CN105566411A - 林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途。具体地，本发明提供了对林可霉素产生菌的遗传改造而获得林可霉素生物合成中间产物及其发酵生产和分离纯化方法。

Description

林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途

技术领域

本发明属于药物领域和生物技术工程领域，具体地，本发明涉及林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途。

背景技术

代谢工程技术是近十多年来随着分子生物学的发展，特别是在抗生素生物合成基因簇克隆与抗生素生物合成途径阐明的基础上，在创新微生物药物研究的需求中提出并逐步发展起来的。通过运用分子遗传学的原理和技术，特异性地合理修饰“细胞工厂”里天然产物的合成途径以获得重组菌株，提高产量或优化发酵的组份，这是当前抗生素菌种改良的一种合理、定向而高效的新途径。代谢工程的成功运用，关键是在基因和蛋白功能水平上认识和理解复杂抗生素的生物合成及其调控机制，这是在微生物体内针对代谢途径进行遗传操作的分子和生化基础。然而，由于对林可霉素生物合成机制缺乏了解，极大地限制了这一技术在林可霉素工业生产菌株改良上的应用。

林可霉素(Lincomycin)及由其化学半合成的下游产品克林霉素(Clindamycin)是临床广泛应用多年疗效明显的药物。目前林可霉素主要由林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)发酵生产。虽然林可霉素已临床应用几十年，然而对其生物合成途径的研究却很少。

一直以来，本领域通过化学合成林可霉素的结构类似物或衍生物的研究不断，然而迄今为止已在临床应用的林可酰胺类抗生素仍然只有林可霉素和在此基础上化学半合成的克林霉素两种。通过遗传改造林可霉素产生菌产生林可霉素生物合成的中间产物或结构类似物，将有助于阐明林可霉素生物合成途径的，从而基于生物合成机制研究的成果，采用组合生物合成的手段产生新的林可酰胺类抗生素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种林可霉素生物合成中间产物及其制法和用途。

本发明的目的在于提供一种制备正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol或麦角硫因的方法。

本发明的第一方面，提供了一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物的结构如式I所示：

式I中，R₁选自：H、卤素、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基和其中R₃选自：H、卤素和C_1-8烷基；

R₂选自

在另一优选例中，所述R₁选自：H、C_1-4烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基)和

在另一优选例中，所述R₃选自：H、和C_1-4烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基)。

在另一优选例中，所述化合物的结构如式Ia所示：

式Ia中，所述R₁、R₂分别如上所述。

在另一优选例中，所述化合物具有选自下组式I1-I5所示的结构：

本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐的用途，用作制备正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol或麦角硫因的原料。

在另一优选例中，所述用途还包括：将所述的化合物用于制备抑制微生物生长的组合物。

在另一优选例中，所述抑制微生物生长的组合物包括治疗微生物或细菌感染的药物。

本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物含有本发明第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐以及任选的载体。

在另一优选例中，所述的载体包括水、有机溶剂。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述的载体包括药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物为用于制备正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol或麦角硫因的原料组合物。

本发明的第四方面，提供了一种微生物菌株，所述微生物为林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)，并且所述菌株中选自下组的一个或多个基因被失活或敲除：

lmbE、lmbE3457、lmbV、mshA、mshC、lmbC、lmbD、lmbN、和lmbF。

在另一优选例中，所述菌株中lmbE和/或lmbE3457基因被失活或敲除。

在另一优选例中，所述菌株中lmbV、mshA和/或mshC基因被失活或敲除。

在另一优选例中，所述菌株中lmbC、lmbD和/或lmbN基因被失活或敲除。

在另一优选例中，所述菌株中lmbF基因被失活或敲除。

在另一优选例中，所述菌株用于制备本发明第一方面所述的化合物。

本发明的第五方面，提供了一种生产中间体化合物的方法，包括步骤：

(a)将权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为原料进行水解反应，从而生成所述的中间体化合物，其中所述的化合物或其药学上可接受的盐来源于林可链霉菌的发酵产物。

在另一优选例中，所述的中间体化合物选自下组：正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol、麦角硫因或其组合。

在另一优选例中，所述的林可链霉菌包括权利要求4中所述的任一菌株。

在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(a)之前，从林可链霉菌的发酵产物中分离出权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，对选自式I1、式I2和式I5所示的化合物中的一种或多种进行水解反应，从而生成正丙基脯氨酸化合物。

在另一优选例中，所述水解反应在碱性条件下进行。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：发酵本发明第四方面所述的微生物菌株，从而获得式I1、式I2和/或式I5所示的化合物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：发酵林可链霉菌突变株，从而获得式I1、式I2和/或式I5所示的化合物，所述林可链霉菌突变株中选自下组的一个或多个基因被失活或敲除：lmbE、lmbE3457、lmbV、mshA、mshC和lmbF基因。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，对选自式I1和式I3所示的化合物中的一种或多种进行水解反应，从而生成二糖化合物GlcN-Ins。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：发酵本发明第四方面所述的生物菌株，从而获得式I1、和/或式I3所示的化合物。

在另一优选例中，所述水解反应在碱性条件下进行。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：发酵林可链霉菌突变株，从而获得式I1、和/或式I3所示的化合物，所述林可链霉菌突变株中选自下组的一个或多个基因被失活或敲除：lmbE、lmbE3457、lmbC、lmbD、和lmbN基因。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，对选自式I2和式I4所示的化合物中的一种或多种进行水解反应，从而生成麦角硫因。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：发酵权利要求4所述的微生物菌株，从而获得式I2、和/或式I4所示的化合物。

在另一优选例中，所述水解反应在酸性条件下进行。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：发酵林可链霉菌突变株，从而获得式I2、和/或式I4所示的化合物，所述林可链霉菌突变株中选自下组的一个或多个基因被失活或敲除：lmbV、mshA、mshC、lmbC、lmbD、和lmbN基因。

本发明的第六方面，提供了一种生产Mycohiol的方法，包括步骤：

(1)制备二糖化合物GlcN-Ins

将权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为原料进行水解反应，从而生成二糖化合物GlcN-Ins；

(2)以GlcN-Ins为原料化学合成Mycothiol。

本发明的第七方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的化合物的方法，包括步骤：

(a)发酵本发明第四方面所述的菌株，从而产生本发明第一方面所述的化合物；和

(b)从发酵产物中分离出本发明第一方面所述的化合物；和任选地将所述化合物转化为其药学上可接受的盐。

本发明的第八方面，提供了一种体外非治疗性地抑制微生物生长或者杀灭微生物的方法，包括步骤：在需要处理的场所使用本发明第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的第九方面，提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：将本发明第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体进行混合，从而形成所述药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定本发明的范围。

图1为林可霉素产生菌同框敲除突变株的电泳结果。图1a,lmbE敲除突变株；图1b，lmbE-E3457双敲除突变株；图1c，lmbV敲除突变株；图1d，mshA敲除突变株；图1e，lmbC敲除突变株；图1f，lmbD敲除突变株；图1g，lmbF敲除突变株。

图2为林可霉素产生菌同框敲除突变株的发酵液HPLC-MS检测结果，显示各突变株中林可霉素A及化合物1-5的产生情况。

图3为化合物1的NMR检测结果，图3a，1HNMR谱图；图3b，13CNMR谱图；图3c，DEPT135NMR谱图；图3d，COSYNMR谱图；图3e，HSQCNMR谱图；图3f，HMBCNMR谱图；图3g，NOESYNMR谱图。

图4为化合物2的NMR检测结果，图4a，1HNMR谱图；图4b，13CNMR谱图；图4c，DEPT135NMR谱图；图4d，COSYNMR谱图；图4e，HSQCNMR谱图；图4f，HMBCNMR谱图；图4g，NOESYNMR谱图。

图5为化合物3的NMR检测结果。图5a，1HNMR谱图；图5b，13CNMR谱图；图5c，DEPT135NMR谱图；图5d，COSYNMR谱图；图5e，HSQCNMR谱图；图5f，HMBCNMR谱图；图5g，NOESYNMR谱图。

图6为化合物4的NMR检测结果。图6a，1HNMR谱图；图6b，13CNMR谱图；图6c，DEPT135NMR谱图；图6d，COSYNMR谱图；图6e，HSQCNMR谱图；图6f，HMBCNMR谱图；图6g，NOESYNMR谱图。

图7为化合物5的NMR检测结果。图7a，1HNMR谱图；图7b，13CNMR谱图；图7c，DEPT135NMR谱图；图7d，COSYNMR谱图；图7e，HSQCNMR谱图；图7f，HMBCNMR谱图；图7g，NOESYNMR谱图。

图8为正丙基脯氨酸的NMR检测结果，图8a，1HNMR谱图；图8b，13CNMR谱图；图8c，DEPT135NMR谱图；图8d，COSYNMR谱图；图8e，HSQCNMR谱图；图8f，HMBCNMR谱图；图8g，NOESYNMR谱图。

图9为二糖化合物GlcN-Ins的NMR检测结果，图9a，1HNMR谱图；图9b，13CNMR谱图。

图10为麦角硫因的NMR检测结果，1HNMR谱图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过对林可霉素生物合成基因簇的克隆，基因敲除获得了林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)突变菌株。对林可霉素生物合成相关的蛋白进行体外生化测活，以体内体外相结合的方式对林可霉素的生物合成机制进行了研究。意外地发现，某些林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)突变菌株产生了新的化合物，随后进行了大量的发酵，对化合物进行了分离鉴定。在此基础上完成了本发明。

活性成分

如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明化合物”和“本发明的林可霉素生物合成中间产物”可以互换使用，都指林可霉素生物合成中间产物，如式I所示的化合物。

应理解，所述术语还包括本发明化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

在本发明优选的实施方式中，术语“C_1-8烷基”指具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。

在本发明优选的实施方式中，术语“C_2-8烯基”是指具有2-8个碳原子的直链或支链烯基，例如乙烯基、丙烯基、1,2-丁烯基、2,3-丁烯基、丁二烯基、或类似基团。

在本发明优选的实施方式中，术语“C_2-8炔基”指具有2～8个碳原子的直链或支链炔基，例如乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、或类似基团。

在本发明优选的实施方式中，术语“卤素”指F、Cl、Br和I。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。可以由阳离子与本发明化合物上的带电荷基团(例如氨基)形成盐。合适的阳离子包括氢离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子。适合形成盐的碱包括但并不限于：碱金属和碱土金属的氢氧化物(如NaOH、KOH)、碱金属和碱土金属的氧化物、碱金属和碱土金属的碳酸盐(如Na₂CO₃)、氨水等。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述化合物结构如下所示：

本发明的化合物可以作为制备其他林可酰胺类抗生素结构类似物，并用于水解产生正丙基脯氨酸、二糖化合物GlcN-Ins、和/麦角硫因等下游产物。

在本发明的较佳地实施方式中，通过将化合物1，2或5水解制备正丙基脯氨酸。

在本发明的较佳地实施方式中，制备正丙基脯氨酸(PPL)的过程如下所示：

在本发明的较佳地实施方式中，通过将化合物1或3水解制备二糖化合物GlcN-Ins。GlcN-Ins可用作化学合成Mycothiol的原料(化学合成方法参考文献：Org.Lett.6,365-368，2004；Org.Lett.12,2630-2633，2010)。

在本发明的较佳地实施方式中，制备二糖化合物GlcN-Ins的过程如下所示：

在本发明的较佳地实施方式中，通过将化合物2或4水解制备麦角硫因。

在本发明的较佳地实施方式中，制备麦角硫因的过程如下所示：

出发菌株

如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指编号为NRRLISP-5355的林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)。本发明的出发菌株保存在美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)，编号为StreptomycinlincolnensisNRRLISP-5355。应理解，出发菌株不仅包括编号为StreptomycinlincolnensisNRRLISP-5355的菌株，还包括其衍生菌株。

工程菌株

本发明还提供了可用于生产本发明化合物的工程菌。

在本发明的一个优选例中，提供了几种生产本发明林可霉素生物合成中间产物的林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)突变菌株。

活性成分的制备

本发明提供了一种制备式I化合物的方法，包括步骤：

对经基因改造的林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)工程菌株进行发酵；

从培养基中提取式I化合物。

离心弃去菌体，上层菌液采用大孔树脂吸附，蒸馏水洗涤后采用甲醇浸泡，过滤除去大孔树脂，滤液经减压浓缩抽干，获得的膏状物先用凝胶柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，最终得到目标产物。

功能性基因

早在1995年，Peschke等就已经通过三个林可霉素抗性基因lmrA，lmrB和lmrC于S.lincolnensis78-11中染色体步移获得了35kb林可霉素生物合成簇[MolMicrobiol.1995,16(6):1137-1156]。捷克Janata研究小组也于2008年在S.lincolnensisATCC25466林可霉素低产菌株中克隆到38217bp的林可霉素生物合成基因簇，通过生物信息学分析，此基因簇包含30个阅读框(ORF)，由27个推定的生物合成及调控基因(lmb)以及3个抗性相关基因(lmr)组成，在S.coelicolorM145和S.coelicolorCH999中进行异源表达证实了此基因簇已包含有完整的林可霉素合成相关基因[FoliaMicrobiol.2008,53(5):395-401]。然而通过序列分析推断出的各个基因产物同已知的蛋白质序列进行比对，有几个基因完全找不到同源蛋白，无法推测功能。而即使能从同源蛋白比对推测出其可能的功能，大部分基因在林可霉素生物合成过程中的功能仍然未知。

本发明中所涉及的林可霉素生物合成基因簇较佳地可参考文献[FoliaMicrobiol.2008,53(5):395-401]。

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbE基因的多核苷酸序列如下所示：

ATGACTCAGTGCCTGCTGACCGTCCACGCGCACCCGGACGACGAGGCCTCCCGCGGCGGCGCCACGGTCGCCCACTACACCGCGCAGGGCGTCCGCGCCGTCCTGGTCACCTGTACCGACGGCGGCGCCGGCGAGGTGCTCAACCCCGCCGTCACCGACGACTTCACCCCCGAACGGTTCGTCGCCGTCCGCAGCGCCGAACTCGACGCCAGCGCACGGAACCTGGGCTACTCGGCCGTGCACCGGCTCGGCTACCGCGACTCCGGCATGGACGGCACGGCGGGCGGCGCCGAGGCCTTCGTACGGGCCCCGCTCGACGAGGCCGCCACCCGCCTCGCCCGGGTGATCGCGGACGAACGCCCCGACGTGGTGATCGGATACGGCACCAACCACACCCGCGACCCGCACCCCGACCACATCCGCGCGAACGAAGTGCTGACGCGCGCCGTCGACCTCCTCGACCACACACCCGCCGTCTACCACATCGCCTTCTCGCGACGTCGCCACCGCGCCTTGCACCAGGCCTGCGTCGACAGCGGGGTGCCCAGCCCGTACGAGGGCGGCCTGAGCGCCCCGCCGGGCGCCTTCGACGACGAGTGGATCACCACACTCGTCGACGTGACCAAGGGCGACGCCGTCGAGCGCAGGCTCGACGCGCTGCGCAGTCACGTGACCCAAGTACCGCCCGCCTCCGGCTGGTTCGCGCTGTCACCGCAGCAGCTGCGGGACGCCTTCCCGTACGAGGAGTACACCCGCGTCGGCGCCGCGCCCCGGGAAGCCGTGGTGCACGACCTGTTCACCGCTCCCGCGTGA(SEQIDNO.:1)

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbE3457基因的多核苷酸序列如下所示：

ATGGCCGTGCACGCCCACCCCGACGACGAGTCGAGCAAGGGCGCGGCCACCATGGCGAAGTACGTGTCCGAGGGGGTGGACGTGCTGGTCGTGACCTGCACGGGAGGGGAGCGCGGCTCCATCCTCAACCCCAAGCTCCAGGGGGACGCGTATATCGAGGAGCACATCCATGAGGTGCGCAAGAAGGAGATGGACGAGGCGAGAGAGATCCTCGGCGTCAAGCAGGAGTGGCTCGGGTTCGTCGACTCGGGCCTGCCCGAGGGGGACCCGCTGCCGCCGCTGCCGGAGGGCTGTTTCGCCCTGGAGGACGTCGACAAGGCGGCCGGTGAGCTGGTGAAGAAGATCCGCTCGTTCCGTCCCCAGGTGATCACCACCTACGACGAGAACGGCGGCTACCCGCACCCCGACCACATCATGACCCACAAGATCTCGATGGTGGCGTTCGAGGGTGCCGCGGACACCGAGAAGTACCCGGAGCAGGAGTTCGGCCCCGCGTACCAGCCGCAGAAGATCTACTACAACCAGGGCTTCAACCGTGAGCGCACCGAGGCCCTGCACAACGCGCTGGTCGAGCGCGGCCTGGAGTCCCCCTACGGCGACTGGCTCAAGCGCTGGGAGGAGTCCGGGATGCAGCAGCGGACGCTCACCACGCACGTCCCGTGTGCCGAGTTCTACGAGATCCGCGACAAGGCCCTGATCGCCCACGCCACGCAGATCGACCCCGACGGCGGCTGGTTCCGGGTGCCGCTGGATCTCCAGAAGGAGGTCTGGCCGACCGAGGAGTACGAGCTCGCGAAGTCCCTCGTCGATACTTCCCTCCCCGAGGCGGACCTCTTTGCGGGCATCCGCGACAATGCCTGA(SEQIDNO.:2)

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbV基因的多核苷酸序列如下所示：

TTGCAGCGCAAGGGACTGGCCCGGCTCGGGTCGGGTGTCACGGCACTGGCCGACGAGGGAAGACACCTGCGGGCCTGGCTCACGAGCGCCGACGCGGCGGCGTGGCGACGGCCCACACGCTGTGCGGAGTGGAACGTCCGGGACGTCGTCGCGCACCTGGCGAGCGGCGAGCTGTACAACCAGGCATGCGTGCACGACGACATCGCCTCGCTCGGCGAGTGGGCCGACGACGAGGCGTACAACGTCGGCCAGGTGGAGATGCGCCGCCACCTGAGCCACCGCGACGTCTTCGCGGAGTGGGACGAGCGCCACCGGGACGTGGTGGCCGCCTGGGGGGCCATGGACCCGGCCGACCCGCTCACCACGAGCTGGGGACCGTACCTGGTCGGCCTGCAGGCGTGGCACATCGCGTCGGAGTACGCGACCCACGCCGACGACATCGGGGTCCCCGTCCCCGCGGAGCGGGCCGCCTCCCGGCTCGACTGGCGCCTCGCCTTCTCCCAGTACGCGGTCGAGGAGTGCGAGCTGGGCCTTACGGTCGAGCCCGCCGAGGGCGACAGTGTGCTCGTGCGGGACGGGGCCGGGGCCGGGGCCGAACTCGTACTGACCCGTGAGCAGTTCGTGGCCGCGGTCAGCGCCCGGCTGCCGTACGACGCCGTCGCCGACGACCCCGCCGTTCACGCGCTGCTACGGCGCATGACGGTGCTGGTGGGGCCGTGA(SEQIDNO.:3)

在本发明的一个优选地实施方式中，mshA基因的多核苷酸序列如下所示：

GTGAGCCAGTACGTCAGCAGGCTCCAGCGTCGCTCCCAGGCCGCCACCCCCCGGCTGCGCCTGCACCGCCGCCCCCGCCGCGTCGCCATGCTCTCCGTGCACACCTCGCCGCTGCACCAGCCGGGCACCGGCGACGCGGGCGGCATGAACGTCTACATCGTGGAGCTCGCCCAGCGCCTCGCCGCGATCAACATCGAGGTGGAGATCTTCACGCGGGCGACCACCGGCGGACTCCCGCACTCGGTCGAGCTCGCCCCGGGCGTCCTCGTCCGGCATGTCGACGCCGGCCCGTACGAGGGCCTGGCCAAGGAGGAGCTGCCCGCGCAGCTGTGCGCCTTCACGCACGGCGTGATGCAGGCGTGGGCGGGCCACCGCCCCGGCTACTACGACCTGGTGCACTCGCACTACTGGCTTTCCGGCCACGTCGGCTGGCTCGCCGCCCAGCGCTGGGGCACCCCCCTGGTGCACGCCATGCACACCATGGCCAAGGTCAAGAACGCCAACCTGGCCGACGGCGACACCCCCGAGCCCGCCGCCCGTGTCATCGGCGAGACCCAGATCGTCGCCGCAGCGGACCGCCTCATCGCCAACACCGCCGAGGAGCGCGACGAACTCGTACGGCACTACGCCGCCGACCCCGACAAGGTCGCGGTCGTGCACCCCGGCGTGAACCTCGACCGCTTCCGCCCCGCCGACGGCCGCGCGGCCGCCCGCGCCCGCCTCGGGCTGCCCCAGGACGCCCTGATCCCGCTGTTCGCGGGCCGCATCCAGCCCCTGAAGGCCCCCGACGTGCTCCTGCGCGCCGTGGCGGTCCTCCTGGACGAACGCCCCGACCTGCGCTCCCGCCTCCTCGTCCCGGTCGTCGGCGGTCTCAGCGGCAGCGGCCTCGCCAAGCCGGAGGGCCTCCAGAAGCTGGCCTCCCGCCTCGGTATCGCGGACGTCGTACGGTTCCACCCGCCCGTCGGGCAGGAGCAGCTCGCCGACTGGTTCCGGGCCGCCTCCGTGCTCGTCATGCCGTCGTACAGCGAGTCCTTCGGACTGGTCGCCATAGAGGCGCAGGCGGCCGGCACCCCCGTGCTCGCGGCCGCGGTCGGCGGACTCCCGGTCGCCGTCCGCGACGGGCAGACCGGTTTCCTCGTACGAGGGCACAATCCCGCCGACTACGCGCGCGTGCTGCGCGACTTCGCCGACAGCCCCGAGCTCGCGCCCCGCATGGGCGAGGCCGCCGCCCGGCACGCCGAGTTCTTCGGCTGGGACACCGCGGCCGCCGCCACCGCCGACGTCTACACGGCCGCGACCCAGTCGCACCGCCGTCACGTACGCTCCCACCATGGGTGA(SEQIDNO.:4)

在本发明的一个优选地实施方式中，mshC基因的多核苷酸序列如下所示：

ATGCATGCCTGGCCCGCTTCCGAGGTCCCCGCCCTGCCTGGTCAGGGCCGCGACCTGAGGATCCACGACACCGCGACCGGCGGCCTCGTCACCCTCACCCCCGGTCCCGTCGCCCGTATCTACGTCTGCGGCATCACGCCGTACGACGCGACCCACATCGGTCACGCGGCGACCTACAACGCGTTCGACCTCGTGCAGCGCGTGTGGCTCGACACCAAGCGGCAGGTCCACTACGTCCAGAACGTCACCGACGTCGACGATCCGCTCCTGGAGCGGGCACAGCGCGACGCCATCGACTGGGTCGCCCTCGCCGAGAAGGAGACCGCCCTCTTCCGCGAGGACATGACCGCCCTGCGGATGCTGCCCCCGCGGCACTACATCGGCGCGGTCGAGGCGATACCCGGCATCGTGCCGCTCGTCGAGCGGCTGCGGGACGCGGGCGCCGCGTACGAACTCGAAGGGGACGTGTACTTCTCCGTCGAGTCCGATCCGCACTTCGGCGAGGTCTCCGGCCTCGACGCCGCCGCCATGCGGCTGCTGTCCGCCGAGCGCGGCGGCGACCCCGAGCGGCCCGGCAAGAAGAACCCGCTCGACCCGATGCTGTGGATGGCCGCCCGCGAGGGCGAGCCCAGCTGGGACGGCGCCTCGCTGGGGCGCGGCCGGCCGGGCTGGCACATCGAGTGCGTCGCGATCGCCCTCGACCACCTCGGGATGGGCTTCGACGTCCAGGGCGGCGGCTCCGACCTCGCCTTCCCGCACCACGAGATGGGCGCCTCGCACGCCCAGGCGCTGACCGGCGAGTTCCCCATGGCCACGGCGTACGTCCACGCCGGCATGGTCGCCCTCCACGGCGAGAAGATGTCCAAGTCCAAGGGCAACCTGGTCTTCGTGTCGCAGCTGCGCCGCGAGGGCGTCGACCCCGCCGCCATACGGCTCGCGCTGCTCGCCCACCACTACCGGGCCGACTGGGAGTGGACCGACCAGGTGCTGCGGGACGCCGTCGACCGCCTCGGCCGCTGGCGTGCCGCGGTCTCCCGGCCCGACGGCCCGTCCGCCGAGGCCCTCGTCGAGGAGATCCGCAAGGCGCTCGCCGACGACCTGGACGCCCCGGCCGCCCTGGCCGCGGTCGACCGCTGGGCCGCCTCGCAGGAGGAGCACGGCGGCACCGACATCGGCGCGCCGGGCGTGGTGACACGAGCGGTGGACGCGCTGTTGGGCGTGGCCCTGTGA(SEQIDNO.:5)

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbC基因的多核苷酸序列如下所示：

ATGTCGTCCTCCGTTCGACTCTCCACACTCCTCGCCTCGGCCGCCGAGGCGAGGCCCGAGGCCCCCGCCGTCCTGGGGGAGACCCGGCTCCCGGTCACCTATGGGGAGCTGGCCGCGCGGGCGGGCGGCATCCAGGCCGCCCTGGCAGGCCTGGGGGTGCGCGCCGGTGACCGGGTAGCGCTGCTGTCCGGGCGGACCGACGCGGACGCCGTGGCCGCGGTGCACGCGATCCTGGCCGCGGGCGCCGTGTACGTGCCGCTCGACGCCGCGTCGCCGCCCGCGCGGTGGGCTTCGGTGAGCCGGGTCTGCGCGCCCACCGCCGTGGTGGGCGAACGCGCGCTGCTCGACCGGTTCGCCGCCGCCGTACCGGGGCCGCGGCGGCTCGCCCTGCCATCGGACGGGGACGAGCTGCCCGCGGGCCGCCTCGACCCCGTCCGGAGCGACGGCACCGATGTCGCGTACCTGCTCACCACCTCCGGCTCCACCGGCGTTCCCAAGTGCGTGGCCCACACCGGTGCGGGCGCCGTCGCCTTCCTGGAGTGGATGGTCGGCGCGTTCCCGGTGGGCGGCGACGATGTGTTCGCCTGCCACGCCCCGCTGCACTTCGACGTGTCGGTGGCCTCGGTGCTCGGCTCCGCGCTGGGCGGCGCGGCCCTGGCCCCGGTGCCCCGTGAACTGTCCGGGTTTCCCGTCGAGCTGGCCACCTGGATCGCCGAACGCGCCGTCACCGTATGGCTCTCCGTGCCCTATCCGCTCGCCCGCCTGTCCGGACTGGAGGAGCGGGCCGCGCGTGAGCGCCTCGCCACCTTGAGGACGGTCGTGTTCGCCGGTGACGTCTTTCCGCACCAGCGGCTCGCCGCACTGATGCGCTGCGCGCCCGGGGCCCGGTTCCTCAACATCTACGGCCCGACCGAGACCAACGGCTGTACGTACGAGGTCGTGGACGCCCCGCCCGCCGGCCCCGTGCCCATCGGCCGGCCCGTCGAGTGCGCCGAGTGCTGGGTCGAGGACGACGACGGGCGGCCGGTCGACGCGGTGGGGTCGGTGGGTGAACTCGTCGTCGCGGGGCCCACGGTGGCCGCCGGATACTGGGGCGTCGAGGGGCACGGAGCCGAGCGGTTCCGCACGGGGGAGACCTGTCCGGGCGGCCGGGCCTACGCCACCGGGGACCAGGTCCGCGTCCTGCCCGGGGGCCGGTACGCCTTCCTCGGCCGCATGGACAACATGATCAAGATGCGCGGGCAGCGGTTCGAGCTGGAGGAGGTGGAGAACGCTGTACGGCTCGCTCCCGGCGTCGAGGACTGCTGCGTGGTGAAGGTGGACGTCCGCGACGATCACTCCCGCCTCCTCGCCGTCGTGGTCGGGCCCGGCGCCGGCGACCCGCGCACCCTGCGCGAGCACTGCCTGACCAGGCTGCCGTCGTGGGCGGTGCCGCACCGGTTCCTCACGGCCGCCGCGCTGCCCCTGGGCTCCACCGGCAAGGTGGACCGCCGCGCGCTCAGGGAGGAACTCGTCACACGCGGGGAGTGA(SEQIDNO.:6)

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbD基因的多核苷酸序列如下所示：

ATGGCGGTATCACCCCAGTCGGTTCGGTTGCCGGAACACGCGCCGCACTGCGAGATCGGCTGCGCGGCGAACGTGGCGAAGAGGGTCGGTGTCGACTTCCCGCGGCACGTGGCCGGGTCCCAGTGGGCGCTGCGCACCTTCGTCCGGGAGCCCGGCGACATCCCGCAGCCCATGCTGGACCGCACGCATCTGACGTTCGGCGCGCACGGCGAGGGCTGGCCCACCGCCCTCGCGGGGATCACGGACGGCACCGTGCACGACCGCCGGGTGGCGCGTTCGGAGCTCCCGGAGGTGCTGCGGGACGACCTCGCCCGGGGCGGCAGTCTGCTGTTCCTGGAGGACCGCGGCTGCCCATGGCTGCACTCCGCCGGCCCCGGGCTGCTGCCGCACACGGTGACCCCGGACGGTGTCGACGCGGCCGGGGTCTGGCAGCTGATCGAGGGGCACAGCTGGTGGGCGGGCCGGTACCCGATGGCGGAGGCCGACCTGCTGGCCGCGGCCTACCCGGACCCCGACCCGCACCATGTGGCGGGCCGGGTCCTGAGCCTGCGTCTGGCCCTGACGCCCGAGCGTCGCGCGGCCCTGGACGCCCTCGCCCTGGACCGGCTGCGGGACAGCGTGCGCGCCTACCTCACGGGGGGCGACGGCCGGCTCGACACCCCGGCGGGCACGCTGGTGTGGACGGACGGGCAGGCGGCGGTCGCGGAACTGCTGGACCGGCTGCGGGGCTGGGAGTACCTGTGCGCGCTCGCCGCCGACGACGGGGCCGGCGTCGAGCAGGGCATCGACATCGCCGTGGGCCGGTATCTGTTCCTGGGCCTGGCGGACGAGCTGGCCTACACGTCGTACGCCCGCGCGGGCGCCCGGCGCCTGACCCGACGCCTCGGCGCTCTCGCGGACATCGGCGACGAACACCTCCCCGACGTGGTGTGGCAGCGGGCGTGGCGCAGCGCCCAGCGGTTCTACCGGTCGCTGCGCGCGGAGCACTTCGACGCCCTGTTGCACGACATCGACGCGGCGGGGGTGGCCGACGCCGCTTGTGCGCGCCGGCTCGCGGAGGTCCTGTAG(SEQIDNO.:7)

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbN基因的多核苷酸序列如下所示：

GTGAGCACTCTGGACGAGGTCCTCGCCCTGCTCCGCACCATCGCGCCGAGCGGCGACGAGACCGAACTCACCGCCGACACCCTCCTGTTCAGCTCCGGCCTGCTCGACAGTCTCGCCCTGGAGGAGCTGCACGTCGCCATCGAGGAGCGCTGGGCGCCCATCCCACCCATGGAACTGGCGCGGGCGAACTTCGACACCCCGGCCGCCATCGCCGCGACGGTGGCCCGTATCACCCATGAGGAGACCCCTGTGAGTGTTGTGAGGAACCTCCTGTCCGACTCGGGCCGGCTGACCGCCGACCTCGCACCGGACGCTATCGAGCGCGGTGCGCAGCTGCTCTTCGACACCTGGCACGCCGGCGGCACCACCCTGTCCTGCGGCAACGGCGGCTCGGCCTCGACCGCCTCCCACTTCGCCGCCGACCTCGCCAAGCTCACCATCGTGCCCGGACAGCGCCGCATGCGGACGCTGTGCCTGAACGACAACGCCTCCGCGTTCTCGGCGTGGACCAACGACGAGGGCTTCCCCGTCGTCTACCGGGAGCAGGCCGAGCCCTGGCTGGAGCCCACCGCCACTCTGGTCGCGTTCTCCGTGCACGGCGGCTCCCGCGGGGGCGAAGTGTCGGCGAACCTGCCCGCCGTCGCCCGCCTCGCCAAGGAACGCGGCGCCGCCGTGGTCGCGGTCACCGGCTTCGACGGCGGCGCCCTCGGCGACCTCGCGGACGTCCACATCAACATCCCGCACGCCACCGAGCCCGTGGCGACCCCGCTGATCGAGTCGCTGCACGTCCTCGTCCACCACGCCCTGTGCGTCGGCGCACGCGCCCTGATCCTGGAGAAGGCGGGGGAGCCGGCATGA(SEQIDNO.:8)

在本发明的一个优选地实施方式中，lmbF基因的多核苷酸序列如下所示：

ATGACCGCCACGGCGAGCGGCGCGCAGACCGCCGCACCGGAACGGCTCACCGACGACGGCTGGCTGATCCGGCGCACATCCGTCGACACCGTCCGCCCCTTCGACGACCCGAGCGCCCAGTGGATGCTGGACCGCGCCCAGGCCCGTCTGCCGCTGTACCTGCTGCACGTCGCCGACCACGCGGAGGCCACGCCGCCCGGACTGCGCGAGGCCCTGCACGCCCAGGACGCGGCCCCCTGCGACGGCCTGCTGTTCTCCCAGTACGGCCTGCCGGAGCTGCGCCGGCGGCTCGACGCCTGGCTCGCCGCCGACGAGGAGTGGGACACCGCGGCGGAGCCGCTCGTCAGCGTCGCGTGGTCGGGCACCGGCGCGGCCATCTTCGACCTGCTGCGCATGCTCAAGGACGGCCGCCCGGGCCCCAGCGCCGTGCTGCTGCCGCGCCCCGGGTGGGGATATGACATGTCGGTGCGCGACACCGGACACGTACCGGTGAGTTACGAGGTGCCCCCCGAGTCCCCGCACGGCCCGGACCCCGCGCACCTGGAGGAGGCGTGGCAGCGGTGCCGCAGCGAGGGCCTCGACGTCGCCTGCATCCTCATCAACCCGCAGCACAACCCGTGGGGCGGCAACTGGACCCCCGAGTTCCTCGCCGCCGTCGCCGCCCTCGCCGAACGTGAGCGAGTGCCCGTCCTGGTGGACAACGCCTTCTACGGGCTGACCGCCGAGGACGTGCGCCCCACCAGCGCGGTCCGGCTCCTCGGCCATCTCGTCGGCCAGGAACTCCTGGTGTCGGTGCGCAGCCTGAGCAAGCAGTTCGCGTGCAGCGGCTGGGCCCTGGGAGCCGTCGCGGGCAGCCCGGGTCTGGTCTCGGCGTACTCCGGCCGCTGGCGCTGTCTGCGGGAGCCGACCGCGGGCTTCCGCGCCCAGGCGGCGATGGCGGCCTGGCTCGGGGGCGCCGAACCCGAGCGCTTCACCCGGCGCCGCCGATCCGAGGCCACCCGGCACGCCAGGCTCCTGCGCACCACACTGCGCGCGGCGGGGCTGCCCGACGACGCCGTCCTGCACCACGGCGGCGCCCCCTTCACCCTGCTGCGGCCCCCGGGCGGCAGCACGGTCGAGGAGGTGCGCGAGCAGACCGTCGTGCGGCACGGCGTCCTGCTCGGCCTGGAGCGGGACGCGCGCGAACGGCCGTGGTTCAAGGTCTGGCTGGGCCGGGACAGCAGCGTCTTCGAACCCGCGGCGCGGGCCCTCGGCGACGCCGCGGCCGAGTGGCGGTACCGGTGA(SEQIDNO.:9)

药物组合物和施用方法

本发明化合物具有优良的抑菌(抗菌)活性，因此可用作抗菌素(或抗生素)，且其性质有助于制成注射剂。

本发明化合物可施用于哺乳动物(如人)，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部等方式给药。所述化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。需要指出，本发明的化合物可以混合给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他活性成分(如抗生素)联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的个体而言，日给药剂量通常为1～1000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、个体健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

1、本发明提供了一类结构新颖的林可霉素生物合成中间产物(也可称为“林可霉素的衍生物”)。

2、本发明提供了通过林可霉素产生菌的遗传改造，经发酵生产和分离纯化，可高产地获得高纯度的所述林可霉素生物合成中间产物。

3、以本发明的林可霉素类似物为基础，不仅有助于制备其他林可酰胺类抗生素结构类似物，而且还可方便通过简单的水解即产生多种极其有用的中间体化合物(包括正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、和/麦角硫因)。

4、采用本发明的生物学方法制备所述中间体化合物，环境影响小，制备条件温和，适合于大规模的工业生产。

5、采用本发明方法，不仅可方便地制备多种有用的中间体化合物，而且避免了采用昂贵和步骤复杂的全化学合成，因此具有成本低等综合优势和应用前景。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本发明的内容。

实施例1林可霉素同框敲除突变株的构建

1.构建用于同框敲除的重组质粒

引物设计：

PCR克隆lmbE基因左臂DNA片段的引物序列如下：

引物1：5'-TATGAATTCCACCTTCACCACGCAGCAGTCC-3'(SEQIDNO.:10)

引物2：5'-TATTCTAGACCTTCCCGTACGAGGAGTACAC-3'(SEQIDNO.:11)

PCR克隆lmbE基因右臂DNA片段的引物序列如下：

引物3：5'-TATTCTAGACGAACCGTTCGGGGGTGAAGTC-3'(SEQIDNO.:12)

引物4：5'-TATAAGCTTCCCGTTGCACACGACGTTTCAC-3'(SEQIDNO.:13)

PCR克隆lmbE3457基因左臂DNA片段的引物序列如下：

引物5：5'-TATGAATTCCTGTTCACCTCCTACGGCGAC-3'(SEQIDNO.:14)

引物6：5'-TATTCTAGAATCCGCGACAAGGCCCTGATC-3'(SEQIDNO.:15)PCR克隆lmbE3457基因右臂DNA片段的引物序列如下：

引物7：5'-TATTCTAGAGCGGATCTTCTTCACCAGCTC-3'(SEQIDNO.:16)

引物8：5'-TATAAGCTTCGCCACATCGCCGAATGGAAC-3'(SEQIDNO.:17)PCR克隆lmbV基因左臂DNA片段的引物序列如下：

引物9：5'-TATGAATTCGACGACGCTGACGTAGTGCAGG-3'(SEQIDNO.:18)

引物10：5'-TATTCTAGACTGACCCGTGAGCAGTTCGTGG-3'(SEQIDNO.:19)PCR克隆lmbV基因右臂DNA片段的引物序列如下：

引物11：5'-TATTCTAGAGATGTCGTCGTGCACGCATGCC-3'(SEQIDNO.:20)

引物12：5'-TATAAGCTTGTCACCGCGGTTGAGCTCGATC-3'(SEQIDNO.:21)PCR克隆mshA基因左臂DNA片段的引物序列如下：

引物13：5'-TATGAATTCCGGTTCGATCTCCACACCGACCAC-3'(SEQIDNO.:22)

引物14：5'-TATTCTAGACTTGGCCATGGTGTGCATGGCGTG-3'(SEQIDNO.:23)PCR克隆mshA基因右臂DNA片段的引物序列如下：

引物15：5'-TATTCTAGACAGACCGGTTTCCTCGTACGAGGG-3'(SEQIDNO.:24)

引物16：5'-TATAAGCTTCATGGTCACCCGGCAGGAAGTCAC-3'(SEQIDNO.:25)PCR克隆lmbC基因左臂DNA片段的引物序列如下：

引物17：5'-TATGAATTCGGATGTACCGTTTCCTGGACC-3'(SEQIDNO.:26)

引物18：5'-TATTCTAGAGGAGGTGGAGAACGCTGTACG-3'(SEQIDNO.:27)PCR克隆lmbC基因右臂DNA片段的引物序列如下：

引物19：5'-TATTCTAGACCGACCATCCACTCCAGGAAG-3'(SEQIDNO.:28)

引物20：5'-TATAAGCTTCAGTCACGTGACCCAAGTACCG-3'(SEQIDNO.:29)PCR克隆lmbD基因左臂DNA片段的引物序列如下：

引物21：5'-TATGAATTCCCTGATGCTCCTGTACACCAGC-3'(SEQIDNO.:30)

引物22：5'-TATTCTAGAGTCCTCCAGGAACAGCAGACTG-3'(SEQIDNO.:31)PCR克隆lmbD基因右臂DNA片段的引物序列如下：

引物23：5'-TATTCTAGACGGTATCTGTTCCTGGGCCTGG-3'(SEQIDNO.:32)

引物24：5'-TATAAGCTTGAACGGTACGTGCAACTCCTCG-3'(SEQIDNO.:33)

PCR扩增

以抽提的林可霉素产生菌林可链霉菌StreptomycinlincolnensisNRRLISP-5355的总DNA为模板，分别用上述各基因左臂和右臂DNA片段特异性引物对的lmbE、lmbE3457、lmbV、mshA、lmbC和lmbD的上下游序列进行PCR扩增，左臂和右臂DNA扩增片段。

构建重组穿梭质粒

将各个基因的左臂和右臂两个片段进行凝胶电泳分离，切胶回收纯化。加入EcoRI和XbaI消化左臂片段，XbaI和HindIII消化下游片段，回收片段之后，将其一同连入用限制性内切酶HindIII和EcoRI处理过的pKC1139质粒(一种温度敏感的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，参考文献：美国专利申请US5,955,319)，形成各个基因的重组质粒穿梭质粒。

将重组质粒转化常规的大肠杆菌E.coliDH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素100μg/ml)中培养过夜，至菌液较浓。提取重组质粒，经酶切验证后，进行商业测序，结果证明，重组穿梭质粒构建正确。

2.同框敲除突变株的构建和筛选

将验证正确的重组穿梭质粒转化入常规的甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coliET12567(可参见US7,326,782和US7,105,491)，通过接合转移的方法，将质粒lmbE、lmbV、mshA、lmbC和lmbD基因敲除质粒导入林可霉素产生菌StreptomycinlincolnensisNRRLISP-5355中。lmbE3457基因敲除质粒导入lmbE敲除突变株中构建lmbE-E3457双敲除突变株。选出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，将接合子置于37℃生长，使质粒基因的上游或下游片段与染色体上的同源片段发生一次同源重组，然后将37℃生长良好的结合子接入不含任何抗生素的TSB液体培养基(购自SIGMA-ALDRICH公司)中，在30℃下培养两天后取少量菌液重新接种入无抗生素的TSB液体培养基中，如此重复5-6轮之后，将菌液在MS固体培养基上划线，挑选丧失阿伯拉霉素抗性的单菌落。抽提DNA，用PCR方法确定基因型。

本实施例中通过上述方法，成功的构建了林可霉素生物合成基因簇的突变菌株，实验结果如图1所示。

图1中a为lmbE敲除突变株的验证结果，从图a的电泳图可以看出，lmbE敲除突变株中lmbE基因缺失了大约0.55kb，说明本实施例中成功地构建了lmbE敲除突变株。

图1中b为lmbE-E3457双敲除突变株的验证结果，在lmbE敲除突变株的基础上，进一步敲除lmbE3457，从图b的电泳图可以看出，lmbE-E3457双敲除突变株中lmbE3457基因缺失了大约0.34kb，说明本实施例中成功地构建了lmbE-E3457双敲除突变株。

图1中c为lmbV敲除突变株的验证结果，从图c的电泳图可以看出，lmbV敲除突变株中lmbV基因缺失了大约0.4kb，说明本实施例中成功地构建了lmbV敲除突变株。

图1中d为mshA敲除突变株的验证结果，从图d的电泳图可以看出，mshA敲除突变株中mshA基因缺失了大约0.6kb，说明本实施例中成功地构建了mshA敲除突变株。

图1中e为lmbC敲除突变株的验证结果，从图e的电泳图可以看出，lmbC敲除突变株中lmbC基因缺失了大约0.7kb，说明本实施例中成功地构建了lmbC敲除突变株。

图1中f为lmbD敲除突变株的验证结果，从图e的电泳图可以看出，lmbD敲除突变株中lmbD基因缺失了大约0.4kb，说明本实施例中成功地构建了lmbD敲除突变株。

图1中g为lmbF敲除突变株的验证结果，从图e的电泳图可以看出，lmbF敲除突变株中lmbF基因缺失了大约0.5kb，说明本实施例中成功地构建了lmbF敲除突变株。

实施例2重组菌株发酵

1.种子活化及培养

将-80℃保存的重组菌株的孢子涂布在MS培养基(甘露醇2％，黄豆饼粉2％，琼脂2％)上，30℃培养7天。切下约1cm²的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基(Solublestarch20.0g，Soyflour10.0g，Cornsteepliquor30.0g，Glucose10.0g，(NH₄)₂SO₄1.5g，CaCO₃5.0g，pH＝7.0)，30℃、250rpm培养40小时，获得用于下一步实验的种子培养液。

2.扩大培养

按10％体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(Glucose100.0g，Soyflour25.0g，Cornsteepliquor2.0g，NaNO38.0g，NaCl5.0g，(NH4)2SO48.0g，K2HPO40.2g，CaCO38.0g，pH＝7.0)，30℃、250rpm培养7天，收获发酵液，得到含有林可霉素结构类似物的粗产物。低温保存，用于检测和分离纯化化合物。

实施例3发酵产物检测

将1mL发酵液过滤样品，12000r/min，离心10min；吸取300μL发酵液，加入流动相600μL(5mM乙酸铵：甲醇＝40：60)稀释三倍；用涡旋仪进行充分涡旋震荡，于4℃静置24h，12000r/min离心10min，取少量上清供HPLC及LC-MS检测与分析。检测条件为：色谱柱采用AgilentZORBAXSB-C18(5μm4.6×250mm)；检测波长为210nm；流动相为5mM乙酸铵水溶液:甲醇(40:60)；恒梯度洗脱17min；流速为0.6mL/min；进样量为20μL。

检测结果如图2所示，从图中可以看出，与野生型相比，lmbE敲除突变株和lmbE-E3457双敲除突变株发酵产物中化合物1的含量明显增加；lmbV敲除突变株和mshA敲除突变株的发酵产物中化合物2的含量显著增加；lmbF敲除突变株的发酵产物中化合物5的含量显著增加；lmbC敲除突变株的发酵产物中化合物3、4的含量有所增加。而野生型菌株中不产生或仅微量产生上述化合物。

实施例4林可霉素结构类似物的分离纯化

发酵液4000rpm离心20分钟，取上清。首先用大孔树脂XAD-2吸附突变株发酵液，甲醇洗脱；然后对洗脱液进行浓缩，再经SephadaxLH20凝胶柱分离，TLC/LC-MS分析确定目标化合物富集管；接着用C18柱半制备粗分得到化合物较纯化合物；最后用SephadaxG10凝胶柱对化合物进行细分进一步纯化得到各目标化合物，并对各目标化合物进行结构鉴定。

图3为化合物1的NMR检测结果，图3a，1HNMR谱图；图3b，13CNMR谱图；图3c，DEPT135NMR谱图；图3d，COSYNMR谱图；图3e，HSQCNMR谱图；图3f，HMBCNMR谱图；图3g，NOESYNMR谱图。根据上述图谱鉴定化合物1的结构如式I1所示。

图4为化合物2的NMR检测结果，图4a，1HNMR谱图；图4b，13CNMR谱图；图4c，DEPT135NMR谱图；图4d，COSYNMR谱图；图4e，HSQCNMR谱图；图4f，HMBCNMR谱图；图4g，NOESYNMR谱图。根据上述图谱鉴定化合物2的结构如式I2所示。

图5为化合物3的NMR检测结果。图5a，1HNMR谱图；图5b，13CNMR谱图；图5c，DEPT135NMR谱图；图5d，COSYNMR谱图；图5e，HSQCNMR谱图；图5f，HMBCNMR谱图；图5g，NOESYNMR谱图。根据上述图谱鉴定化合物3的结构如式I3所示。

图6为化合物4的NMR检测结果。图6a，1HNMR谱图；图6b，13CNMR谱图；图6c，DEPT135NMR谱图；图6d，COSYNMR谱图；图6e，HSQCNMR谱图；图6f，HMBCNMR谱图；图6g，NOESYNMR谱图。根据上述图谱鉴定化合物4的结构如式I4所示。

图7为化合物5的NMR检测结果。图7a，1HNMR谱图；图7b，13CNMR谱图；图7c，DEPT135NMR谱图；图7d，COSYNMR谱图；图7e，HSQCNMR谱图；图7f，HMBCNMR谱图；图7g，NOESYNMR谱图。根据上述图谱鉴定化合物5的结构如式I5所示。

实施例5

药物组合物

化合物	20g
		淀粉	140g

微晶纤维素

60g

按常规方法，将上述物质混合均匀后，装入普通明胶胶囊，得到1000颗胶囊。

实施例6水解产生正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins和麦角硫因等下游产物

正丙基脯氨酸：取5ml化合物1，2或5的水溶液(约含50mg原料)于25ml圆底烧瓶中，滴加5NNaOH溶液至pH＝11，加热回流3h。LC-MS监测反应完全后，真空除去反应溶剂。1ml水溶解体系，用反相C18柱进行两次半制备纯化，条件:H₂O(5mM)/CH₃OH＝80/20；2ml/min；210nm紫外检测，获得的纯正丙基脯氨酸进行核磁鉴定，结果如图8所示，鉴定结果表明本实施例中成功制得了正丙基脯氨酸。

二糖GlcN-Ins：取5ml化合物1或3的水溶液(约含50mg原料)于25ml圆底烧瓶中，滴加5NNaOH溶液至pH＝11，加热回流3h。LC-MS监测反应完全后，真空除去反应溶剂。1ml水溶解体系，用HIlIC柱进行两次半制备纯化，条件:H2O(10mM)/CH3CN＝25/75；2ml/min；示差检测，获得的GlcN-Ins进行核磁鉴定，结果如图9所示，鉴定结果表明本实施例中成功制得了二糖GlcN-Ins。GlcN-Ins可用于化学合成Mycothiol的原料(化学合成方法参考文献：Org.Lett.6,365-368，2004；Org.Lett.12,2630-2633，2010)。

麦角硫因：取5ml化合物2或4的水溶液(约含50mg原料)于25ml圆底烧瓶中，滴加5NHCl溶液至pH＝1，加热回流3h。LC-MS监测反应完全后，真空除去反应溶剂。1ml水溶解体系，用HIlIC柱进行两次半制备纯化，条件:H2O(10mM)/CH3CN＝28/72；2ml/min；243nm紫外检测，获得的纯麦角硫因进行核磁鉴定，结果如图10示，鉴定结果表明本实施例中成功制得了麦角硫因。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的结构如式I所示：

式I中，R₁选自：H、卤素、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基和其中R₃选自：H、卤素和C_1-8烷基；

R₂选自

2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物具有选自下组式I1-I5所示的结构：

3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用作制备正丙基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、Mycothiol或麦角硫因的原料。

4.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐以及任选的载体。

5.一种微生物菌株，其特征在于，所述微生物为林可链霉菌(Streptomycinlincolnensis)，并且所述菌株中选自下组的一个或多个基因被失活或敲除：

lmbE、lmbE3457、lmbV、mshA、mshC、lmbC、lmbD、lmbN、和lmbF。

6.一种生产中间体化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为原料进行水解反应，从而生成所述的中间体化合物，其中所述的化合物或其药学上可接受的盐来源于林可链霉菌的发酵产物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，对选自式I1、式I2和式I5所示的化合物中的一种或多种进行水解反应，从而生成正丙基脯氨酸化合物。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，对选自式I1和式I3所示的化合物中的一种或多种进行水解反应，从而生成二糖化合物GlcN-Ins。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，对选自式I2和式I4所示的化合物中的一种或多种进行水解反应，从而生成麦角硫因。

10.一种生产Mycohiol的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)制备二糖化合物GlcN-Ins

将权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为原料进行水解反应，从而生成二糖化合物GlcN-Ins；

(2)以GlcN-Ins为原料化学合成Mycothiol。

11.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)发酵权利要求4所述的菌株，从而产生权利要求1所述的化合物；和

(b)从发酵产物中分离出权利要求1所述的化合物；和任选地将所述化合物转化为其药学上可接受的盐。