CN102791849B

CN102791849B - 含乳酸菌制剂

Info

Publication number: CN102791849B
Application number: CN201180013082.8A
Authority: CN
Inventors: 立垣爱郎; 渡边丰辉; 滨田和也
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2031-03-09
Also published as: MX337716B; US20150238547A1; EP2546330A4; US9750775B2; EP2546330B1; CN102791849A; JP5868843B2; MX2012009945A; EP2546330A1; US20130058898A1; JPWO2011111734A1; WO2011111734A1

Abstract

本发明提供对过敏的预防治疗和/或血中中性脂肪的减少有效且安全性高的乳酸菌及乳酸菌制剂。将含有对乳酸菌乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）R037株进行培养而获得的乳酸菌菌体或其处理物的组合物作为有效成分添加在药品、饮食品中。

Description

含乳酸菌制剂

技术领域

本发明涉及新型乳酸菌以及以该乳酸菌菌体或其处理物为有效成分的制剂。

背景技术

近年来，由于饮食生活的欧美化、居住环境、运动不足、过度压力等生活环境的变化，过敏性疾病和生活习惯病等的患者数、预备军均有年年增加的倾向，目前也被称为国民病。

过敏性疾病中，特别是花粉症和特异反应性皮炎疾病一直在增加，强烈需要其的预防和改善对策。

花粉症和特异反应性皮炎等被分类为I型的过敏性疾病是从将侵入到生物体内的物质识别为变应原并诱导IgE抗体产生而开始的。当变应原再次侵入时，与肥大细胞和粒细胞上的受体分子相结合的IgE抗体与变应原结合，结果，由肥大细胞和粒细胞释放出过量的组胺和白细胞三烯等化学介质，表现出哮喘、皮炎、鼻涕等过敏症状。

对于这种过敏性疾病的治疗，以往是以对症疗法进行抗组胺剂和类固醇剂等的投予。但是，这些药剂具有副作用，现实情况是在使用方法和长期使用中安全性存在问题。

另外，被称为生活习惯病的疾病之一有高脂血症，由于偏食生活、运动不足、饮酒或抽烟等不良生活习惯的积累等，中性脂肪值超过标准值的状态成为一个指标。作为降低中性脂肪值的方法，饮食疗法及运动疗法是有效的手段，但很难有耐心地持续这种疗法，需要在没有心理上、肉体上的痛苦伴随的情况下降低中性脂肪的方法。

另一方面，在使用了乳酸菌的发酵食品中具有显示整肠（肠调节）作用和免疫激活效果、生活习惯病预防效果等健康效果的物质，备受关注。例如有报告指出，就酸奶而言，发酵中所使用的乳酸菌体或发酵乳中的乳肽显示上述健康功能。目前，乳酸菌的抗过敏功能（专利文献1、2）、中性脂肪减少功能（专利文献3、4）等备受关注。

其中，有报告指出专利文献2所记载的副干酪乳杆菌KW3110株（FERM BP-08634）的抗过敏功能特别高，但对于属于片球菌属的乳酸菌，并未报告其具有抗过敏作用。另外，专利文献4中报告了属于片球菌属的乳酸菌具有中性脂肪减少效果，但其效果还不能说很充分。

另外，已知通过将具有以整肠作用为代表的功能性的乳酸菌制剂制成鸡尾酒类混合制剂进行摄取，会发挥各种健康功能，但几乎没有发挥多种功能性的乳酸菌制剂。

现有技术文献

专利文献1：日本特开平9-2959号公报

专利文献2：日本专利第3585487号公报

专利文献3：日本特开平10-298083号公报

专利文献4：日本特公平6-57657号公报

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于提供具有抗过敏功能、血中中性脂肪的减少功能和/或抗自身免疫性疾病功能、且安全性高的乳酸菌。进而，本发明的课题在于提供含有具有抗过敏功能、中性脂肪减少功能、抗自身免疫性疾病功能等中至少1种功能的乳酸菌和该乳酸菌来源成分的制剂。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：属于片球菌属的特定的乳酸菌和该乳酸菌来源成分具有优异的抗过敏功能、中性脂肪减少功能以及抗自身免疫性疾病功能中的至少1种功能，尤其是兼具抗过敏功能和中性脂肪减少功能，从而完成了本发明。

即，本发明涉及乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）R037株（保藏号NITE BP-900）或具有抗过敏功能、中性脂肪减少功能和/或抗自身免疫性疾病功能的所述R037株的突变体。

另外，本发明为含有对上述乳酸菌进行培养而获得的乳酸菌菌体或其处理物的组合物。该组合物可以以过敏的预防和改善、血中中性脂肪值的减少和/或自身免疫性疾病的预防和改善为目的而制成药品、健康食品、补充剂来利用。

另外，本发明为含有上述组合物、优选含有上述组合物作为有效成分的抗过敏剂。

另外，本发明为含有上述组合物、优选含有上述组合物作为有效成分的血中中性脂肪减少剂。

另外，本发明为含有上述组合物、优选含有上述组合物作为有效成分的抗自身免疫性疾病剂。

另外，本发明为含有上述组合物的饮食品。

另外，本发明还为过敏性疾病、高甘油三酯血症和/或自身免疫性疾病的处置方法，其特征在于，将上述组合物投予至投予对象。

发明效果

根据本发明，可以提供含有安全性高的乳酸菌菌体或其处理物的组合物。根据本发明的组合物，能够提供可作为目前成为国民病的过敏的预防和改善剂、中性脂肪减少剂和/或自身免疫性疾病的预防和改善剂使用的组合物。

附图说明

图1为表示根据本发明的乳酸菌的投予的有无所导致的特异反应性皮炎模型小鼠的皮炎总得分的变化的图。

图2为表示根据本发明的乳酸菌的投予的有无所导致的特异反应性皮炎模型小鼠的耳廓厚度的变化的图。

具体实施方式

以下对本发明详细地进行说明。

本发明的乳酸菌即乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）R037株（以下也称作“R037株”）是从发酵乳中分离出的新型乳酸菌，其以保藏号NITEBP-900保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）。

R037株具有下述菌学上的性质，确认了其为属于乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的菌株。

A形态学性状

1.细胞形态：球菌

2.革兰氏染色性：阳性

3.胞子的有无：无

4.运动性：无

B培养基上的生长状态

MRS琼脂培养基上的群落形态：透镜状的白色球状

C生理学性质

1.37℃下的生长能力：阳性

2.45℃下的生长能力：阳性

3.过氧化氢酶反应：阳性

4.各种碳水化合物（糖类）的分解性（阳性＋、阴性-）

阿拉伯糖：-

半乳糖：＋

乳糖：-

麦芽糖：-

松三糖：-

核糖：＋

木糖：＋

D化学分类学特性

由16S rDNA的全碱基序列解析的结果可知，以99.7%的同源性与乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）UL5株一致。

如后述的实施例所示，R037株不仅具有优异的抗过敏/抗特异反应性皮炎功能，而且还具有优异的中性脂肪减少功能。

本发明中，不仅是上述R037株，它们的突变体只要具有同等的功能，则也属于本发明的技术范围，可以代替上述R037株含有在本发明的组合物中。作为这种突变体并无特别限定，可举出由自然突变所产生的突变体、通过放射线或突变诱导物质等公知的方法人为地诱导突变所获得的突变体等。

在上述R037株或者它们的突变体的培养中，只要是它们能够生长的培养基，则可以使用任何的培养基，对于培养方法，可以通过试管培养、烧瓶培养、利用发酵槽的培养等进行培养，并无特别限定，例如使用在乳酸菌培养中通常使用的MRS培养基、在一般的条件下进行通常的乳酸菌培养即可。

本发明的组合物是含有对从发酵乳中分离出的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）R037株进行培养而得到的菌体或其处理物的组合物。作为组合物中含有的菌体，可以是活菌也可以是死菌（灭活菌）。这里，活菌是指活着的乳酸菌，死菌（灭活菌）是指通过加热、加压、药物处理等实施了灭菌处理的菌体。

进而，本发明中，只要具有同等的功能，则不仅是全菌体（whole cell）、菌体的处理物也可含有在本发明的组合物中。这里所说的菌体的处理物除了这些乳酸菌的通过磨碎或粉碎、抽提等获得的液状化物、实施了选自浓缩、糊化、干燥（喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、滚筒干燥等）、稀释中的至少1个处理的处理物之外，还指乳酸菌的抽提残渣。

含有本发明的R037株、其突变体或者这些乳酸菌来源的成分的本发明组合物由于具有优异的抗过敏功能，因而可作为抗过敏剂使用。本发明的抗过敏剂具有在倾向于Th2型的免疫系统中将对抗原刺激的免疫应答转变成Th1型免疫应答的作用，还可以抑制IgE抗体的产生量。因此，具有预防或改善花粉症、特异反应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等过敏性疾病的功能。

本发明中，抗过敏功能例如可以如后述的实施例那样来评价：将免疫了卵清蛋白（OVA）的BALB/c小鼠的脾细胞在添加有OVA及待测物质的培养基中进行培养，测定培养上清中的细胞因子（IL-12、IL-4），由此进行评价。即，与在未添加有待测物质的培养基中培养的脾细胞所产生的细胞因子IL-12、IL-4产生量相比，通过添加待测物质，如果诱导了脾细胞的IL-12的产生且抑制了IL-4的产生，则评价待测物质具有抗过敏功能。

抗过敏功能还可通过对经口投予了待测物质的小鼠免疫OVA并测定该小鼠的血中总IgE量来进行评价。即，当与未投予待测物质的小鼠相比血中总IgE量有所减少时，则评价待测物质具有抗过敏功能。

抗特异反应性皮炎功能可以如后述的实施例那样来评价：向特异反应性皮炎模型小鼠（Nc/Nga系SPF小鼠）投予待测物质并利用苦基氯致敏和诱导特异反应性皮炎，由此进行评价。即，当与未投予待测物质的小鼠相比皮炎得分有所减少时，则评价待测物质具有抗特异反应性皮炎功能。

含有R037株、其突变体或这些乳酸菌来源成分的组合物由于具有优异的中性脂肪减少功能，因而还可作为中性脂肪减少剂使用。本发明的中性脂肪减少剂具有减少血液中的中性脂肪量、控制血清中的中性脂肪浓度、预防或改善脂质代谢和高甘油三酯血症的效果。

中性脂肪减少功能可以例如如后述的实施例那样通过测定2型糖尿病模型小鼠（KK-Ay小鼠）的血清中中性脂肪量来进行评价。即，当与未投予待测物质的小鼠相比血清中的中性脂肪量降低时，则评价待测物质具有中性脂肪减少功能。

含有R037株、其突变体或这些乳酸菌来源成分的组合物由于具有优异的抗自身免疫性疾病功能，因而还可作为自身免疫性疾病的预防和改善剂使用。本发明的自身免疫性疾病是指类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。

本发明的组合物可作为食品、功能性食品或补充剂、饲料（包括宠物食品）、动物用药品或药品使用。

本发明的组合物在作为食品日常摄取时，含有本发明的组合物的食品的形态并无特别限定，例如可举出食用油脂组合物、烹饪油类、喷淋油类、黄油类、人造黄油类、起酥油类、鲜奶油类、炼乳类、增白剂类、调味品类、腌制液类、面包类、蛋糕类、馅饼类、饼干类、日本点心类、小吃点心类、油炸点心类、巧克力及巧克力点心类、米果类、乳酪面粉糊类、调味汁类、佐料汁类、顶层配料类、冰冻点心类、面类、糕点混合料类、油炸食品类、加工肉产品类、豆腐魔芋等其它加工品、水产酱产品类、冷冻主菜类、畜产冷冻食品、农产冷冻食品等冷冻食品类、米饭类、果酱类、奶酪、干酪食品、类奶酪食品、口香糖类、糖果类、发酵乳类、罐头类、饮料类等一般食品形态。

将本发明的组合物制成食品时的乳酸菌或乳酸菌来源成分的含量并无特别限定，例如在食品中可以按照达到0.00001～100重量%、优选达到0.001～50重量%、更优选达到0.1～30重量%的比例的方式来含有。

将本发明的组合物作为功能性食品或补充剂、饲料或动物用药品使用时，其剂型并无特别限定，例如可举出胶囊剂、糖浆剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、饮剂、注射剂、输液、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂、贴剂、喷雾剂等。在制剂化中，可以适当添加药剂学上可允许的其它制剂、例如赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、抗氧化剂、着色剂、抗凝集剂、吸收促进剂、溶解辅助剂、稳定化剂等进行制备。而且，该制剂还可混合在配合饲料或混合饲料中，也可悬浮在饮用水中施予。或者还可将本发明的组合物直接混入饲料中。

这些情况下，本发明的组合物以乳酸菌或乳酸菌来源成分计，与动物种类无关地按照每日可摄取优选0.01～1000mg/kg体重、更优选0.1～500mg/kg体重的方式施予1次或分多次施予。

使用本发明的组合物作为药品时，其剂型并无特别限定，例如可举出胶囊剂、糖浆剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、饮剂、注射剂、输液、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂、贴剂、喷雾剂等。在制剂化中，可以适当添加药剂学上可允许的其它制剂、例如赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、抗氧化剂、着色剂、抗凝集剂、吸收促进剂、溶解辅助剂、稳定化剂等进行制备。还可以以胶囊剂或片剂等补充剂形态制成特定保健用食品、营养功能食品等保健功能食品或健康食品、营养辅助食品等功能性食品，还可注明用于过敏症状的预防改善和/或中性脂肪减少。此时，作为本发明组合物的投予量，以乳酸菌或乳酸菌来源成分计，按照每个成人每日可摄取优选0.1～1000mg/kg体重、更优选10～300mg/kg体重的方式投予1次或分多次投予。

本发明的组合物通过投予至投予对象，可以预防和改善过敏或特异反应性皮炎等过敏性疾病。此时，作为投予对象并无特别限定，可举出过敏性疾病患者、特异反应性皮炎患者等表现出过敏症状者；虽然目前未表现出过敏症状、但通过抗体检查等被指出有其潜在风险者；以及想对过敏或特异反应性皮炎等的发病防患于未然的健康者或健康动物。

另外，本发明的组合物通过投予至投予对象，可以减少血液中的中性脂肪。此时，作为投予对象并无特别限定，可举出高甘油三酯血症患者；在血液检查等中中性脂肪值高而成为高甘油三酯血症预备群者；以及积累了不良生活习惯而需要注意中性脂肪值的健康者或健康动物。

另外，本发明的组合物通过投予至投予对象，可以预防和改善自身免疫性疾病。作为自身免疫性疾病的预防和改善目的中的投予对象，可举出患有作为自身免疫性疾病的例子在前述示例过的疾病的对象；目前虽然未表现出症状、但通过抗体检查等被指出有其潜在风险者；或者想对这些疾病的发病防患于未然的健康者或健康动物。

实施例

以下示出实施例更为具体地说明本发明，但本发明并非限定于这些实施例。另外，实施例中利用以下所示的方法来评价抗过敏功能、抗特异反应性皮炎功能、中性脂肪减少功能。

＜抗过敏功能的评价＞

将以OVA为抗原进行了免疫的过敏模型小鼠（雄性BALB/c小鼠）的脾细胞与OVA和待测物质进行共培养时，对能否抑制IL-4的产生且促进IL-12的产生进行评价。

另外，对经口投予了待测物质的小鼠（雄性BALB/c小鼠）经时地免疫OVA，测定血清中IgE，评价相对于未投予待测物质的小鼠的血清中IgE量经时地增加、经口投予了待测物质的小鼠的血清中IgE量的增加是否被抑制。

＜抗特异反应性皮炎功能的评价＞

对经口投予了待测物质的特异反应性皮炎模型小鼠（雄性Nc/Nga系SPF小鼠），将苦基氯涂布在背部和足垫上致敏，通过涂布在背部和左右耳廓，对小鼠诱发特异反应性皮炎，研究皮炎得分及耳廓厚度。评价相对于未投予待测物质的小鼠的皮炎得分及耳廓厚度经时地增加、经口投予了待测物质的小鼠的皮炎得分及耳廓厚度的经时性增加是否被抑制。

＜中性脂肪减少功能的评价＞

测定经口投予了待测物质的2型糖尿病模型小鼠（雄性KK-Ay小鼠）的血清中中性脂肪量，评价相对于未投予待测物质的小鼠的血清中中性脂肪量经时地增加、经口投予了待测物质的小鼠的血清中中性脂肪量的增加是否被抑制。

（制造例1～4）各乳酸菌的制备

将表1记载的乳酸菌分别在MRS培养基（将MRS bouillon（关东化学株式会社制）52g溶解在1L水中并进行121℃、15分钟的高压灭菌所得的的培养基）中培养48小时，培养结束后，通过离心分离将菌体回收，用灭菌水洗涤3次后，分散于20ml的灭菌水中，在80℃下加热10分钟后进行冷冻干燥，获得各乳酸菌的冷冻干燥菌体1～4。

表1

	所添加的乳酸菌株
		制造例1（冷冻干燥菌体1）	乳酸片球菌R037（保藏号：NITE BP-900）
制造例2（冷冻干燥菌体2）	德氏乳杆菌乳酸亚种KR-188（保藏号：NITE P-396）
		制造例3（冷冻干燥菌体3）	耐久肠球菌KR-211（保藏号：NITE P-397）
制造例4（冷冻干燥菌体4）	肠膜明串珠菌肠膜亚种KLAB-2(保藏号：NITE P-393)

（实施例1）利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能

本实验中，将5周龄的雌性BALB/c小鼠（Charles River株式会社制）驯化饲养1周后使用。对BALB/c小鼠腹腔内免疫将100μg的OVA和2mg的氢氧化铝凝胶混合并用生理盐水调整为200μl的抗原液（一次免疫），一周后进一步腹腔内免疫等量的抗原液（二次免疫）。距离二次免疫1周后，利用ELISA法测定OVA特异性IgE抗体效价，将确认到抗体效价上升的小鼠作为过敏模型小鼠。

由过敏模型小鼠制备脾细胞后，按照达到2.0×106cells/ml的方式悬浮在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（商品名：RPMI1640、Sigma公司制）中，作为抗原刺激，将OVA（1mg/ml）和制造例1中制备的乳酸菌干燥菌体1（1μg/ml）添加至培养基中。在37℃、5%CO2孵育箱中培养脾细胞7天，利用ELISA法（产品名：Quantikine、R＆D Systems公司制）测定培养后上清中所含的IL-4及IL-12，将该测定值作为评价值。它们的结果汇总于表2。

（参考例1～3）利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能

作为参考例，使用乳酸菌干燥菌体2～4，除此之外与实施例1同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。

（比较例1）利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能

作为阴性对照，不添加乳酸菌液而使用PBS（-），除此之外与实施例1同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。

（参考例4）利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能

作为阳性对照，不添加乳酸菌液而使用具有Th1活化能力的免疫激活剂Picibanil（中外制药株式会社制）1μg/ml，除此之外与实施例1同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。

（参考例5）利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能

为了与日本专利第3585487号进行比较，作为使用了乳酸菌的阳性对照，代替制造例1～4中使用的乳酸菌而使用具有抗过敏活性的乳酸菌干酪乳杆菌L14株（乳业技术协会，与副干酪乳杆菌KW3110、FERM BP-08634相同），与制造例1～4同样地制备乳酸菌的干燥菌体，并与实施例1同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。

表2

（单位：pg/ml）

	所添加的乳酸菌株	IL-4	IL-12
				实施例1（冷冻干燥菌体1）	乳酸片球菌R037（保藏号：NITE BP-900）	145.1	449.8
参考例1（冷冻干燥菌体2）	德氏乳杆菌乳酸亚种KR-188（保藏号：NITE P-396）	73.9	334.0
				参考例2（冷冻干燥菌体3）	耐久肠球菌KR-211（保藏号：NITE P-397）	105.6	306.6
参考例3（冷冻干燥菌体4）	肠膜明串珠菌肠膜亚种KLAB-2（保藏号：NITE P-393）	39.6	356.5
				比较例1	-	3584.9	-
参考例4	（免疫激活剂：Picibanil）¹⁾	434.5	253.1
				参考例5	干酪乳杆菌L14^2）	313.4	172.8

1）中外制药公司制，非乳酸菌制剂

2）由日本乳业技术协会鉴定为是与副干酪乳杆菌KW3110（FERM BP-08634）相同的株

表2示出了过敏模型小鼠脾细胞的相对于OVA和乳酸菌的共培养的

IL-4、IL-12的产生量。在未添加乳酸菌的比较例1中，过敏模型小鼠脾细胞在OVA刺激下诱导了IL-4的产生，但IL-12的产生量为检测限以下，显示了很强的Th2型免疫应答。而使用了Picibanil的参考例4中，过敏模型小鼠脾细胞显示了在OVA刺激下表现出抑制IL-4的产生、诱导IL-12的产生的Th1型免疫应答。另外，在使用了干酪乳杆菌L14株的参考例5中，与参考例4同样，显示了Th1型免疫应答。实施例1、参考例1～3中，也显示了抑制IL-4的产生、诱导IL-12的产生。特别是，由实施例1的结果可见，R037株与参考例5相比，使IL-12产生活化了约2.5倍、将IL-4产生抑制至约1/2，由此可知其抗过敏活性水平高。

（实施例2）利用体内试验测定制剂的抗过敏功能

首先，预先将0.05重量份的制造例1中制备的R037株的冷冻干燥菌体1和赋形剂（商品名：Pinedex#2，松谷化学工业株式会社制）0.45重量份充分地混合，制作乳酸菌制剂。将所制作的乳酸菌制剂0.5重量份和粉末小鼠饲料（产品名：CE-2，Oriental酵母株式会社制）99.5重量份混合，制备乳酸菌制剂的含量为0.5重量%的乳酸菌制剂混合饲料。

将5周龄的雌性BALB/c小鼠（Charles River株式会社制）驯化饲养1周后，开始投予乳酸菌制剂混合饲料（以乳酸菌计，自由摄取平均约2.5mg/日左右），距离该开始日1周后（第7天）腹腔内免疫将100μg的OVA和2mg的氢氧化铝凝胶混合并用生理盐水调整至200μl的抗原液。同样地，在2周后（第14天）、4周后（第28天）、6周后（第42天）、8周后（第56天）免疫OVA抗原液。然后，为了测定血中总IgE量，在3周后（第21天）、5周后（第35天）、7周后（第49天）、9周后（第63天）从小鼠颈静脉采血。利用离心分离对采集的血液回收血清，使用免疫球蛋白E/EIA试剂盒“Yamasa”（Yamasa酱油株式会社制）测定血清中所含的总IgE量。将各测定值示于表3。

（参考例6～8）利用体内试验测定制剂的抗过敏功能

代替R037株的冷冻干燥菌体而分别使用制造例2～4中制备的各乳酸菌的冷冻干燥菌体2～4，除此之外与实施例2同样地测定回收的血清中所含的总IgE量。各测定值示于表3。

（比较例2）利用体内试验测定制剂的抗过敏功能

作为阴性对照，代替乳酸菌制剂混合饲料而使用未添加乳酸菌制剂的粉末小鼠饲料（产品名：CE-2，Oriental酵母株式会社制），除此之外与实施例2同样地测定回收的血清中所含的总IgE量。各测定值示于表3。

（参考例9）利用体内试验测定制剂的抗过敏功能

为了与日本专利第3585487号进行比较，作为阳性对照，代替使用了冷冻干燥菌体1的乳酸菌制剂而使用混合有由副干酪乳杆菌KW3110构成的健康辅助食品（产品名：Noale Capsule、Kirin Yakult Nextstage株式会社制）0.075重量份和粉末小鼠饲料99.925重量份的乳酸菌混合饲料，除此之外与实施例2同样地测定回收的血清中所含的总IgE量。各测定值示于表3。

另外，实施例2、比较例2、参考例6～9的实验期间未见小鼠的体重、饲料总摄取量有差异。

表3

（单位：ng/ml）

*表示相对于比较例2有显著性差异。

由表3的结果可知如下内容。与饲料中未混合有乳酸菌制剂的阴性对照组（比较例2）相比，在第63天时，阳性对照群（参考例9）的血中总IgE量减少。另外，实施例2、参考例6～8的施予了乳酸菌制剂混合饲料的小鼠的血中总IgE量也同样，与比较例2的对照相比在第63天时减少。由表3的结果确认了：特别是含有作为制造例1的R037株的冷冻干燥菌体1的制剂即便与参考例9的制剂相比也具有优异的抗过敏功能。另外，本实验中的总IgE量的变化可以认为是OVA特异性的IgE量的变化，因此表示了本发明的组合物具有抗过敏效果。

（实施例3）利用体内试验测定制剂的抗特异反应性皮炎功能

首先，将0.33重量份的制造例1中制备的R037株的冷冻干燥菌体1和粉末小鼠饲料（产品名：CE-2，日本CLEA株式会社制）99.67重量份混合，制备冷冻干燥菌体1的含量为0.33重量%的乳酸菌混合饲料。

将7周龄的雄性Nc/Nga系SPF小鼠（日本Charles River株式会社制）驯化饲养1周后，开始投予上述乳酸菌混合饲料（以乳酸菌计、自由摄取平均约17mg/日左右），距离该开始日1天后（第1天）对小鼠进行异氟烷麻醉，在剃去毛发的腹部和足垫上涂布致敏用PiCl溶液（5%（w/v）PiCl溶液（溶剂：乙醇/丙酮＝4：1））150μl。特异反应性皮炎的诱发是通过在致敏后4天（第5天）在小鼠的背部和左右耳廓（内外两侧）涂布诱发用PiCl溶液（0.8%（ｗ/v）PiCl溶液（溶剂：橄榄油））150μl来进行的。每隔1周重复进行该特异反应性皮炎诱发操作，共重复7次。从致敏开始日（第1天）开始，每周观察2次皮肤的状态，基于人的特异反应性皮炎的临床状态评价标准，对掻痒症、发红/出血、浮肿、擦伤/组织缺损、痂皮形成/干燥这5个项目按无症状（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）打分，将加和后的值作为皮炎总得分进行评价。另外，从试验开始日（第0天）开始，每周1次使用千分尺进行耳廓厚度的测定。将皮炎总得分的测定结果示于图1、耳廓厚度的测定结果示于图2。

（比较例3）利用体内试验测定制剂的抗特异反应性皮炎功能

作为阴性对照，使用未添加乳酸菌的冷冻干燥菌体的粉末小鼠饲料（产品名：CE-2，日本CLEA株式会社制），除此之外与实施例3同样地测定总得分、耳廓厚度，将其结果示于图1、图2。

另外，实施例3、比较例3的实验期间未见小鼠的体重、饲料总摄取量有差异。

由图1、图2的结果可知以下内容。在饲料中未混合有乳酸菌的阴性对照组（比较例3）在诱发第4次的特异反应性皮炎之后，总得分和耳廓厚度上升，与此相对，投予了混合有R037株的冷冻干燥菌体1的饲料的组（实施例3）的小鼠中，总得分、耳廓厚度的上升均被抑制，就总得分而言，在第34天之后显著地抑制了上升，就耳廓厚度而言，在第35天之后显著地抑制了上升。由以上结果可见本发明的组合物的抗特异反应性皮炎功能。

（实施例4）利用体内试验测定制剂的中性脂肪减少功能

首先，用蒸馏水将混合有67重量份的制造例1中制备的R037株的冷冻干燥菌体1和赋形剂（商品名：Pinedex#2，松谷化学工业株式会社制）33重量份的乳酸菌制剂悬浮至达到浓度10重量%，从而制备了乳酸菌制剂混合液。

使8周龄的雄性KK-Ay小鼠（日本CLEA株式会社制）自由地摄取小鼠饲料（产品名：CE-2，Oriental酵母株式会社制）和灭菌水，驯化饲养2周后，使用塑料制小鼠用灌胃针及1mL结核菌素注射器，按照每日每1kg小鼠体重为7.5ml的方式强制投予上述乳酸菌制剂混合液（以乳酸菌计、强制投予约20mg/日左右）。

实验期间中，使小鼠自由摄取小鼠用饲料（产品名：CE-2，Oriental酵母公司制）和灭菌水。连续强制投予2周后进行采血，回收血清，使用中性脂肪测定试剂盒（Triglyceride E-Test Wako，和光纯药工业株式会社制）测定血清中中性脂肪量。测定值示于表4。

（比较例4）利用体内试验测定制剂的中性脂肪减少功能

作为阴性对照，代替使用乳酸菌混合液而使用未混合有乳酸菌制剂的蒸馏水，除此之外与实施例4同样地测定所回收的血清中含有的中性脂肪量。测定值示于表4。

（参考例10）利用体内试验测定制剂的中性脂肪减少功能

作为阳性对照，代替乳酸菌制剂混合液而使用用蒸馏水将作为胰岛素抵抗性改善药且具有降低血清中中性脂肪效果的吡格列酮（武田药品工业株式会社制）稀释至浓度达到0.4重量%的溶液，除此之外与实施例4同样地测定所回收的血清中含有的中性脂肪量。测定值示于表4。

（参考例11）利用体内试验测定制剂的中性脂肪减少功能

代替R037株的冷冻干燥菌体1，将作为由独立行政法人理化学研究所生物资源中心购买的菌株的乳酸片球菌JCM2032株与制造例1同样地制备冷冻干燥菌体，并与实施例4同样地测定所回收的血清中含有的中性脂肪量。测定值示于表4。

（参考例12）利用体内试验测定制剂的中性脂肪减少功能

代替R037株的冷冻干燥菌体1，将作为由独立行政法人理化学研究所生物资源中心购买的菌株的乳酸片球菌JCM8797株与制造例1同样地制备冷冻干燥菌体，并与实施例4同样地测定所回收的血清中含有的中性脂肪量。测定值示于表4。

（参考例13）利用体内试验测定制剂的中性脂肪减少功能

代替乳酸菌制剂混合液而使用用蒸馏水将由副干酪乳杆菌KW3110构成的健康辅助食品（产品名：Noale Capsule，Kirin Yakult Nextstage株式会社制）悬浮至浓度达到10重量%的乳酸菌液，除此之外与实施例4同样地测定所回收的血清中含有的中性脂肪量。测定值示于表4。

另外，实施例4、比较例4、参考例10～13的任一个实验中均未见小鼠的体重、饲料总摄取量有差异。

表4

	血清中中性脂肪量（mg/dl）
		实施例4	360.1
比较例4	596.6
		参考例10	359.8
参考例11	495.2
		参考例12	477.3
参考例13	463.3

由表4的结果可知以下的内容。与仅强制投予了蒸馏水的比较例4的小鼠的血清中中性脂肪相比，强制投予了具有中性脂肪减少效果的吡格列酮的参考例10的小鼠的血清中中性脂肪量降低，确认到了吡格列酮的中性脂肪减少作用。另外，强制投予了使用制造例1的R037株制备的制剂的实施例4的小鼠、参考例11～13的小鼠，与参考例10的小鼠同样，血清中中性脂肪量均降低，特别是制造例1的R037株具有优异的血清中中性脂肪减少功能。

由这些结果确认了：使用制造例1的乳酸菌（R037株）制备的制剂具有中性脂肪减少效果，且其效果与其它的乳酸菌制剂相比更优异。

Claims

1.一种乳酸菌，其特征在于，其是保藏号为NITE BP-900的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)R037株。

2.一种组合物，其含有对权利要求1所述的乳酸菌进行培养而获得的乳酸菌菌体或其处理物。

3.权利要求1所述的乳酸菌在用于制造具有抗过敏功能和/或中性脂肪减少功能的组合物中的用途。

4.权利要求1所述的乳酸菌在用于制造具有抗过敏功能和中性脂肪减少功能的组合物中的用途。

5.权利要求3或4所述的用途，其中，抗过敏功能是预防或改善花粉症、特异反应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎或过敏性结膜炎的功能。

6.权利要求3所述的用途，其中，中性脂肪减少功能是减少血液中的中性脂肪量的功能。

7.权利要求1所述的乳酸菌在用于制造抗过敏剂中的用途。

8.权利要求1所述的乳酸菌在用于制造中性脂肪减少剂中的用途。

9.根据权利要求3～6任一项所述的用途，其中，组合物为药品或饮食品。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，饮食品为功能性食品或补充剂。

11.根据权利要求9所述的用途，其中，药品为动物用药品。