CN114295533A - 一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，尤其是一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，针对现有的红细胞渗透脆性测定方法存在的操作繁琐、准确性低和抗干扰能力差的问题，现提出如下方案，其包括以下步骤：S1、在分析模组的反应池中，加入低渗透压缓冲液；S2、往S1反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；S3、上述混合液发生溶血并达到溶血平衡状态后，测定平衡状态的红细胞数量A；S4、溶血平衡状态为红细胞不再随孵育时间延长继续减少，本方法检测的是真正意义的红细胞渗透脆性，样品无需进行前处理，测试过程中无需离心，仅需要颗粒或细胞计数模块就可以完成，可配合自动化检测分析仪实现全自动化检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法。
背景技术
正常的红细胞为双凹圆盘形，若将红细胞置于低渗溶液中，因细胞内外存在渗透压差，水分子进入红细胞，使其发生肿胀，甚至破裂，使血红蛋白释出，此即红细胞溶解。红细胞对低渗溶液具有不同的抵抗力，这种抵抗力与红细胞表面积/体积比值有关，也即红细胞有不同的渗透脆性，表面积/体积比值小者抵抗力小(渗透脆性大)；反之，抵抗力大(渗透脆性小)。红细胞膜脆性增高常见于遗传性球型红细胞增多症、椭圆型红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血伴球型红细胞增多症、遗传性口型红细胞增多症的部分病例及II型糖尿病等；红细胞脆性减低见于缺铁性贫血、地中海性贫血、脾切除术后、阻塞性黄疸、肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。某些中药，如当归等，亦可明显减低红细胞脆性，磁场、紫外线、射频亦可降低红细胞脆性。红细胞渗透脆性试验可以作为遗传性红细胞增多症，地中海贫血等多种疾病重要的辅助诊断方法。
目前临床上对红细胞渗透脆性的测定方法主要有以下三种：
1、红细胞渗透脆性试验：本法为传统的手工法，测定红细胞对不同浓度低渗氯化钠溶血的抵抗力，即红细胞的脆性。配制0.68％～0.24％12个不同浓度的氯化钠溶液管，每管1mL。于患者床前用16号针头取血约1ml，各管内加入全血50微升，混匀后置冰箱中2小时观察结果。开始溶血为上层液开始呈透明红色且管底有红细胞者；完全溶血为溶液为透明红色且管底无红细胞者。记录开始溶血及完全溶血的氯化钠浓度，从而得出被检红细胞的脆性试验结果。参考值为开始溶血为0.42％～0.46％NaCl溶液；完全溶血为0.28％～0.34％NaCl溶液。患者与正常对照溶血管的氯化钠浓度相差0.04％才具有诊断价值。该方法要使用12种不同浓度的氯化钠溶液，要等待2小时。该试验简单实用，使用肉眼判断，无需任何仪器，但影响因素较多，准确性低。故每次试验应同时做正常对照。(王霄霞俞康.血液系统疾病的检验诊断.第1版.北京.人民卫生出版社，2007年01月)
2、红细胞渗透脆性试验(一管法)：该方法是在传统的红细胞渗透脆性试验的手工法的基础上改良的一种方法，其原理是通过测定红细胞在特定浓度的NaCl溶液中的溶血率来判定红细胞的渗透脆性。主要组分有A液(红细胞渗透脆性检测液)、B液(终止红细胞溶血液)和C液(皂素，红细胞溶血液)。具体测量方法如下：取试管中加入A液1ml，放37℃，预热1-2分钟，然后加入抗凝全血10μl，立刻混匀，继续放在37℃保温5分钟。5分钟后，加入B液1ml，混匀，3000转/分钟，离心5分钟。上清液轻轻倒入1.0cm×1.0cm的比色杯中(切勿搅动试管底的红细胞)，于530nm波长读取光密度D1(以纯化水作空白对照)。向试管中加入C试验液0.4ml，混匀，待血液全部溶血(透明红色)后，将比色杯中已比色的溶液倒入试管中混匀。将混匀后的溶液，倒入比色杯中，再于530nm波长比色，读取光密度D2。按溶血率(％)＝D1/(D2×1.25)×100％计算出溶血率百分比。溶血率>65％为正常溶血率，<55％为溶血率降低(杜传书增瑞萍华小云等.地中海贫血一管筛查法《一种简易筛查人群地中海贫血的方法1983年》)。有人利用双蒸水替换C液中的皂素，利用酶标仪进行检测，大大简化了检测步骤(张玲，一种改进的红细胞渗透脆性检测方法：中国，CN105136687A[S].2015-12-9)。一管法相对于传统手工法的2小时大为降低，目前是大多数医院使用的红细胞渗透脆性的测定方法。但本法对血液标本的新鲜度要求高，应采用72小时内采集的，2-8℃保存的血液进行测试。
3、比浊分析法：利用检测体系中红细胞为颗粒的特性，利用微电脑控制的自动化温控和检测记录装置，比色杯中加入一定量的低渗NaCl溶液，37℃孵育后再加入一定量的全血标本，快速混匀，并立即开始记录在某特定波长(600nm-800nm)下，透射比浊(潘于华，一种红细胞渗透脆性的测定方法]:中国，CN1268928C[P].2006-8-9)在每一单位时间的吸光度值，以吸光度不再下降为反应终点，从而得到吸光度的动态变化值(A1、A2、A3...Az)。第i秒至第x秒的相对溶血率为(Ai-Ax)/Ai×100％。进而计算出反应中某一时间段里前一测定点至后一测定点的相对溶血率。以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出可反映溶血变化的动态曲线图，根据图形的编号特征可对样品的红细胞脆性进行相关分析。此方法需要记录从反应开始至反应终点的所有吸光度值，需要等反应结束才能出结果，测量时间较长。有人在此基础上，利用相似的波长，改用散射比浊法进行红细胞脆性的检测(卢岳军，一种基于散射比浊技术的红细胞渗透脆性测定方法:中国，CN105928907A[S].2016-9-7；廉正鑫；祁晖，一种红细胞渗透脆性测定方法及其试剂盒:中国，CN201910833578.8)，亦是记录加入全血标本后的散射光的值计算红细胞渗透脆性，因为检测时间短，溶血程度检测为间接参数，缺乏针对性，与传统手工方法和一管法及透射比浊法缺乏一致性。
4.流式细胞术：王维维等[王维维,袁向亮,费奇力,沈立松.流式细胞术快速测定红细胞渗透脆性的应用[J].检验医学,2016,(10):911-916]利用流式细胞术测定红细胞渗透脆性：(1)红细胞悬液的制备。用生理盐水经2步法稀释制得。第1步,取20～30μL全血[用血量需按照公式进行计算,用血量(μL)＝130/(红细胞数目/μL)/106]。加入1mL生理盐水,混匀,尽快执行第2步。第2步,将流式管加入1.2mL生理盐水,将上述稀释的细胞取10μL加入其中(直接加入到试管底部,不要沿管壁加入),轻轻地涡悬混匀,此红细胞悬液即可用于流式细胞仪的分析；(2)流式细胞术测红细胞渗透脆性。前向角散射和侧向角散射采用线性放大方式。FSC和TIME获取散点图也采用线性放大方式,历时204.8秒,划分为8个区域(A～H),每个区域历时约11秒,。将上述悬液混匀上机,待“R1”获取满,按暂停键,移去试管但不终止获取细胞,加入0.8mL无菌水导致渗透性溶血,继续获取细胞,直到H区结束。I区域不用于计算,每管检测约需2分钟。(3)TIME/FSC散点图中每个区域的细胞数作为反映加入无菌水前后细胞残留的参数,细胞渗透溶血的程度以残留红细胞百分比表示,使用公式计算。红细胞残留百分比(％)＝[(G区细胞数+H区细胞数)/2]/[A区细胞数×1.2/2.0]×100％。G和H用来计算红细胞残留百分比。式中1.2/2.0为校正系数,需要校准A区细胞数是因为加入的0.8mL无菌水导致细胞数被稀释；(4)结果判读。如红细胞残留百分比降低,红细胞脆性则增加。该方法可以对红细胞进行直观的检测，但操作比较繁琐，无法做到自动化检测，同时需要流式细胞仪及高级技术人员操作，难以普及。
在上述红细胞脆性的检测方法中，传统手工法需要12管低渗液进行测试，且需手工操作，测量时间长(2小时)，需肉眼判读结果，结果的重复性和准确性差；一管法虽减少了检测的试管数量，但其结果只是反应了未完全溶血的吸光度与完全溶血吸光度的比率，并非真正的溶血率；无论是透射比浊法，或散射比浊法，检测波长均在600nm-800nm之间，无法完全避开脂血对检测结果的影响。
上述所有红细胞脆性检测方法均为间接检测红细胞溶血后的情况，而非红细胞溶血前后细胞数量的直接检测，偏差比较大。流式细胞术虽然实现了红细胞颗粒的直接检测，但操作非常繁琐，且需要流式细胞仪和较高技能的操作人员，难以常规开展。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在红细胞渗透脆性测定方法存在的操作繁琐、准确性低和抗干扰能力差的缺点，而提出的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，包括以下步骤：
S1、在分析模组的反应池中，加入低渗透压缓冲液；
S2、往S1反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S3、上述混合液发生溶血并达到溶血平衡状态后，测定平衡状态的红细胞数量A；
S4、溶血平衡状态为红细胞不再随孵育时间延长继续减少；
S5、在分析模组的反应池中，加入等渗缓冲液；
S6、往S5中的反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S7、测定达到平衡状态时间点的红细胞数量B；
S8、样本中红细胞的渗透脆性结果为(B-A)/B×100％。
优选的，所述全血样本的量为1-500微升。
优选的，所述低渗透压缓冲液为氯化钠或其它盐缓冲液。
优选的，所述低渗透压缓冲液为等张缓冲液。
优选的，所述低渗透压缓冲液是电导率为5.0-7.5mS/cm、pH值为6.0-8.0的盐缓冲盐溶液。
优选的，所述低渗透压缓冲盐溶液的渗透压在50-280。
优选的，所述搅拌混匀的方式为磁力搅拌、空气搅拌、搅拌针或搅拌棒混匀方式、颠倒混匀、摇匀或反复吹打混匀等其他全血混匀方式。
优选的，所述全血标本与低低渗透压缓冲液的混合体积比例为1:10-1000，全血样本可以先行稀释，再进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
利用颗粒计数技术直接检测红细胞在检测过程中的数量变化，整体反应标本中的红细胞在特定浓度的低渗溶液中的变化情况，同时借助微处理器直接计算样本中红细胞渗透脆性结果，最为贴近红细胞渗透脆性试验理论；
本方法检测的是真正意义的红细胞渗透脆性，样品无需进行前处理，测试过程中无需离心，仅需要颗粒或细胞计数模块就可以完成，可配合自动化检测分析仪实现全自动化检测。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，包括以下步骤：
S1、在分析模组的反应池中，加入低渗透压缓冲液；
S2、往S1反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S3、上述混合液发生溶血并达到溶血平衡状态后，测定平衡状态的红细胞数量A；
S4、溶血平衡状态为红细胞不再随孵育时间延长继续减少；
S5、在分析模组的反应池中，加入等渗缓冲液；
S6、往S5中的反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S7、测定达到平衡状态时间点的红细胞数量B；
S8、样本中红细胞的渗透脆性结果为(B-A)/B×100％。
本实施例中，全血样本的量为1微升。
本实施例中，低渗透压缓冲液为氯化钠或其它盐缓冲液。
本实施例中，低渗透压缓冲液为等张缓冲液。
本实施例中，低渗透压缓冲液是电导率为5.0mS/cm、pH值为6.0的盐缓冲盐溶液。
本实施例中，颗粒计数模块及反应池可以是一体的，亦可以是分体的，颗粒计数模块可以基于电阻抗法、光阻法、激光法、流式细胞术或光散射法；颗粒检测模块可以检测0.1微米的颗粒大小，颗粒检测模块可以检测全血中的所有类型的细胞，颗粒检测模块可以是连续检测，亦可以分时检测。
本实施例中，低渗透压缓冲盐溶液的渗透压在50。
本实施例中，搅拌混匀的方式为磁力搅拌、空气搅拌、搅拌针或搅拌棒混匀方式、颠倒混匀、摇匀或反复吹打混匀等其他全血混匀方式。
本实施例中，全血标本与低低渗透压缓冲液的混合体积比例为1:10，全血样本可以先行稀释，再进行检测。
实施例二
一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，包括以下步骤：
S1、在分析模组的反应池中，加入低渗透压缓冲液；
S2、往S1反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S3、上述混合液发生溶血并达到溶血平衡状态后，测定平衡状态的红细胞数量A；
S4、溶血平衡状态为红细胞不再随孵育时间延长继续减少；
S5、在分析模组的反应池中，加入等渗缓冲液；
S6、往S5中的反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S7、测定达到平衡状态时间点的红细胞数量B；
S8、样本中红细胞的渗透脆性结果为(B-A)/B×100％。
本实施例中，全血样本的量为200微升。
本实施例中，低渗透压缓冲液为氯化钠或其它盐缓冲液。
本实施例中，低渗透压缓冲液为等张缓冲液。
本实施例中，低渗透压缓冲液是电导率为6mS/cm、pH值为7的盐缓冲盐溶液。
本实施例中，颗粒计数模块及反应池可以是一体的，亦可以是分体的，颗粒计数模块可以基于电阻抗法、光阻法、激光法、流式细胞术或光散射法；颗粒检测模块可以检测500微米的颗粒大小，颗粒检测模块可以检测全血中的所有类型的细胞，颗粒检测模块可以是连续检测，亦可以分时检测。
本实施例中，低渗透压缓冲盐溶液的渗透压在150。
本实施例中，搅拌混匀的方式为磁力搅拌、空气搅拌、搅拌针或搅拌棒混匀方式、颠倒混匀、摇匀或反复吹打混匀等其他全血混匀方式。
本实施例中，全血标本与低低渗透压缓冲液的混合体积比例为1:100，全血样本可以先行稀释，再进行检测。
实施例三
一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，包括以下步骤：
S1、在分析模组的反应池中，加入低渗透压缓冲液；
S2、往S1反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S3、上述混合液发生溶血并达到溶血平衡状态后，测定平衡状态的红细胞数量A；
S4、溶血平衡状态为红细胞不再随孵育时间延长继续减少；
S5、在分析模组的反应池中，加入等渗缓冲液；
S6、往S5中的反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S7、测定达到平衡状态时间点的红细胞数量B；
S8、样本中红细胞的渗透脆性结果为(B-A)/B×100％。
本实施例中，全血样本的量为500微升。
本实施例中，低渗透压缓冲液为氯化钠或其它盐缓冲液。
本实施例中，低渗透压缓冲液为等张缓冲液。
本实施例中，低渗透压缓冲液是电导率为7.5mS/cm、pH值为8.0的盐缓冲盐溶液。
本实施例中，颗粒计数模块及反应池可以是一体的，亦可以是分体的，颗粒计数模块可以基于电阻抗法、光阻法、激光法、流式细胞术或光散射法；颗粒检测模块可以检测1000微米的颗粒大小，颗粒检测模块可以检测全血中的所有类型的细胞，颗粒检测模块可以是连续检测，亦可以分时检测。
本实施例中，低渗透压缓冲盐溶液的渗透压在280。
本实施例中，搅拌混匀的方式为磁力搅拌、空气搅拌、搅拌针或搅拌棒混匀方式、颠倒混匀、摇匀或反复吹打混匀等其他全血混匀方式。
本实施例中，全血标本与低低渗透压缓冲液的混合体积比例为1:1000，全血样本可以先行稀释，再进行检测。
本发明重复性测定方法
采用本发明重复测试正常样本和异常样本各10次，分别计算测量值的平均值
标准差(SD)，按公式计算变异系数(CV)。
测试结果如下表1-2所示。
表1正常样本重复性测试结果
表2异常样本重复性测试结果
从表1和表2可以看出，本发明检测正常样本和异常样本稀释后红细胞数量A和红细胞数量B变异系数CV均不大于5％，本发明试剂盒红细胞渗透脆性结果变异系数CV均不大于3％，符合临床需求。
本发明方法参考值测定方法
按血常规中红细胞RBC、血红蛋白HGB、红细胞压积HCT、平均红细胞体积MCV、平均血红蛋白量MCH和红细胞分布宽度RDW均正常的大于18周岁的健康人群要求选择样本，实验前排除溶血、纤溶、脂血或黄疸，共收取220例样本，测试结果如表3所示。以K-S结果为准，sig.(双侧)<0.05，测定结果呈偏态分布且结果偏下限。根据95％参考区间用单侧下限计算得到检测结果的参考值范围，确定本发明参考值范围为：>65％。
表3参考值样本测定数据
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在分析模组的反应池中，加入低渗透压缓冲液；
S2、往S1反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S3、上述混合液发生溶血并达到溶血平衡状态后，测定平衡状态的红细胞数量A；
S4、溶血平衡状态为红细胞不再随孵育时间延长继续减少；
S5、在分析模组的反应池中，加入等渗缓冲液；
S6、往S5中的反应池中加入一定体积的全血标本，立即搅拌混匀；
S7、测定达到平衡状态时间点的红细胞数量B；
S8、样本中红细胞的渗透脆性结果为(B-A)/B×100％。
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述全血样本的量为1-500微升。
3.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述低渗透压缓冲液为氯化钠或其它盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述低渗透压缓冲液为等张缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述低渗透压缓冲液是电导率为5.0-7.5mS/cm、pH值为6.0-8.0的盐缓冲盐溶液。
6.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述低渗透压缓冲盐溶液的渗透压在50-280。
7.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述搅拌混匀的方式为磁力搅拌、空气搅拌、搅拌针或搅拌棒混匀方式、颠倒混匀、摇匀或反复吹打混匀等其他全血混匀方式。
8.根据权利要求1所述的一种基于细胞计数技术的红细胞渗透脆性测定方法，其特征在于，所述全血标本与低低渗透压缓冲液的混合体积比例为1:10-1000，全血样本可以先行稀释，再进行检测。
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