CN110982914A - 一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。该检测试剂盒包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条；所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3‑spacer进行末端封闭。本发明使用RPA‑LFS(The isothermal recombinase polymerase amplification and the lateral flow strip)方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
背景技术
沙门氏菌是一类广泛分布于自然界的革兰氏阴性致病菌，据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区以沙门氏菌为首位。沙门氏菌的传播途径主要是食物的摄入，比如受污染的肉类、蛋类及蛋制品、奶制品、海产品等。沙门氏菌对人类和动物健康具有极大危害，人类在进食受其污染的食物12-36h后会有恶心、呕吐、腹泻、腹痛或痉孪、发烧及头痛等症状。因此，精准、快速、简便的鉴定沙门氏菌，既能可以提高食物的质量，避免沙门氏菌的感染，又能保证人类的生命安全；
目前沙门氏菌的检测方法主要有传统标准法、免疫学方法、PCR法、LAMP、滚环扩增法等。传统标准法是食品样品的分步增菌，目的是提高病原菌的检出率并且此方法需要至少4～7d才有检测结果，检验过程复杂繁琐、费时费力。免疫学方法是利用沙门氏菌表面抗原与特定的抗体结合性质进行的检测。但此方法容易出现假阳性，检出率仅为103-105cfu。PCR已被广泛应用于沙门氏菌的检测，钟伟军等对沙门氏菌的肠毒素基因stn设计qPCR引物得到大小119bp片段。实验发现PCR对沙门氏菌具有较高的灵敏度，可检测到100拷贝的标准质粒。但此法需要昂贵的仪器设备，对工作人员的操作水平要求很高，而且不能满足基层医疗组织、偏远地区等的现场检测要求，为此问题本发明通过RPA-LFS技术快速鉴别沙门氏菌，以期为该菌检测带来新的技术参考。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明涉及一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为Inv-F、Inv-R，且序列分别为
5’-CTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’、5’Biotin-CAACCAGATATGTAGGCAATGGAATGACGA-3’，其探针为Inv-P，且序列为5’-FITC-TGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTAGTTTA[THF]GACCTGAATGAATG-C3-spacer-3’。
本发明还涉及一种沙门氏菌特异性的检测试剂盒，其包含上述所述的正反向引物及探针、侧向流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。
优选地，所述正反向引物长度为30bp。
优选地，所述探针长度48bp。
优选地，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。
优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
本发明的有益效果：
本发明使用RPA结合胶体金试纸条快速检测食源性沙门氏菌，能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高，耗时短。
附图说明
图1为试纸条组装示意图；
图2为本发明实施例中探针种间特异性筛选结果；
图3为本发明实施例中体系优化检测的结果示意图；
图4为本发明实施例中RPA-LFS最低检出限测定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明涉及一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为Inv-F、Inv-R，且序列分别为
5’-CTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’、5’Biotin-CAACCAGATATGTAGGCAATGGAATGACGA-3’，其探针为Inv-P，且序列为5’-FITC-TGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTAGTTTA[THF]GACCTGAATGAATG-C3-spacer-3’。本发明还涉及一种沙门氏菌特异性的检测试剂盒，其包含上述所述的正反向引物及探针、侧向流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。
优选地，所述正反向引物长度为30bp。
优选地，所述探针长度48bp。
优选地，，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。
优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
实施例
试验材料
沙门氏菌、金黄色萄球菌、肠致病性埃希氏菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌标准株基因组均由武汉市食品化妆品检疫所提供；
Bas ic kit、
nfokit购自英国TwistDX公司；侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司；PCR清洁试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；Qubit 4购自Thermo Scientific；MonAmpTM SYBR Green购自莫纳生物科技有限公司；本研究所用引物和探针均由通用生物系统(安徽)有限公司合成；罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪，购自罗氏制药。
试验方法
引物及探针设计
从NCBI上获取沙门氏菌的InvA和InvE基因序列，用Primer-Blast通过不同参数设计得到理论上可行的特异性引物。
RPA反应筛选引物
引物筛选所使用的
Basic kit反应体系：Inv-F(10μM)2.1μL、Inv-R(10μM)2.1μL、2X Reaction Buffer 25μL、10X Basic E-mix 5μL、dNTP(1.8mM)2.25μL、Template 1μL、ddH2O6.95μL、20Xcore Reaction mix 2.5μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；通过琼脂糖凝胶电泳及紫外凝胶成像仪检验引物敏感性。
RPA-LFS筛选探针
用Primer Premier 5软件在正反向引物间设计特异性探针，应在理论上尽量避免正方向引物二聚体、发夹结构、错配、探针和反向引物的二聚体等发生。探针筛选使用
nfo kit，其反应体系：Inv-F(10μM)2.1μL、Inv-R(10μM)2.1μL、Inv-P(10μM)0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH2O 11.2μL、加入冻干粉，混匀、Template 2μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；反应结束即刻加入EDTA或置于冰上终止反应，再通过侧流层析试纸条检测获得最佳探针正反向引物，并用琼脂糖凝胶电泳进行结果验证。
试纸条检测原理
吸取无需纯化的扩增产物2μL加入98μL缓冲液中，插入试纸条，在试纸条吸水纸的虹吸作用下，扩增产物与金标抗体、缓冲液向吸水纸端流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端修饰有FITC，与鼠抗FITC金标抗体结合，接着液相继续向吸水纸端流动到达检测线，固定在检测线上的链霉亲和素另一端修饰有生物素的扩增产物捕获，这样就使被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终被质控线上的抗鼠抗体的Fc片段抗体捕获，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而被质控线上的抗鼠抗体捕获，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条的质量进行指控，示意图如图1所示。
种间特异性鉴别
用试纸条进行种间特异性筛选，同时用沙门氏菌引物探针分别扩增沙门氏菌，蜡样芽孢杆菌，肠致病性埃希氏菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌，结果如图2所示。
体系优化
对筛选出来的引物探针进行优化，优化条件为反应时间和反应温度。反应时间分别设置为5min，10min，10min，20min，25min，30min，35min，40min。反应温度设置为22℃，26℃，30℃，34℃，38℃，42℃，46℃。结果如图3所示，最佳反应温、时间为42℃，30min。
最低检出下限测定
由于细菌在食物中的起始含量不能确定，实验室条件下在方法建立过程中检测的模板浓度通常较高，在实际检测中对于极低含量存在的菌也要非常灵敏的检出，所以要对最低检出下限进行测定，对于本研究使用RPA-LFS检测沙门氏菌的最低检出下限为10°CFU/μL结果如图4所示。
与qPCR检测结果进行比较
目前qPCR检测是公认的比较灵敏准确的方法，用qPCR检测结果最为对照，能够说明RPA-LFS用于检测的准确度，在具有相同检测准确的条件下使用RPA-LFS方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下实现实时、实地、即时的快速现场检测,分别使用RPA-LFS和qPCR同时检测人工污染新鲜牛奶的50个样品，共检出8个阳性结果，两种方法所述结果一致，结果如表所示。
(“+”means positive.“-”means negative.)
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为Inv-F、Inv-R，且序列分别为CTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG、Biotin-CAACCAGATATGTAGGCAATGGAATGACGA，其探针为Inv-P，且序列为FITC-TGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTAGTTTA[THF]
GACCTGAATGAATGA-C3 Spacer。
2.一种沙门氏菌特异性的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的正反向引物及探针、侧向流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述正反向引物长度为30bp。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针长度48bp。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
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| CN201911311125.5A CN110982914A (zh) | 2019-12-18 | 2019-12-18 | 一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528613A (zh) * | 2021-07-16 | 2021-10-22 | 安徽农业大学 | 一种基于多酶恒温核酸快速扩增技术检测细菌基因的实验方法 |
| CN113832241A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-12-24 | 江苏海洋大学 | 一种rpa-lfs快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法 |
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| CN105331710A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-02-17 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN108018333A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-11 | 杭州师范大学 | 一种用于同时检测六种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法 |
| CN108060209A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-22 | 中科智测(天津)科技有限公司 | 一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及检测方法 |
| CN110195119A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-03 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒、引物对、探针和方法 |
-
2019
- 2019-12-18 CN CN201911311125.5A patent/CN110982914A/zh active Pending
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