CN110951662B - 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用。本发明所述高产赖氨酸的棒状细菌，具有L‑赖氨酸生产能力并且其细胞内L‑赖氨酸合成途径和/或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子中的至少一种的活性增强。本发明所述高产赖氨酸的棒状细菌通过对赖氨酸生物合成途径或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子的序列进行修饰，使其具有相比内源启动子更高的活性，从而增强起始转录效率，进而提高其产赖氨酸的水平，提高L‑赖氨酸菌株的生产能力。实验表明本发明所述棒状细菌为L‑赖氨酸产率和转化率显著性提高，为L‑赖氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用。
背景技术
赖氨酸(Lysine)的化学名称为2，6-二氨基己酸。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低,且在加工过程中易被破坏而缺乏,故称为第一限制性氨基酸。通常所说的赖氨酸均指L型。L型赖氨酸呈针状晶体，在210℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。
赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一，机体不能自身合成，必须从食物中补充。赖氨酸主要存在于动物性食物和豆类中，谷类食物中赖氨酸含量很低。赖氨酸在促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑情绪等方面都具有积极的营养学意义，同时也能促进某些营养素的吸收，能与一些营养素协同作用，更好的发挥各种营养素的生理功能。赖氨酸可以调节人体代谢平衡，赖氨酸为合成肉碱提供结构组分，而肉碱会促使细胞中脂肪酸的合成。向食物中添加少量的赖氨酸，可以刺激胃蛋白酶与胃酸的分泌，提高胃液分泌功效，起到增进食欲促进幼儿生长与发育的作用。赖氨酸还能提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长。如缺乏赖氨酸，会造成胃液分泌不足而出现厌食、营养性贫血，致使中枢神经受阻、发育不良。赖氨酸在医药上还可作为利尿剂的辅助药物，治疗因血中氯化物减少而引起的铅中毒现象，还可与酸性药物(如水杨酸等)生成盐来减轻不良反应，与蛋氨酸合用则可抑制重症高血压病，还有研究表明，补充赖氨酸能加速疱疹感染的康复并抑制其复发。
L-赖氨酸是世界上第二大氨基酸生产品种，广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。
微生物发酵法生产L-赖氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-赖氨酸最主要的方法。但目前L-赖氨酸的菌种的发酵性能仍较差、L-赖氨酸的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种高产L-赖氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种高产赖氨酸的棒状细菌，具有L-赖氨酸生产能力并且其细胞内L-赖氨酸合成途径和/或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子中的至少一种的活性增强。
本发明通过对赖氨酸生物合成途径或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子的序列进行修饰，使其具有相比内源启动子更高的活性，为RNA聚合酶提供可靠的初始结合位点，从而增强起始转录效率，进而提高其产赖氨酸的水平，从而获得高产L-赖氨酸的基因工程菌。
在本发明中，所述关键酶为天冬氨酸激酶(lysC)或丙酮酸羧化酶(pyc)。
在本发明中，所述活性增强是通过改变启动子-10区及其扩展序列增强启动子活性。
在本发明的实施方案中，所述包含天冬氨酸激酶活性增强启动子的序列如SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18所示；所述包含丙酮酸羧化酶活性增强启动子的序列如SEQ IDNo.19或SEQ ID No.20所示。
根据本发明所述启动子活性的核酸分子，可用作原核生物尤其是大肠杆菌或棒状细菌基因表达的启动子。其中所述棒状细菌是指属于棒状杆菌属或短杆菌属的微生物。可用于本发明的棒状细菌的实例包括但不限于：谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和产氨棒杆菌。
在本发明中，所述棒状细菌，其为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌或产氨棒杆菌。
本发明还提供了所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法，制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的基因片段，与载体连接获得重组载体，转化棒状细菌获得高产赖氨酸的棒状细菌。
在一些实施方案中，所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法中所述制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的方法具体为：以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut1-1/PlysCmut1-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段PlysCmut1-up；以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut1-3/PlysCmut1-4引物对进行PCR扩增，得到片段PlysCmut1-dn；以上述二片段混合物为模板，以PlysCmut1-1/PlysCmut1-4引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的突变的PlysCmut1片段。
在一些实施方案中，所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法中所述制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的方法具体为：以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut2-1/PlysCmut2-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段PlysCmut2-up；以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut2-3/PlysCmut2-4引物对进行PCR扩增，得到片段PlysCmut2-dn；以上述二片段混合物为模板，以PlysCmut2-1/PlysCmut2-4引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的突变的PlysCmut2片段。
在一些实施方案中，所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法中所述制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的方法具体为：以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut1-1/PlysCmut1-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段Ppycmut1-up；以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut1-3/Ppycmut1-4引物对进行PCR扩增，得到片段Ppycmut1-dn；以上述二片段混合物为模板，以Ppycmut1-1/Ppycmut1-4引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和丙酮酸羧化酶的编码基因的突变的Ppycmut1片段。
在一些实施方案中，所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法中所述制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的方法具体为：以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut2-1/PlysCmut2-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段Ppycmut2-up；以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut2-3/Ppycmut2-4引物对进行PCR扩增，得到片段Ppycmut2-dn；以上述二片段混合物为模板，以Ppycmut2-1/Ppycmut2-4引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和丙酮酸羧化酶的编码基因的突变的Ppycmut2片段。
其中，所述PlysCmut1-1的序列如SEQ ID No.1所示；
所述PlysCmut1-2的序列如SEQ ID No.2所示；
所述PlysCmut1-3的序列如SEQ ID No.3所示；
所述PlysCmut1-4的序列如SEQ ID No.4所示；
所述PlysCmut2-1的序列如SEQ ID No.5所示；
所述PlysCmut2-2的序列如SEQ ID No.6所示；
所述PlysCmut2-3的序列如SEQ ID No.7所示；
所述PlysCmut2-4的序列如SEQ ID No.8所示；
所述Ppycmut1-1的序列如SEQ ID No.9所示；
所述Ppycmut1-2的序列如SEQ ID No.10所示；
所述Ppycmut1-3的序列如SEQ ID No.11所示；
所述Ppycmut1-4的序列如SEQ ID No.12所示；
所述Ppycmut2-1的序列如SEQ ID No.13所示；
所述Ppycmut2-2的序列如SEQ ID No.14所示；
所述Ppycmut2-3的序列如SEQ ID No.15所示；
所述Ppycmut2-4的序列如SEQ ID No.16所示。
在一些实施方案中，所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法中所述棒状细菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-0912-1菌株。该菌株是以ATCC13032为出发菌，通过在lysC中引入点突变T311I，解除了天冬氨酸激酶的反馈抑制而获得(参见申请号为201610119394.1的中国专利)。本领域技术人员可以按照谷棒经典方法(C.glutamicumHandbook,Charpter 23)制备MHZ-0912-1感受态细胞。
在一些实施方案中，所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法中所述载体为pK18mobsacB。
在一些实施方案中，包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的重组载体以电穿孔方法转化MHZ-0912-1感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。
进一步的，在一些实施方案中，将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。10％蔗糖脑心浸液培养基上长出的菌株，在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为MHZ-0914-1、MHZ-0914-3、MHZ-0914-3、MHZ-0914-4。
本发明还提供了所述构建方法获得的棒状细菌。
利用本发明获得的棒状细菌进行发酵生产，可获得L-赖氨酸的有效积累，为L-赖氨酸的工业化生产奠定基础。因此本发明还提供了所述棒状细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。
在一些实施方案中，所述棒杆菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-1012-3。
进一步的，本发明还提供了一种L-赖氨酸的生产方法，将上述高产赖氨酸的棒状细菌接种发酵培养基发酵培养。
在本发明中，所述发酵培养基组分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO425g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，豆粕水解液10g/L，CaCO330g/L，pH7.0。
进一步的，在本发明中，所述发酵培养为33℃、培养14～15h。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用。本发明所述高产赖氨酸的棒状细菌，具有L-赖氨酸生产能力并且其细胞内L-赖氨酸合成途径和/或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子中的至少一种的活性增强。本发明所述高产赖氨酸的棒状细菌通过对赖氨酸生物合成途径或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子的序列进行修饰，使其具有相比内源启动子更高的活性，为RNA聚合酶提供可靠的初始结合位点，从而增强起始转录效率，进而提高其产赖氨酸的水平，提高L-赖氨酸菌株的生产能力。实验表明本发明所述棒状细菌为L-赖氨酸产率和转化率显著性提高，为L-赖氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为重组质粒pK18mobsacB-PlysCmut1的示意图；
图2为重组质粒pK18mobsacB-PlysCmut2的示意图；
图3为重组质粒pK18mobsacB-Ppycmut1的示意图；
图4为重组质粒pK18mobsacB-Ppycmut2的示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，本实验所述ATCC13032菌株为谷氨酸棒杆菌标准菌株，可以通过商业渠道购买获得。所述普通液体脑心浸液培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液，所述普通固体脑心浸液培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液和1.8％琼脂粉。
实施例中使用的引物序列信息如表1所示
表1、引物序列信息
实施例1、包含1型突变的lysC启动子的重组载体的构建及在谷氨酸棒杆菌中的引入
以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut1-1/PlysCmut1-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段PlysCmut1-up；以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut1-3/PlysCmut1-4引物对进行PCR扩增，得到片段PlysCmut1-dn。以上述二片段混合物为模板，以PlysCmut1-1/PlysCmut1-4引物对进行PCR扩增，得到含有目的突变的PlysCmut1片段。片段用BamHI、PstI进行双酶切，载体pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-lysCmut1。
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-0912-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-lysCmut1以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0914-1。
实施例2、包含2型突变的lysC启动子的重组载体的构建及在谷氨酸棒杆菌中的引入
以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut2-1/PlysCmut2-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段PlysCmut2-up；以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut2-3/PlysCmut2-4引物对进行PCR扩增，得到片段PlysCmut2-dn。以上述二片段混合物为模板，以PlysCmut2-1/PlysCmut2-4引物对进行PCR扩增，得到含有目的突变的PlysCmut2片段。片段用BamHI、PstI进行双酶切，载体pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-lysCmut2。
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-0912-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-lysCmut2以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0914-2。
实施例3、包含1型突变的pyc启动子的重组载体的构建及在谷氨酸棒杆菌中的引入
以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut1-1/PlysCmut1-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段Ppycmut1-up；以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut1-3/Ppycmut1-4引物对进行PCR扩增，得到片段Ppycmut1-dn。以上述二片段混合物为模板，以Ppycmut1-1/Ppycmut1-4引物对进行PCR扩增，得到含有目的突变的Ppycmut1片段。片段用BamHI、PstI进行双酶切，载体pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pycmut1。
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-0912-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-pycmut1以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0914-3。
实施例4、包含2型突变的pyc启动子的重组载体的构建及在谷氨酸棒杆菌中的引入
以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut2-1/PlysCmut2-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段Ppycmut2-up；以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut2-3/Ppycmut2-4引物对进行PCR扩增，得到片段Ppycmut2-dn。以上述二片段混合物为模板，以Ppycmut2-1/Ppycmut2-4引物对进行PCR扩增，得到含有目的突变的Ppycmut2片段。片段用BamHI、PstI进行双酶切，载体pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pycmut2。
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备MHZ-0912-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-pycmut2以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-0914-4。
实施例5、L-赖氨酸基因工程菌发酵生产L-赖氨酸
将实施例1至实施例4所构建基因工程菌株于500ml三角摇瓶中进行发酵培养，培养温度33℃，培养时间14～15小时，每组实验设置三个平行。所述发酵培养基组分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO425g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，豆粕水解液10g/L，CaCO330g/L，NaOH调pH＝7.0。
各基因工程菌株发酵产L-赖氨酸结果见表2。
表2各基因工程菌株发酵产L-赖氨酸结果
由表2可知，通过改变启动子-10区及-10区扩展序列，可以显著提高菌株的赖氨酸生产性能。MHZ-0914-1和MHZ-0914-2，相比出发菌株，其lysC启动子的-10区及其扩展序列发生了突变，所获得的突变型启动子具有更高的活性，因此可以增强lysC基因的表达。所获得的突变菌株进行摇瓶发酵测试，其赖氨酸产率(产酸、转化率)相比出发菌株，具有显著性提高。
MHZ-0914-3和MHZ-0914-4，相比出发菌株，其pyc启动子的-10区及其扩展序列发生了突变，所获得的突变型启动子具有更高的活性，因此可以增强pyc基因的表达。pyc基因编码的丙酮酸羧化酶催化丙酮酸转化为草酰乙酸，后者是赖氨酸生物合成的重要前体。所获得的突变菌株进行摇瓶发酵测试，其赖氨酸产率(产酸、转化率)相比出发菌株，具有显著性提高。
综上所述，通过改造赖氨酸合成相关基因lysC和pyc基因的启动子，可以大幅提高相应基因的表达活性，从而获得高转化率的赖氨酸生产菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 新疆梅花氨基酸有限责任公司
<120> 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用
<130> MP1721858
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 18
tgagtaaagg tgagctcctt agggagccat cttttggggt gcggagcgcg atccggtgtc 60
tgaccacggt gccccatgcg attgttaatg ccgatgctag ggcgaaaagc acggcgagca 120
gattgctttg cacttgattc agggtagttg actaaagagt tgctcgcgaa gtagcacctg 180
tcacttttgt ctcaaatatt aaatcgaata tcaatatatg gtctgtttat tggaacgcgt 240
cccagtggct gagacgcatc cgctaaagcc ccaggaaccc tgtgcagaaa gaaaacactc 300
ctctggctag gtagacacag tttattgtgg tataattgag cgggtaactg tcagcacgta 360
gatcgaaagg tgcacaaag 379
<210> 19
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 19
ttaagaggta agatgtctgc aggtggaagc gtttaaatgc gttaaacttg gccaaatgtg 60
gcaacctttg caaggtgaaa aactggggcg gggttagatc ctggggggtt tatttcattc 120
actttggctt gaagtcgtgc aggtcagggg agtgttgccc gaaaacattg agaggaaaac 180
aaaaaccgat gtttgattgg gggaatcgtg tggtataata ctaggacgca gtgactgcta 240
tcacccttgg cggtctcttg ttgaaaggaa taattactct a 281
<210> 20
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 20
ttaagaggta agatgtctgc aggtggaagc gtttaaatgc gttaaacttg gccaaatgtg 60
gcaacctttg caaggtgaaa aactggggcg gggttagatc ctggggggtt tatttcattc 120
actttggctt gaagtcgtgc aggtcagggg agtgttgccc gaaaacattg agaggaaaac 180
aaaaaccgat gtttgattgg gggaatcgtg tggtatgata ctaggacgca gtgactgcta 240
tcacccttgg cggtctcttg ttgaaaggaa taattactct a 281
Claims (6)
1.一种高产赖氨酸的棒状细菌，其特征在于，具有L-赖氨酸生产能力并且其细胞内L-赖氨酸合成途径和/或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子中的至少一种的活性增强；
所述关键酶为天冬氨酸激酶或丙酮酸羧化酶；所述活性增强是通过改变启动子-10区及其扩展序列增强启动子活性；
所述天冬氨酸激酶活性增强启动子的序列如SEQ ID No.17或SEQ ID No.18所示；所述丙酮酸羧化酶活性增强启动子的序列如SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示；
所述的棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。
2.权利要求1所述棒状细菌的构建方法，其特征在于，制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的基因片段，与载体连接获得重组载体，转化棒状细菌获得高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，所述棒状细菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-0912-1菌株；所述载体为pK18mobsacB；
所述制备包含活性增强启动子和关键酶的编码基因的方法具体为：
（1）ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut1-1/ PlysCmut1-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段PlysCmut1-up；以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut1-3/ PlysCmut1-4引物对进行PCR扩增，得到片段PlysCmut1-dn；以上述二片段混合物为模板，以PlysCmut1-1/ PlysCmut1-4引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的突变的PlysCmut1片段；或
（2）以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut2-1/ PlysCmut2-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段PlysCmut2-up；以ATCC 13032基因组为模板，以PlysCmut2-3/ PlysCmut2-4引物对进行PCR扩增，得到片段PlysCmut2-dn；以上述二片段混合物为模板，以PlysCmut2-1/ PlysCmut2-4引物对进行PCR扩增，得到包含活性增强启动子和天冬氨酸激酶的编码基因的突变的PlysCmut2片段；或
（3）以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut1-1/ PlysCmut1-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段Ppycmut1-up；以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut1-3/ Ppycmut1-4引物对进行PCR扩增，得到片段Ppycmut1-dn；以上述二片段混合物为模板，以Ppycmut1-1/ Ppycmut1-4引物对进行PCR扩增，得到所述包含活性增强启动子和丙酮酸羧化酶的编码基因的突变的Ppycmut1片段；或
（4）以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut2-1/ PlysCmut2-2引物对进行PCR扩增，得到上游片段Ppycmut2-up；以ATCC 13032基因组为模板，以Ppycmut2-3/ Ppycmut2-4引物对进行PCR扩增，得到片段Ppycmut2-dn；以上述二片段混合物为模板，以Ppycmut2-1/ Ppycmut2-4引物对进行PCR扩增，得到所述包含活性增强启动子和丙酮酸羧化酶的编码基因的突变的Ppycmut2片段；
所述PlysCmut1-1的序列如SEQ ID No.1所示；
所述PlysCmut1-2的序列如SEQ ID No.2所示；
所述PlysCmut1-3的序列如SEQ ID No.3所示；
所述PlysCmut1-4的序列如SEQ ID No.4所示；
所述PlysCmut2-1的序列如SEQ ID No.5所示；
所述PlysCmut2-2的序列如SEQ ID No.6所示；
所述PlysCmut2-3的序列如SEQ ID No.7所示；
所述PlysCmut2-4的序列如SEQ ID No.8所示；
所述Ppycmut1-1的序列如SEQ ID No.9所示；
所述Ppycmut1-2的序列如SEQ ID No.10所示；
所述Ppycmut1-3的序列如SEQ ID No.11所示；
所述Ppycmut1-4的序列如SEQ ID No.12所示；
所述Ppycmut2-1的序列如SEQ ID No.13所示；
所述Ppycmut2-2的序列如SEQ ID No.14所示；
所述Ppycmut2-3的序列如SEQ ID No.15所示；
所述Ppycmut2-4的序列如SEQ ID No.16所示。
4.权利要求2或3所述构建方法获得的谷氨酸棒杆菌。
5.权利要求1或4所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。
6.一种L-赖氨酸的生产方法，其特征在于，权利要求1或4所述谷氨酸棒杆菌接种发酵培养基发酵培养。
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