CN108893556A - 一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)在ARF基因中筛选出参与正向调控植物类黄酮生物合成的候选基因；(2)验证候选基因对生物合成植物类黄酮的作用，最终确定出目标基因。本发明的优点在于，综合利用分子生物学、遗传学和代谢物分析的研究方法，确定At5g62000基因在黄酮醇和原花色素(类黄酮代谢产物)生物合成途径中调控的靶基因和关键的转录因子，阐明生长素调控类黄酮生物合成的基因网络。这为利用该基因来培育具有更高含量的原花色素和黄酮醇的植物品种提供了可能。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法。
背景技术
类黄酮化合物是广泛存在于植物中的一大类具有重要活性的次生代谢产物。类黄酮在植物的生长、发育和繁殖过程中起着重要作用；同时，它们还参与调控植物的生物和非生物逆境胁迫；除此之外，它们还具有抗炎、抗癌和预防心脑血管疾病等有益于人类健康的功效。生长素参与调控类黄酮的生物合成，调节类黄酮代谢途径的多个结构基因和转录因子。使用生长素IAA处理拟南芥时，类黄酮生物合成途径中的关键结构基因CHS、CHI、F3’H和FLS，以及转录因子PAP1、TTG1和MYB12等基因的表达水平显著上升。虽然生长素可以调节类黄酮的生物合成，但是调节的机理还不清楚。目前的研究表明，ARF基因家族是连接生长素受体和类黄酮途径转录因子的重要中间桥梁。ARF转录因子家族包括23个成员，目前还没有明确的证据阐明究竟具体哪些ARF基因参与了生长素调控类黄酮的生物合成，这对生物合成植物类黄酮技术领域来说，造成了发展的瓶颈。
发明内容
为了解决现有技术中无法明确在参与植物类黄酮生物合成过程中具体有哪些ARF基因的问题，本发明提供了一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，实现的目的为，能够准确的确定出具体的ARF家族中哪些基因具有正向调控生物合成植物类黄酮的作用，阐明了生长素调控类黄酮生物合成的基因网络，为利用检测出来的基因来培育具有更高含量的类黄酮化合物的植物品种提供了可能。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明提供的一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，包括如下步骤：
(1)在ARF基因中筛选出参与正向调控植物类黄酮生物合成的候选基因：分析植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，再分析所有ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，将所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因与ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式进行比对，结合ARF基因的进化关系分析，筛选出ARF基因中基因表达模式与所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因表达一致的候选基因；
(2)验证候选基因对生物合成植物类黄酮的作用，最终确定出目标基因：分别检测出包含有所述候选基因T-DNA插入纯合突变体植物中类黄酮代谢产物花青素、黄酮醇、原花色素的含量，将检测出的花青素、黄酮醇、原花色素含量与野生型植物的含量比对，候选基因T-DNA插入纯合突变体植物中类黄酮代谢产物含量低于野生型植物水平的，该候选基因即为目标基因，即为具有正向调控生物合成植物类黄酮作用的基因。
进一步的，所述植物为拟南芥。
采用本发明方法检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，操作简便、缩短了检测时间，因为参与生物合成植物类黄酮ARF基因家族总共有23个成员，再加上许多基因都有共同调节的作用，因此无法快速、准确地确定出真正参与正向调控生物合成植物类黄酮作用的都有哪些基因，本发明提供的方法先根据现有技术的研究结果：拟南芥中类黄酮主要在种皮中积累。因此，本发明通过首先分析类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因等在种皮发育过程中的基因表达模式，以及ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，先从大范围内的ARF家族基因中缩小筛选范围，使整个检测时间用时最少，结果又最为准确。
进一步的，该方法还包括步骤(3)验证目标基因正向调控生物合成类黄酮的作用：采用qRT-PCR的方法分析类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因被目标基因影响表达的情况，所述关键结构基因和转录调控基因的基因表达水平在目标基因突变体中显著下降，在目标基因过量表达株系中显著增加，则目标基因正调控所述关键结构基因和转录调控基因的基因表达水平，从而验证出，目标基因正调控类黄酮的生物合成。为了保证本发明方法的准确性，本发明方法步骤中具体采用通过基因表达水平方式来对最终筛选出来的目的基因进行验证，使检测结果更为可靠。
进一步的，所述步骤(1)中将所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因与ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式进行比对后，分析ARF基因进化关系，从而得到所有的候选基因。增加的此步骤，有效防止在筛选时会遗漏参与植物类黄酮生物合成的基因。
进一步的，所述步骤(2)中目标基因为At5g62000。经过本发明检测方法发现，拟南芥中At5g62000基因是唯一正向调节植物类黄酮生物合成的生长素反应因子。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果，综合利用分子生物学、遗传学和代谢物分析的研究方法，确定At5g62000基因在黄酮醇和原花色素(类黄酮代谢产物)生物合成途径中调控的靶基因和关键的转录因子，阐明生长素调控类黄酮生物合成的基因网络。在解析At5g62000调控原花色素和黄酮醇生物合成的分子机制的基础上，利用基因工程的手段，过量表达At5g62000(ARF2)基因从而增加原花色素和黄酮醇的积累。这为利用该基因来培育具有更高含量的原花色素和黄酮醇的植物品种提供了可能。
附图说明
图1为本发明实施例一中ARF2基因在种皮发育过程中的基因表达水平图标，图中，The expression level of ARF2:ARF2的基因表达水平；seed coat pre-globular stage:球形胚之前时期的种皮；seed coat globular stage:球形胚时期的种皮；seed coatheart stage:心形胚时期的种皮；seed coat linear-cotyledon stage:鱼雷胚时期的种皮seed coat mature green stage:成熟胚时期种皮。
图2为本发明实施例一中ARF基因的进化关系图谱。
图3为本发明实施例一中ARF2基因正调控成熟种子中黄酮醇的含量，图中，Relative level of flavonols:黄酮醇的相对含量；mature seed:成熟种子；Q:槲皮素；K:山奈酚；Q+K:槲皮素和山奈酚之和；Col野生型中的含量作为1；ARF2 OE-1:ARF2基因过量表达株系1；ARF2 OE-2:ARF2基因过量表达株系2。
图4为发明实施例一中其他ARF基因不调控成熟种子中黄酮醇的含量，图中，Relative level of flavonols:黄酮醇的相对含量，Col野生型中的含量作为1，Q:槲皮素；K:山奈酚；Q+K:槲皮素和山奈酚之和。
图5为发明实施例一中ARF2基因正调控植物中可溶单宁的含量，图中，Relativelevel of proanthocyanidins:原花色素的相对含量；Non-extractable PAs:不可溶单宁；Extractable PAs by DMACA:采用DMACA法测定的可溶单宁；Extractable PAs byButanol:采用Butanol法测定的可溶单宁。Col野生型中的含量作为1；ARF2 OE-1:ARF2基因过量表达株系1；ARF2 OE-2:ARF2基因过量表达株系2。
图6为本发明实施例一中其他ARF基因不调控植物中可溶单宁的含量，图中，Relative level of proanthocyanidins:原花色素的相对含量；Non-extractable PAs:不可溶单宁；Extractable PAs by DMACA:采用DMACA法测定的可溶单宁；Extractable PAsby Butanol:采用Butanol法测定的可溶单宁。Col野生型中的含量作为1。
图7为本发明实施例一ARF2基因不调控植物中花青素的含量，图中，Relativelevel of anthocyanins:花青素的相对含量；4-day-old seedlings:4天的苗；17-day-oldseedlings:17天的苗。Col野生型中的含量作为1；ARF2 OE-1:ARF2基因过量表达株系1；ARF2 OE-2:ARF2基因过量表达株系2。
图8为本发明实施例一中arf2-8突变体拟南芥与野生型拟南芥中类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因等在种皮发育过程中的基因表达水平对比图。
图9为本发明实施例一中ARF2基因过量表达株系1与野生型拟南芥中类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因等在种皮发育过程中的基因表达水平对比图，图中，ARF2 OE-1:ARF2基因过量表达株系1。
图10为本发明实施例一中ARF2转录激活的类黄酮生物合成途径中结构基因和转录调控基因的启动子驱动的荧光素酶的相对活性水平的柱形图，图中，Relativeluciferase activity:相对荧光素酶的活性；early common genes:黄酮醇和原花色素生物合成的早期共同基因；flavonol specific genes:黄酮醇生物合成途径特异的基因；PAspecific structural genes and transportation regulator:单宁(原花色素)生物合成途径中特异的结构基因和转运调控基因；MBW complexes genes:MBW三元复合物的基因；other PA specific genes:其它的单宁(原花色素)特异的基因。Control为对照，它的荧光素酶活性水平作为1。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做出进一步的说明。
实施例一：本发明所述植物为拟南芥。
本发明公开的一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，包括如下步骤：
(1)在ARF基因中筛选出参与正向调控植物类黄酮生物合成的候选基因：分析植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，再分析所有ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，将所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因与ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式进行比对，结合ARF基因的进化关系分析，筛选出ARF基因中基因表达模式与所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因表达一致的候选基因；植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式高度相似：在种皮发育的早期，这些基因的表达都维持在一个相对高的水平；在心型期之后，它们的基因表达水平逐渐下降；ARF基因家族在植物种皮发育过程中的基因表达模式分析发现：ARF2(At5g62000)、ARF3、ARF5、ARF7、ARF10和ARF17在种皮发育阶段的基因表达水平较高，可能参与生长素调控类黄酮的生物合成；如图1所示，ARF2基因在种皮发育过程中的基因表达水平，也能够看出与关键结构基因和转录调控基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式相同，也能说明ARF2基因是参与植物类黄酮生物合成的其中一种生长素反应因子；
所述步骤(1)中将所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因与ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式进行比对后，分析ARF基因进化关系，如图2所示，ARF1、ARF11和ARF18与ARF2有较高的相似性，所以防止有遗漏的，由此得到所有的候选基因。
(2)验证候选基因对生物合成植物类黄酮的作用，最终确定出目标基因：分别检测出包含有所述候选基因T-DNA插入纯合突变体植物中类黄酮代谢产物花青素、黄酮醇、原花色素的含量，将检测出的花青素、黄酮醇、原花色素含量与野生型植物的含量比对，候选基因T-DNA插入纯合突变体植物中类黄酮代谢产物含量低于野生型植物水平的，该候选基因即为目标基因，即为具有正向调控生物合成植物类黄酮作用的基因。所述候选基因的插入突变体可从市场上购买得到，例如，我们从NASC(The European Arabidopsis StockCentre)购买了9个ARF基因的T-DNA插入突变体，arf1(SALK_027821)、arf2-6(CS24600)、arf2-7(CS24601)、arf2-8(CS24602)、arf3-1(CS24603)、arf5-1(SALK_023812)、arf7-1(SALK_040394)、arf10-1(CS24611)、arf11-1(CS24612)、arf17(SALK_062511C)和arf18(CS467029),其中arf1、arf5-1、arf7-1和arf18为杂合突变体，其余均为纯合突变体。为了筛选鉴定出arf1、arf5-1、arf7-1和arf18的纯合突变体，我们根据T-DNA引物设计网站，设计用于鉴定纯合突变体的PCR引物(arf1正向引物见SEQ ID NO.1；arf1反向引物见SEQ IDNO.2；arf5-1正向引物见SEQ ID NO.3；arf5-1反向引物见SEQ ID NO.4；arf7-1正向引物见SEQ ID NO.5；arf7-1反向引物见SEQ ID NO.6；LBb1.3引物为arf1、arf5-1和arf7-1特异的T-DNA引物见SEQ ID NO.7；arf18正向引物见SEQ ID NO.8；arf18反向引物见SEQ ID NO.9；o8474引物为arf18特异的T-DNA引物见SEQ ID NO.10。经过大量的DNA提取和PCR实验，我们获得了这4个突变体的T-DNA插入纯合突变体。
如图3、图4、图5、图6、图7所见，发现只有arf2-6、arf2-7和arf2-8突变体中黄酮醇和原花色素的含量与野生型相比显著地下降，而其它的均与野生型没有显著差异；过量表达ARF2基因的株系中黄酮醇和原花色素的含量显著地高于野生型的水平。这些结果表明，ARF2是唯一参与调控原花色素和黄酮醇生物合成的生长素反应因子。
该方法还包括步骤(3)验证目标基因正向调控生物合成类黄酮的作用：采用qRT-PCR的方法分析类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因被目标基因影响表达的情况，所述关键结构基因和转录调控基因的基因表达水平在目标基因突变体中显著下降，在目标基因过量表达株系中显著增加，则目标基因正调控所述关键结构基因和转录调控基因的基因表达水平，从而验证出，目标基因正调控类黄酮的生物合成。如图8和图9所示，F3’H、FLS、MYB11、MYB12、ANS、ANR、TT12、TT19、TT2、GL3、TT15和TT16基因的表达水平在arf2突变体中显著下降，在过量表达株系中显著增加，因此，ARF2正调控这些基因的表达水平，从而正调控原花色素和黄酮醇的生物合成。
为了验证本发明的检测方法的准确性，还可以通过潜在靶基因进行验证，因为生长素反应因子一般是通过蛋白结合到靶基因启动子区的AuxREs顺式作用元件，调控其靶基因的表达。因此，我们分析了类黄酮生物合成途径中总共29个基因启动子区含有的AuxREs顺式作用元件数目，发现其中有15个基因的启动子区含有至少一个AuxREs顺式作用元件(表1)，因此它们可能是ARF2调控类黄酮生物合成的潜在靶基因。
表1
类黄酮生物合成途径中共计29个基因启动子区AuxREs顺式作用元件分析。AuxREsnumber in the promoter sequences:启动子序列中AuxREs顺式作用元件的数目；AuxREsposition in the promoter sequences:启动子序列中AuxREs顺式作用元件的位置。
为了验证本发明的检测方法的准确性，还可以通过ARF2在转录水平上调控黄酮醇和原花色素生物合成途径中结构基因和转录调控基因来进行验证，为了鉴定ARF2调控的下游靶基因，我们克隆了类黄酮生物合成途径中的29个基因的启动子，构建转录激活系统中的原生质体瞬时表达载体，包括报告质粒和效应质粒。分离拟南芥野生型的4周植物莲座叶的原生质体，将报告质粒、效应质粒和对照质粒通过PEG法共转化原生质体。常温条件下，培养16个小时，检测萤火虫荧光和海肾荧光。转录活性分析的实验结果显示：拟南芥中黄酮醇和原花色素生物合成早期的共同基因CHS、CH I、F3H和F3’H的转录并没有被ARF2显著地调控(图10)，而定量PCR的结果也显示CHS、CHI和F3H的基因表达水平也没有被ARF2显著影响(图8和图9)。定量PCR的数据也显示F3’H和FLS的基因表达水平也被ARF2正调控(图8和图9)，而它们的转录活性并没有被ARF2显著地调控(图10)。除了结构基因，MYB11和MYB12作为黄酮醇生物合成的重要调控基因，转录活性和定量PCR的数据也表明它们被ARF2正调控(图8-10)。MYB11和MYB12基因的启动子区包含有AuxRE顺式作用元件。这些数据说明，ARF2可能通过直接调控MYB11和MYB12，从而间接地调控F3’H和FLS基因的表达水平，从而最终正调控黄酮醇的生物合成。
通过转录活性分析实验，我们还发现原花色素合成途径中的ANS、TT2、TT12、TT19、GL3和TT15基因的转录水平被ARF2正调控(图10)；定量PCR的结果显示它们的基因表达水平也被ARF2显著调控，除此之外ANR和TT16的基因表达水平也被ARF2正调控(图8和图9)。这些基因中只有ANS和GL3的启动子区包含有AuxRE顺式作用元件。这些结果说明，ARF2可能通过直接调控ANS和GL3基因的转录，正调控原花色素的生物合成；也可能通过未知的方式直接调控TT2、TT12、TT19和TT15，从而间接调控ANR的基因表达或间接调控TT16的基因表达，最终正调控原花色素的积累。
这些被ARF2调控的基因中ANS和TT15是原花色素合成途径中的结构基因，表明ARF2可能通过调控这些结构基因的表达，进而调控原花色的积累；TT12和TT19影响原花色素前体的运输，因此，ARF2也可能通过调控原花色素前体的运输，进而影响原花色素的最终积累；而TT2是MBW三元复合物的成员，在调控原花色素的生物合成中至关重要，而它的启动子区没有AuxRE顺式作用元件，但被ARF2显著激活，这个结果与之前的RNA分析结果是一致的，表明ARF2可能通过间接的方式激活TT2的表达，调控原花色素的生物合成。
为了验证本发明的检测方法的准确性，还可以通过分析ARF2蛋白与黄酮醇和原花色素生物合成途径中调控蛋白之间的蛋白相互作用来进行验证本发明方法的准确性，我们采用酵母双杂交技术，分析了ARF2蛋白与类黄酮途径中14个调控蛋白之间的相互作用，发现ARF2与TT2和GL3之间在酵母细胞中有较强的蛋白相互作用。进一步采用双分子荧光互补技术检测ARF2与TT2以及ARF2与GL3之间的蛋白相互作用，发现ARF2与TT2在烟草叶片的细胞核中有较强的蛋白相互作用。TT2和GL3参与原花色素的生物合成。这些研究结果显示，ARF2可能通过与TT2和GL3之间的蛋白相互作用，调控原花色素的生物合成。
本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 鉴定arf1纯合突变体的PCR正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
cgcttcaaaa taccttgttg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 鉴定arf1纯合突变体的PCR反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
caccagccac tagtttcttc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 鉴定arf5-1纯合突变体PCR正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
gagaggaagt aagcacccga c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 鉴定arf5-1纯合突变体PCR反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
tcattacatc caggctcatc c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 鉴定arf7-1纯合突变体PCR正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
agtggatgaa tatgcagcag 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 鉴定arf7-1纯合突变体PCR反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 6
aagaggaagg tgcatctcct c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 鉴定arf1、arf5-1和arf7-1纯合突变体PCR的T-DNA引物(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
attttgccga tttcggaac 19
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 鉴定arf18纯合突变体PCR正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 8
aatgtgactg ttagggtttt gttg 24
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 鉴定arf18纯合突变体PCR反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 9
caaaaacggc actcaatg 18
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 鉴定arf18纯合突变体PCR的T-DNA引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 10
ataataacgc tgcggacatc tacatttt 28
Claims (5)
1.一种检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)在ARF基因中筛选出参与正向调控植物类黄酮生物合成的候选基因：分析植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，再分析所有ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式，将所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因与ARF基因在植物种皮发育过程中的基因表达模式进行比对，结合ARF基因的进化关系分析，筛选出ARF基因中基因表达模式与所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因表达一致的候选基因；
(2)验证候选基因对生物合成植物类黄酮的作用，最终确定出目标基因：分别检测出包含有所述候选基因T-DNA插入纯合突变体植物中类黄酮代谢产物花青素、黄酮醇、原花色素的含量，将检测出的花青素、黄酮醇、原花色素含量与野生型植物的含量比对，候选基因T-DNA插入纯合突变体植物中类黄酮代谢产物含量低于野生型植物水平的，该候选基因即为目标基因，即为具有正向调控生物合成植物类黄酮作用的基因。
2.根据权利要求1所述的检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求1或2所述的检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，其特征在于，该方法还包括步骤(3)验证目标基因正向调控生物合成类黄酮的作用：采用qRT-PCR的方法分析类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因被目标基因影响表达的情况，所述关键结构基因和转录调控基因的基因表达水平在目标基因突变体中显著下降，在目标基因过量表达株系中显著增加，则目标基因正调控所述关键结构基因和转录调控基因的基因表达水平，从而验证出，目标基因正调控类黄酮的生物合成。
4.根据权利要求1或2所述的检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将所述植物类黄酮生物合成途径中关键结构基因和转录调控基因的基因表达模式与ARF基因在植物种皮发育过程中的表达进行比对后，分析ARF基因进化关系，从而得到所有的候选基因。
5.根据权利要求1或2所述的检测具有正向调控生物合成植物类黄酮作用基因的方法，其特征在于，所述步骤(2)中目标基因为At5g62000。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181127 |