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CN101043899B - 重折叠转化型生长因子beta家族蛋白 - Google Patents

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CN101043899B CN200580035828XA CN200580035828A CN101043899B CN 101043899 B CN101043899 B CN 101043899B CN 200580035828X A CN200580035828X A CN 200580035828XA CN 200580035828 A CN200580035828 A CN 200580035828A CN 101043899 B CN101043899 B CN 101043899B
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Abstract

用于折叠属于转化型生长因子beta超家族的蛋白的组合物和方法在本发明公开。所述组合物和方法允许所述蛋白在不产生适当折叠的生物活性产物的表达系统中产生时进行折叠。

Description

重折叠转化型生长因子BETA家族蛋白
相关领域的交叉参考
本申请要求2004年8月19日提交的临时申请60/602,825的优先权。该在先申请的全文内容包含在此作为参考。
技术领域
本发明涉及用于重折叠属于转化型生长因子beta超家族的蛋白的组合物和方法。
背景技术
神经胚素(neublastin)也已知为Artemin和Enovin，其为24-kDa同源二聚体分泌型蛋白，促进外周和中央神经系统神经元诸如多巴胺能神经元的存活(Baudet et al.，2000，Development，127：4335；Rosenblad et al.，2000，Mol.Cell Neurosci.，15(2)：199；GenBank AF120274)。编码神经胚素的基因已经被克隆并测序(Roseblad et al.，2000，Mol.Cell Neurosci.，15(2)：199；Baloh et al.，Neuron，21：1291)。
神经胚素是神经胶质细胞来源的神经细胞营养因子(GDNF)配体家族成员。在细胞水平，GDNF成员活化受体酪氨酸激酶RET。RET结合共同受体GDNF家族受体alpha(GFRalpha)，其为糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接型膜蛋白，提供对RET的配体特异性。已知四种GFRalpha(GFRalpha1-4)。神经胚素结合GFRalpha3，与RET一起形成三元信号复合体(Baudet et al.2000，Development，127：4335；Baloh et al.，1998，Neuron，21：1291)，其主要定位于痛觉感觉神经元上(Orozco et al.，2001，Eur.J.Neurosci.，13(11)：2177)。这些神经元检测痛觉和损伤。因此，神经胚素在临床上可用于神经病的一般治疗并更具体地用于治疗神经病性疼痛。
神经胚素和其它GDNF家族成员是转化型生长因子beta(TGF beta)超家族成员，并由此其特征在于存在7个具有相似间隔的保守的半胱氨酸残基，其形成半胱氨酸结的结构(Saarma，1999，Microsc.Res.Tech.，45：292)。每个单体含有这样的两个二硫键，其形成封闭的环结构，包绕第三个二硫键以形成紧实的结状结构。每个单体中所含的第七个半胱氨酸形成分子间二硫键，其共价连接所述单体形成最终的二聚体产物(Rattenholl et al 2000，J.Mol.Biol.，305：523)。
TGF beta家族成员作为前原蛋白合成，所述蛋白在切割信号肽和原结构域以后最终作为成熟同源二聚体分泌(见例如Rattenholl，et al.，2000，J.Mol.Biol.，305：523；Fairlie et al.，2001，J.Biol.Chem.，276(20)：16911)。信号肽和原结构域介导TGF beta家族成员的正确分泌(Rattenholl et al.，2000，J.Mol.Biol.，305：523；Rattenholl et al.，2001，Eur.J.Biochem.，268：3296)。
发明内容
本发明至少部分基于这样的发现，即一些缓冲组合物对于诱导变性多肽的重折叠特别有效。开发本发明具体描述的组合物和方法以诱导蛋白重折叠，从而产生这样的多肽，其具有正确的三维结构以及伴随的生物活性。
一方面，本发明的特征在于诱导变性多肽的折叠的方法，其通过：(1)提供变性多肽；和(2)使该多肽与有效诱导该多肽折叠的量的重折叠缓冲液接触，其中所述重折叠缓冲液包含(i)浓度25mM-150mM、pH5.8-8.0的磷酸钾或磷酸钠，(ii)浓度0.3M-2M的胍-HCl，(iii)浓度0.25M-1M的L-精氨酸，(iv)浓度0.05％-1％的吐温-80，和(v)浓度1mM-4mM的氧化型谷胱甘肽以及浓度0.05mM-0.8mM的还原型谷胱甘肽，其中氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比是5∶1-20∶1。
一些实施方案中，所述变性多肽是含有TGF beta超家族成员的多肽。
本发明中的“TGF beta超家族成员，”指这样的蛋白，其具有与TGF beta超家族的野生型成员相同的序列，保持野生型蛋白生物活性的截短物，或与野生型蛋白(全长或成熟蛋白)具有至少70％的序列同一性并保持野生型蛋白生物活性的变体。TGF beta超家族的成员包括例如，TGF-beta，生长分化因子，骨形态发生蛋白，活化素(activin)，抑制素(inhibin)，和神经胶质细胞系来源的神经营养因子。一些实施方案中，变体与全长野生型蛋白具有至少70％，80％，85％，90％，95％，或98％的序列同一性并保持野生型蛋白的生物活性。一些实施方案中，变体与成熟野生型蛋白具有至少70％，80％，85％，90％，95％，或98％的序列同一性并保持野生型蛋白的生物活性。
本发明所述方法中所用的“重折叠缓冲液”组分的浓度指存在与变性多肽的反应中的重折叠缓冲液组分的最终浓度(不是加入重折叠反应其它组分之前重折叠缓冲液母液中组分的浓度)。
本文中所用“诱导多肽重折叠”指诱导多肽中的三级结构，以及获得相关生物活性，其对应野生型蛋白的生物活性。
TGF beta超家族成员可为神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)家族成员。本文中“GDNF家族成员，”指具有与GDNF家族的野生型成员相同的序列的蛋白质，保持野生型蛋白生物活性的截短物，或与野生型蛋白(全长或成熟蛋白)具有至少70％的序列同一性并保持野生型蛋白生物活性的变体。GDNF家族的成员包括GDNF，neurturin，神经胚素，和persephin。一些实施方案中，变体与全长野生型蛋白具有至少70％，80％，85％，90％，95％，或98％的序列同一性并保持野生型蛋白的生物活性。一些实施方案中，变体与成熟野生型蛋白具有至少70％，80％，85％，90％，95％，或98％的序列同一性并保持野生型蛋白的生物活性。
一些实施方案中，GDNF家族成员是神经胚素蛋白。“神经胚素蛋白”在本文指具有与GDNF家族的野生型成员相同的序列的蛋白质，保持野生型蛋白生物活性的截短物，或与野生型蛋白(全长或成熟蛋白)具有至少70％的序列同一性并保持野生型蛋白生物活性的变体。GDNF家族的成员包括GDNF，neurturin，神经胚素，和persephin。一些实施方案中，变体与全长野生型蛋白具有至少70％，80％，85％，90％，95％，或98％的序列同一性并保持野生型蛋白的生物活性。一些实施方案中，变体与成熟野生型蛋白(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸残基108-220)具有至少70％，80％，85％，90％，95％，或98％的序列同一性并保持野生型蛋白的生物活性。神经胚素蛋白可例如包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基122-220，SEQ ID NO：1的氨基酸残基117-220或SEQ ID NO：1的氨基酸残基108-220或由其组成。
所述方法还包括在利用重折叠缓冲液诱导折叠之前在细菌(例如大肠杆菌)中表达多肽的方法。一些实施方案中，在利用重折叠缓冲液诱导折叠之前，所述多肽以不溶形式在细菌中表达，所述不溶多肽与有效变性所述多肽的量的增溶缓冲液接触。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.30M-0.5M的L-精氨酸。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度至少0.30M的L-精氨酸。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度至少0.35M的L-精氨酸。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.35M的L-精氨酸。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.1％-1％的吐温-80。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.1％-0.5％的吐温-80。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度至少0.1％的吐温-80。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.1％的吐温-80。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含的氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例为5∶1-10∶1。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含的氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例为5∶1。一些实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度1mM-2mM的氧化型谷胱甘肽。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度1mM的氧化型谷胱甘肽。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.5M-1.0M的胍-HCl。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度至少0.5M的胍-HCl。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含浓度0.5M的胍-HCl。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾浓度25mM-100mM。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾浓度25mM-75mM。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾浓度至少50mM。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾浓度50mM。一些实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾pH7.0-8.0。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾pH7.5-8.0。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾pH约7.8。
所述重折叠缓冲液可选包含或由以下组分组成：(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.35M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％的吐温-80，(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
一些实施方案中，所述重折叠缓冲液不由以下组分组成：(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.35M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％的吐温-80，(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
一些实施方案中，所述重折叠缓冲液缺乏尿素和/或甘氨酸。
另一方面，本发明的特征在于这样的组合物，其包含稀释1-10倍时有效诱导神经胚素多肽的折叠的量的重折叠缓冲液，其中所述重折叠缓冲液包含浓度为所述浓度的1-10倍的以下组分：(i)浓度25mM-150mM，pH5.8-8.0的磷酸钾或磷酸钠；(ii)浓度0.3M-2M的胍-HCl；(iii)浓度0.25M-1M的L-精氨酸，(iv)浓度0.05％-1％的吐温-80，(v)浓度1mM-4mM的氧化型谷胱甘肽，和浓度0.05mM-0.8mM的还原型谷胱甘肽，其中氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例是5∶1-20∶1。所述组合物可选用作在开始折叠反应之前利用其它组分稀释的母液。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含L-精氨酸，其浓度为0.30M-0.5M的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含L-精氨酸，其浓度为至少0.30M的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含L-精氨酸，其浓度为至少0.35M的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含L-精氨酸，其浓度为0.35M的1-10倍。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含吐温-80，其浓度为0.1％-1％的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含吐温-80，其浓度为0.1％-0.5％的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含吐温-80，其浓度为至少0.1％的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含吐温-80，其浓度为0.1％的1-10倍。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含的氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例为5∶1-10∶1。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含的氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例为5∶1。一些实施方案中，重折叠缓冲液包含的氧化型谷胱甘肽的浓度为1mM-2mM的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含的氧化型谷胱甘肽的浓度为1mM的1-10倍。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含胍-HCl，其浓度为0.5M-1.0M的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含胍-HCl，其浓度为至少0.5M的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含胍-HCl，其浓度为0.5M的1-10倍。
一些实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾，其浓度为25mM-100mM的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾，其浓度为25mM-75mM的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾，其浓度为至少50mM的1-10倍。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含磷酸钾，其浓度为50mM的1-10倍。一些实施方案中，重折叠缓冲液包含pH7.0-8.0的磷酸钾。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含pH7.5-8.0的磷酸钾。其他实施方案中，重折叠缓冲液包含pH约7.8的磷酸钾。
所述重折叠缓冲液可选包含或由以下组分组成，所述组分的浓度为下述浓度的1-10倍：(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾；(ii)浓度0.5M的胍-HCl；(iii)浓度0.35M的L-精氨酸；(iv)浓度0.1％的吐温-80；(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽；和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
一些实施方案中，所述重折叠缓冲液不由以下物质组成：(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.35M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％的吐温-80，(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
一些实施方案中，所述重折叠缓冲液缺乏尿素和/或甘氨酸。
本文所述组合物和方法的优点在于它们允许大量正确折叠的TGF beta超家族蛋白诸如神经胚素在如下条件下的重折叠和纯化：其中所述蛋白在不能产生正确折叠的生物活性产物的宿主(例如细菌)中产生。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解一样。但类似或等同于本文所述方法和材料的那些可用于本发明的实践和检测，示例性方法和材料在下文描述。所有公开出版物，专利公开，专利和本文所述的其他参考文献的全文包含在此作为参考。如有冲突，以本申请，包括定义为准。所述材料，方法和实例仅仅为了举例说明，并非意图限制。
本发明的其他特征和优点从下面的详细描述以及权利要求明显可见。
附图简述
图1图示了神经胚素的人和大鼠113氨基酸以及104氨基酸形式的序列。
图2图示了将溶解的神经胚素与表1中具体的重折叠缓冲液保温之后检测到的吸光度(缓冲液4，其含有浓度1％的吐温-80，未显示)。
发明内容
本发明提供用于诱导属于TGF beta超家族的变性多肽的折叠的组合物和方法。利用一些组合物诱导变性神经胚素(其为TGF beta超家族以及GDNF亚家族成员)的折叠，在所附工作实施例中描述。由于神经胚素具有TGF beta超家族和GDNF亚家族成员共同的半胱氨酸结状结构，预期本发明所述的重折叠缓冲液可有效诱导属于TGF beta超家族以及GDNF亚家族组的其它多肽的折叠。
神经胚素
天然人前原神经胚素多肽的长度为220个氨基酸，并具有以下序列：MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPVLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ ID NO：1)。
人神经胚素信号肽起始于位置1的蛋氨酸(加下划线)，终止于位置39的丙氨酸(加下划线)。人神经胚素的全长原结构域起始于位置40的丝氨酸(加下划线)，终止于位置107的精氨酸(加下划线)。成熟人神经胚素多肽由羧基末端113个氨基酸组成，其起始于位置108的丙氨酸，结束于位置220的甘氨酸。本文所述的组合物和方法使得变性神经胚素蛋白能有效折叠，所述神经胚素蛋白包括全长神经胚素，成熟神经胚素(缺乏信号肽和原区)，或成熟神经胚素的生物活性截短物或变体。
根据本发明所述方法折叠的神经胚素蛋白的长度可变。尽管成熟人神经胚素多肽可由前原神经胚素的羧基末端113个氨基酸组成，并不需要所有113个氨基酸来获得有用的神经胚素生物活性。氨基末端截短是容许的。因此，神经胚素多肽可对应天然人神经胚素的羧基末端99-113个氨基酸(即其长度可为99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，或113个氨基酸)。由神经胚素的羧基末端104和113个氨基酸组成的神经胚素多肽在下文的工作实施例中举例说明。
除了长度可变，神经胚素多肽的序列也可变。具体地，可将一些氨基酸取代导入神经胚素序列而不明显丧失本文所述的神经胚素生物活性。示例性实施方案中，多肽可与SEQ ID NO：1具有至少70％，80％，85％，90％，95％，98％or 99％的同一性(或与SEQ ID NO：1的氨基酸108-220具有70％，80％，85％，90％，95％，98％or 99％的同一性)。与SEQ ID NO：1(或SEQ IDNO：1的氨基酸108-220)中公开的不同的变体神经胚素多肽的序列，可包括一或多处保守氨基酸取代，一或多处非保守氨基酸取代，和/或一或多处缺失或插入。一些实施方案中，所述变体神经胚素多肽相对于SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：1的氨基酸108-220)包含至少一处氨基酸取代，其提供可偶联聚合物(例如聚亚烷基二醇部分诸如聚乙二醇部分)的内部聚合物偶联位点(示例性神经胚素变体描述于WO 02/060929，其内容包含在此作为参考)。一些实施方案中，所述变体神经胚素多肽相对于SEQ ID NO：1(或SEQ IDNO：1的氨基酸108-220)包含至少一处氨基酸取代，其降低肝素结合(例如，R155E，R156E，R158E，或R155，156E，或位于成熟神经胚素多肽中相应位置的这些取代中的一或多个)。
保守取代是用具有同一性质的一种氨基酸取代另一氨基酸。保守取代包括在下组内进行的取代：缬氨酸，丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸，半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。阳性带电(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中某一成员被相同组中其它成员的任意取代可认为是保守取代。
除包含变体神经胚素多肽以外，多肽可选包含异源氨基酸序列。本文中“异源”用于氨基酸序列时，指这样的序列，其源自对于具体的宿主细胞而言异源的来源，或如果来自相同宿主细胞，为对其原始形式进行了修饰的。示例性异源序列包括异源信号序列(例如天然大鼠白蛋白信号序列，修饰的大鼠信号序列，或人生长激素信号序列)或用于纯化变体神经胚素多肽的序列(例如组氨酸标记)。
神经胚素活性
本文所述方法中所用神经胚素多肽显示天然神经胚素的至少一种生物活性。生物活性神经胚素多肽是这样的多肽，其二聚化时可与GFRα3一起结合RET并诱导RET二聚化以及自身磷酸化。(见例如Sanicola et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：6238)。确定受体结合以及受体自身磷酸化的任何方法可用于评估神经胚素多肽的生物活性。例如，实施例3中描述的KIRA实验可用于评估神经胚素生物活性(也见，Sadick et al.，1996，Anal.Biochem.，235(2)：207)。
重折叠缓冲液
通常，本文所述方法中所用的重折叠缓冲液包括以下组分：(i)浓度25mM-150mM、pH5.8-8.0的磷酸钾或磷酸钠，(ii)浓度0.3M-2M的胍-HCl，(iii)浓度0.25M-1M的L-精氨酸，(iv)浓度0.05％-1％的吐温-80，和(v)浓度1mM-4mM的氧化型谷胱甘肽以及浓度0.05mM-0.8mM的还原型谷胱甘肽，其中氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比是5∶1-20∶1。
一些实施方案中，可使用浓度25mM-150mM的磷酸钠取代磷酸钾。这些方法中所用的磷酸钠或磷酸钾的pH通常落在5.8-8.0的范围内。此外，一些实施方案中，可使用变性剂诸如吐温-20或NP40取代浓度0.05％-1％的吐温-80。
具体重折叠缓冲液对于诱导变性多肽的折叠的有效性可通过在将变性多肽在具体缓冲液中保温后测定吸光度(OD 320)来评估(见实施例1和图2)。在所述实验中检测到的吸光度指示沉淀的、不当折叠的蛋白的存在。如所附实施例2所示，低吸光度读数表示缓冲液对于诱导变性多肽的折叠有效。折叠的多肽的生物活性也可通过本文所述的体外和/或体内生物测定法来测定。
以下是实施部分的实施例。其不应解释为从任何方面对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：鉴定神经胚素重折叠缓冲液
重组神经胚素作为10组氨酸标记的融合蛋白(图1)在大肠杆菌中在T7启动子的控制下表达。人和大鼠113和104氨基酸形式源自它们各自的构建体(图1)并通过本发明所述的方法进行重折叠和纯化。113个氨基酸以及104个氨基酸形式的起点在图1的粗体文本中均加有下划线。
在大肠杆菌中表达时，神经胚素作为不溶蛋白包含在包含体(IB)内。因此，神经胚素必需自IB分离并重折叠以获得可溶且具有生物活性的产物。因此，包含体通过利用Gaulin press在PBS中裂解表达神经胚素的大肠杆菌然后进行离心来获得。除非另有说明，所有离心4℃进行，而所有其它步骤在室温进行。为了获得最大可能产量的正确折叠的神经胚素，优选用不含细胞碎片的IB沉淀物开始。为了实现该目的，对IB沉淀物进行称重并进一步在IB洗涤缓冲液(20mM Tris pH 8.5和0.5M EDTA；8ml每克蛋白)中洗涤。通过在15,000xg离心20分钟收集IB沉淀物，去除混浊的(cloudy)上清，在含有2％Tri-n-X 100的相同缓冲液(8ml每克蛋白)中再次洗涤，以辅助去除污染性磷脂。利用不含洗涤剂的洗涤缓冲液(8ml每克蛋白)进行最后的洗涤以去除吐温-80，弃去上清。
将新鲜制备的增溶缓冲液(6M胍-HCl，0.05M磷酸钾pH 7.8，0.1MDTT，和1.0mM EDTA)加入沉淀并利用polytron混合器进行较好的混合。为了保证完全溶解，在室温搅拌混合物过夜。第二天，在10,000rpm离心20分钟使溶液澄清。将上清倾析入新的容器，称重余下的不溶沉淀以允许评估回收。并非所有蛋白可通过所述过程而溶解。在这一点，利用标准Bradford蛋白测定法利用增溶缓冲液中的BSA作为对照定量可溶蛋白。
为确定具体的缓冲条件是否可产生高产量正确折叠的神经胚素，在96孔板中制备潜在的(potential)重折叠缓冲液的阵列(见表1)。
表1：96-孔板重折叠缓冲图谱
Figure G05835828X20070423D000101
Figure G05835828X20070423D000111
如表1所示，板中的所有胍HCl(0.5M)，还原型谷胱甘肽(0.2mM)，和磷酸钾pH 7.8(50mM)都恒定，但L-精氨酸，氧化型谷胱甘肽，以及吐温-80可变。L-精氨酸浓度为0.15M-0.35M(加入达0.8M L-精氨酸也可)，而氧化型谷胱甘肽为1-4mM。此外，吐温-80可为0-1％。由于一些情况中的甘氨酸可在重折叠过程中取代L-精氨酸，制备分离的板，其中保存的所有缓冲组分除L-精氨酸以外相同，所述L精氨酸被25-100mM的甘氨酸取代。
每个孔中的缓冲液的最终体积是280μl(还原型谷胱甘肽是从母液浓度新鲜添加的)。然后将20微升溶解的神经胚素加入每个孔，其终浓度为0.1mg/ml。48小时内监测吸光度。任何检出的吸光度表示沉淀的但并非正确折叠的蛋白的存在。
在含有0.15M L-精氨酸的孔中观察到最多量的沉淀出现，在含有0.35M L-精氨酸的孔中观察到最小量的沉淀(图2)。在所有含有0.35M L-精氨酸的孔中，在含有0.1％吐温-80的孔中观察到最好的总体结果。当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例为20∶1时观察到最佳重折叠(但选择5∶1的比例进行进一步的实验，以降低重折叠缓冲液中所需氧化型谷胱甘肽的量)。基于这些标准，使用以下实施例中存在的重折叠缓冲液系统并可提供产率高且正确折叠的神经胚素。在所有缓冲条件下，用甘氨酸替换L-精氨酸导致神经胚素沉淀。
实施例2：神经胚素的重折叠和纯化
应用实施例1中描述的缓冲液分析结果来制备以下重折叠缓冲液，其用于本实施例以及后面的实施例：0.5M胍-HCl，0.35M L-精氨酸，50mM磷酸钾pH 7.8，0.2mM还原型谷胱甘肽，1mM氧化型谷胱甘肽，和0.1％吐温-80。重折叠缓冲液是新鲜制备的。溶解的蛋白在重折叠缓冲液中快速稀释到终浓度0.05-0.5mg/ml。平均而言使用0.1mg/ml溶解的神经胚素。该混合物在室温保温至少48小时。无需搅拌。
利用Ni-IMAC层析去除宿主细胞污染物
将L-精氨酸从0.35M稀释到0.175M以避免Ni从IMAC树脂滤出。这可利用以下任意方法进行。利用0.5M胍-HCl将精氨酸直接稀释到适当浓度。由于如果不能保持胍浓度，神经胚素可发生沉淀，因此没有单独使用水(胍-HCl应当保持在缓冲液中直到下文所述的阳离子层析步骤)，造成产品回收的主要损失。由于直接稀释L-精氨酸将实质上增加工作体积并增加所需的胍的量，利用Millipore切向流(tangential flow)Pellicon装置(unit)将蛋白浓缩到原始体积的二十分之一。浓缩后，利用0.5M胍将L-精氨酸稀释到0.175M。
将稀释的L-精氨酸溶液加于Ni-NTA IMAC柱，该柱事先在柱洗涤缓冲液(40mM咪唑和0.5M胍HCl)中以50-100ml每分钟的流速平衡。神经胚素经由组氨酸标记结合于Ni-NTA基质并且在流出物(flow through)中没有观察到产物。利用5个柱体积的洗涤缓冲液洗涤之后，利用0.5M胍中的0.2M咪唑从树脂洗脱神经胚素。弃去柱洗涤缓冲液(其不含有神经胚素)。利用Bradford测定法监测蛋白回收。此外，从该点开始监测宿主细胞污染物。
通过蛋白酶消化从神经胚素分离组氨酸标记
根据所需神经胚素长度(113个氨基酸或104个氨基酸)，采用两种可能的组氨酸标记去除法之一。
为了产生野生型113个氨基酸的神经胚素产物，用Endo Lys C去除标记中所含赖氨酸残基的标记c末端。将5个单位的Endo Lys C(WAKO，catalogue#129-02541)每克神经胚素加入Ni-NTA洗脱所得的物质。不需要缓冲液替代或pH调节(一些情况中采用利用10mM Hepes pH 7.8的缓冲取代，可有效工作)。神经胚素与蛋白酶在室温恒速搅拌下保温过夜。
为了产生神经胚素的104个氨基酸的形式，利用胰蛋白酶(CooperBiomedical#3740)处理组氨酸标记的产物，其中所用胰蛋白酶与神经胚素的比例为1∶2000。再次，无需缓冲液取代或pH调节。将混合物在室温保温过夜同时恒速搅拌。
用洗涤缓冲液(0.5M胍-HCl和0.04M咪唑)平衡Ni-NTA树脂。利用0.5M胍-HCl将神经胚素制备物中的咪唑浓度从0.2M调节到0.04M后，将所述物质加载于Ni-NTA树脂，流速为50-100ml每分钟。收集含有非标记的神经胚素的柱流出物并利用Bradford实验监测神经胚素。为了再生成Ni-NTA树脂，利用0.5M胍HCl中的0.2M咪唑洗脱组氨酸。对该物质以及树脂流出物进行SDS/PAGE以确定蛋白酶消化的效率。
通过加入ddH2O将前一步骤的Ni-NTA流出物中的胍-HCl调节到0.35M。较高浓度的胍可防止神经胚素结合阳离子基质。用C-100洗涤缓冲液(5mM磷酸钠pH 6.5和0.35M NaCl)平衡C-100滤器结合型药筒(Sar-rious，catalogue#C100X)。
可用SP-Sepharose(AmershamPharmacia)取代C-100滤膜。但是，选择C-100是由于其与常规柱层析相比表面积增加。当在SP-Sepharose上纯化神经胚素时，可通过选择较大的柱直径和/或降低蛋白载量来防止神经胚素的局部聚集。这防止神经胚素的局部高浓度，其可导致四聚体形成以及产物沉淀，尤其是利用磷酸钠缓冲液的时候。
将0.35M胍-HCl中的神经胚素以流速50-100ml每分钟加入C-100滤器，然后利用C-100洗涤缓冲液充分洗涤该滤器。该步骤去除任何残留的组氨酸标记，内毒素，以及神经胚素单体。神经胚素二聚体通过利用5mM磷酸钠pH6.5和1M氯化钠将蛋白质从C-100基质洗脱来回收。洗脱通过280nm的UV吸收以及收集在一个容器中的神经胚素的峰来监测。
神经胚素浓度以及缓冲液置换
通过Millipore Biomax-10切向流过滤(tangential flow filtration)浓缩神经胚素，并以5个渗滤体积用相同装置渗滤至5mM磷酸钠pH 6.5和0.15M氯化钠。努力达到终蛋白浓度1.0-1.5mg/ml，不允许浓度超过2.0mg/ml，否则神经胚素开始在该配方中沉淀，造成大量蛋白丢失。一旦产物被浓缩到1.0mg/ml并配制在5mM磷酸钠pH 6.5和0.15M氯化钠中，可将神经胚素等分成方便的等份，保存在-70℃备用。
实施例3：神经胚素的分析定性
对实施例2中所述纯化的神经胚素进行各种分析实验以确定纯度，一级氨基酸序列，生物活性，以及二硫键结构完整性。
纯度和分子量的SDS/PAGE评估
通过4-20％聚丙烯酰胺凝胶，在非还原条件下，对从神经胚素重折叠/纯化步骤获得的样品进行SDS/PAGE分析。终神经胚素产物作为可还原的24,000Da二聚体迁移，估计的纯度＞98％。
重折叠型大鼠神经胚素的质谱分析
为了评估重折叠产物的纯度并测定其质量，在ZMD质谱仪上对神经胚素进行质谱分析。在8M尿素中变性神经胚素并在分析前用DTT处理以还原所有二硫键并将二聚体分子转化成单体。鉴定的主要信号表示大鼠神经胚素残基10-113，提示制备物中的主要物种如预期那样。但是，鉴定了10991Da的主要信号并预期其对应亮氨酸缺失，预期11076的信号是小量精氨酸到赖氨酸取代。低水平的峰对应氧化，乙腈加合物以及TFA加合物。也鉴定了小量的神经胚素的106个氨基酸的形式。没有鉴定胰蛋白酶相关峰。
通过AspN肽作图对大鼠104氨基酸神经胚素的表征
对神经胚素进行AspN肽作图，所述神经胚素是通过胰蛋白酶消化去除组氨酸标记产生的。将该批次与数种其它神经胚素制备物包括野生型大鼠113氨基酸，野生型人113氨基酸，人104氨基酸形式进行比较。结果表明该批次如预期的那样，具有大约8％Met92氧化，5％Leu61缺失，低水平Arg到Lys突变，以及低于1％的Asn95脱氨基作用。
大鼠氨基酸神经胚素二硫化物分析
对大鼠104氨基酸神经胚素进行二硫化物分析。对野生型大鼠113氨基酸神经胚素进行平行实验作为对照。使用大约150μL重折叠并纯化的神经胚素进行二硫化物作图。结果表明两个样品中的所有二硫连接是可比的，并且如预期的那样。神经胚素单体的图谱与对照的相似，但是紧邻主单体峰之前洗脱的低水平峰下的面积不同。预期这些较早洗脱的峰含有部分氧化的单体并且不包含在下游质量作图(mass mapping)中。收集含有二硫键连接的肽的级分并利用DHB作为基质通过MALDI--F质谱法分析。数据表明AspN/胰蛋白酶消化后，大鼠104氨基酸神经胚素如预期的那样，并且没有混合的二硫化物连接(connectivity)的证据。
利用激酶受体活化-酶-连接的免疫吸附物测定神经胚素活性
神经胚素活性通过其刺激NB41A3-mRL3细胞中c-Ret磷酸化的能力来确定，所述细胞是表达Ret和GFRa3的粘性小鼠神经母细胞瘤细胞系。将NB41A3-mRL3细胞以2×105细胞每孔铺于24孔板中含有补充了10％FBS的DMEM中，并在37℃、5％CO2.培养18小时。去除培养基并用1ml PBS每孔洗涤细胞后，在37℃、5％CO2，用含有113氨基酸或104氨基酸神经胚素的DMEM刺激细胞10分钟。为终止神经胚素活性，去除培养基并在用10mM Tris，pH 8.0，0.5％NP40，0.2％DOC，50mM NaF，0.1mM Na3VO4，和1mM PMSF裂解之前即刻用PBS洗涤细胞。在4℃保温1小时之后，通过重复移液搅动裂解物并转移到包被有抗-RET mAb(AA.GE7.3)的96孔ELISA板。在室温用封闭缓冲液(含有1％正常小鼠血清的TBST和3％BSA)封闭所述孔1小时，然后利用单独的TBST洗涤6次。通过将捕获的受体与HRP偶联的磷酸酪氨酸抗体(4G10；0.2Tg每孔)保温(2小时)监测磷酸化的RET。保温后，用TBST洗涤孔6次，通过比色实验监测450nm的HRP活性。测定用裂解物或单独的裂解缓冲液处理的孔的吸光度值，校正背景，数据作为活化混合物中存在的神经胚素浓度的函数作图。大鼠104氨基酸神经胚素在KERA中的活性与阳性113氨基酸神经胚素对照的一样，表明重折叠/纯化过程产生生物活性产物。
内毒素实验
利用Limulus Amebocyte裂解物测定法以及生产商推荐的条件(Bio*Whittaker)，测定每个纯化步骤中的内毒素水平。大量内毒素在第一个Ni-NTA洗涤步骤中去除。添加胰蛋白酶后，观察到内毒素水平轻微升高，其很可能是由于所用胰蛋白酶制备物中的内毒素。利用大量洗涤缓冲液洗涤C100柱可去除残留的内毒素。终产物中的内毒素水平恰好位于最大可接受水平之下。
宿主细胞蛋白测定法
利用Cygnus Technologies的大肠杆菌宿主细胞蛋白测定试剂盒以及生产商推荐的条件，监测每个纯化步骤中的宿主细胞蛋白质污染。该试剂盒是基于ELISA测定法的试剂盒，其敏感度达1ng/ml宿主细胞蛋白。如上文所述的内毒素结果，大部分宿主蛋白清除出现在第一个Ni-NTA层析步骤以及C100洗涤过程中。确定宿主细胞蛋白占终产物的0.0001％以下。
胰蛋白酶清除实验
利用基于荧光素的测定法、用N-T-BOC-GLN-ALA-ARG 7-AMIDO-4-甲基香豆素(Methylcoumarin)HCl作为底物监测胰蛋白酶清除，其敏感度为低于40ng/ml。大部分(如果不是全部)添加的胰蛋白酶通过C100流出洗涤去除。存留在终产物中的胰蛋白酶的量低于0.004％(低于敏感度水平)。
组氨酸标记检测ELISA
开发利用抗多组氨酸抗体的组氨酸标记ELISA来监测存留在终制备物中的组氨酸标记的神经胚素。如预期那样，在Ni-NTA之前的所述物质中发现大部分组氨酸标记，而在第一次Ni-NTA流出物中没有发现所述标记，表明大部分组氨酸标记的神经胚素结合Ni-NTA树脂。该物质用0.2M咪唑洗脱从树脂洗脱。该测定法的敏感度为大约0.3μg/ml，测定终产物中鉴定的组氨酸标记的神经胚素的最终量为总蛋白的0.12％或0.88mg。
宿主细胞DNA检测测定法
宿主细胞DNA的清除利用采用在基于ELISA的夹心实验中偶联于链霉抗生物素的单链DNA结合蛋白的测定法来监测。该测定法显示敏感度为大约200pg/ml大肠杆菌DNA。基于单链DNA结合测定法，确定终制备物具有少于0.0001％的污染性宿主细胞DNA。与上文所述其它实验一样，第一Ni-NTA层析步骤和C100洗涤步骤对于去除起始物种中的DNA杂质是最为有效的。
用104氨基酸神经胚素治疗的慢性收缩损伤(CCI)大鼠
神经胚素治疗的CCI大鼠与载体治疗的对照相比显示减轻的触觉异常性疼痛。神经胚素治疗的大鼠能承受施加于身体同侧的足的较大的力。触觉异常性疼痛利用von Frey Hairs采用up-down法评估(Chaplan et al.，1994)。在第7，10，14，17和21天检测大鼠的改变的痛阈。Shams(n＝3)在检测过程中不显示不同的阈值(克)，而对于所用的von Frey Hairs，所有CCI大鼠与它们的基线值相比具有较低的阈值。神经胚素-1041mg/Kg(n＝8)和3mg/Kg(n＝7)治疗的大鼠与载体治疗的对照相比能承受的阈值升高(n＝8)。在op CCI(post-op CCI)之后17和21天，神经胚素治疗的动物承受的力具有统计学显著性(p＜.05)。热痛觉过敏在神经胚素治疗的CCI大鼠中减轻，在op后21天，剂量3mg/Kg显示高于剂量1mg/Kg的效力。热痛觉过敏利用Hargreaves装置测定以评估热撤退潜伏期(thermal withdrawal latency)。在第7，10，14，17和21天检测大鼠的爪撤退潜伏期(paw withdrawal latency)，发现其变短。检测过程中，Shams(n＝3)不显示改变的爪撤退潜伏期，而所有CCI大鼠与它们的基线值相比具有较短的爪撤退潜伏期。CCI诱导后的14，16和21天，神经胚素-1041mg/Kg(n＝8)和3mg/Kg(n＝7)治疗的大鼠与载体治疗的对照相比能承受施加时间更长的热刺激。在op后21天，虽然104氨基酸神经胚素3mg/Kg-治疗的大鼠与104氨基酸神经胚素1mg/Kg治疗的大鼠相比显示明显更长的潜伏期，神经胚素治疗的动物的爪撤退潜伏期的时间在op CCI后第14，17和21天具有统计学显著性(p＜.05)。
神经胚素治疗的CCI大鼠能将更多的重量加于受影响的慢性收缩的后腿，所述情况如残疾度(incapacitance)检测所见。利用残疾度计测定残疾程度以评估每只足的重量分布。在基线，大鼠将等同的重量分布在它们的每只足，但损伤后它们将较小的重量施加于身体同侧的足。检测期间，Shams(n＝4)不显示足之间的重量分布改变，而与它们的基线值相比，所有CCI大鼠将较小的重量施加于受影响的足。与载体处理的对照相比，104氨基酸神经胚素1mg/Kg(n＝8)和3mg/Kg(n＝7)治疗的大鼠将较多的重量施加于身体同侧的足(n＝8)。神经胚素处理的动物中受影响足的残疾度在op CCI之后第14，17和21天具有统计学显著性(p＜.05)。
神经胚素和载体治疗的CCI大鼠的冷异常性疼痛实验(cold allodyniatest)没有统计学明显的差异，神经胚素治疗的大鼠倾向于在第10天具有较短的持续期。冷异常性疼痛利用在4℃冷却的冷铜板在5分钟受试期的内测定。在第7，10，14，17和21天测定与其基线值相比大鼠的抬爪撤退期。在基线，没有动物对冷有反应。与其基线值相比，Shams(n＝3)在整个检测过程中不显示抬高的爪撤退持续期。与载体治疗的对照(n＝8)相比，在CCI诱导后第14，17和21天，104氨基酸神经胚素1mg/Kg(n＝8)和3mg/Kg(n＝7))治疗的小鼠抬高受影响爪的持续时间较短，但是神经胚素治疗的动物的爪撤退持续时间(duration of paw withdrawal)不具有统计学上显著性。
其它实施方案
虽然本发明根据其详细的说明书进行了描述，前述的说明意图说明而不是限制所附权利要求限定的本发明的范围。其它方面，优点以及修饰在权利要求的范围内。

Claims (14)

1.诱导变性的神经胚素蛋白折叠的方法，所述方法包括：
提供变性的神经胚素蛋白，其由SEQ ID NO：1的氨基酸残基108-220组成或由SEQ ID NO：1的氨基酸残基108-220的片段组成，所述片段含有SEQ ID NO：1的氨基酸残基117-220；和
使该神经胚素蛋白与有效诱导该蛋白折叠的量的重折叠缓冲液接触，其中所述重折叠缓冲液由以下组成(i)浓度50mM、pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.30M-0.5M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％-0.5％的吐温-80，和(v)浓度1mM-2mM的氧化型谷胱甘肽，以及(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
2.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液的L-精氨酸浓度为0.35M。
3.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液的吐温-80浓度为0.1％。
4.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液的氧化型谷胱甘肽浓度为1mM。
5.权利要求1的方法，其中所述重折叠缓冲液由以下物质组成(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.35M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％的吐温-80，(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
6.权利要求1的方法，还包含在利用所述重折叠缓冲液诱导折叠之前在细菌中表达所述神经胚素蛋白。
7.权利要求6的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
8.权利要求6的方法，其中所述神经胚素蛋白以不溶形式在细菌中表达，并且在利用重折叠缓冲液诱导折叠之前，使该不溶的神经胚素蛋白与使所述神经胚素蛋白变性的有效量的增溶缓冲液接触。
9.组合物，由浓度为所述浓度的1-10倍的以下组分组成：(i)浓度50mM，pH 7.8的磷酸钾；(ii)浓度0.5M的胍-HCl；(iii)浓度0.3M-0.5M的L-精氨酸；(iv)浓度0.1％-0.5％的吐温-80；和(v)浓度1mM-2mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
10.权利要求9的组合物，其中L-精氨酸浓度为0.35M的1-10倍。
11.权利要求9的组合物，其中吐温-80浓度为0.1％的1-10倍。
12.权利要求9的组合物，其中氧化型谷胱甘肽浓度为1mM的1-10倍。
13.权利要求9的组合物，由浓度为所述浓度的1-10倍的以下组分组成：(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.35M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％的吐温-80，(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
14.权利要求9的组合物，由以下组分组成：(i)浓度50mM，pH7.8的磷酸钾，(ii)浓度0.5M的胍-HCl，(iii)浓度0.35M的L-精氨酸，(iv)浓度0.1％的吐温-80，(v)浓度1mM的氧化型谷胱甘肽，和(vi)浓度0.2mM的还原型谷胱甘肽。
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