CN107099475B - 一株甲基营养型芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株甲基营养型芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用，属于农用微生物技术领域。本发明的甲基营养型芽孢杆菌HZ‑9，于2017年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14022。本发明的菌株，具有较广的抑菌谱，对引起红掌细菌性叶斑病的病原菌以及葡萄炭疽病菌、尖孢镰刀菌、杨树腐烂病菌、立枯丝核菌、灰霉菌等病原菌具有较强的抑制效果，对引起红掌细菌性叶斑病的病原菌的抑制效果尤为显著，且能够在红掌根际、叶片及叶柄表面稳定定殖；利用该菌株制备的菌剂能够应用于红掌细菌性叶斑病等病害的预防和控制。

Description

一株甲基营养型芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用

技术领域

本发明提供一株甲基营养型芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用，属于农用微生物技术领域。

背景技术

红掌又名火鹤花、幸运花、安祖花等，是天南星科花烛属植物，原产地为南美洲热带雨林地区，现广泛栽培于亚洲、欧洲、非洲等地。该作物属多年生常绿草本花卉，其花型奇特，色彩鲜艳丰富，使用范围广，是在世界范围非常流行、备受亲睐的名贵花卉之一，具有很高的经济价值，在全球热带花卉贸易中，销量仅次于兰花。

近年来红掌细菌性病害在红掌的栽培过程中呈现明显增长的趋势，主要有细菌性叶斑病、细菌性叶枯病、细菌性枯萎病。尤其以细菌性叶斑病的增长趋势最为明显，其扩散速度快、危害大，给红掌产业造成了极大的危害。红掌细菌性叶斑病，是一种由地毯草黄单胞菌的花叶万年青致病变异种（Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae）引起的一类细菌病害。该病害的主要症状为染病之初，在红掌叶片上分布水渍状凹陷斑，病斑在侵染初期呈半透明状，其中新叶的病斑出现在叶脉间，斑点颜色呈褐色并伴有清晰的边缘，老叶的病斑通常出现在其叶部边缘，小点式排列。当空气湿度较大时，病斑迅速增多，在新叶的叶背部位可见充满棕褐色菌脓的斑点，当空气状湿度降低时，新叶叶背部位菌脓消失，病斑由棕褐色变为褐色或者黑色，并呈干枯状。病原菌的侵染可由叶柄维管束传播到茎基部维管束中，侵染过后维管束呈褐色，叶柄中出现菌脓，切断叶柄，菌脓则会从维管束中溢出。此时，发病严重的红掌叶片会出现萎蔫、枯死。如果病原菌侵染传输到茎基部，很有可能整个植株都会死亡。红掌细菌性叶斑病传播速度极快，死亡率很高，在发病严重的地区红掌细菌性叶斑病发病率达到100%，死亡率也高达80%以上。此病的流行严重影响了红掌产业的发展，制约了红掌的生产。

目前，防治红掌细菌性病害的主要措施仍然是化学农药防治。化学防治虽然具有抗菌谱广、成本低、使用便捷、高效稳定等诸多优点，但化学杀菌剂的大量使用带来的土壤、大气污染，生态平衡破坏，食品安全威胁，以及病原菌对农药的抗性增强等问题日益严重，因此，选择高效无毒、不污染环境且不易产生抗药性的生物防治方法进行植物病害的防治，日益受到人们的重视。但是针对红掌细菌性病害的生物防治制剂及方法十分缺乏。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能对红掌细菌性叶斑病起到防控作用的甲基营养型芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用。

本发明从红掌根际土壤中分离获得一株细菌，经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）；本发明将其命名为甲基营养型芽孢杆菌HZ-9。该菌株于2017年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCC No. 14022。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，菌体为杆状，为兼性厌氧发酵型，接触酶、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P测定、明胶液化、柠檬酸盐利用和氮源利用等反应为阳性，甲基红试验和苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性，能在NaCl质量浓度为2%和5%的LB固体培养基生长，生长12h后菌落隆起，表面干燥，为白色、不透明圆形。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，其16SrDNA序列长度为1454bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，具有较广的抑菌谱，对引起红掌细菌性叶斑病的病原菌以及葡萄炭疽病菌、尖孢镰刀菌、杨树腐烂病菌、立枯丝核菌、灰霉菌等病原菌都具有较强的抑制效果；对引起红掌细菌性叶斑病的病原菌的抑制效果尤为显著，且能够在红掌根际、叶片及叶柄表面稳定定殖；因此能够用于红掌细菌性叶斑病的预防和控制。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，能够制备成液体菌剂或固体菌剂施用。所以，本发明还提供了一种利用甲基营养型芽孢杆菌HZ-9生产微生物菌剂的方法，将甲基营养型芽孢杆菌HZ-9的二级种子液接种于发酵培养基进行发酵培养得到液体菌剂，发酵条件：转速为100-120r/min、温度为30-32℃、通气量为1：0.5-1.6、压力为0.05-0.06MPa、培养时间为24-28h。

上述方法，将得到的液体菌剂进行6000-8000r/min离心，收集沉淀物，向沉淀物中缓慢加入沉淀物重量百分比6-10％的玉米粉混合均匀，喷雾干燥，即得固体菌剂。

上述方法，所用甲基营养型芽孢杆菌HZ-9的二级种子液可以通过常规方法获得，还可以通过下述步骤获得：

（1）菌种活化：将甲基营养型芽孢杆菌HZ-9接种于LB固体培养基平板，30℃培养20-24h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板，30℃培养16-20h，备用；

（2）一级种子液制备：将活化的HZ-9菌株接种于LB液体培养基，30℃、200r/min、摇瓶培养16h，备用；

（3）二级种子液制备：将一级种子液接种于发酵培养基，转速200-400r/min、温度28-30℃、通气量1∶0.5-1.6、压力0.05-0.06MPa、培养28-36h，得种子液。

上述方法，

所述通气量为每分钟通入空气的体积与发酵液的体积的比值；

LB固体培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、琼脂15g、蒸馏水1L，121℃灭菌30min；

LB液体培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、蒸馏水1L，121℃灭菌30min；

发酵培养基：葡萄糖10g、淀粉10g、可溶性玉米浆5g、硫酸铵1.5g、磷酸二氢钾0.5g、碳酸钙1g，蒸馏水1L，121℃灭菌30min。

本发明所制备的微生物菌剂为液体菌剂或固体粉剂，其活性成分为甲基营养型芽孢杆菌HZ-9的芽孢及其孢外代谢物。

本发明还提供了微生物菌剂的具体使用方法：液体菌剂与水按照1:100的体积比例混合均匀，灌根；固体菌剂按照4-6kg/亩用量，灌根施用；两种菌剂均可以作为生物有机肥、复合微生物肥料菌种使用。

本发明具有以下优点：

1、甲基营养型芽孢杆菌HZ-9菌株具有较广的抑菌谱，能够在红掌根际稳定定殖。

2、利用甲基营养型芽孢杆菌HZ-9生产的菌剂可有效防治红掌细菌性叶斑病、葡萄炭疽病、杨树腐烂病以及黄瓜枯萎病等。

3、甲基营养型芽孢杆菌HZ-9无污染，无生态毒性，安全性好，传代抑菌性状稳定。

4、甲基营养型芽孢杆菌HZ-9发酵性状好，菌剂生产工艺简单、周期短，成本低，利于工业化生产、运输。

保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2017年4月13日；

保藏编号：CGMCC No.14022；

分类命名：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

附图说明

图1为根据16SrDNA序列，利用Mega5.05分析构建的HZ-9菌株的系统进化树；由图1可以看出HZ-9菌株与已知菌株Bacillus methylotrophicus(JF899288)的16SrDNA同源性达到99%，结合HZ-9菌株的菌体形态、菌落特征及生理生化指标的测定结果，将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

图2为甲基营养型芽孢杆菌HZ-9的抑菌谱。

具体实施方式

下述实施例中：

PDA固体培养基：马铃薯200g、牛肉膏5g、葡萄糖20g、琼脂15g、(NH4)₂SO₄ 1g、MgSO₄ 1g、KH₂PO₄ 0.6g、CaCO₃ 3g、琼脂粉15g、蒸馏水1L，pH 6.8-7.2，121℃灭菌30min；

LB固体培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、琼脂粉15g、蒸馏水1L，121℃灭菌30min；

LB液体培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、蒸馏水1L，121℃灭菌30min。

发酵培养基：葡萄糖10g、淀粉10g、可溶性玉米浆5g、硫酸铵1.5g、磷酸二氢钾0.5g、碳酸钙1g、蒸馏水1L，121℃灭菌30min。

实施例1

1、HZ-9菌株的分离

无菌条件下取采集的红掌根际土样5g，将其溶于45mL的无菌水中，28℃、220r/min条件下振荡1h，吸取0.5mL与4.5mL无菌水混匀，得到10^-1的稀释液，再取0.5mL 10^-1的稀释液与4.5mL无菌水混匀，即得10^-2的稀释液，依稀类推，制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等一系列稀释液。将10^-4、10^-5、10^-6的稀释液，分别用移液器吸取100μL加入PDA固体培养基平板中央，用涂布器将稀释液在各PDA固体培养基平板上涂抹均匀，于37℃生化培养箱恒温培养1-3天。在平板中用接种环挑取各个菌株的单菌落，在LB固体培养基平板划线成纯培养物，保存。

将上述获得的若干株纯培养物进行平板对峙试验，以红掌细菌性叶斑病菌为指示菌，观察抑菌情况，测量抑菌带宽度，筛选获得抑菌效果强的菌株，命名为HZ-9菌株，于2017年4月13日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保存，保藏号为CGMCCNo.14022。

2、HZ-9菌株的鉴定

（1）菌体形态与菌落特征

HZ-9菌株在LB固体培养基上生长12h后：其菌落隆起，表面干燥，为白色、不透明圆形；菌体为杆状，无鞭毛。

（2）生理生化特征

HZ-9菌株的生理生化特征见表1，该菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧发酵型，接触酶、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P测定、明胶液化、柠檬酸盐利用和氮源利用等反应为阳性；甲基红试验和苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性；可在NaCl浓度为2%和5%的LB液体培养基生长。

表1 HZ-9菌株的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

（3）菌株16S rDNA序列分析

HZ-9菌株的16S rDNA序列长度为1454bp，如SEQ ID NO.1所示，将此序列与GenBank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于甲基营养型芽孢杆菌。选取10株与HZ-9菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega5.05软件，采取Neighbor-Joining法构建以16S rDNA序列为基础的系统进化树(附图1)。HZ-9菌株的16S rDNA序列同公开发表的Bacillus methylotrophicus(JF899288)的16S rDNA的同源性达到99%，结合其菌体形态、菌落特征和生理生化特征，将其鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

实施例2

HZ-9菌株的抑菌谱测定

用接种环挑取一环纯化的菌体，点在距PDA平板中央两端3cm处，以实验室保存的葡萄炭疽病菌、尖孢镰刀菌、杨树腐烂病菌、立枯丝核菌、灰霉菌5种病原真菌为靶标，用打孔器切下直径为5mm的菌盘接种于PDA平板中央，28℃培养3-5天，试验结果表明HZ-9菌株对葡萄炭疽病菌、尖孢镰刀菌、杨树腐烂病菌、立枯丝核菌、灰霉菌有较好的拮抗效果，试验结果见表2、附图2。

表2 HZ-9菌株对多种植物病原真菌的拮抗作用

注：“+”表示抑菌带宽度<2mm，“++”表示抑菌带宽度为2-5mm，

“+++”表示抑菌带宽度>5mm。

实施例3

1、HZ-9菌株在红掌根际以及叶片、叶柄表面的定殖能力测定

（1）HZ-9菌株的双抗生素筛选及稳定性检测

将HZ-9菌株接种到LB液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h，作为种子液。将种子液以2%（体积百分比）的接种量接种到含5μg/mL利福平的LB液体培养基中，30℃、200r/min摇瓶培养24h；将该培养液以2%（体积百分比）的接种量接种到含10μg/mL利福平的LB液体培养基中，摇床培养24h；依次类推，使利福平的浓度逐渐由5μg/mL、10μg/mL、20µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、150μg/mL直至增加到300µg/mL，培养得到抗利福平的菌株。

将得到的抗利福平菌株接种到含300µg/mL利福平和5μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中，对抗利福平和壮观霉素的双抗菌株进行筛选，筛选过程中，LB液体培养基中利福平的浓度始终为300µg/mL，壮观霉素浓度逐渐由5μg/mL、10μg/mL、20µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、150μg/m直至增加到300µg/mL，最终获得同时抗利福平和壮观霉素的初始双抗标记菌株。

将筛选的双抗标记突变菌株在不含利福平和壮观霉素的LB固体培养基和LB液体培养基中交替培养3-5代，再回接到含利福平300µg/mL和壮观霉素300µg/mL的LB液体培养基中进行检测，以证实其耐药性的稳定性，最终获得能够稳定遗传的同时抗利福平和壮观霉素的双抗标记菌株。

（2）定殖试验

将双抗标记的HZ-9菌株接种到LB液体培养基中，于30℃、200r/min培养18-20h，作为种子液。将种子液以2%（体积百分比）的接种量接种到同时含有利福平300µg/mL和壮观霉素300µg/mL的LB液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养18-20h；再将该培养液以2%（体积百分比）的接种量接种到LB液体培养基中，30℃，200r/mim振荡培养18-20h，即得到双抗标记的HZ-9菌株菌液。

本发明通过盆栽实验，对HZ-9菌株在红掌根际以及叶片、叶柄表面的定殖能力进行了研究。

HZ-9菌株在红掌根际的定殖试验

花盆内径22cm，每盆种植红掌1棵，3个重复。去除红掌根部的表面土，每盆接种5mL培养好的双抗标记的HZ-9菌株菌液，然后将表面土重新覆盖好。接种菌液后的第15天、30天、45天和60天，分别采集红掌根际土样。无菌环境下称取红掌根际土5g，加入装有45mL无菌水的三角瓶中，混匀并在28℃条件下恒温振荡1h，使细菌细胞充分分散，吸取0.5mL与4.5mL无菌水混匀，得到10^-1稀释液；向装有4.5mL无菌水的小试管中加入0.5mL10^-1稀释液，混匀得10^-2稀释液；依次类推，得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8等一系列稀释液。取不同浓度稀释液100µL分别加入双抗平板中央，用涂布器在平板中均匀涂布，在30℃的培养箱中培养2d之后进行菌落计数，试验结果见表3。由表3可知，接种HZ-9菌株后第15天，红掌根际土壤中的HZ-9菌落数为3.2×10⁸cfu/g；第30天，红掌根际土壤中的HZ-9菌落数为5.2×10⁷cfu/g；第45天，红掌根际土壤中的HZ-9菌落数稍有下降；第60天，红掌根际土壤中的HZ-9菌落数为2.0×10⁷cfu/g，基本维持稳定。根据对HZ-9菌株在红掌根际60天定殖菌落数量的跟踪，表明HZ-9菌株能够在红掌根际稳定定殖。

表3 HZ-9菌株在红掌根际的定殖结果

HZ-9菌株在红掌叶片、叶柄表面的定殖试验

花盆内径22cm，每盆种植红掌1棵，3个重复。用小型喷雾器将培养好的双抗标记的HZ-9菌株菌液均匀喷施在叶片和叶柄表面，每株喷施5mL。喷施菌液后的第7天、14天、21天、28天，分别采集叶片和叶柄样本。无菌环境下分别称取叶片和叶柄5g和1g，分别加入装有45g和9g无菌水的三角瓶中，28℃条件下恒温振荡30 min，将液体梯度稀释涂布双抗平板（方法同根际定殖试验），在30℃的培养箱中培养2天之后进行菌落计数，试验结果见表4。由表4可知，接种HZ-9菌株后第7天，叶片定殖菌落数为2.2×10⁵cfu/g，叶柄定殖菌落数为5.0×10⁴cfu/g；第14天，叶片定殖菌落数为9.6×10⁴ cfu/g，叶柄定殖菌落数下降为4.2×10² cfu/g；第21天，叶片定殖菌落数下降为5.0×10³ cfu/g，叶柄定殖菌落数下降为3.1×10² cfu/g；第28天，叶片定殖菌落数为1.5×10³ cfu/g，叶柄定殖菌落数为2.9×10² cfu/g，基本维持稳定。根据对HZ-9菌株在红掌叶片、叶柄28天定殖数量的跟踪，表明HZ-9菌株能够在红掌叶片、叶柄表面稳定定殖。

表4 HZ-9菌株在红掌叶片、叶柄的定殖结果

时间（天）	叶片定殖菌落数（cfu/g）	叶柄定殖菌落数（cfu/g）
			7	2.2×10<sup>5</sup>	5.0×10<sup>4</sup>
14	9.6×10<sup>4</sup>	4.2×10<sup>2</sup>
			21	5.0×10<sup>3</sup>	3.1×10<sup>2</sup>
28	1.5×10<sup>3</sup>	2.9×10<sup>2</sup>

实施例4

HZ-9菌株最佳产芽孢发酵培养基配方优化

HZ-9菌株基础配方的选择基于培养基材料来源方便、成本低、组成成分简单等原则，从本实验室经验发酵配方中筛选获得。分别选择葡萄糖为速效碳源，淀粉和玉米浆为缓效碳氮源，碳酸钙、硫酸铵和磷酸二氢钾三种无机盐，进行6个因素3个水平正交试验设计，试验因素和水平设置见表5。

将HZ-9菌株接种到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃、200r/min培养至对数期，然后接种至发酵培养基（配方见表5）中，接种量为发酵培养基的2%（体积百分比），30℃、200r/min培养，直至在显微镜下观察芽孢转化率达到95%以上，涂布平板并计数，计算发酵液中的芽孢数。HZ-9菌株产芽孢发酵结果数据分析见表6，从表6中可以看出， 17号发酵培养基的芽孢数量达到4.0×10⁹cfu/mL，与其他发酵培养基的菌落数存在显著差异。最终得到的最佳产芽孢发酵培养基配方为：葡萄糖10g、淀粉10g、玉米浆5g、硫酸铵1.5g、磷酸二氢钾0.5g、碳酸钙1g、水1L。

表5 因素与水平的设置

表6 HZ-9菌株产芽孢发酵培养基优化数据分析

注：数据后面的大写字母为处理间的多重比较结果，α=0.01。

实施例5

甲基营养型芽孢杆菌HZ-9菌剂的制备

（1）菌种活化：将低温保存的HZ-9菌株划线或涂布接种于LB固体培养基平板上，于30℃培养24-36h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基上平板上，30℃下培养16-24h，备用。

（2）一级种子液制备：用接种环刮取两环已活化的HZ-9菌株菌苔，接种于50mL的LB液体培养基中，30℃、200r/min摇瓶培养16h，备用。

（3）二级种子液制备：将步骤（2）所得的一级种子液按照1%-2%（体积百分比）的接种量接入2吨发酵罐中扩大培养制备的二级种子液，转速120r/min、温度30-32℃、通气量6m³/h、罐压0.05-0.06MPa，培养12-16h，作为二级种子液；所用培养基为发酵培养基。

（4）发酵培养：将步骤（3）所得二级种子液按照10%（体积百分比）的接种量接入20吨发酵罐中进行发酵，转速120r/min、温度为30-32℃、通气为量60m³/h、罐压0.05-0.06MPa，培养时间为24-28h，芽孢得率大于90%，即得到HZ-9菌株的液体菌剂；所用培养基为发酵培养基。

（5）固体菌剂制备：将发酵完成的HZ-9菌株发酵液，经碟式离心机6700r/min离心，收集所有沉淀物泵入搅拌器，慢慢加入玉米粉作为载体基质，加入玉米粉的量为沉淀物的6-10%（w/w），搅拌均匀后被输送至离心式喷雾干燥机，通过雾化器分散和高温空气迅速蒸干，料液中的固体物质形成粉状产品，最后通过旋风分离器收集，即得HZ-9菌株的固体菌剂；所得固体菌剂中活体菌数可达1200亿cfu/g。

实施例6

甲基营养型芽孢杆菌HZ-9对红掌叶斑病的防控效果

红掌叶斑病病原菌菌液的制备：用接种环刮取红掌叶斑病菌菌苔，放入无菌水中混合均匀，使其浓度达到1×10⁶cfu/mL。选取大小长势一致的健康红掌幼苗，分为三个试验处理：（1）CK空白：不施加病原菌和菌剂；（2）病原菌对照：施加病原菌，不施加菌剂；（3）菌剂处理：施加病原菌和菌剂。每个处理20株红掌幼苗。其中，病原菌对照组和菌剂处理组，将红掌幼苗伤根浸泡在浓度为1×10⁶ cfu/mL的病原菌菌液中30min；CK空白组将红掌幼苗伤根浸泡在等量的清水中。浸泡后将红掌幼苗移栽至直径22cm的塑料盆中；菌剂处理组施加菌剂（实施例6制备的液体菌剂稀释50倍）、每盆100mL，CK空白组和病原菌对照组施加等量清水；每隔7天再重复施入等量的菌剂及清水；试验期间，各处理盆栽管理措施一致，每天观察各处理的发病情况，待病原菌对照组的发病率达到80%以上时，调查各处理的病情指数、测量株高并计算相对防效。经过跟踪观察，红掌幼苗在移栽20天时，CK空白组没有发病，病原菌对照组和菌剂处理组开始发病，待移栽35天时病原菌对照组的红掌幼苗发病率达到80%以上。调查各处理的病情指数，病原菌对照组的病情指数为25.32、相对防效为0，菌剂处理组的病情指数为12.64、相对防效为50.1%；结果如表7所示。试验结果表明HZ-9菌株菌剂对于红掌细菌性叶斑病具有较好的防治效果。

表7 甲基营养型芽孢杆菌HZ-9菌株对红掌叶斑病的防控效果

<110>山东农业大学

<120>一株甲基营养型芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用

<160>1

<210>1

<211>1454

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

AGGGCGGGCG TGCTAATACA TGCAAGTCGA GCGGACAGAT GGGAGCTTGC TCCCTGATGT 60

TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGT AACCTGCCTG TAAGACTGGG ATAACTCCGG 120

GAAACCGGGG CTAATACCGG ATGGTTGTCT GAACCGCATG GTTCAGACAT AAAAGGTGGC 180

TTCGGCTACC ACTTACAGAT GGACCCGCGG CGCATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC 240

ACCAAGGCGA CGATGCGTAG CCGACCTGAG AGGGTGATCG GCCACACTGG GACTGAGACA 300

CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA GGGAATCTTC CGCAATGGAC GAAAGTCTGA 360

CGGAGCAACG CCGCGTGAGT GATGAAGGTT TTCGGATCGT AAAGCTCTGT TGTTAGGGAA 420

GAACAAGTGC CGTTCAAATA GGGCGGCACC TTGACGGTAC CTAACCAGAA AGCCACGGCT 480

AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGTGGCAAG CGTTGTCCGG AATTATTGGG 540

CGTAAAGGGC TCGCAGGCGG TTTCTTAAGT CTGATGTGAA AGCCCCCGGC TCAACCGGGG 600

AGGGTCATTG GAAACTGGGG AACTTGAGTG CAGAAGAGGA GAGTGGAATT CCACGTGTAG 660

CGGTGAAATG CGTAGAGATG TGGAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACTCT CTGGTCTGTA 720

ACTGACGCTG AGGAGCGAAA GCGTGGGGAG CGAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC 780

GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTAGGG GGTTTCCGCC CCTTAGTGCT GCAGCTAACG 840

CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGGTC GCAAGACTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG 900

GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG 960

GTCTTGACAT CCTCTGACAA TCCTAGAGAT AGGACGTCCC CTTCGGGGGC AGAGTGACAG 1020

GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC 1080

GCAACCCTTG ATCTTAGTTG CCAGCATTCA GTTGGGCACT CTAAGGTGAC TGCCGGTGAC 1140

AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC 1200

ACGTGCTACA ATGGACAGAA CAAAGGGCAG CGAAACCGCG AGGTTAAGCC AATCCCACAA 1260

ATCTGTTCTC AGTTCGGATC GCAGTCTGCA ACTCGACTGC GTGAAGCTGG AATCGCTAGT 1320

AATCGCGGAT CAGCATGCCG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA 1380

CACCAGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGG TGAGGTAACC TTTATGGAGC CAGCCGCCGA 1440

AAGGTGACCA AGGT 1454

Claims (7)

1.一株能对红掌细菌性叶斑病起防控作用的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，其分类命名为Bacillus methylotrophicus，保藏号为CGMCC No.14022。

2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，其特征在于，菌体为杆状，无鞭毛，为兼性厌氧发酵型，接触酶、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P测定、明胶液化、柠檬酸盐利用和氮源利用反应为阳性，甲基红试验和苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性，能在NaCl质量浓度为2％和5％的LB固体培养基生长，生长12h后菌落隆起，表面干燥，为白色、不透明圆形。

3.根据权利要求1或2所述的甲基营养型芽孢杆菌HZ-9，其特征在于，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1-3任一项所述甲基营养型芽孢杆菌HZ-9在红掌细菌性叶斑病的预防和控制中的应用。

5.一种利用权利要求1、2或3所述甲基营养型芽孢杆菌HZ-9生产微生物菌剂的方法，其特征在于，将甲基营养型芽孢杆菌HZ-9的二级种子液接种于发酵培养基进行发酵培养得到液体菌剂，所述的发酵培养基具体成分为：葡萄糖10g、淀粉10g、可溶性玉米浆5g、硫酸铵1.5g、磷酸二氢钾0.5g、碳酸钙1g，蒸馏水1L；所述的发酵条件为：转速为100-120r/min、温度为30-32℃、通气量为1：0.5-1.6、压力为0.05-0.06MPa、培养时间为24-28h。

6.一种采用权利要求5所述方法制备的微生物菌剂。

7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，其活性成分为甲基营养型芽孢杆菌HZ-9的芽孢及其孢外代谢物。

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