CN106318920B - 黄酮-6-羟化酶及其在灯盏乙素合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黄酮‑6‑羟化酶及其在灯盏乙素合成中的应用，具体地，本发明提供了一种黄酮‑6‑羟化酶，它可催化芹菜素6位的羟基化反应，并可获得野黄芩素。此外，本发明还提供了一种利用糖基化转移酶和糖基供体，将野黄芩素制成灯盏乙素的方法。

Description

黄酮-6-羟化酶及其在灯盏乙素合成中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及黄酮-6-羟化酶及其在灯盏乙素合成中的应用。

背景技术

灯盏花是菊科植物短葶飞蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz]的干燥全草，性寒、微苦、甘温辛，具有微寒解毒、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛的功效。灯盏花类药品在临床上的应用效果显著，被列为国家重点发展的中草药品种和中医治疗心脑血管疾病临床必备急救药品。灯盏花注射液在临床上除主要用于心脑血管系统疾病外，在糖尿病、肾病、颈性眩晕、老年性疾病的治疗上也有较好的疗效。云南药物研究所等单位对灯盏花进行了化学和药理的研究，并从灯盏细辛中分离鉴定了多种化学成分,主要活性成分包括灯盏乙素和少量灯盏甲素(其中灯盏乙素的含量占90％以上)。

灯盏乙素的天然合成途径目前尚不清晰，2013年，Anna Berim和David R.Gang在紫花罗勒(Ocimum basilicum L.)和薄荷(Mentha piperita L.)中都发现了一种可以催化7位甲基化黄酮进行6位羟基化的P450酶(CYP82D)，但均未报道在灯盏乙素合成中具备功能。目前灯盏乙素合成过程中的F6H尚不清楚。

目前尚无灯盏花来源的黄酮6位羟化酶的相关报道，因此本领域迫切需要开发一种天然合成野黄芩素和灯盏乙素的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天然合成野黄芩素和灯盏乙素的方法。

本发明第一方面提供了一种用于催化芹菜素6位羟基化的黄酮-6-羟化酶，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有催化芹菜素6位羟基化活性的衍生蛋白；

(c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；

(d)氨基酸序列与SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列的同源性≥65％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，并具有催化芹菜素6位羟基化活性的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

在另一优选例中，所述黄酮-6-羟化酶来自菊科，较佳地，来自灯盏花。

在另一优选例中，所述SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列可与化合物融合，其中所述化合物为延长所述蛋白半衰期的化合物。

在另一优选例中，所述化合物包括聚乙二醇。

在另一优选例中，所述的蛋白为SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列的蛋白。

本发明第二方面提供了一种分离的核苷酸，所述核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NOs.:1所示蛋白的核苷酸序列；

(b)如SEQ ID NOs.:2所示的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NOs.:2所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)的核苷酸序列；

(d)在SEQ ID NOs.:2所示核苷酸序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸所形成的核苷酸序列；

(e)与(a)-(d)任一所述的核苷酸序列互补(较佳地完全互补)的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的核苷酸的序列如SEQ ID NOs.:2所示。

在另一优选例中，序列如SEQ ID NOs.:2所示的多核苷酸编码氨基酸序列如SEQID NOs.:1所示的多肽。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体选自下组：表达载体、穿梭载体、整合载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体选自下组：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述载体包括在酵母中表达的载体，如YCp系列载体、YEp系列载体、YIp系列载体、pCS系列载体、pRS系列载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为低等真核细胞，如酵母细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞，如细菌细胞，较佳地，大肠杆菌。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：酿酒酵母、大肠杆菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为酿酒酵母细胞。

本发明第五方面提供了一种黄酮-6-羟化酶的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的黄酮-6-羟化酶。

本发明第六方面提供了一种黄酮-6-羟化酶或其衍生蛋白或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述宿主细胞的用途，用于催化芹菜素的6位羟基化。

在另一优选例中，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：SEQ ID NO.:1、3、4、5中任一条所示氨基酸序列的蛋白。

在另一优选例中，所述黄酮-6-羟化酶的来源选自下组的一种或多种植物：灯盏花、朝鲜蓟、紫花罗勒、薄荷。

本发明第七方面提供了一种催化芹菜素的6位羟基化的方法，包括步骤：

在黄酮-6-羟化酶或其衍生蛋白存在下，进行芹菜素6位羟基化的催化反应。

在另一优选例中，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：SEQ ID NO.:1、3、4、5中任一条所示氨基酸序列的蛋白。

在另一优选例中，所述黄酮-6-羟化酶的来源选自下组的一种或多种植物：灯盏花、朝鲜蓟、紫花罗勒、薄荷。

本发明第八方面提供了一种制备野黄芩素的方法，包括步骤：

在细胞色素还原酶(CPR)存在下，利用黄酮-6-羟化酶催化芹菜素，从而得到野黄芩素；

在另一优选例中，所述方法还包括制备黄酮-6-羟化酶的步骤。

在另一优选例中，所述黄酮-6-羟化酶的制备步骤如下所述：

(a)将SEQ ID NO.:2、6、7、8中任一条所所示的核苷酸序列或含有所述核苷酸序列的重组表达载体导入宿主细胞，培养所述的宿主细胞；和

(b)从培养物中分离出所述的黄酮-6-羟化酶。

本发明第九方面提供了一种制备灯盏乙素的方法，包括步骤：

(i)在细胞色素还原酶(CPR)存在下，利用黄酮-6-羟化酶催化芹菜素，从而得到野黄芩素；

和

(ii)对步骤(i)获得的野黄芩素进行糖基化反应，从而得到灯盏乙素；

在另一优选例中，所述步骤(ii)在糖基转移酶和糖基供体存在的条件下进行。

在另一优选例中，所述糖基转移酶选自下组：黄酮-7-糖基转移酶F7GAT、黄酮-7-糖基转移酶UGT73C6、黄酮-7-糖基转移酶UGT73B1、黄酮-7-糖基转移酶UBGAT、或其组合。

在另一优选例中，所述糖基转移酶的来源选自下组的一种或多种植物：灯盏花、拟南芥、黄芩、或其组合。

在另一优选例中，所述糖基供体选自下组：UDP－葡萄糖醛酸、UDP－葡萄糖、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为EbF6H、CcsF6H、ObF6H及MpF6H的进化分析图。

图2为EbF6H、CcsF6H、ObF6H及MpF6H编码基因PCR电泳图。

图3为重组质粒Y22-ATR2-EbF6H、Y22-ATR2-CcsF6H、Y22-ATR2-ObF6H、Y22-ATR2-MpF6H用SpeI的酶切电泳图。

图4为重组质粒Y22-ATR2-EbF6H的质粒图谱示意图。

图5为重组质粒Y22-ATR2-CcsF6H的质粒图谱示意图。

图6为重组质粒Y22-ATR2-ObF6H的质粒图谱示意图。

图7为重组质粒Y22-ATR2-MpF6H的质粒图谱示意图。

图8为EbF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素的HPLC-MS分析图。

图9为EbF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素，之后野黄芩素经过糖基化修饰加上UDP-葡萄糖醛酸生产灯盏乙素的HPLC-MS分析图。

图10为CcsF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素的HPLC-MS分析图。

图11为CcsF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素，之后野黄芩素经过糖基化修饰加上UDP-葡萄糖醛酸生产灯盏乙素的HPLC-MS分析图。

图12为ObF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素的HPLC-MS分析图。

图13为ObF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素，之后野黄芩素经过糖基化修饰加上UDP-葡萄糖醛酸生产灯盏乙素的HPLC-MS分析图。

图14为MpF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素的HPLC-MS分析图。

图15为MpF6H催化芹菜素6位羟基化反应合成野黄芩素，之后野黄芩素经过糖基化修饰加上UDP-葡萄糖醛酸生产灯盏乙素的HPLC-MS分析图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的发现，来源于灯盏花、朝鲜蓟、紫花罗勒、或薄荷的黄酮-6-羟化酶均可催化芹菜素6位的羟基化反应，从而得到野黄芩素。此外，本发明人还发现，在糖基转移酶(如UDP-葡萄糖醛酸合成酶(UDPGDH))和糖基供体(如UDP-葡萄糖醛酸)存在下，对野黄芩素的C7位进行糖基化反应，可获得灯盏乙素。在此基础上，本发明人完成了本发明。

黄酮-6-羟化酶

如本文所用，术语“本发明的蛋白”、“本发明的多肽”、“黄酮-6-羟化酶”、“本发明的酶”可互换使用，均指催化芹菜素的C6羟基化酶。在本发明中，所述黄酮-6-羟化酶为SEQID NO.:1、3、4、5所示的蛋白或其衍生蛋白，所述黄酮-6-羟化酶分别来源于灯盏花、朝鲜蓟、紫花罗勒、薄荷四种植物，分别命名为EbF6H、CcsF6H、ObF6H、MpF6H，并且通过同源序列比对，发现SEQ ID NO：1所示的蛋白序列与SEQ ID NO：3所示的蛋白的相似度为69％。灯盏花来源的黄酮-6-羟化酶与其他物种的黄酮-6-羟化酶的同源性比对结果见图1。

本文所用的术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。因此，本文所用的术语“分离的黄酮-6-羟化酶”是指所述蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明的黄酮-6-羟化酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的条带。然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“黄酮-6-羟化酶”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“本发明的黄酮-6-羟化酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:1、3、4或5所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-6个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括黄酮-6-羟化酶蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的黄酮-6-羟化酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的黄酮-6-羟化酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的黄酮-6-羟化酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的黄酮-6-羟化酶”的氨基酸序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供“黄酮-6-羟化酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的黄酮-6-羟化酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“黄酮-6-羟化酶”的保守性变异多肽指与SEQ ID NO:1、3、4或5所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、4或5所示蛋白相同或相似的活性，即，催化芹菜素6位羟基化的活性。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本领域技术人员明白，本发明的“黄酮-6-羟化酶”还包括“黄酮-6-羟化酶”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“黄酮-6-羟化酶”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明黄酮-6-羟化酶的活性片段。因此，任何一种“黄酮-6-羟化酶”的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，“黄酮-6-羟化酶”的生物活性片段是指“黄酮-6-羟化酶”的片段，但其仍然能保持全长“黄酮-6-羟化酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“黄酮-6-羟化酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“黄酮-6-羟化酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的黄酮-6-羟化酶制成固定化酶等其它利用形式。

本发明还提供了编码本发明“黄酮-6-羟化酶”或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:2、6、7或8所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:1、3、4或5所示的蛋白质，但与SEQ ID NO.:2、6、7或8所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.:1、3、4或5所示的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1、3、4或5所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码“黄酮-6-羟化酶”的多聚核苷酸。

本发明的“黄酮-6-羟化酶”核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

在优选的实施方式中，所述“黄酮-6-羟化酶”是：(a)具有SEQ ID NO.:1、3、4或5所示氨基酸序列的蛋白；或(b)由SEQ ID NO.:1、3、4或5所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有“黄酮-6-羟化酶”功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)由SEQ ID NO.:1、3、4或5所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；或(d)在SEQ ID NO.:1、3、4或5所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白。

相应地，所述“黄酮-6-羟化酶”的编码基因是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、4或5所示的蛋白的编码核苷酸序列；或

(b)由SEQ ID NO.:1、3、4或5所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3、4或5所示蛋白功能的衍生蛋白的编码核苷酸序列；或

(c)由SEQ ID NO.:1、3、4或5所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白的编码序列；或

(d)在SEQ ID NO:1、3、4或5所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。

在进一步优选的实施方式中，所述“黄酮-6-羟化酶”的编码基因是：(i)具有SEQID NO.:2、6、7、8所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO.:2、6、7、8所示序列互补的多核苷酸。

细胞色素还原酶(CPR)

细胞色素还原酶(CPR)是P450酶发挥作用的主要电子供体。在本发明中，催化芹菜素6位羟基化的酶(即，黄酮-6-羟化酶)是一种P450酶，可与CPR共同作用，从而催化芹菜素，得到野黄芩素。

表达载体

本发明也涉及包含本发明编码序列的表达载体，以及用本发明的表达载体或“黄酮-6-羟化酶”编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的“黄酮-6-羟化酶”。一般来说有以下步骤：

1.用本发明的编码“黄酮-6-羟化酶”的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；

3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，“黄酮-6-羟化酶”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“黄酮-6-羟化酶”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本文所述的宿主细胞包括包含表达载体或基因组上整合了本发明“黄酮-6-羟化酶”编码序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够高效表达具有芹菜素C6羟基化性能的黄酮-6-羟化酶，本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：酿酒酵母或大肠杆菌。在优选的实施方式中，所述菌株为酿酒酵母。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。当宿主是酿酒酵母，可选用醋酸锂转化的方法

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的黄酮-6-羟化酶及其编码序列、表达载体、宿主细胞可用于催化芹菜素的C6羟基化。

灯盏乙素的制备方法

本发明还提供了一种灯盏乙素的制备方法，包括步骤：

(i)在细胞色素还原酶(CPR)存在下，利用黄酮-6-羟化酶催化芹菜素，从而得到野黄芩素；

和

(ii)对步骤(i)获得的野黄芩素进行糖基化反应，从而得到灯盏乙素；

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现黄酮-6-羟化酶可对芹菜素的C6进行羟基化的催化反应，从而获得野黄芩素。

(2)本发明首次提供了灯盏花来源的黄酮-6-羟化酶，并发现灯盏花来源的黄酮-6-羟化酶能够催化芹菜素的C6进行羟基化的催化反应，从而获得野黄芩素，此外，本发明还首次揭示朝鲜蓟、紫花罗勒、薄荷四种植物来源的黄酮-6-羟化酶也具有催化芹菜素的C6进行羟基化的催化反应的功能。

(3)本发明首次提供了一种制备灯盏乙素的新途径，通过黄酮-6-羟化酶将芹菜素催化为野黄芩素，之后在糖基转移酶和糖基供体存在下，将获得的野黄芩素进一步转化为灯盏乙素。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如果没有特别说明，实施例中所用的材料均为市售产品。

本发明中所用的基因序列SEQ ID NO：6由苏州泓迅生物科技有限公司合成。其余的基因序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物由天津工业生物技术研究所合成。

在本发明中，灯盏花、朝鲜蓟、紫花罗勒、薄荷四种植物来源的具有黄酮化合物6位羟化酶功能的多肽，分别分别命名为EbF6H、CcsF6H、ObF6H、MpF6H，分别为SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的多肽。

实施例1 EbF6H编码核苷酸的获得

根据本发明提供的核苷酸序列信息(SEQ ID NO.:2)，通过对灯盏花的RNA逆转录组扩增或分离得到。具体来说，可使用常规方法或利用Easy spin plus植物RNA快速提取试剂盒(购自北京艾德莱生物科技有限公司)从植物中提取RNA，然后以获得的RNA为模板，利用First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo，USA)按照试剂盒上的操作步骤逆转录获得的cDNA，以之为模板，使用引物EbF6H-F1(SEQ ID NO：9)和EbF6H-R1(SEQ ID NO：10)利用常规PCR方法，特异性扩增EbF6H的编码核苷酸。PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

实施例2 CcsF6H的编码核苷酸的获得

利用灯盏花EbF6H的氨基酸序列与其他菊科物种中进行序列比对,发现目前已经基因组测序的另一个菊科物种朝鲜蓟中存在一个与EbF6H相似度约在69％的氨基酸序列，其Genbank编号为KVH90146.1。经鉴定，推断该基因也具有类似的黄酮类6位羟基化功能，并命名为CcsF6H。

根据氨基酸序列SEQ ID NO：3针对目标宿主细胞(酿酒酵母)对核苷酸序列密码子优化后进行人工合成得到SEQ ID NO：6所示的序列。以CcsF6H-F1(SEQ ID NO：11)和CcsF6H-R1(SEQ ID NO：12)为引物，利用常规PCR方法，特异性扩增CcsF6H的编码核苷酸。PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

实施例3 ObF6H和MpF6H的编码核苷酸的获得

根据序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的信息对基因ObF6H(Genbank编号为AGF30364.1)和MpF6H(Genbank编号为AGF30366.1)的编码核苷酸进行人工合成，也可以根据氨基酸序列SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5，针对目标宿主细胞(酿酒酵母)对核苷酸序列密码子优化后进行人工合成得到SEQ ID NO.:7和8所示的序列。分别以ObF6H-F1(SEQ ID NO：13)和ObF6H-R1(SEQ ID NO：14)、MpF6H-F1(SEQ ID NO：15)和MpF6H-R1(SEQ ID NO：16)为引物，利用常规PCR方法，特异性扩增ObF6H和MpF6H的编码核苷酸。PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。四种植物来源的F6H进化关系如图1所示。

实施例4利用Golden Gate克隆构建方法分别构建EbF6H、CcsF6H、ObF6H、MpF6H表达载体

针对表达EbF6H、CcsF6H、ObF6H、MpF6H宿主细胞的不同，选取穿梭质粒载体进行YCPlacz-22克隆构建。

4.1基因片段的扩增、纯化

以EbF6H-F1(SEQ ID NO：12)和EbF6H-R1(SEQ ID NO：13)为引物，以包含EbF6H编码核苷酸序列的cDNA为模板进行常规PCR，得到EbF6H的编码核苷酸，并将所得的扩增片段进行切胶纯化；

分别以CcsF6H-F1(SEQ ID NO：14)和CcsF6H-R1(SEQ ID NO：15)、ObF6H-F1(SEQID NO：16)和ObF6H-R1(SEQ ID NO：17)、MpF6H-F1(SEQ ID NO：18)和MpF6H-R1(SEQ ID NO：19)为引物，以人工合成的密码子优化后的CcsF6H、ObF6H、MpF6H的编码核苷酸序列为模板，进行常规PCR，得到用于克隆构建的CcsF6H、ObF6H、MpF6H的编码核苷酸序列片段(图2)，并将所得的扩增片段进行切胶纯化；

根据拟南芥(Arabidopsi s thaliana)来源的p450还原酶(ATR2)基因序列(Genbank号：145361355，2139bp，SEQ ID NO：9)设计引物ATR2-F(SEQ ID NO：20)和ATR2-R(SEQ ID NO：21)，以拟南芥cDNA为模板进行常规PCR得到ATR2的编码核苷酸，并将所得的扩增片段进行切胶纯化；

根据序列SEQ ID NO：10的信息人工合成双向启动子PGK1+TDH3的核苷酸。以此为模板，使用引物PGK1+TDH-F(SEQ ID NO：22)和PGK1+TDH-R(SEQ ID NO：23)，利用常规PCR方法，特异性扩增双向启动子PGK1+TDH3的核苷酸，并将所得的扩增片段进行切胶纯化。

根据序列SEQ ID NO：11的信息人工合成空载体YCplac22(GenBank号:X75455.1)的核苷酸。以此为模板，使用引物Y22-F(SEQ ID NO：24)和Y22-R(SEQ ID NO：25)，载体YCplac22的核苷酸，并将所得的扩增片段进行切胶纯化。

4.2利用Golden gate克隆构建技术构建分别含有基因EbF6H、CcsF6H、ObF6H、MpF6H和ATR2的重组载体Y22-ATR2-EbF6H、Y22-ATR2-CcsF6H、Y22-ATR2-ObF6H、Y22-ATR2-MpF6H，Golden gate连接体系及反应条件如下：

反应体系如下：

载体骨架(终止子元件)(200ng)

启动子元件与载体骨架等摩尔的量

基因1与载体骨架等摩尔的量

基因2与载体骨架等摩尔的量

10XNEB T4buffer(NEB)1.5ul

100XBSA*(NEB)0.15ul

BsaI(NEB)1ul

NEB T4Ligase(NEB)1ul

ddH2O补足到15ul

Total 15ul

反应条件如下：

得到的产物直接转化DH5α大肠杆菌(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，培养12-16h,挑取单菌落酶切验证,通过琼脂糖凝胶电泳分析找出正确克隆(图2)。所得正确的重组载体分别命名为Y22-ATR2-EbF6H、Y22-ATR2-CcsF6H、Y22-ATR2-ObF6H、Y22-ATR2-MpF6H，酶切结果如图3所示，其物理图谱分别图4、图5、图6、图7所示。

实施例5利用Golden Gate克隆构建方法构建重组载体Y33-UDPGDH-F7GAT

利用实施例4中4.2所述的Golden gate克隆构建技术，将灯盏花来源的糖基转移酶基因F7GAT与酿脓链球菌来源的UDP-葡萄糖醛酸合成酶基因UDPGDH以及人工合成的双向启动子ADH1+TDH3构建到人工合成载体YCplac33(人工合成的Genbank号：X75456.1)上，得到重组载体Y33-UDPGDH-F7GAT。

实施例6产芹菜素酿酒酵母宿主菌的构建

将灯盏花来源的芹菜素合成相关基因PAL(苯丙氨酸脱氨酶基因)、C4H(肉桂酸羟化酶基因)、4CL(香豆酸辅酶A合成酶基因)、CHS(查尔酮合成酶基因)、CHI(查尔酮异构酶基因)、FSII(黄酮合成酶II基因)通过常规分子克隆构建方法整合到常规的酿酒酵母野生菌W303(Thomas,B.J.and Rothstein R(1989)Elevated recombination rates intranscriptionally active DNA.Cell,56(4):619-663.)的基因组上，得到组氨酸营养缺陷型的产芹菜素酿酒酵母宿主菌SC1。

实施例7产野黄芩素酿酒酵母菌及产灯盏乙素酿酒酵母菌的构建

7.1产野黄芩素酿酒酵母菌的构建

利用常规醋酸锂转化方法分别将实施例4中4.2所述重组载体Y22-ATR2-EbF6H、Y22-ATR2-CcsF6H、Y22-ATR2-ObF6H、Y22-ATR2-MpF6H转化入产芹菜素酿酒酵母宿主菌SC1中，挑取可以在组氨酸、色氨酸缺陷的CM培养基上上长出的克隆，编号分别为SC223、SC251、SC114、SC137；

7.2产灯盏乙素酿酒酵母菌的构建

利用常规醋酸锂转化方法分别将实施例4中4.2所的重组载体Y22-ATR2-EbF6H、Y22-ATR2-CcsF6H、Y22-ATR2-ObF6H、Y22-ATR2-MpF6H与Y33-UDPGDH-F7GAT共转化入实施例6中产芹菜素的酿酒酵母宿主菌SC1中，挑取可以在组氨酸、色氨酸、尿嘧啶缺陷的CM培养基上培养基上长出的克隆，编号分别为SC225、SC254、SC125、SC145。

实施例8发酵生产野黄芩素、灯盏乙素

8.1酿酒酵母工程菌株种子液培养

选用CM培养基(购自索莱宝生物科技有限公司)(配方：YNB w/o AA(0.67％)，葡萄糖(2g/L)，Dropout powder(0.083％)，其中Dropout powder中含有(mg/L)：苏氨酸150，酪氨酸30，缬氨酸150，赖氨酸30，谷氨酸100，丝氨酸150，天冬氨酸100，甲硫氨酸20，苯丙氨酸50，异亮氨酸30，精氨酸20；其它营养成分(mg/L)：腺嘌呤50，尿嘧啶50，组氨酸100，亮氨酸100，色氨酸100(氨基酸))，液体培养基调pH5.6，固体培养基加1.5％琼脂粉(购自索莱宝生物科技有限公司)，调pH6.5。分别在平板上挑取单克隆到含有4mL灭过菌的培养基的试管中，于30℃、200rpm条件下对酿酒酵母工程菌株SC223、SC251、SC114、SC137、SC225、SC254、SC125、SC145进行过夜培养。

8.2.发酵生产

将种子液以1:50的接种比例接种到含50mL灭过菌的培养基的锥形瓶中，在30℃、200rpm条件下发酵培养5天。

实施例9反应产物的LC-MS鉴定

9.1发酵结束后，取900uL样品，加入等体积的无水甲醇，用超声清洗仪进行超声30min。12000rpm离心10min，上清液做高效液相分析。

9.2 HPLC、LC-MS检测条件

HPLC分析：

仪器：岛津高效液相色谱仪1200

色谱柱：Kinetex H15-168747(4.6×250mm)，紫外检测器，检测波长335nm。

流动相：A相为0.1％甲酸；B相为乙腈；C相为甲醇

起始浓度A:75％B:22％C:5％

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测器：PDA检测器

梯度洗脱程序：(浓度为B相百分比)

MS分析

质谱仪：Bruker-micrOTOF-II：

ESI离子源，正离子模式

核质比(m/z)：50-1000

氮气流速：6.0升/分钟

温度：180℃

雾化器压力：1bar

探头电压：14.5KV。

9.3 EbF6H活性鉴定

菌株SC223发酵产物，经过HPLC检测结果显示，EbF6H可以催化芹菜素生成一个新产物，出峰时间为8.5min与野黄芩素标品相一致(图8A),质谱结果显示(图8B)该新产物分子量为(m/z,287[M+H]⁺),这与野黄芩素标品的分子量一致,确定该物质是野黄芩素，摇瓶发酵产量为16.4mg/L。

另外，该新产物经过糖基转移酶催化与UDP-葡萄糖醛酸生成一个新产物，出峰时间为4.5min与灯盏乙素标品相一致(图9A),质谱结果显示(图9B)该新产物的分子量为(m/z,463[M+H]⁺),这与灯盏乙素标品的分子量一致,确定该物质是灯盏乙素，摇瓶发酵产量为22.7mg/L。

9.4 CcsF6H活性鉴定

菌株SC251发酵产物，经过HPLC检测结果显示，CcsF6H可以催化芹菜素生成一个新产物，出峰时间为8.5min与野黄芩素标品相一致(图10A),质谱结果显示(附图10B)该新产物分子量为(m/z,287[M+H]⁺),这与野黄芩素标品的分子量一致,确定该物质是野黄芩素，摇瓶发酵产量为15.2mg/L。

另外，该新产物经过糖基转移酶催化与UDP-葡萄糖醛酸生成一个新产物，出峰时间为4.5min与灯盏乙素标品相一致(图11A),质谱结果显示(图11B)该新产物的分子量为(m/z,463[M+H]⁺),这与灯盏乙素标品的分子量一致,确定该物质是灯盏乙素，摇瓶发酵产量为22mg/L。

9.5 ObF6H活性鉴定

菌株SC114发酵产物，经过HPLC检测结果显示，ObF6H可以催化微量的芹菜素生成一个新产物，出峰时间为8.5min与野黄芩素标品相一致(图12A),质谱结果显示(图12B)该新产物分子量为(m/z,287[M+H]⁺),这与野黄芩素标品的分子量一致,确定该物质是野黄芩素，摇瓶发酵产量为0.5mg/L。

另外，该新产物经过糖基转移酶催化与UDP-葡萄糖醛酸生成一个新产物，出峰时间为4.5min与灯盏乙素标品相一致(图13A),质谱结果显示(图13B)该新产物的分子量为(m/z,463[M+H]⁺),这与灯盏乙素标品的分子量一致,确定该物质是灯盏乙素，摇瓶发酵产量为3.5mg/L。

9.6 MpF6H活性鉴定

菌株SC137发酵产物，经过HPLC检测结果显示，MpF6H可以催化微量的芹菜素生成一个新产物，出峰时间为8.5min与野黄芩素标品相一致(图14A),质谱结果显示(图14B)该新产物分子量为(m/z,287[M+H]⁺),这与野黄芩素标品的分子量一致,确定该物质是野黄芩素，摇瓶发酵产量为0.5mg/L。

另外，该新产物经过糖基转移酶催化与UDP-葡萄糖醛酸生成一个新产物，出峰时间为4.5min与灯盏乙素标品相一致(图15A),质谱结果显示(图15B)该新产物的分子量为(m/z,463[M+H]⁺),这与灯盏乙素标品的分子量一致,确定该物质是灯盏乙素，摇瓶发酵产量为3.5mg/L。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种用于催化芹菜素6位羟基化的黄酮-6-羟化酶，其特征在于，所述黄酮-6-羟化酶为

如SEQ ID NOs.:1所示氨基酸序列的蛋白。

2.一种分离的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸为

(a)编码如SEQ ID NOs.:1所示蛋白的核苷酸序列；

(b)如SEQ ID NOs.:2所示的核苷酸序列；

(e)与(a)-(b)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种权利要求1所述的黄酮-6-羟化酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的黄酮-6-羟化酶。

6.一种黄酮-6-羟化酶或其衍生蛋白或权利要求3所述载体或权利要求4所述宿主细胞的用途，其特征在于，用于催化芹菜素的6位羟基化，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：SEQ IDNO.:1所示氨基酸序列的蛋白。

7.一种催化芹菜素的6位羟基化的方法，其特征在于，包括步骤：

在黄酮-6-羟化酶或其衍生蛋白存在下，进行芹菜素6位羟基化的催化反应，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的蛋白。

8.一种制备野黄芩素的方法，其特征在于，包括步骤：

在细胞色素还原酶(CPR)存在下，利用黄酮-6-羟化酶催化芹菜素，从而得到野黄芩素；

其中，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的蛋白。

9.一种制备灯盏乙素的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在细胞色素还原酶(CPR)存在下，利用黄酮-6-羟化酶催化芹菜素，从而得到野黄芩素；

和

(ii)对步骤(i)获得的野黄芩素进行糖基化反应，从而得到灯盏乙素；

其中，所述黄酮-6-羟化酶选自下组：SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的蛋白。