CN102367435B - 人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用 - Google Patents
人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用。对人全血以离心方式分离出红细胞以及白细胞与血小板的混合物后，剩余血浆再以大于之前最大离心力的方式离心分离并收集沉淀物，将收集的沉淀物分别于≤-20℃和不低于常温的条件下进行冻-融处理后，分离除去沉淀物，得到人富血小板血浆。该方法的原料来源丰富，并使血资源得到充分利用，所得产物的血小板更纯，含有更丰富的包括生长因子在内的营养成分，用于人间充质干细胞的分离、培养能具有更理想的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中对人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用，尤其是可以常规方法由分离了红细胞以及白细胞与血小板的混合物后的废弃血浆、特别是目前尚未得到充分利用而废弃的人脐带血/血浆为原料，进一步制备得到包括但不限于供人间充质干细胞分离培养用的人富血小板血浆。
背景技术
间充质干细胞（MSCs）是一种具有自我更新和多项分化潜能的多能成体干细胞。MSCs最早在骨髓当中分离得到，体外贴壁生长，呈梭形。除了可以向中胚层的成骨，成脂和成软骨方向分化外，MSCs被证明还可以跨胚层分化成多种细胞谱系，如肝细胞，肺细胞，肌肉细胞，神经细胞等。MSCs不表达HLA II类抗原，只表达极少量的HLA I类抗原，其免疫原性极低，因此在细胞移植中对配型要求低。MSCs在人体内分布广泛，目前已经可以从人体的多种组织中分离得到，包括了外周血、脂肪组织、脐带血、脐带、胎盘等组织。
MSCs可以为造血干细胞（HSCs）提供合适的微环境，多项研究表明，MSCs的存在促进了HSCs的增殖和造血干细胞移植后造血系统的重建。与单一的造血干细胞移植比较，MSCs与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果。此外，MSCs还具有免疫调节功能，能够抑制B淋巴细胞、T淋巴细胞、DC细胞等免疫细胞的增殖以及活化。因此，MSCs可以预防和治疗异体造血干细胞移植后产生的移植物抗宿主病（GVHD），避免在器官移植中产生的免疫排斥反应，以及治疗自生免疫性疾病，如红斑狼疮、风湿性关节炎和硬皮病等。由于MSCs具有增殖、分化和低免疫原性等特点，因而可以作为组织工程理想的种子细胞来源，进行组织修复和再生，并已经用于多种疾病的损伤或病变器官的修复，如心脑血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、脑及骨髓神经损伤、老年痴呆等，取得了显著的疗效。MSCs易于导入和表达外源基因，也是一种基因治疗的良好载体。因此，MSCs具有具有巨大的应用潜力和十分广阔的应用前景。
MSCs需要通过体外的培养和扩增，以达到临床应用的细胞数量。传统的MSCs培养体系中需要添加一定量的（10~20%）的胎牛血清（FBS），作为生长因子、微量元素等营养成分的来源。但使用动物血清生产的细胞产品常存在诸多问题：FBS批次间差异较大，降低了细胞培养的重复性和稳定性；存在异基因污染和免疫反应的风险，如Heiskanen等和Sundin等在用FBS的培养的细胞移植后，已发现了抗FBS蛋白的抗体(Heiskanen A et al., Stem Cells. 2007; 25; 197-202; Sundin M et al., Haematologica. 2007; 92:1208-15)。此外，FBS还会引起培养细胞的生理生化及代谢特性的改变，如可以引起MSCs培养过程中向软骨方向分化 (Yokoyama M et al., J Biosci Bioeng. 2008; 106; 46-50)等。特别是，动物血清中常可能含有由蛋白质构成的感染物和未知的动物传染病，可导致传播人畜共患病的更严重危险。
人富血小板血浆（PRP）是指相对于全血来说含有更高水平血小板的血浆。PRP目前在整形外科中已有广泛的应用，主要用于促进骨嫁接后的骨融合和提高骨密度，伤口修复以及用于软组织修复等。PRP中含有多种能维持MSCs增殖的生长因子，如血小板衍生生长因子（PDGFs）、β-转化生长因子（TGF-β）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等。并且随着血小板浓度提高，这类生长因子的浓度相应提高。成体外周血的PRP已经成功用于脂肪来源和骨髓来源MSCs的体外培养（Kocaoemer A et al., Stem Cells. 2007; 25: 1270-1278; Schallmoser K et al., Transfusion 2007；47：1436-1446）。
目前PRP的制备，如Landesberg法和Aghaloo法等方法，原理都是利用血液中各组分密度大小的不同，对人的全血先以一次或分次的离心方式分离出红细胞以及白细胞与血小板的混合物。例如，分次方式可采用由小到大的离心力分别分离出红细胞（如离心力≤200g下离心10分钟）以及白细胞与血小板的混合物（如离心力200~900g下离心10分钟）。处理后，血小板以及白细胞主要都被富集于富血小板血浆层中，剩余的血浆中因血小板含量较低（贫血小板血浆），通常被废弃。目前这些方法得到的富血小板血浆，由于血小板和白细胞较难分开，难以实现血小板与白细胞的分别利用，而且富血小板中混入的高浓度白细胞则有可能对于组织修复等起到副作用。一方面由于外周血的血源紧张，难以大量获得，而且外周血的采集也会给供者带来痛苦，另一方面，成体外周血也容易因接触如辐射、病毒等外源性因子而被污染。
发明内容
针对上述情况，本发明提供一种人富血小板血浆的制备方法，特别是按照常规造血干细胞分离后被废弃的外周血和/或脐带血浆进一步制备PRP的方法，以及将这些所得到PRP在包括但不限于人间充质干细胞分离培养中的应用。
本发明的人富血小板血浆的制备方法，是对人全血以离心方式分离出红细胞以及白细胞与血小板的混合物后，剩余血浆再以大于之前最大离心力的方式离心分离并收集沉淀物，将收集的沉淀物分别于≤0℃和不低于常温的条件下进行冻-融处理后，分离除去沉淀物，得到人富血小板血浆。
在进行红细胞以及白细胞与血小板的混合物分离时，优选的是在人的全血中先加入如常用的6%( w/v)等浓度的羟乙基淀粉或10%(w/v)等浓度的喷他淀粉，至体系中其重量/体积终含量为1~2%并充分均匀混合后，依次分别在≤200g离心力下分离红细胞，和在200~900g离心力下分离白细胞与血小板的混合物，然后在＞900g离心力下对剩余血浆进行分离。
进一步，上述方法中对所说剩余血浆处理的更优选方式，是在≥1000g离心力下进行离心分离。
上述方法中，所说的对由剩余血浆离心分离收集的沉淀物进行冻-融处理时，优选的方式是分别在-20℃和35℃~42℃、优选为37℃的条件下反复进行冻-融处理至少两次，然后在大于对所说该剩余血浆分离的离心力下，离心分离除去其中的沉淀物。对分离除去沉淀物的上清液，根据情况或需要，还可以进一步过滤处理，例如，可以经≤0.22μm膜过滤。所得到的人富血小板血浆以按常规方式低温保存（例如≤-20℃）为宜。
本发明上述的制备方法中，所说的人全血，除可使用人成体外周血外，特别优选的是以人脐带血为原料，制备得到相应的人脐血富血小板血浆（cbPRP）。其制备过程和条件等虽无异，但不仅人脐血的来源更为丰富，可以使目前尚未被充分利用的脐血、以及随着脐带血造血干细胞储存的普及，由分离脐血造血干细胞后大量剩余的脐带血血浆，能得到充分的利用，成为脐血PRP的良好来源，而且试验结果显示，由此得到的富血小板血浆中所含的白细胞浓度较常规方法低于1/20，血小板更纯。尤其是相对于成体外周血，脐带血的来源更加原始，含有更加丰富的包括生长因子在内的营养成分。
试验结果证明，将本发明上述方法制备得到的人富血小板血浆（PRP）和/或人脐血富血小板血浆（cbPRP）用于人间充质干细胞的体外分离、培养，可以具有更理想的效果。
可以理解，本发明上述人富血小板血浆制备方法的原料来源丰富，特别是能使血资源得到更加充分的利用，减少了资源的浪费，所得到的血小板也更纯，并含有更丰富的包括生长因子在内的营养成分，为避免使用FBS培养基生产的相关细胞产品可导致临床应用的风险提供了有效的解决途径。
以下结合附图及实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
附图说明
图1是以本发明方法制备的5% PRP（血小板浓度1000×109个/L）培养基培养的MSCs从组织块周围爬出的显微镜下状态。
图2本发明用制备的PRP培养的MSCs表面标志特征。
图3是采用本发明PRP培养的MSCs具有正常的成骨分化能力的显微镜下状态。
图4是采用本发明PRP培养的MSCs具有正常的成脂分化能力的显微镜下状态。
具体实施方式
实施例1
按常规方式，将采集的人成体血样本加入6%羟乙基淀粉至其在体系中含量为~1%(w/v)并充分混匀。70g离心6分钟，去除下层红细胞。剩余部分用420g离心11分钟，分离得到“血小板+白细胞”混合物层，可用于造血干细胞的储存。剩余的贫血小板血浆层于1000g离心10分钟，将血小板聚集到管底，吸去大部分上清液，以提高血小板的浓度，重悬后，使用Backman Coulter Ac.T Diff2血细胞分析仪测量血小板浓度，然后将其分别在-20℃冷冻后取出，立即置37℃水浴中，持续摇晃使之混匀、快速融化。如此反复冻-融两次后，用3000g离心15分钟去除细胞碎片，得到PRP。根据需要，该PRP还可再用0.22μm膜过滤，于-20℃保存。
实施例2
以足月顺产或剖腹产的健康产妇脐带的脐带血为原料，按实施例1的同样方式操作，得到相应的cbPRP。
实施例3
以实施例2得到的cbPRP进行MSCs的培养实验。
脐带MSCs的培养：
脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的PBS溶液中4℃保存，48h内处理。脐带去除血管，剪碎至1mm3左右。每1.5cm脐带的组织块接种于1个90mm细胞培养皿中，用含DMEM-LG/F12（1:1，v/v）添加10（v）%FBS及添加5(v)% cbPRP（血小板浓度1000×109个/L）的培养基，置于37℃，体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。根据细胞生长情况，每3-5天全量换液一次。结果如图1所示，细胞从组织块周围爬出。待细胞达到70%汇合度时，用0.05(w/v)%的胰酶/EDTA消化，然后按10000个/cm2按的密度进行传代接种。传代培养过程中，每3天全量换液，直至贴壁细胞达到90%汇合度时，重复上述操作进行传代。
不同血小板浓度对MSCs增殖的影响：
FBS培养基分离培养的MSCs细胞，以10000个/cm2的密度接种到6孔细胞培养板中；以同样的cbPRP浓度和不同血小板浓度条件下接种后，于第1、2、3、4天后分别对MSCs进行收获计数，以10%FBS为对照，比较cbPRP中不同血小板浓度对MSCs增殖的影响。其中，采用本发明的3% cbPRP，血小板浓度分别1200、800、400、100（×109个/L）以及3%离心上清液的培养基，MSCs在不同时间点的收获量（单位：万）。结果如表1所示。实验表明，血小板浓度为800~1200×109个/L时，MSCs扩增效果最好。
表1 血小板浓度对MSCs增殖的影响
| 血小板浓度 | Day 0 | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 |
| 上清液 | 10.0 | 9.8 | 23.6 | 28.6 | 33.9 |
| 100 | 10.0 | 9.0 | 30.2 | 47.3 | 56.5 |
| 400 | 10.0 | 10.4 | 35.4 | 65.3 | 98.2 |
| 800 | 10.0 | 9.2 | 40.4 | 80.7 | 102.6 |
| 1200 | 10.0 | 9.9 | 39.1 | 79.2 | 107.9 |
| FBS | 10.0 | 8.5 | 22.7 | 54.2 | 62.4 |
不同cbPRP浓度对MSCs增殖的影响：
FBS培养基分离培养的MSCs细胞，以10000个/cm2的密度接种到6孔细胞培养板中，在确定血小板浓度的条件下，不同的cbPRP浓度与外周血PRP、10%FBS在MSCs增殖方面效果的比较。同样在接种后第1、2、3、4天后对MSCs进行收获计数。
采用本发明不同cbPRP浓度的培养基，以及3(v)%外周血PRP、10%FBS时，各时间点MSCs的收获量（单位：万）。结果如表2所示。实验表明，当cbPRP浓度>3%时，培养效果最佳，且明显好于10%FBS培养基的培养效果。同样浓度（3%）cbPRP比外周血PRP培养基的培养效果更好。
表2 不同PRP浓度对MSCs增殖的影响
| PRP浓度 | Day 0 | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 |
| 0% cbPRP | 10.0 | 7.8 | 12.7 | 11.0 | 9.1 |
| 1% cbPRP | 10.0 | 9.1 | 29.3 | 50.2 | 70.4 |
| 2% cbPRP | 10.0 | 9.2 | 28.3 | 69.5 | 78.3 |
| 3% cbPRP | 10.0 | 6.7 | 32.4 | 67.1 | 119.2 |
| 4% cbPRP | 10.0 | 8.5 | 33.4 | 67.2 | 120.5 |
| 5% cbPRP | 10.0 | 8.9 | 38.3 | 74.7 | 126.3 |
| 7.5% cbPRP | 10.0 | 8.3 | 30.1 | 63.6 | 127.2 |
| 10% cbPRP | 10.0 | 10.2 | 33.5 | 64.9 | 124.7 |
| 3%外周血PRP | 10.0 | 7.0 | 30.7 | 42.8 | 101.1 |
| 10%FBS | 10.0 | 7.4 | 22.6 | 54.0 | 63.0 |
MSCs表面标志检测：
cbPRP分离培养的P5代细胞常规消化后，以PE标记的CD105、CD73、CD79a，FITC标记的CD90、CD14、CD34、CD45、HLA-DR抗体及其相应的同型对照标记细胞，进行流式检测。结果如图2所示：cbPRP培养的细胞表达CD73，CD90，CD105，不表达CD14，CD34，CD45，CD79a，HLA-DR，符合MSCs表面标志的特征。
分化实验：
FBS或者cbPRP培养的细胞，分别以10000个/cm2的密度接种到24孔板中，待长至70%汇合度时，在培养基中加入分化诱导物。成骨分化诱导物包含100 nM 地塞米松, 2 mM b-磷酸甘油, and 50 μM 抗坏血酸，每3天更换一次培养基，3周左右时，用茜素红染色。成脂分化诱导物包含0.5 mM 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤, 50μM 吲哚辛美 and 0.5μM 地塞米松，每3天更换一次培养基，2周左右，用油红染色。结果如图3和图4所示，表明cbPRP培养的MSCs具有正常的成骨和成脂分化能力。其中，图3中的灰白色为染色后显示的MSCs成骨分化部分。图4中灰白色为染色后显示的MSCs成脂分化部分。
Claims (8)
1.人富血小板血浆的制备方法，其特征是以用离心方式分离出人全血中的红细胞以及白细胞与血小板的混合物后剩余的贫血小板血浆为原料，再以大于之前最大离心力的方式离心分离并收集沉淀物，将收集的沉淀物分别于 -20℃和35~42℃的条件下进行冻-融处理后，分离除去沉淀物，得到人富血小板血浆。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是在人的全血中加入羟乙基淀粉或喷他淀粉至体系中其重量/体积终含量为1~2%并充分均匀混合后，依次分别在≤200g离心力下分离红细胞，在200~900g离心力下分离白细胞与血小板的混合物，得到所说的贫血小板血浆，然后在＞900g离心力下对剩余血浆进行分离。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是对所说的贫血小板血浆的分离在≥1000g离心力下进行。
4.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是所说的对由贫血小板血浆离心分离收集的沉淀物分别在-20℃和37℃的条件下反复冻-融处理至少两次后，在大于对所说剩余血浆分离的离心力下，离心除去沉淀物。
5.人脐血富血小板血浆的制备方法，其特征是以用离心方式分离出人脐带血中的红细胞以及白细胞与血小板的混合物后剩余的贫血小板血浆为原料，再以大于之前最大离心力的方式离心分离并收集沉淀物，将收集的沉淀物分别于 -20℃和35~42℃的条件下进行冻-融处理后，分离除去沉淀物，得到人脐血富血小板血浆。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是在人脐带血中加入羟乙基淀粉或喷他淀粉至体系中其重量/体积终含量为1~2%并充分均匀混合后，依次在≤200g离心力下分离红细胞，在200~900g离心力下分离白细胞与血小板的混合物，得到所说的贫血小板血浆，然后在＞900g离心力下对剩余血浆进行分离。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是对所说的贫血小板血浆的分离在≥1000g离心力下进行。
8.如权利要求5至7之一所述的制备方法，其特征是所说的对由贫血小板血浆离心分离收集的沉淀物分别在-20℃和37℃的条件下反复冻-融处理至少两次后，在大于对所说剩余血浆分离的离心力下，离心除去沉淀物。
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