činnosti ledvin.
2. Henioglobinový roztok podle nároku 1 vyznačený tím, že jeho poločas činí v lidském pacientovi asi 15 hodin.
3. Hemoglobinový roztok podle nároku 1 vyznačený tím, že jeho poločas činí v lidském pacientovi asi 24 hodin.
4. Roztok podle nároku 1 vyznačený tím, že je schopen podání infúzí v množství až 5 litrů.
5. Hemoglobinový roztok podle nároku 1 vyznačený tím, zeje schopen podání infúzí lidskému pacientovi v množství až 3 litry, nezpůsobujícím zhoršení činnosti ledvin, a že jeho poločas činí v lidském pacientovi asi 24 hodin.
6. Způsob přípravy roztoku pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu, schopného podání infúzi lidskému pacientovi v množství až 3 litrů, vyznačený tím, že zahrnuje (a) odstranění leukocytů filtrací směsi obsahující červené krvinky přes filtr, který má minimální průměrnou velikost pórů takovou, aby nedošlo k průchodu leukocytů;

(b) lýzu červených krvinek;

(c) přidání oxidu uhelnatého a zahřívání produktu (b) na teplotu asi 60 až 62°C po dobu 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku;

(d) filtraci tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku za účelem odstranění stromatu a stromálních kontaminantů vysrážených při zahřívání;

(e) odplynění tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku zaváděním kyslíku a následně dusíku do tepelně zpracovaného roztoku při teplotě asi 10°C za vzniku pěny;

(f) polymeraci roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu;

(g) oxidaci roztoku;

(h) přečištění roztoku za účelem odstranění tetramemího hemoglobinu a jímání přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu, který obsahuje, vztaženo k hmotnosti celkového hemoglobinu, méně než 0,8 % tetrameru;

(i) upravení pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu na fyziologické hodnoty.

• · · · ·
7. Způsob podle nároku 6 vyznačený tím, zeje odplyněný roztok pyridoxylován uvedením tohoto odplyněného roztoku do styku s pyridoxal-5-fosfátem v molárním poměru pyridoxal-5-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1.
8. Způsob podle nároku 6 vyznačený tím, zeje odplyněný roztok pyridoxylován uvedením tohoto odplyněného roztoku do styku s pyridoxal-5-fosfátem v molárním poměru pyridoxal-5-fosfátu k hemoglobinu asi 2:1.
9. Způsob podle nároku 7 vyznačený tím, zeje pyridoxal-5fosfát uveden do styku s hemoglobinem a borhydridem po dobu asi jedné hodiny.
10. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že je hemoglobin v pyridoxylovaném roztoku polymerován uvedením tohoto pyridoxylovaného roztoku do styku s glutaraldehydem v molárním poměru glutaraldehydu k hemoglobinu od asi 24:1.

·· ·· ► · ♦ » to · · · > · · 1 » · · 4 • to ··
11. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, zeje pyridoxylovaný roztok uveden do styku s glutaraldehydem po dobu 18 hodin, načež se reakce ukončí prudkým ochlazením.
12. Způsob provedení transfúze u lidského pacienta, jehož stav transfuzi vyžaduje, vyznačený tím, že se pacientovi podá až 1,5 litru pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku.
13. Způsob provedení transfúze u lidského pacienta, jehož stav transfúzi vyžaduje, vyznačený tím, že se pacientovi podají až 3,0 litry pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku.
14. Způsob provedení transfúze u lidského pacienta, jehož stav transfúzi vyžaduje, vyznačený tím, že se pacientovi podá až 5,0 litrů pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačený tím, že hemoglobin je glutaraldehydem polymerovaný hemoglobin.

· 99 99 99 99 • «99 9 99 9 99 9

9 9 9999 9 99 9

9 99 99 99 999999

9 999· 9 9

9999 999 99 99 99 99
16. Roztok podle nároku 1 vyznačený tím, že má hemoglobin distribuci molekulových hmotností, znázorněnou na obr.4.
17. Roztok podle nároku 1 vyznačený tím, že je hemoglobin glutaraldehydem polymerovaný hemoglobin s distribucí molekulových hmotností, znázorněnou na obr.4.
18. Způsob podle nároku 15 vyznačený tím, že hemoglobinový přípravek obsahuje 16 % polymerního hemoglobinu o molekulové hmotnosti 128, 26 % polymerního hemoglobinu o molekulové hmotnosti 192 a 58 % polymerního hemoglobinu o molekulové hmotnosti 256.
19. Roztok podle nároku 1 vyznačený tím, že hemoglobinový přípravek obsahuje 16 % polymerního hemoglobinu o molekulové hmotnosti 128, 26 % polymerního hemoglobinu o molekulové hmotnosti 192 a 58 % polymerního hemoglobinu o molekulové hmotnosti 256.

4 4 «4 44

4 4 4 4 4

4444 4 44 4

44 444 444

44 • 4 44
20. Roztok pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu vyznačený tím, že je schopen podání infúzi lidskému pacientovi v množství až asi 3 litrů a že je získán postupem zahrnujícím (a) průtok kive s prošlou nebo s neprošlou dobou expirace vhodným odsávacím zařízením při sníženém tlaku;

(b) odstranění leukocytů z nasáté krve filtrací směsi obsahující červené krvinky přes sadu filtrů, jejichž minimální průměrná velikost pórů je taková, aby nedošlo k průchodu leukocytů;

(c) přídavek oxidu uhelnatého k produktu (b) za vzniku hemoglobinového roztoku o pH nižším než 7;

(d) promytí roztoku (c ) 1% roztokem chloridu sodného za vzniku promytého roztoku;

(e) zředění roztoku (d) vodou za vzniku roztoku lýzovaných buněk;

(f) filtraci roztoku lýzovaných buněk přes filtr za vzniku hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů a částí buněčných stěn;

(g) zahřívání a filtraci hemoglobinového roztoku (f) na teplotu 60 až 62°C po dobu 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů;

(h) zahuštění a diafiltraci tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů za vzniku roztoku karboxyhemoglobinu;

• · • « • · ·· ·· • · · « · A · · • · · * · • · · · ·· ·· (i) (i) (k) (1) (m) (n) (o) (P) odplynění roztoku karboxyhemoglobinu zaváděním plynného kyslíku a poté dusíku do tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku při teplotě 40°C za vzniku pěny; pyridoxylaci odplyněného hemoglobinového roztoku za použití pyridoxal-5 -fosfátu při molárním poměru pyridoxal5-fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1 za vzniku roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu;

polymeraci roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za použití vodného roztoku glutaraldehydu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polyrního hemoglobinu s distribucí molekulových hmotností 65 až 75 % polymeru a 25 až 35 % tetrameru;

oxidaci a ředění polymerovaného roztoku do chvíle, kdy roztok neobsahuje více než 4 % hmotnosti hemoglobinu; přečištění roztoku (1) za účelem odstranění tetramerního hemoglobinu a jímání přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku, který obsahuje méně než 0,8 % tetramerního hemoglobinu; deoxidaci přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku zaváděním plynného dusíku; úpravu pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu na hodnotu 8,8 až 9,0; a zahuštění a sterilizaci roztoku (o).

• · • · · • · ·· • · • · ft · • ftftft ftftft • · · <* • · ftft ·« ftft • · · ft • ftft · • ftft · · · • · ftft ftft
21. Způsob přípravy roztoku pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu, schopného podání infúzí lidskému pacientovi v množství až asi 3 litrů, vyznačený tím, že zahrnuje (a) průtok krve s prošlou nebo s neprošlou dobou expirace vhodným odsávacím zařízením při sníženém tlaku;

(b) odstranění leukocytů z odsáté krve filtrací směsi obsahující červené krvinky přes sadu filtrů, jejichž minimální průměrná velikost póruje taková, aby nedošlo k průchodu leukocytů;

(c) přídavek oxidu uhelnatého k produktu (b) za vzniku hemoglobinového roztoku o pH nižším než 7;

(d) promytí roztoku (c ) 1% roztokem chloridu sodného za vzniku promytého roztoku;

(e) zředění roztoku (d) vodou za vzniku roztoku lýzovaných buněk;

(f) filtraci roztoku lýzovaných buněk přes filtr za vzniku hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů a částí buněčných stěn;

(g) zahřívání a filtraci hemoglobinového roztoku (f) na teplotu 60 až 62°C po dobu 10 hodin za vzniku tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů;

(h) zahuštění a diafiltrací tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku bez obsahu stromálních kontaminantů za vzniku roztoku karboxyhemoglobinu;

(i) odplynění roztoku karboxyhemoglobinu zaváděním plynného kyslíku a poté dusíku do tepelně zpracovaného hemoglobinového roztoku při teplotě 40°C za vzniku pěny;

• · ·» ·· ·

9 9 9

9 9

9 9 • · « · · • · «· 99

9 9 9

9 9 9 • 9 · · 9 9 9 • · • · · 9 (j) pyridoxylaci odplyněného hemoglobinového roztoku za použití pyricloxal-5 -fosfátu při molámím poměru pyridoxal5 -fosfátu k hemoglobinu od asi 1:1 do 3:1 za vzniku roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu;

(k) polymeraci roztoku pyridoxylovaného hemoglobinu za použití vodného roztoku glutaraldehydu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polymerního hemoglobinu s distribucí molekulových hmotností 65 až75 % polymeru a 25 až 35 % tetrameru;

(l) oxidaci a ředění polymerovaného roztoku do chvíle, kdy roztok neobsahuje více než 4 % hmotnosti hemoglobinu;

(m) přečištění roztoku (1) za úěelem odstranění tetramerního hemoglobinu a jímání přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku, který⁷ obsahuje méně než 0,8 % tetramerního hemoglobinu;

(n) deoxidaci přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinového roztoku zaváděním plynného dusíku;

(o) úpravu pH a hladiny elektrolytů v roztoku přečištěného pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu na hodnotu 8,8 až 9,0; a (p) zahuštění a sterilizaci roztoku (o).
22. Vodný roztok pyridoxylovaného polymerovaného hemoglobinu vyznačený tím, že je charakterizován (a) obsahem 9,5 až 12,0 g/dl celkového hemoglobinu;

(b) obsahem méně než 8 % celkového methemoglobinu, vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu;

• · to · <ř toto » · toto • · · · · ·« · · · 4 « · ···· ·«·· to to ·· ·· toto ««toto·· « ····· ·· • to·» ·*·« *· to* ·« ·· (c) obsahem méně než 5 % celkového karboxyhemoglobinu, vztaženo na hmotnost celkového hemoglobinu;

(d) disociací kyslík-hemoglobin při tlaku v rozmezí od 3,07 do 4,27 kPa;

(e) osmolalitou v rozmezí od 280 do 360 mmol/kg;

(f) koncentrací sodných iontů v rozmezí od 135 do 155 mmo/kg;

(g) koncentrací draselných iontů v rozmezí od 3,5 do 4,5 mmol/kg;

(h) koncentrací chloridových iontů v rozmezí od 85 do 110 mmol/kg;

(i) obsahem volného železa nižším než 2,0 ppm;

(j) distribucí molekulových hmotností při píku 128 Kd od 10 do 24 %;

(k) distribucí molekulových hmotností při píku 192 Kd od 18 do 30%;

(l) distribucí molekulových hmotností při píku 256 Kd od 45 do 70 %;

(m) celkovým obsahem tetramerů nižším než 0,8 %;

(n) obsahem endotoxinu nežším než 0,03 EU/ml;

(o) obsahem fosfolipidů nižším než 50 ng/Hb; a (p) obsahem glykolipidů nižším než 2 ng/Hb.

11/ W>

·· · · « ·· ·· · · ···· · · · to··· • · · ···· ···· to ······· ··· ··· • · ···· · · ···· ··· ·· ·· ·· ·· >£ -

9/1

• · · · » · · » · · · · • · · · · <

·· ·· o

oh

NJ

9/2 ·· · · 9 · 9 9 99 9 9 • 9 · 9 9 9 1

9999 9 99 4 •9 9 99 99 999 9 9 4

9 9 9 9 4

99 99 99

3/6