CN105018393B - 一株巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株巨大芽孢杆菌及其应用。该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)STY006，保藏编号为CGMCC No.11053。本发明还公开了一种包括所述的巨大芽孢杆菌菌株STY006的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的巨大芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该巨大芽孢杆菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物细菌性病害，包括棉花枯萎病、大白菜软腐病、生姜姜瘟病、核桃细菌性褐斑病等。
Description
技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的芽孢杆菌及其用途，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。
芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆的芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性，还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，芽孢杆菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的细菌——巨大芽孢杆菌菌株STY006。本发明的菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明所提供的菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)STY006，是从土壤中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11053。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)菌株STY006的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为65：35的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
(4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还公开了一种包括所述的巨大芽孢杆菌菌株STY006的生物防治制剂。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备巨大芽孢杆菌菌株STY006的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，其中所述固料由质量比为65：35的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将巨大芽孢杆菌菌株STY006的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
本发明还提供了上述巨大芽孢杆菌菌株STY006或者上述生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途；所述植物土传病害可以选自棉花枯萎病、大白菜软腐病、生姜姜瘟病、核桃细菌性褐斑病等的一种或几种。
并且，本发明还提供了一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，包括向具有土传病害的植物施用上述巨大芽孢杆菌菌株STY006或者上述生物防治制剂。
实验表明，本发明的巨大芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该巨大芽孢杆菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物细菌性病害，包括棉花枯萎病、大白菜软腐病、生姜姜瘟病、核桃细菌性褐斑病等。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、巨大芽孢杆菌菌株STY006的分离与纯化
本发明的巨大芽孢杆菌菌株STY006是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
⑴芽孢杆菌的分离：土样的采集，在全国不同地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
⑵棉花枯萎病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备LB平板，用打孔器在芽孢杆菌、棉花枯萎病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的巨大芽孢杆菌菌株STY006。实验证明，该巨大芽孢杆菌原粉在防治棉花枯萎病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的巨大芽孢杆菌是具有广泛应用前景的巨大芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
AAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGCAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACTGGAGGAAGGTGGGGAAGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGTCTGCAAGACCACGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCACCTCGCTTACATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTACCGGCCCTTGTACACCCCACCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGCAGTCGGCAAGTAACCTTGAGGAGTTGACC
实施例2
1、巨大芽孢杆菌菌株STY006发酵过程
LB液体培养基：配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2。
大量固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固料：玉米粉65％，麸皮35％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。固液比为1:1.8(质量比)。
巨大芽孢杆菌菌株STY006大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将巨大芽孢杆菌菌株STY006从试管斜面中挑取少量细菌，移至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；
②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，干燥后即可得到芽孢杆菌原粉，500～600亿/克原粉。
实施例3田间药效试验
本实施例提供了巨大芽孢杆菌菌株STY006原粉对棉花枯萎病防治效果的相关实验。
1)供试药剂
巨大芽孢杆菌菌株STY006原粉(实施例2中制备)；70％甲基托布津可湿性粉剂(市售)。
2)供试作物与防治对象：
供试作物为棉花；品种为中棉17号；
防治对象：枯萎病。
3)试验地情况、试验设计及安排
试验地设在山东省东营市王老乡新户村棉花地，土壤为粘土地，往年枯萎病发生较重。试验地栽培条件均匀一致。
本试验设巨大芽孢杆菌STY006原粉药种比为1：200、1:400、1:600；70％甲基托布津可湿性粉剂1:600；清水作对照共5个处理，重复4次。各小区随机区组排列。施药采用湿拌种，每个小区安排营养钵300个，每钵点3粒棉花籽。
4)试验调查及计算方法
(1)气象条件
施药当日晴，微风，最高气温为22℃，最低气温为19℃，相对湿度为70％。
(2)药效及安全性调查
药效调查：调查总共1次，在出苗30天进行，记载300个营养钵种棉花枯萎病发病数，计算病株率及防治效果。
(3)药效计算方法
药效下式计算：
5)结果
(1)供试药剂对棉花枯萎病的防治效果
施药后30天调查病株数，表1结果显示，清水对照的病株率高达29.56％，各个处理的病株率均低于清水对照。巨大芽孢杆菌菌株STY006原粉，原粉药种比为1：200、1:400、1:600；70％甲基托布津可湿性粉剂1:600处理后的病株率分别为5.25％、7.18％、9.97％，均低于对照药剂，70％甲基托布津可湿性粉剂的病株率为10.04％；巨大芽孢杆菌菌株STY006原粉各个处理的防治效果分别为82.24％、75.71％、66.27％，其中1:200的防治效果最好，与其他处理在P<0.05水平上具有显著性差异，70％甲基托布津可湿性粉剂对棉花枯萎病的防治效果为66.04％。巨大芽孢杆菌菌株STY006原粉可有效控制棉花枯萎病的危害。
表1 各个处理后棉花枯萎病的发病率及防治效果
注：同一行数据后有相同字母表示经Duncan多重比较后差异不显著(P<0.05)。
(2)棉花安全性调查：经观察，各药剂处理区与对照区相比，棉花生长正常，无药害产生，说明巨大芽孢杆菌菌株STY006原粉在供试浓度对棉花安全。
因此，从发病率和防治效果来看，巨大芽孢杆菌菌株STY006对棉花枯萎病具有较好的防治效果，药种比400和药种比200的处理，施药后防治效果可达75％以上，明显好于对照药剂，差异显著。
Claims (7)
1.巨大芽孢杆菌（Bacillus magaterium）菌株STY006，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.11053。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株STY006在防治棉花枯萎病中的用途。
3.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株STY006。
4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备巨大芽孢杆菌菌株STY006的种子液；
（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3~5 d；
（3）将步骤（2）培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养；
其中，步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，其中所述固料由质量比为65：35的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水；
所述步骤（3）中的大量发酵培养基同固体培养基。
5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将巨大芽孢杆菌菌株STY006的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3~5 d得到种子液；
（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3~5 d；
（3）将步骤（2）培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8~9 d。
6.权利要求3所述的生物防治制剂在防治棉花枯萎病中的用途。
7.一种用于防治棉花枯萎病的生物防治方法，其特征是，包括向具有棉花枯萎病的棉花施用权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株STY006或者权利要求3所述的生物防治制剂。
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