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CN107686508A - 阿霉素‑rgds,其合成,活性和应用 - Google Patents

阿霉素‑rgds,其合成,活性和应用 Download PDF

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CN107686508A
CN107686508A CN201610634579.6A CN201610634579A CN107686508A CN 107686508 A CN107686508 A CN 107686508A CN 201610634579 A CN201610634579 A CN 201610634579A CN 107686508 A CN107686508 A CN 107686508A
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gly
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Abstract

本发明公开了下式的以戊二酰为连接臂将RGDS与阿霉素的14位OH构成的化合物(简称阿霉素‑RGDS)，公开了阿霉素‑RGDS的制备方法，公开了它的体内抗S180肿瘤活性，公开了它的抗Lewis肺癌转移活性，公开了它对Lewis原位肿瘤生长的抑制作用，公开了它对治疗小鼠生存状态和脏器安全性比阿霉素的优越性。因而本发明公开了它在制备抗肿瘤和抗肿瘤转移药物中的应用。

Description

阿霉素-RGDS,其合成,活性和应用
技术领域
本发明涉及以戊二酰为连接臂将RGDS与阿霉素的14位OH构成的化合物(简称阿霉素-RGDS)，涉及它的制备方法，涉及它的体内抗S180肿瘤活性，涉及它的抗Lewis肺癌转移活性，涉及它对Lewis原位肿瘤生长的抑制作用，涉及它对治疗小鼠生存状态和脏器安全性比阿霉素的优越性。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤和抗肿瘤转移药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康,恶性肿瘤的死亡率仅次于心脑血管疾病,在所有疾病中居第二位。恶性肿瘤患者大都伴随癌转移。癌转移，尤其是癌的肺转移使肿瘤患者面临更为恶劣的预后。发明同时具有抗肿瘤和抗癌转移作用的药物，是新药发明的前沿课题。众所周知，临床上阿霉素广泛用于治疗多种实体瘤和血液肿瘤的。可是，阿霉素的肝毒性、肾毒性和心脏毒性严重影响阿霉素的临床疗效。曾经采取各种各样的化学修饰，企图降低阿霉素的肝毒性、肾毒性和心脏毒性。不过，成效甚微。例如有的专利将赖氨酸的羧基和氨基分别连接阿霉素的3位氨基和胆酸的羧基。可是这个专利没有公开在动物模型上这种连接方式在抗肿瘤活性、抗炎活性和毒性方面有什么优势。为了确认这种连接是否合理，发明人按照它的连接方式制备了赖氨酸的羧基和氨基分别连接阿霉素的3位氨基和胆酸的羧基的化合物。虽然在细胞模型上发明人重复出了该专利公开的抗肿瘤细胞增殖活性，但是在S180小鼠肿瘤模型和耳肿胀炎症小鼠模型上赖氨酸的羧基和氨基分别连接阿霉素的3位氨基和胆酸的羧基的化合物确实没有任何活性。此外，至今没有对阿霉素进行结构修饰导致抗肿瘤转移的报道。为了发明具有抗肿瘤作用、抗肿瘤肺转移作用、可完全消除了阿霉素的肝毒性、肾毒性和心脏毒性的阿霉素衍生物，发明人经过5年摸索。发明人发现，将RGDS对N端氨基和阿霉素的14位羟基分别与戊二酰连接生成的化合物在S180小鼠肿瘤模型上有抗肿瘤活性、在Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤转移模型上有抗癌转移活性，而且可完全消除阿霉素的肝毒性、肾毒性和心脏毒性。根据这个发现发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下式的以戊二酰为连接臂将RGDS与阿霉素的14位OH构成的化合物(简称阿霉素-RGDS)。
本发明的第二个内容是提供阿霉素-RGDS的合成方法,该方法包括:
(1)采用二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)为催化剂的液相缩合的方法，合成Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl；
(2)脱去Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl的C端保护基制备Boc-Arg(NO2)-Gly；
(3)采用二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)为催化剂的液相缩合的方法，合成Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(4)脱去Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的N端保护基制备Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(5)把Boc-Arg(NO2)-Gly和Asp(OBzl)-Ser-OBzl偶联制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(6)在三氟醋酸/三氟甲磺酸中脱除Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的所有保护基制备Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)；
(7)用Fmoc保护阿霉素的3’-NH2；
(8)用戊二酸酯化Fmoc-阿霉素的14位OH制备Fmoc-阿霉素的戊二酸单酯；
(9)Fmoc-阿霉素的戊二酸单酯在DCC存在下与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)形成Fmoc-阿霉素和OSu的戊二酸活泼酯；
(10)Fmoc-阿霉素和OSu的戊二酸活泼酯与Arg-Gly-Asp-Ser缩合得到Fmoc-阿霉素-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser；
(11)在10％哌啶/无水N,N-二甲基甲酰胺中脱除Fmoc-阿霉素-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser的Fmoc得到阿霉素-RGDS。
本发明的第三个内容是评价阿霉素-RGDS的抗肿瘤活性。
本发明的第四个内容是评价阿霉素-RGDS的抗癌转移活性。
本发明的第五个内容是评价单次大剂量给予阿霉素-RGDS对小鼠生存状态和各脏器的影响。
附图说明
图1阿霉素-RGDS的合成路线。i)二环己基羰二亚胺(DCC),1-羟基苯并三氮唑(HOBt),无水四氢呋喃(THF),N-甲基吗啉(NMM),冰浴；ii)氢氧化钠-甲醇溶液(1M),冰浴；iii)氯化氢-乙酸乙酯溶液(6M),冰浴；iv)三氟醋酸:三氟甲磺酸3:1,冰浴；v)9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu),二异丙基乙胺(DIPEA),无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF),冰浴,避光；vi)戊二酸酐(GA),DIPEA,无水DMF,冰浴,避光；vii)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu),DCC,无水DMF,避光；viii)无水DMF,DIPEA,冰浴,避光；ix)10％哌啶/无水DMF,冰浴,避光。
图2.阿霉素-RGDS对小鼠生存率的影响。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl(1)
将9.58g(30mmol)Boc-Arg(NO2)用150mL无水四氢呋喃(THF)溶解，冰浴搅拌，向得到的溶液中依次加入4.25g(31.5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)和7.42g(31.3mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)，冰浴下搅拌10min。加入10.6g(36mmol)Tos·Gly-OBzl，用N-甲基吗啉(NMM)调节pH 8，室温搅拌8h。TLC(二氯甲烷/甲醇，15:1)监测反应完成。反应混合物减压浓缩，黄色油状物用石油醚洗，静置并弃上清。残留物用250mL乙酸乙酯溶解，过滤除二环己基脲(DCU)。滤液依次用5％NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗2次，5％KHSO4水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗2次，5％NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次(100mL/次)。乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩，黄色油状物加200mL二氯甲烷溶解，超声，静置。减压过滤，收集无色粉末状滤饼。滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，35:1)。柱层析纯化物和无色粉末状滤饼合并，共得到13.4g(96％)无色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):467[M+H]+。
实施例2制备Boc-Arg(NO2)-Gly(2)
将20.0g(42.9mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶解在100mL甲醇中，冰浴搅拌，用氢氧化钠-甲醇溶液(1M)调节pH 12，冰浴搅拌5h。TLC(二氯甲烷/甲醇，15:1，加2滴冰醋酸)监测反应完成。反应液用饱和KHSO4中和至pH7，减压浓缩除去甲醇，残留物加入50mL蒸馏水溶解，之后用100mL乙酸乙酯萃洗2次。水层用饱和KHSO4酸化至pH 2，用100mL乙酸乙酯萃取3次。乙酸乙酯相减压浓缩至约150mL，用50mL饱和NaCl水溶液洗3次，用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩至干，得到9.03g(56％)无色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):375[M-H]-。
实施例3制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(3)
将12.9g(40mmol)Boc-Asp(OBzl)用150mL无水THF溶解，冰浴搅拌，依次加入5.67g(42mmol)HOBt和9.89g(48mmol)DCC。反应液冰浴搅拌10min，加入9.22g(42mmol)Tos·Ser-OBzl，用NMM调节pH 8，室温搅拌8h。TLC(二氯甲烷/甲醇，20:1，加2滴冰醋酸)监测反应完成。反应混合物减压浓缩，黄色油状物用石油醚洗，静置并弃上清。残留物用250mL乙酸乙酯溶解，过滤除DCU。滤液依次用5％NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗2次，5％KHSO4水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗2次，5％NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次(100mL/次)。乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩后，残留物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，30:1)，得到8.14g(41％)无色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):501[M+H]+。
实施例4制备HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl(4)
将24.4g(48.8mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶解在200mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(6M)中，冰浴搅拌8h，TLC(二氯甲烷/甲醇，15:1)监测反应完成。冰浴搅拌，加250mL无水乙醚，过滤，得到18.4g(86％)无色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):401[M+H]+。
实施例5制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(5)
将7.90g(21mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly用60mL无水THF和40mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴下搅拌。得到的溶液依次加2.97g(22mmol)HOBt和4.94g(24mmol)DCC。反应液冰浴搅拌10min，加8.74g(20mmol)HCl·Asp(OBzl)Ser-OBzl，用NMM调节pH 8,室温搅拌8h。TLC(二氯甲烷/甲醇，10:1，加2滴冰醋酸)监测反应完成。反应混合物减压浓缩，黄色油状物用石油醚洗，静置并弃上清。残留物用200mL乙酸乙酯溶解，过滤除DCU。滤液依次用5％NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗2次，5％KHSO4水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗2次，5％NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次(70mL/次)。乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩，经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，40:1)，得到12.4g(41％)无色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):757[M+H]+。
实施例6制备Arg-Gly-Asp-Ser(6)
将1g(1.32mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶解在12mL三氟醋酸(TFA)中，冰浴搅拌使溶解至无色澄清，加入4mL三氟甲磺酸(TFMSA)，反应40min，TLC(EA/H2O/HAc,2:1:1)监测反应完成。减压抽除酸气10min，冰浴搅拌，倒入预先冰浴冷却的新开封无水乙醚，静置，弃上清，减压浓缩。得到的土黄色粉末在冰浴下加2mL三蒸水溶解，用浓氨水调节pH至中性，过滤，滤液用SephadexG-10除盐，馏份冻干，得513mg(90％)无色粉末状标题化合物。1H NMR(300MHz,D2O):δ/ppm＝4.57(dd,J＝8.4Hz,J＝4.5Hz,1H),4.18(t,J＝4.5Hz,1H),4.062-3.884(m,3H),3.76(d,J＝4.8Hz,2H),3.15(t,J＝6.75Hz,2H),2.66(dd,J＝16.2Hz,J＝4.5Hz,1H),2.55(dd,J＝16.2Hz,J＝8.4Hz,1H),1.88(m,2H),1.63(m,2H)；ESI-MS(m/e):434[M+H]+。
实施例7制备N-Fmoc-阿霉素(7)
将1.16g(2mmol)盐酸阿霉素溶解在15mL无水DMF中，冰浴搅拌，滴加500μL DIPEA，加入1.012g Fmoc-OSu，冰浴搅拌15h，TLC(二氯甲烷/甲醇，20:1，加2滴冰醋酸)监测反应完成。反应混合物用石油醚洗，静置并弃上清，得到的暗红色油状物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，50:1)，得到1.12g(73％)红色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):788[M+Na]+。
实施例8制备N-Fmoc-阿霉素-14-OH-戊二酸单酯(8)
将1.53g(2mmol)N-Fmoc-阿霉素溶解在10mL无水DMF中，冰浴搅拌，加入228mg戊二酸酐，用DIPEA调pH 8，冰浴搅拌36h，TLC(二氯甲烷/甲醇，20:1)监测反应完成。反应混合物用石油醚-乙醚洗，静置并弃上清，得到的暗红色油状物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，40:1)，得到884mg(50％)红色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):879[M-H]-。
实施例9制备N-Fmoc-阿霉素-14-OH-OSu-戊二酸酯(9)
将1.319g(1.5mmol)N-Fmoc-阿霉素-14-OH-戊二酸单酯溶解在10mL无水DMF中，冰浴搅拌，加259mg(2.25mmol)HOSu和464mg(2.25mmol)DCC，冰浴避光搅拌24h，TLC(二氯甲烷/甲醇，30:1)监测反应完成。反应混合物用石油醚-乙醚洗，静置并弃上清。得到的暗红色粉末经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，50:1)，得到1.0g(68％)红色粉末状标题化合物。ESI-MS(m/e):975[M-H]-。
实施例10制备N-Fmoc-阿霉素-14-OH-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser(10)
将976mg(1mmol)N-Fmoc-阿霉素-14-OH-OSu-戊二酸酯溶解在20mL无水DMF中，加520mg(1.2mmol)Arg-Gly-Asp-Ser，冰浴下用DIPEA调节pH 8，冰浴搅拌48h，TLC(EA/H2O/HAc,3:1:1)监测反应完成。反应混合物用石油醚-乙醚洗，静置并弃上清。得到的暗红色粉末用二氯甲烷磨洗，得到1.07g(83.0％)红色粉末状标题化合物。直接投下步反应。ESI-MS(m/e):1295.450[M+H]+。
实施例11制备阿霉素-14-OH-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser(阿霉素-RGDS)
将500mg(0.386mmol)N-Fmoc-阿霉素-14-OH-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser溶解在9mL无水DMF中，冰浴搅拌，滴加1mL哌啶，冰浴搅拌30min，TLC(EA/H2O/HAc，2:1:1)监测反应完成。冰浴下与6mL无水DMF、1mL TFA及2.4mL吡啶混合。将混合液酸化，用石油醚-乙醚洗，静置并弃上清。得到的暗红色粉末用色谱乙腈/三蒸水(1/9)溶解，经半制备柱纯化(乙腈/三蒸水，22/78，1‰乙酸)，冻干得到20mg(5％)红色粉末标题化合物。ESI-MS(m/e):1071.369[M-H]-。Mp:192-193℃；IR(cm-1):3279.64,3089.23,2975.26,2940.98,1725.33,1643.74,1614.96,1578.35,1405.21,1281.14,1211.24,1117.24,1012.08,988.92,790.96；1H NMR(800MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.104(s,1H),8.556(d,J＝5.6Hz,2H),8.054(d,J＝6.4Hz,1H),7.796(dd,J＝16Hz,J＝6.4Hz,2H),7.561(d,J＝8.0Hz,1H),7.230(s,1H),7.129(m,2H),5,254(s,1H),5.140(d,J＝17.6Hz,1H),4.351(m,1H),4.267-4.226(m,2H),3.983-3.877(m,6H),3.617(s,1H),3.566-3.405(m,5H),3.195(s,2H),3.025(d,J＝5.6Hz,1H),2.974(s,2H),2.77(d,J＝5.6Hz,1H),2.585(d,J＝12Hz,1H),2.408(m,2H),2.315-2.227(m,5H),1.982(m,2H),1.887(m,1H),1.783(m,2H),1.641(m,2H),1.560(m,2H),1.477(m,2H),1.165(d,J＝5.6Hz,3H)；13C NMR(200MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝208.62,186.65,175.62,173.76,173.20,172.64,172.19,171.09,171.03,169.06,169.01,161.18,157.79,156.41,154.97,136.60,135.48,134.99,134.33,120.24,120.06,119.35,111.04,110.94,99.79,90.05,75.48,69.69,66.76,66.63,66.09,65.33,62.92,56.98,55.91,52.71,50.47,47.01,42.96,40.97,38.43,36.21,34.35,33.01,32.23,30.65,29.15,25.35,21.21,17.09；HPLC纯度为97％(流动相为乙腈/三蒸水，22/78；色谱柱为WatresMS C185μm，2.1×150mm Column；流速为0.3mL/min，UV＝478nm；保留时间为10.7min)。
实施例12评价阿霉素-RGDS抗肿瘤活性
采用自行传代的S180腹水瘤模型小鼠，在无菌条件下，处死腹水瘤小鼠，于75％酒精中浸泡5min消毒，取出小鼠仰面置于表面皿中，棉球擦拭腹部，晾干酒精，打开腹腔，抽取接种7天后生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，1000r/min离心3min，去除细胞碎片，沉降血细胞，用生理盐水重悬肿瘤细胞，将肿瘤细胞悬液稀释一定倍数后用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色外观晶亮者为活细胞，按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用生理盐水制备成1.5×107个/mL的细胞悬液，往健康雄性ICR小鼠右腋皮下接种，0.2mL/只(小鼠体重为20±2g)，制成实体瘤动物模型。肿瘤接种24h后，阴性对照为生理盐水，腹腔注射，每天一次，0.2mL/20g，连续给药12天，共给药12次。阳性对照为阿霉素，腹腔注射，每天一次，2μmol/kg，连续给药12天，共给药12次。本发明的阿霉素-RGDS，腹腔注射，每天一次，0.2μmol/kg，连续给药12天，共给药12次。各组小鼠于第13天称取体重(处死前体重)，摘眼球取血，经乙醚麻醉之后脱颈椎处，钝性剥离肿瘤并称重数据采用t检验和方差分析列入表1。结果表明，在0.2μmol/kg剂量下，阿霉素-RGDS和阿霉素一样可显著抑制S180小鼠的肿瘤生长，即阿霉素-RGDS的抗肿瘤活性比阿霉素强4倍。说明，按照本发明的方式用戊二酰分别连接阿霉素的14位羟基和RGDS的氨基可增强阿霉素的抗肿瘤活性。
表1阿霉素-RGDS对S180肉瘤小鼠瘤重的影响
n＝12；a)与生理盐水组比p<0.01；b)与生理盐水组比p<0.01，与阿霉素组比p>0.05。
实施例13评价阿霉素-RGDS的抗肿瘤和抗肿瘤转移活性
Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM高糖培养基培养，培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，传代三次富集细胞。待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至1×107个/mL，台盼蓝拒染试验示活细胞数>95％。取近交系雄性C57BL/6小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，用1mL无菌注射器于小鼠右腋皮下注射瘤细胞悬液，0.2mL/只(含肿瘤细胞数约为2×106个/只)。接种后14天可以生长成直径约2cm的肿瘤，备用。取接种14天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，乙醚麻醉之后颈椎脱臼处死，用75％乙醇浸泡消毒5min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g)/生理盐水体积(mL)为1/3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×107个/mL。取雄性近交系C57BL/6小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL(含肿瘤细胞数约为2×106个/只)。接种后8天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，测量肿瘤体积，筛选肿瘤体积均一的小鼠随机分组。阴性对照为生理盐水，腹腔注射，每天一次，0.2mL/20g，连续给药12天，共给药12次。阳性对照为阿霉素，腹腔注射，每天一次，2μmol/kg，连续给药12天，共给药12次。阳性对照为RGDS，腹腔注射，每天一次，20μmol/kg，连续给药12天，共给药12次。本发明的阿霉素-RGDS，腹腔注射，每天一次，0.2μmol/kg，连续给药12天，共给药12次。各组小鼠于第13天称取体重(处死前体重)，摘眼球取血，经乙醚麻醉之后脱颈椎处，钝性剥离肿瘤并称重 取出肺并数肺上肿瘤转移灶数目。数据列入表2。结果表明，在0.2μmol/kg剂量下，阿霉素-RGDS和阿霉素一样可显著抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，即阿霉素-RGDS的抗Lewis肺癌活性比阿霉素强10倍。说明，按照本发明的方式用戊二酰分别连接阿霉素的14位羟基和RGDS的氨基可增强阿霉素的抗肿瘤活性。
表2的数据还表明，0.2μmol/kg阿霉素-RGDS与2μmol/kg RGDS一样可显著抑制Lewis肺癌转移至肺部的结节数，说明阿霉素-RGDSg抑制Lewis肺癌转移至肺部的活性是RGDS抑制Lewis肺癌转移至肺部的活性的200倍。而阿霉素没有抑制Lewis肺癌转移至肺部的活性。说明，按照本发明的方式用戊二酰分别连接阿霉素的14位羟基和RGDS的氨基可增强RGDS和阿霉素Lewis肺癌转移至肺的活性。
表2阿霉素-RGDS对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重和肿瘤转移的影响
n＝12；a)与生理盐水组比p<0.01；b)与生理盐水组比p>0.05；c)与生理盐水组比p<0.01,与2μmol/kg阿霉素组比p<0.05,与20μmol/kg RGDS组比p>0.05；d)与生理盐水组比p<0.05；e)与2μmol/kg阿霉素组比p>0.05。
实施例14单次大剂量给予阿霉素-RGDS对小鼠的毒性
体重为20～22g的ICR雄性小鼠，适应性喂养2天，随机分为生理盐水组、阿霉素组和阿霉素-RGDS阿霉素-RGDS组，每组10只。三组小鼠分别一次性腹腔注射生理盐水、34.5μmol/kg阿霉素和34.5μmol/kg阿霉素-RGDS。之后连续观察6天，观察各组小鼠的饮食、皮毛和活动力等。每天记录体重和存活率。于第6天称重后摘眼球取血，4℃冰箱中静置2h后离心，离心温度10℃，转速3000r/min，离心15min取上清，用谷丙转氨酶(ALT)试剂盒测定血清ALT、用谷草转氨酶(AST)试剂盒测定血清AST；用尿素氮(BUN)试剂盒测定血清BUN、用肌酐(Cr)试剂盒测定血清Cr；用肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒测定血清CK-MB，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定血清LDH、用心肌肌钙蛋白I(cTnI)酶联免疫检测试剂盒测定血清cTnI、用小鼠肌红蛋白(MB)酶联免疫检测试剂盒测定血清MB。
测定结果表明，生理盐水组和阿霉素-RGDS组小鼠摄食正常、活动正常、毛发光滑，小鼠100％存活。阿霉素组小鼠逐渐出现毛发干涩、摄食减少、活动减少的现象，第5天死亡2只，第6天死亡5只，存活率为30％。
阿霉素-RGDS对小鼠血清ALT和AST的影响见表3。与阿霉素不同，34.5μmol/kg阿霉素-RGDS不升高血清ALT和AST，没有肝脏毒性。
图2表明，单次大剂量给药后观察的6天时间中生理盐水组和阿霉素-RGDS组小鼠没有死亡，存活率100％。阿霉素组第5天死亡1只，第6天死亡6只，至第6天存活率仅30％。
表3阿霉素-RGDS对小鼠血清ALT和AST的影响
阿霉素组n＝3，生理盐水组和CBAORGDS组n＝10；a)与生理盐水组比p<0.01；b)与阿霉素组比p<0.01,与生理盐水组比p>0.05。
阿霉素-RGDS对小鼠血清Cr和BUN的影响见表4。与阿霉素不同，34.5μmol/kg阿霉素-RGDS不升高血清Cr和BUN，没有肾脏毒性。
表4阿霉素-RGDS对小鼠血清Cr和BUN的影响
阿霉素组n＝3，生理盐水组和CBAORGDS组n＝10；a)与生理盐水组比p<0.01；b)与阿霉素组比p<0.01,与生理盐水组比p>0.05。
阿霉素-RGDS对小鼠血清CK-MB、LDH、cTnI和MB的影响见表5。与阿霉素不同，34.5μmol/kg阿霉素-RGDS不升高血清CK-MB、LDH、cTnI和MB，没有心脏毒性。
表5阿霉素-RGDS对小鼠血清CK-MB,LDH,cTnI和MB的影响
阿霉素组n＝3，生理盐水组和CBAORGDS组n＝10；a)与生理盐水组比p<0.01；b)与阿霉素组比p<0.01,与生理盐水组比p>0.05。
总之，按照本发明的方式用戊二酰分别连接阿霉素的14位羟基和RGDS的氨基可增强阿霉素的抗肿瘤活性，可增强RGDS的抗肿瘤转移活性，可完全消除了阿霉素的肝、肾和心脏毒性。因而，本发明获得了意想不到的技术效果。

Claims (4)

1.下式的以戊二酰为连接臂将RGDS与阿霉素的14位OH构成的化合物(简称阿霉素-RGDS)
2.权利要求1的阿霉素-RGDS的制备方法，该方法包括：
(1)采用二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)为催化剂的液相缩合的方法，合成Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl；
(2)脱去Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl的C端保护基制备Boc-Arg(NO2)-Gly；
(3)采用二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)为催化剂的液相缩合的方法，合成Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(4)脱去Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的N端保护基制备Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(5)把Boc-Arg(NO2)-Gly和Asp(OBzl)-Ser-OBzl偶联制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(6)在三氟醋酸/三氟甲磺酸中脱除Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的所有保护基制备Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)；
(7)用Fmoc保护阿霉素的3’-NH2；
(8)用戊二酸酯化Fmoc-阿霉素的14位OH制备Fmoc-阿霉素的戊二酸单酯；
(9)Fmoc-阿霉素的戊二酸单酯在DCC存在下与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)形成Fmoc-阿霉素和OSu的戊二酸活泼酯；
(10)Fmoc-阿霉素和OSu的戊二酸活泼酯与Arg-Gly-Asp-Ser缩合得到Fmoc-阿霉素-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser；
(11)在10％哌啶/无水N,N-二甲基甲酰胺中脱除Fmoc-阿霉素-戊二酰-Arg-Gly-Asp-Ser的Fmoc得到阿霉素-RGDS。
3.权利要求1的阿霉素-RGDS在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求1的阿霉素-RGDS在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
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