CN103558372B - 一种elisa用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域，提供了一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，包括制备抗体标被；对BDNF板和Prolaction板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；配制标准稀释液，作为空白液；配制样本稀释液；将BDNF板和Prolaction板放入孵育振荡器中孵育抗体；加入检测抗体后加入试剂盒SA‑HRP中；放在酶标仪下读取光密度OD值；绘制BDNF和prolactin的回收率标准曲线并测算稀释样品的回收率。本发明有效解决了背景值偏高，信噪比低，灵敏度低，并且具有降低基质效应所产生的干扰，使检测结果更加稳定可靠的特点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别涉及一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法。
背景技术
ELISA是酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。由于ELISA的实验方法具有敏感、特异、经济、简便、安全等特点，因此是目前免疫学实验室中最常用的一种检测方法。
ELISA操作过程中选用优质的试剂、良好的仪器以及正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均采用板式点。
无论ELISA技术如何发展,更高的灵敏度和准确性，更高的数据可重复性始终是广大科研工作者追求的目标。建立一个好的ELISA方法的基础是首先要找到好的抗原与抗体，然而目前该技术仍然面临许多问题和挑战：(1)灵敏度有待提高，ELISA方法在医院，药企和科研院所被应用于与疾病相关的各种因子的检测，这些因子往往都是一些内源性的细胞因子、趋化分子、粘附分子等等，然而有些内源性分子表达风度低，难于被检测，高灵敏度的试剂盒有利于解决这个问题。(2)基质效应问题，ELISA所检测的样本的基质种类多种多样，不同基质成分、物理性质不同，会对样本检测产生干扰，造成结果的不准确或不稳定；并且在内源性因子的定量检测中，配制标准曲线的缓冲液和待测样本真实基质间的客观差异也会影响到最后的检测结果。(3)非特异性吸附，非特异性吸附的原因复杂，其中一个结果就是导致空白的背景值偏高，信噪比偏低，从而影响了整个试剂盒的定量灵敏度。
酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清、血浆或其它基质样本不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性，因此，由于待测样本机制的复杂性也可能造成基质效应，干扰检测结果。
因此，免疫检测技术领域急需一种降低背景值偏高，提高信噪比，增加灵敏度，消除基质效应所产生的干扰，使检测结果更加稳定可靠的ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法。
发明内容
本发明提供了一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，技术方案如下：
一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
第一步，制备抗体包被；
将捕获的脑源性神经营养因子BDNF抗体加入碳酸盐缓冲液中，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为BNDF板，置于2-8℃的温度下包被16-24小时；
进一步地，将催乳素Prolactin抗体加入另一组碳酸盐缓冲液中，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为Prolaction板，置于2-8℃的温度下包被16-24个小时；
第二步，对第一步中BDNF板和Prolaction板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；
将PH值为7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液PBS向第一步中的BNDF板和Prolaction板分别浇注；或者将PH值为7.4±0.2的含有5-10％脱脂奶粉向第一步中的BNDF板和Prolaction板分别浇注；
进一步地，将该浇注好的BDNF板和Prolaction板分别放在2-8℃的温度下封闭放置16-24小时；
进一步地，用含有非离子型表面活性剂Tween20的PBS溶液对封闭好的BDNF板和Prolaction板进行洗涤、晾干后，置于2-8℃的温度下保存待用；
第三步，配制标准稀释液，作为空白液；
首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；
进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂Proclin，搅拌均匀后作为标准稀释液，即空白液；
第四步，配制样本稀释液；
样本稀释液1：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液2：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步的，向该溶液中加入5mmol/l的螯合剂乙二胺四乙酸EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液3：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.05％牛血清γ-球蛋白BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液4：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.10％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液5：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.15％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液6：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.20％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液7：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.25％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
第五步，将BDNF板和Prolaction板放入孵育振荡器中孵育抗体；
分别将第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，重复的分别加入第二步中晾干后待用的BDNF板和Prolaction板的孔中，再向各个反应孔中加入处理酶；
进一步地，将加好溶液的BDNF板和Prolaction板放入孵育振荡器中，在18-25℃的室温条件下反应；
第六步，加入检测抗体；
用含有Tween20的PBS作为洗液，对第五步中反应后的BDNF板和Prolaction板分别洗涤，再相应的向BDNF板的每个反应孔中加入BDNF检测抗体，并且相应的向Prolaction板的每个反应孔中加入Prolaction检测抗体；
第七步，将稀释液加入试剂盒中；
用含有Tween20的PBS作为洗液，对第六步中反应后的BDNF板和Prolaction板分别洗涤后对其进行稀释，再分别向试剂盒SA-HRP中的每个孔中加入稀释后的溶液；
第八步，放在酶标仪下读取光密度OD值；
用含有Tween20的PBS作为洗液，对第七步中反应后的试剂盒SA-HRP分别洗涤，再向该洗涤好的试剂盒SA-HRP中加入四甲基联苯胺TMB底物；
进一步地，将加好TMB的试剂盒SA-HRP放在酶标仪下读取OD值；
第九步，根据OD值计算出非特异性吸附数据，通过比较非特异性吸附数据，进一步确定出牛血清γ球蛋白BGG作为抗原对降低背景噪音具有直接并且积极的作用。
首先，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7和一份正常人血清样本，在BDNF板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果；
进一步地，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7和一份正常人血清样本，在Prolactin板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果；
进一步地，发现在稀释液中加入牛血清γ球蛋白BGG的样本稀释液3-7，在两种包被不同抗体的ELISA板，即BNDF板、Prolactin板中的非特异性吸附NSB都很小，从而说明所产生的背景值都非常低；
进一步地，由于样本稀释液3-7中的BGG浓度不同，但是都降低了ELISA反应中的背景信号；
进一步地，说明任意浓度的牛血清γ球蛋白BGG抗原对降低背景噪音具有直接且积极的作用。
如上所述的一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，还包含：第十步，将第四步中的样本稀释液6作为新的标准稀释液，仅将CHAPS的含量分别调整为0.1％、0.15％、0.25％、0.3％、0.45％、0.5％、0.6％，从而形成7种新的样本稀释液8-14，其它步骤完全按照第一步至八步进行处理，读取OD值，进一步计算出非特异性吸附系数；并对测得的非特异性吸附系数进行分析，得出在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情况下，CHAPS浓度位于0.2％-0.45％之间时，BDNF板和Prolactin板的非特异性吸附NSB都会降低，从而使背景信号降低。
如上所述的一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，还包含：第十一步，从第四步和第十步中选取出三种信噪比高，非特异性信号低的三种样本稀释液来绘制BDNF和prolactin的回收率标准曲线并测算稀释样品的回收率；根据测试结果证明了向含有5％BSA的PBS中分别加入0.05％Tween 20、0.2-0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意浓度的牛血清γ球蛋白BGG、百万分之十五的Proclin作为稀释液，是一种效果非常好的适用于ELISA的样本稀释液，具体步骤为：
首先，分别将BDNF和Prolactin标准抗原加入BDNF和prolactin阴性血清中；
进一步地，向该阴性血清样本中分别加入样本稀释液3、样本稀释液10、样本稀释液12中其他步骤与第五步至第八步完全一致，读出光密度OD值和回收率；
进一步地，两种样本稀释液3和样本稀释液12分别是CHAPS为0.2％和0.45％的2个临界点，经实验表明三种样本稀释液3、10、12配制的BDNF和Prolactin的标准曲线分别互相平行，相关性很好，并且与阴性血清相比回收率提高；
进一步地，证明向PH值为7.4±0.2的含有5％BSA的PBS中分别加入0.05％Tween20、0.2-0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意浓度的牛血清γ球蛋白BGG、百万分之十五的Proclin作为稀释液，是一种效果非常好的适用于ELISA的样本稀释液。
本发明的有益效果是：
1.本发明用牛血清γ球蛋白BGG作为抗原，从而起到降低背景噪音的作用。
2.本发明确定了在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情况下，CHAPS浓度位于0.2％-0.45％之间时，BDNF板和Prolactin板的非特异性吸附NSB都会降低，降低了背景信号。
3.本发明提供了一种非常好的适用于ELISA的抗原标准品和样本稀释液，弥补了行业的空白，促进科学进步。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明：
图1是本发明BDNF在三种稀释液中的回收率标准曲线。
图2是本发明Prolactin在三种稀释液中的回收率标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
本发明提供了一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，具体步骤如下：
第一步，制备抗体包被；
将捕获的脑源性神经营养因子BDNF抗体加入PH值为9.6的0.05mol/l碳酸盐缓冲液中，配制成浓度为2μg/ml的溶液，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为BNDF板，置于2-8℃的温度下包被16-24小时；
进一步地，将催乳素Prolactin抗体加入另一组PH值为9.6的0.05mol/l碳酸盐缓冲液中，配制成浓度为2.5μg/ml的溶液，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为Prolaction板，置于2-8℃的温度下包被16-24个小时；
第二步，对第一步中BDNF板和Prolaction板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；
将PH值为7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液PBS向第一步中的BNDF板和Prolaction板分别浇注，每个孔中浇注300μl；或者将PH值为7.4±0.2的含有5-10％脱脂奶粉向第一步中的BNDF板和Prolaction板分别浇注，每个孔中浇注300μl；
进一步地，将该浇注好的BDNF板和Prolaction板分别放在2-8℃的温度下封闭放置16-24小时；
进一步地，用含有0.05％非离子型表面活性剂Tween的PBS溶液对封闭好的BDNF板和Prolaction板进行洗涤、晾干后，置于2-8℃的温度下保存待用；
第三步，配制标准稀释液，作为空白液；
首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；
进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂Proclin，搅拌均匀后作为标准稀释液，即空白液；
第四步，配制样本稀释液；
样本稀释液1：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液2：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步的，向该溶液中加入5mmol/l的螯合剂乙二胺四乙酸EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液3：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.05％牛血清γ-球蛋白BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液4：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.10％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液5：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.15％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液6：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.20％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
样本稀释液7：首先将0.05％Tween 20加入含有5％BSA的PBS中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％CHAPS搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的EDTA搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.25％BGG；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的Proclin搅拌均匀；
第五步，将BDNF板和Prolaction板放入孵育振荡器中孵育抗体；
分别将第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，以10个重复分别加入第二步中晾干后待用的BDNF板和Prolaction板的孔中，再向各个反应孔中加入100μl处理酶，
进一步地，将加好溶液的BDNF板和Prolaction板放入孵育振荡器中，以500转/分的速度在18-25℃的室温条件下反应2小时。
第六步，加入检测抗体；
用含有0.05％Tween20的PBS作为洗液，对第五步中反应后的BDNF板和Prolaction板分别洗涤4次，再相应的向BDNF板的每个反应孔中加入100μl的BDNF检测抗体，并且相应的向Prolaction板的每个反应孔中加入100μl的Prolaction检测抗体；
第七步，将稀释液加入试剂盒中；
用含有0.05％Tween20的PBS作为洗液，对第六步中反应后的BDNF板和Prolaction板分别洗涤4次，再以1:10000对其进行稀释后，分别向试剂盒SA-HRP中的每个孔中加入100μl的稀释后的溶液；
第八步，放在酶标仪下读取光密度OD值；
用含有0.05％Tween20的PBS作为洗液，对第七步中反应后的试剂盒SA-HRP分别洗涤4次，再向该洗涤好的试剂盒SA-HRP中加入四甲基联苯胺TMB底物；
进一步地，将加好TMB的试剂盒SA-HRP放在波长为450nm的酶标仪下读取OD值；
第九步，根据OD值计算出非特异性吸附数据，通过比较非特异性吸附数据，进一步确定出牛血清γ球蛋白BGG作为抗原对降低背景噪音具有直接并且积极的作用；
首先，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，在BDNF板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果，如表一：
表一
进一步地，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，在Prolactin板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果，如表二：
表二
根据上述表一和表二中的结果进行分析，发现在稀释液中加入牛血清γ球蛋白BGG的样本稀释液3-7，在两种包被不同抗体的ELISA板，即BNDF板、Prolactin板中的非特异性吸附NSB都很小，从而说明所产生的背景值都非常低，为0.02-0.05之间；
进一步地，由于样本稀释液3-7中的BGG浓度不同，但是都降低了ELISA反应中的背景信号；
进一步地，说明牛血清γ球蛋白BGG抗原对降低背景噪音具有直接且积极的作用；
第十步，将第四步中的样本稀释液6作为新的标准稀释液，仅将CHAPS的含量分别调整为0.1％、0.15％、0.25％、0.3％、0.45％、0.5％、0.6％，从而形成7种新的样本稀释液8-14。其它步骤完全按照第一步至八步进行处理，读取OD值；
第十一步，根据OD值计算出非特异性吸附NSB的值，从而得到在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情况下，CHAPS浓度位于0.2％-0.45％之间时，BDNF板和Prolactin板的非特异性吸附NSB都会降低，从而使背景信号的降低；
第十步中的样本稀释液6、样本稀释液8-14和一份正常人血清样本在BDNF板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果，如表三：
表三
进一步地，第十步中的样本稀释液6、样本稀释液8-14、一份正常人血清样本，在Prolactin板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果，如表四：
表四
EDTA，Tween20皆为本领域常用添加剂，但CHAPS并不是大家普遍使用的添加剂。因此，根据上述表三和表四中的结果进行分析，发现在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情况下，CHAPS浓度位于0.2％-0.45％之间时，BDNF板和Prolactin板的非特异性吸附NSB都会降低，从而使背景信号的降低；
第十二步，从第四步和第十步中选取出三种信噪比高，非特异性信号低的三种样本稀释液来绘制BDNF和prolactin的回收率标准曲线，并测算稀释样品的回收率；图1是本发明BDNF在三种稀释液中的回收率标准曲线，图2是本发明Prolactin在三种稀释液中的回收率标准曲线；根据测得的回收率证明了向含有5％BSA的PBS中分别加入0.05％Tween 20、0.2-0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意浓度的牛血清γ-球蛋白BGG、百万分之十五的Proclin作为稀释液，是一种效果非常好的适用于ELISA的样本稀释液。
首先，分别将4000pg/ml的BDNF和Prolactin标准抗原加入BDNF和prolactin阴性血清中；
进一步地，分别以1:2，1:4，1:8对配制好的阴性血清进行稀释，稀释后分别加入样本稀释液3、样本稀释液10、样本稀释液12中，其他步骤与第五步至第八步完全一致，读出光密度OD值，进一步的计算出回收率，并且根据回收率绘制标准曲线，图1是本发明BDNF在三种稀释液中的回收率标准曲线，图2是本发明Prolactin在三种稀释液中的回收率标准曲线；
三种样本稀释液所配制BDNF标准曲线的光密度OD值与回收率，如表五：
表五
三种样本稀释液所配制Prolactin标准曲线的光密度OD值与回收率，如表六：
表六
进一步地，以阴性血清样本作为对照，比较样本稀释液的平均回收率；
BDNF在三种样本稀释液中的平均回收率，如表七：
表七
prolactin在三种样本稀释液中的平均回收率，如表八：
表八
根据对表五、六、七、八的分析，两种样本稀释液3和样本稀释液12分别是CHAPS为0.2％和0.45％的2个临界点；经实验表明三种样本稀释液3、10、12配制的BDNF和Prolactin的标准曲线分别互相平行，相关性很好；用这三种样本稀释液来分别稀释含有BDNF和Prolactin的血清样本，与阴性血清样本相比，其回收率从65-77％提高到85-115％，回收率有了大大的提高，结果准确度提高，从而满足检测的要求；
进一步地，证明向PH值为7.4±0.2的含有5％BSA的PBS中分别加入0.05％Tween20、0.2-0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意浓度的牛血清γ球蛋白BGG、百万分之十五的Proclin作为稀释液，是一种效果非常好的适用于ELISA的样本稀释液。
本发明用牛血清γ球蛋白BGG作为抗原，从而起到降低背景噪音的作用。
本发明确定了在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情况下，CHAPS浓度位于0.2％-0.45％之间时，BDNF板和Prolactin板的非特异性吸附NSB都会降低，降低了背景信号。
本发明提供了一种非常好的适用于ELISA的抗原标准品和样本稀释液，弥补了行业的空白，促进科学进步。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (3)
1.一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
第一步，制备抗体包被；
将捕获的脑源性神经营养因子抗体加入碳酸盐缓冲液中，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为BNDF板，置于2-8℃的温度下包被16-24小时；
进一步地，将催乳素抗体加入另一组碳酸盐缓冲液中，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为催乳素板，置于2-8℃的温度下包被16-24个小时；
第二步，对第一步中的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；
将PH值为7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液向第一步中的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别浇注；或者将PH值为7.4±0.2的含有5-10％脱脂奶粉向第一步中的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别浇注；
进一步地，将该浇注好的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别放在2-8℃的温度下封闭放置16-24小时；
进一步地，用含有非离子型表面活性剂的PBS溶液对封闭好的脑源性神经营养因子板和催乳素板进行洗涤、晾干后，置于2-8℃的温度下保存待用；
第三步，配制标准稀释液，作为空白液；
首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；
进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂，搅拌均匀后作为标准稀释液，即空白液；
第四步，配制样本稀释液；
样本稀释液1：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
样本稀释液2：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步的，向该溶液中加入5mmol/l的螯合剂乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
样本稀释液3：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.05％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
样本稀释液4：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.10％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
样本稀释液5：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.15％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
样本稀释液6：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.20％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
样本稀释液7：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.25％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；
第五步，将脑源性神经营养因子板和催乳素板放入孵育振荡器中孵育抗体；
分别将第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，重复的分别加入第二步中晾干后待用的脑源性神经营养因子板和催乳素板的孔中，再向各个反应孔中加入处理酶，
进一步地，将加好溶液的脑源性神经营养因子板和催乳素板放入孵育振荡器中，在18-25℃的室温条件下反应；
第六步，加入检测抗体；
用含有Tween20的PBS作为洗液，对第五步中反应后的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别洗涤，再相应的向BDNF板的每个反应孔中加入脑源性神经营养因子检测抗体，并且相应的向催乳素板的每个反应孔中加入催乳素检测抗体；
第七步，将稀释液加入试剂盒中；
用含有Tween20的PBS作为洗液，对第六步中反应后的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别洗涤后对其进行稀释，再分别向该试剂盒中的每个孔中加入稀释后的溶液；
第八步，放在酶标仪下读取光密度值；
用含有Tween20的PBS作为洗液，对第七步中反应后的试剂盒分别洗涤，再向该洗涤好的试剂盒中加入四甲基联苯胺底物；
进一步地，将加好TMB的试剂盒放在酶标仪下读取光密度值；
第九步，根据光密度值计算出非特异性吸附数据，通过比较非特异性吸附数据，进一步确定出牛血清γ球蛋白作为抗原对降低背景噪音具有直接并且积极的作用；
首先，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，在脑源性神经营养因子板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果；
进一步地，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1-7、一份正常人血清样本，在催乳素板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果；
进一步地，发现在稀释液中加入牛血清γ球蛋白的样本稀释液3-7，在两种包被不同抗体的ELISA板，即神经营养因子板和催乳素板中的非特异性吸附NSB都很小，从而说明所产生的背景值都非常低，为0.02-0.045之间；
进一步地，由于样本稀释液3-7中的牛血清γ球蛋白浓度不同，但是都降低了ELISA反应中的背景信号；
进一步地，说明牛血清γ球蛋白抗原对降低背景噪音具有直接且积极的作用。
2.根据权利要求1所述的一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，还包含：第十步，将该第四步中的样本稀释液6作为新的标准稀释液，仅将该3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐的含量分别调整为0.1％、0.15％、0.25％、0.3％、0.45％、0.5％、0.6％，从而形成7种新的样本稀释液8-14，其它步骤完全按照第一步至八步进行处理，读取光密度值，进一步计算出非特异性吸附系数；并对测得的非特异性吸附系数进行分析，得出在牛血清γ球蛋白含量一定的情况下，3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐浓度位于0.2％-0.45％之间时，脑源性神经因子板和催乳素板的非特异性吸附都会降低，从而使背景信号降低。
3.根据权利要求2所述的一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，还包含：第十一步，从第四步和第十步中选取出三种信噪比高，非特异性信号低的三种样本稀释液来绘制BDNF和prolactin的回收率标准曲线并测算稀释样品的回收率；根据测试结果证明了向含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中分别加入0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂、0.2-0.45％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5mmol/l的乙二胺四乙酸、任意浓度的牛血清γ球蛋白、百万分之十五的液体防腐剂作为稀释液，是一种效果非常好的适用于ELISA的样本稀释液，具体步骤为：
首先，分别将脑源性神经因子和催乳素标准抗原加入脑源性神经因子和催乳素阴性血清中；
进一步地，分别对配制好的阴性血清进行稀释，稀释后分别加入三种信噪比高，非特异性信号低的样本稀释液3、样本稀释液10、样本稀释液12中，其他步骤与第五步至第八步完全一致，读出光密度值和回收率；
进一步地，样本稀释液3和样本稀释液12分别是3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐为0.2％和0.45％的2个临界点，经实验表明三种样本稀释液3、10、12配制的脑源性神经因子和催乳素的标准曲线分别互相平行，相关性很好，并且与阴性血清相比回收率提高；
进一步地，证明向PH值为7.4±0.2的含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中分别加入0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂、0.2-0.45％的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5mmol/l的乙二胺四乙酸、0.05％-0.2％的牛血清γ球蛋白、百万分之十五的液体防腐剂作为稀释液，是一种效果非常好的适用于ELISA的样本稀释液。
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