CN105505882B - 一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。本发明提供的重组细胞CHO‑K1‑EGFR‑7gRNA是将CHO‑K1‑EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；CHO‑K1‑EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO‑K1细胞；产品甲为如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有DNA分子甲的重组表达载体甲；DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA分子；产品乙为如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有DNA分子乙的重组表达载体乙；DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。本发明对于癌症的治疗具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。
背景技术
近年来，治疗性抗体在临床上的应用越来越广泛。2000-2010年，抗体药物在全球生物制药中所占份额从10.5％扩张到56.41％，预计2015年全球抗体药物市场规模有望达到680亿美元。抗体恒定区缺少核心岩藻糖基化的治疗性抗体目前正处于临床研究中，它们在体外和体内都可以促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependentcellular cytotoxicity,ADCC),这种生理活性引起人们广泛关注，并成为此类药物研究的热点之一。
近年出现多种基因组编辑技术，主要有：锌脂核酸酶技术(zinc fingernuclease,ZFNs)、转录激活样效应核酸酶技术(transcription activator-like effectornucleases,TALEN)与RNA导向的CRISPR-Cas9核酸酶系统。CRISPR-Cas9核酸酶系统是近年来发现并被广泛应用于真核细胞基因组编辑的一种技术。该技术利用Cas9切割靶序列形成双链断裂(DSB)，随后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进而达到对靶基因序列编辑的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。
本发明首先保护一株重组细胞，即重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA。重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA是将CHO-K1-EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；所述CHO-K1-EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO-K1细胞，得到CHO-K1-EGFR细胞；所述产品甲为如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA分子甲的重组表达载体甲；所述DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA分子。所述DNA分子甲具体可为序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的DNA分子或序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示的DNA分子。所述重组表达载体甲具体可为在pcDNA-3.3载体的多克隆位点(例如HindⅢ和NotI酶切位点之间)插入所述DNA分子甲得到的重组质粒。所述产品乙为如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重组表达载体乙；所述DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。所述DNA分子乙具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。所述重组表达载体乙具体可为在pOptiVEC载体的多克隆位点(例如HindⅢ和NotI酶切位点之间)插入所述DNA分子乙得到的重组质粒。
以上任一所述重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA分泌的抗体(IgG)也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述抗体在制备用于杀伤肿瘤细胞的药物中的应用。所述肿瘤细胞可为表皮癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A431细胞。
本发明还保护一种用于杀伤肿瘤细胞的药物，其活性成分为所述抗体。所述肿瘤细胞可为表皮癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A431细胞。
本发明还保护所述抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。所述癌症可为表皮癌。所述癌症具体可为A431细胞引起的表皮癌。
本发明还保护一种用于治疗癌症的药物，其活性成分为所述抗体。所述癌症可为表皮癌。所述癌症具体可为A431细胞引起的表皮癌。
本发明对于癌症的治疗具有重大的应用价值。
附图说明
图1为7种gRNA在Fut8中靶标位置。
图2为Western Blot的结果。
图3为错配酶T7E1检测切割效率的结果。
图4为细胞生长情况检测的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pSpCas9(BB)-2A-Puro载体：购自addgene，目录号PX459。CHO-K1细胞：ATCC，CCL-61。CD CHO Medium：Gibco产品，目录号10743-029。OptiMEM I Medium：Gibco产品，目录号31985-070。脂质体(Fugene HD)：购于Promega公司，目录号E2311。嘌呤霉素：购于GeneOperation公司，目录号ISY1130-0025MG。西妥昔单抗(溶液形式：100mg/50ml，无色透明液体，IgG抗体):德国Merck公司，进口药品证号：S20050095，产品批号7667201。A431细胞(人表皮癌细胞)：ATCC，CRL-1555。pcDNA-3.3载体：Invitrogen公司，目录号K8300-01。pOptiVEC载体：Invitrogen公司，目录号12744-017。
轻链L4的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示。
重链H3由重链可变区(VH)、重链恒定区1(CH1)、铰链区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)组成(H3＝VH+CH1+hinge+CH2+CH3)。重链H3的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。序列表的序列3中，第1-145位氨基酸为重链可变区(VH)，第146-243位氨基酸为重链恒定区1(CH1)，第244-258位氨基酸为铰链区(hinge)，第259-369位氨基酸为重链恒定区2(CH2)，第370-475位氨基酸为重链恒定区3(CH3)。
实施例1、CHO-K1-EGFR细胞的制备
CHO-K1-EGFR细胞即表达抗EGFR人源化抗体L4H3的CHO-K1细胞，其构建过程如下：
1、将序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的双链DNA分子插入pcDNA-3.3载体的HindⅢ和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA-3.3-L4。
2、将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pOptiVEC载体的HindⅢ和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pOptiVEC-H3。
3、将重组质粒pcDNA-3.3-L4和重组质粒pOptiVEC-H3通过共转染的方式共同导入CHO-K1细胞，得到重组细胞，将其命名为CHO-K1-EGFR细胞。
实施例2、重组细胞的发现
一、RNA的设计
CHO-K1-EGFR细胞中Fut8基因的开放阅读框如序列表的序列5所示，包含9个外显子，其中第1-203位核苷酸为外显子1序列，第204-319位核苷酸为外显子2序列，第320-482位核苷酸为外显子3序列，第483-597位核苷酸为外显子4序列，第598-835位核苷酸为外显子5序列，第836-1082位核苷酸为外显子6序列，第1083-1259位核苷酸为外显子7序列，第1260-1410位核苷酸为外显子8序列，第1411-1728位核苷酸为外显子9序列。
通过预实验，发明人设计了7种gRNA如下(7种gRNA在Fut8中靶标位置如图1所示)：1gRNA1、1gRNA2、2gRNA、5gRNA、6gRNA、7gRNA和8gRNA。1gRNA1、1gRNA2、2gRNA、5gRNA、6gRNA、7gRNA和8gRNA分别作用于Fut8基因的第1个外显子、第1个外显子、第2个外显子、第5个外显子、第6个外显子、第7个外显子与第8个外显子。1gRNA1靶向序列表的序列5中第66-85位核苷酸，1gRNA2靶向序列表的序列5中第182-201位核苷酸，2gRNA靶向序列表的序列5中第278-297位核苷酸，5gRNA靶向序列表的序列5中第736-755位核苷酸，6gRNA靶向序列表的序列5中第1005-1024位核苷酸，7gRNA靶向序列表的序列5中第1090-1109位核苷酸，8gRNA靶向序列表的序列5中第1335-1354位核苷酸。7种gRNA的靶标序列如表1所示。
表1 7种gRNA的靶标序列
二、构建重组质粒
分别合成单链DNA分子Oligo I和单链DNA分子Oligo II，然后将上述两条单链DNA分子进行退火，形成两端均具有粘末端的双链DNA分子，将双链DNA分子插入pSpCas9(BB)-2A-Puro载体的BbsI酶切位点得到重组质粒。
表达1gRNA1的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-1gRNA1。表达1gRNA2的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-1gRNA2。表达2gRNA的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-2gRNA。表达5gRNA的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-5gRNA。表达6gRNA的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-6gRNA。表达7gRNA的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-7gRNA。表达8gRNA的重组质粒命名为重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-8gRNA。
用于构建各个重组质粒的Oligo I和Oligo II见表2。
表2 用于构建各个重组质粒的Oligo I和Oligo II
| Oligo I(5’-3’) | Oligo II(5’-3’) | |
| 表达1gRNA1的重组质粒 | CACCGTTTTATATAGGTGGTCATT | AAACAATGACCACCTATATAAAAC |
| 表达1gRNA2的重组质粒 | CACCGGAGAATGGCTGAGTCTCTC | AAACGAGAGACTCAGCCATTCTCC |
| 表达2gRNA的重组质粒 | CACCGTAATTTTCAATCTGTTCTT | AAACAAGAACAGATTGAAAATTAC |
| 表达5gRNA的重组质粒 | CACCGCAGAATTGGCGCTATGCTAC | AAACGTAGCATAGCGCCAATTCTGC |
| 表达6gRNA的重组质粒 | CACCGATCCGTCCACAACCTTGGC | AAACGCCAAGGTTGTGGACGGATC |
| 表达7gRNA的重组质粒 | CACCGTCAGACGCACTGACAAAGT | AAACACTTTGTCAGTGCGTCTGAC |
| 表达8gRNA的重组质粒 | CACCGTTCACTTCGGGGCGTGATCC | AAACGGATCACGCCCCGAAGTGAAC |
三、细胞转染与转染效率鉴定
重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-1gRNA1、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-1gRNA2、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-2gRNA、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-5gRNA、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-6gRNA、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-7gRNA和重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-8gRNA分别进行如下操作：
1、转染前一天用CD CHO Medium悬浮CHO-K1-EGFR细胞(细胞活力大于95％)以使细胞浓度为(6-7)×105/ml，转染当天用CD CHO Medium调整细胞浓度为1×106/ml。
2、转染当天，用OptiMEM I Medium稀释重组质粒，得到总体积为155μl、终浓度为0.02μg/μl的质粒溶液。
3、向步骤2得到的质粒溶液中加入9.9μl Fugene HD，轻轻混匀15次以上，室温孵育5分钟。
4、将步骤3得到的溶液逐滴加入步骤1得到的细胞悬液中，在含8％CO2、37℃条件下125rpm震荡培养72h。
5、完成步骤4后，300rpm离心3min，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤，然后用100μlPBS缓冲液重悬，然后进行Western Blot(一抗为Flag抗体；由于Flag与Cas9蛋白融合表达，因此通过Flag抗体表达情况即可检测Cas9蛋白的转染效率)，检测Cas9表达情况。
结果见图2。cas9在7种转染细胞中都有表达，且在转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-5gRNA、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-6gRNA、重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-7gRNA和重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-8gRNA的细胞中表达量较高。
将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-1gRNA1的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA1。将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-1gRNA2的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA2。将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-2gRNA的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-2gRNA。将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-5gRNA的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA。将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-6gRNA的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-6gRNA。将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-7gRNA的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA。将转染重组质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro-8gRNA的一株细胞命名为重组细胞CHO-K1-EGFR-8gRNA。
四、CRISPR-Cas9切割目标序列的检测
重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA1、重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA2、重组细胞CHO-K1-EGFR-2gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-6gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA和重组细胞CHO-K1-EGFR-8gRNA分别进行如下操作：
1、提取重组细胞的基因组DNA。
2、以重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA1的基因组DNA为模板，PCR扩增1gRNA1的靶标区域；以重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA2的基因组DNA为模板，PCR扩增1gRNA2的靶标区域；以重组细胞CHO-K1-EGFR-2gRNA的基因组DNA为模板，PCR扩增2gRNA的靶标区域；以重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA的基因组DNA为模板，PCR扩增5gRNA的靶标区域；以重组细胞CHO-K1-EGFR-6gRNA的基因组DNA为模板，PCR扩增6gRNA的靶标区域；以重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA的基因组DNA为模板，PCR扩增7gRNA的靶标区域；以重组细胞CHO-K1-EGFR-8gRNA的基因组DNA为模板，PCR扩增8gRNA的靶标区域。
用于扩增各个gRNA的靶标区域的引物见表3。
表3 用于扩增各个gRNA的靶标区域的引物
| 上游引物(5’-3’) | 下游引物(5’-3’) | |
| 扩增1gRNA1的靶标区域 | GAGACTAATTTTGTCTGA | GCAACTATGTAAACCTAT |
| 扩增1gRNA2的靶标区域 | GGGAGTTGAAACTCTGAA | ATGAGCACTAATCCAAAT |
| 扩增2gRNA的靶标区域 | AACCCTTTTTGGTATGCT | GGACACAGTACCTTTCAT |
| 扩增5gRNA的靶标区域 | TACCTGTGACCAAAATGAGA | CAATCCTCCCAAATCAGA |
| 扩增6gRNA的靶标区域 | GTAGTGATGATGTGTTTTGA | TAAAACCAAGGAGCTTCATA |
| 扩增7gRNA的靶标区域 | TAACTTTCATATTGACCTGT | AGGTATGACTTGATTAGATT |
| 扩增8gRNA的靶标区域 | TGTTGATTTGAGAGATGCTT | ACTAAAAACACAGACTAATG |
3、取步骤2的PCR扩增产物，利用错配酶T7E1检测切割效率。结果见图3。图3中，泳道1至7依次代表重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA1、重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA2、重组细胞CHO-K1-EGFR-2gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-6gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA和重组细胞CHO-K1-EGFR-8gRNA的PCR扩增产物的错配酶T7E1酶切结果。结果显示，重组细胞CHO-K1-EGFR-1gRNA2、重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA、重组细胞CHO-K1-EGFR-6gRNA和重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA的PCR扩增产物可检测到切割条带。
根据公式fcut＝(b+c)/(a+b+c),indel(％)＝100×(1-∫(1-fcut))计算各个泳道中各个条带的灰度，结果见表4。
表4 各个泳道中各个条带的灰度
| 条带1 | 条带2 | 条带3 | |
| 1gRNA1的靶标区域 | 4377.33 | 0 | 0 |
| 1gRNA2的靶标区域 | 5475.83 | 1044.52 | 945.9 |
| 2gRNA的靶标区域 | 5552.25 | 0 | 0 |
| 5gRNA的靶标区域 | 2579.65 | 1280.42 | 1030.6 |
| 6gRNA的靶标区域 | 2475.54 | 1372.71 | 1296.86 |
| 7gRNA的靶标区域 | 2380.72 | 1613.79 | 1156.6 |
| 8gRNA的靶标区域 | 2461.24 | 0 | 0 |
五、重组细胞的发现
选择步骤四中T7E1检测indel(％)效率较高的3个重组细胞(CHO-K1-EGFR-5gRNA、CHO-K1-EGFR-6gRNA与CHO-K1-EGFR-7gRNA)，采用10μg/ml的小扁豆凝集素(Lensculinaris agglutinin，LCA)进行筛选，一周后CHO-K1-EGFR-6gRNA的存活率为0％，CHO-K1-EGFR-5gRNA与CHO-K1-EGFR-7gRNA的存活率为95％和97％。
取重组细胞(CHO-K1-EGFR-5gRNA或CHO-K1-EGFR-7gRNA)，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增Fut8基因并测序。
测序结果表明，重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA中Fut8基因发生了如下突变：同源染色体中的一条染色体中的Fut8基因增加32个碱基(序列表的序列5中第753位核苷酸和第754位核苷酸之间处增加了如下32个核苷酸：ATAGCGCCATCCTATATAGCGCCTCCAGTATA)，同源染色体中的另一条染色体中的Fut8基因缺失8个碱基(序列表的序列5中缺失了第747至754个核苷酸)。
测序结果表明，重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA中，Fut8基因发生了如下突变：同源染色体中的两条染色体中的Fut8基因发生了完全相同的突变，一方面增加5个碱基(序列表的序列5中第1109和1110位核苷酸之间增加了TCTGT)，另一方面发生了两个碱基的突变(使得序列表的序列5中第1106和1107位核苷酸由AA突变成了GT)。
六、全基因组测序
将CHO-K1-EGFR细胞和重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA分别进行全基因组测序。
全基因组测序结果表明，与CHO-K1-EGFR细胞相比，重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA的差异仅在于将基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为了序列表的序列7所示的DNA分子。
实施例3、抗体的制备与纯化
分别将待测细胞(CHO-K1-EGFR细胞、重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA或重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA)进行如下操作：
1、将重组细胞接种至125ml细胞培养瓶(装有30ml CD CHO Medium)，在培养箱(含8％CO2、37℃)中125rpm振荡培养至细胞活力低于50％，然后12000rpm离心15min，收集上清液。
2、取步骤1得到的上清液，调pH至6.0-7.0，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
3、取步骤2得到的滤液，采用rProtein A亲和层析柱进行纯化。
rProtein A亲和层析柱(Biorad公司，Bio-Scale Mini Affi-Prep proteinAcartridges)：柱体积为5ml，货号为732-4202。
结合缓冲液(pH7.0)：含3MNaCl的20mM磷酸盐缓冲液。
洗脱缓冲液(pH3.0)：0.1M柠檬酸缓冲液。
流速：2ml/min。
纯化过程：(1)用50ml结合缓冲液平衡rProtein A亲和层析柱；(2)上样；(3)用50ml结合缓冲液洗涤柱子；(4)用25ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。
4、取步骤3得到的过柱后溶液，用Tris-HCl(pH9.0)调pH至7.0，然后使用截留分子量为10kd的超滤管(Millipore公司)进行浓缩，得到的抗体溶液。
重组细胞CHO-K1-EGFR-5gRNA进行上述步骤得到的抗体溶液命名为hErbitux1。
重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA进行上述步骤得到的抗体溶液命名为hErbitux2。
CHO-K1-EGFR细胞得到的抗体溶液命名为hErbitux。
实施例4、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)
ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)是抗体药物发挥靶向性消灭靶细胞的重要作用方式。ADCC是指表达IgGFc受体的效应细胞通过与已结合在肿瘤细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。靶细胞即A431细胞。A431细胞的培养条件：37℃、5％CO2培养箱。效应细胞NK92/FcRγ3a(158V/V)：金斯瑞生物科技公司。
待测抗体溶液为hErbitux、hErbitux1、hErbitux2或西妥昔单抗。
1、取A431细胞，用含有10％FBS的DMEM培养基悬浮，得到2×105/ml的细胞液。
2、取步骤1得到的细胞液，按每孔50μl(即10000个细胞/孔)铺到96孔板中。
3、取待测抗体溶液，用PBS缓冲液(pH7.4,0.01M)进行10倍梯度稀释，得到各个抗体稀释液。待测抗体溶液的浓度为40μg/ml(以总蛋白计)，最大稀释度的抗体稀释液的浓度为0.000004μg/ml(以总蛋白计)。
4、将步骤3得到的抗体稀释液加入完成步骤2的96孔板中(每孔50μl微升)，静置孵育30min。设置用等体积PBS缓冲液代替抗体稀释液的空白对照。
5、将用RPMI 1640培养基悬浮的效应细胞NK92/FcRγ3a加入完成步骤4的96孔板中(每孔100μl微升)，静置孵育6小时。体系中待测抗体的浓度为0.000001μg/ml-10μg/ml(以蛋白浓度计)。每孔中的靶细胞为10000个，效应细胞为50000个，即靶效比为1:5。
6、完成步骤5后，800rpm离心3min，收集上清液。
7、将50μl步骤6得到的上清液加至新的96孔板中，加入50μl LDH检测液(Roche，cat#11644793001)后再室温孵育30min，然后在酶标仪Flexstation3上检测LDH反应的OD值，检测波长为OD492nm，背景波长为OD650nm。
每个处理设置三个重复样本，结果取平均值。
靶细胞裂解率(％)＝(OD实验数据-OD空白对照)/(ODMaximum release-ODMinimum release)×100％。
ODMaximum release表示靶细胞完全裂解时所测得的OD值；ODMinimum release表示靶细胞未裂解时所测得的OD值。
靶细胞裂解率为50％时对应的抗体稀释液中的蛋白浓度，即为EC50值。
Erbitux的EC50值＝0.01086。hErbitux的EC50值＝0.003979。hErbitux1的EC50值＝0.002224、hErbitux2的EC50值＝0.0003266。
结果表明，hErbitux2的ADCC效果更为显著，对靶细胞(A431细胞)的杀伤作用显著优于Erbitux、hErbitux和hErbitux1。
实施例5、细胞生长情况检测
待测细胞为CHO-K1-EGFR细胞或重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA。
将待测细胞接种于125ml摇瓶(内含30ml CD CHO Medium)，37℃、8％CO2条件下125rpm振荡培养，在细胞培养0、3、6、9和12天时分别取样检测细胞数、细胞活力,并通过ELISA试验检测抗体产量。ELISA试验中，一抗为羊抗人IgG(购自北京鼎国，货号AB-0011)，酶标二抗购自中杉金桥(货号ZB-2304)。
结果见图4，A为细胞数结果，B为细胞活力结果，C为抗体浓度结果。CHO-K1-EGFR细胞和重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA进行上述培养，各个时间点的细胞数、细胞活力基本一致，重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA的抗体产量相比CHO-K1-EGFR细胞提高。
Claims (3)
1.重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，是将CHO-K1-EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；
所述CHO-K1-EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO-K1细胞，得到CHO-K1-EGFR细胞；所述产品甲为如下（a）或（b）：（a）DNA分子甲；（b）含有所述DNA分子甲的重组表达载体甲；所述DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA分子；所述产品乙为如下（c）或（d）：（c）DNA分子乙；（d）含有所述DNA分子乙的重组表达载体乙；所述DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。
2.如权利要求1所述的重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，其特征在于：
所述DNA分子甲为序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示的DNA分子；
所述DNA分子乙如序列表的序列4所示。
3.如权利要求1所述的重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，其特征在于：
所述重组表达载体甲为将所述DNA分子甲插入pcDNA-3.3载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组表达载体乙为将所述DNA分子乙插入pOptiVEC载体的多克隆位点得到的重组质粒。
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