CN114410689B

CN114410689B - 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法

Info

Publication number: CN114410689B
Application number: CN202210316484.5A
Authority: CN
Inventors: 张秀军; 刘磊; 王星星
Original assignee: Beijing Xunsheng Biomedical Research Co ltd
Current assignee: Beijing Xunsheng Biomedical Research Co ltd
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-03-29
Also published as: CN114410689A

Abstract

本发明属于抗肿瘤细胞制备领域，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：制备包含有目的基因的重组慢病毒，目的基因包括IL‑7序列、IL‑15序列和IL‑7‑IL‑15融合序列；从肿瘤组织中分离浸润淋巴细胞，加入IL‑2，将细胞培养至对数生长期；将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中，培养2~4天后，加入筛选剂进行筛选培养，培养至全部细胞为转基因阳性细胞；使用Tet‑on系统，加入诱导剂诱导IL‑7或/和IL‑15的表达，维持细胞的扩增培养。该制备方法获得的TIL细胞扩增效率明显提高，比常用TIL扩增方法高5‑10倍左右，扩增的淋巴细胞具有更高的杀伤肿瘤效果。

Description

一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法

技术领域

本发明涉及抗肿瘤细胞的制备方法，具体涉及一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TIL）作为一种个性化的过继性细胞疗法（Adoptive cell transfer therapy，ACT）,至今已发展30余年，显示出巨大的临床应用前景。TIL具有TCR克隆多样性、优越的肿瘤归巢能力，在治疗实体肿瘤方面疗效显著和具有良好的安全性，具有其他ACT方法无法比拟的优势。到目前为止，TIL疗法目前主要作为二线治疗正在进行临床试验。TIL疗法在黑色素瘤、非小细胞肺癌和晚期宫颈癌中已经显示出令人印象深刻的临床反应。

通常TIL的制备方法是肿瘤组织用机械处理和酶消化以后获得单细胞悬液，通过加入高浓度的IL-2来选择培养T淋巴细胞，2-4周内培养到数十亿的TIL细胞后回输给患者。回输治疗伴随高剂量的IL-2输入，来支持注入体内TIL的生长和活性。然而高剂量的IL-2通常会引起全身毒性，需要加强监测和护理；此外，IL-2还可能促进抑制性T细胞的活性，从而抑制TIL的抗肿瘤反应；上述弊端大大限制了TIL治疗的临床应用。

细胞因子IL-7属于促红细胞生成家族 I 型短链细胞因子。研究表明IL-7的表达与T细胞增殖密切相关。如用IL-7刺激新鲜T细胞，T细胞可剂量依赖性扩增，包括CD4+和CD8+亚群；敲除IL-7R，T细胞会停止生长；转入IL-7基因可促进CD4+/ CD8+T细胞的增殖。但CD4+和CD8+T细胞对IL-7有不同的应答效果。IL-7对CD8+T细胞亚群的作用要强于CD4+细胞亚群。与IL-2一样，IL-15也是一种γ链细胞因子。IL-15与IL-2具有类似的生物学功能，IL-15与IL-2共用γc受体亚单位，这两种细胞因子均能诱导T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NKcell）的分化以及促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。但是与IL-2相比，IL-15不会导致Treg的扩增。目前，IL-15常与IL-2联合使用进行T细胞或NK细胞体外扩增培养。

发明内容

肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是一种从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，含有肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+T细胞群体，为了增强TIL对肿瘤细胞的杀伤力和扩增效力，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，具体包括如下步骤：

1）制备包含有目的基因的重组慢病毒；其中，所述目的基因包括IL-7序列、IL-15序列和IL-7-IL-15融合序列；

2）从肿瘤组织中分离浸润淋巴细胞，加入IL-2进行细胞培养至对数生长期；

3）将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中，培养2~4天后，加入筛选剂进行筛选培养，培养至全部细胞为转基因阳性细胞；

4）使用Tet-on系统，加入诱导剂诱导IL-7或/和IL-15的表达，维持浸润淋巴细胞的扩增培养。

其中，所述诱导剂为四环素或四环素衍生物。四环素衍生物的性能类似四环素，属于四环素的衍生，例如盐酸四环素。

相比在蛋白水平控制IL-7或/和IL-15在患者体内的表达水平，本发明是在转录水平控制它们的表达，在治疗过程中更容易操控实现；同时本发明采用的Tet-on系统在转录水平调控IL-7和IL-15的表达具有更高的灵敏度；在操作过程中，只需要少量的诱导剂就可以显著诱导IL-7或/和IL-15的表达，可使在肿瘤治疗过程中，诱导表达的效果更高更精准，患者所受的毒性更低。

另外相比组成型表达IL-7或/和IL-15，本发明采用的Tet-on系统是一个诱导表达系统，具有更高的应用灵活性，随时可以在需要的时候诱导或关闭IL-7或/和IL-15的表达，进一步避免了IL-7或/和IL-15持续表达的潜在毒性。

此外，本发明通过最大程度降低IL-2对TIL活性的影响，提高TIL在体内的扩增效率，同时消除IL-2对患者的毒性，以充分发挥该疗法的潜力。本发明采用转基因方法获得包含有IL-7或/和IL-15的目的基因的稳转TIL细胞；并使TIL细胞在外源诱导剂四环素或其衍生物存在的情况下表达IL-7或/和IL-15，代替常规使用外源添加高浓度IL-2促进TIL细胞生长和扩增。该发明方法获得的TIL细胞扩增效率明显提高，比常用TIL扩增方法高5-10倍左右，扩增的淋巴细胞具有更高的杀伤肿瘤效果。

本发明使用Tet-on系统，通过添加四环素或四环素衍生物来诱导IL-7和IL-15的表达。

其中，Tet-on系统在控制目标基因表达上具有很强的优势。首先Tet-on系统在没有诱导剂时目标基因的表达水平非常低，而添加诱导剂时表达水平显著增高，最高诱导倍数可达10000倍。其次，Tet-on系统的诱导药物为四环素（tetracycline，Tet）或其衍生物如强力霉素（doxcycline，Dox），Tet作为一种抗生素具有很长的历史应用记录，是对人体较为安全的一种药物，并且在Tet-on系统中低剂量的Tet就可调节基因的表达，所以不会对动物或细胞产生强毒性。最后一点是，四环素Tet-on系统具有可逆性，在去除诱导剂后可使系统关闭，也可以反复加入诱导剂，多次启动诱导反应。

本发明进一步提出的，所述IL-7-IL-15融合序列中IL-7和IL-15之间采用IRES连接。IRES能够使蛋白质翻译起始不依赖于信使RNA5’帽子结构，可以起始RNA从中间开始翻译蛋白质，因此可以保证IL-7和IL-15均能正确表达功能蛋白。

其中，所述IL-7序列如SEQ ID No：1所示；

所述IL-15序列如SEQ ID No：2所示；

所述IL-7-IL-15融合序列如SEQ ID No：3所示。

在实际应用中，三条序列会进行优化；下载IL-7和IL-15的CDS序列，然后进行密码子优化增强其表达效果。其优化方式包括但不限于：人类密码子使用偏好性，适度的GC含量，稳定的mRNA二级结构等，消除重复序列，隐蔽剪接位点以及不需要的限制性酶切位点，同时防止细胞中tRNA库的耗尽。

本发明进一步提出的，步骤1）中所述重组慢病毒采用如下方式制得：获取并优化合成IL-7序列、IL-15序列和IL-7-IL-15融合序列，将序列接入慢病毒载体，然后转染HEK-293T细胞进行病毒制备扩增，培养后获得重组慢病毒。

本发明进一步提出的，步骤2）中细胞培养在重组人纤维蛋白和CD3抗体包被的培养环境中进行细胞培养。

本发明进一步提出的，步骤3）中，将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中时，同时加入Polybrene（聚凝胺）；可显著提高逆转录病毒对细胞的感染效率。

其中，所述筛选剂为Puromycin（嘌呤霉素）。

本发明提供一种优选方案，所述制备方法包括如下步骤：

1）制备包含有目的基因的重组慢病毒；其中，所述目的基因包括IL-7序列、IL-15序列以及IL-7-IL-15融合序列；

具体为：获取并优化合成IL-7序列、IL-15序列和IL-7-IL-15融合序列，将序列接入慢病毒载体，然后转染HEK-293T细胞进行病毒制备扩增，培养后获得重组慢病毒；

其中，所述优化包括但不限于：人类密码子使用偏好性，适度的GC含量，稳定的mRNA二级结构等，消除重复序列，隐蔽剪接位点以及不需要的限制性酶切位点，同时防止细胞中tRNA库的耗尽；

优选的，所述IL-7序列如SEQ ID No：1所示；所述IL-15序列如SEQ ID No：2所示；所述IL-7-IL-15融合序列如SEQ ID No：3所示；

2）将肿瘤组织经消化处理后，获得含有浸润淋巴细胞的单细胞悬液；用IL-2培养单细胞悬液，分离纯化浸润淋巴细胞；然后在重组人纤维蛋白和CD3抗体包被的培养环境中，向纯化后的浸润淋巴细胞中继续加入IL-2，培养直至到对数生长期；

3）将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中，同时加入Polybrene，转染2~4天；然后再加入筛选剂进行筛选培养，培养至全部细胞为转基因阳性细胞；

4）使用Tet-on系统，加入四环素或四环素衍生物诱导IL-7或/和IL-15的表达，维持浸润淋巴细胞的扩增培养。

本发明进一步提出的，所述肿瘤组织选自肺肿瘤组织、乳腺肿瘤组织中的一种。

本发明所提供的制备方法可在制备抗肿瘤治疗剂上进行广泛的应用。

本发明提供的制备方法从肿瘤组织中分离浸润淋巴细胞，接种到重组人纤维蛋白和CD3抗体包被的培养瓶中，加入IL-2，培养到对数生长期，用包含有IL-7、IL-15或IL-7-IL-15融合基因的慢病毒稳转TIL细胞，培养72h左右后，加入筛选抗生素Puromycin（嘌呤霉素），两周后不再加入IL-2培养，使用诱导剂四环素或其类似物诱导IL-7或/和IL-15的表达，用于维持TIL细胞的扩增培养，扩增到一定倍数后收获细胞。该方法通过加入四环素诱导剂诱导TIL细胞表达转基因IL-7或/和IL-15，培养后期可以不依赖于高浓度IL-2添加培养；同时可以减少回输细胞数量。TIL回输患者时同样可以不用输注高剂量IL-2，只需按需注射一定量的四环素或其衍生物，细胞既可以在体内大量扩增维持活性，又避免了高浓度IL-2输注对人体的全身毒性；另外本发明方法不需要担心人体持续暴露于IL-7和/或IL-15可能导致的毒性问题，因为在没有外源诱导剂输入的情况下，TIL细胞IL-7或/和IL-15几乎不表达。

附图说明

图1为非小细胞肺癌转基因TIL分泌IL-7和IL-15的ELISA检测结果图；

图2为非小细胞肺癌不同培养方法获得的TIL细胞数目；

图3为非小细胞肺癌不同培养方法获得的TIL细胞扩增倍数；

图4为非小细胞肺癌不同培养方法获得的TIL杀伤靶细胞的结果图；

图5为乳腺癌转基因TIL分泌IL-7和IL-15的ELISA检测结果图；

图6为乳腺癌不同培养方法获得的TIL细胞数目；

图7为乳腺癌不同培养方法获得的TIL细胞扩增倍数；

图8为乳腺癌不同培养方法获得的TIL杀伤靶细胞的结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种浸润淋巴细胞的制备方法，具体如下：

1）制备包含有目的基因的重组慢病毒；

其中，所述IL-7序列如SEQ ID No：1所示；所述IL-15序列如SEQ ID No：2所示；所述IL-7-IL-15融合序列如SEQ ID No：3所示；

2）将肿瘤组织经消化处理后，获得单细胞悬液，用IL-2培养单细胞悬液，分离纯化浸润淋巴细胞；然后在重组人纤维蛋白和CD3抗体包被的培养环境中，向纯化后的浸润淋巴细胞中继续加入IL-2，培养直至到对数生长期；

3）将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中，同时加入Polybrene，转染3天；然后再加入puromycin进行筛选培养，并培养至全部细胞为转基因阳性细胞，之后不再加入IL-2，而是通过加入诱导剂培养浸润淋巴细胞；

实施例1 IL-7、IL-15和IL-7-IL-15基因的慢病毒表达载体的构建

1、含IL-7或IL-15或IL-7-IL-15基因质粒构建

从NCBI上下载IL-7和IL-15的CDS序列，然后进行密码子优化增强其表达效果，这些优化方式包括但不限于：人类密码子使用偏好性，适度的GC含量，稳定的mRNA二级结构等，消除重复序列和隐蔽剪接位点以及不需要的限制性酶切位点，同时防止细胞中tRNA库的耗尽。优化完成后的序列直接进行基因合成，利用ECoRI和BamHI酶切位点连入同样双酶切的Tet-on表达质粒pLVX-TetOne-Puro。酶切验证和测序正确的质粒分别命名为pLVX-IL-7，pLVX-IL-15和pLVX-IL-7-IL15。IL-7和IL-15之间用IRES连接。IRES是内部富含二级结构的核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site)，可以介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译。IRES能够使蛋白质翻译起始不依赖于信使RNA5’帽子结构，可以起始RNA从中间开始翻译蛋白质，因此可以保证IL-7和IL-15均能正确表达功能蛋白。

2、慢病毒制备和滴度测定

将上述步骤获得的含IL-7、IL-15和IL-7-1L-15基因的pLVX-TetOne-Puro质粒、pRSV-Rev载体、pMD2.G载体和pMDLg/pRRE载体分别大提纯化质粒，按一定比例使用Lipo2000混合转染长到大约70%密度的HEK-293T细胞，8h后更换为完全培养基，培养48h和72h后分别收取培养液离心保留上清，上清用0.45μm滤器过滤，获得的滤液即为重组慢病毒的原溶液。

使用Lentivirus Concentration Solution（YEASEN，41101ES50)慢病毒浓缩试剂盒对重组慢病毒进行浓缩。

随后进行慢病毒滴度测定，将HEK-293T细胞接种至24孔板中，每孔1×10⁵个，37℃培养过夜。用DMEM培养基重悬病毒原液，第一个孔病毒原液量为10μL，然后进行10倍梯度稀释，每孔加入100μL培养基-病毒混合液，每个稀释浓度做3个复孔。放入 37℃ 5% CO₂培养箱中培养24h后，将含有病毒DMEM的培养基更换为不含病毒液的DMEM完全培养基继续培养48h后，应用流式细胞仪检测转基因表达阳性的细胞比例，计算病毒滴度。计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数，假设为 A（倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数）和 B（倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数）。

慢病毒滴度计算公式：慢病毒滴度（TU/ml）=（A+B*10)*1000/2/A 孔病毒量。

实施例2 非小细胞肺癌TIL细胞的制备

1. 组织预处理：肿瘤组织标本采集管、试剂、操作器具等用75%乙醇擦拭外表面后放入生物安全柜，在生物安全柜内打开肿瘤组织标本采集瓶，清洗处理肿瘤组织，去除血管、包膜及其它坏死组织。

2. 组织消化：

1）将肿瘤组织在组织酶解液中剪碎至近肉沫状，加组织酶解液混悬，混悬液转移至离心管内，放入电热恒温振荡仪，温度设置37℃，振荡频率为150rpm/min，时间30-60min，恒温消化。

2）取40mL终止保护液放在50mL离心管中待用，取一个70µm的滤网置于50mL离心管口处，准备1个5mL一次性注射器待用。

3）从振荡仪中取出离心管，用移液管逐渐加入到上步骤中的滤网，用研磨棒研磨过滤，边研磨边冲洗，收集单细胞悬液。

4）将3）中收集的单细胞悬液，离心500g，8min，弃上清。用10mL X-VIVO-15培养基重悬细胞沉淀，取样计数，剩余细胞全部离心，500g，8min。

3. 铺板培养

通过离心可以达到除去细胞混悬液中残留蛋白质的目的。按照计数结果，调整细胞密度为0.5-1×10⁶/mL，放入12或24孔培养板，培养基中加入1000-3000IU/mL IL-2。置于CO₂细胞恒温培养箱培养，设置为37℃，CO₂为5%。

4. TIL细胞的分离纯化（S1阶段）

1）换液及扩孔：每天在B+A级培养室，在显微镜下观察细胞如无明显贴壁细胞，隔天进行换液，如淋巴细胞无逐渐增多或癌细胞无减少则继续换液；如淋巴细胞密度明显增多如有细胞团出现，需扩孔操作完成后置于37℃，5% CO₂培养温箱培养。

2）收集：持续培养不超过10天，进行细胞收集。取样检测细胞数量/活性，根据计数结果进行细胞冻存或者进入S2阶段。经过S1阶段培养可以除去组织中肿瘤细胞、纤维细胞以及其他和TIL无关的杂细胞。每天通过显微镜下观察细胞生长状况来确定后续需要进行的工艺操作。观察指标包括淋巴细胞、肿瘤细胞以及其它细胞数量的变化情况和淋巴细胞的分离程度。

5. TIL细胞的快速扩大培养（S2阶段）

1）Day0：提前包被，1-5μg/mL CD3抗体＋10-15μg/mL重组人纤维蛋白（Retronectin缩写RN）加入培养瓶中，4℃包被。使用前将包被液吸出，用PBS洗涤2-3次。取2×10⁷个TIL细胞转移培养瓶，置于CO₂细胞恒温培养箱培养，设置温度：37℃，CO₂：5%，分为七组，每组细胞开始培养数目均为2×10⁷个。

2）Day1：每组加入CTS 免疫细胞血清替代品，第一、五、六、七组加入1000-3000IU/mL IL-2，第二组加入25 ng/mL IL-7，第三组加入25 ng/mL IL-15，第四组同时加入25 ng/mL IL-7和IL-15，Day2到Day4，镜下观测细胞，取样计数，如TIL细胞逐渐增多，需进行补液操作，使细胞密度维持约1×10⁶/mL，完毕置于CO₂细胞培养温箱，温度：37℃，CO₂：5%。

3）Day2：重组慢病毒转染，第二天，将实施例1中制备的包含有IL-7，I-15和IL-7-IL-15基因序列的重组慢病毒分别加入五、六和七组对数生长期的TIL细胞中，同时加入8 μg/ml polybrene。转染3天后加入2ug/mL puromycin筛选，筛选培养大概10-12天后所有细胞都是转基因阳性细胞。

4）Day13：五、六和七组换液时开始撤掉IL-2的添加，通过加入0.5 μg/mL盐酸四环素（Sigma，Cat.：T3383）分别诱导IL-7、IL-15和IL-7-1L-15的表达来维持TIL的培养扩增，加入诱导剂后第二天取上清检测细胞因子IL-7和IL-15的分泌情况（IL-7 Human ELISAKit，Invitrogen，Cat.：#EHIL7X5；IL-15 Human ELISA Kit，Invitrogen，Cat.：BMS2106)。

如图1所示，相比对照组，转基因组在诱导剂四环素的作用下均能产生大量的IL-7或/和IL-15。转基因IL-7和IL-7-IL-15 TIL分别能产生34948.8 pg/mL和34176.2 pg/mLIL-7；转基因IL-15和IL-7-IL-15 TIL分别能产生47615.5 pg/mL和46209.6 pg/mL IL-15。第一组每次换液加入1000-3000IU/mL IL-2，第二组加入25 ng/mL IL-7，第三组加入25ng/mL IL-15，第四组同时加入25 ng/mL IL-7和IL-15。

5）Day23-25：继续培养10-12天，此时细胞数可以达到回输数量。对每组进行记数，检测扩增倍数。

如图2和3所示，本发明的转基因方法可显著提高TIL细胞的扩增倍数，尤其IL-7-IL-15转基因组能达到最高的扩增倍数，达到2700倍。

6. TIL细胞杀伤功能测定

1）取指数生长期的人肺腺癌细胞细胞系H1975进行台盼蓝染色，并计数；于96孔板内每孔加入8000 Target cells/100 μL，于37℃，5%CO₂培养箱孵育过夜，使其贴壁；

2）向靶细胞孔中按10:1和5:1的效靶比加入效应细胞（上步骤5中收获的TIL细胞，该效应细胞是经过HLA配型与靶细胞匹配的TIL细胞），并做相应数量的TIL单独培养的对照；阴性对照组靶细胞使用PBMC；然后转入37℃、5% CO₂培养箱，共孵育24 h；

3）24 h后吸取100μL上清，并向孔内加入20 μL/孔MTS试剂；

4）37℃，5% CO₂培养箱避光孵育0.5-4 h；

5）使用酶标仪检测490nm处的吸光度值；

6）按照下列公式计算各效靶比下的杀伤率。

Cytotoxicity(%)=1-(OD共孵育组-ODTIL单独培养组)/（OD肿瘤细胞阴性对照组-OD空白对照组)×100%。

结果分析：如图4所示，以健康人的无特异性杀伤的PBMC为阴性对照组，该组在理论上的特异性杀伤为0。无论E:T＝10:1或5：1时，第七组转基因TIL（IL-7-IL-15）都表现出最强杀伤效果，E:T＝20:1时可以达到90%以上的杀伤，E:T＝10：1时杀伤降到75%左右。这些结果表明相比普通IL-2培养的TIL细胞，转基因IL-7-IL-15 TIL细胞具有更强的杀伤靶细胞的能力。

实施例3 乳腺癌TIL细胞的制备

乳腺癌组织处理和消化，TIL细胞的分离纯化以及扩大培养阶段操作均同实施例2。扩大培养阶段筛选转基因阳性细胞加上四环素诱导剂后同样利用ELISA试剂盒检测转基因TIL分泌IL-7和IL-15的水平。

结果如图5所示，乳腺癌来源的转基因TIL同样分泌高水平IL-7和IL-15。相比对照组，转基因IL-7和IL-7-IL-15 TIL分别能产生39282 pg/mL和38746.5 pg/mL IL-7；转基因IL-15和IL-7-IL-15 TIL分别能产生54114.3 pg/mL和52106.1 pg/mL IL-15。

整个S2阶段完成以后检测细胞扩增数目和倍数。

结果如图6和7所示，IL-7-IL-15转基因TIL具有最高的细胞数目，可以达到2.89×10¹⁰个，相比开始2×10⁷数目扩增了1445倍。所有组均达到细胞治疗回输剂量要求。

对制备的乳腺癌TIL细胞同样进行杀伤效果检测，所使用乳腺癌肿瘤细胞系为MDA-MB-231，同样效应细胞TIL和靶细胞细胞系是经过HLA配型匹配的。

由图8可以看出本发明转基因方法培养的IL-7-IL-15 TIL 细胞具有最强的杀伤活性，显著高于传统方法，充分说明本方法是一种有效的培养 TIL 细胞的方法。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京循生生物医学研究有限公司

<120> 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法

<140> 2022103164845

<141> 2022-05-13

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgtttcatg tctcgtttcg atacatcttt ggactccccc ccctgatcct cgtcctcctc 60

cccgtcgctt cgtcggactg cgacatcgaa ggaaaagacg gaaaacaata cgaatcggtg 120

ctcatggtgt cgatcgacca gctgctggac tcgatgaaag aaatcggatc gaactgcctc 180

aacaacgaat ttaacttttt taaaagacat atctgcgacg ctaacaagga aggaatgttt 240

ctctttcgcg ctgctcgaaa actgcgacag tttctcaaaa tgaactcgac gggagacttt 300

gacctccacc tcctgaaggt gtcggaagga acgacgatcc tgctgaactg cacgggacag 360

gtcaaaggac gaaaacccgc tgctctcgga gaagctcagc ccacgaagtc gctggaagaa 420

aacaaatcgc tgaaggaaca aaaaaaactg aacgacctct gctttctcaa gcgcctcctc 480

caggaaatca agacgtgctg gaacaagatc ctgatgggaa cgaaagaaca ttga 534

<210> 2

<211> 489

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgagaatct cgaaacccca cctgagatcg atctcgatcc aatgctacct gtgcctcctg 60

ctgaactcgc actttctcac ggaagctgga atccacgtgt ttatcctggg atgcttttcg 120

gctggactgc ccaagacgga agctaactgg gtcaacgtca tctcggacct gaaaaagatc 180

gaagacctga tccaatcgat gcatatcgac gctacgctct acacggaatc ggacgtgcat 240

ccctcgtgca aagtcacggc tatgaagtgc tttctcctgg aactgcaagt catctcgctg 300

gaatcgggag acgcttcgat ccacgacacg gtcgaaaacc tcatcatcct cgctaacaac 360

tcgctgtcgt cgaacggaaa cgtcacggaa tcgggatgca aggaatgcga agaactggaa 420

gaaaaaaaca tcaaagaatt tctgcagtcg tttgtgcaca tcgtccagat gtttatcaac 480

acgtcgtga 489

<210> 3

<211> 1597

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgtttcatg tctcgtttcg atacatcttt ggactccccc ccctgatcct cgtcctcctc 60

cccgtcgctt cgtcggactg cgacatcgaa ggaaaagacg gaaaacaata cgaatcggtg 120

ctcatggtgt cgatcgacca gctgctggac tcgatgaaag aaatcggatc gaactgcctc 180

aacaacgaat ttaacttttt taaaagacat atctgcgacg ctaacaagga aggaatgttt 240

ctctttcgcg ctgctcgaaa actgcgacag tttctcaaaa tgaactcgac gggagacttt 300

gacctccacc tcctgaaggt gtcggaagga acgacgatcc tgctgaactg cacgggacag 360

gtcaaaggac gaaaacccgc tgctctcgga gaagctcagc ccacgaagtc gctggaagaa 420

aacaaatcgc tgaaggaaca aaaaaaactg aacgacctct gctttctcaa gcgcctcctc 480

caggaaatca agacgtgctg gaacaagatc ctgatgggaa cgaaagaaca ttgacccctc 540

tccctccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt 600

tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc 660

tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca 720

aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac 780

gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcaacaggt gcctctgcgg 840

ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt 900

gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct 960

gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg 1020

ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt 1080

ggttttcctt tgaaaaacac gatgataaat gagaatctcg aaaccccacc tgagatcgat 1140

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tgtgcacatc gtccagatgt ttatcaacac gtcgtga 1597

Claims

1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备包含有目的基因的重组慢病毒；其中，所述目的基因为IL-7-IL-15融合序列；

2）从肿瘤组织中分离浸润淋巴细胞，在浸润淋巴细胞中加入IL-2进行细胞培养至对数生长期；

3）将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中，培养2~4天后，加入筛选剂进行筛选培养，培养至全部细胞为转基因阳性细胞；之后不再加入IL-2，通过加入诱导剂培养浸润淋巴细胞；

4）使用Tet-on系统，加入诱导剂诱导IL-7和IL-15的表达，维持浸润淋巴细胞的扩增培养；

所述IL-7-IL-15融合序列如SEQ ID No：3所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组慢病毒采用如下方式制得：获取并优化合成IL-7-IL-15融合序列，将序列接入慢病毒载体，然后转染HEK-293T细胞进行病毒制备扩增，培养后获得重组慢病毒。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中细胞培养在重组人纤维蛋白和CD3抗体包被的培养环境中进行细胞培养。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为四环素或四环素衍生物；所述四环素衍生物为盐酸四环素或强力霉素。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取并优化合成IL-7-IL-15融合序列，将序列接入慢病毒载体，然后转染HEK-293T细胞进行病毒制备扩增，培养后获得重组慢病毒；

其中，所述优化包括但不限于：人类密码子使用偏好性，适度的GC含量，稳定的mRNA二级结构，消除重复序列，隐蔽剪接位点以及不需要的限制性酶切位点，同时防止细胞中tRNA库的耗尽；

所述IL-7-IL-15融合序列如SEQ ID No：3所示；

3）将所述重组慢病毒加入培养至对数生长期的浸润淋巴细胞中，同时加入Polybrene，转染2~4天；然后再加入筛选剂进行筛选培养，培养至全部细胞为转基因阳性细胞；之后不再加入IL-2，通过加入诱导剂培养浸润淋巴细胞；

4）使用Tet-on系统，加入四环素或四环素衍生物诱导IL-7和IL-15的表达，维持浸润淋巴细胞的扩增培养。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肿瘤组织选自肺肿瘤组织、乳腺肿瘤组织中的一种。

7.权利要求1~6任一项所述的制备方法在制备抗肿瘤治疗剂上的应用。