CN110343179A - 结合淋巴细胞活化基因-3(lag-3)的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗体，具体公开了一种结合淋巴细胞活化基因‑3(LAG‑3)的抗体，其具有显著改善的抑制LAG‑3与主要组织相容性(MHC)II类分子之结合的作用。本发明还涉及该抗体在疾病治疗中的用途。

Description

结合淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗体领域，同时涉及该抗的用途和制备方法。具体地，本发明涉及一种结合淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的抗体和其在疾病治疗中的用途。

背景技术

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3)，即LAG-3，也称CD223，是免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白。分子量为70KDa，定位于人12号染色体(20p13.3)。该膜蛋白含有四个胞外免疫球蛋白超家族结构域：一个V区和三个C2区。与CD4分子比较，它们在染色体的定位相似,而且两个分子含有部分共同氨基酸(<20％)。因此有科学家认为为它们可能是由同一基因进化而来^[1]。编码LAG-3的DNA有8个外显子。该分子胞外区由D1、D2、D3和D44个部分组成。在D1区有一个由30个氨基酸组成的环状结构,具有特异性。此外,D1属于V系免疫球蛋白超家族,而D2、D3和D4属于C2系免疫球蛋白超家族。在D1与D3区域，D2与D4区域，有很多氨基酸序列是一致的，可能是由2个IgSF区域基因复制而成4个区域。胞质区由3部分组成：(1)丝氨酸磷酸化位点S454，可能类似于CD4的蛋白激酶C位点；(2)保守的KIEELE基序,不同于任何其他已知的蛋白；(3)重复的EP序列^[2]。

大部分LAG-3通过D1区形成的二聚体形式表达于细胞膜。成熟的LAG-3可以在细胞膜上断裂为相对分子质量为54000的可溶性部分p54(由D1、D2和D3组成)和16000跨膜-胞质部分p16^[3]。完整的LAG-3分子断裂是一种发生在D4区域和跨膜区之间的20个氨基酸的连接肽的蛋白溶解反应。胞膜上LAG-3分子断裂为可溶性分子,受跨膜基质金属蛋白酶类AMAD10和AMAD17的调控,TCR信号传导途径在这两种调节方式中起着重要的作用^[4]。

LAG-3分子主要表达于活化的NK细胞、T淋巴细胞表面，与HLA-II高亲和力结合，参与淋巴细胞的活化^[5,2]。LAG-3负调控T淋巴细胞的增殖活化和T细胞的动态平衡^[6]，LAG-3的异位表达也参与T细胞的调节活动。Workman^[7]等研究发现LAG-3缺乏的老年小鼠体内T细胞的数量是野生型的2倍，CD4⁺CD8⁺LAG-3^-的T细胞能增强淋巴细胞增殖和维持稳态，这种功能在野生型已因LAG-3的异位表达而终止。此外，用抗LAG-3单克隆抗体进行体内治疗，与LAG-3缺乏的细胞相比可以明显增强T细胞的增殖。Workman^[8]等通过实时荧光定量PCR研究发现，LAG-3在类浆细胞性树突状细胞表面的表达是调节性T细胞或活化的效应T细胞表面表达的10倍，表明LAG-3分子可能在类浆细胞性树突状细胞的生物学功能中发挥着重要的作用。

Th1细胞表达LAG-3,而Th2细胞并不表达或低表达。IL-12具有最大刺激LAG-3分子表达潜能^[9]。LAG-3分子负调节T细胞扩增和控制记忆性T细胞池^[10]。此负调节功能与LAG-3:M HC II类分子的结合是密不可分的,并且需要通过其胞质区域结构的信号传导，尤其是与高度保守的KIEELE序列关系最为密切。这种调节功能不是与CD4分子竞争性的结合MHCII类分子。因此，LAG-3是一种独立的负调节分子^[2]。

LAG-3负调节CD4⁺T细胞,在LAG-3:MH C II分子相互作用下,通过其胞内信号传导，抑制CD4Th1细胞增殖和细胞因子的分泌(IFN-γ、IL-2和TNF等)。但抗LAG-3抗体可以恢复其功能,促使细胞增殖与相关因子分泌^[11]。

LAG-3分子也负调节CD8⁺T细胞的活性,在小鼠的实验中,通过抑制LAG-3分子可以增加CD8⁺T细胞的增殖，也可以增加其细胞毒性活性,IFN-γ明显增加,同时对CD8⁺T细胞是直接的调节作用。在LAG-3与CD8⁺T细胞的作用过程中，并不需要CD4⁺T细胞的参与^[2,11]。

LAG-3分子对CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg细胞)的抑制功能也具有直接的调节作用^[11,12],是T reg细胞行使功能所必需的分子。抗LAG-3抗体可以明显地抑制Treg细胞的功能,而且与细胞功能的最大化程度密切相关。抗LAG-3抗体还可以通过抑制Treg细胞功能,使效应性T细胞扩增,但不能促使Treg细胞凋亡^[13]。同时,效应性T细胞可以增加LAG-3分子在Tr eg细胞的表达,且呈剂量依赖性。此外,异位表达的LAG-3同样与T reg细胞的调节功能相关联。由此可见LAG-3对淋巴细胞内环境的稳定起着非常重要的作用^[14]。此外,Liang等^[15]发现,Treg细胞可以通过其表面的LAG-3分子与树突状细胞膜上的MH C II分子之间的细胞-细胞接触作用,通过胞质信号传导,抑制树突状细胞的成熟。并且此作用需要免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)途径的介导参与。

在肿瘤发展过程中,肿瘤特异性CD8⁺T细胞虽然在肿瘤组织中细胞数量增加但其功能部分丧失,如果使用抗LAG-3抗体或去除LAG-3基因,可以恢复CD8⁺T细胞的功能。增加CD8⁺T细胞的数量和其细胞毒性,其细胞因子分泌也增加。此外,在阻滞LAG-3功能作用后,肿瘤组织中细胞毒性T淋巴细胞数量和功能明显增加,且肿瘤生长被抑制,因此认为抑制LAG-3分子表达可以恢复淋巴细胞免疫功能具有抑制肿瘤的发展。Gandhi等^[13]发现在霍杰金淋巴瘤患者的肿瘤组织和外周血中,LAG-3在淋巴细胞高表达。肿瘤组织中特异性CD8⁺T细胞的功能明显受损,与高表达LAG-3和/或Fo xP3的CD4⁺CD25⁺T细胞数量呈负相关。如果去除LAG-3⁺T细胞,发现特异性CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能可以恢复,细胞因子分泌增加。所以，LAG-3的表达与特异性T细胞的免疫负调节功能相关,抑制LAG-3分子功能可以增强特异性CD8⁺T细胞的抗肿瘤作用,该分子有可能是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点。

慢性病毒感染性疾病时常常发生T细胞衰竭。Blackburn^[16]等研究发现CD8+T细胞的衰竭受多种抑制性受体共表达的负性调控。衰竭的CD8+T细胞可表达7个抑制性受体。多种不同的抑制性受体共表达与T细胞衰竭及更严重的感染密切相关^[17]，对T细胞抑制性受体PD-1和LAG-3的阻断，可协同提高T细胞反应和降低体内病毒载量。Konnai^[18]等对感染了牛白血病病毒的牛体内的细胞的LAG-3表达进行分析，发现与LAG-3⁺CD8⁺细胞和LAG-3⁺CD3⁺细胞结合的MHCⅡ类分子显著高于对照组动物。与对照组和无症状组牛相比，持续病毒感染的牛外周血单个核细胞上LAG-3分子的平均荧光强度明显增高。而PD-1和LAG-3的阻断实验表明，在病毒持续感染的牛外周血单个核细胞中增加PD-1和LAG-3抗体可上调INF-γ和IL-2的表达。上述发现表明当感染病毒时，T细胞通过LAG-3分子的限制作用和MHCⅡ类信号分子的表达发挥其抑制功能，LAG-3有可能也是病毒免疫治疗的靶点。

发明内容

发明概述

本发明涉及以下各项：

1.一种结合淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的抗体，其中该抗体具有显著改善的抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子之结合的作用。

2.项1的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含如下的氨基酸序列：

序列41、序列45、序列49、序列53、序列57、序列61、序列75或序列77；

轻链可变区包含如下的氨基酸序列：

序列43、序列47、序列51、序列55、序列59或序列63。

3.权利要求1或2的抗体，包含如下的重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)氨基酸序列41和43；

(2)氨基酸序列45和47；

(3)氨基酸序列49和51；

(4)氨基酸序列53和55；

(5)氨基酸序列57和59；

(6)氨基酸序列61和63；

(7)氨基酸序列75和43；或

(8)氨基酸序列77和43。

4.权利要求1-3任一项的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列41，轻链可变区包含氨基酸序列43。

5.一种分离的抗LAG-3抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含：

(a)重链可变区CDR1，包含序列SYGIS(序列88)；

(b)重链可变区CDR2，包含序列WISAYNGNTNYAQKLQG(序列89)；和

(c)重链可变区CDR3，包含序列DGWWELLRPDDAFDI(序列90)；

轻链可变区包含：

(d)轻链可变区CDR1，包含序列SGDKLGDKYAY(序列91)；

(e)轻链可变区CDR2，包含序列YDSDRPS(序列92)；和

(f)轻链可变区CDR3，包含序列QVWDSSSDQVV(序列93)。

6.权利要求5的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(1)重链可变区包含氨基酸序列41，轻链可变区包含氨基酸序列43；

(2)重链可变区包含氨基酸序列75，轻链可变区包含氨基酸序列43；和

(3)重链可变区包含氨基酸序列77，轻链可变区包含氨基酸序列43。

7.项1-6任一项所述的抗体，其为单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

8.项1-7任一项所述的抗体，其为结合LAG-3的抗体片段。

9.项8的抗体，其中所述抗体片段为Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')₂片段。

10.项1-7任一项所述的抗体，其为全长抗体。

11.项1-7任一项所述的抗体，其为IgG抗体。

12.项1-11任一项所述的抗体，其为单特异性抗体。

13.项1-11任一项所述的抗体，其为多特异性抗体。

14.项13所述的抗体，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。

15.项14的抗体，其中所述双特异性抗体包含结合第二生物分子的第二结合域，其中所述第二生物分子为细胞表面抗原。

16.项15所述的抗体，其中所述细胞表面抗原为肿瘤抗原。

17.一种药物组合物，包括项1-16任一项的抗体以及药学上可接受的载体。

18.一种免疫缀合物，包括与项1-16任一项的抗体连接的治疗剂。

19.项18的免疫缀合物，其中所述治疗剂为细胞毒性剂。

20.包含项18或19的免疫缀合物的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

21.一种制品，包含内装有项17或20的药物组合物的容器和包装插页，其中所述包装插页说明该药物组合物的用法。

22.项21的制品，还包含内装有一种或多种其它药物的一个或多个容器。

23.项22的制品，其中所述其它药物选自如下的一种或多种：免疫刺激性抗体、化疗剂和抗病毒药物。

24.一种分离的核酸，其编码项1-16中任一项所述的抗体。

25.一种载体，其包含项24的分离的核酸。

26.一种宿主细胞，其包含项25所述的载体。

27.项26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

28.项27所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

29.一种制备项1-16中任一项所述的抗体的方法，包括培养项26-28任一项所述的宿主细胞。

30.项29所述的方法，进一步包括自所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗体或结合LAG-3的抗体片段。

31.一种刺激抗原特异性T细胞应答的方法，该方法包括使所述T细胞与项1-16任一项所述的抗体接触，从而刺激抗原特异性T细胞应答。

32.一种在受试者中刺激免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者项1-16任一项所述的抗体，从而刺激该受试者的免疫反应。

33.项32的方法，其中所述受试者为携带肿瘤的受试者，并且给予该受试者项1-16任一项所述的抗体刺激了针对该肿瘤的免疫反应。

34.项32的方法，其中该受试者为携带病毒之受试者，并且给予该受试者项1-16任一项所述的抗体刺激了针对该病毒的免疫反应。

35.一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予该受试者项1-16任一项所述的抗体。

36.一种治疗受试者中病毒感染的方法，该方法包括给予该受试者项1-16任一项所述的抗体。

37.项31-36任一项的方法，其中所述项1-16任一项所述的抗体与一种或多种其它药物联合使用。

38.项37的方法，其中所述其它药物选自如下的一种或多种：免疫刺激性抗体、抗癌药物或抗病毒药物。

39.项38的方法，其中所述免疫刺激性抗体选自如下的一种或多种：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体和抗CTLA-4抗体。

40.项1-16任一项所述的抗体在制备刺激抗原特异性T细胞应答的药物中的用途。

41.项1-16任一项所述的抗体在制备在受试者中刺激免疫反应的药物中的用途。

42.项41的用途，其中所述受试者为携带肿瘤的受试者，并且给予该受试者项1-16任一项所述的抗体刺激了针对该肿瘤的免疫反应。

43.项42的用途，其中该受试者为携带病毒之受试者，并且给予该受试者项1-16任一项所述的抗体刺激了针对该病毒的免疫反应。

44.项1-16任一项所述的抗体在制备抑制受试者中肿瘤细胞生长的药物中的用途。

45.项1-16任一项所述的抗体在制备治疗受试者中病毒感染的药物中的用途。

46.项40-45任一项的用途，其中所述项1-16任一项所述的抗体与一种或多种其它药物联合使用。

47.项46的用途，其中所述其它药物选自如下的一种或多种：免疫刺激性抗体、抗癌药物或抗病毒药物。

发明详述

1.定义

本文中的术语“抗体”以广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要其展现与LAG-3结合活性即可。

如本文中所使用的术语“单克隆抗体”是指获自实质上均质的抗体的群体的抗体，即构成该群体的个别抗体为同一的和/或结合相同的表位，但除去可能的变异抗体，其例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备过程中出现的突变，此类变体一般以微量存在。与典型地包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体针对抗原上的单一表位。因而，修饰语“单克隆”是指抗体的特征为获自实质上均质的抗体群体，而不应被视为需要通过任何特定方法制备的抗体。例如，本发明的单克隆抗体可通过多种技术制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及利用含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。

术语“全长抗体”、“完整抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上与天然抗体结构相似的结构的抗体。

“人类抗体”也可称为“人抗体”、“全人源抗体”或“全人抗体”，为氨基酸序列对应于由人类或人类细胞产生或来源于利用人类抗体谱系或其他人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列的抗体。此人类抗体定义特定地排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可使用本领域中已知的各种技术制备，包括噬菌体展示库技术，如下文献描述的技术：Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。人类抗体可通过向经修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失能的转基因动物(例如免疫异种小鼠)施用抗原来制备(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利第6,075,181号及第6,150,584号)。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，也参见例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)。

术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种的抗体。

“人类共同框架”为代表在选择人类免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的氨基酸残基的框架。一般而言，人类免疫球蛋白VL或VH序列选自于可变域序列的亚组。一般而言，序列亚组为如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL而言，所述亚组为如Kabat等人(同上)描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH而言，所述亚组为如Kabat等人(同上)描述的亚组III。

“人源化”抗体是指包含来自于非人类HVR的氨基酸残基及来自于人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或实质上所有HVR(例如CDR)对应于非人类抗体的HVR，且所有或实质上所有FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体任选地可包含来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人源化形式”是指已进行人源化的抗体。

如本文中所使用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域中具有序列高变性(也称为“互补决定区”或”CDR”)和/或形成结构确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)的各区。一般而言，抗体包含6个HVR：3个处于VH中(H1、H2、H3)且3个处于VL中(L1、L2、L3)。本文中的例示性HVR包括：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)处出现的高变环(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)处出现的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)处出现的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；及

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。

除非另外指出，否则HVR残基及可变域中的其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人(同上)进行编号。

术语“可变区”或“可变域”是指与抗体与抗原结合有关的抗体重链或轻链结构域。天然抗体的重链及轻链(分别为VH及VL)的可变域一般具有类似结构，其中各域包含4个保守框架区(FR)及3个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版。单一VH或VL域即可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自于结合特定抗原的抗体的VH或VL域分离结合该抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH域文库。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

“抗体片段”是指除完整抗体以外包含完整抗体中结合该完整抗体所结合的抗原的一部分的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文中所使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或预防细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如氨甲蝶呤、亚德里米星、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺红菌素或其他插入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如核分解酶；抗生素；毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；本领域已知的各种抗肿瘤药物或抗癌剂。

“免疫缀合物”为抗体与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的缀合物。

“受试者”或“个体”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如牛、羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如人类及非人类灵长类动物，诸如猴)、兔及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些实施方案中，所述受试者或个体为人类。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，否则如本文中所使用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映出结合伴侣成员(例如抗体与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法加以测量，包括本文中所描述的那些方法。用于测量结合亲和力的特定说明性及例示性实施方案描述于下文中。

关于参考多肽序列的“氨基酸序列同源性百分比(％)”定义为在将候选序列与参考多肽序列对准且必要时引入间隙以达成最大序列同源性百分比后且在任何保守取代均不被视为序列同源性的一部分的情况下，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同源性百分比可用本领域多种方式实现，例如使用公开可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。

例如，在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，指定氨基酸序列A同、与或相对于指定氨基酸序列B的氨基酸序列同源性％计算如下：

100×分数X/Y

其中X为在对A与B进行程序比对时由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应了解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同源性％将不等于B与A的氨基酸序列同源性％。除非另外特定陈述，否则本文中所使用的所有氨基酸序列同源性％值使用ALIGN-2计算机程序获得。

2.抗体、制备方法、组合物及制品

1)抗体

本发明涉及抗LAG-3抗体。在某些实施方案中，本发明提供一种抗LAG-3抗体，其包含含有至少1、2、3、4、5或6个选自以下的高变区(HVR)或称为互补决定区(CDR)的结合域：(a)HVR-H1，其包含序列88的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含序列89的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含序列90的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含序列91的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含序列92的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含序列93的氨基酸序列或与该序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列。在一些情况下，抗LAG-3抗体所具有的重链可变(VH)域(区)可包括与序列41、75或77具有至少90％序列同源性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性)的氨基酸序列或序列41、75或77的氨基酸序列，和/或其轻链可变(VL)域(区)包含与序列43具有至少90％序列同源性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性)的氨基酸序列或序列43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗LAG-3抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含如下的氨基酸序列：

序列41、序列45、序列49、序列53、序列57、序列61、序列75或序列77；

轻链可变区包含如下的氨基酸序列：

序列43、序列47、序列51、序列55、序列59或序列63。

在一些实施方案中，抗LAG-3抗体包含如下的重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)氨基酸序列41和43；

(2)氨基酸序列45和47；

(3)氨基酸序列49和51；

(4)氨基酸序列53和55；

(5)氨基酸序列57和59；

(6)氨基酸序列61和63；

(7)氨基酸序列75和43；或

(8)氨基酸序列77和43。

在一些实施方案中，抗LAG-3抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列41、序列75或序列77，轻链可变区包含氨基酸序列43。

2)抗体片段

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)₂、Fv及scFv片段及下文所描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag,NewYork)，第269-315页(1994)；也可参见WO 93/16185；及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。

双功能抗体为具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可为二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体及四功能抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。

单域抗体为包含抗体的所有或部分重链可变域或所有或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人类单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。

抗体片段可通过各种技术产生，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由如本文中所描述的重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。

3)嵌合抗体及人源化抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。

在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。典型地，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)源自于非人类抗体，且FR(或其部分)源自于人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自于非人类抗体(例如获得HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以修复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制造方法可查阅例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，且进一步描述于例如以下文献中：Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall和Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“指导选择”法)。

4)人类抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为人类抗体。人类抗体可使用本领域中已知的各种技术产生。

人类抗体可通过将免疫原施用给经修饰的转基因动物，然后用抗原攻击制备完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。此类动物典型地含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座，其置换内源免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合于动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已灭活。关于由转基因动物获得人类抗体的方法，参见例如美国专利第6,075,181号及第6,150,584号(描述XENOMOUSETM技术)；美国专利第5,770,429号；美国专利第7,041,870号(描述K-M技术)；及美国申请公布第US 2007/0061900号。得自于由此类动物产生的完整抗体的人类可变区可经进一步修饰，例如通过与不同的人类恒定区组合。

人类抗体也可通过基于杂交瘤的方法制造。已描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞株，参见例如Kozbor J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页；Marcel Dekker，Inc.，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞株产生单克隆人类IgM抗体)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤)中所描述的方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers及Brandlein,Histology和Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。

人类抗体也可通过分离选自人类来源噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列来制备。接着可将此类可变域序列与所要的人类恒定域组合。本发明实施例部分描述了通过噬菌体展示库筛选人类抗体的过程。

具体地，可通过针对具有结合LAG-3活性的抗体筛选组合库来分离具有高亲和力的本发明抗体。例如，本领域中已知用于产生噬菌体展示库及针对具有所要结合特征的抗体筛选此类库的多种方法。此类方法可查阅例如Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编,Human Press,Totowa，NJ，2001)，且进一步描述于例如以下文献中：McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)单独克隆VH及VL基因谱系，且随机重组于噬菌体库中，接着可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述针对抗原-结合噬菌体进行筛选。噬菌体典型地将抗体片段呈现为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自于免疫源的库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。描述人类抗体噬菌体库的专利公布包括例如：美国专利第5,750,373号及美国专利公布第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号及第2009/0002360号。

自人类抗体库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人类抗体或人类抗体片段。

5)多特异性抗体

在任何上述方面中，本文中所提供的抗LAG-3抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个结合特异性针对LAG-3，而另一结合特异性针对任何其他抗原(例如第二生物分子，例如细胞表面抗原，例如肿瘤抗原)。相应地，双特异性抗LAG-3抗体可对LAG-3及肿瘤抗原，例如CD3、CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1或TenB2有结合特异性。双特异性抗体也可制备为全长抗体或抗体片段。

用于制造多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链配对的重组共表达(参见Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))WO2009/080253；Schaefer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:11187-11192(2011))，WO 2009/089004A1等。

6)抗体变体

本发明的抗体涵盖本发明抗LAG-3抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质而制备的抗体变体。抗体的氨基酸序列变体可通过向编码该抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可对缺失、插入及取代进行任何组合以获得最终构建体，条件为最终构建体具有所要特征，例如抗原结合。

a.取代变体、插入变体及缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代型突变诱发的相关位点包括HVR及FR。保守取代显示于以下“优选取代”标题下。更多实质性变化提供于如下“例示性取代”标题下，且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸取代引入相关抗体中且针对所希望获得的活性(例如保留/改善抗原结合或改善ADCC或CDC)来筛选产物。

例示性氨基酸取代及优选氨基酸取代

可根据共同侧链性质对氨基酸进行分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将必然伴有将这些类别之一的成员交换成另一类别。

一种类型取代型变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人类抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体将在某些生物学性质(例如增加亲和力)方面相对于亲本抗体得以修饰(例如改善)和/或将实质上保留亲本抗体的某些生物学性质。例示性取代型变体为亲和力成熟抗体，其可使用例如基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文中所描述的那些)便利地产生。简言之，使一个或多个HVR残基突变且使变异抗体展现于噬菌体上，且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。

在某些实施方案中，一个或多个HVR(CDR)内可发生取代、插入或缺失，只要此类变化实质上不削弱抗体结合LAG-3的能力即可。例如，可在HVR中进行实质上不降低结合亲和力的保守变化(例如，如本文中所提供的保守取代)。例如，此类变化可在HVR中的抗原接触残基以外。在以上所提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变或含有不超过1、2或3个氨基酸取代。

用于鉴别可靶向以进行突变诱发的抗体残基或区域的适用方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”，如Cunningham及Wells(1989)Science，244:1081-1085所描述。

7)重组方法

本发明的抗LAG-3抗体可使用重组方法来制备，例如，如美国专利第4,816,567号中所描述。在一个实施方案中，提供编码本文中所描述的抗LAG-3抗体的经分离核酸。此类核酸可编码包含该抗体(例如该抗体的轻链和/或重链)的VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列。在另一实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一实施方案种，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，经转化而具有)：(1)包含编码包含该抗体的VL的氨基酸序列及包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码包含该抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体及包含编码包含该抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制造抗LAG-3抗体的方法，其中该方法包括在适合表达该抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码该抗体的核酸的宿主细胞，及任选地自该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。

为了重组产生抗LAG-3抗体，分离编码抗体的核酸(例如，如上所描述)且插入一个或多个载体中以便在宿主细胞中进行进一步克隆和/或表达。此类核酸可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码该抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。

适用于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核细胞或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗体，尤其在不需要糖基化及Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段及多肽，参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号及第5,840,523号。在表达之后，可自细菌细胞浆中分离处于可溶性部分中的抗体且可进一步纯化。

除原核生物以外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也为抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌及酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

适用于表达糖基化抗体的宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物及脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物及昆虫细胞。已鉴别许多可用于结合昆虫细胞，尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒菌株。

植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号及第6,417,429号(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。

脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞株可能适用。适用哺乳动物宿主细胞株的其他实例为经SV40转化的猴类肾CV1细胞株(COS-7)；人类胚肾细胞株(例如，如Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977)中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(例如，如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类子宫颈癌细胞(HELA)；犬类肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；例如，如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他适用哺乳动物宿主细胞株包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞株，诸如Y0、NS0及Sp2/0。关于适用于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞株的综述，参见例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。

8)免疫缀合物

本发明也提供包含本文中的抗LAG-3抗体与一种或多种细胞毒性剂结合的免疫缀合物，此类细胞毒性剂为诸如化学治疗剂或化学治疗药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。

在一个实施方案中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物结合，包括但不限于美登素(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0425235B1)；奥利司他汀，诸如单甲基奥利司他汀药物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号及第7,498,298号)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号；Hinman等人,CancerRes.53:3336-3342(1993)；及Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))，氨甲蝶呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多烯紫杉醇、紫杉醇、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特西紫杉醇(tesetaxel)及欧塔紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉毒素(trichothecene)；及CC1065。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所描述的抗LAG-3抗体与酶活性毒素或其片段的缀合物，该酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链及单端孢霉毒素等。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所描述的抗LAG-3抗体与放射性原子结合形成的放射性缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu的放射性同位素。

抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双官能蛋白偶合剂制造，诸如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚胺基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

9)药物制剂

本发明的抗LAG-3抗体的药物制剂通过将具有所要纯度的抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合呈冻干制剂或水溶液形式来制备。药学上可接受的载体在所采用的剂量及浓度下一般对受体无毒，且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属配合物(例如锌-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。

例示性冻干抗体制剂描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体制剂包括美国专利第6,171,586号及WO2006/044908中所描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的制剂也可含有超过一种对于所治疗的特定适应症而言必需存在的活性成分，优选具有不会对彼此造成不利影响的互补活性的活性成分。例如，可能需要进一步提供额外治疗剂(例如化学治疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂)。此类活性成分适合以组合形式以对预定目的有效的量存在。

10)制品

在本发明的另一方面中，提供含有本发明抗体或药物组合物的制品。该制品包含容器及处于该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。此类容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑料。该容器容纳本发明组合物自身或该组合物与另一组合物的组合，且可具有无菌进入口(例如，该容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的瓶塞的小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体。该标签或包装插页指示该组合物用于治疗选定肿瘤或病毒感染。此外，该制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；及(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另一细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施方案中的制品可进一步包含指示此类组合物可用于治疗肿瘤或病毒感染的包装插页。可选地，或另外，该制品可进一步包括第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可进一步包括自商业及使用者的立场来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。

附图简述

图1显示6个IgG4单克隆抗体与人LAG-3-6*His标签融合蛋白体外结合活性检测结果。

图2显示瞬时转染ExpiCHO-S表达纯化的MV705-3单克隆抗体的SEC-HPLC检测纯度。

图3显示MV705-3单克隆抗体同人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白结合的ELISA测定结果。

图4显示抗人LAG-3全人源单克隆抗体对人LAG-3-mFc重组融合蛋白与MHC II类分子结合的阻断作用。

图5显示抗人LAG-3全人源单克隆抗体与猕猴LAG-3*6His标签融合蛋白抗原的交叉结合活性。

图6显示抗人LAG-3全人源单克隆抗体与小鼠LAG-3抗原的交叉活性。

图7显示抗人LAG-3全人源单克隆抗体与激活的人CD4⁺ T细胞的结合活性。

图8显示抗人LAG-3全人源单克隆抗体的体外生物功能分析。

图9显示MV705-3和BMS对照单克隆抗体(BMS-25F7和BMS-986016)的结合表位分析实验设计。

图10a-图10d显示MV705-3和BMS对照单克隆抗体(BMS-25F7和BMS-986016)的结合表位分析结果。

图11显示克隆11452、克隆13380和克隆13381的重链可变区、轻链可变区氨基酸序列以及CDR序列。

图12.LAG3人源化小鼠MC38荷瘤模型体内验证13381变体抗肿瘤药效。图中显示为肿瘤的平均体积±SEM。*.显著性水平为0.05；**.显著性水平为0.01。

实施例

实施例1抗LAG-3单克隆抗体的制备

1.1高亲和力结合人LAG-3重组融合蛋白的单链抗体的淘选

本实施例描述从全人源单链scFv噬菌体展示文库中淘选高亲和力结合人LAG-3重组融合蛋白的单链抗体的方法，该方法涉及利用如下所述的全人源单链scFv噬菌体展示文库，其中涉及使用商购的人LAG-3-6*His重组融合蛋白(近岸蛋白，cat#CJ91)，大肠杆菌TG1(Lucigen，cat#60502-1)以及M13KO7辅助噬菌体(Thermo Fisher，cat#18311019)。本实施例涉及的全人源单链scFv噬菌体展示文库构建自含有pBR3.22启动子和M13噬菌体pIII蛋白展示系统的噬菌粒载体pCLS1.0(序列1)，其C端含有Myc-His标签。文库构建时使用大肠杆菌TG1。该全人源单链scFv噬菌体展示文库采取文献中为人熟知的常规方法建立，简述如下：利用RNA提取试剂盒(TaKaRa，cat#9767)从商购健康人群PBMCs(澳赛尔斯,cat#PB-003F-S，50个样本)中获得RNA，每个全人源scFv单链噬菌体展示子文库由五或十个样本的RNA混合建立。用逆转录试剂盒(Thermo Fisher，cat#4368814)将RNA逆转录合成cDNA第一链，按文献(CaiXH，GarenA.PNAS，1995.92(14):6537-6541)以及V-base数据库设计合成扩增人类抗体可变区基因的特异性引物。以cDNA第一链为模板，通过PCR分别扩增人类抗体重链可变区和轻链可变区基因。利用分子克隆技术分别将人类抗体重链可变区及轻链可变区基因片段克隆至噬菌粒载体pCLS1.0。具体的，人类抗体轻链可变区由Nhe I/Not I双酶切克隆至载体pCLS1.0，并电转化至大肠杆菌TG1，获得噬菌体轻链子文库，获得载体pCLS1.0-VL。继续用SfiI/Xho I双酶切将人类抗体重链可变区克隆至载体pCLS1.0-VL)。利用相同方法获得具有重链和轻链可变区组合的全人源scFv噬菌体展示子文库。各个子文库总计库容为9×10⁹。

淘选实验中的人LAG-3-6*His标签融合蛋白均利用生物素标记试剂盒(BiotinLabeling Kit-NH2(Dojindo，cat#LK03))标记生物素。淘选实验简述如下：利用大肠杆菌TG1制备M13KO7辅助噬菌体，测定滴度约为1.0×10¹³，并将其侵染OD600值为0.5-0.6的上述全人源scFv单链噬菌体展示文库，以获得第一轮输入(input)噬菌体。利用液相淘选策略，通过事先和M-280 Streptavidin(Thermo,cat#11206D)预孵育的经生物素标记的人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白富集结合人LAG-3的scFv单链抗体的噬菌体。用pH2.2，0.1M的甘氨酸-盐酸溶液洗脱富集的所述单链抗体噬菌体，得到第一轮输出(output)噬菌体。用第一轮输出噬菌体侵染OD600值为0.5-0.6的TG1大肠杆菌，以获得第二轮输入噬菌体，继续使用上述生物淘选方法得到与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白结合的第二轮输出噬菌体。重复第二轮生物淘选过程进行第三轮或第四轮淘选，将经过第三轮或者第四轮淘选富集的输出噬菌体侵染大肠杆菌TG1，获得单克隆，通过噬菌体ELISA鉴定、挑选和人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白具有高亲和力的单克隆大肠杆菌进行测序分析，获得19个单一核苷酸序列，具体序列信息参见表1。

表1 19个克隆及其核苷酸、氨基酸序列的对应关系

克隆	核苷酸序列	氨基酸序列
			11446	序列2	序列3
11449	序列4	序列5
			11451	序列6	序列7
11452	序列8	序列9
			11453	序列10	序列11
11454	序列12	序列13
			11455	序列14	序列15
11458	序列16	序列17
			11465	序列18	序列19
11469	序列20	序列21
			11471	序列22	序列23
11474	序列24	序列25
			11482	序列26	序列27
11487	序列28	序列29
			11489	序列30	序列31
11491	序列32	序列33
			11501	序列34	序列35
11506	序列36	序列37
			11507	序列38	序列39

1.2通过流式分析选择结合LAG-3蛋白的单链抗体进行IgG转换

为了测试19个具有单一核苷酸序列的单克隆scFv单链抗体与细胞表面LAG-3蛋白结合的能力，将带有该等scFv单链抗体的大肠杆菌单克隆用IPTG诱导表达可溶scFv单链抗体蛋白，取过滤后的上清与激活的人CD4⁺T细胞检测结合活性。利用人CD4⁺ T细胞富集试剂盒(STEMCELL，cat#19052)从人外周血PBMCs中分离出CD4⁺ T细胞。然后，将分离的CD4⁺ T细胞与CD3/CD28 Dynabeads(Gibco，cat#11131D)共孵育，于37℃，5％CO₂培养箱中激活48h。将所述的19个IPTG诱导表达的可溶scFv单链抗体蛋白、2YT培养基(生工生物工程(上海)股份有限公司，cat#SD7019)及空白对照PBS(Hyclone，cat#SH30256.01)分别与激活的人CD4⁺T细胞4℃共孵育1h。然后用冷的1×PBS缓冲液将细胞洗涤两次。加入1:50稀释的anti-His-PE标记的抗体(Miltenyi Biotec，cat#130-092-691)，并将混合物在4℃下孵育30分钟，之后用冷的1×PBS缓冲液洗涤两次,用Guava easyCyte HT流式细胞仪(MERCK MILLIPORE)分析所述诱导表达的scFv单链抗体与激活的CD4阳性T细胞的结合活性分析。流式分析时框选设门选取了表达LAG-3的CD4阳性T细胞。结果如表2所示，19个单克隆诱导表达的可溶scFv单链抗体蛋白中有6个抗体蛋白(11446，11452，11454，11455，11471，11487)具有与激活的人CD4阳性T细胞的最高的结合活性。

表2 19个IPTG诱导表达的可溶scFv单链抗体蛋白与激活的人CD4⁺ T细胞的结合活性

受试样品	结合活性
		2YT培养基	-
空白对照PBS	-
		11446	++
11449	+
		11451	+
11452	+++
		11453	-
11454	++
		11455	+++
11458	+
		11465	+
11469	-
		11471	++
11474	-
		11482	-
11487	++
		11489	-
11491	-
		11501	-
11506	+
		11507	+

选取11446，11452，11454，11455，11471，11487这6个scFv单链抗体基因进行分子克隆转换成IgG4的形式。一般的，将包含前导肽、NheI/Not I酶切位点、重链基因恒定区及人IgG4-Fc的序列克隆构建至pCDNA3.3+，得到载体pCDNA3.3-IgG4。同样的，将包含前导肽、Nhe I/BsiW I酶切位点、轻链Kappa基因恒定区序列克隆构建至pCDNA3.3+，得到载体pCDNA3.3-VKappa，或者将包含前导肽、BamH I/Hind III酶切位点、轻链lambda基因恒定区序列克隆构建至pCDNA3.3+，得到载体pCDNA3.3-VLambda。将前述scFv单链抗体的重链可变区基因核苷酸序列两端加上Nhe I/Not I位点，插入到pCDNA3.3-IgG4质粒的相应位点中；将前述scFv单链抗体的轻链可变区核苷酸序列两端加上Nhe I/BsiW I位点，插入到pCDNA3.3-Vkappa质粒的相应位点中或是利用BamH I/Hind III酶切位点将scFv单链抗体的轻链可变区核苷酸序列插入到pCDNA3.3-VLambda载体中。获得表达所述单克隆抗体的重组质粒，参见表3，其中所有重链都为IgG4(Padlan EA Mol Immunol.1994Feb；31(3):169-217.Anatomy of the antibody molecule)。

表3 6个单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列

1.3、IgG4单克隆抗体的表达、纯化、鉴定和结合活性

将上述表3所列的含重链可变区和轻链可变区的重组质粒用ExpiFectamine^TM CHOTransfection Kit(Thermo Fisher,cat#A29129)脂质体法瞬时转染悬浮培养的ExpiCHO-S细胞(Thermo Fisher,cat#A29127)。

在30ml ExpiCHO Expression培养基(Thermo Fisher,cat#A29100-01)中，以37℃，8％CO₂，120rpm的转速条件下培养前述获得的转染ExpiCHO-S细胞。

经过10-14天培养的转染细胞，通过二级离心处理(第一级离心条件20min，400g；第二级离心条件20min，10000g)，去除细胞和细胞碎片，得到上清液。将澄清的上清液装载入蛋白A亲和层析柱(GE Healthcare，cat#GE-17-5438-04)，通过三步淋洗(淋洗缓冲液依次为含150mM NaCl,pH 5.0的磷酸盐缓冲液；20mM柠檬酸钠-1M氯化钠pH 5.0；20mM柠檬酸钠pH 5.0的淋洗缓冲液)来去除杂质，然后通过pH 3.0的20mM柠檬酸钠溶液分离捕获目标抗体。最后通过超滤浓缩步骤将目标抗体置换至pH 7.4的1×PBS缓冲液中。

将纯化出来的6个IgG抗体(11446，11452，11454，11455，11471，11487)利用ELISA的方法检测其与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白抗原的体外结合活性。测试涉及一种商业化的人LAG-3-6*His标签融合蛋白(近岸蛋白，cat#CJ91)。具体的，将人LAG-3-6*His标签融合蛋白用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释至浓度1μg/ml，4℃过夜包被至96孔板(CORNING，cat#9018)中。经pH 7.4的1xPBS缓冲液洗涤三次后，用5％的脱脂牛奶封闭2h。将纯化出来的6个IgG抗体用pH 7.4的1xPBS缓冲液从100μg/ml开始进行3倍梯度稀释，与包被抗体在25℃共孵育2h。然后用带抗-hIgG标签的HRP检测抗体检测所述抗体与人LAG-3-6*His标签融合蛋白抗原的结合。如图1和表4所示，11452克隆具有和人LAG-3-6*His标签融合蛋白抗原最佳亲和力，将该克隆11452命名为MV705-3，其重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列为SYGIS(序列88)、重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列为WISAYNGNTNYAQKLQG(序列89)、重链CDR3(HCDR3)氨基酸序列为DGWWELLRPDDAFDI(序列90)、轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列为SGDKLGDKYAY(序列91)、轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列为YDSDRPS(序列92)、轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列QVWDSSSDQVV(序列93)。

表4 IgG4单克隆抗体与人LAG-3-6*His标签融合蛋白体外结合活性

受试样品	EC50(μg/ml)
		11446	85.6
11452	0.364
		11471	22.3
11487	3.35
		11455	83.1
11454	85.8

实施例2由转染的ExpiCHO-S细胞制备MV705-3 LAG-3单克隆抗体

将含有优选克隆MV705-3的重链和轻链基因的重组质粒用ExpiFectamineTM CHOTransfection Kit(Thermo Fisher,cat#A29129)脂质体法瞬时转染较大规模(200-600ml)悬浮培养的ExpiCHO-S细胞(Thermo Fisher,cat#A29127)，转染，培养，纯化方法如实施例1.3所述，制备目标抗体。最后通过超滤浓缩步骤将目标抗体置换至pH 7.4的1×PBS缓冲液中，用以进行后续各项体外和体内活性检测和生物分析实验。

实施例3、瞬时表达、纯化的MV705-3抗体的纯度分析

3.1毛细管电泳(CE-SDS)分析实施例2所获的LAG-3单克隆抗体MV705-3的纯度

通过SDS-MW Analysis试剂盒(北京博思雅生化技术研究院，cat#BSYK018)对单克隆抗体MV705-3样品进行还原和非还原处理，方法如下。

非还原：100μg抗人LAG-3全人源单克隆MV705-3抗体样品加入75μl 1％SDS缓冲液，用0.1M Tris-HCl定容至95μl，加入5μl碘乙酰胺，涡旋混匀后在70℃孵育5min，8℃下6000g离心1min。

还原：100μg抗人LAG-3全人源单克隆MV705-3抗体样品加入75μl浓度为1％SDS缓冲液，用0.1M Tris-HCl定容至95μl，加入5μlβ-巯基乙醇，涡旋后在70℃孵育5min，8℃下6000g离心1min。

然后用毛细管电泳仪(Beckman，型号：PA800plus)进行纯度分析。结果表明，在还原(R-CE-SDS)和非还原(NR-CE-SDS)条件下，本发明瞬时转染ExpiCHO-S表达纯化的抗人LAG-3全人源单克隆MV705-3抗体样品，重链(HC)、轻链(LC)和主峰纯度的峰纯度百分比如表5所示。

表5 MV705-3单克隆抗体的重链、轻链和主峰纯度百分比

MV705-3	LC纯度％	HC纯度％	主峰纯度％
				NR-CE-SDS	NA	NA	83.6％
R-CE-SDS	32.4％	66.7％	99.1％

3.2、分子筛液相色谱(SEC-HPLC)分析实施例2所获的LAG-3单克隆抗体MV705-3的纯度

20μg抗人LAG-3全人源单克隆MV705-3抗体(浓度调整至1mg/ml)加载到HPLC色谱仪(Agilent Technologies)的色谱柱(TOSOH，型号：TSKgel G3000SWXL)，流动相为50mM磷酸盐缓冲液，300mM氯化钠，pH 7.0，流速为0.8ml/min，检测波长为280nm。结果如图2。峰值计算使用ChemStation软件进行分析，本发明的抗人LAG-3全人源单克隆MV705-3抗体的主峰百分比＞99.2％、多聚体峰百分比＜1％。

实施例4、MV705-3单克隆抗体与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白的结合

4.1、用ELISA方法检测MV705-3单克隆抗体与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白的亲和力

本实施例涉及用体外活性实验测试MV705-3单克隆抗体与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白抗原的结合力。该实验使用了一种商购人LAG-3-6*His标签融合蛋白(近岸蛋白，cat#CJ91)以及一种阳性对照抗体，即抗体25F7(US2011/0150892A1，PCT/US2009/053405)，其重链核苷酸序列、重链氨基酸序列、轻链核苷酸序列、轻链氨基酸序列依次分别为：序列64、序列65、序列66、序列67。其IgG4kappa载体的构建方法可参考实施例1.2，并如实施例1.3所述的方法转染ExpiCHO-S细胞进行表达，纯化，保存在pH 7.4的1xPBS缓冲液中。将抗人LAG-3全人源单克隆抗体MV705-3，阳性对照抗体分别用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释至浓度1μg/ml，4℃过夜包被至96孔板(CORNING，cat#9018)中。经pH 7.4的1xPBS缓冲液洗涤三次后，用5％的脱脂牛奶封闭2h。将人LAG-3-6*His标签融合蛋白用pH 7.4的1xPBS缓冲液从20μg/ml开始进行3倍梯度稀释，与包被抗体在25℃共孵育2h。然后用抗-His标签的HRP检测抗体检测所述抗体与人LAG-3-6*His标签融合蛋白抗原的结合。单次ELISA实验结果如图3所示，MV705-3单克隆抗体和人LAG-3重组融合蛋白具有高亲和力，ELISA检测亲和力EC50值为40ng/ml。表6总结了三次独立ELISA实验的MV705-3单克隆抗体和人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白结合的EC50值范围(40-100ng/ml)。

表6 MV705-3单克隆抗体与人LAG-3重组融合蛋白的结合活性

受试样品	EC50(μg/ml)
		MV705-3	0.04-0.10
抗体25F7	0.08-0.14

4.2、MV705-3单克隆抗体的亲和平衡解离常数KD的检测

MV705-3单克隆抗体与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白相结合的能力采用OctetRed96生物分子相互作用仪系统(Octet Red96，ForteBio)进行检测。抗人IgG Fc(AHC)的动力学级生物传感器(Fortebio，#18-5063)经pH 1.7的甘氨酸预处理后浸泡在测定PBS缓冲液中。MV705-3以10μg/ml的浓度固定到AHC生物传感器。然后将加载了MV705-3的AHC生物传感器浸入到不同浓度的人LAG-3-6*His抗原和缓冲液中。分析物柱的最后稀释点只包含检测缓冲液，以测试缓冲液与负载生物传感器之间的非特异性结合。从0到300秒检测到了抗原与抗体结合，随后300到900秒发生解离。用检测缓冲液确定了60秒的基线。抗LAG-3的单克隆抗体的亲和力曲线是以1:1结合的动力学传感单价结合模型拟合的。结合动力学分析如表7所示。

表7 人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白与MV705-3的亲和力

4.3、BIAcore检测MV705-3单克隆抗体的亲和平衡解离常数KD

本实施例使用BIAcore SPR技术检验MV705-3单克隆抗体或上述阳性对照抗体与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白的结合。将单克隆抗体MV705-3(1.1μg/ml)或阳性对照抗体(12.9μg/ml)设定至500RU水平，基于由生产商推荐的标准固定化操作流程，将其包被在CM5芯片(GE，货号：BR100530)上。将不同浓度(0.352至45nM)的人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白以30μl/min的流速在已偶联抗体的芯片表面分别注射分析120秒，允许抗原解离10分钟，待抗原结合解离完毕后，用pH 2.1的Gly-HCl再生液以30μl/min的流速对芯片表面进行再生30秒，进一步恢复用PBS缓冲液洗涤芯片60秒稳定芯片状态。使用BIAcore控制软件(2.0.1版)，在BIAcore T200(No.1602831)表面等离振子共振仪上进行所有的实验。使用BiaEvaluation 3.0版软件进行数据分析。结合动力学分析如表8所示，MV705-3单克隆抗体具有比阳性对照抗体25F7更高的与人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白结合的KD。

表8 抗LAG-3抗体对人LAG-3-6*His标签重组融合蛋白的结合动力学

受试样品	KD(M)	kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
				抗体25F7	3.56E-10	4.808E+6	0.001712
MV705-3	8.51E-12	1.078E+5	9.176E-7

实施例5 MV705-3对人LAG-3-mFc重组融合蛋白与MHC II类分子结合的阻断作用

本实施例进行一项体外结合活性测试，该测试能够说明抗人LAG-3全人源单克隆抗体MV705-3对人LAG-3-mFc重组融合蛋白与MHC II类分子结合的阻断作用。该测试利用人LAG-3-mFc重组融合蛋白与表面表达人MHC II类分子的Daudi细胞；人LAG-3-mFc融合蛋白(hLAG-3-mFc)是人LAG-3细胞外结构域与小鼠Fc融合而成，其核苷酸序列为序列68，氨基酸序列为序列69，将表达LAG-3-mFc融合蛋白的核苷酸序列克隆至表达载体pcDNA3.3，并转染Expi293细胞(Thermo Fisher,cat#A14527)，以类似实施例1.3的方法纯化获得上述hLAG-3-mFc重组融合蛋白。将序列#10161构建至表达载体pcDNA3.3，并转染Expi293细胞，表达纯化获得一种同种型对照蛋白。该测试同时涉及阳性对照抗体25F7(如实施例4所述)和这种同种型对照蛋白。

为了测试所述抗体对人LAG-3-mFc重组融合蛋白与MHC II类分子结合的阻断作用，将MV705-3、阳性对照抗体25F7以及同种型对照蛋白用预冷4℃的1xPBS缓冲液从100μg/ml进行3倍梯度稀释，同时各个梯度稀释液中加入10μg/ml的hLAG-3-mFc重组融合蛋白溶液。将该混合液在4℃孵育30min，然后加入2×10⁵个经过预冷4℃的1xPBS缓冲液清洗的Daudi细胞，于4℃孵育1h。随后，用预冷4℃的1xPBS缓冲液清洗一次，并将兔抗小鼠IgG的PE标签的抗体(Abcam，cat#ab7000)与经过清洗的Daudi细胞继续孵育1h，用Guava easyCyteHT流式细胞仪(MERCKMILLIPORE)分析hLAG-3-mFc重组蛋白与Daudi细胞的结合。

如图4和表9结果所示，单克隆抗体MV705-3能够有效阻断人LAG-3-mFc重组融合蛋白与Daudi细胞表面的MHC II类分子的结合，其阻断IC50值为2.8μg/ml；这与阳性对照抗体25F7对人LAG-3-mFc与Daudi细胞表面MHC II类分子结合的阻断能力相当，阳性对照抗体25F7的阻断IC50值为3.3μg/ml。

表9 MV705-3对人LAG-3-mFc与MHC II类分子结合的阻断作用

受试样品	IC50(μg/ml)
		MV705-3	2.8
抗体25F7	3.3
		同种型对照	NA

实施例6 MV705-3与猕猴LAG-3抗原以及小鼠LAG-3抗原的结合活性

本实施例进行一项体外活性测试，该测试为了说明所述抗体与猕猴(Macacafascicularis)LAG-3抗原以及小鼠LAG-3抗原是否具有交叉反应。测试涉及一种商购的重组猕猴LAG-3-6*His标签融合蛋白(近岸蛋白，cat#C998)以及一种构建表达的重组小鼠LAG-3-6*His标签融合蛋白。将小鼠LAG-3基因全长cDNA(Sinobiological，cat#MG53069-G)克隆至表达载体pcDNA3.3，并转染Expi293细胞，获得上述的重组小鼠LAG-3-6*His标签融合蛋白(其核苷酸序列为序列70，氨基酸序列为序列71)。

为了测试所述抗体与猕猴LAG-3抗原的交叉反应，将抗人LAG-3全人源单克隆抗体MV705-3，阳性对照抗体25F7分别用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释至浓度1μg/ml，4℃过夜包被于96孔板(CORNING，cat#9018)。1xPBS缓冲液洗涤三次后，用5％脱脂牛奶封闭2h。将猕猴LAG-3-6*His标签融合蛋白用1xPBS缓冲液从20μg/ml进行3倍梯度稀释，与包被抗体在25℃共孵育2h。然后用抗-his标签的HRP检测抗体检测所述抗体与猕猴LAG-3-6*His标签融合蛋白抗原的结合。

结果如图5和表10所示，单克隆抗体MV705-3与猕猴LAG-3-6*His标签融合蛋白具有良好的交叉反应活性，其EC50值为0.11μg/ml；所述阳性对照抗体25F7与猕猴LAG-3-6*His标签融合蛋白交叉反应弱，对应的EC50值为7.0μg/ml。

表10 MV705-3与猕猴LAG-3抗原的交叉反应活性

受试样品	EC50(μg/ml)
		MV705-3	0.11
抗体25F7	7.0

为了测试所述抗体与小鼠LAG-3抗原的交叉反应，利用上述方法，检测所述抗体MV705-3与小鼠LAG-3-6*His标签融合蛋白抗原的结合活性。结果如图6和表11显示，所述抗体MV705-3与阳性对照抗体25F7均对小鼠LAG-3抗原具有弱交叉反应。

表11 MV705-3与小鼠LAG-3抗原的交叉反应活性

受试样品	EC50(μg/ml)
		MV705-3	2.6
抗体25F7	3.2

实施例7 MV705-3与激活的人CD4⁺ T细胞的结合活性

本实施例进行一项体外结合活性测试，旨在测试所述抗体与激活的人CD4⁺ T细胞的结合活性，激活的人CD4⁺ T细胞表面表达天然人LAG-3。利用实施例1.2中方法激活CD4⁺ T细胞。然后，将抗体MV705-3、阳性对照抗体25F7、上述阴性对照即同种型对照用冷的1xPBS缓冲液(Hyclone，cat#SH30256.01)从10μg/ml 3倍或者4倍梯度稀释。对于结合活性检测，利用稀释1:200的山羊抗人IgG-PE标记的抗体(Abcam，cat#ab98596)检测所述抗体与CD4⁺T细胞的结合，并利用Guava easyCyte HT流式细胞仪(MERCK MILLIPORE)分析所述抗体与细胞的结合活性分析。流式分析时框选设门选取了表达LAG-3的CD4阳性T细胞。结果如图7和表12所示，MV705-3单克隆抗体能够高亲和结合表达LAG-3的CD4阳性T细胞，其结合EC50值为1.9ng/ml。

表12 MV705-3与激活的人CD4⁺ T细胞的结合活性

受试样品	EC50(ng/ml)
		MV705-3	1.9
抗体25F7	16.8

实施例8 MV705-3的体外生物功能分析

本实施例进行一项体外生物功能分析，测试利用商购的稳定表达人LAG-3的细胞株LAG3/NFAT Reporter-Jurkat(BPS bioscience，cat#71278)，Raji细胞(ATCC，cat#CCL-86)，超抗原试剂(Toxin technology-ET404)，bio-glo荧光素酶试剂(Promega，cat#G7940)。

为了测试所述抗体的体外T细胞激活生物功能，将所述抗体MV705-3及阳性对照抗体25F7用RPIM1640(Gbico，cat#11875093)从150μg/ml(5倍终浓度)3倍梯度稀释，3复孔，并设置一个抗体空白浓度的空白对照。各个稀释梯度抗体分别与4×10⁴个细胞/孔的LAG3/NFAT Reporter-Jurkat细胞混合，于37℃，5％CO₂培养箱中预孵育30分钟。随后顺序加入3×10⁴个细胞/孔Raji细胞以及10μl浓度为0.08ng/ml(10倍终浓度)的超抗原试剂。混合物在37℃，5％CO₂培养箱中共孵育5-6个小时。快速加入bio-glo荧光素酶检测试剂100μl孵育5-10分钟，并用TECAN荧光检测仪器(TECAN infinite M1000 PRO)测定生物荧光的信号，以分析所述抗体的体外T细胞激活功能。诱导倍数确定为各个浓度梯度生物荧光信号值与空白对照生物荧光信号值的比值，实验结果用GraphPad Prism进行非线性回归分析。

结果如图8和表13所示，随着所述抗体MV705-3浓度的增加，生物荧光的信号强度呈梯度依赖性升高，这能够说明所述抗体MV705-3能够增加NFAT报告基因的表达，EC50值为0.04μg/ml。所述抗体MV705-3明显表现出优于阳性对照抗体25F7的体外T细胞激活生物功能，阳性对照抗体25F7EC50值为0.64μg/ml。

表13 MV705-3体外激活T细胞的能力

受试样品	EC50(μg/ml)
		MV705-3	0.04
抗体25F7	0.64

实施例9 MV705-3、BMS-25F7抗体和BMS-986016抗体的结合表位分析

本实施例旨在分析MV705-3单克隆抗体是否与BMS-25F7抗体(公开于文献例如US2011/0150892A1和PCT/US2009/053405中，在此通过提及并入本申请)或BMS-986016抗体(BMS-986016包含WO2015116539中所述的SEQ ID NO:1和2所示的重链和轻链，其在WO2014/008218中也有描述，在此通过提及并入本申请)具有相同的结合表位。实验采用OctetRed96生物分子相互作用仪系统(Octet Red96，ForteBio)来进行表征，实验设计如图9所示，简述如下：生物素标记过的hLAG-3-6*his标签重组蛋白以10μg/ml的浓度固定到SA生物传感器(Fortebio，货号18-5020)，平衡300秒后浸入PBS缓冲液中，加载了hLAG-3-6*his标签重组蛋白的SA生物传感器然后被浸入到的各组样品中：(1)100μg/ml BMS对照单克隆抗体(BMS-25F7或BMS-986016)；(2)100μg/mlMV705-3单克隆抗体；(3)100μg/mlMV705-3单克隆抗体和100μg/ml BMS对照单克隆抗体BMS-25F7或BMS-986016混合物；(4)50μg/mlMV705-3单克隆抗体和50μg/ml BMS对照单克隆抗体BMS-25F7或BMS-986016混合物。用PBS缓冲液确定了60秒的基线。从0到300秒检测到了抗原与抗体结合，随后300到900秒发生解离。抗LAG-3的单克隆抗体的亲和力曲线是以一个1:2结合的动力学传感单价结合模型拟合的。结合动力学分析如图10a-d所示,在饱和浓度下(100μg/ml)MV705-3单克隆抗体和BMS对照单克隆抗体与hLAG-3-his标签重组蛋白的结合分别都达到了最高值(Rmax)，但是两个抗体混合物在100μg/ml+100μg/ml或者50μg/ml+50μg/ml的浓度下均能够增加与hLAG-3-his标签重组蛋白的结合信号值，这说明了MV705-3单克隆抗体与BMS的对照抗体与hLAG-3抗原的结合表位不一样。

实施例10 MV705-3单克隆抗体的变体的设计、构建表达和活性测试

10.1 MV705-3单克隆抗体的变体的设计、构建表达

分析查找MV705-3单克隆抗体的氨基酸序列中潜在降解位点，发现该抗体重链中有两个位点含有“DD”氨基酸序列，是潜在的天门冬酰胺出现异构体转变的识别位点，分别位于序列41的第89、90位点和108、109位点。使用Site-Directed Mutagenesis Kit定点诱变试剂盒(New England Biolabs,货号E0552S)来实施对MV705-3单克隆抗体VH区的第89、90位点和108、109位点的定点诱变，将其改为DE或者ED。将诱变成功的MV705-3单克隆抗体变体VH区亚克隆至含有人IgG4S228P恒定区的MV705-3单克隆抗体原载体中(所得克隆编号见列表14；所得克隆重链VH核苷酸序列和氨基酸序列编号参见表15)。将表达MV705-3单克隆抗体各变体重链的载体各自与表达MV705-3单克隆抗体轻链的载体一起共转染至Expi-CHO-S细胞中。

表14 含MV705-3单克隆抗体的优化变体重链的克隆

克隆信息	克隆号
		MV705-3-VH-DD+DE-IgG4	13365
MV705-3-VH-DE+DD-IgG4	13380
		MV705-3-VH-ED+DD-IgG4	13381
MV705-3-VH-DD+ED-IgG4	13386
		MV705-3-VH-DE+ED-IgG4	13563
MV705-3-VH-ED+DE-IgG4	13564
		MV705-3-VH-DE+DE-IgG4	13565
MV705-3-VH-ED+ED-IgG4	13616

表15 变体重链的核苷酸序列和氨基酸序列

将所获得的上述8个MV705-3单克隆抗体变体和MV705-3单克隆抗体经如下所述的各种分析方法检测活性：(a)和人LAG-3重组蛋白结合的ELISA；(b)和表达人LAG-3蛋白的细胞结合实验；(c)利用商购的稳定表达人LAG-3的细胞株LAG3/NFAT Reporter-Jurkat的体外生物功能分析。

10.2 MV705-3单克隆抗体变体的活性测试

(a)MV705-3单克隆抗体的变体和人LAG-3重组蛋白结合的ELISA方法如实施例4所述，结果如表16所示，有2个变体蛋白13380(DE+DD)、13381(ED+DD)具有和MV705-3单克隆抗体类似的与人LAG-3-his标签重组融合蛋白的结和能力，其他变体的结合能力有不同程度的下降。

表16 MV705-3单克隆抗体的变体和人LAG-3重组蛋白结合的ELISA实验结果

(b)MV705-3单克隆抗体的变体和表达人LAG-3的细胞结合实验方法简述如下：

将受试抗体MV705-3单克隆抗体和其变体、阳性对照抗体BMS-25F7和BMS-986016抗体用冷的1xPBS缓冲液(Hyclone，cat#SH30256.01)从10μg/ml开始进行3倍或者4倍梯度稀释。对于结合活性检测，利用1:200稀释的山羊抗人IgG-PE标记的抗体(Abcam，cat#ab98596)检测所述抗体与表达人LAG-3的细胞的结合，并利用Guava easyCyte HT流式细胞仪(MERCK MILLIPORE)分析所述抗体与细胞的结合活性分析。流式分析时框选设门选取了表达LAG-3的阳性细胞。结果如表17所示。与ELISA结果类似，MV705-3单克隆抗体能够高亲和结合表达LAG-3的细胞，其2个变体蛋白13380(DE+DD)，13381(ED+DD)具有和MV705-3单克隆抗体蛋白类似的与表达人LAG-3的细胞的结合能力，其他变体的结合能力有不同程度的下降。

表17 MV705-3单克隆抗体的变体和表达人LAG-3的细胞结合能力

受试样品	EC50(ng/ml)
		BMS-25F7	39±12(N＝4)
BMS-986016	69±56(N＝3)
		MV705-3(DD+DD)	2.3±0.9(N＝4)
13380(DE+DD)	1.8±0.5(N＝4)
		13381(ED+DD)	2.2±0.6(N＝4)
13386(DD+ED)	5.9±3.5(N＝4)
		13563(DE+ED)	4.7±0.8(N＝4)
13616(ED+ED)	5.1±3(N＝2)
		13365(DD+DE)	>10(N＝1)
13565(DE+DE)	>10(N＝2)
		13564(ED+DE)	>10(N＝1)

(c)利用商购的稳定表达人LAG-3的细胞株LAG3/NFAT Reporter-Jurkat的体外生物功能分析如实施例8所述。已知MV705-3变体克隆13365(DD+DE)，13565(DE+DE)和13564(ED+DE)和LAG-3的结合能力下降很多，因此仅测试了MV705-3单克隆抗体以及以下5个变体13380(DE+DD)；13381(ED+DD)；13386(DD+ED)；13563(DE+ED)和13616(ED+ED)。结果如表18所示，变体蛋白13380(DE+DD)和13381(ED+DD)具有和MV705-3单克隆抗体类似的体外激活T细胞的能力。

表18 MV705-3单克隆抗体和其5个变体的体外激活T细胞的能力

受试样品	EC50(μg/ml)
		MV705-3	0.13±0.036(n＝5)
13380(DE+DD)	0.05±0.03(n＝2)
		13381(ED+DD)	0.1±0.059(n＝2)
13386(DD+ED)	>30(n＝1)
		13563(DE+ED)	>30(n＝1)
13616(ED+ED)	>30(n＝1)

实施例11 13381变体体内抑制肿瘤细胞生长的功效

为了测试MV705-3单克隆抗体的13381变体在体内抑制肿瘤细胞生长的功效，使用了人源化的LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3)小鼠(购自：南方模式生物科技股份有限公司，品系全名：B6.129-Lag3tm(hLAG3)/Smoc；目录号NM-KI-00049)。该小鼠通过同源重组方式，将小鼠內源Lag3基因胞外区序列全部替换为人源LAG3序列，从而使小鼠表达人源嵌合LAG3蛋白。给该小鼠接种鼠类MC38结肠癌细胞系制备肿瘤移植模型。

上述人源化的LAG-3小鼠(B6.129-Lag3tm(hLAG3)/Smoc)在第0天各自植入1×10⁶个MC38细胞，在肿瘤长至均值为123(mm³)左右时开始分组给药，连续三周每周给药两次(BIWx3)，从给药开始连续三至四周观察测量肿瘤体积均值。动物分为四组(n＝8)：(1)PBS溶剂对照，BIWx3,ip；(2)mPD-1抗体(BE0146，BioCell)，1mg/kg，BIWx3,ip；(3)MV705-3单克隆抗体13381变体，10mg/kg,BIWx3,ip；(4)MV705-3单克隆抗体13381变体，10mg/kg,和mPD-1抗体(BE0146，BioCell)，1mg/kg,BIWx3，ip。

结果如表19和图12所示，MV705-3单克隆抗体13381突变体单药就能够有效抑制肿瘤生长，平均肿瘤生长抑制率为35.11％()；Ti或者Vi表示在某一特定时间点处理组或者对照组平均肿瘤体积；T0或V0表示分组后给药前处理组或者对照组平均肿瘤体积)，而抗鼠PD-1单克隆抗体对肿瘤生长无抑制作用,MV705-3单克隆抗体13381变体在和抗鼠PD-1单克隆抗体联合用药对肿瘤生长抑制效果最强，平均肿瘤生长抑制率为46.07％。

表19.LAG3人源化小鼠MC38荷瘤模型体内验证MV705-3单克隆抗体13381突变体肿瘤抑制效果。

参考文献：

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序列表

<110> 上海博威生物医药有限公司

<120> 结合淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）的抗体及其用途

<141> 2019-04-01

<160> 93

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttc 240

catgaaaatt ctatttcaag gagacagtca taatgaaata cctattgcct acggcagccg 300

ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg ccatggccta gtgataacct ggctccacac 360

tctggctgtc ctgtggggta ccccctgact ctgtgtccag gggccccctc tcctggaccc 420

atgtgcaccc caaggggcct aagtcattgc tgagcctaga gctgaaggac gatcgcccgg 480

ccagagatat gtgggtaatg gagacgggtc tgttgttgcc ccgggccaca gctcaagacg 540

ctggaaagta ttattgtcac cgtggcaacc tgaccatgtc attccacctg gagatcactg 600

ctcggccagt actatggcac tggctgctga ggactggtgg ctggaaggtc tcagctgtga 660

ctttggctta tctgatcttc tgcctgtgtt cccttgtggg cattcttcat cttcaaagag 720

ccctggtcct gaggaggaaa agaaagcgaa tgactgaccc caccaggaga ttcttcaaag 780

tgacgcctcc cccaggaagc gggccccaga accagtacgg gaacgtgctg tctctcccca 840

cacccacctc aggcctcgga cgcgcccagc gttgggccgc aggcctgggg ggcactgccc 900

cgtcttatgg aaacccgagc agcgacgtcc aggcggatgg agccttgggg tcccggagcc 960

cgccgggagt gggcccagaa gaagaggaag gggagggcta tgaggaacct gacagtgagg 1020

aggactccga gttctatgag aacgactcca accttgggca ggaccagctc tcccaggatg 1080

gcagcggcta cgagaaccct gaggatgagc ccctgggtcc tgaggatgaa gactccttct 1140

ccaacgctga gtcttatgag aacgaggatg aagagctgac ccagccggtc gccaggacaa 1200

tggacttcct gagccctcat gggtcagcct gggaccccag ccgggaagca acctccctgg 1260

ggtcccagtc ctatgaggat atgagaggaa tcctgtatgc agccccccag ctccgctcca 1320

ttcggggcca gcctggaccc aatcatgagg aagatgcaga ctcttatgag aacatggata 1380

atcccgatgg gccagaccca gcctggggag gagggggccg catgggcacc tggagcacca 1440

ggtagtgata aaactcgagc ggtggtggcg gttctggtgg tggtggtagc ggtggcggtg 1500

gtagtggcgg tggcggtgct agctagtgat aatctgggcc ctggggctgc atcctcacct 1560

acagagatgg cttcaacgtc tccatcatgt ataacctcac tgttctgggt ctggagcccc 1620

caactccctt gacagtgtac gctggagcag gttccagggt ggggctgccc tgccgcctgc 1680

ctgctggtgt ggggacccgg tctttcctca ctgccaagtg gactcctcct gggggaggcc 1740

ctgacctcct ggtgactgga gacaatggcg actttaccct tcgactagag gatgtgagcc 1800

aggcccaggc tgggacctac acctgccata tccatctgca ggaacagcag ctcaatgcca 1860

ctgtcacatt ggcaatcatc acagtgactc ccaaatcctt tgggtcacct ggatccctgg 1920

ggaagctgct ttgtgaggtg actccagtat ctggacaaga acgctttgtg tggagctctc 1980

tggacacccc atcccagagg agtttctcag gaccttggct ggaggcacag gaggcccagc 2040

tcctttccca gccttggcaa tgccagctgt accaggggga gaggcttctt ggagcagcag 2100

tgtacttcac agagctgtct agcccaggtg cccaacgctc tgggagagcc ccaggtgccc 2160

tcccagcagg ccacctcgat atcgagggtc gtatggatcc caaatcttgt gacaaaactc 2220

acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc 2280

ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg 2340

tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 2400

tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca 2460

gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct 2520

ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc 2580

gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca 2640

gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 2700

atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 2760

tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct 2820

catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt 2880

ctccgggtaa atagtgataa gcggccgcag gcgcggaaca aaaactcatc tcagaagagg 2940

atctgaatgg ggccgcacat catcatcacc atcactaggg tggcggctcc ggttccggtg 3000

attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 3060

aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 3120

ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 3180

gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 3240

taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 3300

ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 3360

tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 3420

ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aataagaatt cactggccgt cgttttacaa 3480

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 3540

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 3600

agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 3660

tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 3720

cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 3780

ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 3840

atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 3900

ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 3960

tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 4020

accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 4080

taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 4140

caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 4200

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 4260

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 4320

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 4380

taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 4440

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 4500

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 4560

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 4620

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 4680

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 4740

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 4800

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 4860

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 4920

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 4980

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 5040

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 5100

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 5160

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 5220

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 5280

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 5340

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 5400

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 5460

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 5520

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 5580

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 5640

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 5700

caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 5760

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 5820

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 5880

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 5940

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 6000

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 6060

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 6120

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 6180

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 6240

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 6300

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aag 6333

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aattatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcga taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga aaagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagatcaatc 300

gggtttcttg agagcgatgc ttttgatatc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcg 360

agcggtggtg gcggttctgg tggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgg cggtggcggt 420

gctagcgaca tcgtgctgac acagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 480

gtcaccatca cttgccaggc gagtcacggc atttccaact ttttaaattg gtatcagcag 540

aaaccaggaa aagcccctaa gctcctcatc tacgatgcat ccactttgga aacaggggtc 600

ccatcaaggt tcagtggaag tggatctggg acagatttta gattcaccat cagcagcctg 660

cagcctgaag atattgcaac atattactgt caacaatttg ataatctccc gatcaccttc 720

ggccaaggga cacgactgga gattaaa 747

<210> 3

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Gly Phe Leu Glu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser His Gly Ile Ser Asn Phe Leu Asn

165 170 175

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp

180 185 190

Ala Ser Thr Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Thr Asp Phe Arg Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asn Leu Pro Ile Thr Phe

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245

<210> 4

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggtccagt tggtgcaatc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatgag 300

ggagctaact ggggtgatgc ttttgatatc tggggccaag ggaccatggt caccgtctcg 360

agcggtggtg gcggttctgg tggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgg cggtggcggt 420

gctagccagc ttgtgctgac tcaatcgccc tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc 480

accatctctt gttctggaag cagctccaac atcggaaata atgctgtaaa ctggtaccag 540

cagctcccag gaacggcccc caaaatcctc atctatagta ataatcagcg gccctcaggg 600

gtccctgacc gattctctgg ctccaagtct ggcgcctcag cctccctggc catcagtggg 660

ctccagtctg aggatgagtc tgattattac tgtgcagcat gggatgacag cctgaatgct 720

gtggtattca gcggagggac cgagctgacc gtccta 756

<210> 5

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Glu Gly Ala Asn Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Leu

130 135 140

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Ile Leu Ile Tyr

180 185 190

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu

210 215 220

Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala

225 230 235 240

Val Val Phe Ser Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

245 250

<210> 6

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caggtacagc ttcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactgggg ctggatccgc 120

cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagaacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccag gaaccagttc 240

tccctgaaac tgagctctct gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgagaact 300

ggggggggag cctacggttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360

ggtggtggcg gttctggtgg tggtggtagc ggtggcggtg gtagtggcgg tggcggtgct 420

agccagcctg tgctgactca gccgcactct gtgtcggagt ctccgggcaa gacggtgacc 480

atctcctgca cccgcagcag tggcaacatt gccagcaact atgtgcagtg gtatcagaag 540

cgcccgggca gtccccccac cactgtgatc tatgaggaca accaaaggcc ctctggggtc 600

cctgatcgct tctccgcctc catcgacagc tcctccaact ctgcctccct caccatctct 660

ggactgagga ctgaggacga ggctgactac tactgtcagt cttatgacac tatcttgggt 720

tatgtcttcg gaggaggcac ccagctgacc gcccta 756

<210> 7

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ala Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Pro Val

130 135 140

Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr

145 150 155 160

Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln

165 170 175

Trp Tyr Gln Lys Arg Pro Gly Ser Pro Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu

180 185 190

Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Ile

195 200 205

Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Arg Thr

210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ile Leu Gly

225 230 235 240

Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu

245 250

<210> 8

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gcggtggtgg cggttctggt ggtggtggta gcggtggcgg tggtagtggc 420

ggtggcggtg ctagccagct tgtgctgact cagtcgccct cagtgtccgt gtccccagga 480

cagacagcca gcatcacctg ctctggagat aagttgggag ataaatatgc ttactggtat 540

cagcagaagc caggccaggc ccctgtgctg gtcatctatt atgatagcga ccggccctca 600

gggatccctg agcgattctc tggctccaac tctgggaaca cggccaccct gaccatcagc 660

agggtcgaag ccggggatga ggccgactat tactgtcagg tgtgggatag tagtagtgat 720

caagtggtat tcggcggagg cacccagctg accgtcctc 759

<210> 9

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly

145 150 155 160

Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile

180 185 190

Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220

Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp

225 230 235 240

Gln Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

245 250

<210> 10

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctttggca tacactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtacg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctctat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaggatttt 300

gggggtggtg actggggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcgagc 360

ggtggtggcg gttctggtgg tggtggtagc ggtggcggtg gtagtggcgg tggcggtgct 420

agccagtctg tgctgactca gccgccctca gtgtctgggg ccccagggca gagggtcacc 480

atctcctgca ctgggagcag ctccaacatc ggggcaggtg atgatgtaca ttggtaccag 540

cagcttccag gaacagcccc caaactcctc atctatacta acaacaatcg gccctcaggg 600

gtccctgacc gattctctgg ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcagtgag 660

ctccagtctg aggatgaggc tgattattat tgtgcagcat gggatgacag cctgaatggt 720

ccggtgttcg gcggaggaac ccagctgacc gccctc 756

<210> 11

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Phe Gly Gly Gly Asp Trp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ser Val

130 135 140

Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr

145 150 155 160

Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Asp Asp Val

165 170 175

His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

180 185 190

Thr Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Glu Leu Gln Ser Glu

210 215 220

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly

225 230 235 240

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Ala Leu

245 250

<210> 12

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaggtgcagc tgttgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagttgga 300

ctccttgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccatgg tcaccgtctc gagcggtggt 360

ggcggttctg gtggtggtgg tagcggtggc ggtggtagtg gcggtggcgg tgctagccag 420

tctgtcttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 480

tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gctgatccca 540

gaaaaagccc ccagactcct catttatgac gatgataagc gaccctccgg gattcctgac 600

cgattctctg gctcccagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 660

ggggacgagg ccgattattt ctgcggaaca tgggataaca gcctgagtgg tgcggtattc 720

ggcggaggaa cccagctgat catttta 747

<210> 13

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Leu Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ser Val Leu Thr

130 135 140

Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser

145 150 155 160

Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr

165 170 175

Gln Leu Ile Pro Glu Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Asp

180 185 190

Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gln Ser Gly

195 200 205

Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala

210 215 220

Asp Tyr Phe Cys Gly Thr Trp Asp Asn Ser Leu Ser Gly Ala Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu

245

<210> 14

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaggtgcatc tggtagagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaaacaa tcaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt tttactgtgc gagatcaatc 300

ggattccttg agagcgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaacggt caccgtctcg 360

agcggtggtg gcggttctgg tggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgg cggtggcggt 420

gctagcgaaa tagtgttgat gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 480

gccaccctct cctgcagggc cagtcaaagt tttagtgacg ggtccttagc ctggtaccag 540

cagaaacctg gccagcctcc cagactcgtc atctatgatg catcgaagcg ggccactggc 600

atccctgaca ggttcagtgg cagtaggtct gggacagagt tcactctcac catcagcagc 660

ctgcagtctg aagattttgc agtttattcc tgtcagcagt attataactg gcctcccacc 720

ttcggccaag ggacacgact ggagattaaa 750

<210> 15

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Gly Phe Leu Glu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile

130 135 140

Val Leu Met Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

145 150 155 160

Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Asp Gly Ser Leu

165 170 175

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Val Ile Tyr

180 185 190

Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Trp Pro Pro Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 16

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgggtgcggc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt actactgggg ctggatccgc 120

cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300

tatagtggct acgatggggc ttatgttggc tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagcggtg gtggcggttc tggtggtggt ggtagcggtg gcggtggtag tggcggtggc 420

ggtgctagcc agtctgtcct gacgcagccg ccctcagtgt ctggggcccc agggcagagg 480

gtcaccatct cctgcactgg gagcaactcc aacatccggg caggttatga tgtacactgg 540

taccagcagc ttccaggaac agtccccaaa ctcctcatct atggtaacag caatcgaccc 600

tcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc aagtctggca cctcagcctc cctggccatc 660

agtggcctcc agtccgaaga tgagggtaat tacttctgtg ctacatggga tgacagcctg 720

tggggctggg tgttcggcgc agggaccgag ctgaccgtcc ta 762

<210> 17

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Arg Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Val Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln

130 135 140

Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg

145 150 155 160

Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asn Ile Arg Ala Gly Tyr

165 170 175

Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Val Pro Lys Leu Leu

180 185 190

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

210 215 220

Ser Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Phe Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu

225 230 235 240

Trp Gly Trp Val Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

245 250

<210> 18

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caggtccagt tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaaga cttctggagg cacctttagt aattatgcta tcaactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtg atcatcccta tgtttggtcc agcaaactac 180

gtacagaagt tccagggcag agtcacaatt accgcggacg aaaccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccatct attactgtgc gagagacttg 300

gctccagctg gcttctacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcg 360

agcggtggtg gcggttctgg tggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgg cggtggcggt 420

gctagcgaca ttgtgttgac tcagtctcca tcttccgtgt ctgcatctgt aggagacaga 480

gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcaact ggttagcctg gtatcagcag 540

aagccaggga aagcccctaa actcctcatc tatgctgcat ccagtttaca aagtggggtc 600

ccatcaaggt tcagcggcag tagatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 660

cagcctgaag attttgcaac ttactattgt caacaggcta ggaatttccc cttcaccttc 720

ggccaaggga cacgactgga gattaaa 747

<210> 19

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Ile Pro Met Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Val Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Thr Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ala Pro Ala Gly Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile

130 135 140

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala

165 170 175

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala

180 185 190

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg

195 200 205

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Arg Asn Phe Pro Phe Thr Phe

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245

<210> 20

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

caggtgcagc tgttgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacacccc 300

tacgactact acggtatgga cgtctggggc caagggacaa cggtcaccgt ctcgagcggt 360

ggtggcggtt ctggtggtgg tggtagcggt ggcggtggta gtggcggtgg cggtgctagc 420

gaaattgtgt tgacacagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 480

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 540

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 600

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 660

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 720

tggacgttcg gccaagggac caaagtggat atcaaa 756

<210> 21

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Pro Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu

130 135 140

Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser

145 150 155 160

Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn

165 170 175

Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

180 185 190

Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

210 215 220

Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro

225 230 235 240

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

245 250

<210> 22

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgggtgcggc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120

cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180

aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300

gcgatacgcg atgcttttga tatctggggc caagggacaa cggtcaccgt ctcgagcggt 360

ggtggcggtt ctggtggtgg tggtagcggt ggcggtggta gtggcggtgg cggtgctagc 420

gacatccaga tgacccagtc tccatcgtcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 480

atcacttgcc gggcaagtca gagcgttagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 540

gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 600

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 660

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccccctttt cggcggaggg 720

accaaactgg agatcaaa 738

<210> 23

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Arg Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ala Ile Arg Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met

130 135 140

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

145 150 155 160

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

180 185 190

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

210 215 220

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 24

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagtcctg 300

actcctgggc cttactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360

gtctcgagcg gtggtggcgg ttctggtggt ggtggtagcg gtggcggtgg tagtggcggt 420

ggcggtgcta gcgaagttat gttgatgcag tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg 480

gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcatcagcta cttagcctgg 540

taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atggtacatc tagcagggcc 600

actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac tctcaccatc 660

agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc agcagtatgg tagctcaccc 720

ccattcactt tcggccctgg gaccaaactg gaaatcaaa 759

<210> 25

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Leu Thr Pro Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser

130 135 140

Glu Val Met Leu Met Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

145 150 155 160

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

165 170 175

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

180 185 190

Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

210 215 220

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

225 230 235 240

Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 26

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgggtgcggc tgcaggagtc gggccctggc ctggtgaagt cctcacagac cctgtccctc 60

acctgcagtg tctctggtga ctccatcagt agtggtaaat actactggac ctggatccgg 120

cagcccgccg ggaagggact ggagtggctt gggcgcatcc attccagtgg gtttgcccag 180

tacaacccct ccctcaaggg tcgtctcacc atctctatag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaacc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagacta 300

cccacgccga cgtacttcta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcgagcggtg gtggcggttc tggtggtggt ggtagcggtg gcggtggtag tggcggtggc 420

ggtgctagcg aaactgtgat gacccagtct ccagactccc tggctgtgtc tctgggcgag 480

agggccacca tcaactgcaa gtccagccag agtattttat acagctccaa caataagaac 540

tacttagctt ggtaccagca gaaaccagga cagcctccta ggctgctcat ttactgggcc 600

tctacccggc aatccggggt ccctgaccga ttcagtggta gcgggtctgg gacagatttc 660

actctcacca tcagcagcct gcggcctgaa gatgtggctg tttattactg tcaacaatat 720

tatggtgctc cgatcacctt cggccaaggg acacgactgg agattaaa 768

<210> 27

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Arg Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Lys Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Ile His Ser Ser Gly Phe Ala Gln Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Pro Thr Pro Thr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu

130 135 140

Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu

145 150 155 160

Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser Ser

165 170 175

Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

180 185 190

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro

195 200 205

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

210 215 220

Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

225 230 235 240

Tyr Gly Ala Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245 250 255

<210> 28

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggccggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cctctggatt cacctttgat gatcatgcca tgcactgggt caggcaaact 120

ccagagaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atggaggtga catacgctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgcat 240

ctgcaaatga acagtctgag aggtgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagatggt 300

ggatatagtg ttcttagggc ttttgatatc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcg 360

agcggtggtg gcggttctgg tggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgg cggtggcggt 420

gctagccagt ctgtgttgac gcagccgccc tcagtgtctg gggccccggg gcagagggtc 480

accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540

cagcagcttc caggaacagc ccccaaactc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca 600

ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 660

gggctccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cctatgacag cagcctgagt 720

ggttgggtgt tcggcggagg aacccagctg atcatttta 759

<210> 29

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Asp Ile Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Val Leu Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ser

130 135 140

Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

165 170 175

Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala

210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser

225 230 235 240

Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu

245 250

<210> 30

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgggtgcggc tgcaggagtc gggccctggc ctggtgaagt cctcacagac cctgtccctc 60

acctgcagtg tctctggtga ctccatcagt agtggtaaat actactggac ctggatccgg 120

cagcccgccg ggaagggact ggagtggctt gggcgcatcc attccagtgg gtttgcccag 180

tacaacccct ccctcaaggg tcgactcacc atatcagtgg acacgcgcaa gaatgagttc 240

tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcggctacg 300

gtggtaactc cggtcgactc tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360

tcgagcggtg gtggcggttc tggtggtggt ggtagcggtg gcggtggtag tggcggtggc 420

ggtgctagcg atacagtgat gacacagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac 480

agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag agcattagca gctatttaaa ttggtatcag 540

cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg atctatgctg catccagttt gcaaagtggg 600

gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt 660

ctgcaacctg aagattttgc aacttactac tgtcaacaga gttacagtac cccgctcact 720

ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 750

<210> 31

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Arg Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Lys Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Ile His Ser Ser Gly Phe Ala Gln Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Arg Lys Asn Glu Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Thr Val Val Thr Pro Val Asp Ser Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp

130 135 140

Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

180 185 190

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245 250

<210> 32

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gaggtgcagc tggaggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagattac 300

tatgatagta gtggttattt cgctgggggt gctgcttttg atatctgggg ccaagggaca 360

acggtcaccg tctcgagcgg tggtggcggt tctggtggtg gtggtagcgg tggcggtggt 420

agtggcggtg gcggtgctag cgaaacgaca ctcacgcagt ctccagccac cctgtctgtg 480

tctccagggg acagcgccac cctctcctgc agggccagtc gctatgttgg caacaacttg 540

gcctggtacc accagaagcc tggccaggct cccaggctcc tcatctatga cgcatccacc 600

agggccactg gtgtcccagg cagattcagt ggcagtgggt ttgggacaga cttcactctc 660

accatttcca gcctgaggtc tgagaatttt gcagtttatt tctgtcagca atatgataac 720

tggcccctga ccttcggcca agggacacga ctggagatta aa 762

<210> 33

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Phe Ala Gly Gly Ala Ala

100 105 110

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ala Ser Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val

145 150 155 160

Ser Pro Gly Asp Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Val

165 170 175

Gly Asn Asn Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

180 185 190

Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Gly Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

210 215 220

Leu Arg Ser Glu Asn Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asn

225 230 235 240

Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 34

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gaggttcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120

cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagtat 300

agtggtggta gctactacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cgagcggtgg tggcggttct ggtggtggtg gtagcggtgg cggtggtagt 420

ggcggtggcg gtgctagcga aattgtgttg acccagactc catcctccct gtctgcatct 480

gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg gcaagtcaga gcattagcag ctatttaaat 540

tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctatgctgc atccagtttg 600

caaagtgggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 660

atcagcagtc tgcaacctga agattttgca acttactact gtcaacagag ttacagtacc 720

ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 759

<210> 35

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

145 150 155 160

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

180 185 190

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

210 215 220

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr

225 230 235 240

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 36

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cagctgcagc tgcaggagtc gggccctggc ctggtgaagt cctcacagac cctgtccctc 60

acctgcagtg tctctggtga ctccatcagt agtggtaaat actactggac ctggatccgg 120

cagcccgccg ggaagggact ggagtggctt gggcgcatcc attccagtgg gtttgcccag 180

tacaacccct ccctcaaggg tcgactcacc atatcagtgg acacgcgcaa gaatgagttc 240

tccctaaaaa tgacctctgt gactgccgca gacacggccg tctattactg tgcgagaggc 300

ggctggaacg acccctttga ctcctggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcgagcggt 360

ggtggcggtt ctggtggtgg tggtagcggt ggcggtggta gtggcggtgg cggtgctagc 420

gatatccaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 480

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 540

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 600

gaatccgggg tccctgaccg attcagtgtc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 660

atcagcagcc tgcatgctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 720

cctatcactt tcggccctgg gaccaagctg gagatcaaa 759

<210> 37

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 37

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Lys Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Ile His Ser Ser Gly Phe Ala Gln Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Arg Lys Asn Glu Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Met Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Trp Asn Asp Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Ile Gln Met

130 135 140

Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr

145 150 155 160

Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

180 185 190

Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

195 200 205

Ser Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

210 215 220

His Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 38

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

caggtgcagc tacaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtta ctccatcagc agtggttact actggggctg gatccggcag 120

cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctatc atagtgggag cacctactac 180

aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gagagaccta 300

caggattggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag cggtggtggc 360

ggttctggtg gtggtggtag cggtggcggt ggtagtggcg gtggcggtgc tagcctggct 420

gtgctgactc acgcaccctc agcgtctggg acccccgggc agagagtcac catctcttgt 480

tctggaagca agtccaacat cggaagtaat tctgttaact ggtatcagca cctccccgga 540

acggccccca aactcctcat acatactaat gatcagcggc cctcaggggt ccctgaccga 600

ttcgctggct ccaagtctgg cacctcagca tccttgacca tcagtggcct caggcctgaa 660

gatgaggcgg attattactg tgcaacatgg gatgacagca tgagtggtcc ggtgttcggc 720

ggtgggaccg agctgaccgt ccta 744

<210> 39

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 39

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gln Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Leu Ala Val Leu Thr His

130 135 140

Ala Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys

145 150 155 160

Ser Gly Ser Lys Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Asn Trp Tyr Gln

165 170 175

His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr Asn Asp Gln

180 185 190

Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Lys Ser Gly Thr

195 200 205

Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Arg Pro Glu Asp Glu Ala Asp

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Met Ser Gly Pro Val Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

245

<210> 40

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 41

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 41

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

cagcttgtgc tgactcagtc gccctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagataagtt gggagataaa tatgcttact ggtatcagca gaagccaggc 120

caggcccctg tgctggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240

gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcaagt ggtattcggc 300

ggaggcaccc agctgaccgt cctcggt 327

<210> 43

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 43

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 44

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aattatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcga taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga aaagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagatcaatc 300

gggtttcttg agagcgatgc ttttgatatc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcg 360

agc 363

<210> 45

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Gly Phe Leu Glu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 46

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gacatcgtgc tgacacagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca cggcatttcc aactttttaa attggtatca gcagaaacca 120

ggaaaagccc ctaagctcct catctacgat gcatccactt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttagattca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatatta ctgtcaacaa tttgataatc tcccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa a 321

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 47

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser His Gly Ile Ser Asn Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Arg Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asn Leu Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gaggtgcagc tgttgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagttgga 300

ctccttgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccatgg tcaccgtctc gagc 354

<210> 49

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 49

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Leu Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

cagtctgtct tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagctgatc 120

ccagaaaaag cccccagact cctcatttat gacgatgata agcgaccctc cgggattcct 180

gaccgattct ctggctccca gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta tttctgcgga acatgggata acagcctgag tggtgcggta 300

ttcggcggag gaacccagct gatcatttta ggt 333

<210> 51

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 51

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Leu Ile Pro Glu Lys Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gln Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gly Thr Trp Asp Asn Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu Gly

100 105 110

<210> 52

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gaggtgcatc tggtagagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaaacaa tcaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt tttactgtgc gagatcaatc 300

ggattccttg agagcgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaacggt caccgtctcg 360

agc 363

<210> 53

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 53

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Gly Phe Leu Glu Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gaaatagtgt tgatgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca aagttttagt gacgggtcct tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagc ctcccagact cgtcatctat gatgcatcga agcgggccac tggcatccct 180

gacaggttca gtggcagtag gtctgggaca gagttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240

tctgaagatt ttgcagttta ttcctgtcag cagtattata actggcctcc caccttcggc 300

caagggacac gactggagat taaa 324

<210> 55

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 55

Glu Ile Val Leu Met Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Ser Asp Gly

20 25 30

Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Val

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Trp Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgggtgcggc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120

cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180

aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300

gcgatacgcg atgcttttga tatctggggc caagggacaa cggtcaccgt ctcgagc 357

<210> 57

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 57

Arg Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Ala Ile Arg Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gacatccaga tgacccagtc tccatcgtcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcgttagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccccctttt cggcggaggg 300

accaaactgg agatcaaa 318

<210> 59

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 60

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggccggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cctctggatt cacctttgat gatcatgcca tgcactgggt caggcaaact 120

ccagagaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atggaggtga catacgctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgcat 240

ctgcaaatga acagtctgag aggtgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagatggt 300

ggatatagtg ttcttagggc ttttgatatc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcg 360

agc 363

<210> 61

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Asp Ile Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Val Leu Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 62

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cggggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttgg 300

gtgttcggcg gaggaaccca gctgatcatt ttaggt 336

<210> 63

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 63

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu Gly

100 105 110

<210> 64

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gattactact ggaactggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata atggaaacac caactccaac 180

ccgtccctca agagtcgagt caccctatca ctagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgtt tggatatagt 300

gactacgagt acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320

ctctccctgt ctctgggtaa a 1341

<210> 65

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 65

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 66

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac ttttggccag 300

gggaccaacc tggagatcaa acgtacggtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 67

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 67

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 68

<211> 2004

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ctccagccag gggctgaggt cccggtggtg tgggcccagg agggggctcc tgcccagctc 60

ccctgcagcc ccacaatccc cctccaggat ctcagccttc tgcgaagagc aggggtcact 120

tggcagcatc agccagacag tggcccgccc gctgccgccc ccggccatcc cctggccccc 180

ggccctcacc cggcggcgcc ctcctcctgg gggcccaggc cccgccgcta cacggtgctg 240

agcgtgggtc ccggaggcct gcgcagcggg aggctgcccc tgcagccccg cgtccagctg 300

gatgagcgcg gccggcagcg cggggacttc tcgctatggc tgcgcccagc ccggcgcgcg 360

gacgccggcg agtaccgcgc cgcggtgcac ctcagggacc gcgccctctc ctgccgcctc 420

cgtctgcgcc tgggccaggc ctcgatgact gccagccccc caggatctct cagagcctcc 480

gactgggtca ttttgaactg ctccttcagc cgccctgacc gcccagcctc tgtgcattgg 540

ttccggaacc ggggccaggg ccgagtccct gtccgggagt ccccccatca ccacttagcg 600

gaaagcttcc tcttcctgcc ccaagtcagc cccatggact ctgggccctg gggctgcatc 660

ctcacctaca gagatggctt caacgtctcc atcatgtata acctcactgt tctgggtctg 720

gagcccccaa ctcccttgac agtgtacgct ggagcaggtt ccagggtggg gctgccctgc 780

cgcctgcctg ctggtgtggg gacccggtct ttcctcactg ccaagtggac tcctcctggg 840

ggaggccctg acctcctggt gactggagac aatggcgact ttacccttcg actagaggat 900

gtgagccagg cccaggctgg gacctacacc tgccatatcc atctgcagga acagcagctc 960

aatgccactg tcacattggc aatcatcaca gtgactccca aatcctttgg gtcacctgga 1020

tccctgggga agctgctttg tgaggtgact ccagtatctg gacaagaacg ctttgtgtgg 1080

agctctctgg acaccccatc ccagaggagt ttctcaggac cttggctgga ggcacaggag 1140

gcccagctcc tttcccagcc ttggcaatgc cagctgtacc agggggagag gcttcttgga 1200

gcagcagtgt acttcacaga gctgtctagc ccaggtgccc aacgctctgg gagagcccca 1260

ggtgccctcc cagcaggcca cctcgatatc gagggtcgta tggatgagcc cagagggccc 1320

acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc 1380

gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctccctgag ccccatagtc 1440

acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg 1500

aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 1560

ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc 1620

aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc 1680

aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact 1740

aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg 1800

gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac 1860

tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa 1920

agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1980

agcttctccc ggactccagg taaa 2004

<210> 69

<211> 668

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 69

Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser

20 25 30

Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly

35 40 45

Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro

50 55 60

Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu

65 70 75 80

Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro

85 90 95

Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu

100 105 110

Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala

115 120 125

Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu

130 135 140

Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser

145 150 155 160

Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala

165 170 175

Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg

180 185 190

Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln

195 200 205

Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg

210 215 220

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu

225 230 235 240

Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val

245 250 255

Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu

260 265 270

Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr

275 280 285

Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala

290 295 300

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu

305 310 315 320

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

325 330 335

Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val

340 345 350

Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln

355 360 365

Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu

370 375 380

Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly

385 390 395 400

Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser

405 410 415

Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu Asp Ile Glu Gly

420 425 430

Arg Met Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys

435 440 445

Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe

450 455 460

Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val

465 470 475 480

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile

485 490 495

Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr

500 505 510

His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro

515 520 525

Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val

530 535 540

Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro

545 550 555 560

Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu

565 570 575

Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp

580 585 590

Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr

595 600 605

Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

610 615 620

Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu

625 630 635 640

Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His

645 650 655

His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

660 665

<210> 70

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

tcagggcctg ggaaagagct ccccgtggtg tgggcccagg agggagctcc cgtccatctt 60

ccctgcagcc tcaaatcccc caacctggat cctaactttc tacgaagagg aggggttatc 120

tggcaacatc aaccagacag tggccaaccc actcccatcc cggcccttga ccttcaccag 180

gggatgccct cgcctagaca acccgcaccc ggtcgctaca cggtgctgag cgtggctcca 240

ggaggcctgc gcagcgggag gcagcccctg catccccacg tgcagctgga ggagcgcggc 300

ctccagcgcg gggacttctc tctgtggttg cgcccagctc tgcgcaccga tgcgggcgag 360

taccacgcca ccgtgcgcct cccgaaccgc gccctctcct gcagtctccg cctgcgcgtc 420

ggccaggcct cgatgattgc tagtccctca ggagtcctca agctgtctga ttgggtcctt 480

ttgaactgct ccttcagccg tcctgaccgc ccagtctctg tgcactggtt ccagggccag 540

aaccgagtgc ctgtctacaa ctcaccgcgt cattttttag ctgaaacttt cctgttactg 600

ccccaagtca gccccctgga ctctgggacc tggggctgtg tcctcaccta cagagatggc 660

ttcaatgtct ccatcacgta caacctcaag gttctgggtc tggagcccgt agcccctctg 720

acagtgtacg ctgctgaagg ttctagggtg gagctgccct gtcatttgcc cccaggagtg 780

gggacccctt ctttgctcat tgccaagtgg actcctcctg gaggaggtcc tgagctcccc 840

gtggctggaa agagtggcaa ttttaccctt caccttgagg ctgtgggtct ggcacaggct 900

gggacctaca cctgtagcat ccatctgcag ggacagcagc tcaatgccac tgtcacgttg 960

gcggtcatca cagtgactcc caaatccttc gggttacctg gctcccgggg gaagctgttg 1020

tgtgaggtaa ccccggcatc tggaaaggaa agatttgtgt ggcgtcccct gaacaatctg 1080

tccaggagtt gcccgggccc tgtgctggag attcaggagg ccaggctcct tgctgagcga 1140

tggcagtgtc agctgtacga gggccagagg cttcttggag cgacagtgta cgccgcagag 1200

tctagctcag gcgcccacag tgctaggaga atctcaggtg accttaaagg aggccatctc 1260

catcatcacc atcatcat 1278

<210> 71

<211> 426

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 71

Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser Pro Asn Leu Asp Pro Asn

20 25 30

Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly

35 40 45

Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu His Gln Gly Met Pro Ser

50 55 60

Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Ala Pro

65 70 75 80

Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu His Pro His Val Gln Leu

85 90 95

Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro

100 105 110

Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His Ala Thr Val Arg Leu Pro

115 120 125

Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser

130 135 140

Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys Leu Ser Asp Trp Val Leu

145 150 155 160

Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Val Ser Val His Trp

165 170 175

Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr Asn Ser Pro Arg His Phe

180 185 190

Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln Val Ser Pro Leu Asp Ser

195 200 205

Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser

210 215 220

Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu Glu Pro Val Ala Pro Leu

225 230 235 240

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys His Leu

245 250 255

Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ala Lys Trp Thr Pro

260 265 270

Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala Gly Lys Ser Gly Asn Phe

275 280 285

Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr

290 295 300

Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu

305 310 315 320

Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Leu Pro Gly Ser Arg

325 330 335

Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Lys Glu Arg Phe

340 345 350

Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg Ser Cys Pro Gly Pro Val

355 360 365

Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala Glu Arg Trp Gln Cys Gln

370 375 380

Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala Thr Val Tyr Ala Ala Glu

385 390 395 400

Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys

405 410 415

Gly Gly His Leu His His His His His His

420 425

<210> 72

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgaagct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 73

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 73

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 74

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgag acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 75

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 75

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 76

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 77

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 78

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgaagatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 79

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 79

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 80

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgag acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgaagatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 81

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 81

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 82

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgaagct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 83

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 83

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 84

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgag acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgatgaagct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 85

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 85

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Glu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 86

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

gaggttcagc tgttggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggc 300

tggtgggagc tactacgtcc cgaagatgct tttgatatct ggggccaagg gacaacggtc 360

accgtctcga gc 372

<210> 87

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 87

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 88

Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5

<210> 89

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 89

Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 90

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 90

Asp Gly Trp Trp Glu Leu Leu Arg Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 91

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 91

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Tyr

1 5 10

<210> 92

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 92

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser

1 5

<210> 93

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 93

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln Val Val

1 5 10

Claims (10)

1.一种结合淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的抗体，其中该抗体具有显著改善的抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC)II类分子之结合的作用。

2.权利要求1的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含如下的氨基酸序列：

序列41、序列45、序列49、序列53、序列57、序列61、序列75或序列77；

轻链可变区包含如下的氨基酸序列：

序列43、序列47、序列51、序列55、序列59或序列63。

3.权利要求1或2的抗体，包含如下的重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)氨基酸序列41和43；

(2)氨基酸序列45和47；

(3)氨基酸序列49和51；

(4)氨基酸序列53和55；

(5)氨基酸序列57和59；

(6)氨基酸序列61和63；

(7)氨基酸序列75和43；或

(8)氨基酸序列77和43。

4.权利要求1-3任一项的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列41，轻链可变区包含氨基酸序列43。

5.一种分离的抗LAG-3抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含：

(a)重链可变区CDR1，包含序列SYGIS(序列88)；

(b)重链可变区CDR2，包含序列WISAYNGNTNYAQKLQG(序列89)；和

(c)重链可变区CDR3，包含序列DGWWELLRPDDAFDI(序列90)；

轻链可变区包含：

(d)轻链可变区CDR1，包含序列SGDKLGDKYAY(序列91)；

(e)轻链可变区CDR2，包含序列YDSDRPS(序列92)；和

(f)轻链可变区CDR3，包含序列QVWDSSSDQVV(序列93)。

6.权利要求5的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(1)重链可变区包含氨基酸序列41，轻链可变区包含氨基酸序列43；

(2)重链可变区包含氨基酸序列75，轻链可变区包含氨基酸序列43；和

(3)重链可变区包含氨基酸序列77，轻链可变区包含氨基酸序列43。

7.权利要求1-6任一项所述的抗体，其为单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

8.权利要求1-7任一项所述的抗体，其为结合LAG-3的抗体片段。

9.权利要求8的抗体，其中所述抗体片段为Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')₂片段。

10.权利要求1-7任一项所述的抗体，其为全长抗体。