CN110407938B

CN110407938B - 抗tim-3单克隆抗体、表达载体及其应用

Info

Publication number: CN110407938B
Application number: CN201910738072.9A
Authority: CN
Inventors: 赵健; 郎小玲; 耿树生
Original assignee: Beijing Zhaoderivative Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhaoderivative Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2039-08-12
Also published as: CN110407938A

Abstract

本发明公开了一种抗TIM‑3单克隆抗体、表达载体及其应用，本发明的单克隆抗体能特异性与TIM‑3蛋白结合，与抗PD‑1抗体联合应用产生协同增效作用。本发明的抗体可以用于治疗肿瘤，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

抗TIM-3单克隆抗体、表达载体及其应用

技术领域

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗TIM-3单克隆抗体、表达载体及其应用。

背景技术

TIM-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulindomainand Mucin domain protein，Tim)家族成员。由于Tim家族广泛参与了机体的免疫调节过程，其功能正日益受到人们的重视。TIM-3特异性表达于活化的Th1、Th17效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9，Gal-9)为TIM-3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，Gal-9与Th1、Th17细胞上的Tim-3分子特异性结合，可引发后者的调亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。目前，研究证实TIM-3分子主要通过调节不同CD4+T细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过程。

目前的研究证实TIM-3表达的异常与许多疾病有密切的关系，如研究发现HIV，HCV感染的患者以及一些肿瘤患者，其T细胞上TIM-3表达升高，由于TIM-3能介导T效应细胞的调亡，传递负性调节信号，可导致机体的免疫功能瘫痪。任何阻断TIM-3/Gal-9结合的因素均可以使Th1、Th17细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能。

一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或TIM-3表达的升高，导致Th1细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断TIM-3/Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。如给哮喘模型动物注射抗TIM-3抗体或重组TIM-3融合蛋白均能通过阻断TIM-3/Gal-9结合，增强Th1细胞活性，纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Th1/Th2细胞平衡。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断TIM-3的活性增强了体内Th1效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明TIM-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用。

上述研究资料表明，TIM-3通路具有重要的免疫调节功能，其表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。但目前国内外均无TIM-3靶点的药物获批上市。医药魔方全球新药数据库显示全球共有13种抗TIM-3抗体的在研项目，研发进展最快的是TESARO的TSR-022，目前处于II期临床，礼来、诺华、罗氏均在此靶点有所布局，而我国在此方面研究要落后于国外，因此我们亟需建立和发展具有自主知识产权的抗TIM-3抗体及其相关的检测产品，以提高我国抗体药物的国际地位。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种特异性结合TIM-3的单克隆抗体，具有高效和安全的特点。

本发明的目的之二在于提供上述抗体的重链、轻链或其片段。

本发明的目的之三在于提供编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或其片段，以及插入这些核酸分子以用于重组表达上述抗体的重组载体和重组细胞。

本发明的目的之四在于提供上述单克隆抗体的制备方法和用途。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种特异性结合TIM-3的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR1具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

优选地，重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQID NO:6所示的氨基酸序列。

进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的单克隆抗体结合性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。

本发明的单克隆抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与上述单克隆抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。

进一步，所述单克隆抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。

F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。

Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

本发明的公开的单克隆抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。

本发明的单克隆抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。

本发明的单克隆抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化，从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)基团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。

本发明还提供了编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述核酸分子包括编码单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体重链的核苷酸序列，或编码单克隆抗体轻链的核苷酸序列。

本发明的编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。

具体地，编码重链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:9所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:10所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:11所示，编码重链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:12所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如SEQ IDNO:13所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:15所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含前面所述的核酸分子，此外，还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

在本发明的具体实施例中，重组载体是将前面所述的核酸分子插入ZY-CDMO载体中构建而成。

本发明还提供了前面所述的重组载体的构建方法，所述方法包括将前面所述的核酸分子插入ZY-CDMO载体中。

具体的，本发明的重组载体的构建方法如下所示：

通过常规PCR在抗体轻链可变区的5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入XbaI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的EcoRI和XbaI之间；在抗体重链可变区的5’端引入HindIII酶切位点，在3’端引入PmeI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的HindIII和PmeI之间，构建获得重组载体。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中导入了前面所述的核酸分子或转染了前面所述的重组载体。

本发明中“重组细胞”一词指的是导入核酸分子或载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞的动物细胞。

在本发明的具体实施方案中，所述重组细胞是CHO细胞。

本发明还提供了一种利用前面所述的重组细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的重组细胞并回收所述抗体。

本发明还提供了一种通过上述方法产生的抗体或抗原结合片段。

本发明还提供了一种检测产品，所述检测产品包括本发明前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是能够检测出TIM-3表达量的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物还可包括治疗有效量的以下抗体中的至少一种：抗T细胞膜上的负性免疫调节分子的抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。

T细胞膜上的负性免疫调节分子包括CD25、Foxp3、CTLA-4、GITR。

在本发明的具体实施例中，抗PD-1抗体是nivolumab。

进一步，所述药物组合物还包括可药用载体或稀释剂。可以用任何适当的药用载体施用根据本发明的药物组合物用于治疗。

用于肠胃外给药和局部给药时，本发明的药物组合物包括无菌水或非水溶剂、悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油、和可注射的有机酯。水性载体包括水、水-乙醇溶液，其中包括盐和缓冲的一般肠胃外载体，其包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏液、或非挥发性油。静脉载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如那些基于林格氏葡萄糖等的电解质补充剂。组合物可能包括其它赋形剂，如稳定化试剂或防腐剂。实用的稳定赋形剂包括表面活性剂(聚山梨酯20&80、泊咯沙姆407)、聚合物(聚乙二醇，聚乙烯吡咯酮)、糖类(蔗糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖)、醇(山梨醇，甘油丙二醇，乙二醇)、适当的蛋白质(白蛋白)、合适的氨基酸(甘氨酸，谷氨酸)、脂肪酸(乙醇胺)、抗氧化剂(抗坏血酸，半胱氨酸等)、螯合剂(EDTA盐类、组氨酸、天门冬氨酸)或金属离子(钙、镍、镁、锰)。有用的防腐剂有苯甲醇、氯代丁醇、苯扎氯铵，也可使用对羟基苯甲酸酯类。

可以以浓缩的形式或者以粉末的形式以根据需要重构提供根据本发明的药物组合物。这样的粉剂可以使用上述赋形剂。在冷冻干燥的情况下，某些冷冻保护剂是优选的，其包括聚合物(聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。

本发明的药物组合物可以与其他抗肿瘤药联合使用，所述的抗肿瘤药物包括目前经过FDA批准的所有抗肿瘤药。

所述的抗肿瘤药包括经FDA批准的药物或未批准的药物。

所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。

所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。

所述的抗肿瘤药还包括RNA药物、蛋白或多肽药物、抗体药物、基因治疗药物。

靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测TIM-3蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取含有TIM-3蛋白的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的特异性结合TIM-3蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测TIM-3蛋白表达量的产品中的应用。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。

本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的用途，所述用途包括以下任一项：

(1)在制备前面所述的检测产品中的应用；

(2)在制备前面所述的药物组合物中的应用；

(3)在制备阻断TIM-3与TIM-3的配体结合的药物中的应用；

(4)在制备调节TIM-3活性或水平的药物中的应用；

(5)在制备解除PD-1对机体免疫抑制的药物中的应用；

(6)在制备激活T细胞的药物中应用；

(7)在制备促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物中的应用；

(8)在制备逆转抗PD-1免疫治疗获得性耐药的药物中的应用；

(9)在制备增强抗肿瘤免疫反应的药物中的应用；

(10)在制备逆转机体外周耐受的药物中的应用；

(11)在制备抗肿瘤药物中的应用；

(12)在制备治疗免疫障碍的药物中的应用。

本发明还提供了前面所述的药物组合物的用途，所述用途包括以下任一项：

(1)在制备激活T细胞的药物中应用；

(2)在制备促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物中的应用；

(3)在制备解除PD-1对机体免疫抑制的药物中的应用；

(4)在制备逆转抗PD-1免疫治疗获得性耐药的药物中的应用；

(5)在制备增强抗肿瘤免疫反应的药物中的应用；

(6)在制备逆转机体外周耐受的药物中的应用；

(7)在制备抗肿瘤药物中的应用；

(8)在制备治疗免疫障碍的药物中的应用。

本文所用术语“免疫障碍”是指机体免疫抑制。可用于本发明的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、肿瘤和感染性疾病。

本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或本发明的药物组合物可以用于治疗的肿瘤种类没有特别限制，任何实体的、非实体的、恶性的或良性的肿瘤均包括在本发明的范围之内。肿瘤的实例包括但不限于：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。

本发明前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段可以以化学方法或者通过基因工程与其他因子缀合。这些因子提供将抗体靶向所需功能位点的作用或者为抗体提高或提供其他性能。

根据本发明的单克隆抗体可以以化学方法或者通过基因工程标记，以提供可检测的抗体。

本发明的“治疗”意在包括为受治疗者施用特异性结合TIM-3的单克隆抗体，其目的包括改善、治疗肿瘤。

本发明的“治疗有效量”是指对肿瘤的有害影响至少有所改善的水平。本领域技术人员能很容易地确定本发明的单克隆抗体的给药量和方案。

本发明的“TIM-3”、“TIM-3蛋白”、“TIM-3抗原”通用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种新的特异性结合TIM-3的单克隆抗体，该抗体具有亲和力高，无副作用，成本低廉，成分清晰，实现生产标准化，质量控制简单等竞争优势。

附图说明

图1显示ZY-CDMO载体的物理图谱；

图2显示利用ELISA检测抗体亲和活性的结果图；

图3显示利用ELISA检测抗体对T细胞分泌IFN-γ的影响的统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 抗TIM-3抗体表达载体的构建

前期经过噬菌体抗体库筛选获得与TIM-3抗原结合力较强的几个抗体，本申请研究的是其中一个抗体。

(1)利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列(抗体的重链可变区序列如SEQID NO:12所示)、轻链可变区序列(抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO:16所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入ZY-CDMO载体中，ZY-CDMO载体图谱如图1所示。

具体操作如下：通过常规PCR在轻链可变区的5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入XbaI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的EcoRI和XbaI之间；在重链可变区的5’端引入HindIII酶切位点，在3’端引入PmeI酶切位点，插入到ZY-CDMO载体的HindIII和PmeI之间，构建获得真核表达载体。

实施例2 抗TIM-3抗体的表达与纯化

于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度0.5×10⁶cells/ml的CHO细胞，当细胞密度生长至2×10⁶cells/ml以上，细胞活率95％以上，细胞以1×10⁷cells/ml密度接种于电转缓冲液，将40μg质粒加入电击杯中，再加入0.7ml细胞悬液，最后补入电转缓冲液至0.8ml，轻轻混匀，不要产生气泡。在300V，900μF的条件下电击一次，将电击杯置于冰盒中冰浴5min，稀释到6ml培养基中在37℃CO₂培养箱中恢复48h，向种子培养基中加入75μM MSX接种96孔板并进行克隆筛选，通过有限稀释方法分单克隆细胞至96孔板内，37℃，5％CO₂培养箱培养，待细胞扩增至一定数量，进行ELISA验证，挑选阳性克隆依次放大到24孔板、6孔板、T25方瓶。经过6～8周的培养及筛选，获得能够高效表达抗TIM-3抗体的单克隆细胞株。

单克隆细胞株经过筛选培养基多步扩大培养，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，持续2周后，离心收集细胞于125ml摇瓶中，于37℃、5％CO₂、转速125rpm的摇床中进行FedBatch培养12天，期间在第3、5、7、9天分别补加初始体积的10％补料培养基，并维持葡萄糖浓度3g/L-5g/L，培养结束后收获上清，将上清进行纯化。采用AKTA(GE公司)进行抗TIM-3抗体的分离纯化。首先收集过Protein A亲和层析柱(MabSelect SuRe)pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至8.0，上样到阴离子交换层析柱(Q-Sepharose FF)，280nm进行监控和收集样品。将收集液pH值调节至5.5，上样到阳离子交换层析(Poros)收集样品，超滤浓缩后获得抗TIM-3的抗体。

实施例3 抗TIM-3的抗体对TIM-3抗原的亲和活性检测

利用ELISA检测亲和力，具体步骤如下：

包被：取ELISA平板用pH9.6包被液稀释靶蛋白人TIM-3(Sino Biological，10390-H08H)至0.5μg/ml，100μl/孔在湿盒中4℃包被过夜。

弃去孔中液体，并倒置平板在纸巾上拍干残留液体，加入洗涤液(0.1％PBST)300μl/孔洗3次。

封闭：加入封阻液(2％M-PBS)300μl/孔37℃静置1.0h。

加入一抗：用DPBS将抗TIM-3抗体稀释成1mg/ml，再依次进行10倍稀释，共7个浓度梯度，将稀释后的样品加入对应孔中，100μl/孔，37℃静置1.0h。

同时加入DPBS作为阴性对照。稀释方式如下：

羊抗人-HRP二抗：用DPBS按1:3000稀释，100μl/孔，37℃静置1.0h。

显色：TMB显色，100μl/孔，室温显色10min。

终止：2N H₂SO₄100μl/孔，酶标仪测OD450nm。

结果：

结果图2所示，本发明抗TIM-3抗体的EC50为0.03046μg/ml。

实施例4 抗TIM-3抗体与TIM-3抗原的亲和动力学

使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体与TIM-3抗原的结合动力学和亲合力。除非另有说明，可以从GE公司购买所有试剂和材料，并且可以在25℃下进行测量。亲和力分析通过SPR(Biacore T200)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在CM5芯片偶联抗人IgG Fc的抗体，将待测抗体在以30μL/min的流速流入，用偶联于芯片上的抗人IgG Fc的抗体捕获待测抗体；分析物(TIM-3)梯度稀释后(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和0nM)，以流速30μL/min的流速流入，待测抗体与分析物结合时间120s，解离时间1200s；整个实验用HBS-EP作为运行缓冲液，芯片用10mM甘氨酸HCl、pH2.1溶液60秒脉冲进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数KD。

结果：测定的平衡解离常数KD为6.41×10^-9M。

实施例5 抗TIM-3抗体对免疫细胞分泌INF-γ的影响

用人的淋巴细胞分离液从300mL新鲜血液的血细胞中分离人外周血单核细胞(PBMC)，用单核细胞磁珠分选试剂盒(美天旎公司，货号130-117-337)从PBMC中分离单核细胞。将分离得到的单核细胞以2.5×10^4/孔种于96孔板，培养基为10％血清、250U/mL humanGM-CSF和500U/mL human IL-4的1640培养基中，每三天更换一次培养基，培养七天，在第七天单核细胞分化为了树突状细胞(DC细胞)。

同时在第七天从另一份新鲜血液的PBMC中用CD4+T细胞磁珠分选(抗生物素磁珠(美天旎公司货号:130-091-153)及MS分选柱(美天旎公司货号:130-042-201))分离CD4+T细胞。将2×10⁵/孔的CD4+T细胞与树突状细胞按照5：1的比例充分混匀，并接种至96孔细胞培养板中，同时分别加入10μg/mL抗TIM-3抗体及0μg/mL、2μg/mL nivolumab抗体，培养五天后，收集上清，用IFN-γ检测试剂盒(购自BioLegend公司，货号430104)检测上清中IFN-γ的表达。

PBMC的分离步骤如下：

(1)从抽取300mL新鲜血液(加入肝素抗凝)，加入等体积的生理盐水稀释。

(2)向15mL离心管中加入5mL的人外周血淋巴细胞分离液，然后将稀释好的血液缓慢加到淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心20min。

(3)离心后用吸管将白膜层吸出至加有10mL生理盐水的试管中，1500rpm离心10min，重复两次。

(4)显微镜下计数，并进行下一步实验。

单核细胞的磁珠分选步骤如下：

(1)每10⁷个PBMC细胞加入30μL分选Buffer重悬，加入10μL FcR BlockingReagent和10μL Biotin-Antibody Cocktail充分混匀，冰上避光孵育10min。

(2)每10⁷个PBMC细胞加入30μL分选Buffer和20μL Anti-Biotin MicroBeads充分混匀，冰上避光孵育15min。

(3)加入2mL/10⁷个细胞的分选Buffer，300g离心10min。

(4)加入500μL/10⁸个细胞的分选Buffer重悬细胞，准备好分离珠，放到磁极上，用300mL分选Buffer清洗分离柱。把细胞悬液加入柱子中。

(5)收集留下来的细胞液体，用3mL分选Buffer洗柱子两次。

CD4+T细胞的磁珠分选步骤如下：

(1)每10⁷个PBMC细胞加入40μL分选Buffer重悬，加入10μL CD4+T Cell Biotin-Antibody Cocktail，冰上孵育5min。

(2)每10⁷个PBMC细胞加入30μL分选Buffer和20μL CD4+T Cell MicroBeadCocktail充分混匀，冰上避光孵育10min。

(3)准备好分离珠，放到磁极上，用300mL分选Buffer清洗分离柱。把细胞悬液加入柱子中。

(4)收集流下来的细胞液体，用3mL分选Buffer洗柱子三次。

IFN-γ的ELISA检测步骤如下：

(1)每孔加入100μL稀释好的Capture Antibody，密封ELISA板子，4℃孵育过夜。

(2)洗板机洗板4次，每孔加入200μL的1×Assay Diluent A，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育1h。

(3)洗板机洗板4次，每孔加入100μL稀释好的标准品和检测样品，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育2h。

(4)洗板机洗板4次，每孔加入100μL稀释好的Detection Antibody，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育1h。

(5)洗板机洗板4次，每孔加入100μL稀释好的Avidin-HRP，密封ELISA板子，在摇床上室温孵育30min。

(6)洗板机洗板5次，每孔加入100μL混合好的TMB显色液，避光孵育20min。

(7)每孔加入100μL Stop Solution，放在酶标板上450nm处读取ELISA板吸光度值。

结果

结果如图3所示，以人IgG作为阴性对照组，抗TIM-3抗体可显著增强CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力，而且，抗TIM-3抗体与nivolumab协同作用的效果优于单独使用抗TIM-3抗体和nivolumab的效果之和。本结果说明本发明的抗体能够和PD-1抗体大幅度协同激活T细胞显著分泌INF-γ。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京昭衍生物技术有限公司

<120> 抗TIM-3单克隆抗体、表达载体及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Gly Ser Phe Ser Arg Gly Gly Tyr Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Asp His Tyr Thr Ser Ser Tyr Asn Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ser Val Gln Ser Tyr Ile

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Ala Ser Gln Arg Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Arg Phe Ser Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Arg Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp His Tyr Thr Ser Ser Tyr Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Ser Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Ser Gln Arg Ser Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe Ser Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcggcagct ttagccgcgg cggctattat 30

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atttattata gcggcagcac c 21

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgcgcgatc attataccag cagctataac tatgattat 39

<210> 12

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggtgcagc tgcaggaaag cggcccgggc ctggtgaaac cgggcgaaac cctgagcctg 60

acctgcgccg tgagcggcgg cagctttagc cgcggcggct attattggaa ctggattcgc 120

cagccgccgg gcaaaggcct ggaatggatt ggctatattt attatagcgg cagcaccaac 180

tataacccga gcctgaaaag ccgcgtgacc attagcctgg ataccagcaa aaaccagttt 240

agcctgaaac tgagcagcgt gaccgcggaa gataccgcgg tgtattattg cgcgcgcgat 300

cattatacca gcagctataa ctatgattat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360

agc 363

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaagcgtgc agagctatat a 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aatgcgagcc aacgctcc 18

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagcagcgct tctcctggcc gccgacc 27

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60

ctgagctgcc gcgcgagcga aagcgtgcag agctatatag cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggccaggcgc cgcgcctgct gatttataat gcgagccaac gctccaccgg cattccggcg 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag cgcttctcct ggccgccgac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

Claims

1.一种特异性结合TIM-3蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.编码权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，编码重链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:9所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:10所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:11所示，编码重链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:12所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:13所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:15所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:16所示。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求3或4所述的核酸分子。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中导入了权利要求3或4所述的核酸分子，或转染了权利要求5所述的重组载体。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、治疗有效量的以下抗体中的至少一种：抗T细胞膜上的负性免疫调节分子的抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，T细胞膜上的负性免疫调节分子包括CD25、Foxp3、CTLA-4、GITR。

10.一种检测TIM-3的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

11.一种非诊断目的的检测TIM-3蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取含有TIM-3蛋白的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

12.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的应用，所述应用包括以下任一项：

(1)在制备权利要求10所述的检测产品中的应用；

(2)在制备权利要求7-9中任一项所述的药物组合物中的应用；

(3)在制备阻断TIM-3与TIM-3的配体结合的药物中的应用；

(4)在制备调节TIM-3活性或水平的药物中的应用；

(5)在制备促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物中的应用。

13.权利要求7-9中任一项所述的药物组合物在制备促进T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物中的应用。