CN109097457A - 确定核酸样本中预定位点突变类型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了确定核酸样本中预定位点突变类型的方法。所述方法包括：(1)利用第一引物组对所述核酸样本进行扩增，以便获得含有所述预定位点至少一部分的第一扩增产物；(2)获得第一扩增产物的测序结果；(3)将所述测序读段与预先设置的第一参考序列集合进行比对；以及(4)基于步骤(3)中所得到的比对结果，确定所述预定位点的突变类型。利用本发明的方法可以准确地确定突变类型，捕获效率高，且可在一次实验中检测多个突变，从而提高检测效率，降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及确定核酸样本中预定位点突变类型的方法。
背景技术
基因变异包含单碱基突变、拷贝数变异、短序列的插入和删除以及长序列的插入和删除。虽然突变有不同的类型，但各种突变都可能会有对应的生物学功能。为了检测特定位点的基因分型结果，通常的方式是使用聚合酶链式反应对特定核苷酸片断进行指数级的扩增，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量分析。
然而，目前的检测方法主要涉及单碱基突变，无法检测短序列的插入和删除、拷贝数变异和长序列的插入和删除，且检测位置有限。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种确定核酸样本中预定位点突变类型的方法。利用本发明的方法可以准确地确定突变类型，即纯合突变或杂合突变，捕获效率高，且可在一次实验中检测多个突变，从而提高检测效率，降低检测成本。
本发明提出了一种确定核酸样本中预定位点突变类型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用第一引物组对所述核酸样本进行扩增，以便获得含有所述预定位点至少一部分的第一扩增产物；(2)获得第一扩增产物的测序结果；(3)将所述测序结果中测序读段与预先设置的第一参考序列集合进行比对；以及(4)基于步骤(3)中所得到的比对结果，确定所述预定位点的突变类型，其中，所述第一参考序列集合包括多个过滤序列，并且所述多个过滤序列的每一个对应所述预定位点的一种可能突变类型，所述过滤序列包括：第一基础序列，所述第一基础序列是由所述第一引物组在野生型核酸序列上限定得到的；第一变量序列，所述第一变量序列与所述预定位点对应，并且由选自所述预定位点可能突变类型之一的序列构成。利用本发明的方法可以准确地确定突变类型，即纯合突变或杂合突变，且可在一次实验中检测多个突变，从而提高检测效率，降低检测成本。
根据本发明的实施例，所述突变包括短序列的插入或删除、拷贝数变异、长序列的插入或删除或单碱基突变。
根据本发明的实施例，所述突变为长序列的插入或删除，并且在步骤(1)之前，预先包括：利用第二引物组对所述核酸样本进行扩增，以便获得第二扩增产物；以及基于所述第二扩增产物的长度，确定所述预定位点是否为下列的至少之一：仅具有突变型；仅具有野生型；和同时具有突变型和野生型。
根据本发明的实施例，所述过滤序列进一步包括：引物序列，所述引物序列是由所述第一引物组的引物序列确定的，并且所述引物序列设置在基础序列的两端。
根据本发明的实施例，在进行步骤(3)之前，预先基于所述第一引物组的序列，对所述测序读段进行分组，其中，将含有相同引物的至少部分序列的测序读段分在相同的组中。
根据本发明的实施例，所述至少部分序列为所述引物自5’端起前至少10bp的序列。根据本发明的优选实施例，所述至少部分序列为所述引物自5’端起前19bp的序列。
根据本发明的实施例，所述突变为短序列的插入或删除、拷贝数变异或单碱基突变，在步骤(4)中，进一步包括：(a)针对所述预定位点，确定所述预定位点对应的测序读段总数目；(b)针对所述预定位点所对应的各过滤序列，确定所述各过滤序列对应的测序读段数目；(c)基于所述各过滤序列对应的测序读段数目和所述预定位点对应的测序读段总数目，确定所述各过滤序列的支持比例；以及(d)基于所述支持比例，确定所述预定位点的突变类型。
根据本发明的实施例，在步骤(d)中包括：当存在支持比例超过90％的单一过滤序列时，确定所述预定位点为由所述单一过滤序列对应的突变类型构成的纯合突变；当存在支持比例均超过10％的两种过滤序列时，确定所述预定位点为由所述两种过滤序列对应的突变类型构成的杂合突变。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：(i)分别获得所述第一扩增产物的测序结果和所述第二扩增产物的测序结果；(ii)将所述第一扩增产物和第二扩增产物的测序结果分别与预先设置的第一和第二参考序列集合进行比对，以便获得所述第一扩增产物对应的测序读段数目和所述第二扩增产物对应的测序读段数目；以及(iii)基于所述第一扩增产物对应的测序读段数目和所述第二扩增产物对应的测序读段数目，确定所述预定位点的突变类型，其中，所述第二参考序列集合包括多个过滤序列，并且所述多个过滤序列的每一个对应所述预定位点的一种可能突变类型，所述过滤序列进一步包括：第二基础序列，所述第二基础序列是由所述第二引物组在野生型核酸序列上限定得到的；第二变量序列，所述第二变量序列与所述预定位点对应，并且由选自所述预定位点可能突变类型之一的序列构成。
根据本发明的实施例，在步骤(iii)中，当所述第一扩增产物对应的测序读段数目和所述第二扩增产物对应的测序读段数目均超过10条，则确定所述预定位点同时具有野生型和突变型；当仅所述第一扩增产物对应的测序读段数目超过10条，则确定所述预定位点仅存在突变型；当仅所述第二扩增产物对应的测序读段数目超过10条，则确定所述预定位点仅存在野生型。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的确定核酸样本中预定位点突变类型的方法的流程示意图；以及
图2显示了根据本发明一个实施例的不同长度PCR产物的荧光定量图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了确定核酸样本中预定位点突变类型的方法，下面将对其进行详细描述。
根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：
S100扩增
在该步骤中，利用第一引物组对核酸样本进行扩增，以便获得含有预定位点至少一部分的第一扩增产物。
根据本发明的实施例，突变包括短序列的插入或删除、拷贝数变异、长序列的插入或删除或单碱基突变。
需要说明的是，本发明所使用的术语“短序列”主要是指不超过100bp的序列，“长序列”主要是指大于100bp的序列，拷贝数变异主要指拷贝数重复总长度不超过100bp的突变。
S200测序
在该步骤中，基于第一扩增产物构建测序文库，并对测序文库进行测序，以便获得第一扩增产物的测序结果。
S300比对
在该步骤中，将测序结果中测序读段与预先设置的第一参考序列集合进行比对。
根据本发明的实施例，第一参考序列集合包括多个过滤序列，并且多个过滤序列的每一个对应预定位点的一种可能突变类型，过滤序列包括：第一基础序列，第一基础序列是由第一引物组在野生型核酸序列上限定得到的；第一变量序列，第一变量序列与预定位点对应，并且由选自预定位点可能突变类型之一的序列构成。
具体地，
(1)针对单碱基突变：若引物为从3’端到5’端，选取扩增产物序列减去引物序列后的一段序列作为候选过滤序列。接着，查询候选过滤序列上是否存在已知的单碱基突变，如果没有单碱基突变，则该候选过滤序列即为构成第一参考序列集合的过滤序列。如果存在已知的突变，则通过穷举法列出候选过滤序列上所有可能的突变组合，将候选过滤序列上突变位置上的碱基型进行相应的替换，替换后会由一条序列生成多条序列，该多条序列即构成第一参考序列集合的过滤序列。若引物为从5’端到3’端，扩增产物序列减去与引物序列反向互补的序列后的一段序列作为候选过滤序列。后续确定过滤序列的方法与前面3’端到5’端引物的确定方法相同。
(2)针对短序列的插入、删除突变和拷贝数变异：构建过滤序列的方法与(1)相似，先按照引物从3’端到5’端还是相反，选取候选过滤序列。之后根据已知的插入/删除序列，将之前候选过滤序列中相应的碱基插入/删除，以便得到过滤序列。
根据本发明的实施例，过滤序列进一步包括：引物序列，引物序列是由第一引物组的引物序列确定的，并且引物序列设置在基础序列的两端。该引物序列可以视作标签，便于后续比对。
根据本发明的实施例，在进行步骤S300之前，预先基于第一引物组的序列，对测序读段进行分组，其中，将含有相同引物的至少部分序列的测序读段分在相同的组中。根据本发明的具体实施例，至少部分序列为引物自5’端起前至少10bp的序列。根据本发明的优选实施例，至少部分序列为引物自5’端起前19bp的序列。使用每一条引物序列的前19bp作为该引物的代表kmer，使用Linux系统命令grep从测序结果中搜索以代表kmer为开始的序列，作为各个引物对应的序列集合。
S400确定预定位点的突变类型
在该步骤中，基于步骤S300中所得到的比对结果，确定预定位点的突变类型。
根据本发明的实施例，在步骤S400中，基于各过滤序列的支持测序读段数，确定预定位点的突变类型。
根据本发明的实施例，突变为短序列的插入或删除、拷贝数变异或单碱基突变，在步骤S400中，进一步包括：(a)针对预定位点，确定预定位点对应的测序读段总数目；(b) 针对预定位点所对应的各过滤序列，确定各过滤序列对应的测序读段数目；(c)基于各过滤序列对应的测序读段数目和预定位点对应的测序读段总数目，确定各过滤序列的支持比例；以及(d)基于支持比例，确定预定位点的突变类型。
根据本发明的具体实施例，在步骤(d)中包括：当存在支持比例超过90％的单一过滤序列时，确定预定位点为由单一过滤序列对应的突变类型构成的纯合突变；当存在支持比例均超过10％的两种过滤序列时，确定预定位点为由两种过滤序列对应的突变类型构成的杂合突变。
对于第一引物组中的每一对引物，将参考序列与经分组的与该引物对应的测序读段集合进行序列比对，根据计算出的结果，取出错配的序列以及测序错误导致的不完全匹配的序列。若得到的序列数目小于50条，则表明该位点因测序深度过低无法得出准确结果；若支持比例超过90％的单一过滤序列，则确定预定位点为由单一过滤序列对应的突变类型构成的纯合突变；若支持比例均超过10％的两种过滤序列，则确定预定位点为由两种过滤序列对应的突变类型构成的杂合突变。
由于可能的插入或删除的序列导致的PCR产物的长度不同，而不同长度的PCR产物有着不同的反应效率，从而使得上述判定方法只适合长度小于100bp的突变。对于长度大于100bp的插入删除类突变，需要使用接下来描述的判定方案。
根据本发明的实施例，突变为长序列的插入或删除，并且在步骤S100之前，预先包括：利用第二引物组对核酸样本进行扩增，以便获得第二扩增产物；以及基于第二扩增产物的长度，确定预定位点是否为下列的至少之一：仅具有突变型；仅具有野生型；和同时具有突变型和野生型。
根据本发明的具体实施例，突变为长序列的插入或删除，并且在步骤S100之前，预先进一步包括：(i)分别获得第一扩增产物的测序结果和第二扩增产物的测序结果；(ii)将第一扩增产物和第二扩增产物的测序结果分别与预先设置的第一和第二参考序列集合进行比对，以便获得第一扩增产物对应的测序读段数目和第二扩增产物对应的测序读段数目；以及(iii)基于第一扩增产物对应的测序读段数目和第二扩增产物对应的测序读段数目，确定预定位点的突变类型，其中，所述第二参考序列集合包括多个过滤序列，并且多个过滤序列的每一个对应预定位点的一种可能突变类型，过滤序列进一步包括：第二基础序列，第二基础序列是由第二引物组在野生型核酸序列上限定得到的；第二变量序列，所述第二变量序列与所述预定位点对应，并且由选自所述预定位点可能突变类型之一的序列构成。
根据本发明具体实施例，在步骤(iii)中，当第一扩增产物对应的测序读段数目和第二扩增产物对应的测序读段数目均超过10条，则确定预定位点同时具有野生型和突变型；当仅第一扩增产物对应的测序读段数目超过10条，则确定预定位点仅存在突变型；当仅第二扩增产物对应的测序读段数目超过10条，则确定预定位点仅存在野生型。
具体地，引物设计时，第二组引物分别设计在发生突变序列前方100bp之内以及突变序列开始后的500bp之内。如果该引物能够被PCR扩增，则说明待检测样本中包含野生型序列。第一组引物分别设计在发生突变序列前方100bp之内以及突变序列结束后的500bp之内。如果第一组引物可以被检测到，且与第二基础序列相比长度差别较大，则说明待检测样本包含突变型序列。为排除样本污染，需要测序检测到的read条数超过10条才会宣称待检测样本为野生型或突变型。如果待检测样本只有第二组引物检测read数超过10条，则待检测样本为纯和野生型；如待检测样本只有第一组引物检测read数超过10条，则待检测样本为纯合突变；如果检测样本第一及第二组引物检测read数都超过10条，则待检测样本为杂合突变。如果检测样本第一及第二组引物检测read数都没有超过10条，则待检测样本因实验失败而无法检测该突变。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法确定预定位点突变类型。
1、采集8只宠物狗的唾液，唾液采样器用的是PerformagenePG-100采样试剂盒，提取试剂盒是PG-AC4试剂盒(品牌DNA Genotek,货号PG-100)，按照试剂盒说明书进行操作，最后将DNA溶于40μL TE溶液。引物序列见表1。
表1
通过第一轮多重pcr扩增建库，反应体系见表2，反应温度见表3。
表2
注：引物混合物指的是表1中所有引物的混合物
表3
反应完成后使用30μL Ampure XP磁珠进行纯化，22μL TE缓冲液溶解回收产物，产物进行第二轮PCR反应。
2、第二轮引入标签接头PCR反应，反应体系如表4，反应引物见表5，标签引物R为标签引物1-8的混合物，每种标签引物的序列的浓度为20μM，反应温度如表6。
表4
表5
表6
3、磁珠纯化流程：
将上述PCR产物转移至1.5mL EP管中，
1)加入室温下平衡30min以上的xp磁珠，涡旋混匀后静置5min；
2)短暂离心后置于磁力架上，待液体澄清后，吸弃所有液体；
3)加入200μL 75％的乙醇溶液后涡旋震荡；
4)短暂离心后置于磁力架上，吸弃所有液体；
5)重复步骤3)和4)一次；
6)37℃干燥磁珠；
7)加入40μL Buffer TE，涡旋震荡后静置5min；
8)短暂离心，将反应液置于磁力架上，待液体澄清后，吸取DNA溶液转移至新的EP管；
9)取1μL样品进行Qubit定量。
Qubit定量：199μl缓冲液+1μl染料。
4、PCR样本进行单链环化：
将8个带有不同标签序列的宠物狗扩增产物各取20ng进行混合，用TE配置成48μL体系，加入5μL 20μM介导片段，混匀。将反应体系置于95℃孵育3min，立马置于冰上。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端，其序列如下：(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端)。GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO：5)。
配制如下表7的反应体系：
表7
| 组分 | 用量 |
| 10×TA缓冲液(Epicentre公司) | 6μL |
| 三磷酸腺苷(100mM) | 0.6μL |
| T4DNA连接酶(快速)(600U/μL)(Enzymatics公司) | 0.2μL |
| 总体积 | 6.8μL |
按照表7反应体系加入纯化的产物中，混匀，置于37℃孵育30min。
5、根据BGISEQ-500的文库构建要求进行文库构建，构建好的文库经浓度检测合格后利用BGISEQ-500测序仪测序。
测序：取构建的单链环状DNA文库进行DNA纳米球制备、BGISEQ-500上机测序。测序过程严格按照BGISEQ-500的标准操作流程进行上机操作。其中表3的PCR产物2100 检测结果如图2所示。使用BGI-Seq 500测序，测序类型为SE100。每个样本测序得出的原始read数为表8所示。
表8
| 样本编号 | pcr Read数 |
| C9 | 9412318 |
| C15 | 10433744 |
| C17 | 10107323 |
| C50 | 11184140 |
| C65 | 7365550 |
| C92 | 9215597 |
| C94 | 8344256 |
| C95 | 14722398 |
按照下列分析方法分析待检测位点的基因型：
1、针对短序列的插入或删除、拷贝数变异或单碱基突变
(1)针对单碱基突变：若引物为从3’端到5’端，选取扩增产物序列减去引物序列后的一段序列作为候选过滤序列。接着，查询候选过滤序列上是否存在已知的单碱基突变，如果没有单碱基突变，则该候选过滤序列即为构成第一参考序列集合的过滤序列。如果存在已知的突变，则通过穷举法列出候选过滤序列上所有可能的突变组合，将候选过滤序列上突变位置上的碱基型进行相应的替换，替换后会由一条序列生成多条序列，该多条序列即构成过滤序列。若引物为从5’端到3’端，扩增产物序列减去与引物序列反向互补的序列后的一段序列作为候选过滤序列。后续确定过滤序列的方法与前面3’端到5’端引物的确定方法相同。
针对短序列的插入、删除突变和拷贝数变异：构建过滤序列的方法与(1)相似，先按照引物从3’端到5’端还是相反，选取候选过滤序列。之后根据已知的插入/删除序列，将之前候选过滤序列中相应的碱基插入/删除，以便得到过滤序列。
(2)以引物5’端的前19bp作为该引物的代表kmer，从测序得出的read中，使用Linux 系统命令grep搜索以代表kmer开始的read，作为各个引物对应的read集；
(3)对于每一对引物，将引物序列和每一条过滤序列分别拼接起来，作为一组参考序列。将read集中逐个取出read，使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)与参考序列进行比对，根据计算出的分值，去除错配的read以及因测序错误导致的不完全匹配的read。
(4)计算经过步骤(3)过滤出的read个数，若read数目小于50条，则声明该位点因测序深度过低无法得出准确结果。统计突变位点上各过滤序列对应的测序读段数目和突变对应的测序读段总数目，确定各顾虑序列的支持比例：
当存在支持比例超过90％的单一过滤序列时，确定突变位点为由单一过滤序列对应的突变类型构成的纯合突变；当存在支持比例均超过10％的两种过滤序列时，确定突变位点为由两种过滤序列对应的突变类型构成的杂合突变。
2、针对长序列的插入或删除
(i)分别设计两组引物，第一组引物分别设计在发生突变序列前方100bp之内以及突变序列结束后的500bp之内。如果第一组引物扩增能够被PCR扩增，得到第一扩增产物，且与野生型序列相比长度差别较大，则说明待检测样本包含突变型序列。
第二组引物分别设计在发生突变序列前方100bp之内以及突变序列开始后的500bp之内。如果第二组引物扩增能够被PCR扩增，得到第二扩增产物，则说明待检测样本中包含野生型序列。
(ii)按照上述针对短序列的插入或删除的步骤(1)～(3)进行，获得过滤后的read数。
当第一扩增产物对应的read数和第二扩增产物对应的read数均超过10条，则确定突变位点为杂合突变；当仅第一扩增产物对应的read数超过10条，则确定突变位点为纯合突变；当仅第二扩增产物对应的read数超过10条，则确定突变位点仅存在野生型。
编号C96的样本的检测结果，其中W指野生型，M指突变型，用来标注非单碱基突变。对于单碱基突变，结果使用ACGT的碱基类型来表示，结果见表9所示。将得出的基因分型中单碱基突变与同一批样本的25层全基因组测序之后进行变异检测的结果相比，两者的一致性为100％。从而表明本发明的方法能够准确地鉴定出突变位点的突变类型。
表9
| 样品 | 突变类型 | 样品 | 突变类型 |
| C96.csv L5 | CC | C96.csv L2 | TT |
| C96.csv S1 | WM | C96.csv MUS_4 | CC |
| C96.csv CLI_1 | WW | C96.csv S2 | WM |
| C96.csv T | GG | C96.csv M | WM |
| C96.csv A1 | GG | C96.csv C | CC |
| C96.csv BLO_12 | AA | C96.csv B2 | CT |
| C96.csv K | MM | C96.csv B1 | TT |
| C96.csv A2 | CC | C96.csv BRA_14 | AA |
| C96.csv E1 | GA | C96.csv BLO_6 | CC |
| C96.csv EYE_9 | CC | C96.csv KID_5 | GG |
| C96.csv L5 | CC | C96.csv BLO_4 | GG |
| C96.csv S1 | WM | C96.csv EAR | AA |
| C96.csv CLI_1 | WW | C96.csv A3 | WM |
| C96.csv T | GG | C96.csv E2 | TC |
| C96.csv A1 | GG | C96.csv D | GA |
| C96.csv BLO_12 | AA | C96.csv L3 | WW |
| C96.csv K | MM | C96.csv BLO_11 | MM |
| C96.csv A2 | CC | C96.csv L4 | WW |
| C96.csv E1 | GA | C96.csv L1 | TT |
| C96.csv EYE_9 | CC | C96.csv BRA_9 | GG |
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因研究院
<120> 确定核酸样本中预定位点突变类型的方法
<130> PIDC3171091
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 1
ccttttctgc aagtgactgc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 2
tgaccccttc atctacgcct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 3
agttctgaaa gacgcagcca c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 4
taagaggcag cacttcatcc c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 5
ttttcacact ttacaacgct ccc 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 6
agctttccgg cacgttctgt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 7
cccctgtggt catgaagtcc a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 8
ccggggactt gcagctgttg 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 9
atcccttgta tgtgattagt agctt 25
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 10
aatttcagga agatggtcag gta 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 11
tcaattccca agagagtgtg c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 12
gctatcactg cctcacacct 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctggaaatgt ggctagacca a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 14
taccttccac tgtgtttcgg a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 15
cttcccctgt aggaccggag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctgcacccat caccgtggac 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 17
ccagtgggtg ctaccacg 18
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 18
ggctttcctt gtccattgct aatc 24
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 19
gcttgcttga ttggctattt agaaac 26
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 20
gctggagtaa gaccctaaac cc 22
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 21
ggggaattga taccaatatt gaagac 26
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 22
gcactataaa caaggtatcc cgaga 25
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 23
ccagtggagc ccctcg 16
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 24
gagcaactta cttaacatat tggctt 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 25
gaattcacca tgatttatag aggagt 26
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 26
tggttctact tacacttgca t 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 27
acagctataa cacctacgcc tc 22
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 28
tccagctgct tgaaccttg 19
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 29
cccacttatc aaaccgttgg ac 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 30
ttcttgcagt tgttcagatc cag 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 31
aacccagaga gtgacgatca gg 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 32
tcaaggagct caccaacgag a 21
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 33
acccagtgat tcctttacga gatc 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 34
tgcgtgcact agagtcgtac c 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 35
gctggttctc cctgacccac 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 36
atgcaggaca ctccatcgtc t 21
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 37
gcataattag tccatcaaac cgaga 25
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 38
cctgacccga tattactcaa gc 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 39
catctcatcc ctaccatgta cc 22
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 40
cccctgaatt ccagatgtat gcaa 24
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 41
acatccaggt ggtgcccatc 20
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 42
gaaaacaagg cactctaaag accg 24
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 43
tgtgcttttc tttgactgaa ggg 23
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 44
ggctgacctt agtaatccta ttgac 25
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 45
tgctggacca aatttcagtg t 21
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 46
atgaagtttc tttgcctcag gtt 23
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 47
aaacctctaa gatcagtgcc acaa 24
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 48
gcaaactatc catgaaactg tgcta 25
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 49
atcagcttct cacggttgga c 21
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 50
tgaccccact aatcagcttg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 51
cgtgctcccc atgtacctga 20
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 52
gcaggactca cctccaaata ccc 23
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 53
tgtaggtagg gtgtgcccat 20
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 54
aggctctccg acccact 17
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 55
agtatacata tcacaacacc gtgga 25
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 56
tgctcccagg cataagtca 19
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 57
ggaataaaag ctgttaatcg ccact 25
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 58
tgctcccagg cataagtca 19
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 59
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 60
tgtgagccaa ggagttggca caataatttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 61
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 61
tgtgagccaa ggagttgctg cttgctgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 62
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 62
tgtgagccaa ggagttgtgg aagtgccttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 63
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 63
tgtgagccaa ggagttgtaa aagtttattg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 64
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 64
tgtgagccaa ggagttgttc ctgagtattg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 65
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 65
tgtgagccaa ggagttgtgg gcttggattg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 66
tgtgagccaa ggagttgact ggtgagattg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 67
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 67
tgtgagccaa ggagttggtt ttcctaattg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 68
gccatgtcgt tctgtgagcc aagg 24
Claims (10)
1.一种确定核酸样本中预定位点突变类型的方法，其特征在于，包括：
(1)利用第一引物组对所述核酸样本进行扩增，以便获得含有所述预定位点至少一部分的第一扩增产物；
(2)获得第一扩增产物的测序结果；
(3)将所述测序结果中测序读段与预先设置的第一参考序列集合进行比对；以及
(4)基于步骤(3)中所得到的比对结果，确定所述预定位点的突变类型，
其中，
所述第一参考序列集合包括多个过滤序列，并且所述多个过滤序列的每一个对应所述预定位点的一种可能突变类型，所述过滤序列包括：
第一基础序列，所述第一基础序列是由所述第一引物组在野生型核酸序列上限定得到的；
第一变量序列，所述第一变量序列与所述预定位点对应，并且由选自所述预定位点可能突变类型之一的序列构成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变包括短序列的插入或删除、拷贝数变异、长序列的插入或删除或单碱基突变。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤序列进一步包括：引物序列，所述引物序列是由所述第一引物组的引物序列确定的，并且所述引物序列设置在基础序列的两端。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行步骤(3)之前，预先基于所述第一引物组的序列，对所述测序读段进行分组，其中，将含有相同引物的至少部分序列的测序读段分在相同的组中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少部分序列为所述引物自5’端起前至少10bp的序列，
优选地，所述至少部分序列为所述引物自5’端起前19bp的序列。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变为短序列的插入或删除、拷贝数变异或单碱基突变，在步骤(4)中，进一步包括：
(a)针对所述预定位点，确定所述预定位点对应的测序读段总数目；
(b)针对所述预定位点所对应的各过滤序列，确定所述各过滤序列对应的测序读段数目；
(c)基于所述各过滤序列对应的测序读段数目和所述预定位点对应的测序读段总数目，确定所述各过滤序列的支持比例；以及
(d)基于所述支持比例，确定所述预定位点的突变类型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中包括：
当存在支持比例超过90％的单一过滤序列时，确定所述预定位点为由所述单一过滤序列对应的突变类型构成的纯合突变；
当存在支持比例均超过10％的两种过滤序列时，确定所述预定位点为由所述两种过滤序列对应的突变类型构成的杂合突变。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变为长序列的插入或删除，并且在步骤(1)之前，预先包括：
利用第二引物组对所述核酸样本进行扩增，以便获得第二扩增产物；以及
基于所述第二扩增产物的长度，确定所述预定位点是否为下列的至少之一：
仅具有突变型；
仅具有野生型；和
同时具有突变型和野生型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(i)分别获得所述第一扩增产物的测序结果和所述第二扩增产物的测序结果；
(ii)将所述第一扩增产物和第二扩增产物的测序结果分别与预先设置的第一和第二参考序列集合进行比对，以便获得所述第一扩增产物对应的测序读段数目和所述第二扩增产物对应的测序读段数目；以及
(iii)基于所述第一扩增产物对应的测序读段数目和所述第二扩增产物对应的测序读段数目，确定所述预定位点的突变类型，
其中，
所述第二参考序列集合包括多个过滤序列，并且所述多个过滤序列的每一个对应所述预定位点的一种可能突变类型，所述过滤序列进一步包括：
第二基础序列，所述第二基础序列是由所述第二引物组在野生型核酸序列上限定得到的；
第二变量序列，所述第二变量序列与所述预定位点对应，并且由选自所述预定位点可能突变类型之一的序列构成。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(iii)中，
当所述第一扩增产物对应的测序读段数目和所述第二扩增产物对应的测序读段数目均超过10条，则确定所述预定位点同时具有野生型和突变型；
当仅所述第一扩增产物对应的测序读段数目超过10条，则确定所述预定位点仅存在突变型；
当仅所述第二扩增产物对应的测序读段数目超过10条，则确定所述预定位点仅存在野生型。
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