CN107177693B - 一种多倍pcr扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多倍PCR扩增方法，即以一对5’端与通用引物相同的多个相同序列组成的多倍引物(低浓度)和一对通用引物(高浓度)在同一PCR反应中进行扩增，扩增中所用DNA聚合酶是具有链置换作用的耐热聚合酶。多倍引物序列包含两部分，即3’端与目标基因互补，5’端携带至少1个与通用引物相同的序列。上、下游多倍引物5’端携带通用引物的数目相同或不同，且上、下游通用引物的序列也可以相同或不同。本方法一次循环同时产生多个扩增产物，且每一个扩增产物除含有目标扩增序列外还含有至少一个上游和一个下游通用引物序列。本发明因一次循环可以产生超过两倍的扩增产物，故能显著提高PCR的扩增效率和检测灵敏度，适合作为常规分子生物学实验室手段和医学核酸检测手段用于低模板数基因的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种多倍PCR扩增方法。
背景技术
PCR技术作为一种体外快速扩增特定基因的方法，因其高特异性和灵敏度等优点已广泛应用于各领域。PCR方法的关键是根据目标基因设计一对具有高严谨性的寡核苷酸引物，通过DNA聚合酶酶促反应实现快速扩增。
自PCR技术发明以来，虽然各种改进和衍生的方法层出不穷，但是都未能突破其基本模式，即每一个目标基因的扩增都是通过与模板互补的一对上下游引物进行的。常规PCR使用一对引物进行扩增，每次循环最多只能产生两倍的扩增产物，故其扩增效率受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供了一种多倍PCR扩增方法，以突破现有技术中每次循环最多只能产生两倍扩增产物的极限，从而提高PCR的扩增效率及缩短PCR反应时间。
本发明的多倍PCR扩增方法，所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增，所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物，且以链替换作用的耐热DNA聚合酶代替常规的DNA聚合酶。以较低浓度的多倍引物在最初的几个循环中引发PCR，产生包含通用引物序列的第一扩增产物；以第一扩增产物为模板，在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下，使用较高浓度的通用引物扩增PCR。对于目标基因，一次循环可以产生超过两倍的扩增产物，从而提高PCR的扩增效率以及缩短PCR扩增时间。
本发明的第一个方面是提供一种多倍PCR扩增方法，包括利用一对3’端与目标基因互补的特异性序列及5’由多个通用序列所构成的多倍引物完成第一轮扩增，产生包含通用引物序列的第一扩增产物；以第一扩增的产物为模板，在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下，利用通用引物完成第二轮扩增，产生多条携带目标基因序列的扩增产物；其中多倍引物和通用引物同时加入，在同样的退火温度条件下进行反应。
本发明的第二个方面是提供一种多倍PCR扩增所用引物的设计，包括多倍引物和通用引物。
所述多倍引物浓度为5-100nM；多倍引物的3’端与目标基因序列完全互补，其序列可用引物软件设计，应符合通常优秀引物的高严谨性，序列长度为10-30碱基；5’端包含至少一个与通用引物完全相同的序列，其序列间可用碱基连接；多倍引物形成发夹结构的碱基数应尽量低，且自身总互补碱基数应尽量低。
多倍引物的上、下游序列包含的通用引物数相同或不同，但一个体系中上、下游多倍引物所包含通用引物序列总数目至少为3个。
所述通用引物浓各为l-10μM；通用引物序列与目标基因序列无关，其设计完全独立于被测基因；其物序列长度为10-30碱基；通用引物的退火温度与多倍引物3’端特异性序列的退火温度相差不超过4℃；上游通用引物和下游通用引物的序列可以相同或不同。
多倍引物和通用引物与其它PCR反应试剂一起混合，两轮PCR扩增在相同退火温度下进行，在反应的最初几个循环中有较低浓度的多倍引物完成，而通用引物由于其序列与目标基因不匹配，完全起不了作用。
本发明的多倍PCR扩增方法比常规PCR方法有很多优势：
第一，较低浓度的多倍引物的使用，提高了反应的严谨性，有利于减少或消除引物二聚体和非特异性扩增产物；
第二，多倍引物的特异性序列的解链温度和通用引物的相近，因此多倍引物和通用引物在同一退火温度下反应，避免了由于引物的解链温度及结合效率等不同所造成的扩增效率的不均一；
第三，通用引物的序列是独立于目标模板序列而设计的，具有高严谨性。高浓度的通用引物延长了多倍PCR的扩增产物的直线累积期，有利于提高检测的灵敏度及缩短扩增时间。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为本发明的多倍PCR扩增方法示意图。图中Fm和Rm分别为上游和下游多倍引物，FUP和RUP分别为上游和下游通用引物。
图2A和图2B为本发明的多倍引物示意图。图中101.上游特异性引物，102.连接碱基，103.上游通用引物，104.下游特异性引物，105.连接碱基，106.下游通用引物。
图3A和3B为实施例1中分别使用2倍引物和3倍引物的扩增电泳图。M为50bp的DNA分子标准。
图4为本发明实施例2中实时荧光多倍PCR的特异性实验。
具体实施方式
如图1所示，本发明提供了一种多倍PCR扩增方法，即以一对多倍引物(低浓度)和一对通用引物(高浓度)在同一PCR反应中进行扩增，扩增中所用DNA聚合酶是具有链置换作用的耐热聚合酶。在PCR反应的前几个循环，多倍引物的3’端与目标基因特异性结合，随着聚合酶的延伸，产生带有5’端序列的完整双链DNA。在随后的PCR循环中由通用引物完成扩增，由于聚合酶的链置换作用，外部引物所形成的链会随着延伸置换掉内部的链，这样每个循环后可以产生多个扩增产物，其每一个扩增产物除含有目标扩增序列外还含有至少一个上游和一个下游通用引物序列。Fm和Rm分别为上游和下游多倍引物，FUP和RUP分别为上游和下游通用引物。
如图2A和图2B所示，上游多倍引物的设计有两部分组成，即3’端的目标基因特异性引物序列101和5’端的上游通用引物序列103，两者间以连接碱基102相连；下游多倍引物的设计同样有两部分组成，即3’端的目标基因特异性引物序列104和5’端的上游通用引物序列106，两者间以连接碱基105相连。上、下游多倍引物的5’端的通用引物序列可以相同或不同，其通用引物的数目也可以相同或不同。5’端的通用引物序列与3’端的特异性序列间也可以设计成一段特异性的探针序列用于检测。
本发明能显著提高PCR的扩增效率和检测灵敏度，适合作为常规分子生物学实验室手段和医学核酸检测手段用于低模板数基因的检测。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中SD DNA聚合酶及SD反应缓冲液购自BIORON GmbH(德国)公司，引物及其它相关试剂由上海生工生物工程股份有限公司提供。
实施例1
多倍PCR扩增模板DNA：
以69bp的人工合成模板为扩增目标，根据技术方案中多倍引物和通用引物设计的原则设计下列引物(表1)。
反应条件如下：
PCR反应体系总体积为25μL，包含10U的SD DNA聚合酶，1×的SD反应缓冲液，3.5mM的MgCl2，0.4mM的dNTPs，各30nM的上下游多倍引物Fm和Rm，各1μM的上下游通用引物FUP和RUP，0.5μL的SYBR Geen I(20x)，2μL的模板。以无菌水作阴性对照。
PCR扩增程序为：92℃变性2min，随后92℃变性20s，56℃复性30s，68℃延伸20s，25个循环。取5μL上述扩增液加入1μL的6x加样缓冲液，混匀后取5μL进行电泳实验，电泳条件为：电压100V，时间60min，2％的琼脂糖凝胶，4S红色核酸染料显色。
图3A和3B分别为实施例1中使用2倍引物和3倍引物的扩增电泳图。M为50bp的DNA分子标准。
上述多倍PCR扩增结果：
(1)使用2倍引物对(F2/R2)得到三条扩增条带，分别分113bp,135bp和157bp，表示产生四个扩增产物，即两个135bp及113bp和157bp各一个。
(2)使用3倍引物对(F3/R3)得到五条扩增条带，分别分113bp,135bp，157bp，179bp和201bp，表示产生九个扩增产物，即两个135bp，三个157bp，两个179bp及113bp和201bp各一个。
表1.人工合成模板及多倍引物和通用引物序列
实施例2
沙门氏菌的实时定量多倍PCR检测：
以沙门氏菌的ttr基因为检测目标设计多倍引物和通用引物(表2)。
反应条件如下：
PCR反应体系总体积为25μL，包含10U的SD DNA聚合酶，1×的SD反应缓冲液，4mM的MgCl2，0.4mM的dNTPs，各30nM的上下游2倍引物F2和R2，各1μM的上下游通用引物FUP和RUP，0.5μL的SYBR Geen I(20x)，2μL的模板。以无菌水作阴性对照。
PCR扩增程序为：92℃变性2min，随后92℃变性30s，55℃复性30s，68℃延伸1min，在延伸段进行荧光检测，35个循环。
表2 检测沙门氏菌ttr基因的引物序列表
如图4所示，图4为本发明实施例2中实时荧光多倍PCR的特异性实验。图中沙门氏菌菌株为鼠沙门氏菌CMCC50071，非沙门氏菌菌株为大肠杆菌ATCC 8739，副溶血性弧菌CMCC 17802，单增李斯特菌CMCC 54003。
结果判读：根据沙门氏菌ttr基因所设计的引物用于多倍PCR分析，从图4可以看出，只有沙门氏菌检出，而其它非沙门氏菌例如大肠杆菌，副溶血性弧菌，单增李斯特菌都未能检测，说明引物的特异性非常好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
序 列 表
<110> 中山大学
<120> 一种多倍PCR扩增方法
<160> 11
<210> 1
<211> 69
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<213> 人工序列
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Claims (7)
1.一种多倍PCR扩增方法，其特征在于：所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增，所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物，以及具有链替换作用的耐热DNA聚合酶；以较低浓度的多倍引物在最初几个循环引发PCR，产生的第一扩增产物包含多个通用引物序列；以第一扩增产物为模板，使用较高浓度的通用引物扩增PCR，产生包含目标基因的多个第二扩增产物；
所述方法进一步包括步骤：
1)第一扩增反应，多倍引物与模板杂交，产生包含至少两个上游通用引物和一个下游通用引物或至少一个上游通用引物和两个下游通用引物序列的第一扩增产物；
2)第二扩增反应，以第一扩增产物为模板，通用引物与第一扩增产物结合，在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下，产生多个包含目标基因序列和至少一个上游通用引物和一个下游通用引物的第二扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，多倍引物浓度为5-100nM；所述多倍引物的3’端与目标基因特异性互补，5’端包含至少1个与通用引物序列相同的结合位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，多倍引物的上、下游序列包含的通用引物数相同或不同，但一个体系中多倍引物所包含的通用引物序列总数目至少为3个。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述通用引物浓各为l-10μM；所述通用引物与目标基因序列无同源性；所述通用引物的解链温度与目标基因特异性引物的解链温度相差不超过4℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述通用引物的上、下游的序列相同或不同。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，多倍引物的3’端与目标基因序列完全互补，其序列用引物软件设计，序列长度为10-30碱基，5’端包含至少一个与通用引物完全相同的序列，其序列间用碱基连接。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通用引物序列与目标基因序列无关，其设计完全独立于被测基因；其物序列长度为10-30碱基。
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