CN101078023B

CN101078023B - 一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法

Info

Publication number: CN101078023B
Application number: CN2007101070798A
Authority: CN
Inventors: 吴力克
Original assignee: Chongqing Baiao Dikewei Ecology Technology Co ltd
Current assignee: Chongqing Like Biotechnology Co ltd
Priority date: 2007-05-18
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2027-05-18
Also published as: CN101078023A

Abstract

本发明公开了一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，包括以下步骤：将蚕蛹、蝇蛆的皮壳通过干法或湿法破碎细粉化处理；将得到的细粉体经来自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液进行共酶解反应，充分脱除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白质；用两步法脱色；收集脱色后物料，洗涤、干燥后制成甲壳素产品；通过米根霉全细胞固定化生物反应器进行循环脱乙酰反应，得到壳聚糖；用产酸细菌进行液体深层发酵壳聚糖获得高度水溶性的甲壳寡糖。本发明有益效果：提高产品质量和生产效率、降低能耗，大幅减少酸、碱、氧化剂和其它有害化学品的使用量以及废液、废渣的排放，并能同时生产出附加值高的副产品，综合利用资源，提高生产效益。

Description

一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法

技术领域

本发明属于生物技术应用以及新材料、化工产品生产技术领域，尤其涉及一种用生物法从蚕蛹、蝇蛆以及其它昆虫的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，具体地说，是应用以多种微生物酶共酶解和固定化全细胞生物反应器生物转化从昆虫皮壳原料中制取甲壳素和/或壳聚糖。

背景技术

甲壳素又名甲壳质，学名几丁质(chitin)，是一种直链天然氨基多糖，也是目前发现的唯一带有正电荷的可食性动物纤维。甲壳素在自然界的储量仅次于纤维素，每年生物圈的生物合成量约有100亿吨，是地球上第二大生物资源。作为结构物质，甲壳素主要分布于真菌、原生生物和无脊椎动物，在高等动物则主要分布于关节、蹄、足等以及肌肉与骨的接合处。长期以来，由于甲壳素不溶于水、稀酸、稀碱和大多数有机溶剂的惰性特点，一直没有受到应有重视。但近几十年来，随着生命科学和生物技术的巨大进步，甲壳素的理化特性、生物活性和功能特点逐渐被人们所认识，特别是甲壳素及其衍生物作为一种新型原料和材料在制药、组织工程、精细化工、材料与纺织工业、食品工业、农业以及环境保护诸多方面的应用价值，正在被快速地展现出来，受到人们的广泛关注，其产业化的深度和广度正在蓬勃推进，而其对人体和环境有益无害的“绿色原料”特性，更是符合时代潮流，得到了人们的青睐，展示了非常美好的市场前景。

虽然甲壳素是一种优良的生物原料，但其作为和蛋白质以及某些无机物紧密结合的生物结构成分，提取并不容易。目前全球范围内用于制取甲壳素、壳聚糖(甲壳素脱乙酰基后的产物，可大大增加溶解度)及其衍生物的主流工艺是化学法，其制备过程中使用大量的酸碱和有害的化学试剂，产生大量的废水废料，严重污染环境特别是水体环境；高频度、长时间的高温处理过程带来了巨大的能源消耗；频繁的洗涤净化程序和稀酸、稀碱的回收处理难度又导致宝贵的清洁淡水被大量消耗浪费；凡此种种，为这一“绿色原料”的可持续开发生产和深一步的产业化应用蒙上了重重的阴影。正因如此，近年来，人们开始将目光转向了生物方法，目前主要是生物发酵的方法，即通过对主要原料丝状真菌的发酵，获得足量的菌丝体，再以菌丝体为原料，采用微生物酶和化学法相结合的方法提取甲壳素和壳聚糖。该方法条件温和，可减少人力、物力和能耗，质量易控，也能大幅度地减轻环境污染，但由于微生物体内甲壳素含量远不及节肢动物(尤其是目前大量使用的甲壳纲和昆虫纲动物)以及真菌发酵时间漫长等原因，生物发酵法生产甲壳素/壳聚糖在产量和效率上还不够理想，其生产成本过高，真正实现工业化生产还要假以时日。

目前制取甲壳素最常用的原料是工业废弃的虾、蟹壳，其化学组成为：40％无机物，主要是CaCO3；30％有机物，主要是蛋白质；甲壳素含量约占20-25％。因此，根据虾、蟹壳化学组成特点采用的提取工艺路线是：净化处理-浓酸脱钙-稀碱脱蛋白-氧化剂脱色(非必需)-浓碱脱乙酰基-壳聚糖。该工艺的缺点已如前述，而且，其原料来源还存在产地和运输成本的限制。另一类主要原料是丝状真菌菌丝体，如发酵工业产生的菌丝体废渣，甲壳素含量可达20-22％。其提取工艺的优点和局限性亦如前述。并且，生物发酵法目前只是获得原料，后续制取甲壳素和壳聚糖，仍主要采用化学法，故仍然存在环境污染问题。

近年来，多种昆虫纲动物皮壳中含有丰富甲壳素的事实，引起人们的极大关注。研究证实，家蚕蛹皮中所含甲壳素高达33％-44％，而干蛆皮所含甲壳素更高达35％-54.8％，而且此类昆虫皮壳中几乎不含钙质等无机物，有利于甲壳素的分离提取，是颇为理想的甲壳素生产原料。然而，尽管蚕蛹和蝇蛆皮壳具有上述优点，但近期的实践表明，用化学法从蚕蛹和蝇蛆制取甲壳素存在困难，主要表现为皮壳中脂肪太多，色素太多，脱乙酰基困难，因而生产出的甲壳素产品质量不高。此外，由于提取工艺中增加了化学脱脂步骤，强化了脱色和脱乙酰基的物理/化学处理力度，产生了更大的废液、废料污染和更多的能耗。

因此，如何改进工艺，使之能够利用昆虫皮壳开发出高质量的甲壳素及相关产品，同时又能有效控制能耗和环境污染，是甲壳素研发和生产人员面临的巨大挑战。

发明内容

本发明的目的在于应用发酵工程和酶工程的技术手段，结合部分物理和化学方法，设计并实施了一套以生物法为主的甲壳素/壳聚糖制取方法，用以从蚕蛹、蝇蛆及其它昆虫皮壳中获得甲壳素和壳聚糖，旨在克服传统工艺的上述弊端，在明显提高产品质量和生产效率的前提下，降低能耗，大幅减少酸、碱、氧化剂和其它有害化学品的使用量以及废液、废渣的排放，消除其对环境的污染和人体健康的威胁，并能够同时生产出附加值高的副产品，综合利用资源，提高生产效益，从而提供一种增效节耗、环境友好、资源节约的绿色制取工艺，达到有效、可持续地促进甲壳素产业发展的目的。

本发明还涉及将提取的甲壳素/壳聚糖，用生物学和/或化学方法进一步加工成特种壳聚糖或壳聚糖衍生物。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，包括以下步骤：将蚕蛹、蝇蛆的皮壳通过干法或湿法破碎细粉化处理；将得到的细粉体经来自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液进行共酶解反应，充分脱除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白质；用两步法脱色，即先以H₂O₂初步脱色，再用富含过氧化氢合成-还原酶系的粗酶液进行酶法脱色并还原H₂O₂；收集脱色后物料，洗涤、干燥后制成甲壳素产品；通过米根霉全细胞固定化生物反应器进行循环脱乙酰反应，得到不同DD值的壳聚糖。还可进一步应用化学方法或者生物方法，将所得的甲壳素或壳聚糖制备成特种壳聚糖或改性壳聚糖。

所述细粉化处理，是指将鲜蚕蛹或鲜蝇蛆，清洗除杂、充分沥水后先行机械破皮处理，用诸如液压式或螺旋式压榨机的压榨法挤出内容物(所述内容物另行处理)，收集皮壳，烘干至水分＜10％，0℃以下预冻6小时，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体；如为干蛹或干蛆，则净化后直接预冻、粉碎处理成细粉体。

所述微生物粗酶液，是指用不同出发菌株诱导驯化而得的高产脂肪酶活的产朊假丝酵母(保藏号CCTCC NO.M207053)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名为产朊假丝酵母ODK-CC₁(Candida utilis ODK-CC₁)；高产蛋白酶活的枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC NO.M207028)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名枯草芽孢杆菌ODK-BK₁(BacillussubtilisODK-BK₁)；高产H₂O₂及其氧化-还原酶系的采绒革盖菌(又名云芝)(保藏号CCTCC NO.M207024)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名云芝ODK-CY₁(Polystictus versicolor ODK-CY₁)，分别经好氧液体深层发酵后，去除菌体而得到的胞外酶粗酶液。

所述共酶解反应，是指将所获细粉体以固∶液＝1∶5的配比量，先用65℃温水浸泡30min，抑制杂菌及无关酶活，再加入与温水容积等量的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液，在40℃恒温下，于反应釜内将皮壳粉混悬液和粗酶液缓慢混合，充分搅拌，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18h，反应终止后以2500r/min离心进行固、液分离，溶于反应液中的蛋白和脂肪及其分解产物另法提取收集。

所述两步法脱色，是指先将酶解反应后的固体物料，加入少量稀碱(10％NaOH)浸泡、煎煮2h，更换碱液后重复，共3次，以彻底脱除少量残余脂肪和蛋白质以及残余酶活，过滤收集滤渣，水洗3遍后，先用5％H₂O₂煮沸1h，快速脱色，再用富含H₂O₂以及H₂O₂氧化-还原酶系的粗酶液进行酶解反应，脱除原料中难解离色素并陆续将H₂O₂转化为无毒无害的CO₂和H₂O，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心(2500r/min)，将沉淀洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。

所述脱乙酰反应，是指将所得甲壳素用40℃温水悬浮、充分混匀后，循环流加于米根霉(保藏号CCTCC NO.M207054)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名米根霉ODK-RM₁(Rhizopus oryzae ODK-RM₁)，全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，根据产品和用途对脱乙酰度的要求，用电位滴定法动态检测反应产物的DD值(脱乙酰度)，直至达到所要求的DD值标准，终止反应，收集反应产物，按1/3容积浓缩后，真空或冷冻干燥，得壳聚糖。

所述制备特种壳聚糖，本发明采用生物法，即用产酸细菌进行液体深层发酵壳聚糖，获得具有高度水溶性的甲壳寡糖。

所述制备改性壳聚糖，本发明采用化学法，即将甲壳素加工为碱性甲壳素胶体溶液后，分别用环氧乙烷、氯乙酸或丙烯腈处理，可分别生成羟乙基甲壳素、羧甲基甲壳素或氰乙基甲壳素。

本发明的方法也适用于其它昆虫皮壳甲壳素的制取，如蝉蜕、蜚蠊、掸子虫等。

本发明的有益效果：本发明利用蛹皮、蛆皮生产甲壳素，有助于治理环境，资源化利用，变废为宝，并带动蚕蛹和蝇蛆的深加工产业；本发明选用蚕蛹和蝇蛆皮壳制取甲壳素，除其含量高以外，还在于蛹皮甲壳素主要为α-型甲壳素，具有优良的稳定性，对于甲壳素的工业化应用非常重要；而蝇蛆壳聚糖在低重金属离子含量、低灰分含量方面明显优于虾、蟹壳壳聚糖，两者均为优良的甲壳素制取原料；本发明采用了以酶法为主的脱除脂肪、蛋白和色素工艺，由于酶反应的高选择性，可以有效地克服昆虫皮壳中的高脂肪、高色素对甲壳素提取造成的困难，明显提高甲壳素的得率和质量；本发明大大减少了酸、碱和有机溶剂在制取工艺中的应用，而代之以温和的微生物酶法作为核心工艺，不仅基本消除了强酸、强碱、有害溶剂废水和废渣排放造成的环境污染，减少了相关设备和试剂成本，而且基本杜绝了强烈化学反应导致的质量问题以及产品中化学溶剂的残留带来的潜在健康威胁；本发明采用全细胞固定化生物反应器循环酶解反应脱乙酰基新工艺，不仅过程简单、没有污染，而且可以准确掌握脱乙酰度，按产品和用途需要生产不同DD值的壳聚糖，有益于产品的质量控制以及种类、用途的多元化；本发明的又一突出优点是大部分的工作单元在常温、中温下进行，大幅减少了热能需要，降低了能耗；此外，化学品用量的减少也相应减少了水的用量和废水排放，节约了用水；本发明的另一个有益效果是能够充分进行资源综合开发，得到一系列附加值高的副产物，提高综合经济效益，包括：

1)通过脂肪酶的解离，可以获得纯度高的蚕蛹油脂，因其杂质少，可进行充分开发利用，如精制蚕蛹油、提取脂肪酸、制备表面活性剂和聚酰胺纤维(尼龙)、制造润滑油和肥皂等。

2)通过蛋白酶的解离，可以获得纯度高的蚕蛹或蝇蛆蛋白，可制备食用或饲用蛋白质、制取蛹酪素、制备蛋白水解物和氨基酸制品等。

3)在用发酵法制备粗酶液时，可获得高生物量的有益微生物菌体，其中云芝(采绒革盖菌)、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母均为极度安全的可食用微生物，可直接用作食用或饲用微生物菌剂或微生态制剂，也可制成相关产品。

附图说明

图1表示蛹壳细粉体共酶解前后脂肪含量和蛋白质含量比较；

图2表示蝇壳细粉体共酶解前后脂肪含量和蛋白质含量比较；

图3表示固定化细胞流程；

图4表示上流式米根霉全细胞固定化生物反应器脱乙酰流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了有效实现本发明的方法，发明人进行了如下工作：

1.确定发酵产朊假丝酵母制取脂肪酶粗酶液工艺

产朊假丝酵母出发菌株分离自酿酒酒糟，由本发明人反复诱导驯化为高产脂肪酶活菌株后，送武汉中国典型培养物保藏中心保藏(保藏号CCTCC NO.M207053)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名为产朊假丝酵母ODK-CC₁(Candida utilisODK-CC₁)。

粗酶液制备过程：产朊假丝酵母接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)5天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，25℃，100r/min恒温振荡培养3天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6LPDA液体培养基的10L不锈钢气升式发酵罐中，25℃，100r/min好氧深层液体培养约5天，测得脂肪酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏，待用于本工艺的共酶解步骤。

2.确定发酵枯草杆菌制取蛋白酶粗酶液工艺

枯草杆菌出发菌株分离自日本产有机小粒纳豆，由本发明人反复诱导驯化为高产蛋白酶活菌株后，保藏编号CCTCC NO.M207028，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名枯草芽孢杆菌ODK-BK₁(Bacillussubtilis ODK-BK₁)。

粗酶液制备过程：枯草杆菌菌株接种于普通固体培养基恢复培养(复壮)2天，转种于装有300ml的去琼脂液体培养基的500ml三角烧瓶中，25℃，100r/min恒温振荡培养3天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体培养基的10L不锈钢气升式发酵罐中，25℃，100r/min好氧深层液体培养约3天，测得脂肪酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏，待用于本工艺的共酶解步骤。

3.确定发酵采绒革盖菌制取过氧化氢合成酶-还原酶粗酶液工艺

采绒革盖菌(云芝)出发菌株购自广东省微生物研究所菌种保藏中心(菌株编号：GIM5.178)，由本发明人反复驯化诱导为H₂O₂氧化-还原酶系高产菌株后，保藏编号CCTCC NO.M207024，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名云芝ODK-CY1(Polystictus versicolor ODK-CY₁)。

粗酶液制备过程：云芝菌株接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)7天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，28℃，150r/min恒温振荡培养5天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的不锈钢气升式发酵罐中，30℃，100r/min好氧深层液体培养约7天，测多酚过氧化物酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏，待用于本工艺的脱色步骤。

4.考察粗酶液共酶解反应的效果

1)粗酶液共酶解去除蛹壳及蝇壳脂肪和蛋白质成分的效果

①单因素分析比较共酶解前后蛹壳和蝇壳细粉体的脂肪含量(索氏抽提法测定)，见表1。

表1共酶解前后脂肪含量变化比较

②单因素分析比较共酶解前后蛹壳和蝇壳细粉体的蛋白质含量(凯氏定氮法测定)，见表2。

表2共酶解前后蛋白质含量变化比较

2)化学法和生物法对蚕蛹皮壳难解离色素脱色效果比较

将H₂O₂氧化-还原酶系(生物法)蛹壳脱色素效果与高锰酸钾-亚硫酸氢钠(化学法)的蛹壳脱色素效果进行比较，结果见表3。

表3高锰酸钾-亚硫酸氢钠和H₂O₂氧化-还原酶系脱色素效果比较

5.米根霉发酵、固定化反应器制备及甲壳素脱乙酰反应

1)确定米根霉发酵产酶工艺条件

白色米根霉出发菌株购自广东省微生物研究所菌种保藏中心(菌株编号：3038)，由本发明人反复驯化诱导为甲壳素脱乙酰酶高产菌株后，保藏编号CCTCC NO.M207054，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年4月24日，分类命名米根霉ODK-RM₁(Rhizopus oryzae ODK-RM₁)。

米根霉细胞增殖过程：白色米根霉接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)7天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，25℃，120r/min恒温振荡培养5天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的不锈钢气升式发酵罐中，28℃，100r/min好氧深层液体培养约5d，测甲壳素脱乙酰酶酶活达定值时，终止发酵，用管式菌体离心机收集菌体，加保护剂后冻干制成菌粉。

2)制备全细胞固定化生物反应器

①全细胞固定化：

将2％海藻酸钠溶液与上述干菌粉按液∶固＝5∶1的比例充分混合，得混悬液约3L，室温下以10ml/min的速度，通过针泵滴入0.2mol/Lde CaCL中，形成直径约5.0-5.5mm的小珠，全部混悬液滴注完毕后，将形成的小珠装入反应器装置。

②上流式生物反应器制作：

制作圆柱状不锈钢上流式反应器主体，内径50.8cm×高度584cm，工作容积10L；辅以底物流入、产物流出、菌培养基流加及惰性气体加压等功能通道。

3)脱乙酰反应及效果评定

本发明工艺路线所得甲壳素，用40℃温水悬浮、充分混匀后，从底物入口缓慢流加于米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，产物出口收集反应液后，由闭路通道循环回流到反应器，每一循环周期约60min。转化反应期间如反应液黏度偏大，用惰性气体加压洗脱产物。反应终止的时间点依对产物脱乙酰度的要求以及反应器酶活强度而定。反应循环次数对脱乙酰度的影响见表4。

表4固定化细胞脱乙酰反应循环次数对产物脱乙酰度的影响

实施例1：蚕蛹甲壳素的制备

a.预处理：收集鲜家蚕蛹10kg，清洗除杂、充分沥水后用绞肉机机械破皮处理，用压榨法(液压式或螺旋式压榨机)挤出内容物(另行处理)，收集皮壳，烘干至水分＜10％，0℃以下预冻6h，结块后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体。

b.所获细粉体先用65℃热水浸泡30min，倾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水以及等量容积的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，在40℃恒温下，于反应釜内将皮壳细粉体和粗酶液缓慢混合，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18h，将大部分脂肪、蛋白质溶解于反应液中，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离，溶于反应液中的蛋白和脂肪产物另法提取。

c.收集酶解反应后的固体物料，加入少量稀碱(10％NaOH)浸泡、煎煮2h，更换碱液后按相同时间重复煎煮过程，共3次，彻底脱除少量残余脂肪和蛋白质，过滤，滤液另行处理。

d.滤渣水洗3遍后，先用5％H₂O₂煮沸1h，快速脱色，再用富含H₂O₂以及H₂O₂氧化-还原酶系的采绒革盖菌去菌体粗酶液进行酶反应，脱除原料中难解离的色素并陆续将H2O2转化为无毒无害的CO₂和H₂O，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心(2500r/min)，将沉淀洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。

实施例2：蝇蛆壳聚糖的制备

a.预处理：收集鲜蝇蛆10kg，清洗除杂、充分沥水后用绞肉机机械破皮处理，用压榨法(液压式或螺旋式压榨机)挤出内容物(另行处理)，收集皮壳，烘干至水分＜10％，0℃以下预冻6h，板结后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体。

c.收集固体物料，40℃温水洗3遍，沥干，先用5％H2O2煮沸1h，快速脱色，再用富含H₂O₂以及H₂O₂氧化-还原酶系的采绒革盖菌去菌体粗酶液进行酶法脱色，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕进行离心(2500r/min)，将沉淀洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。

d.将洗涤后的沉淀物按固∶液＝1∶4的配比量、或已干燥的甲壳素按固∶液＝1∶8的配比量，与40℃温水混合为悬浮液，充分混匀后，

定量循环流加于上流式米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，用电位滴定法动态检测反应产物的DD值(脱乙酰度)，直至反应液样本的DD值＞85％、黏度低于100×10-3Pa·s时，终止反应。

f.收集反应产物，按1/3容积减压浓缩后，真空或冷冻干燥，得高脱乙酰度、低黏度壳聚糖。

实施例3：乳杆菌发酵制备甲壳低聚糖

a.预处理：家蚕蛹10kg清洗除杂、破皮处理后，压榨法挤出内容物，收集皮壳，烘干至水分＜10％，0℃以下预冻后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体。

b.细粉体先用65℃热水浸泡30min，倾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水以及等量容积的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒温下，于反应釜内缓慢混合，间歇搅拌，进行共酶解脱脂脱蛋白反应，反应时间18h，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离。

c.收集固体物料，40℃温水洗3遍，沥干，先用5％H₂O₂煮沸1h，快速脱色，再用富含H₂O₂以及H₂O₂氧化-还原酶系的采绒革盖菌去菌体粗酶液进行酶法脱色，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心(2500r/min)，沉淀物洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。

d.将甲壳素按固∶液＝1∶8的配比量，用40℃温水重新悬浮，混匀后定量循环流加于上流式米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，电位滴定法动态检测反应产物的DD值(脱乙酰度)，直至反应液样本的DD值＞70％，终止反应。

f.收集反应液，定容定浓度后作为碳源及反应底物，添加1％多价蛋白胨为氮源(可直接来自副产品蚕蛹蛋白及其水解产物)和少量无机盐，按2％接种量接种本发明人诱导驯化、能够以壳聚糖为营养物质的乳杆菌，厌氧深层液体发酵，直至菌体生物量至少达到＞1.0×10⁹cfu/ml后，终止发酵，用特制菌体分离机去除菌体，发酵液直接浓缩，真空或冷冻干燥，得固体半透明粉末状、其中80％相对分子量＜3000的甲壳寡糖。

实施例4：羧甲基甲壳素的制备

a.预处理：鲜蝇蛆10kg清洗除杂、破皮处理后，压榨法挤出内容物，收集皮壳，烘干至水分＜10％，0℃以下预冻后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体。

b.细粉体先用65℃热水浸泡30min，倾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水以及等量容积的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒温下于反应釜内进行共酶解脱脂脱蛋白反应，时间18h，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离。

c.收集固体物料，40℃温水洗3遍后沥干，先用5％H₂O₂煮沸1h，快速脱色，再用富含H₂O₂以及H₂O₂氧化-还原酶系的粗酶液进行酶法脱色，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心(3500r/min)，沉淀物洗涤、干燥，得白色粉末状甲壳素。

d.所获甲壳素先加入10倍量的异丙醇中搅拌溶胀，沥干后再加入甲壳素质量约5倍的45％氢氧化钠溶液，15℃以下持续浸泡3h，间歇搅拌，反应结束后滤去剩余反应液，得约相当于甲壳素质量3倍的碱性甲壳素胶体溶液；以1.2倍于甲壳素的质量比例称取固体氯乙酸，分次加入该胶体溶液中，每次间隔数分钟，加毕，提升温度至70℃，反应3h，得可溶于水的羧甲基壳聚糖，加5倍蒸馏水溶解，冰醋酸调pH至7.0、抽滤后用70％乙醇洗涤、干燥，得白色粉末状羧甲基壳聚糖。

实施例5：蚕蛹油脂的提取

a.预处理：家蚕蛹30kg清洗除杂、破皮处理后，压榨法挤出内容物待用，皮壳烘干至水分＜10％，0℃以下预冻后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体。

c.固体用于甲壳素提取。收集富含脂质蛋白质的分离液体，减压浓缩至1/4容积，与先前挤压出的内容物混合，继续浓缩至膏状。

d.用浸出法进行油脂提取：将上述浓缩物移入浸出罐，装罐量85％，采用逆流浸泡式浸出工艺，以6号抽提溶剂油为浸出溶剂、罐组式(共3个罐)浸出方式进行油脂抽提，混合油放罐后，用98kPa蒸汽下压、145kPa蒸汽上蒸，蒸脱蛹粕中残留溶剂，检测残溶合格后，由出粕口排出脱脂蛹粕，继续用于蛋白质提取。

e.对浸出所得的混合油进行蒸发、汽提，脱除混合油中的浸出溶剂以及易发挥组分，得蚕蛹毛油，控制毛油中溶剂残留量＜0.05％，或闪点220℃。毛油可继续精炼为精制蛹油。

实施例6：蝇蛆蛋白的提取

a.预处理：蝇蛆20kg清洗除杂、破皮处理后，压榨法挤出内容物待用，皮壳烘干至水分＜10％，0℃以下预冻后，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm(60-100目)的细粉体。

b.细粉体先用65℃热水浸泡30min，倾掉，再以固∶液＝1∶4的配比量，加入40℃的洁净温水，以及等量容积的脂肪酶和蛋白酶混合粗酶液，40℃恒温下于反应釜内进行共酶解脱脂脱蛋白反应，时间18h，反应终止后离心(2500r/min)进行固、液分离。

d.将蛆膏用3倍量的石油醚浸没，60℃浸取4次，每次1h，浸毕离心(3500r/min，20min)进行固液分离。

e.分离的液态混合油用于蛆油提取。将固体沉淀的灰色脱脂蛆粕，加蒸馏水搅拌成匀浆，用0.25％NaOH溶解蛋白质，过滤去除固形物，滤液用HCL调pH至4.5，静置3h，加入饱和硫酸铵溶液，静置、离心，沉淀即为蛋白质，将此浆状蛋白沉淀装入透析袋，透析除盐后用活性炭脱色，95％乙醇抽提，真空干燥，得精制蛆蛋白粉。

Claims

1.一种从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于包括以下步骤：将蚕蛹、蝇蛆的皮壳通过干法或湿法破碎细粉化处理；将得到的细粉体经来自微生物的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液进行共酶解反应，充分脱除蛹皮/蛆皮原料中的脂肪和蛋白质；用两步法脱色，即先以H₂O₂初步脱色，再用富含过氧化氢氧化-还原酶系的粗酶液进行酶法脱色并还原H₂O₂；收集脱色后物料，洗涤、干燥后制成甲壳素产品；通过米根霉全细胞固定化生物反应器进行循环脱乙酰反应，得到不同脱乙酰值的壳聚糖；所述微生物粗酶液是指用不同出发菌株诱导驯化而得的高产脂肪酶活的产朊假丝酵母(Candida utilis)ODK-CC₁，保藏号CCTCC NO.M207053，高产蛋白酶活的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ODK-BK₁，保藏号CCTCC NO.M207028，高产H₂O₂氧化-还原酶系的云芝(Polystictus versicolor)ODK-CY₁，保藏号CCTCC NO.M207024，分别经好氧液体深层发酵后，去除菌体而得到的胞外酶粗酶液；所述米根霉为米根霉(Rhizopus oryzae)ODK-RM₁，保藏号CCTCC NO.M207054。

2.根据权利要求1所述的从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于：进一步用产酸细菌进行液体深层发酵壳聚糖，获得具有高度水溶性的甲壳寡糖。

3.根据权利要求1所述的从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于：进一步将甲壳素加工为碱性甲壳素胶体溶液后，分别用环氧乙烷、氯乙酸或丙烯腈处理，分别生成羟乙基甲壳素、羧甲基甲壳素或氰乙基甲壳素。

4.根据权利要求1-3任一项所述的从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于：所述细粉化处理，是指如果是鲜蚕蛹或鲜蝇蛆，则清洗除杂、充分沥水后先行机械破皮处理，用液压式或螺旋式压榨机的压榨法挤出内容物，收集皮壳，烘干至水分＜10％，0℃以下预冻6小时，用离心式碰撞粉碎机将其粉碎至平均粒度为150-250μm的细粉体；若是干蛹或干蛆，则净化后直接预冻、粉碎处理成细粉体。

5.根据权利要求1-3任一项所述的从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于：所述共酶解反应，是指将所获细粉体以固∶液＝1∶5的配比量，先用65℃温水浸泡30min，抑制杂菌及无关酶活，再加入与温水容积等量的脂肪酶粗酶液和蛋白酶粗酶液共混而成的混合液，在40℃恒温下于反应釜内将皮壳粉混悬液和粗酶液缓慢混合，充分搅拌，进行共酶解脱脂、脱蛋白反应，反应时间18小时，反应终止后以2500r/min离心进行固、液分离。

6.根据权利要求1-3任一项所述的从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于：所述两步法脱色，是指先将酶解反应后的固体物料，加入少量稀碱中浸泡、煎煮2h，更换碱液后重复3次，过滤收集滤渣，水洗3遍后，先用5％H₂O₂煮沸1小时，快速脱色，再用富含H₂O₂氧化-还原酶系的粗酶液进行酶解反应，脱除原料中难解离色素并陆续将H₂O₂转化为无毒无害的CO₂和H₂O，反应温度40℃，反应时间18h，反应毕离心分离，将沉淀洗涤、干燥得白色粉末状甲壳素。

7.根据权利要求1-3任一项所述的从蚕蛹、蝇蛆的皮壳中制取甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于：所述脱乙酰反应，是指将所得甲壳素用40℃温水悬浮、充分混匀后，循环流加于米根霉全细胞固定化反应器中，进行脱乙酰基反应，根据产品和用途对脱乙酰度的要求，用电位滴定法动态检测反应产物的脱乙酰度，直至达到所要求的脱乙酰度标准，终止反应，收集反应产物，按1/3容积浓缩后，真空或冷冻干燥，得壳聚糖。