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CN101151368B - 基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法 - Google Patents

基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法 Download PDF

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Abstract

在作为宿主细胞的大肠杆菌中导入至少一种由参与2-脱氧-青蟹肌糖合成的基因构成的基因表达盒，配制转化体，使用此转化体，由D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉或米糠合成2-脱氧-青蟹肌糖。将含有此2-脱氧-青蟹肌糖的培养液，用由氢离子型强酸性阳离子交换树脂和有机酸离子型碱性阴离子交换树脂构成的混合柱或双柱进行处理。使该被精制的2-脱氧-青蟹肌糖与三甲氧基甲烷反应，变为2-脱氧-青蟹肌糖二甲基缩酮，结晶化·精制后，在酸存在下水解，高度精制。

Description

基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法
技术领域
本发明涉及基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2-脱氧-青蟹肌糖(scylloinosose)的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法。 
背景技术
目前在石油化学领域中，开始以石油作为原料生产六元碳环化合物。另一方面，在丁酰苷菌素(butyrosin)生产菌环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)中发现了2-脱氧-青蟹肌糖合成酶(DOI合成酶)，该酶可催化以葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)为基质，合成六元碳环化合物2-脱氧-青蟹肌糖(以下也称为DOI)的反应(图1，专利文献1)。 
DOI合成酶是参与含有2-脱氧链霉胺作为苷元的氨基糖苷抗生素的生物合成的酶，其生成物DOI是作为医药原料或化学工业资源有用的物质。化学合成DOI的方法使用多步反应和有害或昂贵的金属，与其相对，如果使用DOI合成酶，则能够用较短的工序高效率地生产DOI。目前已经确立了使用通过在大肠杆菌中表达DOI合成酶而获得的重组DOI合成酶，用较短工序由葡萄糖-6-磷酸生产DOI的方法(专利文献1)。并且，已知DOI可以通过下述反应合成，即，使己糖激酶和DOI合成酶与葡萄糖作用的二步酶反应、或使DOI合成酶与葡萄糖-6-磷酸作用的一步酶反应(专利文献1、非专利文献1)。另外，也有报道指出，浓缩酶反应液后制成乙酸溶液，与碘化氢作用，由此可以在不精制DOI的情况下变为儿茶酚(专利文献1)。 
但是，使用嵌入DOI合成酶的大肠杆菌、以来自生物质(biomass) 的D-葡萄糖为原料、通过发酵进行DOI合成的方法，尚未作为课题被提出。 
目前为止，已有报道指出可通过酶反应合成DOI，变为反应组合物状态的DOI，但精制·分离DOI本身的方法未见报道。并且，完全没有公开关于从含有比酶反应液中多种多量的培养基成分、作为碳源的葡萄糖、除此之外还含有来自蛋白胨等的氨基酸类、或各种金属离子类的微生物培养液中精制DOI的信息。即。目前的现状为，没有在来自酶反应液及微生物培养液等的杂质的存在下精制DOI的相关报道，或尚未确立可工业应用的精制方法。 
为了在来自微生物培养液等的杂质的存在下精制DOI，已知有实验室规模的通过HPLC分离或采用活性炭柱色谱的方法。但是，不言而喻通过HPLC分离不适于工业生产。另外，采用活性炭柱色谱的方法中，使培养基中的有机化合物都吸附到活性炭上后，边改变醇等有机溶剂的浓度，边利用吸附力的差别使其顺次洗脱。所以，生产大量的DOI时，必须有足以吸附培养基中大部分有机化合物的量的活性炭，此方法也不适于大量精制。由此可知，目前为止尚未确立用于精制DOI的适当的工业方法。 
专利文献1：特开2000-236881号公报(专利第3122762号) 
非专利文献1：K.Kakinuma、E.Nango、F.Kudo、Y.Matsushima、及T.Eguchi著、Tetrahedron Letters、2000年、41卷、p.1935-1938 
非专利文献2：Ota，Y.等著，J.Antibiot.、2000年、53卷、1p.158-1167 
非专利文献3：Kudo，F.等著、J.Antibiot.、1999年、52卷、p.559-571 
发明内容
本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供能够实现可以工业规模制备DOI的体系的基因表达盒、具有此基因表达盒的转化体及2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法。 
本发明的基因表达盒的特征在于，由参与2-脱氧-青蟹肌糖的合成的基因构成。 
本发明的基因表达盒的特征在于，所述参与2-脱氧-青蟹肌糖的合成的基因是2-脱氧-青蟹肌糖合成酶。由此，可以获得能够工业制备DOI的转化体。 
另外，本发明转化体的特征在于，该转化体是向宿主细胞中导入上述基因表达盒而获得的。 
本发明转化体的特征在于，所述宿主细胞是选自大肠菌种、及GILSP基因重组微生物表记载的宿主细胞(平成18年3月公告表中记载的细胞)中的宿主细胞。由此，可以实施能工业制备DOI的方法。 
本发明转化体的特征在于，所述宿主细胞是基因被破坏的宿主细胞，所述基因选自编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因、编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的zwf基因、编码磷酸葡糖变位酶的pgm基因、及编码处于稳定期的负责蛋白质合成修饰的核糖体修饰因子蛋白质的rmf基因中的至少一种。由此，除上述之外，还能够实施能以较高效率工业制备DOI的方法。 
另一方面，本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法的特征在于，具有使上述转化体和碳源接触的工序。由此，能够工业制备DOI。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法的特征在于，所述碳源为选自D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠及废糖蜜、及可以得到D-葡萄糖的生物质中的至少一种碳源。由此，除上述之外，还能通用地制备DOI。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的特征在于，是通过上述2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法获得的。由此，能够得到充分发挥了利用转化体的制备方法的特质的2-脱氧-青蟹肌糖。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，包含以下工序，即，使上述转化体和碳源接触，得到具有2-脱氧-青蟹肌糖的组合物的工序，和，用具有氢离子型强酸性阳离子交换树脂和有机酸离子型碱性阴离子交换树脂的混合柱(mixed-bed column)或双柱 (double-bed column)处理所述组合物的工序。由此，能以工业方式获得高纯度的DOI。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，所述有机酸离子型碱性阴离子交换树脂是乙酸离子型阴离子交换树脂。由此，能够通过浓缩操作除去乙酸，因此实用中可以优选使用。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的特征在于，是通过上述2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法获得的。由此，可以得到纯度高、充分发挥了利用转化体的特质的2-脱氧-青蟹肌糖。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，包含以下工序，即，使上述2-脱氧-青蟹肌糖和三烷氧基甲烷反应，得到2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮的工序，和在酸存在下水解所述2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮的工序。由此，除上述之外，还能高效地分离杂质。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，所述三烷氧基甲烷是三甲氧基甲烷。由此，能够通过浓缩操作容易地除去在接下来的水解工序中生成的甲醇，因此，实用中可以优选使用。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的特征在于，是通过上述2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法获得的。由此，能够得到在纯度等方面实用性也优异的2-脱氧-青蟹肌糖。 
作为医药原料或化学工业原料十分重要的六元碳环化合物，目前为止通过以石油为原料的石油化学进行制备。但是，通过使用本发明的技术，可以以来自可再生的植物资源(生物质)的D-葡萄糖作为原料，由细菌合成六元碳环化合物2-脱氧-青蟹肌糖(DOI)。另外，可以通过处理培养液，回收精制的DOI。 
附图说明
[图1]表示由D-葡萄糖生成DOI的反应路线及DOI合成酶催化的反应。 
[图2A]表示pLEX-btrC的结构。 
[图2B]表示pGAP-btrC的结构。 
[图2C]表示pGAD-btrC的结构。 
[图2D]表示pGAP-btrC/pGAD-btrC的结构。 
[图3A]表示将含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△pgi株在2×YT培养基、或米糠培养基中培养不同的时间时，菌体萃取物的SDS-PAGE图案。 
[图3B]表示将含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的大肠杆菌GI724△pgi△zwf△pgm株在2×YT培养基中培养不同的时间时，菌体萃取物的SDS-PAGE图案。 
[图4A]为含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△pgi株的培养(2×YT3L、30℃、pH7.5、5％D-葡萄糖、培养24小时)上清液的肟化反应物的HPLC图。 
[图4B]为含有pLEX-btrC的大肠杆菌GYI724△rmf株的培养(2×YT、10mL、30℃、pH7，3％D-葡萄糖、培养48小时)上清液的肟化反应物的HPLC图(左图培养0小时)。 
[图5]表示伴随含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△pgi株的培养(2×YT+2％葡萄糖(◆)，或，2×YT+5％D-葡萄糖(■)、3L、30℃、pH7.5)，(A)培养基的浊度、(B)D-葡萄糖浓度、及(C)DOI生产量的时间曲线(横轴为添加葡萄糖后的经过时间)。 
[图6]表示伴随含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△pgi△zwf株的培养(2×YT+3％甘露醇+5％D-葡萄糖、3L、30℃、pH7.5)，(A)培养基的浊度、(B)D-葡萄糖浓度、及(C)DOI生产量的时间曲线(横轴为添加葡萄糖后的经过时间)。 
[图7]表示伴随含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△pgi△zwf△pgm株的培养(2×YT+5％D-葡萄糖+0.5％甘露醇、3L、25℃、pH7)，(左)菌体浊度、(中)培养基中的D-葡萄糖浓度、(右)DOI生产量的时间曲线(横轴为添加D-葡萄糖后的经过时间)。 
[图8]表示伴随含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△pgi△zwf△pgm株(◆)和含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的大肠杆菌GI724 △pgi△zwf△pgm株(■)的培养(2×YT+5％D-葡萄糖+0.5％甘露醇、3L、25℃、pH6-7)，(左)菌体浊度、(中)培养基中的D-葡萄糖浓度、(右)DOI生产量的时间曲线(横轴为添加D-葡萄糖后的经过时间)。 
[图9]表示伴随含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724野生型株(◆)和含有pLEX-btrC的大肠杆菌GI724△rmf株(■)的培养(2×YT+3％D-葡萄糖、10mL、30℃、pH7)，(左)菌体浊度、(中)培养基中的D-葡萄糖浓度、(右)DOI生产量的时间曲线(横轴为添加D-葡萄糖后的经过时间)。 
[图10]为对按照实施例8的方法将培养液流入离子交换树脂所得的馏分的pH、传导度、DOI浓度进行绘制所得的图。 
[图11]按照实施例8的方法精制所得的DOI的13C-NMR光谱。 
[图12]为对按照实施例9的方法将培养液流入离子交换树脂所得的馏分的pH、传导度、DOI浓度进行绘制所得的图。 
[图13]按照实施例9的方法精制所得的DOI的13C-NMR光谱。 
[图14]表示本发明2-脱氧-青蟹肌糖精制方法的第二方案的原理的简图。 
[图15]按照实施例10的方法精制所得的DOI的1H-NMR光谱。 
[图16]按照实施例11的方法精制所得的DOI的1H-NMR光谱。 
[图17]按照实施例12的方法精制所得的DOI的1H-NMR光谱。 
具体实施方式
考虑DOI合成酶的特性，将该酶导入其他微生物中，由此能够以来自大量存在的生物质的D-葡萄糖为原料，高效率地用较短工序生产有用资源DOI。 
因此，本发明人等为了开发出以大肠杆菌为宿主细胞通过发酵法用简便便宜的方法生产DOI的方法作为DOI的新型合成方法，进行了潜心研究。从而完成本发明。 
另外，为采用工业方法精制DOI的系统时，作为优选方法，例如 可以举出：原理为从柱上部流入培养液，从下部流出精制的DOI的方法、及使DOI或其衍生物结晶化进行分离的方法、及将上述方法组合的方法。基于上述观点，通过研究吸附DOI之外的物质且DOI不被吸附最先流出之类的柱基材，并且研究在结晶化·分离后能够高效地获取DOI的DOI衍生物，从而完成本发明。 
以下，说明本发明的优选实施方案。 
<本发明的基因表达盒> 
本发明的基因表达盒的特征在于，由参与2-脱氧-青蟹肌糖合成的基因构成。即，本发明的基因表达盒只要由参与2-脱氧-青蟹肌糖合成的基因、和能使此基因表达的例如载体等的基因构成即可，没有特殊的限制。 
(参与2-脱氧-青蟹肌糖合成的基因) 
在本发明的基因表达盒中，作为参与2-脱氧-青蟹肌糖合成的基因可以为编码能够合成2-脱氧-青蟹肌糖的公知的蛋白质的基因。作为其例子，可以举出btrC基因，该btrC基因编码由D-葡萄糖合成DOI的、来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的DOI合成酶的42kDa亚基(参见专利文献1、非专利文献1及Genbank AB066276等)。当然，只要为编码具有DOI合成酶活性的酶的基因即可，也可以利用来自环状芽孢杆菌之外的生物的基因。另外，上述基因的碱基序列只要是合成具有本发明DOI合成酶活性的酶的基因即可，在其基因的碱基序列中可以产生缺失、取代、插入等变异。 
(本发明的基因表达盒的构建) 
为了构建本发明的基因表达盒，可以使用在下述宿主细胞内能够使上述参与2-脱氧-青蟹肌糖合成的基因表达的基因。作为基因表达盒的基因构建，可以举出启动子、参与转录活化的序列、RBS(核糖体结合部位)、终止子等。例如，在以大肠杆菌为宿主细胞的大量表达蛋白质的体系中，该基因的5′上游可以连接启动子、参与转录活化的序列、RBS(核糖体结合部位)等DNA序列，该基因的3′下游可以连接终止子等DNA序列。上述DNA序列只要是在大肠杆菌中发挥作 用的序列即可，可以为任意序列。启动子有进行结构表达的启动子或进行诱导表达的启动子，可以使用任-种启动子，优选可以控制表达的启动子。另外，在以大肠杆菌为宿主的基因表达中，通常使用以IPTG(异丙基-硫代-吡喃半乳糖苷，isopropyl-thio-galactopyranoside)为首的成本较高的诱导物。 
本发明中，优选使用不利用IPTG之类昂贵诱导物即可实现目的基因高度表达的表达体系。作为用于实现此目的的宿主·载体体系，例如可以利用PL表达体系(Invitogen)、使用GAP启动子或GAD启动子的表达体系等。 
在PL表达体系中，嵌入载体(pLEX，氨苄青霉素耐性标记物)上的基因的表达，受到来自λ噬菌体的引起构成上强表达的启动子PL启动子的控制。另外，PL表达体系利用培养基中色氨酸浓度进行表达控制，在色氨酸浓度高的培养基中诱导表达。 
另一方面，在单独或同时使用gapA(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶A的基因)启动子或gadA(编码谷氨酸脱羧酶A的基因)启动子的表达体系中，嵌入载体(来自pUC，氨苄青霉素耐性标记物)上的基因的表达，可以在营养增殖期或稳定期引起结构上的强表达。使用上述gapA启动子或gadA启动子等的表达体系不需要特殊的试剂或操作，在通常的培养时诱导表达。 
另-方面，PL表达体系中，通常用于大肠杆菌培养的完全培养基中为了诱导启动子活性存在充分量的色氨酸，不需要为了诱导表达再另外加入色氨酸。另外，使用gapA启动子或gadA启动子的表达体系也同样不需要为了诱导表达而加入诱导物。即，不需要使用昂贵的诱导物，就可以高度表达目的基因。 
<本发明的转化体> 
本发明的转化体的特征为，向宿主细胞中导入上述基因表达盒而形成。以下，说明本发明的宿主细胞。 
(宿主细胞) 
作为本发明的转化体中可以使用的宿主细胞，没有特殊的限制， 可以使用保藏在菌株保藏单位(例如IFO、ATCC等)中的菌株。作为上述例子，例如可以举出大肠杆菌。另外，作为大肠杆菌之外的宿主细胞，可以使用GILSP(Good Industrial Large-Scale Practice(优良工业规范))基因重组微生物表中记载的宿主细胞(平成18年3月公告表中记载的细胞，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)HPD31、短芽孢杆菌HPD31-M3、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DN2461、地衣芽孢杆菌DN2717、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K2A1、来自枯草芽孢杆菌M168的菌株、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、来自大肠杆菌(Escherichia coli)K12的菌株、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))。 
(本发明的基因破坏株) 
在本发明的转化体中，考虑到2-脱氧-青蟹肌糖的合成，上述宿主细胞可以使用各种破坏染色体/质粒基因的菌株。本发明的优选方案为，将编码宿主细胞载有的、参与葡萄糖-6-磷酸代谢的酶即磷酸葡糖异构酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶及磷酸葡糖变位酶的基因(分别为pgi基因、zwf基因及pgm基因)分别单独地破坏、或同时破坏两个(pgi基因和zwf基因及pgi基因和pgm基因)，或同时破坏3个。并且，可以单独地破坏编码参与控制稳定期中蛋白质合成的RMF蛋白质的基因(rmf基因)，或者将编码参与上述葡萄糖-6-磷酸代谢的酶的基因被破坏的各种基因破坏株的rmf基因破坏。由此抑制菌引起的作为用于DOI生产的直接基质的葡萄糖-6-磷酸的分解代谢，通过稳定期中的蛋白质合成，使得DOI生产能力显著提高。 
[参与葡萄糖-6-磷酸分解的基因的破坏株] 
为了以尽可能高的收率合成DOI，一般认为有必要尽可能地抑制由菌体导致的D-葡萄糖的异化代谢。在大肠杆菌中，作为编码与D-葡萄糖异化代谢相关的酶的基因，有以下三种基因，即，编码与在糖酵解体系中从葡萄糖-6-磷酸变为果糖-6-磷酸相关的磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase)的(pgi)基因，和编码参与磷 酸戊糖途径中从葡萄糖-6-磷酸向磷酸葡萄糖酸内酯的转化的酶即葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(Gluxose-6-phosphate dehydrogenase)的zwf基因，编码参与从葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸的转化的酶即磷酸葡糖变位酶(phosphoglucomutase)的pgm基因。通过破坏上述基因，能够抑制作为DOI合成酶基质的葡萄糖-6-磷酸伴随菌体增殖的异化分解。 
[参与稳定期中的蛋白质合成的基因的破坏株] 
为了解除对稳定期中的BtrC蛋白质合成的抑制，必须抑制参与该过程的RMF蛋白质的产生。因此，认为通过破坏编码RMF蛋白质的rmf基因，在稳定期之后也可以合成BtrC蛋白质，进而继续DOI合成。 
(本发明的基因破坏株的制作) 
在本发明中，作为制作破坏宿主细胞特定基因的基因破坏株的方法，可以使用本技术领域公知的方法。例如，可以举出诱发突变的方法(通过自然育种的方法、添加变异剂、紫外线照射、放射线照射等)、采用随机突变的方法(采用插入序列(IS)、易位子(Tn)等的方法)、部位特异性基因破坏法(采用单、双交换方法的方法)等。其中，从筛选所期望的基因破坏株的方面来看，优选可在破坏对象的基因中插入含有显示耐药性的基因的片段的部位特异基因破坏法。需要说明的是，如下所述，本发明转化体中使用的实施了基因破坏的宿主细胞，可以使用Gene Bridges社的Quick and Easy BAC Modification Kit制作，但并不限定于此。 
(本发明的转化体的制作方法) 
本发明的转化体可以将上述基因表达盒导入上述宿主细胞中进行制作。作为此导入方法，可以举出感受态法(competence method)或利用受体介导的胞吞作用的方法等。 
<本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法> 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法的特征在于，使上述转化体和碳源在适于转化体成长等的介质中接触。 
作为碳源，可以使用D-葡萄糖或D-葡糖胺、D-半乳糖胺等含 氮单糖类，上述单糖类构成的二糖以上的糖类或寡糖、或来自碳水化合物(淀粉、米糠、废糖蜜等)多糖类的单糖类。 
作为进行本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法的介质，只要是能够使宿主细胞增殖/成长等的公知的培养基即可，可以为固态、液体等，介质形态没有限定。作为上述例子，可以举出琼脂培养基、RMG培养基、2×YT培养基、LB培养基、M9基础培养基或SOB培养基等。上述介质中有碳源、氮源、无机盐类、其他有机营养源。此碳源，除上述之外，还可以为甘露醇等表1所示的物质等。作为该氮源，例如可以举出氯化铵、酪蛋白氨基酸、蛋白胨、酵母提取物。作为无机盐类，例如可以举出磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钠等。如上所述，作为宿主·载体体系使用GAP-GAD表达体系或PL表达体系(Invitrogen)时，可以不用昂贵的诱导物。 
另一方面，为了适应宿主的生长等，介质还可以含有适当的添加剂。为了使导入上述基因表达盒中的参与2-脱氧-青蟹肌糖的合成的基因表达，介质中还可以含有例如IPTG或色氨酸等使启动子活性提高的化合物。特别是，通过启动子进行的基因表达为诱导型时，可以适时添加诱导物。 
在本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法中，使上述转化体和碳源接触的温度、时间、氛围等，只要是适于转化体成长的环境即可，没有特殊的限制。例如，其温度较优选为20C至37℃。另外，时间也没有特殊限制，可以大致为1天至7天。 
例如，本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法，首先，使作为碳源的大肠杆菌能够同化的物质(例如，D-葡萄糖等)在培养基中与上述转化体接触。之后，从所得培养上清液中回收DOI。如上所述，通过使用转化体的本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法，可以工业上获得DOI。 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法由于具有上述构成，所以能够通过己糖激酶(hexokinase)和DOI合成酶以高收率由D-葡萄糖合成DOI。另外，通过制作、培养上述含有质粒pGAP-btrC、pGAD -btrC、pGAP-btrC/pGAD-btrC或pLEX-btrC的GI724△rmf转化株、GI724△pgi△rmf转化株、GI724△pgi转化株、GI724△pgi△zwf转化株或GI724△pgi△zwf△pgm转化株等的方法，如图1所示，从D-葡萄糖经过葡萄糖-6-磷酸，再经过DOI合成酶催化的5步反应，可生成DOI。 
在本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法中，如上所述，使转化体和碳源接触，可以得到具有2-脱氧-青蟹肌糖的组合物(例如，含有2-脱氧-青蟹肌糖的培养基、宿主细胞等)。例如，以含有2-脱氧-青蟹肌糖的培养基为2-脱氧-青蟹肌糖的原料时，只需从培养上清液中回收DOI即可。在本发明中，作为从培养液中回收DOI的方法，考虑到2-脱氧-青蟹肌糖的物理/化学性质或培养基的组成等，只需采用公知的萃取方法回收2-脱氧-青蟹肌糖即可。例如，可以使用下述方法。即，首先，在培养结束后，用离心机或过滤装置等从培养液中除去菌体，得到培养上清液。之后，再过滤处理此培养上清液，除去菌体等固态物，将此滤液添加到离子交换树脂中，用蒸馏水洗脱。边测定折射率、pH、传导率，边分离不含杂质的馏分，去除此水溶液的溶剂，可以回收DOI。例如可以采用高效液相色谱法或核磁共振法等对所得DOI进行分析。 
<本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的第一方案> 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于包括如下工序，即，使上述转化体和碳源接触，得到具有2-脱氧-青蟹肌糖的组合物的工序，和用具有氢离子型强酸性阳离子交换树脂和有机酸离子型碱性阴离子交换树脂的混合柱或双柱处理所述组合物的工序。在本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法中，使转化体和碳源接触的步骤，以上述本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法为基准进行。通过此步骤，可以得到含有2-脱氧-青蟹肌糖的组合物。此组合物由上述介质构成，以下说明使用培养基作为介质的情况。 
在含有碳源的培养基中培养转化体，在该培养结束后的培养液中，除了作为残留碳源的葡萄糖之外，还含有培养基的各种成分。作 为上述各种成分可以举出各种氨基酸或肽类、及各种金属离子类等。为了获得DOI，必须除去上述各成分，在本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法中提供了解决上述问题的方法。 
作为培养基中含有的应该除去的杂质，如上所述，有作为残留碳源的D-葡萄糖、各种氨基酸或肽类、及各种金属离子类。其中通过研究培养条件，可知能够继续培养至D-葡萄糖完全消耗。如上所述得到的培养基中，作为残留的杂质，有各种氨基酸或肽类、及各种金属离子类。在氨基酸类中，有赖氨酸或组氨酸、色氨酸之类具有多个氨基的碱性氨基酸，也有谷氨酸或天冬氨酸之类具有多个羧基的酸性氨基酸。另外，金属离子当然为阳离子，同时培养基中也存在作为其相反离子的氯离子或硫酸根离子等。所以，只需研究出一种吸附所有上述杂质，并且不吸附DOI的基材即可。 
本发明人等基于上述构思，对基材进行研究且探讨了洗脱条件，结果发现，使用常用的离子交换树脂，例如钠离子型或氢离子型强酸性阳离子交换树脂及氯离子型或氢氧根离子型碱性阴离子交换树脂的方法，不能高效率地精制DOI。即，即使使用分别连接的双柱、或将两者混合的混合柱，仍然不能实现上述目的。氨基酸可以与2种离子交换树脂的任一种键合。另外，金属离子与阳离子交换树脂键合，而DOI由于无离子性官能团，所以，具有不与任何离子交换树脂键合的特性。所以，推测氨基酸类及金属盐类与离子交换树脂键合，只有DOI不吸附而溶离出来，但结果并非如此。DOI的回收率为50％以下，并且因离子交换树脂的使用条件不同而变化较大。为了适合大量处理的工业方法，必须进一步提高回收率且使效果稳定。 
本发明人等更广泛地深入研究基材和精制条件，结果发现，通过采用使用有机酸离子作为阴离子交换树脂的相反离子的方法，即，使用有机酸离子型阴离子交换树脂和氢离子型阳离子交换树脂的混合柱或双柱，可以更有效率地精制DOI。作为有机酸，可以举出乙酸、丙酸、草酸等，其中优选使用乙酸。考虑到在pH为8以上的碱性区域内DOI极易分解，只有在pH为3～5的弱酸性条件下稳定，优选使 用乙酸作为有机酸。即，如果DOI在酸性和碱性两区域内完全稳定，则可以采用将培养液流入常用的将阴离子交换树脂和阳离子交换树脂填充到各柱内的双柱中的方法，除去上述杂质。另外，如果在两区域中具有与果糖同等的稳定性，则可以用混合柱精制。本发明人等率先发现，即使使用混合柱，DOI在碱性区域中仍发生分解而不稳定，更不必说双柱。 
为了解决此问题，本发明人等对如何选择与所用离子交换树脂键合的相反离子进行了研究，结果发现了使用有机酸离子作为阴离子交换树脂的相反离子的方法。由此，有机酸残留在溶离液中，也可混入到DOI的溶离成分中，但其能够有效地将溶离液的pH保持在4左右。在有机酸中，乙酸具有可以通过浓缩除去的优点。 
由此可知，可以通过使培养液通过将氢离子型阳离子交换树脂和有机酸离子型阴离子交换树脂混合而制成的离子交换柱，精制DOI，从而完成本发明。该方法是能适用于工业大量生产的方法。 
使用混合填充式或双填充式离子交换树脂柱的精制方法能够吸附除去残留在葡萄糖完全消耗的培养液中的来自原料的带电性杂质、各种氨基酸或肽类、及各种金属离子类。所以，可以通过洗脱未吸附的中性物质DOI进行精制。但是，根据培养条件不同，此DOI中可能混入微量中性物质，进一步研究将从离子交换树脂柱中洗脱的DOI更高度精制的方法。根据NMR等的测定，可以推断DOI以酮型和水合物型混合的结构存在，DOI难于结晶化。目前为止，DOI和其衍生物的结晶化均未见报道。以下，说明进一步高度精制DOI的方法。 
<本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的第二方案> 
本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于包含以下工序，即，使上述2-脱氧-青蟹肌糖和三烷氧基甲烷反应，得到2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮的工序，和在酸存在下水解所述2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮的工序。作为该方案中可以使用的2-脱氧-青蟹肌糖，除含有2-脱氧-青蟹肌糖的上述组合物之外，还可以举出第一方案得到的2-脱氧-青蟹肌糖等。以下，说明该第二方案。 
本发明人等基于将洗脱的DOI衍生转化为结晶性物质进行结晶化，分离·精制后，高效地恢复为DOI的原理，探讨适用此原理的物质及精制方法。图14给出该原理的概述。图14为表示本发明2-脱氧-青蟹肌糖精制方法的第二方案的原理的简图。 
为了满足上述要件，转化DOI的反应条件及恢复的反应条件的必须要件是能够在DOI不发生分解的酸性条件下实施、及衍生改变的物质易于结晶化且能恢复成DOI、并且上述操作能够以工业规模实施。研究了符合上述要件的各种方法。其结果发现，在稳定的酸性条件下使DOI与三烷氧基甲烷反应，转化为2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮(DOI-dak)进行结晶化·精制的方法。 
在此三烷氧基甲烷((RO)3CH)中，R只要为碳原子数为1～4的链状烷烃类即可，没有特殊的限制，例如可以举出甲烷、乙烷、丙烷、丁烷等。本发明中，作为该烷氧基甲烷，从容易除去下述水解工序中生成的醇的方面来看，最优选三甲氧基甲烷。需要说明的是，使用三甲氧基甲烷时，可以得到脱氧-青蟹肌糖二甲基缩酮(DOI-dmk)。 
2-脱氧-青蟹肌糖烷基缩酮的结晶化可以在将2-脱氧-青蟹肌糖烷基缩酮溶解于适当的溶剂(例如甲醇、乙醇、水等)后，利用使液相的亲水性降低的介质(例如氯仿、己烷、醚等)进行结晶化。如上所述，可以得到2-脱氧-青蟹肌糖烷基缩酮的结晶。 
如上所述得到的2-脱氧-青蟹肌糖烷基缩酮在酸存在下水解，变为2-脱氧-青蟹肌糖。此水解反应可以在甲苯磺酸、盐酸、硫酸等适当的介质存在下进行。水解后可以得到2-脱氧-青蟹肌糖。 
由此可知，本发明的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法是能够充分地进行工业大量生产的方法。 
实施例 
以下，通过实施例具体地说明本发明。但本发明的范围并不限定于这些实施例。 
(实施例1) 
<<DOI合成酶基因>> 
作为糖环化酶基因，可以使用来自环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的、编码2-脱氧-青蟹肌糖(DOI)合成酶的42kDa亚基的btrC基因(参见专利文献1、Genbank AB066276、非专利文献2等)。 
(实施例2) 
<<重组质粒及重组株的构建>> 
<btrC基因及pLEX-btrC> 
以含有btrC基因全长的质粒pDS4(非专利文献3)作为模板，使用序列号1所示引物1和序列号2所示引物2，btrC基因的PCR扩增使用KOD聚合酶(TOYOBO)，PCR的反应条件为以94℃×30秒、52℃×30秒、68℃×1分为1次循环，进行30次循环。将如上所述地进行PCR扩增得到的DNA片断用NdeI和XbaI进行消化，通过将其插入载体pLEX(Invitrogen)的多克隆位点NdeI-XbaI部位，构建pLEX-btrC(图2A)。 
<pGAP-btrC/p-GAD-btrC> 
gapA启动子基因以大肠杆菌的染色体DNA为模板，使用序列号17所示引物和序列号18所示引物，通过PCR扩增进行合成。该gapA启动子基因的PCR扩增中，使用KOD聚合酶，在以下反应条件下进行，得到gapA启动子片断。 
将94℃×30秒 
50℃×30秒 
68℃×1分钟作为1次循环，进行30次循环 
gadA启动子基因，以大肠杆菌的染色体DNA为模板，使用序列号19所示引物和序列号20所示引物，通过PCR扩增进行合成。该gadA启动子基因的PCR扩增使用KOD聚合酶，在以下反应条件下进行，得到gadA启动子片断。 
将94℃×30秒 
52℃×30秒 
68℃×1分钟作为1次循环，进行30次循环 
aspA终止子基因，  以含有aspA终止子基因的质粒pLEX(Invitrogen)作为模板，使用序列号21所示引物和序列号22所示引物，通过PCR扩增进行合成。该aspA终止子基因的PCR扩增使用KOD聚合酶(TOYOBO)，在以下反应条件下进行，得到aspA终止子片断。 
将94℃×30秒 
55℃×30秒 
68℃×1分钟作为1次循环，进行30次循环 
在16℃下，使用2×Ligation mix(TAKARA)使PCR扩增得到的gadA启动子片断和上述btrC片断反应30分钟。将由此所得的连接(Ligation)产物作为模板，使用序列号2所示引物和序列号5所示引物，使用KOD聚合酶，在以下条件下进行PCR扩增，得到2个片断合为1个形成的片断gadA-btrC片断。 
将94℃×30秒 
52℃×30秒 
68℃×1分钟作为1次循环，进行30次循环 
将此片断用XbaI消化所得的片断插入载体pLEX(Invitrogen)的多克隆位点的XbaI部位。 
然后，在16℃下，使用2×Ligation mix使上述扩增得到的gapA启动子片断和btrC片断和aspA终止子片断反应30分钟。将由此所得的连接(Ligation)产物作为模板，使用序列号3所示的引物和序列号8所示的引物，使用KOD聚合酶，在以下条件下进行PCR扩增，得到3个片断合为1个形成的片断gapA启动子-btrC-aspA终止子片断。 
将94℃×30秒 
50℃×30秒 
68℃×1分钟作为1次循环，进行30次循环 
将此片断用BamHI消化所得的片断插入载体pLEX(Invitrogen) 的多克隆位点的BamHI部位，所述载体中插入了gadA-btrC，由此构建pGAP-btrC/pGAD-btrC(图5)。 
(实施例3) 
《宿主细胞的制备》 
使用Gene Bridges社的Quick and Easy BAC Modification Kit，根据其中所附说明书记载的方法进行基因破坏。用于制作单独破坏pgi基因所用的盒的PCR引物组的序列如序列号3和序列号4所示。在用于单独破坏zwf基因所用的盒的扩增中使用的PCR引物组的序列如序列号5和序列号6所示。用于制作单独破坏pgm基因所用的盒的PCR引物组的序列如序列号7、序列号8、序列号9及序列号10所示。为了得到pgi基因和zwf基因的双重破坏株，用于扩增破坏zwf基因单独破坏株中的pgi基因所用的盒的PCR引物组的序列如序列号11和序列号12所示。为了得到pgi基因和pgm基因的双重破坏株，用于扩增破坏pgi基因单独破坏株中的pgm基因所用的盒的PCR引物组的序列如序列号7、序列号8、序列号9及序列号10所示。进而，为了得到pgi基因和zwf基因和pgm基因的三重破坏株，用于扩增破坏pgi基因和pgm基因的双重破坏株中的zwf基因所用的盒的PCR引物组的序列如序列号5和序列号6所示。另外，破坏rmf基因的盒所用的引物如序列号13、序列号14、序列号15及序列号16所示。 
将载体、p SC 101-BAD-gbaA-tetra导入宿主细胞大肠杆菌株(GI724)中，所述载体添加在试剂盒中，编码在大肠杆菌内促进相同重组的酶群。在添加3μg/mL四环素的LB培养基中将该株进行一夜前培养。将前培养菌体以1％浓度植菌在添加了3μg/mL的LB培养基中，在30℃下培养至O.D.＝0.2。在该时间点下添加阿拉伯糖使终浓度为0.2％，进而在37℃下培养1小时，由此诱导表达参与促进相同重组的酶群。进而分别转化基因破坏用盒，诱导靶基因的基因破坏。通过在含有氯霉素、新霉素(卡那霉素)或链霉素或其中2个或3个的、37℃的LB培养基中选择转化体，得到目的基因破坏株(pgi基因破坏株 (△pgi株)、zwf基因破坏株(△zwf株)、pgm基因破坏株(△pgm株)、pgi/zwf双重基因破坏株(△pgi△zwf株)、pgi/pgm双重基因破坏株(△pgi△pgm株)及pgi/zwf/pgm三重基因破坏株(△pgi△zwf△pgm株))。对于rmf基因破坏株(△rmf株)，使用与上述相同的方法，得到上述各种破坏株的rmf破坏株。由此所得的野生型株及各基因破坏株在各种单一碳源中的生长水平如表1所示。 
△pgi株、△zwf株及△pgm株可以使用D-葡萄糖作为碳源，与野生型株相比，使用D-葡萄糖的生长速度也显著减缓，认为能够抑制菌体对D-葡萄糖的消耗。另外，由于△pgi△zwf株、△pgi△pgm株及△pgi△zwf△pgm株以D-葡萄糖作为单一碳源生长非常困难，所以认为葡萄糖-6-磷酸的分解几乎完全被抑制。由此可知，能够期待通过使用上述的破坏株，DOI生产量及DOI转化效率与野生型株相比得到提高。另外，各双重基因破坏株及三重基因破坏株通过辅助地加入甘露醇或葡糖酸盐等非发酵性碳源，能够使生长得到改善(表1)。另外，rmf基因破坏株中的碳源，具有与破坏了葡萄糖-6-磷酸代谢酶基因的各种破坏株相同的生长水平。 
[表1] 
碳源 野生型   △pgi   △zwf   △pgm   △pgi△zwf   △pgi△pgm  △pgi△zwf△pgm
D-葡萄糖 ++   +   ++   ++   -   -  -
果糖 ++   ++   ++   ++   +   +  +
甘油 +/-   +   ++   ++   +   +  +
甘露醇 ++   +   ++   ++   ++   ++  ++
葡糖酸盐 -   ++   ++   ++   ++   ++  ++
(表中，“++”表示生长非常好 
“+”表示生长良好 
“+/-”表示少量生长 
“-”表示几乎不生长) 
(实施例4) 
<<转化体>> 
根据Gene Bridges社试剂盒附带说明书中记载的方案，用上述所得的pLEX-btrC转化宿主大肠杆菌株(GI724)，通过在含有氨苄青霉素的培养基中进行选择，得到GI724/pLEX-btrC株。另外，与上 述相同地，将pGAP-btrC/pGAD-btrC转化到宿主大肠杆菌株(GI724)，通过在含有氨苄青霉素的培养基中进行选择，得到GI724/pGAP-btrC/pGAD-btrC株。进而，也可以对GI724△rmf、GI724△pgi、GI724△zwf、GI724△pgm、GI724△pgi△rmf、GI724△pgi△zwf、GI724△pgi△pgm及GI724△pgi△zwf△pgm的各基因破坏株，相同地转化pGAP-btrC/pGAD-btrC，分别得到GI724△rmf/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△pgi/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△zwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△pgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△pgi△rmf/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△pgi△zwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△pgi△pgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC株、GI724△pgi△zwf△pgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC株。 
(实施例5) 
<<DOI合成酶表达的确认>> 
<GI724△pgi/pLEX-btrC株> 
在30℃下于诱导培养基(6％磷酸氢二钠、3％磷酸二氢钾、0.5％氯化钠、1％氯化铵、0.2％酪蛋白氨基酸、0.5％D-葡萄糖、1mM氯化镁)中培养GI724△pgi/pLEX-btrC株至O.D600nm＝0.7后，移至2×YT培养基(大肠杆菌用完全培养基、1.6％色氨酸、1％酵母提取物、0.5％氯化钠)中，在37℃下再培养6小时后，回收菌体，通过12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确认BtrC蛋白质的表达。其结果如图3A所示。可以确认通过在2×YT培养基中培养6小时，BtrC大量表达。需要说明的是，图3A的各条带如下所示。 
条带M： 
分子量标记物(商品名：Precision Plus Protein Standard(BIO-RAD社制、目录序号：161-0374)、以下相同) 
条带1： 
将含有pLEX-btrC的GI724株在基础营养培养基(M9基础培养基：0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵)中培养6小时所得的菌体的萃取物(用1×SDS Loding Buffer：50mMTris-HCl(pH6.8)；2％SDS；0.1％溴酚蓝；10％甘油；100mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol)溶液萃取、以下相同)
条带2： 
将含有pLEX-btrC的GI724株在添加色氨酸的诱导培养基中培养6小时所得的菌体的萃取物 
条带3： 
将含有pLEX-btrC的GI724株在未添加色氨酸的诱导培养基中培养6小时所得到菌体的萃取物 
条带4： 
在米糠培养基(组成：20％米糠酶处理液)中培养2小时所得的菌体的萃取物 
条带5： 
在米糠培养基(组成：20％米糠酶处理液)中培养6小时所得的菌体的萃取物 
使用2×YT培养基时，即使不添加色氨酸，BtrC也可高度表达。另外，使用米糠培养基培养的菌体中，BtrC也可高度表达。上述结果表明，使用上述表达体系，不使用昂贵的诱导物，也可以高度表达DOI合成酶基因。 
<GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC株> 
在前培养培养基(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中，在30℃下将GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC株培养一晚。以该前培养液作为主培养培养基，在2×YT培养基(大肠杆菌用完全培养基；1.6％胰胨(triptone)、1％酵母提取物、0.5％氯化钠)中按1％进行植菌，再于30℃下培养直至O.D.600nm＝0.7后，回收菌体，用12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确认BtrC蛋白质的表达。其结果如图3B所示。需要说明的是，图3B的各条带如下所示。 
条带1：分子量标记物 
条带2：主培养0小时后收集的菌体萃取物 
条带3：主培养12小时后收集的菌体萃取物 
条带4：主培养36小时后收集的菌体萃取物 
条带5：主培养72小时后收集的菌体萃取物 
根据图3B可以确认，通过在2×YT培养基中培养6小时，BtrC大量表达。由此结果可知，通过使用此表达体系，不添加昂贵的诱导物，DOI合成酶基因也能高度表达。 
(实施例6) 
<<DOI的合成>> 
<使用含有pLEX-btrC的GI724△pgi株的DOI合成> 
将GI724△pgi/pLEX-btrC株接种至装入300mL三角烧瓶中的35mL前培养液(RMG培养基、0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中，培养15小时。然后，在装入3升2×YT培养基的10升培养槽中以1％的浓度植入菌体。将其在培养温度30℃、搅拌速度300rpm、空气10L/分钟、pH7.7的条件下进行培养，600nm的O.D.为0.7时以2％或5％浓度添加D-葡萄糖，再培养48小时。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液1。 
<使用含有pLEX-btrC的GI724△pgi△zwf株的DOI合成> 
在35mL含有1％甘露醇的RMG培养基(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中植入GI724△pgi△zwf/pLEX-btrC株，进行1晚的前培养。然后，在3升含有3％甘露醇的2×YT培养基(10升培养槽内)中以1％的浓度植入菌体，在30℃、搅拌速度300rpm、空气10L/分钟、pH7.7的条件下进行培养，600nm的O.D.为0.7时，以3％的浓度添加葡萄糖，再继续培养。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液2。 
<使用含有pLEX-btrC的GI724△pgi△zwf△pgm株的DOI合成> 
向300mL三角烧瓶中的50mL前培养液(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中接种含有pLEX-btrC的GI724△pgi△zwf△pgm株，培养15小时。将该前培养液以1％植菌到加入了3L 2×YT培养基的10L培养槽(B.E.MARUBISHI株式会社MDL-6C型)中。将其在培养温度25℃、搅拌速度300rpm、流入空气10L/分钟、pH7.0的条件下进行培养，OD600nm＝0.7时添加D-葡萄糖使其浓度为5％，再培养72小时。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液3。 
<使用含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的GI724△pgi△zwf△pgm株的DOI合成> 
向300mL三角烧瓶中的50mL的前培养液(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中接种含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的GI724△pgi△zwf△pgm株，培养15小时。将该前培养液以1％的浓度植菌到加入3L的2×YT培养基的10L培养槽中。将其在培养温度25℃、搅拌速度300rpm、流入空气10L/分钟、pH6.0的条件下进行培养，OD600nm＝0.7时添加D-葡萄糖使浓度为5％，再培养72小时。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液4。 
<使用含有pLEX-btrC的GI724△rmf株的DOI合成> 
在试验管中向3mL前培养液(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中接种含有pLEX-btrC的GI724△rmf株，培养15小时。将此前培养液以1％的浓度植菌到加入10mL的2×YT培养基的L型试验管中。将其在培养温度30℃、振荡速度160rpm、pH7.0的条件下进行培养，OD600nm＝0.7时，添加D-葡萄糖使其浓度为3％，再培养72小时。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液5。 
(实施例7) 
<<DOI生产量的测定>> 
<DOI的肟化> 
按照以下顺序定量培养上清液中蓄积的DOI。对于培养上清液1及2，在各时间点收集培养液，加入与上清液等量的水、上清液的2倍量的甲醇、及终浓度为1.5mg/mL的O-(4-硝基苄基)羟基胺(NBHA)，将其混合，在60℃下培育1小时，由此诱导DOI的肟化。 
另外，将培养上清液3、4及5混合9倍量的灭菌蒸馏水，再加入与该溶液等量的甲醇后，加入30mg/mL的o-(4-硝基苄基)羟基胺盐酸盐(NBHA)，将其混合，在60℃下培育1小时，由此诱导DOI的肟体。 
<DOI的检测> 
如上所述得到的DOI肟体在Speep Vac System(Thermo社ISS110)中蒸发掉溶剂后，将肟化DOI溶解于适量的甲醇，采用HPLC(高效液相色谱)分析法对其中的一部分进行分析，进行DOI的检测及定量。高效液相色谱为SHIMADZU社LC-10AT、柱使用Phrnomenex社Luna5u C18(柱长150mm、柱内径4.6mm)，溶离液使用20％甲醇。测定262nm下的紫外线吸收。根据标准曲线法定量DOI的O-(4-硝基苄基)肟衍生物的量。需要说明的是，使用Glucose assay procedure kit(Megazyme社制)进行葡萄糖定量。 
如图4A及4B所示，在HPLC分析中确认相当于DOI的肟体的峰。另外，图5至7中给出DOI生产量、培养基的浊度、及D-葡萄糖浓度的时间曲线。 
(参考例1) 
<使用含有pLEX-btrC的GI724△pgi株的DOI合成> 
向装入300mL三角烧瓶的35mL前培养液(RMG培养基：0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中接种GI724△pgi/pLEX-btrC 株，培养15小时。然后，在加入3升的2×YT培养基的10升培养槽中以1％的浓度植入菌体。将其在培养温度30℃、搅拌速度300rpm、空气10L/分钟、pH7.7的条件下培养，600nm的O.D.为0.7时添加D-葡萄糖至浓度为2％或5％，再培养24小时。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液11。 
(参考例2) 
<使用含有pLEX-btrC的GI724△pgi△zwf△pgm株的DOI合成> 
向300mL三角烧瓶中的50mL前培养液(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)中接种含有pLEX-btrC的GI724△pgi△zwf△pgm株，培养15小时。在加入3L 2×YT培养基的10L培养槽(B.E.MARUBISHI株式会社MDL-6C型)中以1％浓度植菌此前培养液。将其在培养温度25℃、搅拌速度300rpm、流入空气10L/分钟、pH7.0的条件下进行培养，OD600nm＝0.7时，添加D-葡萄糖使其浓度为5％，再培养72小时。分别回收D-葡萄糖添加前及D-葡萄糖添加后的培养液，将此培养液离心，除去菌体，分别回收培养上清液12及13。 
(参考例3) 
<使用含有pLEX-btrC的GI724野生型株的DOI合成> 
在具有3mL前培养液(0.6％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.05％氯化钠、0.1％氯化铵、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mM氯化镁)的试验管中接种含有pLEX-btrC的GI724野生型株，培养15小时。将此前培养液以1％的浓度植菌到加入10mL的2×YT培养基的L型试验管中。将其在培养温度30℃、振荡速度160rpm、pH7.0的条件下进行培养，OD600nm＝0.7时添加D-葡萄糖使其浓度为3％，再培养72小时。通过离心从培养规定时间的培养液中除去菌体，回收培养上清液14。 
(参考例4) 
<DOI生产量的测定> 
可以按照下述顺序对如上所述得到的培养上清液11至14中蓄积的DOI进行定量。 
对于培养上清液11，加入与此上清液等量的水、上清液的2倍量的甲醇、及终浓度1.5mg/mL的O-(4-硝基苄基)羟基胺(NBHA)，将其混合，在60℃下培育1小时，由此诱导DOI的肟化。 
针对培养上清液12、13及14，混合相对于上清液为9倍量的灭菌蒸馏水，再加入与此溶液等量的甲醇后，加入30mg/mL的o-(4-硝基苄基)羟基胺盐酸盐(NBHA)混合，在60℃下培育1小时，由此诱导DOI的肟体。 
用Speep Vac System(Thermo社ISS110)使来自上述衍生化的培养上清液11至14的液体蒸发掉溶剂后，将肟化DOI溶解于适量的甲醇，用HPLC(高效液相色谱)分析法对其中的一部分进行分析，进行DOI的检测及定量。高效液相色谱为SHIMADZU社LC-9A、柱使用Phrnomenex社Luna 5u C18(柱长150mm、柱内径4.6mm)，溶离液使用20％甲醇。测定262nm下的紫外线吸收。通过标准曲线定量DOI的O-(4-硝基苄基)肟衍生物的量。 
(实施例8) 
<使用Amberlite IR120和Amberlite IRA410混合柱的方法> 
将氢离子型的Amberlite IR120和乙酸离子型的Amberlite IRA410各200mL混合后，充填到柱(
Figure 2006800107712_0
5cm×25cm)中，将柱调至pH2.96，添加100mL参考例1的培养液(含有1.4g的DOI)后，通过以2mL/分钟的流速流入蒸馏水进行溶离。以每馏分6mL进行收集，每隔1瓶对所得馏分测定pH及传导度。另外，每隔3瓶进行DOI的定量。DOI的定量在衍生成O-(4-硝基苄基)肟后，用HPLC测定面积，之后，根据标准曲线进行计算。此时的结果如图10所示。另外，将馏分分4段收 集，冻结干燥后，测定各段中DOI的纯度及量。结果如表2所示。所得的精制DOI的13C-NMR色谱如图11所示。13C-NMR色谱使用Bruker社的DPX-250NMR装置(13C核在67.5MHz共振)，测定溶解于重水的试样。 
(实施例9) 
<使用Amberlite IR200和Amberlite IRA410的混合柱的方法> 
将氢离子型的Amberlite IR200和乙酸离子型的Amberlite IRA410各200mL混合后，充填到柱(
Figure 2006800107712_1
5cm×25cm)中。向其中加入pH调至2.97的50mL参考例1的培养液(含有562mg的DOI)后，通过以2mL/分钟的流速流入蒸馏水进行溶离。以每馏分6mL进行收集，每隔1瓶对所得馏分测定pH及传导度。另外，每隔3瓶进行DOI的定量。此时的结果如图12所示。另外，将馏分分为4段进行收集，冻结干燥后，测定各段中DOI的纯度及量。结果如表3所示。所得的精制DOI的13C-NMR色谱如图13所示。DOI的定量方法及13C-NMR色谱的测定方法与实施例8相同。 
[表2] 
    重量(mg)     DOI量(mg)   纯度(％)
 Fr.27-47     207     42   20.3
 Fr.48-60     252.4     226.3   89.7
 Fr.61-95     253.9     117.8   46.4
 Fr.96-     24.6     13.2   53.5
 总计     737.9     399.3   54.1
[表3] 
    重量(mg)     DOI量(mg)     纯度(％)
 Fr.26-45     85.7     71.4     83.8
 Fr.46-71     120     114.1     95.1
 Fr.72-95     31.6     25.1     79.5
 Fr.96-     11.9     1.3     10.8
 总计     249.2     211.9     85.0
(实施例10) 
<使用Amberlite200CT和AmberliteIRA96SB的双柱的方法> 
在阳离子交换树脂柱(Amberlite200CT、氢离子型、400mL)中负荷含有DOI的培养液(DOI含量：22.1g/850mL)，用水使其洗脱。将通过洗脱液的TLC分析确认含有DOI的馏分通入阴离子交换树脂柱(AmberliteIRA96SB、乙酸离子型、600mL)，接下来用水使其洗脱。将通过洗脱液的TLC分析确认含有DOI的馏分减压浓缩，得到20.8g图15的1H-NMR所示纯度的DOI。其纯度与通过混合柱进行精制法时程度几乎相同。1H-NMR使用Bruker社的DPX-250NMR装置，测定溶解于重水的试样。 
(实施例11) 
<转化为二甲基缩酮衍生物，进行了结晶化·精制后，变回为2-脱氧-青蟹肌糖的方法> 
将实施例10的精制DOI(17.8g)溶解于甲醇(835mL)中，加入三甲氧基甲烷(310mL)、甲苯磺酸一水合物(2.12g)搅拌3小时后，用碳酸氢钠(30.6g)中和反应液，过滤后进行减压浓缩。将残渣溶解于甲醇中，加入其3倍量的硅胶(C-200、60g)，通过减压浓缩，使DOI吸附在硅胶表面上。将吸附此DOI的硅胶填充到用乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1平衡的硅胶柱中。之后，使用乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1的混合溶剂使DOI洗脱。收集含有DOI的洗脱液，减压浓缩，得到二甲基缩酮衍生物(20.7g)。接下来，在加入25mL甲醇溶解得到的溶液中，边加热边加入100mL氯仿和7.5mL己烷，冷却，分离析出的白色结晶，得到9.1g 2-脱氧-青蟹肌糖二甲基缩酮结晶。在图16所示的1H-NMR中，未检测到杂质的信号。 
将二甲基缩酮体的结晶(995mg)溶解于丙酮(22mL)中，加入甲苯磺酸一水合物(280mg)和蒸馏水(6mL)，搅拌5小时。通过TLC确认原料消失后，减压浓缩。将溶解于水的残渣通过阴离子交换树脂柱(IRA96SB、乙酸离子型、10mL)，浓缩所含馏分，由此可以定量地得到高度精制的DOI(770mg)。图1 7所示的1H-NMR中，未检测到杂质的信号。 
[保藏微生物的说明] 
本发明中使用的保藏微生物的说明如下所示。 
Escherichia coli 
GI724△pgi△zwf△pgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC 
FERM AP-20809 
1.保藏机构名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 
2.保藏日：平成18年2月24日(2006年2月24日) 
3.保藏编号：FERM AP-20809 
Escherichia coli 
GI724△rmf△pgi/pLEX-btrC 
FERM AP-20808 
1.保藏机构名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 
2.保藏日：平成18年2月24日(2006年2月24日) 
3.保藏编号：FERM AP-20808 
产业上的可利用性 
根据本发明，使用来自可再生资源的如淀粉等生物质的原料，代替现有的来自石油的化学物质，通过发酵，可以制造高纯度DOI，该DOI为用于制造各种六元碳环化合物的起始原料。 
以上通过本发明的优选实施方案说明了本发明。虽然此处给出特定的具体例说明本发明，但只要不超出权利要求书所定义的本发明的广泛的宗旨及范围，上述具体例中可以加入各种修改及变更。即，不能理解为本发明限定于具体例的详细说明及附图。 

Claims (8)

1.一种转化体，其特征在于，该转化体通过将含有编码2-脱氧-青蟹肌糖合成酶的基因的基因表达盒导入宿主细胞而形成，所述宿主细胞是基因被破坏的宿主细胞，所述被破坏的基因为选自编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因、编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的zwf基因、编码磷酸葡糖变位酶的pgm基因、及编码负责处于稳定期的蛋白质合成的修饰的核糖体修饰因子蛋白质的rmf基因中的至少一种。
2.如权利要求1所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞是选自大肠杆菌种、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌HPD31、短芽孢杆菌HPD31-M3、地衣芽孢杆菌DN2461、地衣芽孢杆菌DN2717、枯草芽孢杆菌K2A1、来自枯草芽孢杆菌M168的菌株、谷氨酸棒杆菌及嗜热脂肪地芽孢杆菌中的宿主细胞。
3.如权利要求1所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞是来自大肠杆菌K12的菌株。
4.一种2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法，其特征在于，
该方法具有使权利要求1～3所述的转化体和碳源接触的工序，和从所得培养上清液中回收2-脱氧-青蟹肌糖的工序，
所述碳源为选自D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠及废糖蜜以及可以得到D-葡萄糖的生物质中的至少一种碳源。
5.一种2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述精制方法包含以下工序，
使权利要求1～3所述的转化体和碳源接触，得到含有2-脱氧-青蟹肌糖的组合物的工序，所述碳源为选自D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠及废糖蜜以及可以得到D-葡萄糖的生物质中的至少一种碳源；和
用具有氢离子型强酸性阳离子交换树脂和有机酸离子型碱性阴离子交换树脂的混合柱或双柱处理所述组合物的工序。
6.如权利要求5所述的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述有机酸离子型碱性阴离子交换树脂是乙酸离子型阴离子交换树脂。
7.如权利要求5或6所述2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述精制方法还包含以下工序，
使2-脱氧-青蟹肌糖和三烷氧基甲烷反应，得到2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮的工序；和
在酸存在下水解所述2-脱氧-青蟹肌糖二烷基缩酮的工序。
8.如权利要求7所述的2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述三烷氧基甲烷是三甲氧基甲烷。
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