CN1389472A - 治疗结肠癌等消化道肿瘤的抗iv型胶原酶单抗3d6与力达霉素的免疫偶联物 - Google Patents
治疗结肠癌等消化道肿瘤的抗iv型胶原酶单抗3d6与力达霉素的免疫偶联物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1389472A CN1389472A CN 02125314 CN02125314A CN1389472A CN 1389472 A CN1389472 A CN 1389472A CN 02125314 CN02125314 CN 02125314 CN 02125314 A CN02125314 A CN 02125314A CN 1389472 A CN1389472 A CN 1389472A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ldm
- monoclonal antibody
- conjugate
- lidamycin
- collagenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及的抗IV型胶原酶单抗3D6,以2－亚胺基四氢噻吩(2－IT)和N－羟基琥珀酰亚胺基－间－(N－马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)或其它交联剂分子作为中介体,与力达霉素(LDM)偶联,获得了单抗3D6－LDM的偶联物,以单抗3D6对人的结肠癌、食管癌和胃癌等消化道肿瘤进行免疫组织化学染色,显示IV型胶原酶在上述消化道肿瘤中的表达和活化增加,间接ELISA方法测定单抗3D6与鼠结肠癌26(C26)、人结肠癌HT－29、鳞癌KB、肝癌22(H22)的免疫结合活性,结果显示,HT－29、C26细胞对单抗3D6具有较强的免疫结合能力,体内实验用于治疗小鼠结肠癌,3D6－LDM偶联物显示出比同等剂量的游离LDM更强的肿瘤生长抑制作用,因此,3D6－LDM偶联物可能用于结肠癌及其它消化道肿瘤的治疗。
Description
技术领域：
本发明涉及一种由单克隆抗体和抗肿瘤药物组成的免疫偶联物及其制备方法和在肿瘤靶向治疗中的应用。
背景技术：
单克隆抗体(单抗)3D6是以IV型胶原酶免疫BALB/c小鼠后，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/O细胞融合，经克隆筛选后所获得的杂交瘤细胞株分泌的抗体。该抗体分子量为150kDa左右，可以与IV型胶原酶特异性结合并中和其活性。
据报道，基质金属蛋白酶(MMPs)与恶性肿瘤的生长、转移和新血管生成之间存在着密切的关系，恶性肿瘤或其间质细胞通过分泌多种基质金属蛋白酶来降解基底膜和细胞外基质组分，从而有利于肿瘤的侵袭和转移过程。因此，MMPs成为引人注目的肿瘤治疗的分子靶点(Drugs Aging 1997，11：229)。IV型胶原酶，又称为明胶酶，包括MMP-2和MMP-9两个组分，是MMPs家族中的重要成员，它可以降解基底膜中作为其它组分构建支架的IV型胶原，从而有利于肿瘤细胞破坏和穿透基底膜进行侵袭和转移(Mol Med Today 2000，6：149)。大量研究表明，抑制IV型胶原酶或其它MMPs的分泌及其活性的小分子药物在体内具有抑制肿瘤生长和转移的作用(J Natl Cancer Inst 2001，93：178)。由于IV型胶原酶在恶性肿瘤组织的表达和活化显著增加，本实验室以往以抗IV型胶原酶单抗3D6的Fab’片段携带抗肿瘤药物进行的单抗导向治疗取得了良好的效果，并申请了专利(专利公开号CN1268377A)。本实验室在对人的结肠癌和其它消化道肿瘤组织进行研究的过程中发现，用抗IV型胶原酶单抗3D6进行免疫组织化学染色，人的结肠癌、食管癌及胃癌等消化道肿瘤组织染色结果呈阳性。其中，在对5例人结肠癌组织及其邻近正常组织进行染色时发现，正常组织与单抗3D6的免疫组织化学染色为阴性，而结肠癌组织则呈现不同程度的阳性染色，表明IV型胶原酶在肿瘤组织中特异性表达。而用单抗3D6及其Fab’片段与抗肿瘤药物组成的免疫偶联物治疗结肠癌等消化道肿瘤的研究尚未见报道。以本研究所自行研制的抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)(中国抗生素杂志1994，19(2)：164)作为弹头药物，本发明制备了单抗3D6-LDM偶联物，并观察了其对小鼠移植性结肠癌C26的体内抗肿瘤作用。结果显示，与同等剂量的游离力达霉素相比，3D6-LDM偶联物的抗肿瘤作用显著增强。因此，3D6-LDM偶联物有可能成为治疗结肠癌等消化道肿瘤的新型抗肿瘤药物。
本发明的目的是以合适的方法制备单抗3D6-LDM的偶联物，并将此偶联物用于结肠癌等消化道肿瘤的治疗。
发明内容：
1.单抗3D6-LDM偶联物 本发明所涉及的单抗3D6-LDM偶联物为抗IV型胶原酶单抗3D6与抗肿瘤抗生素LDM以1∶1的分子比，通过小分子的交联剂进行连接所形成的化学免疫偶联物。其中的一种分子结构是通过连接分子2-亚氨基四氢噻吩(2-IT)和N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)等进行连接形成的(图1A)；本发明所涉及的3D6-LDM的另一种分子结构可以为通过连接分子如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等进行连接所形成的化学免疫偶联物(图1B)。3D6-LDM偶联物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量在160kDa左右。其中单抗3D6的分子量为150kDa左右，LDM的分子量为11349Da，偶联物的分子量相当于两者之和，说明偶联物中单抗3D6和LDM的分子比为1∶1。
2.以2-IT和MBS作为交联分子的单抗3D6-LDM偶联物的制备利用抗IV型胶原酶单抗3D6作为携带抗肿瘤药物的导向载体：(1)经羟基磷灰石柱纯化后的单抗3D6置截留分子量为10kDa的透析袋中用pH8.0的0.05M硼酸缓冲液进行透析，调节其浓度为5mg/ml。取溶于pH为8.0的0.05M的硼酸缓冲液中，浓度为4 mg/ml的2-IT溶液10μl加入上述5mg/ml的3D6溶液中，在充氮气的条件下于室温反应40min。反应结束后，置截留分子量为30kDa的离心浓缩管中，以0.05M，pH为6.8的磷酸盐缓冲液(PB)进行缓冲液交换，并离心除去未反应的2-IT。(2)取力达霉素溶解于0.05M pH6.8的PB中配成5mg/ml的浓度，搅拌下加入溶于DMF的浓度为10mg/ml的MBS，室温反应40min。反应结束后，置截留分子量为10kDa的透析袋中，以0.05M，pH6.8的PB充分透析16h。透析完毕后立即与经2-IT修饰的单抗3D6进行偶联反应，室温反应6h或过夜。反应液置截留分子量为30kDa的超滤离心浓缩管中，离心超滤3-4次，去除未反应的MBS修饰的力达霉素，得到3D6-LDM的偶联物。
3.以SPDP或长链的N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)作为交联分子的3D6-LDM偶联物的制备：(1)取LDM 2mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，配成4mg/ml的浓度，然后加入摩尔数为10倍过量的SPDP或LC-SPDP(15mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中)，室温反应30min。反应结束后置浓度为0.1mol/L的醋酸缓冲液(pH4.5)中充分透析。取透析内液加入二巯基苏糖醇(DTT)至终浓度为10mmol/L，室温反应30min，然后置磷酸盐缓冲液中充分透析。(2)另取单抗3D6 2mg溶于pH为6.8，浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中，加入摩尔数为10倍过量的SPDP或LC-SPDP，室温反应30min，于PBS液中充分透析。(3)合并(1)和(2)中的透析内液，室温反应过夜。然后经Sephadex G-75柱分离，收集第一峰，得到3D6-LDM的偶联物。
本发明所说的单抗3D6-LDM偶联物与IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应性实验证明，该偶联物保留了与IV型胶原酶和上述各种肿瘤细胞的结合能力。本发明所说的单抗3D6在不同人肿瘤组织的免疫组织化学染色实验结果显示，结肠癌等消化道肿瘤组织对单抗3D6呈现阳性染色、而在结肠癌周围的正常组织中染色为阴性，说明IV型胶原酶在结肠癌组织中的表达具有特异性。本发明所说的3D6-LDM偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用实验显示，3D6-LDM偶联物比单独使用LDM对肿瘤细胞的细胞毒性强，且与偶联物的浓度成依赖关系。而本发明所说的3D6-LDM偶联物静脉注射给药时，对小鼠结肠癌的治疗效果明显高于单独使用LDM。
以下所举3D6-LDM偶联物的抗肿瘤活性的实施例，对本发明而言只是说明性的，而非限制性的。实施例1：
单抗3D6和3D6-LDM偶联物与IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应性以ELISA方法进行。单抗3D6与人结肠癌HT-29细胞、小鼠结肠癌C26细胞、人口腔鳞癌KB细胞、小鼠肝癌H22细胞呈现良好的免疫结合活性(图2)。偶联后测定单抗3D6-LDM偶联物与IV型胶原酶以及人结肠癌HT-29细胞、小鼠结肠癌C26细胞、人口腔鳞癌KB细胞、小鼠肝癌H22细胞的免疫结合能力，结果显示3D6-LDM偶联物保留了单抗3D6与IV型胶原酶(图3)以及上述各种肿瘤细胞的结合能力(图4)。实施例2：
单抗3D6在不同人肿瘤组织的免疫组织化学染色单抗3D6在对多例人结直肠癌、盲肠癌、食管癌、胃癌等消化道肿瘤组织进行免疫组织化学染色时，呈现较高的阳性反应率(表1)。实验中的组织切片均设有空白对照(以PBS替代单抗3D6)、阴性对照(以无关的抗力达霉素单抗F9替代单抗3D6)，染色结果均为阴性，证明单抗3D6的免疫组织化学染色为针对组织中IV型胶原酶的特异性染色结果。免疫组织化学染色结果表明，单抗3D6在人体结直肠癌、盲肠癌、食管癌、胃癌等消化道肿瘤组织中均有不同程度的阳性染色。在消化道肿瘤组织样本中，单抗3D6的染色多位于腺细胞样肿瘤细胞顶端和基底以及侵袭入基质或血管的肿瘤细胞内，并呈强阳性染色，阳性率达80％(32/40)，显示IV型胶原酶在肿瘤细胞破坏和穿透基底膜的过程中起作用。
表1 单抗3D6在不同人肿瘤组织中的免疫组织化学染色肿瘤样本 阴性染色例数 阳性染色例数 染色阳性率(％)结肠癌 1 21 95.2盲肠癌 1 3 75.0食管癌 2 3 60.0胃癌 4 5 55.6
另外，观察5例结肠癌及其邻近正常组织的免疫组织化学染色，正常组织中染色为阴性，而结肠癌组织显示不同程度的阳性染色(表2)，肿瘤细胞内棕色深染颗粒位于腺上皮细胞样肿瘤细胞的顶端，个别病例见于周围间质内(图5，图6)。结果显示了IV型胶原酶在结肠癌组织中表达的特异性。
表2 半定量分析单抗3D6在结肠癌及其邻近正常组织的免疫组织化学染色结肠癌病例序号 结肠癌组织染色情况 邻近正常组织染色情况1 ++++ -2 +++ -3 + -4 ++++ -
5 ++ -实施例3：
3D6-LDM偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用用四氮唑蓝(MTT)法测定3D6-LDM偶联物及游离力达霉素对体外培养的结肠癌C26细胞和肝癌H22细胞的杀伤作用，结果游离力达霉素对两种细胞的IC50分别为4.8×10-11mol/L和6.2×10-11mol/L，3D6-LDM偶联物表现出比游离力达霉素更强的体外细胞毒性，对两种细胞的IC50分别为4.3×10-12mol/L和5.1×10-12mol/L。力达霉素及3D6-LDM偶联物浓度依赖性地抑制H22细胞的增殖(图7，表4)。
表3 MTT法测定力达霉素和3D6-LDM在体外对肝癌H22细胞的杀伤作用
A560(％对照)药物浓度(mol/L×10-12)
LDM 3D6-LDM1000 27.73 18.63100 53.44 26.2910 74.80 60.041 78.40 64.180.1 80.41 78.670.01 82.41 83.02实施例4：
3D6-LDM偶联物静脉注射对小鼠结肠癌C26的疗效 取体内传代的小鼠结肠癌C26瘤块，匀浆后以生理盐水按1∶3的比例稀释，然后按0.2ml/只接种于BALB/c小鼠腋窝皮下，接种72小时后静脉注射给药，对照组给予生理盐水，共给药一次，实验第10天测量各组动物的肿瘤体积，并以瘤体积计算抑瘤率。结果表明，3D6-LDM偶联物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.10mg/kg剂量的抑瘤率分别为54.5％，70.3％和81.2％，而0.05mg/kg力达霉素的抑瘤率为56.4％，显著低于等剂量的偶联物(表4)。
表4 3D6-LDM静脉注射给药对小鼠移植结肠癌C26的生长抑制作用
动物数 体重(g) 瘤重(mg)药物 剂量(mg/kg) 抑瘤率(％)
开始/结束 开始/结束 Xaver±SD对照 10/10 18.4/18.2 1.01±0.193D6 0.75 10/10 18.0/17.9 0.75±0.20 25.7LDM 0.05 10/10 18.1/18.3 0.44±0.16 56.4*3D6+LDM 0.75+0.05 10/10 18.5/18.1 0.62±0.13 38.6*3D6-LDM 0.025 10/10 18.2/17.9 0.46±0.09 54.5*3D6-LDM 0.05 10/10 18.1/16.4 0.30±0.06 70.3**3D6-LDM 0.10 10/10 18.6/16.3 0.20±0.06 81.2**
皮下接种肿瘤，第3天静脉注射给药一次；
*P＜0.01与对照组比较，**P＜0.01与力达霉素组比较
发明效果：
本发明的优点与积极效果是在于确定了抗IV型胶原酶单抗3D6与力达霉素偶联物的制备方法，观察到单抗3D6与结肠癌等消化道肿瘤之间的免疫组织化学反应，为单抗3D6-LDM偶联物用于结肠癌等消化道肿瘤的治疗提供了实验依据。力达霉素是一种迄今为止报道的具有最强细胞毒作用并有明显体内抗肿瘤作用的抗肿瘤抗生素，目前正作为一类新药处于研究开发阶段。单抗3D6-LDM偶联物在对小鼠移植性肝癌的治疗中显示出良好的疗效，而关于其对结肠癌等消化道肿瘤的治疗尚无报道。免疫组织化学染色实验证明，单抗3D6在结肠癌等消化道肿瘤组织中呈现阳性反应，而在周围正常组织中染色为阴性。酶联免疫吸附实验也表明，3D6-LDM偶联物与小鼠结肠癌C26以及人结肠癌HT-29细胞之间存在较强的免疫结合活性。用3D6-LDM偶联物治疗小鼠移植性结肠癌C26表现出比游离力达霉素更强的抗肿瘤作用。因此，预期单抗3D6与力达霉素的偶联物将有可能开发成为新型的抗肿瘤导向药物用于临床肿瘤治疗，并取得良好的效果。
附图说明：图1 单抗3D6-LDM的结构示意图
其中A表示以2-IT和MBS作为交联剂进行连接得到的3D6-LDM
B表示以SPDP或LC-SPDP为交联剂进行连接得到的3D6-LDM图2 单抗3D6与C26、HT-29、H22、KB细胞的免疫反应性
其中横坐标为抗体3D6浓度(μg/ml)
纵坐标为490nm的吸光值图3 单抗3D6-LDM偶联物及单抗3D6与IV型胶原酶的免疫反应性
其中横坐标为抗体浓度(μg/ml)
纵坐标为490nm吸光值图4 单抗3D6-LDM偶联物对C26、HT-29、H22、KB细胞的免疫反应性
其中横坐标为3D6-LDM浓度(μg/ml)
纵坐标为490nm吸光值图5 单抗3D6与人结肠癌组织免疫组织化学染色的结果
图中显示放大400倍的结肠癌组织，左侧正常结肠无阳性染色，右侧为结
肠癌组织，可见腺细胞样肿瘤细胞内阳性颗粒分布于细胞顶端，标尺长度
为100μm。图6 单抗3D6与一例人结肠癌组织免疫组织化学染色的结果
图中显示1例放大100倍的结肠癌组织，左上方为正常结肠，染色阴性，
右下方的肿瘤组织呈强阳性染色，深染的棕色颗粒位于肿瘤细胞的胞浆内，
标尺长度为400μm。图7 力达霉素及单抗3D6-LDM偶联物对H22细胞增殖的抑制作用(MTT法)
其中横坐标为力达霉素和3D6-LDM的浓度的对数，即log(mol/L)
纵坐标为细胞存活率(％)，T/C为加药组存活细胞数/未加药组细胞存活数。
Claims (3)
1.抗IV型胶原酶单克隆抗体3D6与力达霉素(LDM)的免疫偶联物，其特征是单抗3D6-LDM偶联物是由单抗3D6蛋白分子上的氨基和LDM辅基蛋白分子上的氨基之间通过小分子的交联剂作为接头形成的单抗3D6和LDM分子比为1∶1的免疫偶联物，偶联物的分子量为160kDa左右，其中用于连接单抗3D6和LDM的小分子接头可以是2-亚胺基四氢噻吩(2-IT)和N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)，也可以是N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等其它小分子异型双功能交联剂。
2.一种抗IV型胶原酶单克隆抗体3D6与力达霉素(LDM)的免疫偶联物的制备方法，其特征是所说偶联物的制备是将力达霉素先以异型双功能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)修饰，然后加入经2-亚胺基四氢噻吩(2-IT)巯基化的单抗3D6，反应后经纯化得到产物；或者是将力达霉素以其它异型双功能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或长链的N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)等异型双功能交联剂作为中介体与单抗3D6进行偶联反应，反应后经纯化得到产物。
3.抗IV型胶原酶单克隆抗体3D6与力达霉素(LDM)偶联物在治疗结肠癌等消化道肿瘤中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02125314 CN1389472A (zh) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | 治疗结肠癌等消化道肿瘤的抗iv型胶原酶单抗3d6与力达霉素的免疫偶联物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02125314 CN1389472A (zh) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | 治疗结肠癌等消化道肿瘤的抗iv型胶原酶单抗3d6与力达霉素的免疫偶联物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1389472A true CN1389472A (zh) | 2003-01-08 |
Family
ID=4745520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 02125314 Pending CN1389472A (zh) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | 治疗结肠癌等消化道肿瘤的抗iv型胶原酶单抗3d6与力达霉素的免疫偶联物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1389472A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101314619B (zh) * | 2007-06-01 | 2010-12-22 | 齐鲁制药有限公司 | 肿瘤治疗性疫苗ctp37crm197免疫原及其制备方法与应用 |
| CN101437852B (zh) * | 2006-03-17 | 2013-06-12 | 健泰科生物技术公司 | 抗tat226抗体和免疫偶联物 |
-
2002
- 2002-07-24 CN CN 02125314 patent/CN1389472A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101437852B (zh) * | 2006-03-17 | 2013-06-12 | 健泰科生物技术公司 | 抗tat226抗体和免疫偶联物 |
| CN101314619B (zh) * | 2007-06-01 | 2010-12-22 | 齐鲁制药有限公司 | 肿瘤治疗性疫苗ctp37crm197免疫原及其制备方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1329604A3 (ru) | Способ получени конъюгированного соединени ,специфичного по отношению к клеткам меланомы | |
| CN110713547B (zh) | CD47-低pH插入肽在标记或治疗肿瘤中的应用 | |
| Im et al. | Helicobacter pylori-targeting multiligand photosensitizer for effective antibacterial endoscopic photodynamic therapy | |
| JP2756329B2 (ja) | 癌の診断、治療のための免疫結合体 | |
| US4094971A (en) | Immunological adjuvant agents active in aqueous solution | |
| US20080161245A1 (en) | Protein-Binding Anthracycline Peptide Derivatives and Drugs Containing Them | |
| HU208161B (en) | Process for producing cytotoxic active ingredient - antibody conjugates and pharmaceutical compositions | |
| KR20010090602A (ko) | 디디에스 화합물 및 그의 측정방법 | |
| JP2022058911A (ja) | 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化 | |
| JPH07505905A (ja) | 修飾ｃ反応性タンパク質を使用する癌の治療方法 | |
| US20120195895A1 (en) | Fusion Protein of an Anti-CD20 Antibody Fab Fragment and Lidamycin, a Method for Preparing the Same, and the Use Thereof | |
| US4801578A (en) | Muramylpeptide-glycoprotein immunostimulant derivatives, their preparation and their use in medication | |
| CN113365665B (zh) | 抗Her2抗体药物偶联物药物制剂 | |
| EP0325270A2 (en) | Anticancer conjugates | |
| US20230310624A1 (en) | Affibody-cytotoxin conjugate for active targeted therapy of tumors, nanoparticle thereof, preparation method thereof and application thereof | |
| RU2113224C1 (ru) | Продукт полипептидной природы, способ его получения и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой и анальгезирующей активностью | |
| EP0580171A2 (en) | Pharmaceutical composition containing a carrier bound antitumor substance | |
| CN1389472A (zh) | 治疗结肠癌等消化道肿瘤的抗iv型胶原酶单抗3d6与力达霉素的免疫偶联物 | |
| CN101475643B (zh) | 一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE及其制备方法和应用 | |
| EP0215131A1 (en) | E87Ag ANTIGEN OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA, MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST IT, AND HYBRIDOMA | |
| CN1240721C (zh) | 力达霉素与单克隆抗体及其Fab'片段的偶联物以及在结肠癌等肿瘤靶向治疗中的应用 | |
| AU651320B2 (en) | Pharmaceutical product for the treatment of sepsis | |
| JPS6075499A (ja) | ネオカルチノスタチン誘導体及びその製造法 | |
| CA1247010A (en) | Fibronectin-dextran-drug complex and method of preparation thereof | |
| CN1128157C (zh) | 力达霉素与单抗活性片段的偶联物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |