CN103130760B - 一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用，该抗肿瘤药物为酪氨酸激酶抑制剂，该药物新的核心骨架为儿茶酚部分，左侧为羟基醚化部分；该药物的制备方法为2,4,5-三羟基苯乙酮与氯甲酸甲酯反应，通过羟醛缩合反应关环生成苯并二氢吡喃结构，然后苯并二氢吡喃结构与间卤苯胺或间乙炔苯胺作用生成4-间卤苯胺-6,7-二羟基香豆素或4-乙炔苯胺-6,7-二羟基香豆素，脱掉邻苯二羟基的甲酸甲酯，醚化，通过快速色谱纯化并结晶后获得目标产物；该药物应用于治疗既往接受过化学治疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌。

Description

一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于新药设计及药物化学领域，具体涉及一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白酪氨酸激酶（PTK）是一组肿瘤发生过程中最活跃、进展较快的细胞信号转导过程中关键酶系，通过催化使ATP上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质的酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活各种底物酶，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。多数肿瘤细胞PTK活性异常升高，近80%的致癌基因都含有酪氨酸激酶编码。因此PTK是一个非常重要和有价值的抗肿瘤靶点。抑制酪氨酸激酶受体可以有效控制下游信号的磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的生长。基于酪氨酸激酶靶点开发的新药，针对正常细胞和肿瘤细胞之间的差异，可达到高选择性、低毒性的治疗效果，从而克服传统细胞毒药物的选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点。酪氨酸激酶受体分为表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR) 、血小板源生长因子受体(PDGFR) 等，针对各种受体的酪氨酸激酶抑制剂目前已开发上市的主要为表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK) 抑制剂、血管内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR-TK) 抑制剂和血小板源生长因子受体酪氨酸激酶(PDGFR-TK)抑制剂等。其中表皮生长因子受体(EGFR) 在非小细胞肺癌中高表达，其抑制剂在治疗化疗失败以及晚期转移的非小细胞肺癌取得非常好的疗效。在美国及西欧国家已经有十几种酪氨酸激酶抑制剂被批准用于靶向性抗肿瘤冶疗的临床试验，其中包括Gefitinib, Erlotinib, and Lapatinib等EGFR以及其与其密切相关的Her2家族的抑制剂(inhibitors)。这三类抑制剂以4-苯胺喹唑啉为最佳核心骨架，是基于靶点EGFR的ATP结合口袋设计的。4-苯胺喹唑啉类抑制剂在应用过程中会因为诱发受体突变而产生耐药性，因此很必要寻找新的骨架为核心的酪氨酸激酶表皮生长因子抑制剂。另一方面这类蛋白酪氨酸激酶抑制剂都由国外医药企业开发，售价非常高，像特凯罗、格列卫每盒（150mg×30片）售价在￥18800- 23000元，国人很难承受得起，也非常有必要开发具有我们自主知识产权的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物。

研究认为4-苯胺喹唑啉的1位芳香氮与EGFR受体中的氢键供体形成氢键，而3位芳香氮与受体中的水分子形成氢键，而该水分子与受体中的Thr790形成氢键，这样形成稳定的结合构象，同时苯胺所连接的芳香取代基与受体中的苯丙氨酸以π- π方式叠合，因此4-苯胺喹唑啉类EGFR抑制剂表现出良好的药理活性。要寻找与4-苯胺喹唑啉类抑制剂活性相当的新核心骨架，需要基于靶标EGFR的结构特征，以及受体与4-苯胺喹唑啉的相互作用模式，从头设计、验证、合成、评价以新骨架为核心的衍生物。

本发明将以酪氨酸激酶如表皮生长因子受体为靶点，基于表皮生长因子受体的活性位点信息，应用计算化学方法与模型，设计并合成了与4-苯氨喹唑啉类抑制剂活性相当的新核心骨架的EGFR抑制剂，经过细胞水平检测，新核心骨架抑制剂直接作用于EGFR，并显示出良好的抗非小细胞肺癌、前列腺癌等药理活性，此外还借助体内外模型开展了其成药效性的评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型靶向性抗肿瘤药物及其制备方法与应用，根据肿瘤中高表达的酪氨酸激酶表皮生长因子受体（EGFR）的三维结构特征，应用计算化学方法从头设计EGFR抑制剂，并制备合成，通过细胞水平检测，显示具有良好的EGFR抑制活性，从而达到抗肿瘤效果，可用于治疗经化疗失败以及转移性非小细胞肺癌的治疗。

本发明提供了一种新型靶向性抗肿瘤药物，该药物具有新的核心骨架，具体结构通式如下：

其中：R₁和R₂为甲基、甲醇乙酯、2-吗啉-4-乙基中的一种，R₃为卤素取代基Br或Cl或乙炔基，R₄为H、F、对F苯取代基中的一种。

本发明提供的抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物为酪氨酸激酶抑制剂，相对于已上市的药物分子结构，该药物具有新的核心骨架儿茶酚，左侧为羟基醚化部分。

本发明提供的抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物可制成片剂、胶囊剂或注射剂。

本发明提供的抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物作用在于抑制肿瘤中高表达的表皮生长因子受体（EGFR），达到抗肿瘤的目的。

本发明还提供了抗肿瘤药物的制备方法，该方法以2,4,5-三羟基苯乙酮和氯甲酸甲酯为起始原料，以碳酸钾为缚酸剂，在-20℃下反应1小时获得酚羟基保护后的产物，接着在无水体系中借助金属钠的催化通过羟醛缩合反应关环生成苯并二氢吡喃结构中间体，在60℃下反应将苯并二氢吡喃中间体与间卤苯胺作用生成4-间卤（或乙炔）苯胺-6,7-二羟基香豆素，然后于20℃下借助溴乙基甲基醚-乙腈溶液将4-间卤（或乙炔）苯胺-6,7-二羟基香豆素中间体醚化，反应物通过快速色谱纯化并结晶后获得目标产物。

本发明提供的抗肿瘤药物，应用于治疗既往接受过化学治疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）。

本发明提供的抗肿瘤药物，是具有抗肿瘤作用的新候选药物，该药物的新核心骨架系列化合物经细胞和酶活检测，都具有良好的抗肿瘤活性，体外实验显示，该骨架具有作用于EGFR的良好药理活性；该系列化合物可作为抗非小细胞肺癌、抗前列腺癌、抗乳腺癌等候选药物。

本发明提供的抗肿瘤药物EGFR抑制剂在肿瘤细胞株水平的检测中显示了良好的活性，所检测的细胞株包括前列腺细胞株lincap, PC3, 非小细胞肺癌A549细胞株，检测的IC₅₀值与阳性对照药埃罗替尼，吉非替尼进行了比较，同时对细胞株进行了EGF诱导并进行细胞毒检测，结果显示，该系列化合物通过作用于EGFR而抗细胞增殖；同时做了大鼠的体内的肿瘤造模实验，结果显示，该系列化合物可有效抑制肿瘤的增殖与转移，并有效缓解患鼠的生理症状，具有与上市药物埃罗替尼和吉非替尼具有相当的药理活性。

本发明与已上市的抗肿瘤药物EGFR抑制剂相比，具有以下优点：

1、具有自主知识产权新核心骨架，可替代已有的4-苯胺喹唑啉核心骨架；

2、特异质毒性如肝毒性等发生概率较低，LD₅₀高于前其它药物；

3、人体内代谢产物进程明确，比如该系列化合物只会被 I相代谢酶P450酶代谢，而不被II相代谢酶如葡萄糖醛酸转移酶、儿茶酚氧转移酶，磺酸化酶等所代谢。

附图说明

图1为EGFR抑制剂ERI-09的核磁氢谱图；

图2为EGFR抑制剂ERI-13的核磁氢谱图。

具体实施方式

以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1：表皮生长因子受体抑制剂（ERI-09）的合成

在25 ml单口圆底烧瓶中加入1.68克原料A 2,4,5-三羟基苯乙酮(10 mmol), 用10 ml乙腈溶解原料后在搅拌状态下加入碳酸钾6.9克（50 mmol），-20℃下缓慢滴加氯甲酸甲酯-乙腈溶液（32 mmol）。反应1小时后TLC检测原料是否转化完全，待原料A转化完全后继续搅拌0.5小时后过滤，旋蒸除去乙腈后得3.2克产品B。用无水甲苯复溶B，加热回流后加入金属钠，B在金属钠的催化下发生缩合反应获得3.3克含有产物C的粗品。经色谱柱分离后获得1.65克产物C纯品，将C溶于乙腈后加入1.0克间氯苯胺，搅拌下滴加NaOH溶液后于60℃下反应4-8小时，TLC检测产物C消失后用25%甲酸终止反应。乙酸乙酯萃取后得1.5克产物D，用乙腈复溶产物D后在搅拌下加入3.5克碳酸钾（25 mmol），于20℃下缓慢滴加溴乙基甲基醚-乙腈溶液（20 mmol）。反应1小时后TLC检测化合物D是否转化完全，待D转化完全后用25%甲酸终止反应，产物经乙酸乙酯萃取，干燥，旋蒸后得1.2克终产品E。具体合成路线如下：

 

实施例2：表皮生长因子受体抑制剂（ERI-13）的合成

将1.5克产物D溶于乙腈后在搅拌下加入3.5克碳酸钾（25 mmol），于20℃下缓慢滴加甲基溴-乙腈溶液（20 mmol）。反应1小时后TLC检测化合物D是否转化完全，待D转化完全后用25%甲酸终止反应，产物经乙酸乙酯萃取，干燥，旋蒸后得1.1克终产品F。合成路线如下：

 

实施例3 EGFR抑制剂（ERI-09）非小细胞肺癌A549细胞水平的检测

人非小细胞肺癌细胞株A549培养于含10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, USA) 的HAM'S/F-12培养基（HyClone, USA），并在此培养基中加入100ng/ml epidermal growth factor (EGF, Sigma, USA)，上述细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，置于CO₂恒温培养箱，培养3-5天后用于实验。

收集处于对数生长期的细胞，分别接种于96孔板中（6500细胞/孔/100 ul，含100ng/ml EGF的RPMI1640），培养24 h后，分别加入梯度浓度的化合物（500、250、100、50、25、12.5、6.25、1μM/L）；将相同体积100ng/ml EGF的RPMI1640添加1%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)设为实验对照组；只有培养液但不加细胞为空白组。各浓度组分别设3个平行孔。继续培养48 h后，SRB法检测细胞的存活率。每孔加入50 μl 10%的预冷（4 ℃）的三氯乙酸（Trichloroacetic acid,TCA），经4 ℃固定1小时，自来水清洗5次后，充分干燥后加入一定体积的SRB溶液（Sigma, USA）,置37℃避光染色30 min。1%醋酸清洗数次，晾干，加入适量体积的Tris 溶液(10 mM, pH 10.5)充分溶解后置酶标仪测定吸光度（A570 nm）。按照以下公式计算生长抑制率( IR)：IR ( %) = [ 1 - (实验组 A 值 - 空白组A 值) / (对照组A 值 - 空白组 A 值) ] ×100 %， 并采用Origin 6.0软件计算IC₅₀值。EGFR抑制剂ERI09的A549细胞株不加EGF诱导的IC₅₀值为15μmol，加EGF诱导的IC₅₀为0.48μmol，说明对新核心骨架化合物通过作用于EGFR而产生抗肿瘤效果。

实施例4 EGFR抑制剂作用于小鼠体内人造肿瘤模型的活性检测

使用6-8周龄雄性C57BL/6系小鼠，分为试验药物组、模型组、环磷酰胺对照组，每组六只，将小鼠Lewis肺癌细胞株经2.5g/L胰酶+0.2g/L的EDTA消化液消化，取单细胞悬液，以每只0.2mL注射于右前肢腋下，观察成瘤率。以实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示药效观测指标，在诱发之前给予受试药物EGFR抑制剂以及阴性对照（生理盐水）和阳性对照（埃罗替尼），EGFR抑制剂显示出依存于剂量的抑制作用，且其ED₅₀为12mg/Kg，与阳性对照药埃罗替尼（10mg/Kg）相当，说明新核心骨架EGFR抑制剂的有效性。

实施例5 EGFR抑制剂的代谢活性检测

应用重组人源I相II相代谢酶系对EGFR抑制剂ERI-9的代谢谱进行鉴定分析，发现ERI-9只被I相代谢酶P450酶缓慢代谢，人肝微粒体系半衰期为分钟，比同类上市药物延长10%，说明新骨架的EGFR抑制剂具有合适的代谢稳定性，成药性良好。

Claims (4)

1.一种靶向性抗肿瘤药物，其特征在于：该药物的核心骨架，具体结构通式如下：

R₁和R₂同时为甲基、甲氧乙基中的一种，R₃为卤素取代基Cl，R₄为H；

该药物的制备方法如下：以2,4,5-三羟基苯乙酮和氯甲酸甲酯为起始原料，以碳酸钾为缚酸剂，在-20℃下反应1小时获得酚羟基保护后的产物，接着在无水体系中借助金属钠的催化通过羟醛缩合反应关环生成苯并二氢吡喃结构中间体，在60℃下反应将苯并二氢吡喃中间体与间氯苯胺作用生成4-间氯苯胺-6,7-二羟基香豆素，然后于20℃下借助溴乙基甲基醚-乙腈溶液或甲基溴-乙腈溶液将4-间氯苯胺-6,7-二羟基香豆素中间体醚化，反应物通过快速色谱纯化并结晶后获得目标产物。

2.按照权利要求1所述的靶向性抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物为酪氨酸激酶抑制剂，相对于已上市的药物分子结构，该药物具有核心骨架儿茶酚，左侧为羟基醚化部分。

3.按照权利要求1所述的靶向性抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物可制成片剂、胶囊剂或注射剂。

4.按照权利要求1所述的靶向性抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物作用在于抑制肿瘤中高表达的表皮生长因子受体，达到抗肿瘤的目的。